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KR102826798B1 - Dna 손상 복구 효율 조절용 조성물 - Google Patents

Dna 손상 복구 효율 조절용 조성물 Download PDF

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KR102826798B1
KR102826798B1 KR1020220027681A KR20220027681A KR102826798B1 KR 102826798 B1 KR102826798 B1 KR 102826798B1 KR 1020220027681 A KR1020220027681 A KR 1020220027681A KR 20220027681 A KR20220027681 A KR 20220027681A KR 102826798 B1 KR102826798 B1 KR 102826798B1
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Abstract

본 발명은 상동 재조합 경로(Homologous recombination deficiency, HR) 촉진용 조성물 및 이를 포함하는 상동 재조합 경로 결핍 질환의 예방 또는 치료용 조성물에 관한 것이다. 본 발명은 TEAD 단백질, 보다 구체적으로는 TEAD 단백질의 N-말단 부위와 DNA 손상반응 관련 단백질이 결합하는 신규 복합체인 TEAD-complex2의 형성을 저해함으로써 종양을 비롯한 상동 재조합 경로 활성화에 효율적으로 이용될 수 있다. 이에, 본 발명은 종양을 비롯한 다양한 상동 재조합 경로 결핍 질환의 치료에 이용될 수 있을 뿐 아니라, DNA 이중결합 절단 후 상동 재조합을 촉진시킴으로써 CRISPR/Cas 시스템과 같은 유전자 가위 기술에서의 유전자 편집 효율을 비약적으로 향상시킬 수 있다.

Description

DNA 손상 복구 효율 조절용 조성물{A Composition for Controlling Efficiency for Repair of Damaged DNA}
본 발명은 TEAD 단백질과 일련의 단백질들 간의 결합을 조절함으로써 DNA 손상 복구를 촉진 또는 저해하는 방법에 관한 것이다.
DNA 손상은 세포의 분열 및 생존 과정에서 필연적으로 발생하는 스트레스로, 약 200여개 이상의 단백질이 1) DNA 손상의 인지, 2) DNA 손상에 대한 신호 전달 및 3) DNA 손상의 복구에 직·간접적으로 관여하고 있다. DNA 손상 복구 기전이 잘 작동하지 않으면 유전체 불안정성을 초래하여 종양을 비롯한 다양한 질병을 야기한다. 또한 면역세포의 활성 및 항체 생성 과정에도 DNA 손상 복구 기전이 필수적이기 때문에 DNA 손상 복구 기전의 결핍은 면역 기능의 저하 및 관련 질환의 발병을 초래한다. 따라서 다양한 DNA 손상의 종류와 복구 기전 및 이에 관여하는 단백질을 동정하고 이들의 구체적인 기능을 규명하는 것은 분자 생물학적 기전 이해와 이를 통한 질병의 치료 전략 수립에 매우 중요한 문제이다.
전사인자는 DNA에 결합하여 특정 유전자의 발현을 조절하는 단백질로, 전사인자가 어떤 유전자의 발현에 관여하며 어떠한 신호전달 체계를 통해 조절되는지에 대해 연구가 진행되어 왔다. 그러나, 특정 유전자를 전사, 발현시키는 고유의 기능 외에 전사인자의 다른 기능에 대한 연구는 거의 이루어지지 못하고 있다.
이에, 본 발명자들은 세포의 핵 안에서 전사 조절 외에도 DNA 손상의 인식과 손상 복구 기전에 직접적으로 관여하는 특정 전사인자를 규명하고, 이들의 활성을 조절함으로써 DNA 손상 복구기전 저해를 통한 항암 치료 전략, DNA 손상 복구기전 결함으로 초래된 질병의 치료 전략, 상동 재조합(Homologous recombination) 효율 증가를 통해 유전자 편집 효율의 개선 전략을 제시하고자 하였다.
본 명세서 전체에 걸쳐 다수의 논문 및 특허문헌이 참조되고 그 인용이 표시되어 있다. 인용된 논문 및 특허문헌의 개시 내용은 그 전체로서 본 명세서에 참조로 삽입되어 본 발명이 속하는 기술 분야의 수준 및 본 발명의 내용이 보다 명확하게 설명된다.
삭제
Ameer L. Elaimy et al., PNAS 116(28): 14174-14180 (2019)
본 발명자들은 DNA 손상 복구기전을 효율적으로 활성화하거나 저해할 수 있는 유효한 분자 타겟을 발굴하기 위하여 예의 연구 노력하였다. 그 결과, 종래에는 YAP/TAZ와 결합하는 Hippo 경로의 전사인자로만 알려진 TEAD 단백질이 DNA 손상 반응 및 복구에 관여하는 단백질들과 직접적으로 결합한다는 사실을 최초로 규명하고, 이러한 결합을 통해 DNA 상동 재조합의 효율이 감소되며, TEAD 단백질을 발현 또는 활성을 억제하거나 TEAD 단백질과 이들 단백질 간의 상호작용을 억제할 경우 상동 재조합의 효율이 현저히 증가한다는 사실을 발견함으로써, 본 발명을 완성하게 되었다.
따라서 본 발명의 목적은 상동 재조합 경로(Homologous recombination, HR) 촉진용 조성물 및 이를 포함하는 상동 재조합 경로 결핍 질환의 예방 또는 치료용 조성물을 제공하는 데 있다.
본 발명의 다른 목적은 비상동 말단연결(non-homologous end joining, NHEJ) 촉진용 조성물을 제공하는 데 있다.
본 발명의 또 다른 목적은 상동 재조합 경로(Homologous recombination, HR) 촉진용 조성물의 스크리닝 방법을 제공하는 데 있다.
본 발명의 다른 목적 및 이점은 하기의 발명의 상세한 설명, 청구범위 및 도면에 의해 보다 명확하게 된다.
본 발명의 일 양태에 따르면, 본 발명은 TEAD(TEA domain) 단백질의 억제제를 유효성분으로 포함하는 상동 재조합 경로 결핍(Homologous recombination deficiency) 질환의 예방 또는 치료용 조성물을 제공한다.
본 발명자들은 DNA 손상 복구기전을 효율적으로 활성화하거나 저해할 수 있는 유효한 분자 타겟을 발굴하기 위하여 예의 연구 노력하였다. 그 결과, 종래에는 YAP/TAZ와 결합하는 Hippo 경로의 전사인자로만 알려진 TEAD 단백질이 DNA 손상 반응 및 복구에 관여하는 단백질들과 직접적으로 결합한다는 사실을 최초로 규명하고, 이러한 결합을 통해 DNA 상동 재조합의 효율이 감소되며, TEAD 단백질을 발현 또는 활성을 억제하거나 TEAD 단백질과 이들 단백질 간의 상호작용을 억제할 경우 상동 재조합의 효율이 현저히 증가한다는 사실을 발견하였다.
본 명세서에서 용어 "상동 재조합 경로 결핍(Homologous recombination deficiency disease) 질환"은 DNA 이중사슬 절단(double strand break, DSB)의 발생 시 손상되지 않은 상동성 DNA 가닥을 주형으로 사용하여 손상된 가닥을 복구하는 상동 재조합 경로가 비활성화되거나 정상적으로 진행되지 못하여 DNA 손상으로 인한 세포 독성이 회복되지 못하는 모든 병적 상태(Pathological condition)를 포괄하는 의미이다. DSB의 복구 실패는 지놈 불안정성 및 세포 사멸과 같은 치명적인 결과를 초래하며, DSB의 복구 오류에 의한 부적절한 말단 결합은 염색체 전위(translocation)에 따른 발암성 형질전환의 주요 원인이 된다.
본 발명의 구체적인 구현예에 따르면, 본 발명의 조성물로 예방 또는 치료할 수 있는 상동 재조합 경로 결핍 질환은 상동 재조합 결핍성 종양이다.
보다 구체적으로는, 상기 상동 재조합 결핍성 종양은 상동 재조합 결핍성 유방암, 난소암, 복막암, 림프종, 다형성 교모세포종, 신경교육종, 성상세포종, 교모세포종, 수모세포종, 신경교종, 천막상 원시 신경외배엽 종양, 비정형 기형 횡문근양 종양, 맥락총 암종, 악성 신경절종, 대뇌 신경교종증, 수막종 및 부신경절종으로 구성된 군으로부터 선택된다.
본 명세서에서 용어 "TEAD(TEA domain) 단백질의 억제제"는 TEAD 단백질의 활성 또는 발현의 저하를 야기시키는 물질을 의미하며, 이에 의해 TEAD의 활성 또는 발현이 탐지 불가능해지거나 무의미한 수준으로 존재하게 되는 경우뿐 아니라, TEAD와 PARP, Ku80/70, RFC1, Rad51, RPA1/2 등의 단백질 간의 결합을 통한 상동 재조합 저해가 유의하게 개선될 수 있을 정도로 TEAD의 활성 또는 발현을 감소시키는 물질을 의미한다.
본 명세서에서 용어 "발현의 감소"는 TEAD의 발현량이 예를 들어 대조군에 비하여 20% 이상 감소한 상태, 보다 구체적으로는 30% 이상 감소한 상태, 보다 더 구체적으로는 40% 이상 감소한 상태를 의미할 수 있다.
본 명세서에서 용어 "활성의 감소"란 대조군에 비하여 TEAD의 생체내 고유한 기능이 측정 가능할 정도로 유의하게 감소하는 것을 말하며, 구체적으로는 대상체 내에서의 DNA 손상 반응 관련 단백질과의 결합을 통한 상동 재조합 저해가 유의하게 개선 또는 회복될 수 있을 정도로 TEAD의 활성이 감소하는 것을 말한다. 활성(activity)의 감소는 단순한 기능(function)의 감소뿐 아니라 안정성(stability)의 감소로 기인한 궁극적인 활성 저해를 포함한다.
본 발명의 구체적인 구현예에 따르면, 상기 TEAD 단백질은 TEAD 1, TEAD 2, TEAD3 및 TEAD 4로 구성된 군으로부터 선택된다.
본 발명의 구체적인 구현예에 따르면, 상기 TEAD 단백질의 억제제는 서열목록 제1서열 내지 제4서열 중 하나 이상의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩타이드에 특이적으로 결합하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편; 또는 서열목록 제1서열 내지 제4서열 중 하나 이상의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩타이드에 특이적으로 결합하는 앱타머이다.
본 발명에 따르면, 서열목록 제1서열의 아미노산 서열은 TEAD1 단백질의 N-말단의 30 ~ 101번 잔기에 해당하고, 제2서열의 아미노산 서열은 TEAD2 단백질의 N-말단의 40 ~ 111번 잔기에 해당하고, 제3서열의 아미노산 서열은 TEAD3 단백질의 N-말단의 30 ~ 101번 잔기에 해당하고, 그리고 제4서열의 아미노산 서열은 TEAD4 단백질의 N-말단의 1 ~ 75번 잔기에 해당한다.
본 발명자들은 TEAD 단백질의 C-말단 영역이 YAP/TAZ와 결합함으로써 암의 생존과 분열에 필수적인 유전자의 발현을 조절하는 전자인자로서의 고유한 기능을 발휘하는 것과 별개로, TEAD 단백질의 N-말단은 DNA 손상 반응 및 복구에 직접적으로 관여하는 단백질들과 경쟁적으로 결합하여 이들이 DSB(double strand break) 부위의 DNA 단일 가닥과 결합하는 것을 저해함으로써 상동 재조합의 효율을 감소시킨다는 것을 최초로 규명하였다. 따라서, 서열목록 제1서열 내지 제4서열 중 어느 하나의 아미노산 서열에 특이적으로 결합하는 항체 또는 앱타머는 TEAD 단백질의 N-말단 영역에 의한 상동 재조합 억제 효과를 차단할 수 있다.
TEAD 단백질을 특이적으로 인식하는 항체는 폴리클로날 또는 모노클로날 항체이며, 바람직하게는 모노클로날 항체이다.
본 발명의 항체는 당업계에서 통상적으로 실시되는 방법들, 예를 들어, 융합 방법(Kohler and Milstein, European Journal of Immunology, 6:511-519 (1976)), 재조합 DNA 방법(미국 특허 제4,816,567호) 또는 파아지 항체 라이브러리 방법(Clackson et al, Nature, 352:624-628(1991) 및 Marks et al, J. Mol. Biol., 222:58, 1-597(1991))에 의해 제조될 수 있다. 항체 제조에 대한 일반적인 과정은 Harlow, E. and Lane, D., Using Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press, New York, 1999; 및 Zola, H., Monoclonal Antibodies: A Manual of Techniques, CRC Press, Inc., Boca Raton, Florida, 1984에 상세하게 기재되어 있다.
본 명세서에서 용어 "항원 결합 단편(antigen binding fragment)"은 면역글로불린 전체 구조 중 항원이 결합할 수 있는 폴리펩티드의 일부를 의미하며, 예를 들어 F(ab')2, Fab', Fab, Fv 및 scFv를 포함하나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 명세서에서 용어 "특이적으로 결합(specifically binding)"은 "특이적으로 인식(specifically recognizing)"과 동일한 의미로서, 항원과 항체(또는 이의 단편)가 면역학적 반응을 통해 특이적으로 상호작용하는 것을 의미한다.
본 발명은 항체 대신 TEAD 단백질에 특이적으로 결합하는 앱타머를 이용하여 이의 활성을 억제할 수도 있다. 본 명세서에서 용어 "앱타머"는 특정 표적물질에 높은 친화력과 특이성으로 결합하는 단일 줄기의(single-stranded) 핵산(RNA 또는 DNA) 분자 또는 펩타이드 분자를 의미한다. 앱타머의 일반적인 내용은 Hoppe-Seyler F, Butz K "Peptide aptamers: powerful new tools for molecular medicine". J Mol Med. 78(8):426??30(2000); Cohen BA, Colas P, Brent R . "An artificial cell-cycle inhibitor isolated from a combinatorial library". Proc Natl Acad Sci USA. 95(24):14272??7(1998)에 상세하게 개시되어 있다.
본 발명의 구체적인 구현예에 따르면, 상기 TEAD 단백질의 억제제는 서열목록 제1서열 내지 제4서열 중 하나 이상의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩타이드를 인코딩하는 뉴클레오타이드의 발현을 억제하는 핵산 분자이다.
본 명세서에서 용어 "핵산 분자"는 DNA(gDNA 및 cDNA) 그리고 RNA 분자를 포괄적으로 포함하는 의미를 가지며, 핵산 분자에서 기본 구성 단위인 뉴클레오타이드는 자연의 뉴클레오타이드뿐만 아니라, 당 또는 염기 부위가 변형된 유사체 (analogue)도 포함한다(Scheit, Nucleotide Analogs, John Wiley, New York(1980); Uhlman 및 Peyman, Chemical Reviews, 90:543-584(1990)).
본 명세서에서 용어 "발현을 억제하는 핵산 분자"는 표적 유전자와 혼성화될 수 있는 상보적인 핵산 서열을 포함함으로써 표적 유전자를 특이적으로 인식하고, 이의 기능 저하를 야기하는 뉴클레오타이드 구조 상의 변형을 야기할 수 있는 핵산 분자를 의미하며, 예를 들어 shRNA, siRNA, miRNA, 리보자임, PNA, 안티센스 올리고뉴클레오타이드, CRISPR 시스템에 포함된 gRNA를 포함한다.
본 명세서에서 용어 "상보적"은 소정의 어닐링 또는 혼성화 조건 하에서 발현 억제용 핵산 분자가 타겟 핵산 서열에 선택적으로 혼성화할 정도로 충분히 상보적인 것을 의미하며, 실질적으로 상보적(substantially complementary) 및 완전히 상보적(perfectly complementary)인 것을 모두 포괄하는 의미를 가지고, 바람직하게는 완전히 상보적인 것을 의미한다. 본 명세서에서 용어 "실질적으로 상보적인 서열"은 완전히 일치되는 서열뿐만 아니라, 특정 서열에 어닐링하여 서열 특이적인 혼성화가 일어날 수 있는 범위 내에서, 비교 대상의 서열과 부분적으로 불일치되는 서열도 포함되는 의미이다.
본 명세서에서 용어 "shRNA(small hairpin RNA)"는 인 비보 상에서 스템-루프(stem-loop) 구조를 이루는 단일 가닥으로 50-70개로 구성된 뉴클레오타이드로서, RNA 간섭을 통해 타겟 유전자의 발현을 억제하기 위한 타이트한 헤어핀 구조를 만드는 RNA 서열을 의미한다. 통상적으로 5-10개의 뉴클레오타이드의 루프 부위 양쪽으로 상보적으로 19-29개의 뉴클레오타이드의 긴 RNA가 염기쌍을 이루어 이중가닥의 스템을 형성하며, 언제나 발현되도록 하기 위하여 U6 프로모터를 포함하는 벡터를 통해 세포 내로 형질도입되며 대개 딸세포로 전달되어 타겟 유전자의 발현억제가 유전되도록 한다.
본 명세서에서 용어 "siRNA"는 특정 mRNA의 절단(cleavage)을 통하여 RNAi(RNA interference) 현상을 유도할 수 있는 짧은 이중사슬 RNA를 의미한다. 타겟 유전자의 mRNA와 상동인 서열을 가지는 센스 RNA 가닥과 이와 상보적인 서열을 가지는 안티센스 RNA 가닥으로 구성된다. 전체 길이는 10 내지 100 염기, 바람직하게는 15 내지 80 염기, 가장 바람직하게는 20 내지 70 염기이고, 타겟 유전자의 발현을 RNAi 효과에 의하여 억제할 수 있는 것이면 평활(blunt) 말단 혹은 점착(cohesive) 말단 모두 가능하다. 점착 말단 구조는 3 말단 돌출한 구조와 5 말단 쪽이 돌출한 구조 모두 가능하다.
본 명세서에서 용어 "miRNA(microRNA)"는 세포내에서 발현되지 않는 올리고뉴클레오타이드로서 짧은 스템-루프 구조를 가지면서 타겟 유전자의 mRNA와 상보적인 결합을 통하여 타겟 유전자 발현을 억제하는 단일 가닥 RNA분자를 의미한다.
본 명세서에서 용어 "리보자임(ribozyme)"은 RNA의 일종으로 특정한 RNA의 염기 서열을 인식하여 자체적으로 이를 절단하는 효소와 같은 기능을 가진 RNA 분자를 의미한다. 리보자임은 타겟 mRNA 가닥의 상보적인 염기서열로 특이성을 가지고 결합하는 영역과 타겟 RNA를 절단하는 영역으로 구성된다.
본 명세서에서 용어 "PNA(Peptide nucleic acid)"는 핵산과 단백질의 성질을 모두 가지면서 DNA 또는 RNA와 상보적으로 결합이 가능한 분자를 의미한다. PNA는 자연계에서는 발견되지 않고 인공적으로 화학적인 방법으로 합성되며, 상보적인 염기 서열의 천연 핵산과 혼성화(hybridization)를 통해 이중가닥을 형성하여 타겟 유전자의 발현을 조절한다.
본 명세서에서 용어 "안티센스 올리고뉴클레오타이드"는 특정 mRNA의 서열에 상보적인 뉴클레오타이드 서열로서 타겟 mRNA 내의 상보적 서열에 결합하여 이의 단백질로의 번역, 세포질내로의 전위(translocation), 성숙(maturation) 또는 다른 모든 전체적인 생물학적 기능에 대한 필수적인 활성을 저해하는 핵산 분자를 의미한다. 안티센스 올리고뉴클레오타이드는 효능을 증진시키기 위하여 하나 이상의 염기, 당 또는 골격(backbone)의 위치에서 변형될 수 있다(De Mesmaeker et al., Curr Opin Struct Biol., 5(3):343-55, 1995). 올리고뉴클레오타이드 골격은 포스포로티오에이트, 포스포트리에스테르, 메틸 포스포네이트, 단쇄 알킬, 시클로알킬, 단쇄 헤테로아토믹, 헤테로시클릭 당숄포네이 등으로 변형될 수 있다.
본 명세서에서 용어 "gRNA(guideRNA)"는 타겟 유전자를 인식하여 핵산분해효소(nuclease)를 유도함으로써 인식된 분위를 특이적으로 절단하는 유전자 편집 시스템에 사용되는 RNA 분자를 의미한다. 이러한 유전자 편집 시스템에는 대표적으로 CRISPR(Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats) 시스템이 있다.
상술한 본 발명의 핵산 분자는 예를 들어 상동 재조합 경로 결핍 질환을 가진 대상체 내에서 발현시킴으로써 TEAD 단백질의 발현을 유전자 수준에서 억제할 수 있다.
본 명세서에서 용어 "발현시키다"는 대상체가 외래(exogenous) 유전자를 발현하게 하거나 또는 내인성(endogenous) 유전자의 자연적 발현량을 증가시키기 위해 유전자 전달체를 이용하여 인위적으로 이를 도입함으로써 유전자가 대상체 세포 내에서 염색체외 인자로서 또는 염색체 통합 완성에 의해 복제 가능하게 되는 것을 의미한다. 따라서, 용어 "발현"은 "형질전환(transformation)", "형질감염(transfection)" 또는 "형질도입(transduction)"과 동일한 의미이다.
본 명세서에서, 용어 "유전자 전달 시스템(gene delivery system)"은 유전자를 세포 내로 운반하는 모든 수단을 의미하며, 유전자 전달은 유전자의 세포내 침투(transduction)와 동일한 의미를 가진다. 조직 수준에서, 상기 용어 유전자 전달은 유전자의 확산(spread)과 동일한 의미를 가진다. 따라서, 본 발명의 유전자 전달 시스템은 유전자 침투 시스템 및 유전자 확산 시스템으로 기재될 수 있다.
보다 구체적으로는, 상기 핵산 분자는 서열목록 제5서열 내지 제8서열 중 하나 이상의 뉴클레오타이드 서열에 특이적으로 결합한다.
본 발명에 따르면, 서열목록 제5서열의 뉴클레오타이드 서열은 서열목록 제1서열의 아미노산 서열을 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열이고, 서열목록 제6서열의 뉴클레오타이드 서열은 서열목록 제2서열의 아미노산 서열을 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열이고, 서열목록 제7서열의 뉴클레오타이드 서열은 서열목록 제3서열의 아미노산 서열을 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열이고, 서열목록 제8서열의 뉴클레오타이드 서열은 서열목록 제4서열의 아미노산 서열을 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열이다.
본 발명에서 발현이 억제되는 뉴클레오타이드 서열은 첨부한 서열목록에 기재된 뉴클레오타이드 서열에 한정되지 않는다는 것은 당업자에게 명확하다.
뉴클레오타이드에서의 변이는 단백질에서 변화를 가져오지 않는 것도 있다. 이러한 핵산은 기능적으로 균등한 코돈 또는 동일한 아미노산을 인코딩하는 코돈 (예를 들어, 코돈의 축퇴성에 의해, 아르기닌 또는 세린에 대한 코돈은 여섯 개이다), 또는 생물학적으로 균등한 아미노산을 인코딩하는 코돈을 포함하는 핵산분자를 포함한다.
상술한 생물학적 균등 활성을 갖는 변이를 고려한다면, 본 발명의 핵산 분자는 서열목록에 기재된 서열과 실질적인 동일성(substantial identity)을 나타내는 서열도 포함하는 것으로 해석된다. 상기의 실질적인 동일성은, 상기한 본 발명의 서열과 임의의 다른 서열을 최대한 대응되도록 얼라인하고, 당업계에서 통상적으로 이용되는 알고리즘을 이용하여 얼라인된 서열을 분석한 경우에, 최소 60%의 상동성, 보다 바람직하게는 70%의 상동성, 보다 더 바람직하게는 80%의 상동성, 가장 바람직하게는 90%의 상동성을 나타내는 서열을 의미한다.
서열비교를 위한 얼라인먼트 방법은 당업계에 공지되어 있다. 얼라인먼트에 대한 다양한 방법 및 알고리즘은 Higgins and Sharp, CABIOS 5:151-3(1989); Corpet et al., Nuc. Acids Res. 16:10881-90(1988); Huang et al., Comp. Appl. BioSci. 8:155-65(1992) 및 Pearson et al., Meth. Mol. Biol. 24:307-31(1994)에 개시되어 있다. NCBI Basic Local Alignment Search Tool(BLAST)(Altschul et al., J. Mol. Biol. 215:403-10(1990))은 NBCI(National Center for Biological Information) 등에서 접근 가능하며, 인터넷 상에서 blastp, blasm, blastx, tblastn and tblastx와 같은 서열 분석 프로그램과 연동되어 이용할 수 있다.
본 명세서에서 용어 "예방"은 질환 또는 질병을 보유하고 있다고 진단된 적은 없으나, 이러한 질환 또는 질병에 걸릴 가능성이 있는 대상체에서 질환 또는 질병의 발생을 억제하는 것을 의미한다.
본 명세서에서 용어 "치료"는 (a) 질환, 질병 또는 증상의 발전의 억제; (b) 질환, 질병 또는 증상의 경감; 또는 (c) 질환, 질병 또는 증상을 제거하는 것을 의미한다. 본 발명의 조성물을 대상체에 투여하면 TEAD 단백질의 활성 또는 발현을 억제함으로써 TEAD 단백질의 N-말단 영역에 의한 상동 재조합 억제효과를 차단하여, 상동 재조합 경로 결핍으로 인한 증상의 발전을 억제하거나, 이를 제거하거나 또는 경감시키는 역할을 한다. 따라서, 본 발명의 조성물은 그 자체로 이들 질환 치료의 조성물이 될 수도 있고, 혹은 다른 약리성분과 함께 투여되어 상기 질환에 대한 치료 보조제로 적용될 수도 있다. 이에, 본 명세서에서 용어 "치료" 또는 "치료제"는 "치료 보조" 또는 "치료 보조제"의 의미를 포함한다.
본 명세서에서 용어 "투여" 또는 "투여하다"는 본 발명의 조성물의 치료적 유효량을 대상체에 직접적으로 투여함으로써 대상체의 체내에서 동일한 양이 형성되도록 하는 것을 말한다.
본 발명에서 용어 "치료적 유효량"은 본 발명의 약제학적 조성물을 투여하고자 하는 개체에게 조성물 내의 약리성분이 치료적 또는 예방적 효과를 제공하기에 충분한 정도로 함유된 조성물의 함량을 의미하며, 이에 "예방적 유효량"을 포함하는 의미이다.
본 명세서에서 용어 "대상체"는 제한 없이 인간, 마우스, 래트, 기니아 피그, 개, 고양이, 말, 소, 돼지, 원숭이, 침팬지, 비비 또는 붉은털 원숭이를 포함한다. 구체적으로는, 본 발명의 대상체는 인간이다.
본 발명의 조성물이 약제학적 조성물로 제조되는 경우, 본 발명의 약제학적 조성물은 약제학적으로 허용되는 담체를 포함한다.
본 발명의 약제학적 조성물에 포함되는 약제학적으로 허용되는 담체는 제제시에 통상적으로 이용되는 것으로서, 락토스, 덱스트로스, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 전분, 아카시아 고무, 인산 칼슘, 알기네이트, 젤라틴, 규산 칼슘, 미세결정성 셀룰로스, 폴리비닐피롤리돈, 셀룰로스, 물, 시럽, 메틸 셀룰로스, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 활석, 스테아르산 마그네슘 및 미네랄 오일 등을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 본 발명의 약제학적 조성물은 상기 성분들 이외에 윤활제, 습윤제, 감미제, 향미제, 유화제, 현탁제, 보존제 등을 추가로 포함할 수 있다. 적합한 약제학적으로 허용되는 담체 및 제제는 Remington's Pharmaceutical Sciences (19th ed., 1995)에 상세히 기재되어 있다.
본 발명의 약제학적 조성물은 경구 또는 비경구 투여할 수 있으며, 구체적으로는 경구, 정맥, 피하 또는 복강 투여될 수 있다.
본 발명의 약제학적 조성물의 적합한 투여량은 제제화 방법, 투여방식, 환자의 연령, 체중, 성, 병적 상태, 음식, 투여 시간, 투여 경로, 배설 속도 및 반응 감응성과 같은 요인들에 의해 다양하게 처방될 수 있다. 본 발명의 약제학적 조성물의 바람직한 투여량은 성인 기준으로 0.001-100 ㎎/kg 범위 내이다.
본 발명의 약제학적 조성물은 당해 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자가 용이하게 실시할 수 있는 방법에 따라, 약제학적으로 허용되는 담체 및/또는 부형제를 이용하여 제제화함으로써 단위 용량 형태로 제조되거나 또는 다용량 용기 내에 내입시켜 제조될 수 있다. 이때 제형은 오일 또는 수성 매질중의 용액, 현탁액, 시럽제 또는 유화액 형태이거나 엑스제, 산제, 분말제, 과립제, 정제 또는 캅셀제 형태일 수도 있으며, 분산제 또는 안정화제를 추가적으로 포함할 수 있다.
본 발명의 다른 양태에 따르면, 본 발명은 TEAD(TEA domain) 단백질의 억제제를 유효성분으로 포함하는 상동 재조합 경로(Homologous recombination, HR) 촉진용 조성물을 제공한다.
본 발명에서 이용되는 TEAD 단백질의 억제제 및 이에 의한 상동 재조합 경로 촉진 효과는 이미 상술하였으므로, 과도한 중복을 피하기 위해 그 기재를 생략한다. 본 발명의 조성물은 TEAD 단백질, 구체적으로는 TEAD 단백질의 N-말단 영역과 DNA 손상 반응 관련 단백질들 간의 결합을 저해하여 이들 단백질이 DSB 부위의 DNA 단일 가닥과 잘 결합하도록 한다. 이를 통해 촉진된 상동 재조합 경로는 다양한 상동 재조합 경로 결핍 질환의 치료에 이용될 수 있을 뿐 아니라 zinc finger, TALEN, CRISPR/Cas 시스템과 같이 DSB 단계가 수반되는 유전자 편집 기술에서 유전자 삽입(Knock-in) 효율을 비약적으로 향상시킬 수 있다.
본 발명의 또 다른 양태에 따르면, 본 발명은 TEAD(TEA domain) 단백질 또는 이의 기능적 일부 절편을 유효성분으로 포함하는 비상동 말단연결(non-homologous end joining, NHEJ) 촉진용 조성물을 제공한다.
후술하는 실시예에서 보는 바와 같이, 본 발명자들은 TEAD 단백질의 N-말단 영역이 PARP, Ku70/80과 결합함으로써 DNA 이중사슬 절단(DSB) 발생시 상보성이 없는 말단끼리 연결되는 비상동 말단연결(non-homologous end joining, NHEJ)을 촉진함을 최초로 규명하였다. 전형적으로, 세포는 상동성 재조합(HR)과 비상동 말단연결(NHEJ)의 두 가지 주요 DSB 복구 기작을 선택적으로 이용하게 되는데, TEAD 단백질 또는 이의 기능적 일부, 구체적으로는 PARP, Ku70/80과 결합하는 이의 N-말단 영역의 단백질 절편의 수가 증가하게 되면 상동 재조합을 저해하고 비상동 말단연결을 증가시킴으로써 DNA 이중 나선 절단 복구 기작을 선택적으로 유도할 수 있다.
본 발명의 구체적인 구현예에 따르면, 본 발명에서 이용되는 TEAD 단백질의 기능적 일부 절편은 서열목록 제1서열 내지 제4서열 중 하나 이상의 아미노산 서열을 포함한다.
본 발명의 또 다른 양태에 따르면, 본 발명은 다음의 단계를 포함하는 상동 재조합 경로(Homologous recombination, HR) 촉진용 조성물의 스크리닝 방법을 제공한다:
(a) TEAD(TEA domain) 단백질 또는 이를 발현하는 세포를 포함하는 생물학적 시료에 후보물질을 접촉시키는 단계;
(b) 상기 시료 내 TEAD 단백질의 활성 또는 발현량을 측정하는 단계,
상기 TEAD 단백질의 활성 또는 발현량이 감소한 경우, 상기 후보물질은 상동 재조합 경로 촉진용 조성물로 판정한다.
본 발명에서 이용되는 TEAD 단백질 및 이를 이용한 상동 재조합 경로 촉진용 조성물에 대해서는 이미 상술하였으므로, 과도한 중복을 피하기 위해 그 기재를 생략한다.
본 발명에서 용어 "생물학적 시료"는 인간을 포함한 포유동물로부터 얻어지는, TEAD 단백질 또는 이를 발현하는 세포를 포함하고 있는 모든 시료로서, 조직, 기관, 세포 또는 세포 배양액을 포함하나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 스크리닝 방법을 언급하면서 사용되는 용어 "후보물질"은 TEAD 단백질 또는 이를 발현하는 세포를 포함하는 시료에 첨가되어 TEAD의 활성 또는 발현량에 영향을 미치는지 여부를 검사하기 위하여 스크리닝에서 이용되는 미지의 물질을 의미한다. 상기 시험물질은 화합물, 뉴클레오타이드, 펩타이드 및 천연 추출물을 포함하나, 이에 제한되는 것은 아니다. 시험물질을 처리한 생물학적 시료에서 TEAD의 발현량 또는 활성을 측정하는 단계는 당업계에 공지된 다양한 발현량 및 활성 측정방법에 의해 수행될 수 있다. 측정 결과, TEAD의 발현량 또는 활성이 감소한 경우 상기 시험물질은 DNA의 상동 재조합 경로 촉진용 조성물로 판정될 수 있다.
본 발명에 따르면, 본 발명의 스크리닝 타겟인 TEAD 단백질의 발현 수준은 항원-항체 반응을 이용한 면역분석(immunoassay) 방법에 따라 측정할 수 있다. 이러한 면역분석은 종래에 개발된 다양한 면역분석 또는 면역염색 프로토콜에 따라 실시될 수 있다.
예를 들어, 본 발명의 방법이 방사능면역분석 방법에 따라 실시되는 경우, 방사능동위원소(예컨대, C14, I125, P32 및 S35)로 표지된 항체가 이용될 수 있다.
본 발명의 다른 구현예에 따르면, 본 발명의 스크리닝 타겟인 TEAD 단백질의 발현 수준은 TEAD 단백질을 인코딩하는 유전자의 발현량을 측정하는 제제를 이용하여 유전자 수준에서 측정될 수도 있다. 상기 유전자의 발현량을 측정하는 제제는 예를 들어 TEAD 유전자의 핵산 서열에 특이적으로 결합하는 프라이머 또는 프로브이다.
본 명세서에서 사용되는 용어 "프라이머"는 핵산쇄(주형)에 상보적인 프라이머 연장 산물의 합성이 유도되는 조건, 즉, 뉴클레오타이드와 DNA 중합효소와 같은 중합제의 존재, 적합한 온도와 pH의 조건에서 합성의 개시점으로 작용하는 올리고뉴클레오타이드를 의미한다. 구체적으로는, 프라이머는 디옥시리보뉴클레오타이드 단일쇄이다. 본 발명에서 이용되는 프라이머는 자연(naturally occurring) dNMP(즉, dAMP, dGMP, dCMP 및 dTMP), 변형 뉴클레오타이드 또는 비-자연 뉴클레오타이드를 포함할 수 있으며, 리보뉴클레오타이드도 포함할 수 있다.
본 명세서에서 용어 "프로브"는 특정 뉴클레오타이드 서열에 혼성화될 수 있는 디옥시리보뉴클레오타이드 및 리보뉴클레오타이드를 포함하는 자연 또는 변형되는 모노머 또는 결합을 갖는 선형의 올리고머를 의미한다. 구체적으로, 프로브는 혼성화에서의 최대 효율을 위하여 단일가닥이며, 더욱 구체적으로는 디옥시리보뉴클레오타이드이다. 본 발명에 이용되는 프로브로서, 상기 TEAD 유전자의 특정 염기서열에 완전하게(perfectly) 상보적인 서열이 이용될 수 있으나, 특이적 혼성화를 방해하지 않는 범위 내에서 실질적으로(substantially) 상보적인 서열이 이용될 수도 있다. 일반적으로, 혼성화에 의해 형성되는 듀플렉스(duplex)의 안정성은 말단의 서열의 일치에 의해 결정되는 경향이 있기 때문에, 타겟 서열의 3'-말단 또는 5'-말단에 상보적인 프로브를 사용하는 것이 바람직하다.
혼성화에 적합한 조건은 Joseph Sambrook, et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, N.Y.(2001) 및 Haymes, B. D., et al., Nucleic Acid Hybridization, A Practical Approach, IRL Press, Washington, D.C.(1985)에 개시된 사항을 참조하여 결정할 수 있다.
본 발명의 또 다른 양태에 따르면, 본 발명은 다음의 단계를 포함하는 상동 재조합 경로(Homologous recombination, HR) 촉진용 조성물의 스크리닝 방법을 제공한다:
(a) TEAD(TEA domain) 단백질 또는 이를 발현하는 세포; 및 PARP, Ku80, Ku70, LIG3, RFC1, Rad51, RPA1, RPA2, 및 XRCC1로 구성된 군으로부터 선택되는 하나 이상의 단백질 또는 이를 발현하는 세포를 포함하는 생물학적 시료에 후보물질을 접촉시키는 단계;
(b) 상기 시료 내 TEAD 단백질과 RFC1, PARP, Ku80, Ku70, LIG3, RFC1, Rad51, RPA1, RPA2, 및 XRCC1로 구성된 군으로부터 선택되는 하나 이상의 단백질 간의 결합을 측정하는 단계,
상기 결합이 감소된 경우, 상기 후보물질은 상동 재조합 경로 촉진용 조성물로 판정한다.
본 발명에서 이용되는 TEAD 단백질, 상동 재조합 경로 촉진용 조성물 및 스크리닝에 사용되는 생물학적 시료에 대해서는 이미 상술하였으므로, 과도한 중복을 피하기 위해 그 기재를 생략한다.
본 명세서에서 용어 "결합의 감소"는 TEAD 단백질, 구체적으로는 이의 N-말단 영역과 RFC1, PARP, Ku80, Ku70, LIG3, RFC1, Rad51, RPA1, RPA2, 및 XRCC1로 구성된 군으로부터 선택되는 하나 이상의 단백질 간의 결합이 저해되어 이들 DNA 손상반응 관련 단백질들과 DSB(double strand break) 부위의 DNA 단일 가닥 간의 결합이 측정 가능한 수준으로 회복되는 것을 의미한다. 이러한 결합의 감소는 후보물질이 TEAD 단백질에 경쟁적으로 결합하여 상기 나열된 DNA 손상반응 관련 단백질들과의 상호작용을 방해함으로써 이루어질수도 있고, 또는 TEAD 단백질의 활성 또는 발현을 감소시킴으로써 이루어질 수도 있다. 구체적으로는 대조군에 비하여 결합이 20% 이상 감소한 상태, 보다 구체적으로는 40% 이상 감소한 상태, 더욱 구체적으로는 60% 이상 감소한 상태를 의미할 수 있다.
본 발명의 특징 및 이점을 요약하면 다음과 같다:
(a) 본 발명은 상동 재조합 경로(Homologous recombination deficiency, HR) 촉진용 조성물 및 이를 포함하는 상동 재조합 경로 결핍 질환의 예방 또는 치료용 조성물을 제공한다.
(b) 본 발명은 TEAD 단백질, 보다 구체적으로는 TEAD 단백질의 N-말단 부위와 DNA 손상반응 관련 단백질이 결합하는 신규 복합체인 TEAD-complex2의 형성을 저해함으로써 종양을 비롯한 상동 재조합 경로 활성화에 효율적으로 이용될 수 있다.
(c) 본 발명은 종양을 비롯한 다양한 상동 재조합 경로 결핍 질환의 치료에 이용될 수 있을 뿐 아니라, DNA 이중결합 절단 후 상동 재조합을 촉진시킴으로써 CRISPR/Cas 시스템과 같은 유전자 가위 기술에서의 유전자 편집 효율을 비약적으로 향상시킬 수 있다.
도 1은 DNA 손상 복구기전에 참여하거나, DNA 손상 복구기전에 관여하는 단백질과 결합하는 전사인자의 스크리닝 결과를 나타낸다. 면역형광 어세이를 통해 손상된 DNA 마커와 동시에 위치하는(co-localized) 전사인자인 GATA1, SPIB, BTG2, IKZF1 및 NFE2을 선정하였다(도 1a). 면역침강을 통해 GATA1이 PARP와 결합하고, p53과 RPA1/2와, YAP이 RPA1/2, PARP와 결합함을 확인하였다(도 1b).
도 2는 TEAD가 YAP/TAZ와의 결합을 통해 전사기능 외의 독립적인 역할을 가짐을 보여주는 그림이다. YAP/TAZ가 없거나(K562, H146), YAP/TAZ가 항상 비활성화되어 있는(OCM1, HT29) 세포에서는 YAP/TAZ-TEAD 억제를 통한 세포 사멸이 관찰되지 않았다(도 2a). 웨스턴 블롯을 통해 각 세포의 TEAD 발현 감소를 확인하였다(도 2b). YAP/TAZ가 억제되거나 없는 세포에서는 TEAD의 억제를 통한 세포성장 억제가 관찰되지 않았다(도 2c). YAP/TAZ가 없는 경우 TEAD가 전사를 위한 프로모터 결합이 감소함을 확인하였다(도 2d).
도 3은 전사인자인 TEAD가 DNA 손상복구 기전에 관여하는 단백질과 결합하며 이는 YAP/TAZ와 경쟁적임을 보여주는 그림이다. 도 3a는 Bioplex interactome을 통해 TEAD와 Rad51과의 결합을 확인한 결과이다. 도 3b는 질량분석(Mass spectrometry)을 통해 TEAD4가 PARP, Ku80, LIG3, RFC1, Ku70 및 XRCC1과 결합함을 확인한 결과이다. 도 3c는 세포 수준에서 TEAD와 RPA2와의 YAP/TAZ 독립적인 결합을 확인한 결과를 보여준다. 도 3d는 세포 수준에서 TEAD와 Rad51과의 YAP/TAZ 독립적인 결합을 확인한 결과를 보여준다. 도 3e는 세포 수준에서 TEAD와 DNA 손상복구 기전 관여 단백질들이 YAP/TAZ에 의해 억제됨을 보여주는 그림이다. 도 3f는 Rad51과 TEAD의 결합에 TEAD의 N-말단이 필수적임을 확인한 그림이다. 도 3g는 Rad51과 TEAD의 결합이 YAP에 의해 억제됨을 확인한 결과이다. 도 3h는 세포 수준에서 TEAD 1/2/4와 Ku70이 결합함을 확인한 결과를 나타낸다. 이렇게 TEAD의 N-terminal에서 결합하는 단백질들을 complex2라 새롭게 명명하고 이와 구별하기 위해 YAP/TAZ를 complex1으로 명명하였다. 도 3i는 complex1과 complex2의 구성을 도식화한 그림이다. 도 3j를 통해 TEAD1/2/3/4에서 complex2의 형성에 필수적인 sequence를 도식화하여 표현하였다.
도 4는 TEAD가 DNA 복제 스트레스(DNA replication fork stress)를 악화시켜 복제기점 붕괴(fork collapse)를 야기함을 규명한 결과를 나타낸다. TEAD가 없는 경우 DNA 복제 스트레스에 의한 손상이 현저히 적게 야기되었다(도 4a). 단일가닥 DNA 노출은 TEAD가 없는 경우 증가되어 있었다(도 4b). TEAD가 없는 경우 HU에 의한 RPA의 인산화가 ATR에 억제에 의해 복구되었다(도 4c). TEAD가 없는 경우 HU에 의한 DNA 복제 스트레스를 덜 받았고(도 4d), TEAD가 없는 경우 HU에 대한 세포 생존율이 증가하였으며(도 4e), 이러한 현상은 YAP/TAZ가 없는 세포(Molm14), YAP/TAZ가 억제되어 있는 세포(OCM1), YAP/TAZ가 활성화되어 있는 세포(211H), 그리고 YAP/TAZ가 없는 세포(H146)에서 모두 관찰되었다(도 4f-4g).
도 5는 TEAD가 BRCA1을 억제하고 53BP1을 활성화시켜 비상동 말단연결(non-homologous end joining, NHEJ)을 촉진함을 보여주는 그림이다. 도 5a는 CPT에 의한 DNA 이중가닥 절단을 복구하기 위해 TEAD가 있는 경우 53BP1을 통한 NHEJ를, TEAD가 없는 경우 BRCA1을 활성화시킴을 규명한 그림이다. TEAD가 없는 경우 HR에 필수적인 Rad51이 활성화됨을 밝혔다(도 5b). 웨스턴 블랏을 통해 DNA 이중가닥 절단을 복구할 때 TEAD가 없는 경우 HR 신호인 RPA의 인산화가 오래 유지됨을 확인하였다(도 5c). TEAD가 없는 경우 DNA이 중가닥 절단에 대한 생존율이 증가함을 확인하였다(도 5d). NHEJ의 효율을 측정하는 EJ5-GFP 리포터 시스템과 HR의 효율을 측정하는 HR 리포터 시스템을 구축하여 TEAD가 억제되거나, 과발현되었을 때 NHEJ가 감소하고 HR이 증가하며, NHEJ가 증가하고 HR이 감소함을 확인하였다(도 5e). 유전자 편집효율(Gene editing efficiency)를 측정할 수 있는 mClover 리포터 시스템을 통해 TEAD가 없는 경우 HR을 통한 유전자 녹-인(knock-in) 효율이 증가하였다(도 5f).
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에 있어서 자명할 것이다.
실시예
실험방법
세포배양
H293A 세포는 10% FBS와 1% 페니실린/스트렙토마이신을 추가한 DMEM 배지에 배양하였으며 37℃ 5% CO2 인큐베이터에서 유지하였다.
TEAD1/2/4 녹아웃(KO) 세포 제작
H293A 세포 내 TEAD 유전자의 발현을 억제하기 위해 TEAD1/2/4에 대한 shRNA 및 gRNA를 사용하였다. 각 gRNA는 CRISPR design tool(http://crispr.mit.edu)을 참고하여 설계하였고, shRNA 및 gRNA 염기서열은 하기 표 1과 같다. pSpCas9(BB)-2A-Puro (PX459) (Addgene no.48139)에 shRNA 및 gRNA를 클로닝한 후 H293A 세포에 형질도입하였다. 24시간 후 퓨로마이신을 통해 2~ 3일간 TEAD1/2/4 KO 세포를 선별하여 유지하였다.
명칭 염기서열 (5'-3') 서열목록
shTEAD1/2/4 ATGATCA ACTTCATCCACAAG 제9서열
gRNA for TEAD1 TGGCAGTGGCCGAGACGATC 제10서열
gRNA for TEAD2 AGATAGGTGGGACGCCGGCG 제11서열
gRNA for TEAD4 TCAAGGATCTCTTCGAACG 제12서열
면역침강(IP)
IP를 위해 H293A 세포에 Myc-tagged TEAD를 형질도입하고 24시간 배양하였다. 세포는 프로테아제 포스파타아제 억제제 칵테일을 첨가한 0.5% NP-40 용해 완충액으로 얼음 위에서 용해시켰다. 용해된 세포를 10분마다 2-30번씩 파이펫팅하여 펠렛을 풀며 30분간 얼음 위에서 용해시킨 후, 13000rpm으로 10분 간 4℃에서 원심분리하여 상층액을 취하였다. 상층액에 Myc-접합된 자성 비드를 넣고 4℃로 테이터에서 18시간 배양하였다. 자성 바(Magnetic bar)로 비드-단백질 복합체를 모으고 0.5% NP-40 용해 완충액으로 4번 세척한 후, laemmli 완충액을 통해 면역침강된 단백질을 용출하였다.
면역형광 어세이
면역형광 어세이를 위해 세포를 글래스 커버슬립에 배양하였다. PBS로 1회 세척한 후 4% 파라포름알데히드로 15분간 상온에서 고정하였다. PBS로 3회 세척한 후, 0.2% (v/v) Triton X-100으로 10분 간 투과화(permeabilization)하고 PBS로 10분간 3회 세척하였다. 3% BSA로 30분 간 블로킹하고 1차 항체(Rad51 #8875 Cell Signaling Technology, 53BP1 #88439 Cell Signaling Technology, RPA32 ab2175 abcam, RPA70 ab97338 abcam, RPA32 S33 A300-246A Bethyl, H2A.X (Ser139) 05-636 Merck, Phospho RPA32 (S4/S8) A300-245A Bethyl, BRCA1 sc-6954 Santa Cruz Biotechnology, TEAD4 sc-101184 Santa Cruz Biotechnology)와 함께 4℃ 쉐이커에서 18시간 동안 배양하였다. 다시 PBS로 10분 간 3회 세척한 후, 3% BSA에 녹인 2차 항체와 함께 암실에서 2시간 동안 배양하였다. PBS로 10분간 3회 세척한 후, DAPI 용액을 첨가하여 염색하고, PBS로 2회 세척하였다. Prolong 안티페이드 시약으로 마운팅한 후 LEICA DMI800 공초점 현미경으로 이미지를 수득하였다.
DRGFP/NHEJ 어세이
H293A DR-GFP 세포를 구축하기 위해 선형화된 pDRGFP(addgene #26475) 플라스미드를 형질전환하여 세포의 지놈 DNA에 삽입하였다. H293A EJ5-GFP 세포 또한 같은 방법으로 선형화된 pimEJ5GFP(addgene #44026) 플라스미드를 세포의 지놈 DNA에 삽입하였다. 각 세포는 퓨로마이신(4μg/ml)을 통해 선별하여 유지하였다. DNA 이중가닥 손상 복구 효율을 측정하기 위해 I-SecI 플라스미드를 형질전환하고 48 - 72 시간 배양 후 유세포 분석기를 통해 GFP+ 세포의 비율을 측정하였다.
mClover 어세이
유전자 타겟팅 효율을 측정하기 위해 H293A WT, H293A TEAD1/2/4 KO 세포에 공여자 플라스미드와 gRNA 플라스미드를 함께 형질전환하고 72시간 배양 후 유세포 분석기를 통해 GFP+ 세포의 비율을 측정하였다.
세포 생존율 분석
H293A WT, H293A TEAD 1/2/4 KO 세포를 24 웰 플레이트 당 100,000 세포를 씨딩하고, 24시간뒤 CPT(0.01, 0.03, 0.1, 0.3, 1μM), 하이드록시우레아(0.01, 0.03, 0.1, 0.3, 1mM)를 48시간 처리한 후 MTT 기질을 2시간 동안 처리하고 DMSO로 용해 후 540nm에서의 흡광도를 측정하였다.
실험 결과
DNA 손상 복구기전에 관여하는 전사인자의 동정
DNA 손상 복구기전에 관여하는 단백질 또는 이들 단백질과 결합하는 전사인자를 동정한 결과, 면역형광 어세이를 통해 손상된 DNA 마커와 공배치된(co-localized) 전사인자인 GATA1, SPIB, BTG2, IKZF1 및 NFE2을 선정하였다(도 1a). 또한 면역침강을 통해 GATA1이 PARP와 결합하고, p53과 RPA1/2와, YAP이 RPA1/2, PARP와 결합함을 확인하였다(도 1b).
TEAD는 YAP/TAZ와 결합함으로써 전사기능 외의 독립적인 기능을 한다
YAP/TAZ가 없는 K562 및 H146 세포와, YAP/TAZ가 항상 비활성화되어 있는 OCM1 및 HT29 세포에서는 YAP/TAZ-TEAD를 억제하여도 세포 사멸이 관찰되지 않았다(도 2a). 웨스턴 블롯을 통해 각 세포에서 TEAD 발현이 감소됨을 확인하였다(도 2b). YAP/TAZ가 억제되거나 발현되지 않는 세포에서는 TEAD의 억제를 통한 세포성장 억제가 관찰되지 않았다(도 2c). 아울러, TEAD가 세포 내에서 YAP와 독립적으로 nucleoplasm 부위에 존재하여 전사적으로 독립적으로 기능할 수 있음을 보았다(도 2d).
TEAD는 YAP/TAZ와 경쟁적으로 DNA 손상복구 기전에 관여하는 단백질과 결합한다
Bioplex interactome을 통해 TEAD가 Rad51과 결합함을 확인하였으며(도 3a), 질량분석(Mass spectrometry) 결과 TEAD4가 PARP, Ku80, LIG3, RFC1, Ku70 및 XRCC1과 결합함을 알 수 있었다(도 3b). 아울러, 세포 수준에서 TEAD와 RPA2는 YAP/TAZ에 독립적인 결합을 하였으며(도 3c), TEAD와 Rad51 역시 YAP/TAZ에 독립적인 결합을 함을 확인하였다(도 3d). 세포 수준에서 TEAD와 DNA 손상복구 기전 관여 단백질들이 YAP/TAZ에 의해 억제됨을 확인하였으며(도 3e), Rad51과 TEAD의 결합에 TEAD의 N-말단이 필수적임을 확인할 수 있었다(도 3f). 한편, Rad51과 TEAD의 결합이 YAP에 의해 억제되었으며(도 3g), TEAD 1/2/4와 Ku70이 결합을 형성하였다(도 3h).
이상과 같이, 본 발명에서는 TEAD의 N-말단에서 결합하는 단백질들을 complex2라 새롭게 명명하고 이와 구별하기 위해 YAP/TAZ를 complex1으로 명명하였다(도 3i).
TEAD는 DNA 복제 스트레스(DNA replication fork stress)를 악화시켜 복제기점 붕괴(fork collapse)를 야기한다
TEAD가 없는 경우 DNA 복제 스트레스에 의한 손상이 현저히 감소되었으며(도 4a), 단일가닥 DNA 노출은 TEAD가 없는 경우 증가되어 있었다(도 4b). TEAD가 없는 경우 HU에 의한 RPA의 인산화가 ATR에 억제에 의해 복구되었다(도 4c). TEAD가 없는 경우 HU에 의한 DNA 복제 스트레스를 덜 받았고(도 4d), TEAD가 없는 경우 HU에 대한 세포 생존율이 증가하였으며(도 4e), 이러한 현상은 YAP/TAZ가 없는 세포(Molm14), YAP/TAZ가 억제되어 있는 세포(OCM1), YAP/TAZ가 활성화되어 있는 세포(211H), 그리고 YAP/TAZ가 없는 세포(H146)에서 모두 관찰되었다(도 4f-4g).
TEAD는 BRCA1을 억제하고 53BP1을 활성화시킴으로써 비상동 말단연결(NHEJ)을 촉진한다
CPT에 의한 DNA 이중가닥 절단을 복구하기 위해, TEAD가 있는 경우 53BP1을 통한 NHEJ를, TEAD가 없는 경우 BRCA1을 활성화시킴을 확인하였다(도 5a). TEAD가 없는 경우 HR에 필수적인 Rad51이 활성화되었으며(도 5b), 웨스턴 블롯 분석을 통해 DNA 이중가닥 절단을 복구할 때 TEAD가 없는 경우 HR 신호인 RPA의 인산화가 오래 유지됨을 확인하였다(도 5c). TEAD가 없는 경우 DNA가 중가닥 절단 시에도 생존율이 증가함을 확인하였으며(도 5d), NHEJ의 효율을 측정하는 EJ5-GFP 리포터 시스템과 HR의 효율을 측정하는 HR 리포터 시스템을 구축하여 TEAD가 억제되거나, 과발현되었을 때 NHEJ가 감소하고 HR이 증가하며, NHEJ가 증가하고 HR이 감소함을 확인하였다(도 5e). 유전자 편집효율(Gene editing efficiency)를 측정할 수 있는 mClover 리포터 시스템을 통해 TEAD가 없는 경우 HR을 통한 유전자 녹-인(knock-in) 효율이 증가함을 알 수 있었다(도 5f).
이상으로 본 발명의 특정한 부분을 상세히 기술하였는 바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 이러한 구체적인 기술은 단지 바람직한 구현예일 뿐이며, 이에 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백하다. 따라서, 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항과 그의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.
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Claims (13)

  1. TEAD(TEA domain) 단백질의 억제제를 유효성분으로 포함하는 상동 재조합 경로 결핍(Homologous recombination deficiency) 질환의 예방 또는 치료용 조성물로서;
    상기 TEAD 단백질 억제제는, TEAD 단백질의 N-말단에 결합하는 단백질인 complex2에 결합하여 TEAD-complex2의 형성을 저해하는 억제제인 것이고,
    상동 재조합 경로 결핍 질환은 상동 재조합 결핍성 종양, 판코니 빈혈(Fanconi anemia), 블루움 증후군(Bloom syndrome) 및 미세혈관 확장성 운동실조증(ataxia telangiectasia)으로 구성된 군으로부터 선택되는 것인,
    예방 또는 치료용 조성물.
  2. 제 1 항에 있어서, 상기 TEAD 단백질은 TEAD 1, TEAD 2 및 TEAD 4로 구성된 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 조성물.
  3. 제 1 항에 있어서, 상기 TEAD 단백질의 억제제는 서열목록 제1서열, 제2서열 및 제4서열 중 하나 이상의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩타이드에 특이적으로 결합하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편; 또는 서열목록 제1서열, 제2서열 및 제4서열 중 하나 이상의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩타이드에 특이적으로 결합하는 앱타머인 것을 특징으로 하는 조성물.
  4. 제 1 항에 있어서, 상기 TEAD 단백질의 억제제는 서열목록 제1서열, 제2서열 및 제4서열 중 하나 이상의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩타이드를 인코딩하는 뉴클레오타이드의 발현을 억제하는 핵산 분자인 것을 특징으로 하는 조성물.
  5. 삭제
  6. 제 1 항에 있어서, 상기 상동 재조합 결핍성 종양은 상동 재조합 결핍성 유방암, 난소암, 복막암, 림프종, 다형성 교모세포종, 신경교육종, 성상세포종, 교모세포종, 수모세포종, 신경교종, 천막상 원시 신경외배엽 종양, 비정형 기형 횡문근양 종양, 맥락총 암종, 악성 신경절종, 대뇌 신경교종증, 수막종 및 부신경절종으로 구성된 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 조성물.
  7. 삭제
  8. 삭제
  9. 삭제
  10. 삭제
  11. 다음의 단계를 포함하는 상동 재조합 경로(Homologous recombination, HR) 촉진용 조성물 및 비상동 말단연결(non-homologous end joining, NHEJ) 억제용 조성물의 스크리닝 방법:
    (a) TEAD(TEA domain) 단백질 또는 이를 발현하는 세포; 및 PARP, Ku80, Ku70, Rad51, RPA1 및 RPA2로 구성된 군으로부터 선택되는 하나 이상의 단백질 또는 이를 발현하는 세포를 포함하는 생물학적 시료에 후보물질을 접촉시키는 단계; 및
    (b) 상기 시료 내 TEAD 단백질과 PARP, Ku80, Ku70, Rad51, RPA1 및 RPA2로 구성된 군으로부터 선택되는 하나 이상의 단백질 간의 결합을 측정하는 단계,
    상기 Rad51, RPA1, RPA2 결합이 감소된 경우, 상기 후보물질은 상동 재조합 경로 촉진용 조성물로 판정한다.
    반면에, 상기 PARP, Ku80, Ku70 결합이 감소된 경우, 상기 후보물질은 비상동 재조합 경로 억제용 조성물로 판정한다.
  12. 제 11 항에 있어서, 상기 TEAD 단백질은 TEAD 1, TEAD 2 및 TEAD 4로 구성된 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 방법.
  13. 제 11 항에 있어서, 상기 TEAD 단백질은 서열목록 제1서열, 제2서열 및 제4서열 중 하나 이상의 아미노산 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
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