KR102831152B1 - 신규한 웨이셀라 시바리아 sc51-2 균주 및 이의 배양방법 - Google Patents

Abstract

본 발명은 KACC 92568P로 기탁된 웨이셀라 시바리아(Weissella cibaria) SC51-2 균주 및 이의 용도에 관한 것이다.
본 발명의 웨이셀라 시바리아(Weissella cibaria) SC51-2 균주는 용혈활성이 없고 내산성 및 내담즙성이 우수하므로, 생균제 조성물 등으로 적용이 가능하다.

Description

신규한 웨이셀라 시바리아 SC51-2 균주 및 이의 배양방법{Novel Weissella cibaria SC51-2 strain and method for culturing thereof}

본 발명은 신규한 웨이셀라 시바리아 SC51-2 균주 및 이의 배양방법에 관한 것이다.

유산균(Lactic acid bacteria)은 당류를 분해하여 젖산을 생성하는 세균으로, 흔히 젖산균이라고 부른다. 사람이나 동물의 소화관, 우유, 요구르트, 치즈, 김치, 식물, 토양 등 자연계에 널리 분포하며, 인체 소화계에 공생하면서 섬유질과 복합 단백질을 분해해 중요한 영양소를 생성하는 역할을 한다. 이러한 특성으로 유산균은 사람을 비롯한 동물의 위장관 내 미생물 환경을 개선하고 면역력을 증진시키는 등 유익한 영향을 미친다. 최근 들어 유산균에 대한 연구가 활발히 진행되면서, 유산균은 일반 식품뿐만 아니라 건강기능식품과 의약품에 이르기까지 폭넓게 활용되고 있다.

한편, 프로바이오틱스(Probiotics)는 적정량 섭취하면 장에 정착하여 장 건강 개선, 면역 증진, 콜레스테롤 감소 등 다양한 유익한 기능을 가진 살아있는 균으로 알려져 있다. 하지만 프로바이오틱스가 장에서 생존하려면 산과 담즙에 대한 내성이 있어야 하며, 안전성 측면에서 용혈성 유무를 반드시 확인해야 한다. 프로바이오틱스로 활용되는 균주는 용혈활성을 일으키지 않아야 하며, 감마성 용혈(γ-hemolysis)을 나타내는 경우 동물이나 인간에게 무해한 비병원성 균주로 간주된다. 이러한 균주만이 안전한 프로바이오틱스 생균제로 적합하다.

대표적인 유산균으로는 스트렙토코커스 속(Streptococcus　sp.), 페디오코커스 속(Pediococcus　sp.), 류코노스톡 속(Leuconostoc　sp.), 락토바실러스 속(Lactobacillus　sp.), 스포로락토바실러스 속(Sporolactobacilus　sp.), 비피도박테리움 속(Bifidobacterium　sp.) 등이 있다.

유산균이 인체나 동물에서 유용한 효과를 발휘하려면 소화기관을 통과하는 동안 생존하여 소장에 정착할 수 있어야 한다. 이를 위해 유산균은 위장에서 분비되는 위산과 소장에서 분비되는 담즙에 높은 내성을 가져야 하며, 이를 통해 가혹한 소화 환경에서도 생존해 소장에 도달하는 생균 수를 유지할 수 있다. 또한, 장내 상피 세포나 점막에 흡착해 안정적으로 정착해야 실질적인 효과를 발휘할 수 있다. 따라서, 내산성과 내담즙성이 우수한 유산균을 사용하는 것이 중요하다.

이에 본 발명자들은 내산성과 내담즙성이 뛰어나면서, 감마성 용혈을 나타내어 용혈활성이 없는 신규 유산균을 개발하고, 이를 배양할 수 있는 배양 배지를 설계하고 대량 배양에 활용하고자 하였다.

특허공개번호 제10-2024-0133920호(2024년09월05일)

본 발명에서는 웨이셀라 시바리아(Weissella cibaria) SC51-2 균주가 기존에 알려진 다른 균주들에 비해 우수한 내산성과 내담즙성을 가지며, 용혈활성이 없는 것을 확인하였다. 이를 통해 생균제(프로바이 오틱스 제제)로서 적합한 균주임을 입증하였으며, 장내 세균총의 정상화와 정장 작용을 기대할 수 있다. 또한, 상기 균주를 대량으로 배양할 수 있는 신규한 배양배지를 개발하고, 그 배양 방법을 확립함으로써 본 발명을 완성하였다.

상기한 목적을 달성하기 위하여, 본 발명의 목적은 KACC 92568P로 기탁된 웨이셀라 시바리아(Weissella cibaria) SC51-2 균주를 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 웨이셀라 시바리아(Weissella cibaria) SC51-2 균주, 상기 균주의 건조물, 상기 균주의 배양물 또는 상기 배양물의 추출물을 유효성분으로 포함하는 생균제 조성물을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 상기 웨이셀라 시바리아(Weissella cibaria) SC51-2 균주, 상기 균주의 건조물, 상기 균주의 배양물 또는 상기 배양물의 추출물을 유효성분으로 포함하는 사료 첨가제 조성물을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 상기 웨이셀라 시바리아(Weissella cibaria) SC51-2 균주, 상기 균주의 건조물, 상기 균주의 배양물 또는 상기 배양물의 추출물을 유효성분으로 포함하는 사료 조성물을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 상기 웨이셀라 시바리아(Weissella cibaria) SC51-2 균주를 ML 배지에서 배양하는 단계를 포함하는, 웨이셀라 시바리아(Weissella cibaria) SC51-2 균주의 배양방법을 제공하는 것이다.

이하 본 명세서에 대하여 더욱 상세히 설명한다.

본 발명에서 개시된 각각의 설명 및 실시형태는 각각에 대한 다른 설명 및 실시형태에도 적용될 수 있다. 즉, 본 발명에 개시된 다양한 요소들의 모든 조합이 본 발명의 범주에 속한다. 또한, 하기에 기술된 구체적인 서술에 의하여 본 발명의 범주가 제한된다고 볼 수 없다.

본 명세서에서 사용되는 「포함하는」과 같은 표현은, 해당 표현이 포함되는 문구 또는 문장에서 특별히 다르게 언급되지 않는 한, 다른 실시예를 포함할 가능성을 내포하는 개방형 용어(open-ended terms)로 이해되어야 한다.

본 발명의 설명 및 청구범위에서 사용된 용어나 단어는, 통상적이거나 사전적인 의미로 한정해서 해석되어서는 아니되며, 발명자는 그 자신의 발명을 가장 최선의 방법으로 설명하기 위해 용어의 개념을 적절하게 정의할 수 있다는 원칙에 입각하여, 본 발명의 기술적 사상에 부합하는 의미와 개념으로 해석되어야만 한다.

상기 목적을 달성하기 위해, 본 발명은 KACC 92568P로 기탁된 웨이셀라 시바리아(Weissella cibaria) SC51-2 균주를 제공한다.

본 발명의 발명자들은 사천시의 배추 김치와 한우 농장의 원유 또는 축산 분변 시료로부터 수십 종의 미생물을 분리하였으며, 이들 미생물 중에서 용혈 활성이 없는 균주 5종를 분리 및 동정하였으며, 이 중에서 2종의 균주가 내산성과 내담즙성이 우수한 것으로 선발되었다. 또한, 선발된 균주의 16S rRNA 유전자 염기서열을 분석하여 분류계통학적 위치를 확인한 결과, 웨이셀라 시바리아(Weissella cibaria)와 99.93%의 상동성을 보여 웨이셀라 시바리아에 속하는 신규한 균주임을 확인하였다(도 1). 상기 균주를 웨이셀라 시바리아(Weissella cibaria) SC51-2 균주로 명명하고 국립농업과학원에 2023년 11월 7일자로 기탁하여 수탁번호 KACC 92568P를 부여받았다.

또한, 선발된 다른 균주의 16S rRNA 유전자 염기서열을 분석하여 분류계통학적 위치를 확인한 결과, 라틸락토바실러스 사케이 아종 사케이(Latilactobacillus sakei subsp. sakei) 균주와 100%의 상동성을 보여 라틸락토바실러스 사케이 아종 사케이에 속하는 신규한 균주임을 확인하였다(도 1). 이를 라틸락토바실러스 사케이 아종 사케이(Latilactobacillus sakei subsp. sakei) SC83-3 균주로 명명하고 국립농업과학원에 2023년 11월 7일자로 기탁하여 수탁번호 KACC 92567P를 부여받았다.

상기 웨이셀라 시바리아(Weissella cibaria) SC51-2 균주는 내산성과 내담즙성이 우수하며, 용혈활성을 일으키지 않는 감마성 용혈(γ-hemolysis)을 나타내어 동물이나 인간에게 무해한 비병원성 균주로 프로바이오틱스 생균제로 활용될 수 있다.

또한, 상기 라틸락토바실러스 사케이 아종 사케이(Latilactobacillus sakei subsp. sakei) SC83-3 균주 역시 내산성과 내담즙성이 우수하며, 용혈활성을 일으키지 않는 감마성 용혈(γ-hemolysis)을 나타내어 동물이나 인간에게 무해한 비병원성 균주로 프로바이오틱스 생균제로 활용될 수 있다.

다른 하나의 양태로서, 본 발명은 웨이셀라 시바리아(Weissella cibaria) SC51-2 균주, 상기 균주의 건조물, 상기 균주의 배양물 또는 상기 배양물의 추출물을 유효성분으로 포함하는 생균제 조성물을 제공한다.

본 발명에서 상기 웨이셀라 시바리아(Weissella cibaria) SC51-2 균주는 내산성과 내담즙성이 우수하고 용혈활성을 일으키지 않는 감마성 용혈(γ-hemolysis)을 나타내므로, 상기 SC51-2 균주, 상기 균주의 건조물, 상기 균주의 배양물 또는 상기 배양물의 추출물을 생균제(프로바이오틱스) 조성물의 유효성분으로 포함될 수 있다.

또한, 본 발명의 생균제 조성물에 내산성과 내담즙성이 우수하며, 용혈활성을 일으키지 않는 라틸락토바실러스 사케이 아종 사케이(Latilactobacillus sakei subsp. sakei) SC83-3 균주, 상기 균주의 건조물, 상기 균주의 배양물 또는 상기 배양물의 추출물을 추가로 포함할 수 있다.

본 발명에서 용어 "생균제(프로바이오틱스)"는 숙주의 장내 미생물 균형을 유지함으로써 유익한 효과를 발휘하는 살아있는 미생물을 의미한다. 이는 사람이나 동물이 섭취했을 때 위장관 내에서 생존하며, 특정 병리적 상태를 예방하거나 치료할 수 있는 미생물 제제를 지칭한다. 일반적으로 생균제는 장내 세균총의 이상 발효로 인해 발생하는 다양한 증상을 치료하고 개선하는 데 효과가 있다. 생균제는 사람이나 동물에게 투여되면 장내 소화관 벽에 밀착하여 정착함으로써 유해 미생물이 자리 잡는 것을 방지하며, 유산을 생성하여 장내 pH를 낮춰 유해 미생물의 증식을 억제한다. 또한 생균제는 숙주의 장내 균총을 정상화하여 세균성 질환을 예방할 뿐만 아니라, 장내 병원성 세균 억제제, 면역 증강제, 살균제, 소화제, 정장제, 지사제 등으로 활용될 수 있다. 이와 같은 생균제 조성물은 사료, 건강기능식품, 일반 식품, 의약품 등 다양한 분야에서 유용하게 사용될 수 있다.

본 발명에서 용어 "정장제"란 사람이나 동물의 장내 세균총의 이상 발효로 인해 발생하는 다양한 증상을 치료하거나 개선하는 용도를 의미한다. 본 발명에서 사용된 균주는 내산성과 내담즙성이 우수하여 위장관 환경에서도 생존할 수 있으며, 이를 통해 유해 미생물로 인한 감염성 설사, 위장염, 염증성 장질환, 신경성 장염 증후군, 소장 미생물 과성장증, 장 급이성 설사 등의 증상에 정장제로 활용할 수 있다.

또한, 상기 본 발명에 따른 생균제 조성물은 본 발명의 유산균과 함께 인간 또는 동물(가축)이 섭취하기에 적합하고, 섭취시 유해 미생물의 생육을 억제하며 장내 균총의 균형을 개선시키는 활성을 가지는 다른 종류의 공지된 미생물을 추가로 포함할 수 있다.

본 발명에서, 용어 "균주"는 균주의 파쇄된 세포벽 분획, 사균, 또는 건조균을 포함하는 의미이다. 배양액 중의 배양 배지를 제거하고 농축된 균체만을 회수하기 위해 원심분리 또는 여과과정을 거칠 수 있으며, 이러한 단계는 통상의 기술자의 필요에 따라 수행할 수 있다. 농축된 균체는 통상적인 방법에 따라 냉동 또는 동결 건조하여 그 활성을 잃지 않도록 보존할 수 있다.

본 발명에서, 용어 "균주의 건조물"은 상기 균주의 세포 또는 상기 균주의 배양액으로부터 수분을 제거하여 건조된 분말을 의미한다. 상기 건조물은 동결건조, 진공건조, 열풍건조, 분무건조, 감압건조, 분무건조, 포말건조, 고주파건조, 적외선건조 등의 방법을 통해 건조된 것을 포함하나 이에 제한되지 않는다.

본 발명에서, 용어 "배양물"은 본 발명에 따른 균주를 적합한 액체 배지에서 배양한 배양액 자체, 상기 배양액을 여과 또는 원심분리하여 균주를 제거한 여액(여과액 또는 원심분리한 상등액), 상기 배양액을 초음파 처리하거나 상기 배양액에 용해효소(lysozyme)를 처리하여 수득한 세포 파쇄액 등이 포함된다. 상기 배양액은 균주에 의해 생산, 분비되는 성분, 예컨대 대사산물을 포함하며 이에 따라 내산성 및 내담즙성이 우수하여 위장에서도 죽지 않고 생존한 상태로 장까지 도달하여 유익균의 성장을 촉진하는 프로바이오틱(probiotic) 활성을 가질 수 있다.

본 발명에서, 용어 "배양물의 추출물"은 배양물을 다양한 유기용매를 이용해 다양한 생리활성물질이 포함되도록 추출한 것을 의미하며, 이에 한정되는 것은 아니지만, C₁-C₄ 알코올(예를 들어, 메탄올, 에탄올, 부탄올 등), 아세톤 및 에틸아세테이트 등으로 이루어진 군으로부터 선택된 유기용매를 단독으로 사용하거나 2종 이상을 순차적으로 사용하여 추출을 수행할 수 있다.

상기 생균제 조성물은 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자가 용이하게 실시할 수 있는 방법에 따라, 담체, 부형제 및/또는 첨가제를 이용하여 제제화 함으로써 단위 용량 형태로 제조되거나 또는 다용량 용기내에 내입시켜 제조될 수 있다. 이때, 제형은 오일 또는 수성 매질중의 용액, 현탁액 또는 유화액 형태이거나 엑스제, 분말제, 과립제, 정제, 캅셀제, 젤(예컨대, 하이드로젤) 또는 동결건조제의 형태일 수 있으며, 상기 첨가제로 분산제, 안정화제 또는 동결 보호제를 추가적으로 포함할 수 있다. 또한 통상적인 생균제 조성물 제조방법에 따라 동결건조 또는 열건조될 수 있고, 캡슐화된 형태 또는 배양 현탁액이나 건조 분말 형태일 수 있다.

구체적으로 상기 동결건조제 형태의 경우, 상기 균주를 동결 보호제와 함께 동결건조하여 분말의 형태로 사용하는 것을 포함하며, 상기 동결 보호제는 탈지분유(Skim Milk), 말토덱스트린, 덱스트린, 트레할로스, 말토오스, 유당, 만니톨, 사이클로덱스트린, 글리세롤 및/또는 꿀일 수 있다. 또한, 보존 담체와 혼합하여 흡착시킨 후 건조시켜 고체화하여 사용하는 것을 포함하며, 상기 보존 담체는 규조토, 활성탄 및/또는 탈지강일 수 있다.

또 다른 하나의 양태로서, 본 발명은 상기 웨이셀라 시바리아(Weissella cibaria) SC51-2 균주, 상기 균주의 건조물, 상기 균주의 배양물 또는 상기 배양물의 추출물을 유효성분으로 포함하는 사료 첨가제 조성물을 제공한다.

또 다른 하나의 양태로서, 상기 웨이셀라 시바리아(Weissella cibaria) SC51-2 균주, 상기 균주의 건조물, 상기 균주의 배양물 또는 상기 배양물의 추출물을 유효성분으로 포함하는 사료 조성물을 제공한다.

본 발명의 사료 첨가제 조성물 또는 사료 조성물은 상기 웨이셀라 시바리아(Weissella cibaria) SC51-2 균주, 상기 균주의 건조물, 상기 균주의 배양물 또는 상기 배양물의 추출물을 유효성분으로 포함하며, 라틸락토바실러스 사케이 아종 사케이(Latilactobacillus sakei subsp. sakei) SC83-3 균주, 상기 균주의 건조물, 상기 균주의 배양물 또는 상기 배양물의 추출물을 추가적으로 포함할 수 있다.

본 발명에서 용어 "균주", "균주의 건조물", "균주의 배양물", "배양물의 추출물"에 대한 설명은 전술한 바와 같다.

상기 사료 첨가제 조성물은 고농축액이거나 분말 또는 과립형태로 제조될 수 있다. 상기 사료 첨가제 조성물은 구연산, 후말산, 아디픽산, 젖산, 사과산 등의 유기산이나 인산나트륨, 인산칼륨, 산성 피로인산염, 폴리인산염(중합인산염) 등의 인산염이나, 폴리페놀, 카테킨, 알파-토코페롤, 로즈마리 추출물, 비타민 C, 녹차 추출물, 감초 추출물, 키토산, 탄닌산, 피틴산 등의 천연 항산화제 중 어느 하나 또는 하나 이상을 추가로 포함할 수 있다. 상기 사료 첨가제 조성물은 동물에게 단독으로 투여하거나 식용 담체 중에서 다른 사료 첨가제와 조합하여 투여할 수도 있다. 또한, 상기 사료 첨가제 조성물은 탑 드레싱으로서 또는 이들을 동물 사료에 직접 혼합하거나 또는 사료와 별도의 경구 제형으로 용이하게 동물에게 투여할 수 있다.

상기 사료 조성물은 통상의 사료 형태로 제제화 될 수 있으며, 통상의 사료 성분을 함께 포함할 수 있다. 동물의 식이 욕구를 충족시키는데 통상적으로 사용되는 임의의 단백질-함유 유기 곡분을 포함할 수 있다. 이러한 단백질-함유 곡분은 통상적으로 옥수수, 콩 곡분, 또는 옥수수/콩 곡분 믹스로 주로 구성되어 있다.

또한, 상기 사료 첨가제 조성물 및 사료 조성물은 보조제, 예를 들어 보존제, 안정화제, 습윤제 또는 유화제, 용액 촉진제 등을 함유할 수 있다. 상기 사료 첨가제 조성물은 침주, 분무 또는 혼합하여 동물의 사료에 첨가하여 이용될 수 있다.

본 발명의 사료 또는 사료 첨가제 조성물은 포유류, 가금 및 어류를 포함하는 다수의 동물 식이에 적용할 수 있다. 상기 포유류로서 돼지, 소, 양, 염소, 실험용 설치 동물 뿐만 아니라, 애완 동물(예: 개, 고양이) 등에게 사용할 수 있으며, 상기 가금류로서 닭, 칠면조, 오리, 거위, 꿩, 및 메추라기 등에도 사용할 수 있고, 상기 어류로서 송어 등에 이용될 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.

또 다른 하나의 양태로서, 상기 웨이셀라 시바리아(Weissella cibaria) SC51-2 균주를 ML 배지에서 배양하는 단계를 포함하는, 웨이셀라 시바리아(Weissella cibaria) SC51-2 균주의 배양방법을 제공한다.

본 발명의 상기 웨이셀라 시바리아(Weissella cibaria) SC51-2 균주는 29 내지 31℃, 40 내지 120rpm으로 22 내지 26 시간 배양할 수 있다.

또한, 상기 균주는 pH 3.5~5.5에서 배양할 수 있다.

상기 웨이셀라 시바리아(Weissella cibaria) SC51-2 균주는 ML 배지에서 3 내지 10ML 수준으로 소량을 통상의 진탕배양법으로 배양할 경우 33℃나 35℃의 온도에서 24h 정치 배양에 비해 30℃, 50rpm, 24h 조건에서 배양하는 경우 균주의 성장이 높았다(실시예 8, 표 7). 또한, 보다 배양회전속도(rpm)를 높이고 배양시간 길게 하여 배양을 실시한 결과, ML (Miracle Lactobacillus) 배지에서 30℃, 50rpm, 24h 조건이나 30℃, 100rpm 48h 조건에 비해 30℃, 100rpm 24h 조건에서 1.3E+09(CFU/ml) 수준으로 보다 잘 성장하였으며 배양시간이 48h으로 길어진 경우 오히려 균주의 성장이 감소하였다(실시예 9, 표 8).

또한, 대량 배양 시에도 온도 30℃, 100rpm 조건에서 2.4E+10(CFU/ml) 수준으로 소규모 진탕배양의 1.3E+09(CFU/ml)에 비해 더욱 잘 성장하였다(실시예 9, 표 9).

상기 웨이셀라 시바리아(Weissella cibaria) SC51-2 균주는 정치 배양 보다는 29 내지 31℃, 40 내지 120rpm으로 22 내지 26 시간 배양시 균주의 성장을 최고로 높일 수 있다. 또한, 상기 배양시 pH pH 3.5~5.5에서 배양하는 것이 적절하였다.

따라서, 500L 내지 5000L의 ML 배지에서 29 내지 31℃, 40 내지 120rpm으로 22 내지 26 시간 배양하여 균주를 대량 배양할 수 있다.

상기 웨이셀라 시바리아(Weissella cibaria) SC51-2 균주의 배양에 사용한 ML (Miracle Lactobacillus) 배지는 본 발명에서 개발된 신규한 미라클-유산균 배지로 포도당(Glucose), 대두 펩톤(Soy peptone), 효모 추출물(yeast extract), 아세트산 나트륨(Sodium acetate), 시트르산 암모늄(Ammonium citrate dibasic), 황산 마그네슘(Magnesium sulfate), 황산 망간(Manganese sulfate) 및 인산수소이칼륨(Potassium phosphate dibasic anhydrous)을 포함한다.

구체적으로 포도당(Glucose) 0.2~1.5%(w/v), 대두 펩톤(Soy peptone) 0.1~1.5% (w/v), 효모 추출물(yeast extract) 0.1~1.5% (w/v), 아세트산 나트륨(Sodium acetate) 0.1~1.5% (w/v), 시트르산 암모늄(Ammonium citrate dibasic) 0.01~0.1% (w/v), 황산 마그네슘(Magnesium sulfate) 0.001~0.1% (w/v), 황산 망간(Manganese sulfate) 0.001~0.1% (w/v), 인산수소이칼륨(Potassium phosphate dibasic anhydrous) 0.01~1% (w/v) 및 증류수 95~99% (w/v)을 포함한다.

본 발명의 웨이셀라 시바리아(Weissella cibaria) SC51-2 균주는 내산성과 내담즙성이 우수하며, 용혈활성이 없는 프로바이오틱스 균주이다. 이 균주는 정장제로 활용되어 장내 유해 미생물의 이상 발효로 인해 발생할 수 있는 다양한 증상을 치료하거나 예방하며, 건강 상태를 개선하는 데 도움을 준다. 또한, 가축의 사료 섭취량 증가, 체중 증가, 영양소 소화율 향상, 면역력 강화 등의 효과를 제공하며, 분변 내 악취를 감소시키는 데에도 기여할 수 있다.

아울러, 본 발명에서는 상기 균주의 성장을 극대화할 수 있는 신규한 ML 배지를 개발하였으며, 이를 기반으로 균주의 성장을 최대로 증진시킬 수 있는 배양 방법을 확립하였다. 이러한 기술은 균주의 대량 배양 및 활용 가능성을 크게 향상시키는 장점을 가진다.

도 1은 Weissella cibaria SC51-2 균주와 Latilactobacillus sakei subsp. sakei SC83-3 균주의 16S rRNA 염기서열을 분석하여 유연 관계가 높은 균주와 계통분석을 실시한 결과이다.
도 2는 Weissella cibaria SC51-2의 배양조건에 따른 균체수를 나타낸다.
도 3은 Latilactobacillus sakei subsp. sakei SC83-3의 배양조건과 배지(ML, MGL, MYL)를 달리하여 배양한 균체수를 나타낸다.

이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 실시예 등을 들어 상세하게 설명하기로 한다. 그러나, 본 발명에 따른 실시예들은 여러 가지 다른 형태로 변형될 수 있으며, 본 발명의 범위가 하기 실시예들에 한정되는 것으로 해석되어서는 안 된다. 본 발명의 실시예들은 당업계에서 평균적인 지식을 가진 자에게 본 발명을 보다 완전하게 설명하기 위해 제공되는 것이다.

[실시예]

실시예 1. 유산균의 분리 및 용혈성 검정

축산용 생균제로 활용하기 위한 유산균을 분리하기 위해, 사천시 관내의 배추김치(가가호호)와 사천시 곤양면 황덕리의 한우 농장에서 원유 또는 축산 분변 시료를 채취하였다. 시료는 희석평판법을 사용하여 분석하였으며, BCP(Bromocresol Purple) 배지에서 노란색으로 변한 균총을 선택하여 유산균임을 확인한 뒤 분리하였다.

분리된 유산균의 용혈성을 확인하기 위해 TSA(Tryptic Soy Agar) 배지를 조제하고, 멸균 후 온도가 약 45~50℃로 내려갔을 때 클린벤치에서 Sheep blood를 5% 농도(1000ml 기준 50ml)로 첨가하였다. 혼합된 배지는 교반기로 잘 섞은 뒤 페트리디시에 분주하여 건조시켰다. 이후 대상 미생물을 획선접종하고 37℃에서 48시간 동안 배양하였다. 배양 결과는 육안으로 관찰하였으며, 알파용혈(콜로니 주변 녹색 환), 베타용혈(콜로니 주변 투명 환), 감마용혈(환 생성 없음)을 기준으로 용혈성을 판단하였다.

유산균의 용혈성 실험을 통해 축산용 생균제로 사용할 미생물의 안전성을 평가한 결과, 알파용혈을 나타내는 균주는 적혈구가 불완전하게 파괴되어 헤모글로빈이 변성되므로 축산용 생균제로 적용하기에 부적합하다는 결론을 얻었다. 또한, 베타용혈을 나타내는 균주는 혈구를 완전히 분해하는 용혈독소를 분비하여 장출혈이나 바이러스 감염과 같은 문제를 유발할 수 있으므로 축산용 생균제로 적합하지 않다는 것을 확인하였다.

반면, SC51-2, SC51-3, SC83-1, SC105-1, SC105-3 균주는 감마용혈(용혈이 발생하지 않는 상태)을 나타내었으며, 용혈독소를 생성하지 않아 안전성이 높았다. 따라서, 이들 균주는 축산용 생균제로 적합하다는 평가를 내릴 수 있었다.

Strains	α-hemolysis	β-hemolysis	γ-hemolysis
SC17	O
SC19-2	O
SC23	O
SC24-1	O
SC45-1	O
SC45-2	O
SC45-3	O
SC46-1	O
SC46-3	O
SC46-5	O
SC47-1	O
SC47-2	O
SC47-3	O
SC47-3	O
SC47-3	O
SC47-5	O
SC48-2	O
SC48-3	O
SC51-1	O
SC51-2			O
SC51-3			O
SC55	O
SC55-2		O
SC63	O
SC66-3	O
SC66-4	O
SC74-2		O
SC82-1	O
SC82-2	O
SC82-3	O
SC83-1			O
SC86-3	O
SC93-1	O
SC94-2	O
SC95-2	O
SC96-2	O
SC97-1	O
SC97-1	O
SC98-1	O
SC105-1			O
SC105-3			O
SC105-4	O

실시예 2. 내산성 유산균의 선발

용혈활성에서 감마용혈로 판단된 SC51-3, SC83-3, SC105-3, SC105-1, SC51-2 5 종의 유산균 균주의 단일 균총을 5 mL MRS broth에 37℃에서 24시간 동안 전배양 후 0.1%를 새로운 액체배지에 접종하여 24시간 동안 본배양하였다.

상기 MRS broth 배지는 펩톤(Peptone): 1%(w/v), 비프 추출물(Beef extract): 1%(w/v), 효모 추출물(Yeast extract): 0.5%(w/v), 글루코스(Glucose): 2%(w/v), 폴리소르베이트 80(Tween 80): 0.1%(w/v), 시트르산 암모늄(Ammonium citrate): 0.2%(w/v), 아세트산 나트륨(Sodium acetate): 0.5%(w/v), 황산 마그네슘(Magnesium sulfate): 0.01%(w/v), 황산 망가니즈(Manganese sulfate): 0.005%(w/v), 인산이칼륨(Dipotassium phosphate): 0.2%(w/v)을 포함한다.

돼지의 위 속과 같이 2시간 동안 위산에 노출되는 환경을 구성하기 위해 상기 본 배양된 유산균 5 mL 을 1,100×g에서 10분 동안 원심분리 후 균체를 회수하고 동일한 부피의 HCL로 조정된 MRS(pH 2)배지를 추가하고 현탁하였다. 이후 37℃에서 2시간 동안 진탕 배양후 MRS 배지에 희석평판하여 24시간 후 집락 수를 계수하였다.

그 결과, 5종의 유산균 중 내산성이 가장 높았던 것은 SC51-2 균주가 2.6E+05(CFU/ml), SC83-3 균주가 2.2E+05(CFU/ml)였다(표 2).

반면, SC105-1 균주는 1.6E+04(CFU/ml), SC105-3 균주는 3.3E+04(CFU/ml)로 앞의 2균주 보다 내산성이 비교적 낮았다(표 2). SC51-3 균주는 HCL로 조정된 MRS(pH 2)배지에서 2.5E+06(CFU/ml)로 현저히 감소하여 내산성이 좋지 않을 것을 알 수 있다.

따라서, 내산성이 비교적 높아 생균제에 적합한 유산균은 2균주로 SC51-2 그리고 SC83-3인 것을 알 수 있다.

유산균의 내산성 비교 결과

Strains	Control (CFU/ml)	Acid resistance (pH2.0) (CFU/ml)
SC51-3	4.4×108	2.5×106
SC83-3	2.5×107	2.2×105
SC105-3	5.8×106	3.3×104
SC105-1	1.3×108	1.6×104
SC51-2	2.2×106	2.6×105

실시예 3. 내담즙성 유산균의 선발

5 mL MRS broth에 균주의 단일 균총을 37℃에서 24시간 동안 전배양 후 0.1%를 새로운 액체배지에 접종하여 24시간 동안 본배양하였다.

돼지의 장속과 같이 7시간 동안 담즙에 노출되는 환경을 구성하기 위해 본 배양된 유산균 5 mL 을 1,100×g에서 10분 동안 원심분리 후 균체를 회수하고 동일한 부피의 0.3% oxgall이 들어 있는 MRS broth에 37℃ 조건에서 7시간 동안 배양하였다. 이후 MRS 배지에 희석평판하여 24시간 후 집락 수를 계수하였다.

이 중에서 5종의 유산균 중 내담즙성이 가장 높았던 것은 SC51-2 균주로 2.6E+05(CFU/ml) 였고 그 다음으로 SC83-3 균주가 1.8E+05(CFU/ml)였다(표 3). 내산성과 마찬가지로 담즙의 조건에서 살아있는 상태로 유지되는 비율이 높았던 유산균 2균주(SC51-2, SC83-3)가 생균제 개발 유산균으로 적합하다고 판단하였다.

유산균의 내담즙성 비교 결과

Strains	Control (CFU/ml)	Acid resistance (pH2.0) (CFU/ml)
SC51-3	5.6×108	2.8×104
SC83-3	2.8×107	1.8×105
SC105-3	6.3×106	5.1×103
SC105-1	2.0×108	3.6×104
SC51-2	2.9×106	2.6×105

실시예 4. 유산균의 동정 및 계통수

유산균을 동정하기 위하여, 16S rRNA 유전자는 범용 프라이머인 27F(AGAGTTTGATCMTGGCTCAG) 및 1492R (GGTTACCTTGTTACGACTT)를 이용하여 유전자를 증폭하였다. 증폭된 유전자 산물은 제노텍(대전, 한국)에 의뢰하여 3100 Genetic Analyser (Applied Biosystems, USA)로 염기서열을 분석하였다. 16S rRNA 유전자는 3개의 프라이머(518F; CCAGCAGCCGCGGTAATACG, 800R; TACCAGGGTATCTAATCC, 984F; ACGCGARGAACCTTAC)를 이용하여 염기서열을 결정하였다. 얻어진 염기서열은 Seqman 소프트웨어(DNASTAR, USA)를 이용하여 염기서열 오류를 검정하고 연결하였다. 16S rRNA 유전자 시퀀스를 기반으로 EZ-BioCloud (https://www.ezbiocloud.net)에 등록되어있는 표준 균주의 염기서열을 이용하였으며, 염기서열을 SINA aligner (http://www.arb-silva.de/aligner)를 이용하여 정렬하였다. 계통수의 작성을 위해 MEGA 7 프로그램의 Clustal W 프로그램으로 염기서열을 정렬하고 염기서열 길이를 맞추었다. 계통도를 작성하기 위해 Neighbor-joining 알고리즘을 사용하였으며, 계통도의 안정성은 1000회 bootstraping을 수행하여 확인하였다.

그 결과 SC51-3, SC83-3, SC105-3, SC105-1, SC51-2 5 종의 유산균 균주는 각각 Lactiplantibacillus argentoratensis SC51-3, Latilactobacillus sakei subsp. sakei SC83-3, Weissella hellenica SC105-3, Lactiplantibacillus paraplantarum SC105-1, Weissella cibaria SC51-2로 확인되었다(도 1).

실시예 5. 유산균 제형(동결건조)의 내산성 비교

실시예 1~3에서 내산성과 내담즙성이 우수하다고 선발된 Weissella cibaria SC51-2와 Latilactobacillus sakei subsp. sakei SC83-3 균주를 동결건조하여 얻은 유산균 분말 제품의 내산성을 비교하였다.

동결건조된 유산균 시제품 0.5ｇ을 HCL로 조정된 MRS(pH 2)배지 4.5 mL에 추가하고 현탁하였다. 37℃에서 2시간 동안 진탕 배양후 MRS 배지에 희석평판하여 24시간 후 집락 수를 계수하였다. G4000 프로바이오틱스 제품의 주력균주로 사용되고 있는 Lactiplantibacillus paraplantarum 균주의 동결건조체를 비교구로 사용하였다.

표 4를 참고하면, Weissella cibaria SC51-2 균주는 pH 2의 환경에서 1.7E+08(CFU/ｇ)이었고 Latilactobacillus sakei subsp. sakei SC83-3 균주는 9.2E+06(CFU/ｇ)으로 두 균주 모두 1.0E+05(CFU/g) 이상인 것으로 확인하였다(표 4). 반면, Lactiplantibacillus paraplantarum 균주는 내산성이 8.1E+03(CFU/g)인 것으로 나타나서 내산성에 취약한 유산균으로 확인되었다.

동결건조 제형의 내산성 비교 결과

Strains	Control (CFU/g)	Acid resistance (pH2.0) (CFU/g)
Weissella cibaria SC51-2 (lyophilization)	2.8×1010	1.7×108
Latilactobacillus sakei subsp. sakei SC83-3 (lyophilization)	7.0×108	9.2×106
Lactiplantibacillus plantarum (lyophilization)	1.3×107	8.1×103

실시예 6. 유산균 제형(동결건조)의 내담즙성 비교

실시예 1~3에서 선발된 Weissella cibaria SC51-2와 Latilactobacillus sakei subsp. sakei SC83-3 균주를 동결건조하여 얻은 유산균 분말 제품의 내담즙성을 비교 하였다.

동결건조된 유산균 시제품 0.5ｇ을 0.3% oxgall이 들어 있는 MRS broth 4.5 mL에 37℃ 조건에서 7시간 동안 배양하였다. MRS 배지에 희석평판하여 24시간 후 집락 수를 계수하였다. Weissella cibaria SC51-2 균주는 0.3% 담즙의 환경에서 9.5E+07(CFU/ｇ)이었고 Latilactobacillus sakei subsp. sakei SC83-3 균주는 1.0E+07(CFU/ｇ)로 두 균주 모두 1.0E+05(CFU/g) 이상인 것으로 확인하였다(표 5). 반면, 비교구로 사용한 Lactiplantibacillus paraplantarum 균주는 2.1E+03(CFU/ｇ)로 내담즙성이 상대적으로 약한 것을 알 수 있다(표 5).

동결건조 제형의 내담즙성 비교 결과

Strains	Control (CFU/ g)	bile resistance (CFU/ g)
Weissella cibaria SC51-2 (lyophilization)	2.9×1011	9.5×107
Latilactobacillus sakei subsp. sakei SC83-3 (lyophilization)	2.3×109	1.0×107
Lactiplantibacillus plantarum (lyophilization)	1.2×108	2.1×103

시중에서 판매 중인 대부분의 미생물제제와 생균제를 참고한 결과, 균주가 위와 장의 환경 조건에서 생존하며 유익한 효과를 발휘하기 위해서는 농도가 최소 1.0E+05(CFU/ml) 이상이어야 한다는 점이 확인되었다. 따라서, Lactiplantibacillus paraplantarum 균주는 상대적으로 내산성이 취약한 유산균임을 알 수 있다. 반면, Weissella cibaria SC51-2 균주와 Latilactobacillus sakei subsp. sakei SC83-3 균주는 동결건조 후에도 1.0E+05(CFU/ml) 이상의 농도를 유지하므로, 동결건조 과정을 거쳐 다양한 형태로 제품화하더라도 내산성과 내담즙성이 유지될 수 있음을 확인하였다.

실시예 7. MRS broth 배지를 이용한 유산균 균주의 배양 조건 확립

균주의 배양에는 유산균 성장에 최적화된 MRS broth 배지를 사용하여 온도 조건과 배양 조건을 달리해 균체 성장에 대해 비교하고 고농도 성장이 가능한 균주를 선정하고자 하였다.

5 mL MRS broth에 온도(30℃, 33℃, 35℃), 정치배양과 50rpm 진탕배양법으로 3가지 온도 조건과 배양 방법에 따른 24시간 배양 후 유산균의 성장 차이를 비교하였다. 모든 측정값은 3회 반복 실험의 평균값으로 하여, 그 결과를 작성하였다(표 6).

MRS배지 내 온도별, 배양법에 따른 유산균 성장 차이 비교 결과

35℃ 정치배양 24h 후 변화
시료명	pH	mV		OD		CFU/ml
접종전 공배지	6.8	15.1		0.165		-
SC83-3	4.02	162.8		0.211		1.8E+07
SC51-2	4.07	160.3		0.191		1.2E+07
35℃ 50rpm 진탕배양 24h 후 변화
시료명	pH	mV		OD		CFU/ml
접종전 공배지	6.8	15.1		0.165		-
SC83-3	3.90	169.7		0.232		2.2E+07
SC51-2	4.07	160.2		0.182		1.5E+07
33℃ 정치배양 24h 후 변화
시료명	pH	mV		OD		CFU/ml
접종전 공배지	6.8	15.1		0.165		-
SC83-3	3.90	169.2		0.194		1.9E+07
SC51-2	3.87	169.2		0.192		3.4E+07
33℃ 50rpm 진탕배양 24h 후 변화
시료명	pH	mV		OD		CFU/ml
접종전 공배지	6.8	15.1		0.165		-
SC83-3	3.98	168.3		0.231		2.1E+07
SC51-2	3.97	165.3		0.207		8.9E+07
30℃ 정치배양 24h 후 변화
시료명	pH	mV		OD		CFU/ml
접종전 공배지	6.8	15.1		0.165		-
SC83-3	4.11	171.3		0.25		2.1E+08
SC51-2	3.92	171.3		0.219		8.1E+07
30℃ 50rpm 진탕배양 24h 후 변화
시료명	pH		mV		OD		CFU/ml
접종전 공배지	6.8		15.1		0.165		-
SC83-3	4.13		183.2		0.236		1.5E+08
SC51-2	3.91		166.1		0.219		1.3E+08

MRS broth 배지를 사용하여 균체 성장을 비교해본 결과, Latilactobacillus sakei subsp. sakei SC83-3 균주는 30℃ 정치배양 24h 조건에서 잘 성장하였으며, Weissella cibaria SC51-2 균주는 30℃ 50rpm, 24h 조건에서 잘 성장하였다.

실시예 8. ML broth 배지를 이용한 유산균 균주의 배양 조건 확립

유산균 균주 배양을 위한 신규한 ML 배지 (Miracle Lactobacillus)를 제조하였다. ML 배지는 포도당(Glucose) 0.2~1.5%(w/v), 대두 펩톤(Soy peptone) 0.1~1.5% (w/v), 효모 추출물(yeast extract) 0.1~1.5% (w/v), 아세트산 나트륨(Sodium acetate) 0.1~1.5% (w/v), 시트르산 암모늄(Ammonium citrate dibasic) 0.01~0.1% (w/v), 황산 마그네슘(Magnesium sulfate) 0.001~0.1% (w/v), 황산 망간(Manganese sulfate) 0.001~0.1% (w/v) 및 인산수소이칼륨(Potassium phosphate dibasic anhydrous) 0.01~1% (w/v) 및 증류수 95~99% (w/v)을 포함하도록 제조하였다.

실시예 7에서 MRS broth 배지를 사용하여 배양한 결과를 바탕으로, 5 mL의 ML 배지를 이용하여 온도(30℃,33℃,35℃), 정치배양과 50rpm 진탕배양법으로 3가지 온도 조건과 배양 방법에 따른 24시간 배양 후 유산균의 성장 차이를 비교하였다. 모든 측정값은 3회 반복 실험의 평균값으로 하여, 그 결과를 작성하였다(표 7).

ML배지 내 온도별, 배양법에 따른 유산균 성장 차이 비교 결과

35℃ 정치배양 24h 후 변화
시료명	pH	mV		OD		CFU/ml
접종전 공배지	6.73	15.6		0.141		-
SC83-3	3.90	169.7		1.05		3.8E+07
SC51-2	4.15	162.7		1.22		2.4E+07
35℃ 50rpm 진탕배양 24h 후 변화
시료명	pH	mV		OD		CFU/ml
접종전 공배지	6.73	15.6		0.141		-
SC83-3	4.22	172.1		2.15		3.6E+07
SC51-2	4.21	163.3		1.45		3.6E+07
33℃ 정치배양 24h 후 변화
시료명	pH	mV		OD		CFU/ml
접종전 공배지	6.73	15.6		0.141		-
SC83-3	3.95	188.4		3.83		4.5E+07
SC51-2	3.97	165.3		1.52		1.2E+08
33℃ 50rpm 진탕배양 24h 후 변화
시료명	pH	mV		OD		CFU/ml
접종전 공배지	6.73	15.6		0.141		-
SC83-3	3.94	178.2		3.18		4.0E+07
SC51-2	3.87	169.2		2.32		1.4E+08
30℃ 정치배양 24h 후 변화
시료명	pH	mV		OD		CFU/ml
접종전 공배지	6.73	15.6		0.141		-
SC83-3	4.08	171.1		4.02		5.8E+07
SC51-2	3.92	171.3		2.22		6.7E+08
30℃ 50rpm 진탕배양 24h 후 변화
시료명	pH		mV		OD		CFU/ml
접종전 공배지	6.73		15.6		0.141		-
SC83-3	4.17		155.6		3.94		4.6E+07
SC51-2	3.84		171.3		4.18		8.5E+08

본 발명에서 개발한 ML 배지를 사용하여 균체 성장을 비교해본 결과, MRS 배지와 동일하게 Latilactobacillus sakei subsp. sakei SC83-3 균주는 30℃ 정치배양 24h 조건에서 잘 성장하였고, Weissella cibaria SC51-2 균주 역시 MRS 배지와 동일하게 30℃ 50rpm, 24h 조건에서 잘 성장하였다. 또한 MRS 배지에 비해 ML 배지를 사용한 경우 균주의 성장이 높았다.

실시예 9. ML broth 배지를 이용한 Weissella cibaria SC51-2 균주의 고농도 배양을 위한 대량배양 조건 설정

분말화를 위해 선발한 두 균주 Latilactobacillus sakei subsp. sakei SC83-3와 Weissella cibaria SC51-2 균주 중, 첫 번째 Weissella cibaria SC51-2 균주의 고농도 배양을 위해 실시예 8의 결과를 토대로 배양 온도는 30℃로 고정하면서, 배양회전속도(rpm)를 보다 다양하게 하여 균주의 성장을 비교하였다.

각 배양액의 pH와 O.D값은 일반시험법의 pH측정법 및 흡광도 측정법에 따라 600mm에서 측정하였다.

Weissella cibaria SC51-2, ML배지(Miracle Lactobacillus) 배양 결과

시료명	pH	mV	OD	CFU/ml
접종전 공배지	6.74	15.1	0.112	-
30℃ 24h 정치배양	3.92	170.2	2.31	7.7E+08
30℃ 24h 50rpm 진탕배양	3.98	171.3	2.51	8.1E+08
30℃ 24h 100rpm 진탕배양	4.02	182.1	4.13	1.3E+09
30℃ 48h 정치배양	3.87	165.2	1.46	3.4E+07
30℃ 48h 50rpm 진탕배양	3.91	167.4	1.91	7.7E+07
30℃ 48h 100rpm 진탕배양	3.88	171.4	2.17	1.5E+08

ML배지에서의 배양회전속도(rpm)에 따른 Weissella cibaria SC51-2 균주의 성장을 비교했을 때, 30℃ 24h 조건에서 rpm이 높아질수록 대체적으로 균수가 증가하는 경향을 보였다. 30℃ 100rpm으로 24시간 배양했을 때, 1.3E+09(CFU/ml)로 가장 높게 측정되었으며, 48시간 배양했을 때 오히려 균수가 감소하는 경향을 보였다(표 8 및 도 2). 따라서, Weissella cibaria SC51-2 균주 배양을 위한 신규한 ML 배지는 온도 30℃, 100rpm, 24시간 배양이 적합하다는 것을 확인하고 이를 대량배양 조건으로 설정하였다.유산균의 대량 배양 및 동결건조는 정읍 농축산용 미생물지원센터의 1.5톤 멸균 배양기, 연속 원심분리기, 그리고 동결건조기를 사용하여 분말 형태로 제작하였다. 대량 배양 과정에서는 ML broth 배지 1000L에 전배양액을 1%(10L) 접종하였으며, 배양 조건은 온도 30℃, 회전속도 100rpm, 공기 공급(air) 0, 압력 0.2 bar, pH 4.5로 설정하였다. 또한, 배양 중 pH가 4.5 이하로 떨어지지 않도록 NaOH를 이용해 자동으로 조절하였다. 24시간 배양 후 skim milk를 혼합한 약 80kg의 유산균액을 동결건조하여 14kg의 원말을 획득하였다(표 9). 동결건조한 Weissella cibaria SC51-2 균주의 원말 균수는 2.4E+10(CFU/ml)로 측정되어 대량배양 시 소규모 진탕배양에서 관찰된 1.3E+09(CFU/ml)보다 균주의 성장이 더욱 증가하는 것을 확인하였다.

Weissella cibaria SC51-2의 대량배양 조건 및 동결건조 후 원말 생산량

온도	Rpm	pH	air	압력	사용 skim milk	건조 후 총 원말
30	100	4.5	0	0.2	14kg	14kg

실시예 10. ML broth 배지를 이용한 Latilactobacillus sakei subsp. sakei SC83-3 균주의 고농도 배양을 위한 대량배양 조건 설정

Latilactobacillus sakei subsp. sakei SC83-3 균주의 고농도 배양을 위한 최적 배지 설정을 위해 신규한 ML 배지를 기본으로, 질소원과 탄소원을 각각 추가하여 비교하고자 하였다.

(A) : ML 배지

(B) : ML배지+ 포도당 = 총 포도당 2%(w/v) 함량 배지 Miracle Glucose Lactobacillus (이하 MGL, Miracle Glucose Lactobacillus)

(C) : ML배지+ yeast extract = 총 yeast extract 2%(w/v) 함량 배지 (이하 MYL, Miracle Yeast Lactobacillus)

기본 ML배지(A)와 ML배지에 포도당과 yeast extract를 각각 증량하여 포도당 함량이 2%(w/v)가 되도록 추가된 MGL 배지(B), ML 배지에 yeast extract 함량이 2%(w/v)가 되도록 추가된 MYL 배지(C) 3가지로 조성하였다. 이후 탄소원과 질소원의 증량이 Latilactobacillus sakei subsp. sakei SC83-3 균주의 성장에 차이가 있는지 확인하였고 배양 조건은 온도 30℃,정치배양과 50rpm, 100rpm 속도의 진탕배양으로 비교하였다. 모든 측정값은 3회 반복 실험의 평균값으로 하여, 그 결과를 작성하였다(표 10).

앞서 표 7에서 확인된 바와 같이, ML 배지를 사용하여 Latilactobacillus sakei subsp. sakei SC83-3 균주의 30℃ 24h 정치배양과 30℃ 24h 50rpm 진탕배양을 비교했을 때, 각각 5.8E+07(CFU/ml), 4.6E+07(CFU/ml)의 균체수가 확인되어, Weissella cibaria SC51-2 균주의 6.7E+08(CFU/ml)와 8.5E+08(CFU/ml)에 비해 균주의 성장이 낮았다.

이에, 보다 고농도 배양을 위해 ML 배지에 포도당 또는 효모 추출물을 추가한 MGL 배지, MYL 배지를 사용하여 정치배양과 회전속도 50rpm과 100rpm의 진탕배양 그리고 배양시간을 증가시킨 후 균주의 생육을 비교하였다(표 10, 도 3). 표 10 및 도 3은 Latilactobacillus sakei subsp. sakei SC83-3의 배양조건 별 균체수 측정 결과이다.

MYL 배지 사용 30℃, 48시간 정치배양에서 6.3E+08(CFU/ml)로 가장 높은 균체수값을 나타냈으며, 포도당인 탄소원의 증량보다 yeast extract 질소원의 증량과 배양시간의 증가가 Latilactobacillus sakei subsp. sakei SC83-3 균주의 생육에 더 효과적인 것을 확인하였다. 그러므로 MYL 배지, 온도 30℃, 48시간 정치배양이 적합하다는 것을 확인하고 이를 대량배양 조건으로 설정하였다.

Latilactobacillus sakei subsp. sakei SC83-3의 배지별 균체수 결과 비교

(A) : ML배지
시료명	pH	OD	CFU/ml
접종전 공배지	6.53	0.14	-
정치배양 24h	4.08	4.02	5.1E+07
50rpm 24h	4.17	3.94	4.6E+07
100rpm 24h	5.33	1.12	2.1E+06
정치배양 48h	4.02	4.06	5.8E+07
50rpm 48h	4.10	4.20	5.2E+07
100rpm 48h	4.21	1.12	1.2E+05
(B) : MGL배지
시료명	pH	OD	CFU/ml
접종전 공배지	6.14	0.16	-
정치배양 24h	4.01	4.23	6.3E+07
50rpm 24h	4.10	4.05	5.7E+07
100rpm 24h	4.87	1.62	1.2E+07
정치배양 48h	3.95	4.17	5.6E+07
50rpm 48h	3.98	3.64	3.9E+07
100rpm 48h	4.12	1.29	4.7E+06
(C) : MYL배지
시료명	pH	OD	CFU/ml
접종전 공배지	6.10	0.18	-
정치배양 24h	4.84	4.98	2.9E+08
50rpm 24h	4.86	4.65	2.7E+08
100rpm 24h	4.96	4.33	1.6E+08
정치배양 48h	4.99	5.18	6.3E+08
50rpm 48h	4.16	5.02	4.1E+08
100rpm 48h	4.26	2.12	1.4E+07

대량배양시 전배양액 1%(10L)를 ML broth 배지 1000L에 접종 후, 온도 30℃, 0~10rpm, air 0, 압력 0.2, pH 4.8로 설정하고, 그 이하로 떨어지지 않도록 NaOH로 자동 조절하였다. 대량배양은 진탕배양과 달리 정치배양을 진행할 경우 배양액 위아래 온도차이가 날 수 있으므로 온도차이가 나지 않도록 0~10rpm으로 배양하였다. 표 11은 Latilactobacillus sakei subsp.sakei SC83-3의 대량배양 조건 및 동결건조 후 원말 생산량을 나타낸다. 48시간 배양 후 skim milk를 섞은 81kg 정도의 유산균액을 동결건조 한 결과 15kg의 원말을 획득하였다(표 11). 동결건조한 Latilactobacillus sakei subsp.sakei SC83-3 균주의 원말 균체수는 2.7E+09(CFU/ml)로 측정되어 대량배양 시 소규모 진탕배양에서 관찰된 6.3E+08(CFU/ml)보다 균주의 성장이 더욱 높았다.

Latilactobacillus sakei subsp. sakei SC83-3의 대량배양 조건 및 동결건조 후 원말 생산량

온도	rpm	pH	air	압력	사용 skim milk	건조 후 총 원말
30	0~10	4.8	0	0.2	12kg	15kg

또한, 대량배양 시 상업용 배지인 MRS 배지를 대체해 Weissella cibaria SC51-2 균주는 ML 배지로 배양하고, Latilactobacillus sakei subsp. sakei SC83-3 균주는 MYL 배지로 배양할 경우 ML배지는 21배 이상, MYL 배지는 17배 이상의 가격을 절감할 수 있다(표 12).

배지 조성에 따른 예상 단가(원/ton)

지명	단가(원/ton)
Lactobacili MRS (BD DifcoTM)	20,000,000원
MYL	1,150,000원
ML	940,000원

본 발명에서는 내산성과 내담즙성이 우수한 Weissella cibaria SC51-2, Latilactobacillus sakei subsp. sakei SC83-3 균주를 선별하였으며, 이들 균주의 고농도 성장과 경제성이 우수한 배지 조성과 배양조건(대량배양 포함)을 확립하고 대량배양 후 균주의 장기보관을 위한 동결건조제를 생산하는 방법을 개발하였다. Weissella cibaria SC51-2 균주는 ML 배지를 사용하여 30℃, 24시간, 100rpm의 속도로 진탕배양 시 1.3E+09(CFU/ml)의 균체수를 얻을 수 있었고, Latilactobacillus sakei subsp. sakei SC83-3 균주는 ML 배지에 yeast extract를 증량한 MYL배지를 사용하여 30℃, 48시간 정치배양했을 때, 6.3E+08(CFU/ml)로 가장 높은 균체수를 얻을 수 있었다. 또한, 이들 균주를 ML 배지를 사용하여 대량배양 시 Weissella cibaria SC51-2 균주의 원말 균수는 2.4E+10(CFU/ml), MYL 배지를 사용하여 대량 배양시 Latilactobacillus sakei subsp. sakei SC83-3 균주의 원말 균수는 2.7E+09(CFU/ml)로 측정되어 소규모 진탕배양에 비해 균주의 성장이 높은 것을 확인하였다. 또한, 1ton 당 기존의 MRS 배지를 대체해 ML 배지와 MYL배지로 배양할 경우 ML배지는 21배 이상, MYL배지는 17배 이상의 가격을 절감할 수 있는 것을 확인하였다.

이상에서 본 발명의 바람직한 실시예에 대하여 상세하게 설명하였지만 본 발명의 권리범위는 이에 한정되는 것은 아니고 다음의 청구범위에서 정의하고 있는 본 발명의 기본 개념을 이용한 당업자의 여러 변형 및 개량 형태 또한 본 발명의 권리범위에 속하는 것이다.

또한, 본 발명은 사천시의 재원으로 재단법인 사천시미생물발효재단의 지원을 받아수행된 연구성과물이다.

국립농업과학원 KACC92568P 20231107 국립농업과학원 KACC92567P 20231107

Claims (10)

1. KACC 92568P로 기탁된 웨이셀라 시바리아(Weissella cibaria) SC51-2 균주로서,
   분변 내 악취를 감소시키고 가축의 사료 섭취량과 체중을 증가시키는 특징을 가지는 축산용 웨이셀라 시바리아(Weissella cibaria) SC51-2 균주.
2. 제1항에 있어서, 상기 균주는 내산성과 내담즙성이 우수하며 감마성 용혈(γ-hemolysis)을 나타내는 것인, 축산용 웨이셀라 시바리아(Weissella cibaria) SC51-2 균주.
3. 제1항의 웨이셀라 시바리아(Weissella cibaria) SC51-2 균주, 상기 균주의 건조물, 상기 균주의 배양물 또는 상기 배양물의 추출물을 유효성분으로 포함하는 축산용 생균제 조성물.
4. 삭제
5. 제1항의 웨이셀라 시바리아(Weissella cibaria) SC51-2 균주, 상기 균주의 건조물, 상기 균주의 배양물 또는 상기 배양물의 추출물을 유효성분으로 포함하는 사료 첨가제 조성물.
6. 제1항의 웨이셀라 시바리아(Weissella cibaria) SC51-2 균주, 상기 균주의 건조물, 상기 균주의 배양물 또는 상기 배양물의 추출물을 유효성분으로 포함하는 사료 조성물.
7. 제1항의 웨이셀라 시바리아(Weissella cibaria) SC51-2 균주를 500 내지 5000L의 ML (Miracle Lactobacillus) 배지에서 29 내지 31℃, 40 내지 120rpm으로 22 내지 26 시간 배양하는 단계를 포함하며,
   상기 ML 배지는 포도당(Glucose) 0.2~1.5%(w/v), 대두 펩톤(Soy peptone) 0.1~1.5% (w/v), 효모 추출물(yeast extract) 0.1~1.5% (w/v), 아세트산 나트륨(Sodium acetate) 0.1~1.5% (w/v), 시트르산 암모늄(Ammonium citrate dibasic) 0.01~0.1% (w/v), 황산 마그네슘(Magnesium sulfate) 0.001~0.1% (w/v), 황산 망간(Manganese sulfate) 0.001~0.1% (w/v), 인산수소이칼륨(Potassium phosphate dibasic anhydrous) 0.01~1% (w/v) 및 증류수 95~99% (w/v)을 포함하며,
   분변 내 악취를 감소시키고 가축의 사료 섭취량과 체중을 증가시키는 특징을 가지는 축산용 웨이셀라 시바리아(Weissella cibaria) SC51-2 균주의 대량 배양방법.
8. 삭제
9. 제7항에 있어서, 상기 균주는 pH 3.5~5.5에서 배양하는 것인, 축산용 웨이셀라 시바리아(Weissella cibaria) SC51-2 균주의 대량 배양방법.
10. 삭제