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KR102813362B1 - 세포의 자동화 배양을 위한 시스템, 방법 및 장치 - Google Patents

세포의 자동화 배양을 위한 시스템, 방법 및 장치 Download PDF

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KR102813362B1
KR102813362B1 KR1020217001808A KR20217001808A KR102813362B1 KR 102813362 B1 KR102813362 B1 KR 102813362B1 KR 1020217001808 A KR1020217001808 A KR 1020217001808A KR 20217001808 A KR20217001808 A KR 20217001808A KR 102813362 B1 KR102813362 B1 KR 102813362B1
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South Korea
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cell culture
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cell
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culture vessel
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엠마누엘 나자렛
에릭 저비스
마틴 오’킨
캐릭 페리스
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스템셀 테크놀러지스 캐나다 인크.
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Abstract

본 발명은 세포의 자동화 배양을 위한 시스템 및 방법, 및 세포 배양물에서 하나 이상의 콜로니를 해리하기 위한 장치 및 방법을 설명한다. 자동화 시스템은 적어도 하나의 이미징 모듈, 피펫 모듈, 핸들링 모듈 및 선택적으로 스테이지 모듈을 포함한다. 상술된 모듈의 조정된 작동은 제1 시점 및 하나 이상의 후속 시점에서 캡처된 하나 이상의 이미지로부터 계산된 세포 배양물의 하나 이상의 특성에 기반하여 적어도 하나의 프로세서에 의해 달성된다. 장치는, 회전 가능한 드라이브에 연결된, 하나 이상의 충격 범퍼를 갖는 장착 표면, 드라이브에 의존적으로 또는 독립적으로 회전 가능한 플랫폼, 및 플랫폼에 연결되고 하나 이상의 충격 범퍼와 충돌 가능하여 플랫폼 상의 세포 배양 용기에서 세포 배양물에 해리력을 전달할 수 있는 하나 이상의 충격 브래킷을 포함한다.

Description

세포의 자동화 배양을 위한 시스템, 방법 및 장치
관련 출원에 대한 상호 참조
이 출원은 2018년 6월 19일자로 출원된 미국 임시 출원 제62/686,962호의 우선권을 주장하며, 이의 전체 내용은 참조에 의해 본원에 포함된다.
본 발명은 세포의 배양에 관한 것으로, 좀 더 구체적으로 세포의 자동화 배양에 관한 것이다.
무엇보다도, 세포 배양물의 유지는 배양 배지의 빈번한 교체, 세포 밀도 모니터링, 유지 또는 확장과 같은 다운스트림(downstream) 적용을 위한 계대(passaging) 또는 계대 배양(subculturing), 다운스트림 적용을 위한 배양된 세포의 수확을 관여시킬 수 있다.
실험실의 세포 배양 규모에 따라, 매일 매일의 세포 유지는 연구자나 기술자의 시간에 과도하게 부담이 될 수 있다. 또한, 단일 연구자나 기술자 또는 팀 구성원 간의 세포 배양 관행의 불일치는 생존력, 성장률, 표현형, 대사 등과 같은, 그러나 이에 한정되지 않은 차선의 세포 특성으로 이어질 수 있다. 또한, 정기적인 세포 배양은 관련된 연구자 또는 기술자 사이에서 반복적인 긴장 장애(strain disorder)를 일으킬 수 있다.
실험실의 세포 배양 규모가 반드시 크지 않은 경우, 배양된 세포의 다운스트림 적용은 또한 특정 세포 배양 관행을 지시할 수 있다. 예를 들어, 배양된 세포가 임상 적용에 사용되는 경우, 세포 배양과의 인간 접촉을 최소화하는 특정 레벨의 규제 준수가 필요할 수 있다. 또는 규정 또는 지침에 따라 공간과 시간 모두에서 세포 배양의 일관된 배양/계대 배양이 필요할 수 있다.
실제로, 세포의 자동화된 배양은 잠재적으로 다른 이점을 제공하면서 앞서 언급한 문제 중 일부를 해결할 수 있다.
줄기 세포를 포함 하나 이에 제한되지 않는, 선행 기술에 의해 해결되지 않은 세포 배양에 대한 자동화된 접근법의 일 양태는 한 계대에서 다른 계대로의 일관된 배양/계대 배양에 관한 것이다. 세포 배양/계대 배양의 다른 또는 관련된 도전은 세포 배양 용기의 다른 웰(well) 또는 다른 세포 배양 용기에서 세포의 다른 성장 역학으로부터 발생될 수 있다. 이러한 문제와 다른 문제는 일차 세포 또는 줄기 세포와 같은 민감한 세포 유형을 배양할 때 더욱 악화된다. 민감한 줄기 세포의 구체적인 예는 중간엽 줄기 세포(MSC: mesenchymal stem cell), 상피 줄기 세포, 신경 줄기 세포, 배아 줄기 세포(ESC: embryonic stem cell) 및 유도 다능성 줄기 세포(iPSC: induced pluripotent stem cell)를 포함할 수 있다. ESC 및 iPSC는 다른 다능성 세포 유형 중에서 광범위하게 다능성 줄기 세포(PSC)라고 지칭될 수 있다.
PSC는 조밀하게 부착된 콜로니(colony) 또는 최대 수천 개의 세포 집합체로 성장하는 경향이 있다. 특정 가시적, 형태학적 또는 표현형 단서에 따라, 연구원 또는 기술자는 PSC 배양의 세포를 계대 배양하기를 원할 것이다. 실제로, 마우스(mouse) PSC는 단일 PSC로 완전히 해리된 후 또는 후속 배양에서 새로운 콜로니 형성에 거의 또는 전혀 영향을 미치지 않는 덩어리(clump)로 계대 배양될 수 있다. 대조적으로, 인간 PSC는 예를 들어, 핵형 불안정성으로 인해 단일 PSC로 완전히 분리될 때 후속 배양에서 제대로 수행되지 않는 경향이 있다. 오히려, 인간 PSC는 계대 배양 전에 PSC의 작은 수(약 5개 이상)의 덩어리로 분리될 때 더 잘 수행되는 경향이 있다.
계대의 시기와 같은 배양 조건이 세포 배양의 특성에 영향을 미치고 따라서 다운스트림 적용에서 그 유용성에 영향을 미친다는 것은 잘 알려져 있다. 전술된 내용은 다운스트림 응용분야에서 결과의 재현성을 확신하기 위해 일관된 세포 배양 관행의 중요성을 강조한다. 따라서 연구자나 기술자에게 가장 편리한 시점이 아닌 최적의 시점에 세포 배양물을 계대시키는 것이 중요하다. 일부가 상술된 PSC와 같은 줄기 세포를 포함하나 이에 국한되지 않는 세포 배양/계대 배양의 복잡성을 고려하여, 후속 계대에서 일관된 자손 배양을 얻기 위해 적응적으로 배양하고 세포를 계대할 수 있는 자동화된 세포 배양 시스템에 대한 요구가 있다.
본 발명은 세포 배양물을 배양하기 위한 시스템 및 방법을 제공하는 것을 목적으로 한다. 특정 실시예에서, 세포의 배양물은 다능성(pluripotent) 줄기 세포일 수 있고, 선택적으로 인간 다능성 줄기 세포일 수 있다. 보다 특정한 실시예에서, 인간 다능성 줄기 세포와 같은 세포의 배양은 세포의 부착된 배양물로서 배양될 수 있다. 본 발명은 또한 다능성 줄기 세포와 같은 세포의 배양을 계대 또는 확장하기 위한 시스템 및 방법을 제공하는 것을 목적으로 한다. 일부 실시예에서, 시스템 및 방법은 자동화된다.
하나의 넓은 양태에서, 세포 배양 용기 내의 세포 배양 배지에서 세포 배양을 적응적으로 계대하기 위한 자동화 시스템이 본원에 기술되어 있다. 자동화 시스템은 제1 시점 및 하나 이상의 후속 시점에서 상기 세포 배양물의 하나 이상의 이미지를 캡처하기 위한 이미징 모듈, 하나 이상의 피펫(pipette)의 단부와 결합 가능한 피펫 팁(tip)을 통해 상기 세포 배양 용기로부터 유체를 끌어 들이기 위한 상기 하나 이상의 피펫을 갖는 피펫 모듈, 상기 피펫 모듈로부터 이격되고, 둘 이상의 용액 리저버(reservoir)와 유체 연통되는 액체 디스펜서(dispenser) 모듈, 상기 자동화 시스템 내에서 상기 세포 배양 용기나 이의 뚜껑, 또는 딸 세포 배양 용기나 이의 뚜껑을 잡고 운반하기 위한 한 쌍의 대향 가능한 아암(opposable arm)을 갖는 핸들링 모듈, 및 상기 이미징 모듈, 상기 피펫 모듈, 상기 액체 디스펜서 모듈 및 상기 핸들링 모듈과 통신하는 적어도 하나의 프로세서를 포함한다. 상기 프로세서는, 상기 이미징 모듈로부터 상기 하나 이상의 이미지를 수신하고, 상기 이미징 모듈로부터 수신된 상기 하나 이상의 이미지에 기반하여, 상기 세포 배양물의 하나 이상의 특성을 계산하고, 상기 세포 배양물을 계대시키게끔 자동화된 계대 프로토콜을 실행하도록 구성되며, 상기 프로토콜은, 상기 세포 배양물의 상기 계산된 하나 이상의 특성을 상기 하나 이상의 특성에 대한 학습된 임계 레벨; 또는 상기 하나 이상의 특성에 대한 입력된 임계 레벨과 비교하는 것에 기반하여, 상기 피펫 모듈, 상기 액체 디스펜서 모듈 및 상기 이미징 모듈의 작업을 조정하는 것을 포함한다.
일부 실시예에서, 하나 이상의 특성은: 상기 세포 배양물의 컨플루언스(confluence)의 측정치; 상기 세포 배양물의 콜로니(colony) 또는 세포의 형태의 측정치; 상기 세포 배양물의 콜로니 또는 세포의 분화의 측정치; 상기 세포 배양물의 콜로니 크기 분포의 측정치; 상기 제1 시점으로부터 상기 하나 이상의 후속 시점까지 a), b), c) 또는 d)의 변화의 측정치; 또는 b), c) 또는 d)에 대한 a)의 측정치, a), c) 또는 d)에 대한 b)의 측정치, a), b) 또는 d)에 대한 c)의 측정치, 또는 a), b) 또는 c)에 대한 d)의 측정치를 포함할 수 있다.
일부 실시예에서, 상기 학습된 또는 상기 입력된 임계 레벨은: a)의 경우, 세포 또는 콜로니 컨플루언스에 대해 약 30 내지 90%; b)의 경우, 대조군 배양물의 약 ±30%; c)의 경우, 유지 프로토콜에서 대조군 배양물의 약 0 내지 30% 또는 분화 프로토콜에서 대조군 배양물의 약 50% 내지 100%; 또는 d)의 경우, 대조군 배양물의 평균 콜로니 크기 분포의 약 15% 이내 또는 이의 하위분획(subfraction)으로 한다.
일부 실시예에서, 상기 세포 배양 용기에서의 상기 세포 배양물 및 제2 세포 배양 용기에서의 제2 세포 배양물에 대해 계산된 상기 하나 이상의 특성이, 상기 제1 시점에서, 또는 상기 하나 이상의 후속 시점에서 상이하고, 상기 하나 이상의 특성은 후속 계대 동안 더 일관성이 있게 된다.
일부 실시예에서, 상기 이미징 모듈은 상기 배양 용기 내의 단일 세포를 분해할 수 있는 카메라를 포함한다.
일부 실시예에서, 상기 세포 배양 용기를 지지하기 위한 스테이지(stage) 모듈을 더 포함한다.
일부 실시예에서, 상기 스테이지 모듈은 제1 축선 또는 제2 축선, 또는 둘 모두를 따라 제1 평면에서 이동 가능하다.
일부 실시예에서, 상기 스테이지 모듈 또는 이의 하위 구성요소는 제3 축선을 따른 이의 에지(edge)를 중심으로 피벗(pivot)된다.
일부 실시예에서, 상기 하나 이상의 피펫이 캐리지(carriage)에 부착된다.
일부 실시예에서, 상기 액체 디스펜서 모듈은 둘 이상의 도관을 포함하고, 각각의 도관은 둘 이상의 용액 리저버 중 별도의 하나와 유체 연통된다.
일부 실시예에서, 상기 액체 디스펜서 모듈은 제1 용액의 리저버와 유체 연통되는 제1 도관, 및 제2 용액의 리저버와 유체 연통되는 제2 도관을 포함하고, 상기 제1 용액 및 상기 제2 용액은 딸 세포 배양 용기에 동시에 분배된다.
일부 실시예에서, 각각의 도관은 재사용 가능하거나 교체 가능하다.
일부 실시예에서, 상기 시스템은 적어도 상기 이미징 모듈, 피펫 모듈, 액체 디스펜서 모듈, 스테이지 모듈 및 핸들링 모듈을 하우징(housing)하는 인클로저(enclosure)를 더 포함한다.
일부 실시예에서, 상기 인클로저는 멸균이다.
일부 실시예에서, 상기 시스템은 둘 이상의 용액 리저버 및 물 리저버 중 하나 이상을 저장하기 위한 냉동 모듈을 더 포함하되, 상기 둘 이상의 용액 리저버, 상기 냉동 모듈 및 상기 폐기물 리저버는 상기 인클로저의 외부에 있다.
일부 실시예에서, 상기 폐기물 리저버는 상기 인클로저 내의 폐기물 트로프(trough)와 유체 연통된다.
일부 실시예에서, 상기 폐기물 트로프는 소수성 코팅물로 코팅된다.
일부 실시예에서, 상기 시스템은 하나 이상의 센서를 더 포함하되, 상기 하나 이상의 센서는 상기 이미징 모듈 상의, 상기 스테이지 모듈 상의, 또는 둘 이상의 용액 리저버 내에서 로드(load)의 질량을 검출하고 보고하도록 구성되어: 상기 이미징 모듈 상의, 상기 스테이지 모듈 상의 또는 상기 둘 이상의 용액 리저버 내의 로드(load)의 질량을 검출하고; 상기 로드의 질량이 예상과 다를 때 경고를 트리거(trigger)한다.
일부 실시예에서, 상기 시스템은 상기 인클로저와 인큐베이터 모듈을 연결하고 상기 세포 배양 용기를 상기 인큐베이터 모듈로부터 상기 핸들링 모듈의 부근으로 운반하기 위한 폐쇄된 컨베이어 모듈을 더 포함한다.
일부 실시예에서, 상기 인큐베이터 모듈은 상기 세포 배양물을 위한 허용 환경 조건을 유지한다.
일부 실시예에서, 상기 시스템은 그래픽 사용자 인터페이스를 더 포함한다.
일부 실시예에서, 상기 그래픽 사용자 인터페이스는 상기 둘 이상의 용액 리저버 각각에 대한 유체 레벨 보고를 디스플레이한다.
다른 넓은 양태에서, 세포 배양 용기 내의 세포 배양 배지에서 다능성 줄기 세포의 부착된 배양물을 적응적으로 계대하기 위한 자동화 시스템이 본원에서 설명된다. 자동화 시스템은 제1 시점 및 하나 이상의 후속 시점에서 상기 세포 배양물의 하나 이상의 이미지를 캡처하기 위한 이미징 모듈, 하나 이상의 피펫(pipette)의 단부와 결합 가능한 피펫 팁(tip)을 통해 상기 세포 배양 용기로부터 유체를 끌어 들이기 위한 상기 하나 이상의 피펫을 갖는 피펫 모듈, 상기 피펫 모듈로부터 이격되고, 둘 이상의 용액 리저버(reservoir)와 유체 연통되는 액체 디스펜서(dispenser) 모듈, 상기 자동화 시스템 내에서 상기 세포 배양 용기나 이의 뚜껑, 또는 딸 세포 배양 용기나 이의 뚜껑을 잡고 운반하기 위한 한 쌍의 대향 가능한 아암(opposable arm)을 갖는 핸들링 모듈, 및 상기 이미징 모듈, 상기 피펫 모듈, 상기 액체 디스펜서 모듈 및 상기 핸들링 모듈과 통신하는 적어도 하나의 프로세서를 포함한다. 상기 프로세서는, 상기 이미징 모듈로부터 상기 하나 이상의 이미지를 수신하고, 상기 이미징 모듈로부터 수신된 상기 하나 이상의 이미지에 기반하여, 상기 세포 배양물의 하나 이상의 특성을 계산하고, 상기 세포 배양물을 계대시키게끔 자동화된 계대 프로토콜을 실행하도록 구성되며, 상기 프로토콜은, 상기 세포 배양물의 상기 계산된 하나 이상의 특성을 상기 하나 이상의 특성에 대한 학습된 임계 레벨; 또는 상기 하나 이상의 특성에 대한 입력된 임계 레벨과 비교하는 것에 기반하여, 상기 피펫 모듈, 상기 액체 디스펜서 모듈 및 상기 이미징 모듈의 작업을 조정하는 것을 포함한다.
다른 넓은 양태에서, 세포 배양물을 적응적으로 계대하기 위한 자동화 방법이 본원에 기술된다. 상기 방법은: 세포 배양 용기 내의 세포 배양 배지에 상기 세포 배양물을 제공하는 단계; 제1 시점 및 하나 이상의 후속 시점에서 상기 세포 배양물의 하나 이상의 이미지를 이미징 모듈에 의하여 캡처하는 단계; 상기 하나 이상의 이미지에 기반하여 상기 이미징 모듈에 통신적으로 결합된 적어도 하나의 프로세서에 의해 세포 배양물의 하나 이상의 특성을 계산하는 단계; 및 상기 계산된 세포 배양물의 하나 이상의 특성을 상기 하나 이상의 특성에 대한 학습된 임계 레벨; 또는 상기 하나 이상의 특성에 대한 미리 결정된 임계 레벨과 비교하는 단계에 기반하여 자동화된 계대 프로토콜을 적어도 하나의 프로세서에 의해 실행하는 단계를 포함한다.
일부 실시예에서, 상기 세포 배양물을 제공하는 단계는 인큐베이터로부터 세포 배양물을 전달하는 단계를 포함한다.
일부 실시예에서, 상기 방법은 상기 세포 배양 용기를 스테이지 모듈 상에 위치시키는 단계를 더 포함한다.
일부 실시예에서, 상기 방법은 세포 배양물로부터 세포의 현탁액을 수득하는 단계, 및 딸 세포 배양 용기의 세포 현탁액의 일부 또는 전부를 시딩(seeding)하는 단계를 더 포함한다.
일부 실시예에서, 상기 딸 세포 배양 용기에 시딩하는 단계 전에, 상기 세포 현탁액이 제1 피펫 팁을 통과하여, 상기 세포 배양물을 단일 세포 현탁액 안으로, 또는 평균 직경이 상기 제1 피펫 팁의 보어(bore) 직경을 초과하지 않는 복수의 덩어리로 해리시킨다.
일부 실시예에서, 상기 세포 현탁액을 수득하는 단계는 상기 세포 배양 용기로부터 상기 세포 배양 배지를 흡인하는 단계, 및 상기 세포 배양 용기 내의 상기 세포 배양물을 분리 용액과 접촉시키는 단계를 포함한다.
일부 실시예에서, 상기 분리 용액이 분획 용액이고, 상기 분획 용액이 상기 세포 배양 용기의 벽으로부터 분화된 세포의 제1 집단 또는 미분화 세포의 제2 집단을 선택적으로 분리한다.
일부 실시예에서, 상기 방법은 상기 세포 현탁액을 시딩하는 단계 전에, 제1 용액 및 제2 용액을 상기 딸 세포 배양 용기에 동시에 분배하는 단계를 더 포함한다.
일부 실시예에서, 상기 제1 용액이 상기 세포 배양 배지이고, 상기 제2 용액이 용해된 세포외 매트릭스(extracellular matrix)이다.
일부 실시예에서, 상기 세포 배양물은 다능성 줄기 세포이다.
일부 실시예에서, 상기 다능성 줄기 세포는 인간 다능성 줄기 세포이다.
일부 실시예에서, 상기 다능성 줄기 세포는 덩어리로서 계대된다.
다른 넓은 양태에서, 다능성 세포의 부착된 배양물을 적응적으로 계대하기 위한 자동화 방법이 본원에 기술된다. 상기 방법은: 세포 배양 용기 내의 세포 배양 배지에 상기 세포 배양물을 제공하는 단계; 제1 시점 및 하나 이상의 후속 시점에서 상기 세포 배양물의 하나 이상의 이미지를 이미징 모듈에 의하여 캡처하는 단계; 상기 하나 이상의 이미지에 기반하여 상기 이미징 모듈에 통신적으로 결합된 적어도 하나의 프로세서에 의해 세포 배양물의 하나 이상의 특성을 계산하는 단계; 및 상기 계산된 세포 배양물의 하나 이상의 특성을 상기 하나 이상의 특성에 대한 학습된 임계 레벨; 또는 상기 하나 이상의 특성에 대한 미리 결정된 임계 레벨과 비교하는 단계에 기반하여 자동화된 계대 프로토콜을 적어도 하나의 프로세서에 의해 실행하는 단계를 포함한다.
일부 실시예에서, 상기 방법은 상기 세포 배양 용기로부터 상기 세포 배양 배지를 흡인하는 단계 및 세포 현탁액을 생성(yield)하도록 상기 세포 배양 용기 내의 다능성 줄기 세포의 부착된 배양물을 분리 용액과 접촉시키는 단계를 더 포함한다.
일부 실시예에서, 상기 분리 용액은 상기 세포 배양 용기의 벽으로부터 선택적으로 분리된 분화된 세포의 제1 집단 또는 미분화 세포의 제2 집단으로서 세포 현탁액을 생성하는 분획화 용액이다.
일부 실시예에서, 상기 세포 현탁액은 상기 세포 현탁액이 통과하는 제1 피펫 팁의 보어 직경을 초과하지 않는 평균 직경을 갖는 다능성 줄기 세포의 덩어리를 포함한다.
일부 실시예에서, 상기 방법은 상기 세포 현탁액을 딸 배양 용기에 시딩하는 단계를 더 포함한다.
일부 실시예에서, 상기 방법은 상기 세포 현탁액을 시딩하는 단계 전에, 제1 용액 및 제2 용액을 상기 딸 배양 용기에 동시에 분배하는 단계를 더 포함한다.
일부 실시예에서, 상기 제1 용액이 상기 세포 배양 배지이고, 상기 제2 용액이 용해된 세포외 매트릭스(extracellular matrix)이다.
다른 넓은 양태에서, 세포 배양물에서 하나 이상의 콜로니를 해리하기 위한 방법이 제공된다. 상기 방법은: 이 발명에 따른 장치를 제공하는 단계; 상기 장치의 플랫폼상의 분리 용액에 노출된 하나 이상의 배양 세포 콜로니를 담고있는 세포 배양 용기를 위치시키는 단계; 상기 드라이브의 영향 하에서 플랫폼을 회전시키는 단계; 및 상기 장치의 하나 이상의 충격 브래킷과 상기 장치의 하나 이상의 충격 범퍼를 반복적으로 충돌시키는 단계를 포함하되, 상기 하나 이상의 충격 브래킷은 상기 플랫폼에 결합되어, 상기 플랫폼 및 이 위에 있는 상기 세포 배양 용기에 힘을 전달하여 세포 배양물에서 하나 이상의 콜로니를 해리시킨다.
일부 실시예에서, 상기 방법은 세포 배양물을 플랫폼에 고정시키는 단계를 추가로 포함할 수 있다.
일부 실시예에서, 상기 플랫폼을 회전시키는 단계는 시계 방향일 수 있다. 일부 실시예에서, 상기 플랫폼을 회전시키는 단계는 반시계 방향일 수 있다.
일부 실시예에서, 상기 방법은 시계 방향과 반시계 방향 사이에서 상기 드라이브의 진동 회전을 더 포함할 수 있다. 구체적인 실시예에서, 진동은 시계 방향과 반시계 방향으로 회전하는 사이에 5 초 미만의 지연을 포함할 수 있다. 좀 더 구체적인 실시예에서, 진동은 시계 방향과 반시계 방향으로 회전하는 사이에 1 초 미만의 지연을 포함할 수 있다. 여전히 좀 더 구체적인 실시예에서, 진동은 시계 방향과 반시계 방향으로 회전하는 사이에 약 0.5 밀리세컨드의 지연을 포함할 수 있다.
일부 실시예에서, 하나 이상의 배양된 세포의 콜로니는 세포 배양 용기의 웰(well) 바닥에 직접 또는 간접적으로 부착될 수 있다.
일부 실시예에서, 상기 배양된 세포의 하나 이상의 콜로니는 다능성 줄기 세포의 배양물에서 하나 이상의 미분화된 콜로니일 수 있다.
다른 넓은 양태에서, 다능성 줄기 세포를 계대하기 위한 자동화 시스템이 제공된다. 시스템은: 하나 이상의 세포 배양 용기를 지지하기 위한 스테이지 모듈; 세포 배양 용기 핸들링 모듈; 피펫 모듈; 상기 피펫 모듈로부터 이격되고, 둘 이상의 용액 리저버와 유체 연통되는 액체 디스펜서 모듈; 제1항 내지 제14항 중 어느 한 항의 장치에 따른 해리 모듈; 폐기물 리저버; 및 상기 자동화 시스템의 모듈 각각의 작동을 조정하기 위한 컨트롤러을 포함한다.
일부 실시예에서, 상기 스테이지 모듈은 상기 플랫폼을 포함할 수 있으며, 상기 플랫폼 또는 이의 하위 구성요소는 이동 가능할 수 있다. 일부 실시예에서, 상기 플랫폼 또는 이의 하위 구성요소는 제1 평면에서 이동 가능하다. 일부 실시예에서, 상기 플랫폼 또는 이의 하위 구성요소는 제1 축선 및 제2 축선을 따른 경로에서 이동 가능할 수 있다. 일부 실시예에서, 상기 플랫폼 또는 이의 하위 구성요소는 또한, 제3 축선을 따른 경로에서 이동될 수 있다.
일부 실시예에서, 상기 핸들링 모듈은 한 쌍의 대향 가능한 아암을 포함할 수 있다.
일부 실시예에서, 상기 피펫 모듈은 하나 이상의 피펫을 포함할 수 있고, 피펫 각각의 단부는 일회용 피펫 팁과 결합될 수 있다.
일부 실시예에서, 상기 피펫 모듈과 상기 핸들링 모듈은 모두 이동 가능한 유닛에 포함된다.
일부 실시예에서, 상기 액체 디스펜서 모듈은 둘 이상의 라인을 포함하고, 각각의 라인은 둘 이상의 용액 리저버 중 별도의 하나와 유체 연통된다. 일부 실시예에서, 상기 둘 이상의 라인 중 라인 각각은 재사용 가능할 수 있다. 일부 실시예에서, 상기 둘 이상의 라인 중 라인 각각은 교체 가능할 수 있다.
일부 실시예에서, 상기 시스템은 이미징 모듈을 추가로 포함할 수 있으며, 상기 이미징 모듈은 하나 이상의 배양 용기의 웰에서 단일 세포를 분해할 수 있는 카메라를 포함한다. 일부 실시예에서, 상기 이미징 모듈은 상기 하나 이상의 배양 용기의 웰에서 다능성 줄기 세포 배양물의 특성을 조사하기 위한 이미지 프로세서를 포함할 수 있다.
일부 실시예에서, 상기 시스템은 인큐베이터 모듈을 더 포함할 수 있으며, 여기서 상기 인큐베이터 모듈은 다능성 줄기 세포의 배양을 위한 허용 환경 조건을 유지한다.
일부 실시예에서, 상기 시스템은 하나 이상의 세포 배양 용기를 상기 인큐베이터로부터 상기 핸들링 모듈의 부근으로 운반하기 위한 컨베이어 모듈을 추가로 포함할 수 있다.
일부 실시예에서, 상기 시스템은 하나 이상의 용액 리저버 중 하나 이상을 저장하기 위한 냉동 모듈을 더 포함할 수 있다.
일부 실시예에서, 상기 시스템은 적어도 스테이지 모듈, 핸들링 모듈, 피펫 모듈 및 볼텍스(vortex) 모듈을 위한 하우징을 더 포함할 수 있다.
일부 실시예에서, 더 많은 용액 리저버, 냉각 모듈 및 폐기물 리저버는 상기 하우징 외부에 있다.
일부 실시예에서, 상기 시스템은 그래픽 사용자 인터페이스를 더 포함할 수 있다. 일부 실시예에서, 상기 그래픽 사용자 인터페이스는 상기 둘 이상의 용액 리저버 각각에 대한 유체 레벨 보고를 디스플레이할 수 있다.
다른 넓은 양태에서, 세포의 자동 계대를 위한 방법이 제공된다. 상기 방법은: 본원에 개시된 시스템을 제공하는 단계; 핸들링 모듈을 사용하여 스테이지 모듈 상에 세포의 제1 세포 배양 용기를 위치시키는 단계; 피펫 모듈을 사용하여 제1 세포 배양 용기의 웰로부터 배양 배지를 흡인하는 단계; 액체 디스펜서 모듈을 사용하여 해리 용액을 제1 세포 배양 용기의 웰 안으로 분배하는 단계; 해리 모듈을 이용하여 상기 제1 세포 배양 용기의 웰 바닥으로부터 세포 콜로니를 탈착하는 단계; 탈착된 세포 콜로니를 세포 현탁액 안으로 해리시키는 단계; 및 피펫 모듈을 사용하여 제2 세포 배양 용기의 웰 안으로 일 체적의 세포 현탁액을 시딩하는 단계를 포함한다.
일부 실시예에서, 상기 방법은 컨베이어 모듈을 사용하여, 포지셔닝 단계 전에 제1 세포 배양 용기를 인큐베이터 모듈로부터 전달하는 단계를 추가로 포함할 수 있다.
일부 실시예에서, 상기 방법은 스테이지 모듈을 사용하여, 흡인 단계 전에 제1 세포 배양 용기를 틸팅(tilting)하는 단계를 추가로 포함할 수 있다.
일부 실시예에서, 상기 방법은 흡인 단계 후에, 액체 디스펜서 모듈을 사용하여 분배된 세척 완충액으로 제1 세포 배양 용기의 웰을 세척하는 단계를 추가로 포함할 수 있다.
일부 실시예에서, 상기 방법은 분배 단계 후에, 인큐베이터 모듈에서 제1 세포 배양 용기를 인큐베이트하는 단계를 추가로 포함할 수 있다.
일부 실시예에서, 상기 방법은 탈착된 세포 콜로니를 세포 현탁액 안으로 분쇄하는 단계를 추가로 포함할 수 있다.
일부 실시예에서, 상기 방법은 핸들링 모듈을 사용하여, 시딩 단계 전에, 스테이지 모듈 상에 제2 세포 배양 용기를 위치시키는 단계를 추가로 포함할 수 있다.
일부 실시예에서, 상기 방법은 컨베이어 모듈을 사용하여 제2 세포 배양 용기를 인큐베이터 모듈로 전달하는 단계를 추가로 포할할 수 있다.
본 발명의 다른 특징 및 이점은 다음의 상세한 설명으로부터 명백해질 것이다. 그러나, 상세한 설명 및 구체적인 예시가 본 발명의 바람직한 실시예를 나타내지만, 본 발명의 범위와 사상 내에서 다양한 변경 및 수정이 기술 분야에서 숙련된 자들에게 이 상세한 설명으로부터 명확하게 될 것이기 때문에, 단지 도해의 방식으로 제공된다는 점이 이해되어야 한다.
본원에 설명된 다양한 실시예의 더 나은 이해를 위해, 그리고 이러한 다양한 실시예가 어떻게 실행될 수 있는지를 더 명확하게 보여주기 위해, 예로서, 적어도 하나의 예시적인 실시예가 도시되고 이제 설명되는 첨부된 도면이 참조될 것이다. 도면은 본원에 설명된 교시의 범위를 제한하려는 것이 아니다.
도 1은 세포 배양물을 계대하기 위한 자동화 시스템의 일 실시예의 평면도를 도시한다. 선택적 요소는 파선으로 도시된다.
도 2는 본원에 설명된 자동화 시스템에서 사용되는 이미징 모듈의 일 실시예의 측면도를 도시한다.
도 3은 본원에 설명된 자동화 시스템에서 사용되는 캐리지의 일 실시예의 정면도(a) 및 본원에 설명된 자동화 시스템의 일 실시예의 측면도(b)를 도시한다.
도 4는 (a) 세포의 라이브 배양물의 다른 시점에서 이미징 모듈을 사용하여 캡처된 대표적인 이미지, 및 (b) 세포를 그레이로 하여 영역을 나타내는 도 4a에 도시된 라이브 세포 이미지의 해당 변형된 표현을 도시한다. 주석으로 표시된 바와 같이, Day 2, Day 3, Day 4, Day 5, Day 6, 및 Day 7에 대한 이미지가 도시된다.
도 5는 세포 배양물의 컨플루언시가 이미징 모듈에 의해 캡처된 하나 이상의 이미지에 기반하여 결정될 수 있다는 점을 도시한다. (a) 온보드 이미징 모듈을 사용하여 세포의 라이브 세포 이미지 배양물의 컨플루언시와 훽스트(Hoechst)를 사용하여 염색되고 형광 현미경을 사용하여 이미지화된 (훽스트 33258, 352 nm 여기, 461 nm 방출) 세포 배양물에 대한 대응되는 변환된 표현의 시각적 비교. (b) 이미징 모듈 웰을 사용하는 세포의 라이브 세포 이미징 194 배양물 또는 동일한 194 배양물을 훽스트- 염색하여 결정된 % 컨플루언시의 회귀 분석. 각 점은 하나의 세포 배양 용기(즉, 6-웰 플레이트의 웰)를 나타낸다. (c) 연속 계대에 걸쳐 다양한 표시된 조건 하에서 배양된 다양한 표시된 세포 유형 중 하나의 웰의 % 컨플루언시의 결정을 요약한 차트. 다양한 표시된 조건은 Gentle Cell Dissociation Reagent (GCDR TM) (STEMCELL Technologies) 또는 ReLeSR TM (STEMCELL Technologies) 기반 덩어리 생성, TeSR-E8 TM (STEMCELL Technologies) 또는 mTeSR1 TM (STEMCELL Technologies) 유지 배지, iPS 또는 ES 세포주 및 다양한 세포주를 포함한다.
도 6은 둘 이상의 시점에 대한 % 컨플루언시 결정이 이용될 수 있는 다양한 방식을 도시한다. (a)는 6 개의 세포 배양 (즉, 6 웰 플레이트의 각 웰)의 % 컨플루언시가 지수 성장 모델에 맞는 그래프를 도시한다. (b) % 컨플루언시 및 지수 피팅이 F016 세포의 162 배양에 대한 분열 시간을 계산하기 위해서 사용될 수 있는 히스토그램을 도시한다(평균 = 33.1 시간, 표준 편차 ±7.2 시간). (c) H9 세포의 186 배양에 대한 분열 시간을 계산하기 위해 % 컨플루언시 및 지수 피팅을 사용할 수 있는 히스토그램을 도시한다(평균 = 37.9 시간, 표준 편차 ±14.9 시간). (d) 예측된 7 일 컨플루언시 및 실제 7-일 컨플루언시의 회귀 분석을 도시한다(R2 = 0.95). 예측된 7 일 컨플루언시는 (a)에서와 같이 2 일 내지 6 일 % 컨플루언시 데이터를 지수 성장 모델에 피팅하여 결정되었다.
도 7은 스프레이 계대 세포 및 단일 세포 계대 세포의 하나 이상의 이미지로부터 % 컨플루언시가 계산될 수 있음을 도시한다. (a)는 스프레이 계대 H9 세포의 6-웰 배양 플레이트의 웰 각각의 대표적인 이미지를 도시한다. (b)는 (a)에서 웰 각각의 대응하는 마스크 영역을 도시한다. (c)는 (b)에서 마스크된 영역의 이미지 분석 후 해당 % 컨플루언시 값을 도시한다. (d)는 단일 세포 계대 M001 세포의 6-웰 배양 플레이트의 웰 각각의 대표적인 이미지를 도시한다. (e)는 (d)에서 웰 각각의 대응하는 마스크 영역을 도시한다. (f)는 (e)에서 마스크된 영역의 이미지 분석 후 해당 % 컨플루언시 값을 도시한다.
도 8은, 훽스트 염색 프로토콜에 의해 동일한 세포 배양물에 대해 결정된 이미지 모듈 및 평균 콜로니 영역에 의해 캡처된 하나 이상의 이미지에 기반하여 계산된 24 웰(즉, 6 웰 플레이트의 각 웰)의 세포 배양물의 평균 콜로니 면적에 대한 회귀 분석을 도시한다(R2 = 0.86, p = 0.94).
도 9는, 이미징 모듈에 의해서 캡처된 하나 이상의 이미지 및 동일한 세포 배양물 내 실제 세포 수에 기반하여 계산되는 바와 같은, 24 개의 세포 배양물 내 총 강도(임의 단위)의 회귀 분석을 도시한다(R2 = 0.94, p < 0.0001). 총 강도는 이미지의 마스킹된 영역 내에 있는 픽셀 각각의 강도의 합으로 정의된다. 실제 세포 카운트를 생성하기 위해, 모든 세포가 배양 용기로부터 수확되었고, 단일 세포 현탁액을 생성하는 데 사용되었으며, 이 현탁액은 다음으로 카운트를 위해 샘플링되었다.
도 10은 이미징 모듈에 의해서 캡처된 일 세트의 이미지에 대해 적용된 기계 학습 알고리즘의 결과를 도시한다. (a) 자르기 후 이미징 모듈에 의해 캡처된 세포 배양물의 대표 이미지를 도시한다. (b)는 (a)에 표시된 대표 이미지의 배경(가장 어둡게), 분화(가장 밝음) 및 미분화(중간) 영역의 자동으로 분류된 영역의 오버레이(overlay)를 도시한다. (c)는 세 가지 분류 모델의 결과를 도시한다. 모델 3은 모든 픽셀을 가장 일반적인 클래스, 즉 미분화된 것으로 분류하고, 대조군으로서 포함된다.
도 11은 ReLeSRTM (STEMCELL Technologies)을 사용하여 자동화 계대 프로토콜 후 3 개의 다른 세포주의 배양물에 남아 있는 퍼센트 분화된 영역을 도시한다. 세포주 각각에 대해, 6개의 다른 웰이 신경형 콜로니, 섬유 아세포형 콜로니, 완전히 분화된 콜로니(전체) 및 복잡한 분화된 콜로니에 대해 평가되었다.
도 12는 그래프를 도시하며, 여기서 하나 이상의 이전 시점에서 세포 배양물의 % 컨플루언시의 계산은, 세포 배양물이 높은 시간적 해상도로 원하는 % 컨플루언시에 도달될 시간을 예측하기 위해서 사용될 수 있다. 각 라인은 서로 다른 세포 배양 용기(즉, 6-웰 플레이트의 웰)에 해당된다.
도 13은 3 연속 계대에서 1C 세포의 7 % 컨플루언시의 6-웰 플레이트의 6-웰 내 변동 계수의 도트 플롯을 도시한다. 계산된 % 컨플루언시에 기반하는 적응형 계대는 후속 시점에서 세포 배양물의 보다 일관된 % 컨플루언시로 이어질 수 있다. 쌍체 표본에 대한 Wilcoxon Signed-Rank 테스트에 기반하여, P1과 P2에 대조적으로, P0과 P2 사이의 변동 계수에서 유의한 차이가 관찰되지 않았다. P0에서 주어진 플레이트에 대한 모든 웰에 동일한 부피로 시딩되었다. P1에서, 웰은 1:25 내지 1:200 범위의 희석액을 사용하여 계대되어 COV가 증가되었다. P2에서, 적응형 계대를 위한 회귀 모델을 사용하여, 웰 각각에 대해 분할 비율이 선택되어 웰이 유사한 컨플루언시를 갖게끔 되돌릴 수 있도록 했다.
도 14는 본원에 설명된 자동화 시스템에서 사용되는 폐기물 트로프의 일 실시예의 사시도(a) 및 단면 사시도(b)를 도시한다.
도 15는 세포 배양물을 계대하기 위한 방법의 일 실시예의 흐름도를 도시한다.
도 16은 세포 배양물에 존재하는 하나 이상의 콜로니를 해리하기 위한 장치의 사시도를 도시한다.
도 17은 세포 배양물에 존재하는 하나 이상의 콜로니를 해리하기 위한 장치의 정면도를 도시한다.
도 18은 세포 배양물에 존재하는 하나 이상의 콜로니를 해리하기 위한 장치의 측면도를 도시한다.
도 19는 세포 배양물에 존재하는 하나 이상의 콜로니를 해리하기 위한 장치의 평면도를 도시한다. 설명을 위해 플랫폼은 도시되지 않았고, 플랫폼에 일반적으로 연결되는 충격 브래킷은 표시되어 있다.
다양한 시스템, 장치, 및 방법이 청구된 주제의 적어도 하나의 실시예의 일례를 제공하기 위해 아래에서 설명된다. 아래에 설명되는 어떠한 실시예도 임의의 청구된 주제를 제한하지 않고, 임의의 청구된 주제는 아래에서 설명되는 시스템, 장치, 및 방법과 상이한 것들을 커버할 수 있다. 청구된 주제는 아래에 설명된 하나의 시스템, 장치 또는 방법의 모든 특징부을 갖는 시스템, 장치 및 방법에, 또는 아래에 설명된 시스템, 장치 및 방법의 다수 또는 모두에 공통적인 특징부에 한정되지 않는다. 청구될 수 있는 주제는 청구범위 및 도면을 포함하여 이 문서의 어느 부분에 개시된 요소 또는 프로세스 단계의 임의의 조합 또는 하위 조합으로 존재할 수 있다. 따라서, 본원의 교시에 따라 개시된 시스템, 장치 또는 방법이 본원에 포함된 임의의 하나 이상의 특징부를 구현할 수 있다는 점, 및 특징부가 의도된 목적을 위해 물리적으로 실행 가능하고 실현 가능한 특정 조합 또는 하위 조합으로 사용될 수 있다는 점을 당업자는 이해할 것이다.
또한, 아래에 설명된 시스템, 장치 또는 방법이 청구된 주제의 실시예가 아닐 수 있다. 본 문서에서 청구되지 않은, 본원에서 설명된 시스템, 장치, 또는 방법에 개시된 임의의 주제는 또 다른 보호 수단 예를 들면, 계속 특허 출원의 주제일 수 있고, 출원인(들), 발명자(들) 및/또는 소유자(들)는 본 문서에서 그것의 개시에 의해 임의의 이러한 주제를 포기하거나, 부인하거나 또는 대중에게 헌정할 의도가 없다.
또한, 예시의 간결성 및 명료성을 위해, 적절한 것으로 고려되는 경우, 참조 부호가 대응하거나 유사한 요소를 나타내기 위해 도면들 가운데에서 반복될 수 있음이 이해될 것이다. 게다가, 다수의 특정 상세는 본원에서 설명된 예시적 실시예의 완전한 이해를 제공하기 위해 제시된다. 그러나, 본 명세서에서 설명된 예시적 실시예가 이러한 특정 상세 없이 실시될 수 있음이 당업자에 의해 이해될 것이다. 다른 예에서, 잘 알려진 방법, 절차 및 구성요소는 본 명세서에서 설명된 예시적 실시예를 모호하게 하지 않기 위해 상세하게 설명되지 않았다. 게다가, 설명은 본 명세서에서 설명된 예시적 실시예의 범위를 제한하는 것으로 간주되지 않을 것이다.
본 명세서에서 이용될 때 "실질적으로", "약" 및 "대략적으로"와 같은 정도의 용어는 결과가 크게 변경되지 않는 정도의 수식되는 용어의 합리적인 편차의 양을 의미한다는 점을 유의해야 한다. 이러한 정도의 용어는, 편차가 수식하는 용어의 의미를 무효로 하지 않는다면 수식되는 용어의 이 편차, 예를 들어, 1%, 2%, 5%, 또는 10%를 포함하는 것으로서 해석되어야 한다.
또한, 본원에서 종점에 의한 임의의 수치 범위의 인용은 그 범위 내에 포함된 모든 숫자 및 분수를 포함한다(예를 들어 1 내지 5는 1, 1.5, 2, 2.75, 3, 3.90, 4 및 5를 포함 함). 또한, 모든 숫자와 분수가 "약"이라는 용어에 의해 수정되는 것으로 추정되며, 이는, 최종 결과가 크게 변경되지 않은 경우, 참조되는 숫자의 특정 양, 예를 들어, 1%, 2%, 5%, 또는 10%까지 변동을 의미한다는 점이 이해될 것이다.
또한, 본 명세서에서 사용되는 "및/또는"이라는 용어는 "포괄하는 -또는"을 나타내는 것으로 의도된다는 점에 유의해야 한다. 즉, "X 및/또는 Y"는 예를 들면, X 또는 Y 또는 둘 모두를 의미하도록 의도된다. 또 다른 예로서, "X, Y, 및/또는 Z"는 X 또는 Y 또는 Z 또는 이들의 임의 조합을 의미하도록 의도된다.
본 발명은 세포 배양물에서 하나 이상의 콜로니를 배양하거나 해리하기 위한 시스템, 장치 및 방법을 설명한다. 특정 실시예에서, 세포의 배양물은 다능성 줄기 세포이고, 선택적으로 인간 다능성 줄기 세포이다. 좀 더 구체적인 실시예에서, 인간 다능성 줄기 세포와 같은 세포의 배양은 하나 이상의 콜로니를 인간 다능성 줄기 세포의 덩어리 또는 클러스터로 해리시키는 것을 포함한다. 본 발명은 또한, 장치 및/또는 방법을 세포의 배양을 계대하거나 또는 확장하기 위한 시스템 및 방법 안으로 통합하는 것을 설명한다. 특정 실시예에서, 시스템 및 방법은 자동화된다.
본원에 사용된 "계대(passaging)"는 세포 배양물이 계대되거나 또는 계대 배양될 수 있는 시점까지의 세포 배양 활동, 및 신선한 배양 배지로 세포 배양물의 일부 또는 전부를 하나 이상의 딸 세포 배양 용기에 시딩(seeding)하는 것을 포함하여, 세포 배양물을 계대하거나 또는 계대 배양하는 것과 관련된 활동을 의미한다. 따라서 계대라는 용어는, 세포 배양물의 계대 배양고 같은, 일상적인 세포 배양과 관련된 활동, 및 또한, 세포 배양물을 확장하거나, 수확하거나 (예를 들어, 냉동 보존을 위해서), 분화하거나, 또는 새로 유도된 세포주를 온보딩하는 것을 목표로 하는 워크 플로우를 포괄적으로 지칭한다. 일 실시예에서, 제1 세포 배양 용기에서 나온 일 부피의 세포 현탁액은 단 하나의 딸 세포 배양 용기 안으로 시딩될 수 있다(즉, 1:1 계대 배양). 일 실시예에서, 제1 세포 배양 용기에서 나온 일 부피의 세포 현탁액은 복수의 딸 세포 배양 용기 안으로 시딩될 수 있다(즉, 확장의 일 형태로 간주될 수 있는 1:n+1 계대).
본원에서 사용되는 경우, "세포 배양물"은 세포 배양 용기에서 배양, 계대 배양, 확장 또는 분화될 수 있는 모든 유형의 세포를 의미한다. 일 실시예에서, 세포는 조혈 줄기 세포 또는 이의 전구체와 같은 비부착(anchorage independent) 세포이다. 일 실시예에서, 세포는, 단층에서 배양되거나 세포의 부착 배양물로서 배양되는 것과 같은 부착식(anchorage dependent) 세포이다. 일 실시예에서,부착식 세포는 중간엽 줄기 세포이다. 일 실시예에서, 부착식 세포는 다능성 줄기 세포("PSC: pluripotent stem cell")이다. PSC는 배아 줄기 세포, 나이브(naive) 줄기 세포, 확장된 다능성 줄기 세포, 또는 유도된 다능성 줄기 세포일 수 있다.
본원에서 사용되는 경우, "세포 배양 용기" 또는 "딸 세포 배양 용기"는 세포 배양물을 지원하기 위해서 사용될 수 있는 컨테이너를 의미한다. 세포 배양 용기는 원형 접시와 같은 단일 플라스크 또는 접시일 수 있거나, 다수 웰 배양 플레이트일 수 있다. 세포 배양 용기가 멀티웰 배양 플레이트에 대응되는 경우, 각 웰, 일부 웰 또는 모든 웰이 세포 배양 용기로 간주될 수 있다. 구체적으로, 계대 방법을 수행한 후 새로운 세포 배양 용기에 세포의 배양물을 시딩한 후, 이러한 새로운 세포 배양 용기를 여기서 딸 세포 배양 용기라고 한다.
시스템
본 발명의 일 양태에서, 세포 배양물을 계대하기 위한 시스템이 설명된다. 일 실시예에서, 세포는 PSC이고, 더욱 구체적으로 세포는 인간 PSC일 수 있다. 일 실시예에서, 인간의 또는 다른 PSC는 세포의 부착된 배양물로서 배양되거나 계대된다. 인간 PSC와 같은 세포를 덩어리 또는 클러스터로 계대하는 것이 많은 응용분야에서 바람직하기 때문에, 이러한 세포를 계대하기 위한 자동화 시스템 및 방법은 이의 덩어리 계대에 적합할 수 있다.
일 실시예에서, 인간 다능성 줄기 세포와 같은 세포 배양물을 계대하기 위한 자동화 시스템(1)은, 이미징 모듈(100); 피펫 모듈(200); 액체 디스펜서 모듈(300); 하나 이상의 용액 리저버(350)(예를 들어 350a, 350b, 350c 등); 핸들링 모듈(400); 선택적으로 스테이지 모듈(500) 및 자동화 시스템의 모듈 각각의 작동을 조정하기 위한 프로세서(600)(도 1 및 도 3 참조)를 포함하여, 다양한 모듈을 포함한다.
이미징 모듈(100)은 일 실시예에서, 스테이지(110) 위에 위치될 수 있는 카메라(105)를 포함한다(도 2). 일 실시예에서, 카메라(105)는 스테이지(110) 상에서 고정되거나 이동 가능할 수 있다. 일 실시예에서, 카메라(105)는 스테이지(110) 아래에서 고정되거나 이동 가능할 수 있다. 세포 배양 용기가 스테이지(110) 상에 위치되는 경우, 카메라(105)는 제1 시점 및 하나 이상의 후속 시점에서 세포 배양 용기 내의 세포 배양물의 하나 이상의 이미지를 적절한 스케일 및 해상도로 캡처할 수 있다.
일 실시예에서, 카메라(105)의 렌즈(미도시)는 스테이지(110)의 평면에 대해 실질적으로 수평 방향으로 향하고, 세포 배양물의 하나 이상의 이미지는 반사 거울(120)에 의존하여 캡처된다(도 2 참조). 거울(120)은 카메라(105)의 렌즈로부터 적절한 거리에 위치되고, 또한 카메라(105)의 초점면에 물체 평면(즉, 세포 배양 용기 내의 세포 배양물)을 반사하기 위해 충분히 각을 이룬다. 일 실시예에서, 거울(120)의 각도(125)는 약 45°이다.
카메라(105)는 수십 개의 시점에 걸쳐 수천 개의 배양 용기에 대해 캡처될 수 있는 하나 이상의 이미지를 저장하기에 충분한 컴퓨터 판독 가능 메모리와 연관된다. 컴퓨터 판독 가능 메모리는 카메라(105)에 배치될 수 있고/있거나, 컴퓨터 판독 가능 메모리는 원격으로, 예를 들어, 개인용 컴퓨터 디바이스 내에 또는 클라우드(즉, 원격 서버) 상에 저장될 수 있다.
일 실시예에서 카메라(105)는 동영상 또는 정지 이미지를 캡처한다. 일 실시예에서 카메라(105)는 흑백(또는 그레이스케일) 또는 컬러 정지 이미지를 캡처한다. 일 실시예에서, 하나 이상의 이미지는 암시야 기술을 사용하여 캡처되며, 여기서 세포 배양물 주변의 필드는 일반적으로 어두운 반면, 세포 배양물은 샘플 콘트라스트(contrast)를 제공한다.
일 실시예에서, 카메라(105)는 세포를 배양하기 위해서 사용되는 세포 배양 용기의 영역을 이미지화할 수 있다. 이러한 일 실시예에서, 세포 배양 용기는 35 mm 접시 또는 100 mm 접시일 수 있다. 또한 이러한 일 실시예에서, 세포 배양 용기는 6-웰 플레이트일 수 있고, 카메라(105)는 6-웰 각각의 세포 배양 영역을 포함하는 단일 이미지를 캡처할 수 있다. 이러한 이미지는 있는 그대로 저장될 수 있거나, 예를 들어, 웰 각각의 잘린 이미지에 대응되는 서브세트로서 6개의 연관된 파일로 저장될 수 있다. 일 실시예에서, 6-웰 플레이트의 웰 각각에 대응되는 6개의 개별 이미지가 캡처될 수 있다. 당업자는 세포 배양 용기가 12-, 24-, 96- 또는 384-웰 플레이트와 같은, 그러나 이에 한정되지 않는, 임의의 형식일 수 있고, 어느 경우이든, 카메라(105)가 세포 배양 용기의 웰 각각을 포함하는 이미지(들)(또는 원하는 서브세트), 또는 웰 각각의 개별 이미지(또는 원하는 서브세트)를 캡처할 수 있다는 점을 이해할 것이다.
특정 실시예에서, 카메라(105)는 세포 배양 용기 또는 이의 웰 내의 단일 세포물을 분해할 수 있다. 이러한 실시예 또는 다른 실시예에서, 카메라(105)는 세포 배양 용기, 또는 이의 웰 내의 세포 배양물의 단일 콜로니를 분해할 수 있다. 카메라(105)는 전체 세포 배양 용기(또는 이의 웰)의 이미지를 캡처할 수 있으므로, 카메라(105)는 또한, 세포 배양 용기 내의 세포 배양물의 단일 세포 또는 콜로니 각각을 분해할 수 있다.
일부 실시예에서, 이미징 모듈(100)은 세포 배양 용기에서 PSC와 같은 세포 배양물의 하나 이상의 특성을 조사하기 위한 이미지 프로세서를 포함한다. 하나 이상의 특성의 조사를 통해서, 시스템(1)은, 배지 변경 프로토콜, 계대 프로토콜, 확장 프로토콜, 차별화 프로토콜, 또는 배양 종료 프로토콜과 같은 적절한 작업을 실행할 수 있다. 다른 실시예에서, 하나 이상의 특성을 조사하기 위한 프로세서는 이미징 모듈(100) 내에 포함되지 않고, 오히려 별도로, 예를 들어 컴퓨터 디바이스 내에 포함될 수 있는 중앙 집중식 프로세서 모듈 내에 포함될 수 있다. 따라서, 시스템(1)은 적어도 하나의 프로세서(아래에서 더 상세히 설명됨)를 포함할 수 있다.
일 실시예에서, 스테이지(110)는 그 위에 있는 세포 배양 용기의 존재 및 중량을 검출하고 보고하기 위한 하나 이상의 로드 셀을 포함한다. 따라서 하나 이상의 로드 셀은 작동 시작 여부에 대한 피드백을 시스템(1)에 제공할 수 있다. 예를 들어, 스테이지(110)로부터 세포 배양 용기의 부재는 이미징 작업이 실행되어서는 안 된다는 신호를 보낼 수 있다. 일 실시예에서, 하나 이상의 로드 셀은 적절한 부피의 용액이 세포 배양 용기에 추가되었는지 또는 이로부터 제거되었는지 여부를 확인한다. 일 실시예에서, 하나 이상의 로드 셀은 뚜껑이 세포 배양 용기로부터 제거되었는지 여부를 확인하기에 충분히 민감하다.
일 실시예에서, 스테이지(110)는 스테이지 모듈(500)과 분리되어 있다. 일 실시예에서, 스테이지(110)는 스테이지 모듈(500)의 하위 구성요소이다. 일 실시예에서, 스테이지(110) 및 스테이지 모듈(500)은 하나이고 동일하다.
시스템(1)은 또한, 피펫 모듈(200)을 포함한다. 피펫 모듈(200)은 하나 이상의 피펫의 단부와 결합 가능한 피펫 팁을 통해 세포 배양 용기로부터 유체, 예를 들어, 세포 배양 배지를 끌어 들이기 위한 하나 이상의 피펫을 포함한다. 피펫 모듈(200)은 또한, 하나 이상의 피펫 각각과 유체 연통하는, 세포 배양 용기로부터 유체를 끌어 당기기 위해 필요한 흡인을 생성하는 수단을 포함한다.
일 실시예에서, 피펫 모듈(200)의 하나 이상의 피펫은 이에 부착된 피펫 팁이 세포 배양 용기의 유체와 접촉되거나 접촉되지 않도록 하강되거나 올려질 수 있다. 일 실시예에서, 세포 배양 용기는 하나 이상의 피펫의 피펫 팁이 세포 배양 용기 내의 유체와 접촉되거나 접촉되지 않도록 올려지거나 하강될 수 있다.
하나 이상의 피펫이 수직 평면 내에서 올려지거나 하강되는 것에 상관없이, 피펫 모듈(200) 및 하나 이상의 피펫이 스테이지(110)의 수평면에 대해 x 또는 y 축 중 하나 또는 둘 모두를 따라 시스템(1) 내에서 이동되는 것이 또한 바람직할 수 있다. 이러한 실시예에서, 피펫 모듈(200)은, 예를 들어 피펫 모듈(200)의 부착에 의해, 이동 가능한 유닛(220)(또는 캐리지)에 포함될 수 있다(도 3). 일 실시예에서, 캐리지(220)는 시스템(1) 내에서 트래킹을 따라 이동될 수 있으며, 이 트래킹은 시스템(1)의 데크(227) 위에 현수되거나 고정(rooted)될 수 있다. 일 실시예에서, 캐리지(220)는 데크의 일측 또는 양측의 길이를 따라 또는 실질적으로 길이를 따라 이어질 수 있다. 이러한 캐리지는 본 기술분야에 알려져 있고, 예시적인 캐리지는 NimbusTM(Hamilton Company) 시스템을 포함한다.
일 실시예에서, 피펫 팁은 일회용이므로, 하나 이상의 피펫은 피펫 배출 메커니즘을 포함할 수 있다. 피펫 배출 메커니즘의 일 예시는 하나 이상의 피펫의 튜브형 본체 위로 슬라이딩되는 칼라(collar)를 포함하고, 칼라의 에지가 피펫 팁과 접촉될 때 튜브형 본체로부터 피펫 팁을 분리한다.
피펫 모듈(200)의 사용의 예시적인 예는: 세포 현탁액을 분쇄하는 것; 폐기물을 위한 세포 배양 용기로부터 액체를 흡인하는 것; 또는, 예를 들어, 자동화된 계대 프로토콜 동안 딸 세포 배양 용기가 세포로 시딩될 때, 세포 배양 용기의 유체의 일부 또는 전부를 딸 세포 배양 용기로 옮기는 것을 포함할 수 있지만, 이에 한정되지 않는다.
시스템(1)은 또한, 피펫 팁의 복수 랙(rack)을 위한 스테이징 영역을 포함할 수 있다. 시스템(1)은 둘 이상의 사용 중인 팁 랙을 수용할 수 있고, 두 개 이상의 백업 팁 랙을 수용할 수 있다. 일 실시예에서, 피펫 팁 랙(225)은 사용 중인 피펫 팁 랙에 대응할 수 있는 반면, 피펫 팁 랙(230a, 230b, 230c, 230d)은 백업 팁 랙에 대응할 수 있다. 피펫 팁 랙(225) 내에서 피펫 팁을 소진하면, 소모된 팁 랙이 백업 팁 랙(230a, 230b, 230c 또는 230d)으로 대체될 수 있다. 시스템(1) 내의 모든 피펫 팁이 소모되면, 시스템(1)의 사용자는 스테이징 영역을 새로운 피펫 팁 랙으로 재장전할 수 있다. 액세스 가능해야 하지만 현재 스테이지(110), 스테이지 모듈(500)에 근접하게 위치되지 않은 스테이징 영역(피펫 팁 랙(225)과 연속적인 상자)은 또한, 세포 배양 용기 또는 이의 뚜껑을 보관하기 위해서 사용될 수 있다.
시스템(1) 또는 이의 임의의 구성요소를 불필요하게 오염시킬 가능성을 최소화하기 위해, 피펫 팁이 하나 이상의 피펫 단부로부터 분리되는 시스템(1)의 영역은 중요한 고려 사항이다. 특히, 이러한 영역은 세포 배양 용기, 피펫 팁 랙 스테이징 영역(들) 및 사용 중인 피펫 팁 랙과 접촉되는 시스템(1)의 임의의 구성요소로부터 멀리 떨어져 있어야 한다. 일 실시예에서, 피펫 팁은 하나 이상의 피펫으로부터 폐기물 리셉터클(receptacle)(250) 안으로 분리된다. 일 실시예에서, 폐기물 리셉터클(250)은, 이미징 모듈(100), 피펫 모듈(200), 피펫 팁 랙(225 및 230) 및 아래에서 설명되는 다른 모듈과 같은 시스템(1)의 구성 요소와 사용자의 접촉을 최소화하면서, 시스템(1)로부터의 내용물 제거를 용이하게 하기 위해서 슬라이딩 가능한 서랍에 포함될 수 있다. 일 실시예에서, 센서는, 예를 들어 캐리지(220)의 이동을 방해하지 않도록 폐기물 리셉터클(250)의 위치를 검출하고 보고한다.
시스템(1)은 액체 디스펜서 모듈(300)을 더 포함한다. 액체 디스펜서 모듈(300)은 피펫 모듈(200)과 이격될 수 있다. 명확성을 위해서, 이격되어 있다는 것은 이들이 시스템(1)의 별개의 요소이고, 가능하게는 시스템(1)의 상이한 위치에 있다는 점을 의미한다. 액체 디스펜서 모듈(300)은 용액을 대량으로 세포 배양 용기 안에 분배하기 위해서 사용되는 반면, 피펫 모듈(200)은 세포 배양 용기로부터 유체의 일부 또는 전부를 끌어내기 위해서 사용된다. 액체 디스펜서 모듈(300)의 사용의 예시적인 예는: 세포 배양 또는 분화 배지를 세포 현탁액으로 시딩하기 전 또는 후에, 이르 세포 배양 용기 또는 딸 세포 배양 용기 안으로 분배하는 것; 세포 배양 용기 내의 세포 배양의 자동화 계대 프로토콜 동안 세포 배양 용기에 대해 세척 완충액 또는 세포 분리 용액을 분배하는 것; 또는 세포 배양 매트릭스 용액(예: 용해된 세포외 매트릭스)을 분배하는 것을 포함할 수 있다.
액체 디스펜서 모듈(300)은 하나 이상의 용액 리저버(350)와 유체 연통되는 하나 이상의 도관(325)을 포함한다(예를 들어, 도 1 참조). 용액 리저버(350)는 다능성 줄기 세포와 같은 세포의 자동화 배양 또는 계대를 수행하기 위한 다양한 용액을 담고 있다. 용액 리저버(350)에 담길 수 있는 용액의 예는 세포 배양 배지, 세포 분화 배지, 세포 배양 매트릭스 용액(예: 용해된 세포외 매트릭스), 세포 세척 완충액, 및 세포 분리 용액 또는 세포 해리 용액을 포함하지만, 이에 한정되지는 않는다.
용액 리저버(350)의 내용물은 시스템(1)의 사용자에 의해 채택된 워크 플로우에 의존될 수 있고, 사용자가 요구하는 대로 교환될 수 있다. 워크 플로우의 비제한적인 예는 세포 공급, 세포 계대, 세포 확장, 세포 온보드(onboard), 세포의 클론 집단 유도, 또는 세포 분화를 포함할 수 있다. 이러한 워크 플로우는 다능성 줄기 세포 배양의 자동화 양태에 관심이 있는 사용자에게 특히 일반적이다.
용액 리저버(350)는 시스템(1)의 사용자에 의해 채택된 워크 플로우에서 사용되는 임의의 합리적인 부피의 용액을 수용할 수 있다. 예를 들어, 용액 리저버(350)는 세포 배양 용액을 담기 위해 일반적으로 사용되는 500 mL 병에 대응될 수 있다. 대안적으로, 용액 리저버(350)는 1 갤런 또는 10 L 카보이(carboy)와 같은 더 큰 병 또는 백에 대응될 수 있다. 일부 실시예에서, 용액 리저버들(350)은 상이한 부피의 용액들을 수용할 수 있다. 예를 들어, 더 큰 부피로 사용되는 용액은 상대적으로 더 큰 리저버에 제공될 수 있는 한편, 더 적은 부피로 사용되는 용액은 상대적으로 더 작은 리저버에 제공될 수 있다.
언급된 바와 같이, 용액 리저버(350)는 액체 디스펜서 모듈(300)의 하나 이상의 도관(325)과 유체 연통된다. 하나 이상의 도관은, 용액을 전달할 수 있으면, 어떤 형태를 취할 수 있다. 일 실시예에서, 하나 이상의 도관 각각은 가요성 튜브에 해당된다. 하나 이상의 도관 각각을 통해 용액을 전달하기 위해, 용액 리저버(350) 및 하나 이상의 도관은 펌프와 연관될 수 있다. 일 실시예에서, 펌프는 연동 펌프이다. 일 실시예에서, 펌프는 용액 리저버로부터 도관을 통해 용액을 끌어 당기는 섬프(sump) 펌프와 유사하게 작동될 수 있다.
액체 디스펜서 모듈(300)은 하나 이상의 도관을 포함할 수 있고, 각각의 도관은 하나 이상의 용액 리저버(350) 중 별도의 하나와 유체연통될 수 있으며, 예를 들어 제1 도관(325a)은 제1 리저버(350a)와 유체 연통될 수 있다(미도시). 액체 디스펜서 모듈(300)이 하나 이상의 도관을 포함하며, 각각의 도관이 하나 이상의 용액 리저버(350) 중 별개의 하나와 유체 연통되는 실시예에서, 도관 각각은 재사용 가능하고/거나 교체 가능할 수 있다.
일 실시예에서, 액체 디스펜서 모듈(300)은 제1 용액의 리저버와 유체 연통되는 제1 도관 및 제2 용액의 리저버와 유체 연통되는 제2 도관을 포함할 수 있고, 제1 용액과 제2 용액은 서로 다른 시간에 분배된다. 예를 들어, 제1 용액은 세척 완충액일 수 있고, 제 2 용액은 세포 분리 용액 또는 세포 해리 용액일 수 있다. 따라서, 적절한 부피의 제1 용액이 세포 배양 용기(세포 배양물을 포함할 수도 있고 포함하지 않을 수도 있음) 안에 분배될 수 있으며, 피펫 모듈(200)을 사용하는 등의 방법으로 제1 용액을 제거한 후, 적절한 부피의 제2 용액이 세포 배양 용기 안에 분배될 수 있다. 대안적으로, 제1 용액은 세포 분리 용액 또는 세포 해리 용액에 대응될 수 있고, 제2 용액은 세포 배양 배지에 대응될 수 있다. 대안적으로, 제1 용액은 세포 배양 매트릭스에 대응될 수 있고, 제2 용액은 세포 배양 배지에 대응될 수 있다.
일 실시예에서, 액체 디스펜서 모듈(300)은 제1 용액의 리저버와 유체 연통되는 제1 도관 및 제2 용액의 리저버와 유체 연통되는 제2 도관을 포함할 수 있고, 제1 용액과 제2 용액은 동시에 분배된다. 예를 들어, 제1 용액은 세포 배양 매트릭스 용액이고, 제2 용액은 세포 배양 배지일 수 있다. 따라서, 적절한 부피의 제1 용액이 세포 배양 용기(세포 배양물을 포함할 수도 있고 포함하지 않을 수도 있음) 안에 분배될 수 있으며, 제1 용액을 제거함 없이, 적절한 부피의 제2 용액이 또한, 세포 배양 용기 안에 분배될 수 있다.
시스템(1)은 세포 배양 용기 핸들링 모듈(400)을 더 포함한다(도 3 참조). 핸들링 모듈(400)은 자동화 시스템(1) 내에서 세포 배양 용기나 이의 뚜껑, 또는 딸 세포 배양 용기나 이의 뚜껑을 잡고 운반하기 위한 한 쌍의 대향 가능한 아암(opposable arm)을 포함할 수 있다. 세포 배양 용기 또는 이의 뚜껑을 잡은 핸들링 모듈(400)은 이 용기 또는 뚜껑을 시스템(1)의 다른 스테이션(즉, 모듈)으로 운반할 수 있다.
핸들링 모듈(400)은 또한 시스템(1) 내에서 피펫 팁 랙을 왕복시킬 수 있다. 일 실시예에서, 핸들링 모듈(400)은 피펫 팁이 소모된 피펫 팁 랙을 사용 중인 위치로부터 폐기물 리셉터클(250)로 또는 소모된 피펫 팁 랙을 위한 스테이징 영역으로 운반할 수 있다. 핸들링 모듈(400)은 다음으로, 피펫 팁(230)의 백업 랙을 사용 중인 위치로 운반할 수 있다. 대안적인 실시예에서, 사용자는 시스템(1) 내에서 피펫 팁 랙을 왕복할 수 있다.
핸들링 모듈(400)은 또한, 피펫 모듈(200)과 함께 캐리지(220)에 포함될 수 있다(도 3A). 일 실시예에서, 핸들링 모듈(400)은 캐리지(220)의 피펫 모듈(200)과 구별되는 요소이다. 일 실시예에서, 피펫 모듈(200)은 또한, 핸들링 모듈(400)의 기능을 수행할 수 있다. 예를 들어, 한 쌍의 패들(paddle)은 두 개의 피펫의 단부에 (피펫 팁 대신) 결합될 수 있고, 한 쌍의 패들은 시스템(1) 내에서 세포 배양 용기 또는 이의 뚜껑을 잡고 운반하기 위해서 사용될 수 있다. 일 실시예에서, 핸들링 모듈(400) 및 피펫 모듈(200)은 둘 다 캐리지(220)의 별개의 요소로 포함될 수 있고, 피펫 모듈(200)은 또한, 이의 두 개의 피펫의 단부를 한 쌍의 패들과 결합시킴으로써 그립(grip) 기능을 제공할 수 있다.
시스템(1)은 위에 위치된 하나 이상의 세포 배양 용기를 지지하기 위한 스테이지 모듈(500)을 더 포함할 수 있다. 스테이지 모듈(500)은 적어도 부분적으로 액체 디스펜서 모듈(300)의 아래에 배치될 수 있고, 또한, 적어도 부분적으로 이미징 모듈(100)(도 1)의 아래에 배치될 수 있다.
스테이지 모듈(500)은 플랫폼(510)을 포함할 수 있으며, 스테이지 모듈(500) 또는 플랫폼(510), 또는 이의 하위 구성요소는 이동 가능하다. 스테이지 모듈(500) 또는 플랫폼(510), 또는 이의 하위 구성요소는 제1 수평면에서 이동 가능할 수 있다. 스테이지 모듈(500) 또는 플랫폼(510), 또는 이의 하위 구성요소가 제1 수평면에서 이동 가능한 실시예에서, 제1 축선(즉, x 축)을 따르는 경로, 또는 제2 축선(즉, y 축)을 따르는 경로, 또는 둘 다에서 이동 가능할 수 있다.
스테이지 모듈(500) 또는 플랫폼(510), 또는 이의 하위 구성요소의 수평면 이동은, 예를 들어, 안에 있는 일정 부피의 세포 현탁액에 시딩할 때, 세포 배양 용기에, 또는 이의 하나 이상의 웰에 담겨진 세포를 분배하는 데 도움이 될 수 있다. 수평면 이동은 또한, 세포 배양 용기 내에서, 또는 이의 하나 이상의 웰 내에서, 세포 배양 배지, 세척 완충액, 분리 또는 해리 용액, 또는 세포 배양 매트릭스 용액(예: 용해된 세포외 매트릭스)와 같은 안에 분배된 용액을 분배하는 데 도움이 될 수 있다.
일 실시예에서, 스테이지 모듈(500) 또는 플랫폼(510), 또는 이의 하위 구성요소는 또한, 제3 축선을 따른 경로에서 이동될 수 있다. 예를 들어, 스테이지 모듈(500) 또는 플랫폼(510), 또는 이의 하위 구성요소는 스테이지 모듈(500) 또는 플랫폼(510), 또는 이의 하위 구성 요소의 에지 둘레로 수직으로 틸팅되거나 피벗될 수 있다. 특정 실시예에서, 틸팅은 플랫폼(510)과 같은, 스테이지 모듈(500)의 하위 구성요소의 에지 둘레로 발생된다.
스테이지 모듈(500) 또는 플랫폼(510), 또는 이의 하위 구성요소의 틸팅 이동은 세포 배양 용기에 담겨 있을 수 있는 임의의 용액을 이의 코너(세포 배양 용기의 하나 이상의 웰의 코너 각각을 포함함)로 수집하는 데 도움이 될 수 있다. 세포 배양 용기 내에서 이러한 용액 수집은, 딸 세포 배양 용기에 시딩하기 위해 세포 배양 용기로부터 일정 부피의 세포 현탁액을 추출하는 것을 포함하여, 피펫 모듈(200)의 흡인 또는 분쇄 작업을 용이하게 할 수 있다. 따라서, 특히 세포 배양 용기가 위에 위치될 수 있는 스테이지 모듈(500) 또는 플랫폼(510), 또는 이의 하위 구성요소는 피펫 모듈(200)의 하나 이상의 피펫에 의해 액세스 가능해야 한다.
핸들링 모듈(400)의 특정 기능은, 시스템(1)이 하나 이상의 이미지를 캡쳐하는 것과 같은 다양한 기능을 수행하기 전에, 그리고 자동화 세포 배양 방법의 다양한 단계를 수행하기 전에 스테이지 모듈(500)(또는 스테이지(110) 상에 세포 배양 용기를 배치하는 것일 수 있다.
일 실시예에서, 스테이지 모듈(500)은 그 위에 있는 세포 배양 용기의 존재 및 중량을 검출하고 보고하기 위한 하나 이상의 로드 셀을 포함한다. 따라서 하나 이상의 로드 셀은 작동 시작 여부에 대한 피드백을 시스템(1)에 제공할 수 있다. 예를 들어, 스테이지 모듈(500)로부터 세포 배양 용기의 부재는 액체 분배 작업이 실행되어서는 안 된다는 신호를 보내어, 불필요한 유출을 방지하고 시스템(1)이 오프라인으로 전환되어야 하는 것을 방지할 수 있다. 일 실시예에서, 하나 이상의 로드 셀이 세포 배양 용기로부터 뚜껑이 제거되었는지 여부를 확인하기에 충분히 민감하다. 일 실시예에서, 하나 이상의 로드 셀은 약 100 μL 정도의 적은 양의 액체 이동이 발생했는지 확인하기에 충분히 민감하다.
일 실시예에서, 스테이지(110)는 스테이지 모듈(500)에 포함된다. 일 실시예에서, 스테이지(110)는 스테이지 모듈(500)과 구별되어 있다.
시스템(1)은, 적어도 이미징 모듈(100), 피펫 모듈(200), 액체 디스펜서 모듈(300) 및 핸들링 모듈(400)에 통신적으로 결합된 적어도 하나의 프로세서(600)를 더 포함한다. 일 실시예에서, 적어도 하나의 프로세서(600)는, 적어도 이미징 모듈(100), 피펫 모듈(200), 액체 디스펜서 모듈(300), 핸들링 모듈(400) 및 스테이지 모듈(500)에 통신적으로 결합된다.
이미징 모듈(100)과 관련하여, 적어도 하나의 프로세서(600)는: 스테이지(110)(또는, 스테이지 모듈(500) 또는 플랫폼(510), 또는 그 하위 구성요소) 상에 세포 배양 용기를 배치할지, 또는 스테이지(110)(또는 스테이지 모듈(500) 또는 플랫폼(510), 또는 이의 하위 구성요소)로부터 세포 배양 용기를 제거할지 여부; 하나 이상의 이미지를 캡쳐할지 여부; 또는 하나 이상의 이미지에 기반하여 하나 이상의 특성을 계산할지 여부에 관한 커맨드(command)를 개시할 수 있다.
피펫 모듈(200)과 관련하여, 적어도 하나의 프로세서(600)는: 시스템(1)의 제1 위치로부터 시스템(1)의 제2 위치로 이동될지 여부; 세포 배양 용기로부터 일 부피, 예를 들어, 일 부피의 세포 현탁액을 흡인할지 여부; 세포 배양 용기의 일 부피를 분쇄(즉, 피펫을 위 아래로 이동)될지 여부; 딸 세포 배양 용기의 일 부피의 세포 현탁액을 시딩할지 여부; 또는 흡인된 볼륨을 폐기물 트로프 안으로 배출할지(아래 참조) 여부에 관한 커맨드를 개시할 수 있다.
액체 디스펜서 모듈(300)과 관련하여, 적어도 하나의 프로세서(600)는: 일 부피의 액체를 세포 배양 용기에 분배할지 여부; 또는 어떤 용액(들)이 분배될지 그리고 이러한 용액(들)의 양을 특정할지 여부에 관한 커맨드를 개시할 수 있다.
핸들링 모듈(400)과 관련하여, 적어도 하나의 프로세서(600)는: 시스템(1)의 제1 위치로부터 시스템(1)의 제2 위치로 이동할지 여부; 세포 배양 용기 또는 이의 뚜껑을 시스템(1)의 제1 위치로부터 시스템(1)의 제2 위치로 이동시킬지 여부; 세포 배양 용기의 뚜껑을 제거할지 여부; 또는 피펫 팁 랙을 이동시킬지 여부에 관한 커맨드를 개시할 수 있다. 적어도 하나의 프로세서(600)는 또한, 핸들링 모듈(400)의 한 쌍의 대향 가능한 아암보다 우선적으로 패들 쌍을 결합할지 여부에 관한 커맨드를 개시할 수 있다.
스테이지 모듈(500)과 관련하여, 적어도 하나의 프로세서(600)는: X-축 또는 Y-축, 또는 둘 모두를 따르는 경로에서 스테이지 모듈(500) 또는 플랫폼(510), 또는 이의 하위 구성요소를 이동시키는지 여부; 또는 스테이지 모듈(500) 또는 플랫폼(510), 또는 이의 하위 구성요소를 이의 에지를 따라 틸팅시키는지 여부에 관한 커맨드를 개시할 수 있다.
일 실시예에서, 시스템(1)은 자동화 계대, 배양, 확장 또는 분화 프로토콜을 실행하기 위해 시스템(1)의 다양한 모듈의 작동을 조정하기 위한 하나의 중앙 프로세서(600)를 포함한다. 용어 "계대"가 아래 또는 본원의 어느 곳에서 사용되는 경우, 배양, 확장 또는 분화라는 용어, 또는 이의 변형이 동일하게 적용될 수 있다는 것이 의도된다는 점이 주의되어야 한다. 이러한 실시예에서, 프로세서(600)는 시스템(1)에 통신 가능하게 결합된 컴퓨터 디바이스에 포함될 수 있다.
일 실시예에서, 시스템(1)은 자동화 계대, 배양, 확장 또는 분화 프로토콜을 실행하기 위해 시스템(1)의 다양한 모듈의 작동을 조정하기 위한 하나 이상의 프로세서(600)를 포함한다. 이러한 실시예에서, 제1 프로세서는 시스템(1)에 통신적으로 결합된 제1 컴퓨터 디바이스에 포함될 수 있고, 제2 프로세서는, 시스템(1)의 모듈(예를 들어, 이미징 모듈(100)의 이미지 프로세서)에 통합될 수 있는 제2 컴퓨터 디바이스에 포함될 수 있고, 제1 프로세서 및 시스템(1)에 통신가능하게 결합될 수 있다.
그럼에도 불구하고, 적어도 하나의 프로세서(600)는 이미징 모듈(100)로부터 하나 이상의 이미지를 수신하도록 그리고, 이미징 모듈(100)로부터 수신된 하나 이상의 이미지에 기반하여, 세포 배양의 하나 이상의 특성을 계산하도록 구성된다.
일 실시예에서, 하나 이상의 특성은 세포 배양 용기 내에서 세포 배양의 컨플루언스의 측정치에 해당된다. 세포 배양의 컨플루언스는, 세포 배양에 의해 커버되는 세포 배양 용기의 표면적, 또는 결정에 사용되는 표면적의 이러한 다른 부분을 결정하기 위해서 하나 이상의 이미지를 분석함으로써, 그리고 이 값을 세포 배양 용기의 총 표면적 또는 결정에 사용되는 표면적의 이러한 다른 부분으로 나눕으로써, 계산될 수 있다. 일 실시예에서, 하나 이상의 이미지 각각을 일 표현으로 변환하기 위해 소프트웨어 스크립트가 실행될 수 있으며, 그레이(grey) 또는 그레이스케일(greyscale) 픽실레이션(pixilation)은 세포 배양물에 할당되어 흰색 배경으로부터 세포 배양물을 콘트라스트한다. 일 실시예에서, 세포에는 검정색 백그라운드에 흰색, 그레이 또는 그레이스케일 픽실레이션이 할당될 수 있다. 그럼에도 불구하고, 변환된 표현은 세포 배양 용기 내의 세포 배양물의 컨플루언스의 측정을 결정하기 위해 시스템(1)의 적어도 하나의 프로세서(600)에 의해 쉽게 분석될 수 있다.
도 4a는 세포 배양 용기의 웰 내에서 세포 배양물을 매일 촬영한 이미지를 도시한다. 이미지의 육안 검사에 의해 세포 배양물의 컨플루언스가 후속의 하나 이상의 시점에 비교하여 제1 (이전) 시점부터 증가된 점은 확인되나, 컨플루언시(confluency)와 이에 대한 변경 사항을 효율적이고 안정적으로 정량화하기는 어렵다. 도 4b는 도 4a에 도시된 이미지 각각의 변환된 표현을 도시한다. 변환된 표현에 기초하여, 시스템(1)의 적어도 하나의 프로세서(600)는, 단일 시점에서 또는 다수 시점에 걸쳐, 세포 배양 용기 내 또는 세포 배양 용기들 사이의 세포 배양물의 컨플루언시를 쉽게 계산할 수 있다.
변형된 표현을 기반으로 한 컨플루언시의 결정은, 훽스트 염색과 같은 DNA 결합 염료에 의한 고전적 접근법을 사용하는 컨플루언시 결정과 일치한다(도 5a 및 도 5b). 도 5a는 훽스트로 염색되지 않았거나 염색된 동일한 세포 배양 용기의 실제 이미지와 변환된 표현을 비교한다. 도 5b는 두 가지 방법을 사용하여 세포 배양물의 계산된 컨플루언스의 일치성을 회귀 분석으로 확인한다(R2 = 0.9, 표준 오차 = 0.04, p = 0.95). 도 5c는 일련의 시점에 걸친 세포 배양물의 컨플루언시가 다양한 조건에서 배양된 다양한 세포주에 대한 하나 이상의 이미지를 기반으로 계산될 수 있음을 확인한다.
또한, 변형된 표현을 기반으로 한 상이한 시점에서 컨플루언시의 결정은, 세포 배양물의 증가된 컨플루언시가 배양에서 세포의 예상 성장률과 일치하는 대략 지수 성장 모델(도 6a)에 적합하다는 점을 확인한다. 컨플루언시의 변화의 결정은 또한, 세포 배양물의 성장 속도(즉, 분열시간)를 계산하기 위해서 사용될 수 있다. 도 6b 및 도 6b는 두 개의 서로 다른 세포 배양물(즉, 세포주)에 대해 계산된 분열시간이 예상 값과 일치하는 점을 도시한다. 세포 배양물의 컨플루언시의 시간에 따른 변화로부터 결정된 지수 성장 모델을 기반으로, 후속 시점에서 세포 배양물의 컨플루언시를 예측할 수 있었다(도 6d). 도 6d는 후속 시점에서 예측된 컨플루언시가 동일한 후속 시점에서 동일한 세포 배양물의 실제 컨플루언시와 일치하는 점을 확인한다.
앞서 말한 내용은 덩어리 계대된 세포 배양물의 하나 이상의 이미지를 기반으로 컨플루언시가 계산될 수 있음을 입증하는 반면, 또한 스프레이 계대(기계적 스크래핑 없이 세포 배양물에 대한 배양 배지의 반복된 세척을 통해 분리된 세포)되거나, 또는 단일 세포로 계대된 세포 배양물의 컨플루언시를 계산할 수 있다(도 7a 내지 도 7f). 따라서, 본원에 개시된 자동화 시스템 및 방법은 반드시 덩어리로 계대/배양되지 않은 세포, 예를 들어, 특정 PSC 계통, 중간엽 줄기 세포, 상피 줄기 세포, 신경 줄기 세포, 암 세포, 암 세포주 등을 포함하지만 이에 한정되지 않는 일반적으로 포유 동물 세포에 적용 가능할 수 있다. PSC가 단일 세포로 계대되는 실시예에서, 개별 PSC의 생존을 촉진하는 보충제, 예컨대 CloneRTM (STEMCELL Technologies) 또는 개시되고/거나 상업적으로 이용 가능할 수 있는 다른 보충제를 배양 배지에 포함시키는 것이 필요할 수 있다. 따라서, 세포의 클론 집단을 유도하기 위해 자동화 시스템(1)을 사용하는 것이 가능할 수 있다.
일 실시예에서, 하나 이상의 특성은 세포 배양 용기 내의 세포 수의 측정치에 대응된다. 콜로니로 조직된 것과 같은 세포 배양물 내의 세포 수는 적어도 개별 세포 영역, 개별 세포가 포함된 콜로니의 영역, 및/또는 콜로니 내의 세포 적층 정도의 함수일 수 있다. 많은 경우에 개별 관심 세포의 영역은 이미 알려져 있을 수 있지만, 개별 세포의 영역과 세포의 콜로니 및 세포 적층 정도는 이미징 모듈(100)을 사용하여 캡처된 하나 이상의 이미지로부터 계산될 수 있다. 실제로, 더 큰 콜로니 영역 및 세포 콜로니의 높은 수준의 세포 적층은 해당 콜로니의 세포 수의 증가 및 결과적으로 세포 배양물에서 세포 수의 증가에 대응되어야 한다.
콜로니 영역은 로우(raw) 이미지 또는 하나 이상의 이미지의 변환된 표현에 기반하여 계산될 수 있지만, 세포 적층의 정도를 정량화하는 것은 더 큰 도전을 제기한다. 세포의 층이 증가함에 따라 더 적은 빛이 통과할 수 있기 때문에 상대적으로 더 밝은 콜로니가 생성되므로, 세포 적층의 정도는 개별 콜로니의 밝기에 따라 결정될 수 있다. 일 실시예에서, 변환된 표현은 세포 적층의 정도가 결정될 수 있는 히트 맵으로서 표현될 수 있다. 일 실시예에서, 하나 이상의 이미지의 로우 이미지는 콜로니 겉보기 밝기와 관련하여 충분한 데이터를 제공할 수 있다. 어떤 경우든, 필요한 값을 얻은 후, 세포 배양 용기(또는 이 안의 콜로니 각각)에 있는 세포의 수가 계산될 수 있다. 세포의 특정 배양물이 세포 적층되는 경향이 없는 실시예에서, 세포 배양물의 개별 콜로니의 밝기 결정에 의존하지 않고 세포 수가 계산될 수 있다.
도 8에서는, 하나 이상의 이미지를 기반으로 계산된 평균 콜로니 크기(즉, 면적)가 훽스트 염색 접근법(R2 = 0.86, p = 0.94)을 사용하여 결정된 평균 콜로니 크기(즉, 면적)에 대응하는 점이 도시된다. 따라서, 세포 배양물 내(또는 세포의 다수 배양물 사이)의 콜로니 크기 분포의 측정은 하나 이상의 이미지로부터 결정될 수 있고, 이러한 하나 이상의 특성은 시스템(1) 작동에 영향을 미치기 위해 단독으로 또는 다른 하나 이상의 특성과 조합하여 사용될 수 있다.
도 9에서는, 세포 배양 용기 내의 총 세포 수가 이미지 모듈(100)을 사용하여 캡처된 하나 이상의 이미지를 기반으로 계산될 수 있다는 점, 및 이러한 계산이 수동 접근 방식을 사용하여 얻어진 총 세포 수의 카운트와 양호한 상관 관계를 보인다(R2 = 0.94, p <0.0001)는 점이 도시된다. 하나 이상의 이미지에 기반된 총 세포 수의 결정은 원시 강도 밀도로 표현되며, 원시 강도 밀도 값은 세포의 라이브 배양물의 하나 이상의 이미지(즉, 로우 이미지)와 조합하여 세포 컨플루언시의 변환된 표현으로부터 생성된다.
일 실시예에서, 하나 이상의 특성은 세포 배양 용기 내의 세포 배양물 형태의 측정치에 대응할 수 있다. 세포 배양물의 허용 가능 또는 허용되지 않는 형태는 하나 이상의 이미지에 기반하여, 세포 배양물의 디지털 프로파일을 공지된 표준과 비교함으로써 결정될 수 있다. 예를 들어, PSC 콜로니는 일반적으로 가장자리가 부드러운 돔형으로 되어 있고, 세포의 밀집 및 높은 핵 대 세포질 비율을 보인다. 이에 반해, 분화된 PSC 콜로니 또는 분화 중인 PSC 콜로니는 전술된 특성으로부터 벗어난다. 따라서, 세포 배양물에서 PSC 콜로니의 디지털 프로파일은 하나 이상의 이미지를 기반으로 그리고 표준과 비교하여 생성될 수 있으며, 시스템(1)은 적어도 하나의 프로세서를 통해 적절한 동작 과정을 실행할 수 있다.
위 문단과 연관된 일 실시예에서, 하나 이상의 특성은 세포 배양 용기 내의 세포 배양물의 분화 정도의 측정치에 해당될 수 있다. 하나 이상의 이미지를 기반으로, 표준과 비교하여 세포 배양물의 형태의 일치 또는 불일치(예: 콜로니 기준 또는 평균 기준)는 세포 배양물의 분화 상태를 예측할 수 있다. 예를 들어, 자동화 시스템(1)을 사용하여 분화 프로토콜이 진행 중이고 계산된 하나 이상의 특성이 특정 시점에서 예상되는 세포 형태를 확인하는 경우, 진행 중인 프로토콜에서 이탈 할 필요가 없다. 그러나 계산된 하나 이상의 특성을 기반으로 예상보다 적거나 분화가 없는 경우, 시스템(1)은 프로토콜이 추가의 하나 이상의 이미징 시점 동안 계속되도록 허용하거나, 시스템(1)은 새로운 분화 배지를 도입하기 위해 배지 변경을 수행할 수 있다. 다른 예시에서, 자동화 시스템(1)이 PSC 배양물의 확장 프로토콜 또는 유지관리 프로토콜을 실행하는 경우, 상당한 수준의 분화는 예상보다 빠른 계대 프로토콜 또는 종료 프로토콜을 트리거할 수 있다.
일 실시예에서, 세포 배양물의 분화 상태(또는 형태의 변화)는 기계 학습 분류기(즉, 훈련된 기계 학습 분류기)를 사용하여 얻은 데이터로부터 파생된 방정식 또는 모델, 및 하나 이상의 이미지에 의존하여 결정될 수 있다. 도 10a 및 도 10b는 각각, 이미징 모듈(100)에 의해 캡처된 대표적인 이미지, 및 도 10a의 이미지의 미분화, 분화(더 밝음) 및 배경(가장 어두운) 영역의 오버레이의 대표 이미지를 도시한다. 도 10c는 세 가지 다른 분류 모델을 사용하는 분류기의 결과를 도시한다. 예측 변수를 무시하면서 미분화 콜로니 분류에만 의존하는 제1 분류 모델을 사용하여, 53.83% ± 0.00%의 분류 정확도가 달성될 수 있었다. 상관 관계가 가장 높은 클래스(즉, 미분화, 미분 및 백그라운드)에 특징(feature)를 할당하는 제2 분류 모델을 사용하여, 94.93% ± 0.08%의 분류 정확도가 달성될 수 있었다. 규칙의 의사 결정 트리(decision tree of rules)를 기반으로 클래스(즉, 미분화, 미분 및 백그라운드)에 특징을 할당하는 제3 분류 모델을 사용하여, 99.90% ± 0.02%의 분류 정확도를 달성할 수 있다. 상술된 데이터를 생성하기 위해서 사용되는 분류기는 이미지 세트를 사용하여 훈련되었으며, 백그라운드 영역, 미분화된 PSC 영역 및 분화된 PSC 영역은 하나 이상의 이미지 하위 세트에서 수동으로 선택되었다. 이러한 훈련된 세트는 도 10의 테스트 이미지를 포함하지 않았다. 분류기 훈련 및 실험은 WEKA Workbench를 사용하여 수행되었다. 예를 들어, Ian H. Witten and Eibe Frank(2005)의 "Data Mining: Practical machine learning tools and techniques”, 2nd Edition, Morgan Kaufmann, San Francisco, 2005를 참조한다.
외배엽, 내배엽 및 중배엽 계통 세포는 각각 독특한 형태를 나타내므로, 훈련된 기계 학습 분류기가 하나 이상의 이미지를 기반으로 이러한 구별을 하는 것도 가능할 것이다.
본원에 개시된 시스템 또는 방법이 PSC 유지 프로토콜을 수행하기 위해서 사용되는 실시예에서, 또한, 미분화된 PSC를 선택적으로 계대시켜 상대적으로 높은 분화도를 나타내는 세포 배양 용기 콜로니를 남겨 놓을 수 있다(도 11). 예를 들어, 시스템(1)이 적어도 하나의 프로세서(600)에 의해 개시된 커맨드에 응답하여 계대 프로토콜을 개시할 때, 피펫 모듈(200)은 세포 배양 용기로부터 세포 배양 배지를 흡인할 수 있고(스테이지 모듈 (500)의 틸팅 기능에 의존하거나 의존하지 않음), 액체 디스펜서 모듈(300)은 세포 배양 용기에 일 부피의 세척 완충액을 분배할 수 있다(이후에 세척 완충액은 피펫 모듈(200)을 사용하여 흡인됨). ReLeSRTM (STEMCELL Technologies)과 같은 특수 세포 분리 용액이 세포 배양 용기에 분배되어 세포 배양 용기에서 미분화 PSC의 콜로니를 선택적으로 분리할 수 있다. 세포 배양물의 분화의 측정치에 따라, 세포 분리 용액에 노출되는 시간이 조정될 수 있다. 예를 들어, 높은 추정된 분화의 경우, 더 짧은 배양 시간은, 분리되는 분화된 콜로니의 비율을 줄일 수 있다. 따라서, 단지 미분화 PSC의 분리된 콜로니로부터 생성된 일 부피의 세포 현탁액을 시딩하는 것은 딸 세포 배양 용기 내의 미분화 PSC를 농후하게 할 수 있다. 마찬가지로, 분화 프로토콜을 수행할 때, 미분화 PSC의 이와 같이 분리된 콜로니는 폐기될 수 있고, 나머지 분화된 콜로니는 해리된 후 계대될 수 있다.
일 실시예에서, 하나 이상의 특성은 하나 이상의 후속 시점과 비교하여 제1 시점으로부터 계산된 하나 이상의 특성의 변화의 측정치에 대응될 수 있다. 예를 들어, 하나 이상의 특성은 제2 시점에서 세포 배양물의 컨플루언스 측정치와 비교하여 제1 시점에서 세포 배양물의 컨플루언스 측정치일 수 있다.
도 12는, 자동화 시스템(1)을 사용하여 계대 프로토콜이 실행되는 시점은 제1 시점 및 하나 이상의 후속 시점에서 세포 배양의 컨플루언시를 계산하는 것에 기반하여 결정될 수 있다는 점을 도시한다. 따라서, 임의의 세포 배양물에 대한 최대 또는 원하는 사전 계대 컨플루언시까지 상술된 데이터의 플롯을 외삽하는 것은, 특히 자동화 시스템(1)이 어느 한 시점에서 최대 수백 개의 플레이트를 담당하는 경우, 계대 프로토콜을 스케줄링하는 데 도움이 될 수 있다.
일 실시예에서, 하나 이상의 특성은 하나 이상의 특성 중 상이한 하나의 특성의 함수로서 하나 이상의 특성 중 하나의 측정치에 대응될 수 있다. 예를 들어, 하나 이상의 특성은 세포의 분화 정도 또는 세포 배양물의 콜로니의 함수로서 세포 배양물의 컨플루언시의 측정치일 수 있으며, 그 반대일 수도 있다. 이러한 하나 이상의 특성은 또한, 제1 시점에서 그리고 하나 이상의 후속 시점에서 평가될 수 있다.
하나 이상의 특성 계산과 관련된 모든 데이터 포인트의 수집 및 분석을 기반으로, 시스템(1)은 자가 학습(즉, 자가 훈련)이 가능하고, 자동화된 계대, 또는 다른 프로토콜을 실행할 시기에 관한 지침을 운영자가 제공할 것을 요구하지 않는다. 따라서, 본원에 개시된 주제는 세포 배양물을 적응적으로 계대하기 위한 시스템 및 방법에 관한 것일 수 있다.
본원에서 사용되는 경우, "적응적 계대"는, 유연하고, 실행이 하나 이상의 시점에서 캡처된 하나 이상의 이미지에 기반하여 계산된 하나 이상의 특성에 의존하는 계대 프로토콜을 지칭한다. 또한, 이러한 계대 프로토콜은 반드시 시스템(1)의 운영자로부터의 신호(cue)에 의존하는 것은 아니다. 오히려, (하나 이상의 시점에서 캡처된) 하나 이상의 이미지를 처리하고 하나 이상의 특성을 계산한 시스템(1)은, 예를 들어(그러나, 한정되지 않음), 세포 배양물의 일상적인 유지 배양 동안 또는 새로 파생되거나 획득된 세포주의 온보딩 작업 동안에 일관된 세포 배양물을 얻거나 유지하기 위하여 적절한 양의 세포를 가지고 적절한 시간에 계대 프로토콜(또는 확장 프로토콜 또는 분화 프로토콜)을 실행할 수 있다.
일 실시예에서, 세포 배양 용기에서의 세포 배양물 및 제2 세포 배양 용기에서의 제2 세포 배양물과 관련하여 계산된 하나 이상의 특성이 제1 시점 또는 하나 이상의 후속 시점에서 상이하고, 시스템(1)의 작동에 기반하여 하나 이상의 특성이 후속 계대 동안 더 일관되게 된다. 예를 들어, 제1 세포 배양 용기 또는 제1 웰에서 세포의 제1 배양물의 컨플루언스가 제1 시점(예: 6일을 0으로 계대)에서 25%이고, 제1 세포 배양 용기의 제2 웰에서와 같은, 제2 세포 배양 용기에서 제2 세포 배양물의 컨플루언스는 제1 시점에서 10%이면, 이것은 비동기 자동화 계대 프로토콜의 실행으로 귀결될 것이다. 비동기 자동화 계대 프로토콜을 실행하는 것은 효율성 문제로 바람직하지 않을 수 있으나, 만약, 예를 들어 제1 세포 배양물과 제2 세포 배양물이 동일한 세포 배양 용기의 다른 웰에있는 경우, 또한 나머지 세포 배양물이 계대됨에 따라 한 세포 배양물이 불필요한 위험에 노출시킬 수 있다. 따라서, 자동화 시스템(1)은, 후속 시점(예: 6일을 0 + n으로 계대)에서 세포의 제1 및 제2 배양물의 컨플루언스를 보다 일관되게 만들기 위해 제1 세포 배양물 및 제2 세포 배양물 모두의 후속 계대의 하나 이상의 요소, 예를 들어 시딩 밀도를 적응적으로 조정할 수 있다.
도 13은, 안에 있는 세포의 각 배양물의 컨플루언스의 상대적으로 넓은 변화를 갖는 다수의 세포 배양 용기에 걸쳐, 컨플루언스의 변화는 시스템(1)을 사용하는 적응성 계대 프로토콜을 따라 더욱 일관되게 될 수 있다. 모세포 배양 용기의 컨플루언시와 딸 세포 배양 용기의 컨플루언시 사이의 관계를 결정한 후, 딸 또는 손녀 세포 배양 용기로의 세포 현탁액의 적절한 희석(즉, 시딩 밀도)을 계산할 수 있다.
시스템(1)의 적어도 하나의 프로세서는 자동 계대 프로토콜을 실행하여 세포 배양물을 계대하도록 추가로 구성되며, 프로토콜은, 계산된 세포 배양물의 하나 이상의 특성과 세포 배양물의 하나 이상의 특성에 대해 학습된 또는 입력된 임계 레벨을 비교하는 것에 기반하여 적어도 이미징 모듈(100), 피펫 모듈(200), 액체 디스펜서 모듈(300) 및 핸들링 모듈(400)의 작동을 조정하는 것을 포함한다.
하나 이상의 이미지를 캡처할 때, 자동화 시스템(1)은 하나 이상의 이미지에 기반하여 세포 배양물의 하나 이상의 특성을 (이미징 모듈에 통신적으로 결합된 하나 이상의 프로세서(600)에 의해) 계산한다. 일 실시예에서, 하나 이상의 특성을 계산하는 단계는 위에 제공된 설명에 따라 달성될 수 있다. 특히, 하나 이상의 특성은:
a) 상기 세포 배양물의 컨플루언스의 측정치;
b)상기 세포 배양물의 콜로니 또는 세포의 형태의 측정치;
c) 상기 세포 배양물의 콜로니 또는 세포의 분화의 측정치;
d) 상기 세포 배양물의 콜로니 크기 분포의 측정치;
e) 상기 제1 시점으로부터 상기 하나 이상의 후속 시점까지 a), b), c) 또는 d)의 변화의 측정치; 또는
f) b), c) 또는 d)에 대한 a)의 측정치, a), c) 또는 d)에 대한 b)의 측정치, a), b) 또는 d)에 대한 c)의 측정치, 또는 a), b) 또는 c)에 대한 d)의 측정치를 포함할 수 있다.
하나 이상의 특성을 계산한 후, 자동화 시스템(1)은, 계산된 세포 배양물의 하나 이상의 특성을 세포 배양물의 하나 이상의 특성의 학습 또는 입력된 임계 레벨과 비교하는 것에 기반하여 (적어도 하나의 프로세서(600)에 의해) 자동화 계대 프로토콜을 실행한다.
일 실시예에서, 세포 배양물(즉, 세포 또는 콜로니)의 컨플루언스의 측정치와 관련하여 학습된 또는 입력된 임계 레벨은 약 30 내지 90% 범위에 있다. 따라서, 만약 세포 배양물이 약 30 내지 90% 컨플루언스를 달성한 경우, 자동화 시스템(1)은 계대 프로토콜을 개시할 수 있다. 일 실시예에서, 세포 배양물(즉, 세포 또는 콜로니)의 컨플루언스의 측정치는 약 40 내지 80% 범위 내에 있다. 일 실시예에서, 세포 배양물(즉, 세포 또는 콜로니)의 컨플루언스의 측정치는 약 50 내지 70% 범위 내에 있다.
일 실시예에서, 세포 배양물(즉, 세포 또는 콜로니)의 형태의 측정치와 관련하여 학습된 또는 입력된 임계 레벨은 대조 세포 배양물의 약 ±30%이다. 따라서, 세포 배양물이 그 형태면에서 대조 세포 배양물의 약 ±30% 사이에서 벗어나면, 자동화 시스템(1)은 계대 프로토콜을 개시할 수 있다. 일 실시예에서, 세포 배양물(즉, 세포 또는 콜로니)의 형태의 측정치는 대조 세포 배양물의 ±20% 내에 있다. 일 실시예에서, 세포 배양물(즉, 세포 또는 콜로니)의 형태의 측정치는 대조 세포 배양물의 ±10% 내에 있다.
일 실시예에서, 세포 배양물(즉, 세포 또는 콜로니)의 분화 레벨의 측정치와 관련하여 학습된 또는 입력된 임계 레벨은 유지관리 프로토콜에서 대조 배양물의 약 0 내지 30%이거나, 분화 프로토콜에서 대조 배양물의 약 50% 내지 100%이다. 한편으로, 만약 세포 배양물이 유지관리 프로토콜에서 대조군 배양물에 비해 약 0 내지 30%, 또는 약 10 내지 20%, 또는 약 15%의 분화 레벨을 달성했다면, 자동화 시스템(1)은 계대 프로토콜을 개시할 수 있다. 이에 반해, 만약 세포 배양물이 분화 프로토콜에서 대조군 배양물에 비해 약 0 내지 30%, 또는 약 10 내지 20%, 또는 약 15%의 분화 레벨을 달성했다면, 자동화 시스템(1)은 계대 프로토콜을 개시할 수 있다. 오히려, 이러한 시나리오에서 자동화 시스템(1)은 아무것도 하지 않거나, 또는 사용된 분화 배지를 새로운 분화 배지로 대체할 수 있다. 반면에, 만약 세포 배양물이 분화 프로토콜에서 대조군 배양물에 비해 약 50 내지 100%, 또는 약 60 내지 90%, 또는 약 70 내지 80%, 또는 약 75%의 분화 레벨을 달성했다면, 자동화 시스템(1)은 계대 (및/또는 확장) 프로토콜을 개시하거나, 또는 다운스트림 적용을 위해 분화된 세포를 수확할 수 있다. 이에 반해, 만약 세포 배양물이 유지 프로토콜에서 대조군 배양물에 비해 약 50 내지 100%, 또는 약 60 내지 90%, 또는 약 70 내지 80%, 또는 약 75%의 분화 레벨을 달성했다면, 자동화 시스템(1)은 세포 배양물을 트라이(try)하고 레스큐(rescue)하기 위해 계대 프로토콜 또는 종료 프로토콜을 개시할 수 있다.
일 실시예에서, 세포 배양물(즉, 세포 또는 콜로니)의 콜로니 크기 분포의 측정치와 관련하여 학습된 또는 입력된 임계 레벨은 대조군 배양물의 평균 콜론니 크기의 약 20%, 약 15%, 약 10% 또는 약 5% 이내이거나, 또는 이의 하위분획이다. 따라서, 만약 세포 배양물이 대조군 배양물의 평균 콜로니 크기 분포의 약 20%, 약 15%, 약 10% 또는 약 5% 이내 또는 이의 하위분획의 평균 콜로니 크기 분포를 달성하면, 자동화 시스템(1)은 계대 프로토콜을 개시할 수 있다. 일 실시예에서, 대조군 배양물의 평균 콜로니 크기 분포의 약 20%, 또는 약 15%, 또는 약 10% 또는 약 5% 이내의 임계 레벨은 콜로니 크기 분포의 하위 분획, 예를 들어 상위 10%, 또는 상위 20%, 상위 30% 또는 상위 40%, 하위 10%, 하위 20%, 하위 30% 또는 하위 40%에 속한다.
시스템(1)은, 적어도 피펫 모듈(200), 액체 디스펜서 모듈(300), 핸들링 모듈(400), 스테이지 모듈(500), 및 피펫 팁 랙(225 및 230), 및 캐리지(220)를, 이들을 포함하는 실시예에서, 하우징하는 인클로저(700)를 더 포함할 수 있다. 이미징 모듈(100) 및 카메라(105)는 또한 인클로저(700)(도 3b)에 하우징될 수 있지만, 인큐베이터 모듈(후술 됨)과 같은 다른 곳에 포함될 수 있다.
일 실시예에서, 인클로저(700)는 멸균 내부 환경을 유지한다. 일 실시예에서, 인클로저(700)는 무균실에 해당될 수 있다. 이러한 실시예에서, 본원에 개시된 시스템(1)의 모든 모듈은 멸균실에 포함될 수 있다. 일 실시예에서, 인클로저(700)는 생물학적 안전 캐비닛에 대응될 수 있다. 이러한 실시예에서, 공간 제약으로 인해, 내부에 배치되는 모듈은 자동화 계대 (또는 기타) 프로토콜을 수행하는 모듈로 제한되어야 한다.
일 실시예에서, 하나 이상의 용액 리저버(350), 냉동 모듈(800) 및 폐기물 리저버(900)는 인클로저(700)의 외부에 있다.
시스템(1)은 하나 이상의 용액 리저버(350) 중 하나 이상을 저장하기 위한 냉동 모듈(800)을 더 포함할 수 있다. 냉동 모듈(800)은 원하는 온도에서 하나 이상의 용액 리저버(350) 중 하나 이상을 저장하도록 의도된다. 예를 들어, 세포 배양 배지는 이의 내용물의 분해를 제한하기 위해 약 4°C에서 보관될 수 있다. 유사하게, 세포 분리 용액, 세척 완충액 및 특정 세포 배양 매트릭스 용액은 바람직하게는 약 4°C에서 보관될 수 있다.
냉동 모듈(800)은 하나 이상의 센서를 포함할 수 있다. 일 실시예에서, 제1 센서는 하나 이상의 용액 리저버(350) 각각의 질량을 검출하고 (적어도 하나의 프로세서(600)에) 보고한다. 따라서, 제1 센서는, 적절한 부피의 용액이 제1 리저버로부터 배출되었다는 실시간 피드백을 시스템(1)에 제공한다. 실패하면, 시스템(1)은 제1 리저버로부터 분배될 용액의 수정 부피를 결정할 수 있다. 동일하거나 상이한 실시예에서, 제2 센서는 냉동 모듈(800) 내의 온도를 검출하고 (적어도 하나의 프로세서(600)에) 보고한다. 따라서, 제2 센서는 냉동 모듈(800)이 적절한 온도로 유지된다는 실시간 피드백을 시스템(1)에 제공한다.
시스템(1)은 또한 폐기물 저장소(900)를 포함할 수 있다(도 1 참조). 폐기물 리저버(900)는 인클로저(700) 내에 위치된 폐기물 트로프(925)와 유체 연통될 수 있다. 원치 않는 용액이든 미생물이든, 시스템(1) 내의 세포 또는 다른 구성 요소의 배양물을 오염시킬 가능성을 최소화하기 위해서, 폐기물 트로프의 구성과 위치는 중요한 고려사항이다. 도 14a 및 도 14b는 폐기물 트로프(925)의 일 실시예를 도시한다.
일 실시예에서, 폐기물 트로프(925)는 이미징 모듈(100), 액체 디스펜서 모듈(300), 및 스테이지 모듈(500)로부터 멀리 떨어져 있을 수 있다. 일 실시예에서, 폐기물 트로프(925)는, 프라이밍 작동(즉, 도관으로부터 오래된 또는 실온 용액 제거) 동안 액체 디스펜서 모듈(300)의 하나 이상의 도관으로부터 세포 배양 용액의 폐기를 단순화하기 위해 액체 디스펜서 모듈(300) 아래에 위치될 수 있다.
폐기물 트로프(925)는 용액을 폐기물 리저버(900)로 전달하기 위한 채널(930)을 포함한다. 일 실시예에서, 폐기물 트로프는 제1 싱크(sink)(935) 및 제2 싱크(937)를 포함하며, 제1 싱크 및 제2 싱크는 모두 채널(930)과 유체 연통된다. 제1 싱크(935)는 피펫 모듈(200)로부터 배출물을 수용할 수 있고, 제2 싱크는 액체 디스펜서 모듈(300), 특히 이와 관련된 하나 이상의 도관으로부터 배출물을 수용할 수 있다.
일 실시예에서, 제1 싱크(935)는 살균 용액과 같은 용액을 제공하기 위한 플러시 유입구(938)를 더 포함한다. 당업자는 세포 배양 공정에 유용한 적절한 살균 용액을 알 수 있을 것이다. 예를 들어, 살균 용액은 희석된 표백제일 수 있다. 대안적으로, 살균 용액은 이소프로필 알코올과 같은, 알코올일 수 있다.
일 실시예에서, 폐기물 트로프(925)는 내부에서 배출되는 용액의 고임(pooling)을 최소화하는 기하학적 구조를 포함할 수 있다. 일 실시예에서, 폐기물 트로프(925)의 수용 표면(940)은 채널(930)을 향해 아래로 기울어져 이를 통해 배출되는 용액을 촉진할 수 있다. 일 실시예에서, 수용 표면(940)은 수용 표면(940)에 형성된 점 또는 실질적으로 점으로 수렴하는 한 쌍의 경사진 벽을 더 포함할 수 있다. 이러한 실시예에서, 수렴된 한 쌍의 벽은 하향 경사면과 협력하여 배출된 용액을 채널 (930)쪽으로 그리고 이를 통해 촉진한다.
일 실시예에서, 폐기물 트로프(925)는 폐기물 리저버(900) 백업 또는 채널(930)의 막힘을 검출하고 (적어도 하나의 프로세서(600)에) 보고하기 위한 액체 레벨 센서(945)를 더 포함한다.
일 실시예에서, 폐기물 트로프(925)는 소수성 코팅물 또는 초소수성 코팅물로 코팅될 수 있다. 일 실시예에서, 코팅물은 실리카 나노입자(nanoparticle) 기반일 수 있다. 당업자는, 실록산 또는 퍼플루오로카본계 코팅물 등과 같은 다른 적절한 소수성 또는 초소수성 코팅물을 알고 있을 것이다.
일 실시예에서, 폐기물 트로프(925)는, 세포 배양 배지와 같은 잔류 용액이 수집되어 잠재적인 오염 문제를 일으킬 수 있는 큰 개방 영역을 최소화하기 위해 상대적으로 작은 풋프린트를 점유할 수 있다. 일 실시예에서, 폐기물 트로프(925)는 용량을 감소시키지 않으면서 개방 영역을 추가로 감소시키기 위해 커버(950)를 더 포함한다.
시스템(1)은 인큐베이터 모듈(1000)을 더 포함할 수 있으며, 여기서 인큐베이터 모듈은 다 능성 줄기 세포와 같은 세포 배양을 위한 허용 환경 조건을 유지한다. 인큐베이터 모듈은 당업계에 공지되어 있으며, 예를 들어 Liconic으로부터 구입될 수 있다. 일 실시예에서, 인큐베이터 모듈(1000)은 다수의 세포 배양 용기를 위한 랙킹(racking)을 포함할 수 있다. 일 실시예에서, 인큐베이터 모듈(1000)은 랙킹으로부터 세포 배양 용기를 선택적으로 당기기 위한 핸들링 수단을 더 포함하고, 이러한 핸들링 수단은 세포 배양 용기와 연관된 고유 식별자(즉, 바코드 및 바코드 리더)에 기반하여 세포 배양 용기를 선택적으로 당긴다.
일 실시예에서, 인큐베이터 모듈(1000)은 내부의 온도, 또는 습도와 같은 다른 조건 및 CO2%와 같은 다른 대기 조건을 검출하고 (적어도 하나의 프로세서 600에) 보고하기 위한 하나 이상의 센서를 포함한다.
시스템(1)이 인큐베이터 모듈(1000)을 포함하는 경우, 엔클로저(700)와 인큐베이터 모듈 (1000)을 연결하고 인큐베이터 모듈(1000)로부터 핸들링 모듈(400)(도 1)의 근접부 안으로 세포 배양 용기를 운반하기 위한 컨베이어 모듈(1150)을 포함하는 것이 바람직할 수 있다. 일 실시예에서, 컨베이어 모듈(1150)은 세포 배양 용기가 비멸균 환경에 노출되는 것을 방지하기 위해 폐쇄될 수 있다.
인큐베이터 모듈(1000) 및 컨베이어(1150)는 둘 다 적어도 하나의 프로세서(600)에 통신 가능하게 결합된다. 인큐베이터 모듈(1000)과 관련하여, 적어도 하나의 프로세서(600)는: 핸들링 수단을 결합하여 내부의 랙킹에서 세포 배양 용기를 선택적으로 당기거나 세포 배양 용기를 교체할지 여부; 또는 내부의 대기 조건을 조정할지 여부에 관한 커맨드를 개시할 수 있다. 컨베이어 모듈(1150)과 관련하여, 적어도 하나의 프로세서(600)는: 인큐베이터 모듈(1000) 밖으로 세포 배양 용기를 운반할지 여부; 또는 예를 들어, 엔클로저(700)로부터 인큐베이터 모듈 안으로 세포 용기를 운반할지 여부에 관한 커맨드를 개시할 수 있다.
시스템(1)은 선택적으로 자동화 시스템의 모듈 각각의 동작을 조정하기 위한 제어기(700)를 더 포함할 수 있다. 제어기(700)는 개인용 컴퓨터에 포함될 수 있는 소프트웨어를 포함한다. 제어기(700)의 소프트웨어는 자동화 시스템의 모듈 각각의 작동을 조정하기 위해서 필요한 커맨드를 수행할 수 있다.
시스템(1)은 적어도 하나의 프로세서에 통신 가능하게 결합된 그래픽 사용자 인터페이스(1200)를 더 포함할 수 있다. 그래픽 사용자 인터페이스(1200)는 바람직하게 인클로저(700)의 외부에 위치된다. 일 실시예에서, 그래픽 사용자 인터페이스(1200)는 시스템(1)과 일체화된 개인용 컴퓨터의 디스플레이이다. 일 실시예에서, 그래픽 사용자 인터페이스(1200)는 시스템(1)과 무선으로 연결된 개인용 컴퓨터의 디스플레이이다. 그래픽 사용자 인터페이스(1200)는 시스템(1)의 사용자에게 시스템(1)의 작동, 예를 들어, 자동화 세포 배양 프로세스를 스케쥴하고, 시스템(1)에 의해 실행되는 자동화 세포 배양 프로세스를 검토하고, 카메라(105)에 의해 캡처된 하나 이상의 이미지를 검토하고, 시스템(1)에 통합된 각 센서로부터 알림을 받거나 상태를 수신하고, 하나 이상의 용액 리저버(350) 각각에 대한 유체 레벨 보고를 관찰하는 동작을 지시하는 데 필요한 컨트롤을 제공할 수 있다.
시스템(1)은 아래에 설명된 바와 같이 세포 배양물에서 하나 이상의 콜로니를 해리하기 위한 장치에 따라 해리 모듈(1300)을 추가로 포함할 수 있다. 세포 배양 용기는 핸들링 모듈(300)을 사용하여 해리 모듈(1300)로 운반될 수 있다.
시스템을 사용하는 방법
본 발명의 다른 양태에서, 자동화 시스템(1)은 세포 배양물을 계대하는 자동화 방법을 수행하기 위해서 사용될 수 있다(도 15). 일 실시예에서, 자동화 시스템(1)은 세포 배양물을 적응적으로 계대하는 자동화 방법을 수행하기 위해 사용될 수 있다. 특정 실시예에서, 세포는 다능성 줄기 세포일 수 있고, 더 구체적으로 세포는 인간 다능성 줄기 세포일 수 있다. 인간 다능성 줄기 세포를 덩어리 또는 클러스터로 계대하는 것이 많은 응용 분야에서 바람직하기 때문에, 인간 다능성 줄기 세포의 배양물을 계대하는 자동화 방법은 이의 덩어리 계대에 적합할 수 있다.
본원에 개시된 방법은 세포 배양물을 계대하는데 사용될 수 있지만, 이는 이러한 방식으로 한정되지 않는다. 방법의 변형은 일상적인 유지 체계(regime)의 일부로서 배지 교환을 수행하기 위해 사용될 수 있다. 대안적으로, 상기 방법은 세포 확장 체계를 수행하기 위해 사용될 수 있으며, 세포 배양물은 더 큰 배양 용기 또는 더 많은 수의 웰로 연속적으로 배양될 수 있다. 대안적으로, 새로운 세포주, 예를 들어 새로 유래되거나 획득된 PSC 세포주의 온보딩 체계를 수행하기 위해 방법이 사용될 수 있으며, 초기 계대(들)에서 데이터(즉, 하나 이상의 특성)의 획득 및 분석은 후속 계대를 수행하기 위한 최적의 조건에 대해 알려줄 수 있다. 대안적으로, 상기 방법은 세포 분화 체계를 수행하기 위해 사용될 수 있으며, 세포의 시작 집단은 분화 배지와 같은 분화 조건에 노출되어 세포의 시작 집단을 세포의 유도체 계통으로 전환한다. 다능성 줄기 세포에 특정한 예시는, 적절한 배양 배지에 노출시 이러한 세포의 외배엽 유사 또는 외배엽 세포, 내배엽 유사 또는 내배엽 세포, 또는 중배엽 유사 또는 중배엽 세포로의 분화를 포함한다.
세포 배양물을 계대하기 위한 자동화 방법은 세포 배양 용기 내의 세포 배양 배지에 세포 배양물을 제공하는 것을 포함한다. 일 실시예에서, 세포 배양물을 제공하는 것은 인큐베이터로부터 세포 배양물을 전달하는 것을 포함한다. 세포 배양 용기를 전달하는 것은 위에서 설명된 컨베이어 모듈과 같은 컨베이어 수단을 사용하여 수행될 수 있다. 일 실시예에서, 세포 배양 용기(및 그 안의 세포 배양물)를 제공하는 것은 위에서 설명된 핸들링 모듈과 같은 세포 배양 용기 핸들러를 사용하여 달성될 수 있다.
일 실시예에서, 자동화 방법, 보다 구체적으로 세포 배양 용기(및 그 안의 세포 배양물)를 제공하는 단계는 상기에서 설명된 스테이지 모듈과 같은 스테이지 상에 배양 용기를 배치하는 단계를 추가로 포함할 수 있다. 일 실시예에서, 세포 배양 용기를 위치시키는 단계는 세포 배양 용기 핸들러(즉, 핸들링 모듈)를 사용하여 달성될 수 있다.
자동화 방법은 또한, 제1 시점 및 하나 이상의 후속 시점에서 상기 세포 배양물의 하나 이상의 이미지를 이미징 모듈에 의하여 캡처하는 단계를 포함한다. 일 실시예에서, 이미징 모듈은 본질적으로 위에서 설명된 바와 같다.
하나 이상의 이미지를 캡처한 후, 자동화 방법은 또한, 이미징 모듈에 통신적으로 결합된 하나 이상의 프로세서에 의해 하나 이상의 이미지에 기반하여 세포 배양물의 하나 이상의 특성을 계산하는 단계를 포함한다. 일 실시예에서, 하나 이상의 특성을 계산하는 단계는 위에 제공된 설명에 따라 달성될 수 있다. 특히, 하나 이상의 특성은:
a) 상기 세포 배양물의 컨플루언스의 측정치;
b) 상기 세포 배양물의 콜로니 또는 세포의 형태의 측정치;
c) 상기 세포 배양물의 콜로니 또는 세포의 분화의 측정치;
d) 상기 세포 배양물의 콜로니 크기 분포의 측정치;
e) 상기 제1 시점으로부터 상기 하나 이상의 후속 시점까지 a), b), c) 또는 d)의 변화의 측정치; 또는
f) b), c) 또는 d)에 대한 a)의 측정치, a), c) 또는 d)에 대한 b)의 측정치, a), b) 또는 d)에 대한 c)의 측정치, 또는 a), b) 또는 c)에 대한 d)의 측정치를 포함할 수 있다.
하나 이상의 특성을 계산한 후, 자동화 방법은 또한, 계산된 세포 배양물의 하나 이상의 특성을 세포 배양물의 하나 이상의 특성의 학습 또는 입력된 임계 레벨과 비교하는 것에 기반하여 하나 이상의 프로세서에 의해서 자동화 계대 프로토콜을 실행하는 단계를 포함한다.
일 실시예에서, 세포 배양물(즉, 세포 또는 콜로니)의 컨플루언스의 측정치와 관련하여 학습된 또는 입력된 임계 레벨은 약 30 내지 90%에 있다. 따라서, 만약 세포 배양물이 약 30 내지 90% 컨플루언스를 달성한 경우, 자동화 시스템(1)은 계대 프로토콜을 개시할 수 있다. 일 실시예에서, 세포 배양물(즉, 세포 또는 콜로니)의 컨플루언스의 측정치는 약 40 내지 80% 내에 있다. 일 실시예에서, 세포 배양물(즉, 세포 또는 콜로니)의 컨플루언스의 측정치는 약 50 내지 70% 내에 있다.
일 실시예에서, 세포 배양물(즉, 세포 또는 콜로니)의 형태의 측정치와 관련하여 학습된 또는 입력된 임계 레벨은 대조 세포 배양물의 약 ± 30% 내에 있다. 따라서, 세포 배양물이 그 형태면에서 대조 세포 배양물의 약 ± 30% 사이에서 벗어나면, 자동화 시스템(1)은 계대 프로토콜을 개시할 수 있다. 일 실시예에서, 세포 배양물(즉, 세포 또는 콜로니)의 형태의 측정치는 대조 세포 배양물의 ±20% 내에 있다. 일 실시예에서, 세포 배양물(즉, 세포 또는 콜로니)의 형태의 측정치는 대조 세포 배양물의 ±10% 내에 있다.
일 실시예에서, 세포 배양물(즉, 세포 또는 콜로니)의 분화 레벨의 측정치와 관련하여 학습된 또는 입력된 임계 레벨은 유지관리 프로토콜에서 대조 배양물의 약 0 내지 30%이거나, 분화 프로토콜에서 대조 배양물의 약 50% 내지 100%이다. 한편으로, 만약 세포 배양물이 유지관리 프로토콜에서 대조군 배양물에 비해 약 0 내지 30%, 또는 약 10 내지 20%, 또는 약 15%의 분화 레벨을 달성했다면, 자동화 시스템(1)은 계대 프로토콜을 개시할 수 있다. 이에 반해, 만약 세포 배양물이 분화 프로토콜에서 대조군 배양물에 비해 약 0 내지 30%, 또는 약 10 내지 20%, 또는 약 15%의 분화 레벨을 달성했다면, 자동화 시스템(1)은 계대 프로토콜을 개시할 수 있다. 오히려, 이러한 시나리오에서 자동화 시스템(1)은 아무것도 하지 않거나, 또는 사용된 분화 배지를 새로운 분화 배지로 대체할 수 있다. 반면에, 만약 세포 배양물이 분화 프로토콜에서 대조군 배양물에 비해 약 50 내지 100%, 또는 약 60 내지 90%, 또는 약 70 내지 80%, 또는 약 75%의 분화 레벨을 달성했다면, 자동화 시스템(1)은 계대 (및/또는 확장) 프로토콜을 개시하거나, 또는 다운스트림 적용을 위해 분화된 세포를 수확할 수 있다. 이에 반해, 만약 세포 배양물이 유지 프로토콜에서 대조군 배양물에 비해 약 50 내지 100%, 또는 약 60 내지 90%, 또는 약 70 내지 80%, 또는 약 75%의 분화 레벨을 달성했다면, 자동화 시스템(1)은 세포 배양물을 트라이(try)하고 레스큐(rescue)하기 위해 계대 프로토콜 또는 종료 프로토콜을 개시할 수 있다.
일 실시예에서, 세포 배양물(즉, 세포 또는 콜로니)의 콜로니 크기 분포의 측정치와 관련하여 학습된 또는 입력된 임계 레벨은 대조군 배양물의 평균 콜론니 크기의 약 20%, 약 15%, 약 10% 또는 약 5% 이내이거나, 또는 이의 하위분획이다. 따라서, 만약 세포 배양물이 대조군 배양물의 평균 콜로니 크기 분포의 약 20%, 약 15%, 약 10% 또는 약 5% 이내 또는 이의 하위분획의 평균 콜로니 크기 분포를 달성하면, 자동화 시스템(1)은 계대 프로토콜을 개시할 수 있다. 일 실시예에서, 대조군 배양물의 평균 콜로니 크기 분포의 약 20%, 또는 약 15%, 또는 약 10% 또는 약 5% 이내의 임계 레벨은 콜로니 크기 분포의 하위 분획, 예를 들어 상위 10%, 또는 상위 20%, 상위 30% 또는 상위 40%, 하위 10%, 하위 20%, 하위 30% 또는 하위 40%에 속한다.
본원에서 사용되는 경우, "자동화 계대 프로토콜"은, 세포 배양물의 일부 또는 전부를 하나 이상의 딸 세포 배양 용기에 시딩하는 것을 포함하여, 예를 들어, 서브-배양(sub-culturing)에 의해서 세포 배양물이 증식될 수 있는 시점까지의 배양 활동, 및 세포 배양물의 서브-배양에 필요한 활동을 가리킨다. 따라서, 계대라는 용어는, 세포 배양물의 서브-배양과 같은, 일상적인 세포 배양과 관련된 활동, 및 세포 배양물을 확장하거나 또는 분화하는 것을 목표로 하는 워크 플로우를 포괄적으로 지칭한다.
일 실시예에서, 계대 프로토콜을 실행하는 단계는 세포 배양물로부터 세포의 현탁액을 수득하는 단계, 및 딸 세포 배양 용기의 세포 현탁액의 일부 또는 전부를 시딩하는 단계에 의해서 달성될 수 있다.
일 실시예에서, 세포 현탁액을 수득하는 단계, 세포 배양물을 단일 세포 현탁액 또는 제1 피펫 팁의 보어 직경을 초과하지 않는 평균 직경을 갖는 복수의 덩어리로 해리하기 위해 세포 현탁액을 제1 피펫 팁을 통해 통과시키는 단계를 더 포함한다. 일 실시예에서, 제1 팁을 통해 세포 현탁액을 통과시키는 단계는 위에서 설명된 바와 같이 피펫 모듈을 사용하여 수행될 수 있다.
세포 현탁액을 수득하는 단계 전에, 제1 세포 배양 용기의 배양 배지는 세포 배양 용기 또는 이의 웰에서 배양 배지를 흡인함으로써 제거될 수 있다. 상기와 같이, 일 실시예에서, 세포 배양 배지를 흡인하는 단계는 위에서 설명된 피펫 모듈을 사용하여 달성될 수 있다. 일 실시예에서, 세포 배양 배지를 제거(즉, 흡인)하는 단계는 제1 세포 배양 용기를 기울이는 단계 다음에 피펫 모듈의 피펫에 결합된 피펫 팁을 세포 배양 용기의 하단 모서리 또는 이의 웰로 지향시키는 단계를 포함할 수 있다.
배양 배지를 흡인하는 단계 후, 세척 완충액을 세포 배양 용기 또는 이의 웰에 분배함으로써 세척 단계를 수행하는 것이 바람직할 수 있다. 일 실시예에서, 세척 완충액은 위에서 설명된 액체 디스펜서 모듈을 사용하여 분배될 수 있다. 그 후, 세척 완충액은, 예를 들어 피펫 모듈을 통해서 위에서 설명된 바와 같이 흡인(즉, 제거)될 수 있다.
공급 처방이 수행되는 경우, 세포 배양 용기를 위에서 설명한 인큐베이터 모듈과 같은 인큐베이터로 복귀시키기 전에, 신선한 배양 배지가 세포 배양 용기 또는 이의 모든 적절한 웰에 (사용된 배양 배지를 흡인하고/거나 세척한 후) 첨가될 수 있다.
세포 계대 또는 확장과 관련된 방법에서, 세포 배양 배지가 제거된 (선택적으로 세척 단계를 거친) 세포 배양 용기 내의 세포 배양물은 분리/해리 용액과 접촉될 수 있다. 임의의 적절한 분리 또는 해리 용액은 세포 배양 용기 또는 이의 웰에서 세포 배양물과 접촉되기 위해서 사용될 수 있다. 일 실시예에서, 분리 용액은 ReLeSRTM (STEMCELL Technologies) 또는 STEMdiffTM Neural Rosette Selection Reagent (STEMCELL Technologies)일 수 있다. 일 실시예에서, 해리 용액은 GCDR (STEMCELL Technologies) 또는 기타 트립신 기반 용액일 수 있다. 세포 배양 용기에서 세포 배양물을 분리 또는 해리 용액과 접촉시키는 단계는 위에서 설명된 바와 같은 액체 디스펜서 모듈을 사용하여 수행될 수 있다. 사용되는 용액의 유형에 따라, 세포 배양물은 약 37°C 또는 실온에서 충분한 시간 동안 분리 또는 해리 용액의 존재 하에서 인큐베이트될 수 있다. 또한, 사용되는 용액의 유형에 따라, 세포 배양물을 인큐베이트하기 전에 용액을 흡인하는 것이 바람직할 수 있다. 또한, 사용되는 용액의 유형 및 세포 유형에 따라, 세포 배양 용기를 인큐베이터 모듈로 전달하는 것이 바람직할 수 있다.
일 실시예에서, 분리 용액은 분획화 용액이고, 분획화 용액은 세포 배양 용기의 벽으로부터 분화된 세포의 제1 집단 또는 미분화된 세포의 제2 집단을 선택적으로 분리한다. 이러한 실시예에서, 용도에 따라, ReLeSRTM (STEMCELL Technologies) 또는 STEMdiffTM Neural Rosette Selection Reagent (STEMCELL Technologies)가 사용될 수 있다.
제1 세포 배양 용기의 인큐베이션 후, 방법의 다음 단계는 핸들링 모듈을 사용하여 제1 세포 배양 용기를 해리 모듈(아래 설명됨)로 운반하는 단계, 및 해리 모듈을 사용하여 다능성 줄기 세포 콜로니와 같은 세포 콜로니를 제1 세포 배양 용기의 웰의 하부로부터 분리하는 단계를 포함할 수 있다.
위에서 언급된 바와 같이, 하나 이상의 세포 콜로니의 일부 또는 전부는 분리/해리 용액으로 인해 분리될 수 있거나, 또는 해리 모듈을 사용하여 하나 이상의 세포 콜로니의 일부 또는 전부가 분리되도록 촉진하는 것이 필요할 수 있다. 어떤 경우든, 해리 모듈을 활성화시키는 단계는 분리된 세포 콜로니를 세포 현탁액 안으로, 그리고 일 실시예에서, 다능성 줄기 세포 덩어리의 현탁액 안으로 해리하는 데 도움이 될 수 있다.
일부 실시예에서, 해리 모듈을 활성화하기 전이나 후에 피펫 모듈을 사용하여 세포 현탁액을 분쇄하는 단계는 하나 이상의 콜로니를, 다능성 줄기 세포 덩어리의 현탁액과 같은 세포 현탁액 안으로 해리할 수 있다.
하나 이상의 세포 콜로니를 세포 현탁액 안으로 해리시킨 후, 일 부피의 세포 현탁액(단일 세포 현탁액이든 복수의 덩어리 현탁액이든)은 딸 세포 배양 용기 또는 이의 웰 안에, 예를 들어 피펫 모듈에 의해서 시딩될 수 있다.
일 실시예에서, 일 부피의 세포 현탁액을 딸 세포 배양 용기에 시딩하기 전 또는 후에, 자동화 방법은 딸 세포 배양 용기에 제1 용액 및 제2 용액을 동시에 또는 순차적으로 분배하는 단계를 추가로 포함할 수 있다. 일 실시예에서, 제1 용액은 세포 배양 배지이고 제2 용액은 용해된 세포외 매트릭스이다.
확장 실험을 위해, 세포 현탁액의 일부 또는 전부는 제1 세포 배양 용기보다 더 큰 제2 배양 용기에 또는 제2 배양 용기의 복수의 웰에 시딩될 수 있다.
장치
본 발명의 일 양태에서, 세포 배양물에 존재하는 하나 이상의 콜로니를 분리 또는 해리하기 위한 장치가 제공된다(도 16 참조). 본 개시내용 전체에 걸쳐, 장치(2)는 또한 해리 모듈로 지칭될 수 있다.
본원에 사용된 용어 "세포"는, 탈체(ex vivo) 또는 시험관 내에서 배양될 수 있는 모든 유형의 세포를 지칭한다. 세포가 부착된 배양물로서 성장하는 것이 중요할 수 있지만, 현탁액에서 성장하는 세포도 본 발명의 범위 내에 있다. 세포는 기원이 포유류일 수 있고, 어떤 상황에서는 세포가 인간 세포일 수 있다. 세포는 또한 다능성 줄기 세포일 수 있고, 일부 실시예에서 세포는 인간 다능성 줄기 세포일 수 있다. 일부 실시예에서, 세포는 다능성 줄기 세포의 배양에서 하나 이상의 미분화된 콜로니이다. 미분화 다능성 줄기 세포는 단층으로서 또는 현탁액에서 배양될 수 있고, 분열 시 각각 콜로니 또는 응집체를 형성한다. 미분화 다능성 줄기 세포는 자가 재생이 가능한 세포이고, 모든 계통으로 분화될 수 있다. 예를 들어, 다능성 줄기 세포는 배아 줄기 세포, 유도된 다능성 줄기 세포, 또는 현장에서 출현하는 다른 유형의 세포일 수 있으며, 이의 예는 확장된 다능성 줄기 세포를 포함한다. 많은 다능성 줄기 세포주가 알려져 있지만, 기존 과학 기술을 이용하여 새로운 다능성 줄기 세포주를 만드는 것은 일상적인 일이다.
세포 배양물에서 하나 이상의 콜로니를 해리하기 위한 장치(2)의 일 실시예에서, 장치는 장착 표면(10)에 연결된 회전 가능한 드라이브(5)를 포함한다(도 16 참조). 회전 가능한 드라이브(5)는 전기 에너지를 회전 운동으로 변환시키는 임의의 공지된 메커니즘을 포함할 수 있다. 일 실시예에서, 회전 가능한 드라이브(5)는 회전 가능한 샤프트(20)(도 17 참조)에 연결된 모터(15)를 포함한다. 드라이브(5)는 장착 표면(10)의 상부 표면에 연결될 수 있고, 모터(15) 및 회전 가능한 축(20)은 장착 표면(10)의 수평면으로부터 위쪽으로 돌출될 수 있다. 따라서, 회전 가능한 드라이브(5) 또는 이의 회전 가능한 샤프트(20)는 장착 표면(10)에 수직이거나 실질적으로 수직인 제1 축선을 중심으로 회전 가능하다.
장치(2)는 세포 배양 용기를 지지하기 위한 플랫폼(25)을 더 포함한다. 플랫폼(25)은 드라이브(5)에 연결되고, 좀 더 구체적으로 회전 가능한 드라이브(5)의 단부(22)에 연결되고, 좀 더 더 구체적으로, 회전 가능한 샤프트(20)의 단부(22)에 연결된다(도 17 참조).
플랫폼(25)은 세포 배양 용기(미도시)의 바닥 표면을 지지하도록 실질적으로 평면일 수 있다. 플랫폼(25)은 이의 상부 표면 상에 적어도 하나의 세포 배양 용기를 지지할 수 있다면 임의의 치수일 수 있다. 많은 유형의 세포 배양 용기가 본 기술분야에 공지되어 있으며, 모두 본 발명에서 고려된다. 일반적으로, 세포 배양 용기는 배양을 위해 세포를 수용할 수 있는 임의의 컨테이너일 수 있다. 비제한적인 예로서, 세포 배양 용기는 예를 들어, 6-웰 플레이트, 12-웰 플레이트, 24-웰 플레이트 또는 96-웰 플레이트와 같지만 이에 한정되지 않는, 마이크로플레이트일 수 있다. 대안적으로, 세포 배양 용기는 T 플라스크와 같지만 이에 제한되지 않는 세포 배양 플라스크일 수 있다. 세포 배양 용기가 T 플라스크인 일부 실시예에서, 플랫폼은 예를 들어, T25 플라스크, T75 플라스크, T150 플라스크, 175 플라스크 또는 T225 플라스크를 지지할 수 있도록 적절한 치수를 가질 수 있다. 대안적으로, 세포 배양 용기는, 페트리(Petri) 접시, 35 mm 접시, 10 mm 접시 또는 그 이상과 같지만 이에 제한되지 않는 세포 배양 접시일 수 있다.
일 실시예에서, 플랫폼(25)은 드라이브(5) 또는 이의 단부(22)에 오프셋(offset) 연결된다. 예를 들어, 앞서 설명된 것처럼, 드라이브(5) 또는 이의 단부(22)는 제1 회전 축선을 정의할 수 있고, 플랫폼(25)은 플랫폼(25)의 회전 중심을 통과하는 제 2 회전 축선을 중심으로 회전될 수 있다. 일부 실시예에서, 드라이브(5) 또는 단부(22)는 플랫폼(25)의 회전 중심으로부터 오프셋된 위치에서 플랫폼(25)에 결합될 수 있다. 플랫폼(25)이 드라이브(5)에 오프셋 방식으로 연결된 경우, 플랫폼(25)은, 드라이브(5) 또는 이의 단부(22)가 플랫폼 (25)의 회전 중심에 결합되는 경우와 비교할 때, 제1 축선(즉, 드라이브(5)의 회전 축선 또는 이의 단부(22))에 대해 더 넓은 궤도를 가질 것이다.
동일하거나 상이한 실시예에서, 플랫폼(25)은 또한, 드라이브 (5)에 간접적으로 연결될 수 있다. 이러한 실시예에서, 장치(1)는 드라이브(5)에 대한 플랫폼(25)의 부착을 매개하는 스페이서(27)를 더 포함할 수 있다. 스페이서(27)는, 회전 가능한 드라이브(5)에 종속적으로 또는 독립적으로 회전되는 플랫폼(25)을 여전히 허용하면서, 플랫폼(25)의 드라이브(5)에 대한 부착을 매개하는 임의의 구성 요소일 수 있다. 바람직한 실시예에서, 스페이서(27)는 베어링이다.
플랫폼(25)이 드라이브(5)에 간접적으로 그리고 오프셋으로 연결되는 실시예에서, 스페이서(27)는 대안적으로 본원에서 편심 스페이서로 지칭될 수 있다. 도 18에서 볼 수 있는 바와 같이, 스페이서(27)는 이의 제1 위치(28)에서 드라이브(5)에, 그리고 이의 제2 위치(29)에서 플랫폼(25)에 연결될 수 있다. 스페이서(27)가 베어링인 특정 실시예에서, 드라이브(5)는 이의 제1 레이스(즉, 내부 레이스)에 연결될 수 있고, 플랫폼(25)은 이의 제2 레이스(즉, 외부 레이스)에 연결될 수 있다. 따라서, 제1 위치(28)는 내부 레이스에 대응되고 제2 위치(29)는 제2 레이스에 대응된다.
스페이서(27)가 베어링이고 플랫폼(25)이 이의 외부 레이스에 연결되는 실시예에서, 플랫폼(25)은 제1 축선으로부터 오프셋된 제2 축선을 중심으로 회전 가능하다. 일부 실시예에서, 제2 축선은 플랫폼(25)의 회전 중심을 통과할 수 있다. 다른 실시예에서, 제2 축선은 플랫폼(25)의 회전 중심 이외의 지점을 통과할 수 있다. 제1 축선 및 제2 축선은, 기하학적 구조가 장치(1)의 작동 및 이의 요소들, 즉 하나 이상의 임팩트 브래킷 및 하나 이상의 임팩트 범퍼(이는 아래에서 더 자세히 설명될 것이다)의 삽입을 허용한다면, 임의의 거리만큼 오프셋될 수 있다. 특정 실시예에서, 제1 축선(즉, 제1 위치) 및 제2 축선(즉, 제2 위치)은 약 4 mm, 약 4.5 mm, 약 5 mm, 약 5.5 mm, 약 6 mm, 약 6.5 mm, 약 7 mm, 약 7.5 mm, 약 8 mm, 약 8.5 mm, 약 9 mm, 약 9.5 mm 또는 약 10 mm만큼 오프셋된다.
일부 실시예에서, 플랫폼(25)은 그 위에 세포 배양 용기를 위치시키는 것을 돕는 가이드 요소(30)를 더 포함할 수 있다. 가이드 요소(30)는 플랫폼(25)의 상부 표면으로부터 위쪽으로 상승된 핀 또는 리지(ridge)와 같은 (이에 한정되지 않음) 돌출부에 대응될 수 있다. 플랫폼(25) 상에 세포 배양 용기를 배치하는 것을 돕는 것 외에도, 가이드 요소(30)는 또한 장치(2)의 작동 동안 플랫폼(25)에 세포 배양 용기를 고정하는 것을 도울 수 있다.
플랫폼(25)이 사각형인 실시예에서, 가이드 요소(30)는 플랫폼(25)의 하나 이상의 코너에 위치될 수 있다. 특정 실시예에서, 가이드 요소(30)는 플랫폼(25)의 적어도 2개의 코너에 위치될 수 있다. 더 바람직한 실시예에서, 가이드 요소(30)는 플랫폼(25)의 네 코너 모두에 위치될 수 있다.
플랫폼(25)이 사각형이 아닌 실시예에서, 세포 배양 용기를 플랫폼(25)에 배치하고 선택적으로 고정하는 데 도움이 되는 구성으로 가이드 요소(30)를 적절하게 배열하는 것이 간단할 것이다.
장치(1)는 플랫폼(25)에 연결된 하나 이상의 충격 브래킷(35)을 더 포함할 수 있다. 충격 브래킷(35)은 플랫폼(25)의 임의의 부분, 예를 들어 하나 이상의 에지 또는 하부에 연결될 수 있지만 이에 제한되지 않는다. 세포 배양 용기의 풋프린트가 플랫폼(25)의 표면적보다 큰 경우, 충격 브래킷(35)의 상부 표면이 플랫폼(25)의 상측 평면 위로 돌출되지 않도록 하는 것이 중요할 수 있다.
충격 브래킷(35)은 임의의 재료로 만들어질 수 있지만, 과도한 마모 및 소음을 최소화하거나 방지하기 위해, 고무 또는 고무 유사 물질, 바람직하게는 비교적 조밀한 고무 또는 고무 유사 물질로 충격 브래킷(35)을 제조하는 것이 바람직할 수 있다. 대안적으로, 충격 브래킷(35)은 금속 또는 준금속과 같지만 이에 제한되지 않는 더 강하고 더 내구성있는 재료로 만들어 질 수 있고, 선택적으로 충격 부위에서 고무 또는 고무와 같은 물질로 캡핑될 수 있다.
특정 실시예에서, 장치(2)는 두 개의 충격 브래킷(35a 및 35b)을 포함한다. 충격 브래킷(35a 및 35b)은 플랫폼(25)의 밑면 또는 대향 에지에 연결될 수 있다. 임팩트 브래킷(35a 및 35b)을 포함하여 임팩트 브래킷(35)이 플랫폼(25)에 연결되는 위치에 관계 없이, 이들이 장착 표면(10)에 연결된 하나 이상의 충격 범퍼(40)와 접촉될 수 있다는 것이 중요하다.
충격 범퍼(40)는 일반적으로 장착 표면(10)의 상측 표면에 결합되고 장착 표면(10)으로부터 플랫폼(25)의 아래쪽을 향해 축방향으로 연장된다. 일부 실시예에서, 특히 충격 브래킷(35)이 플랫폼(25)의 밑면에 결합될 때, 충격 범퍼(40)는 일반적으로 장착 표면(10)과 플랫폼(25) 사이의 간격보다 작은 거리만큼 플랫폼 (25)의 밑면을 향해 연장된다.
충격 범퍼(40)는 임의의 재료로 만들어질 수 있으나, 과도한 마모와 소음을 최소화하거나 방지하기 위해, 고무 또는 고무 유사 물질, 바람직하게는 비교적 조밀한 고무 또는 고무 유사 물질로 충격 범퍼(40)를 제조하는 것이 바람직할 수 있다. 대안적으로, 충격 범퍼(40)는 금속 또는 준금속과 같지만 이에 제한되지 않는 더 강하고 더 내구성있는 재료로 만들어 질 수 있고, 선택적으로 충격 부위에서 고무 또는 고무와 같은 물질로 캡핑될 수 있다.
특정 실시예에서, 장치(2)는 사변형을 정의하기 위해 장착 표면(10) 상에 배열된 4개의 충격 범퍼(40a, 40b, 40c 및 40d)를 포함한다. 충격 범퍼(40a, 40b, 40c 및 40d)의 배열은 35a 또는 35b와 같은 임의의 하나의 충격 브래킷의 이동이 각각 40c 및 40d, 또는 40a 및 40b와 같은 2개의 충격 범퍼에 의해 경계를 이루는 점을 보장할 수 있다. 임의의 하나의 임팩트 브래킷의 이동이 두 개의 임팩트 범퍼로 제한되는 경우, 충격 브래킷 (및 따라서 플랫폼)의 이동은 2개의 충격 범퍼 사이에서 제한된다.
도 19를 참조하면, 충격 브래킷(35a 및 35b) 및 충격 범퍼(40a, 40b, 40c 및 40d)의 예시적인 배열이 도시된다. 단지 예시로서, 플랫폼(25)(도 19에 도시되지 않음)이 드라이브(5)의 직접적인 영향 하에 주어진 방향으로 회전될 때, 충격 브래킷(35a)은 충격 범퍼(40c)와 충돌한다. 스페이서(27)에 의해, 브래킷(35a)은 드라이브(5)의 회전과 무관하게 충격 범퍼(40d)를 향하여 리바운되고 그리고 잠재적으로 접촉될 수 있다. 충격 브래킷(35b) 및 충격 범퍼(40a 및 40b)에 대해서도 동일한 역학이 발생된다.
따라서, 하나 이상의 충격 범퍼(40)는 장착 표면(10)에 연결되고, 플랫폼(25)이 드라이브(5)의 영향 하에서 회전될 때, 하나 이상의 충격 브래킷(35)에 의해 접촉 가능하다. 하나 이상의 충격 브래킷(35)과 하나 이상의 충격 범퍼(40)의 반복적인 충돌은 플랫폼(25) 및, 안에 담겨진 내용물을 포함하여, 그 위에 있는 임의의 세포 배양 용기에 힘을 전달한다. 이러한 교반 또는 충격력은 세포 배양 용기에 담겨진 배양 세포의 하나 이상의 콜로니가 세포 덩어리 또는 클러스터와 같지만 이에 제한되지 않는 더 작은 단위로 해리되도록 할 수 있다.
장치(2)는 드라이브(5)의 출력을 조절하는 컨트롤러를 더 포함할 수 있다. 제어기를 조작함으로써, 드라이브(5)의 회전 방향, 드라이브(5)의 회전 속도; 및 드라이브(5)의 회전 가속도는 조정가능하다. 특정 실시예에서, 드라이브(5)의 회전 방향은 시계 방향일 수 있다. 다른 실시예에서, 드라이브(5)의 회전 방향은 반시계 방향일 수 있다. 보다 구체적인 실시예에서, 드라이브(5)의 회전 방향은 시계 방향 또는 반시계 방향일 수 있다. 여전히 보다 구체적인 실시예에서, 드라이브(5)의 회전 방향은 시계 방향과 반시계 방향 사이에서 진동될 수 있다.
장치(2)는 장치의 작동에 대한 피드백을 수신하기 위해 가속도계 또는 광학 플래그 센서와 같은 센서를 더 포함할 수 있다.
장치(2)는 플랫폼의 배향을 제공하는 홈 센서를 더 포함할 수 있다.
장치를 사용하는 방법
본 발명의 다른 양태에서, 장치(2)는 세포 배양물에서 하나 이상의 콜로니를 해리하는 방법에 사용될 수 있다. 비제한적인 실시 양태에서, 세포 배양은 하나 이상의 콜로니에 포함된 다능성 줄기 세포의 배양일 수 있다. 보다 구체적인 비제한적 실시예에서, 세포 배양물에서 하나 이상의 콜로니는 다능성 줄기 세포의 배양물에서 하나 이상의 미분화 콜로니일 수 있고, 선택적으로 다능성 줄기 세포는 인간의 것이다.
본 발명의 다른 양태에서, 장치(2)는 세포 배양 용기의 웰 내의 배양 배지에 시딩된 세포를 분배하는 방법에서, 또는 세포외 매트릭스와 같은 코팅 물질로 세포 배양 용기의 웰을 코팅하는 방법에서 사용될 수 있다.
이어지는 방법은 본 발명에 따른 장치를 제공하는 단계, 및 세포 배양물에서 하나 이상의 콜로니를 담고 있는 세포 배양 용기를 장치 상에 배치하는 단계에 의존한다. 특정 실시예에서 세포 배양 용기를 스테이지에 고정하는 것이 바람직할 수 있다. 예를 들어, 세포 배양 용기는 세포 배양 용기와 가이드 요소의 협력을 통해 스테이지에 고정될 수 있다.
일부 실시예에서, 세포 배양물은 분리 용액의 존재 하에서 인큐베이트될 수 있었으며, 이 분리 용액은 이후에 제거되거나, 비활성화되거나 또는 중화될 수 있거나, 되지 않을 수 있다. 분리 용액을 사용하는 것은 배양된 세포의 하나 이상의 콜로니가 세포 배양 용기의 웰 바닥에 직접 또는 간접적으로 부착될 때 바람직할 수 있다. 분리 용액의 일반적인 예로는 ReLeSRTM (STEMCELL Technologies Inc.) 및 STEMdiffTM Neural Rosette Selection Reagent (STEMCELL Technologies Inc.)를 포함한다. 일반적으로 분리 용액, 특히 ReLeSRTM 및 STEMdiffTM Neural Rosette Selection Reagent와 관련하여, 이러한 분리 용액은 짧은 기간 동안 (예를 들어, 1 내지 15 분 동안) 적절한 세포 배양물에 첨가될 수 있고, 이후 추가 기간 동안 세포 배양물을 인큐베이트하기 전에 제거될 수 있다. 이러한 인큐베이션 후, 콜로니의 일부 또는 전부가 웰 바닥에서 분리되거나 최소한의 힘에 반응하여 웰 바닥으로부터 분리되는 경향이 있다.
다른 실시예에서, 세포 배양물은 해리 용액의 존재 하에서 인큐베이트될 수 있었으며, 이 해리 용액은 이후에 제거되거나, 비활성화되거나 또는 중화될 수 있거나, 되지 않을 수 있다. 단층으로 성장하는 세포와 작업할 때 해리 용액을 사용하는 것이 바람직할 수 있다. 해리 용액의 일반적인 예는 트립신이다. 당업자는 특정 세포주 또는 세포 유형에 대해 해리 용액에 대한 과도한 노출이 세포 배양물에서 하나 이상의 콜로니를 완전히 해리시키고/거나 세포 배양물을 손상시킬 수 있다는 점을 인식할 것이다.
또 다른 실시예에서, 세포 배양물은, 분리 또는 해리 용액의 존재 하에 세포 배양물을 배양하는 동안, 장치 상에 위치될 수 있다. 이러한 실시예에서, 세포 배양물에서 하나 이상의 콜로니는 본 발명의 장치를 사용하여 동시에 해리될 수 있거나, 또는 충분한 배양 기간 후에 본 발명의 장치를 사용하여 즉시 해리될 수 있다. 일부 실시예에서, 특정 분리 또는 해리 용액은 주어진 온도(즉, 37°C 이상)에서 최적으로 작용될 수 있다. 일부 실시예에서, 플랫폼 및/또는 장치 또는 플랫폼을 둘러싸는 인클로저를 가열하기 위해 본원에서 설명된 장치에 가열 요소를 제공하는 것이 바람직할 수 있다.
상술된 분리 또는 해리 관행에 관계 없이, 세포 배양물이 충분한 시간 동안 인큐베이트된 후, 세포 배양물에서 하나 이상의 콜로니는 본 발명에 기재된 바와 같은 장치를 사용하여 더 작은 단위로 해리될 준비가 될 수 있다. 상술된 바와 같이, 드라이브의 영향으로 플랫폼을 회전 시키면 하나 이상의 임팩트 브래킷이 하나 이상의 임팩트 범퍼와 접촉하게 되어, 이로써 세포 배양물에서 하나 이상의 콜로니에 해리력이 전달된다.
일부 실시예에서, 드라이브의 회전 속도 및 따라서 플랫폼의 회전 속도를 조정하는 단계는 세포 배양물에서 하나 이상의 콜로니를 최적으로 해리시키기 위해 바람직할 수 있다. 드라이브의 회전 속도를 위쪽으로 조정하면 충격 주파수가 증가된다. 마찬가지로, 드라이브의 회전 속도를 아래쪽으로 조정하면 충격 주파수가 감소된다. 당업자는 적절한 충격 빈도가 배양된 특정 세포주 또는 세포 유형에 의존될 수 있다는 점을 인식할 것이다.
일부 실시예에서, 드라이브의 회전 방향을 조정하는 단계는 세포 배양물에서 하나 이상의 콜로니를 최적으로 해리시키기 위해 바람직할 수 있다. 일 실시예에서, 스테이지를 회전시키는 단계는 시계 방향으로 이다. 다른 실시예에서, 스테이지를 회전시키는 단계는 반시계 방향으로 이다. 또 다른 실시예에서, 스테이지를 회전시키는 단계는 시계 방향 또는 반시계 방향으로 이다.
또 다른 실시예에서, 스테이지를 회전시키는 단계는 시계 방향 또는 반시계 방향 사이에서 진동되는 단계를 포함할 수 있다. 스테이지의 회전 방향을 시계 방향 및 반시계 방향으로 진동시키는 단계를 포함하는 실시예에서, 진동은 시계 방향과 반시계 방향으로 회전하는 사이에 5 초 미만의 지연을 포함할 수 있다. 스테이지의 회전 방향을 시계 방향 및 반시계 방향으로 진동시키는 단계를 포함하는 좀 더 구체적인 실시예에서, 진동은 시계 방향과 반시계 방향으로 회전하는 사이에 1 초 미만의 지연을 포함할 수 있다. 스테이지의 회전 방향을 시계 방향 및 반시계 방향으로 진동시키는 단계를 포함하는 여전히 좀 더 구체적인 실시예에서, 진동은 시계 방향과 반시계 방향으로 회전하는 사이에 약 0.5 밀리세컨드 이하의 지연을 포함할 수 있다.
드라이브의 속도, 방향 또는 회전 가속도를 조정하는 것을 포함하는 일부 실시예에서, 이러한 작동은 전술된 바와 같이 제어기에 의해 달성될 수 있다. 따라서, 본원에 개시된 방법의 특정 실시예는 제어기를 사용하여 드라이브의 회전 속도, 방향 또는 가속도를 제어하는 단계를 더 포함할 수 있다.
본원에 개시된 방법의 일부 실시예는 특히 인간 다능성 줄기 세포와 같지만 이에 제한되지 않는 다능성 줄기 세포의 하나 이상의 미분화 콜로니를 해리시키는 것에 관한 것이다. 이러한 방법에서, 다능성 줄기 세포의 미분화된 콜로니를 선택적으로 분리하기 위해 ReLeSRTM과 같은, 그러나 이에 한정되지 않는 특정 분리 용액의 선호도를 이용하는 것이 바람직할 수 있다. 따라서, ReLeSRTM과 같은 그러나 이에 한정되지 않는 선택적 분리 용액을 본 발명의 장치의 사용과 쌍을 이루는 방법은 유리하게는 세포 배양물에 존재하는 원하는 하나 이상의 콜로니를 더 작은 단위로 해리하는 동시에 원하는 세포 유형을 선택할 수 있다.
세포 배양물에서 인간 다능성 줄기 세포의 하나 이상의 미분화 콜로니를 해리하는 하나의 실시예에서, ReLeSRTM과 같은, 그러나 이에 제한되지 않는 분리 용액은 인간 다능성 줄기 세포의 미분화 콜로니가 세포 배양 용기의 웰의 웰 바닥에 대한 부착을 약화시킬 수 있다. 세포 배양 배지와 같은, 그러나 이에 한정되지 않는 일 부피의 용액을 웰에 첨가한 후, 인간 다 능성 줄기 세포의 하나 이상의 콜로니 중 일부 또는 전부가 웰 바닥으로부터 분리되어 용액에 현탁될 수 있다. 웰 바닥에 부착된 인간 다능성 줄기 세포의 나머지 미분화 콜로니는, 드라이브의 영향으로 플랫폼을 회전하고 하나 이상의 충격 브래킷과 하나 이상의 충격 범퍼를 반복적으로 충돌 할 때, 웰 바닥으로부터 분리될 수 있다. 인간 다능성 줄기 세포의 하나 이상의 미분화 콜로니의 선택과 동시에, 이러한 콜로니는 서로 충돌하고 세포 배양 용기의 웰 벽에 부딪히면서 더 작은 단위(즉, 덩어리)로 분해된다.
분화 실험 동안과 같은, 그러나 이에 한정되지 않는 대안적인 실시예에서, 다능성 줄기 세포의 하나 이상의 분화된 콜로니를 선택하는 것이 바람직할 수 있다. 상술된 바와 동일한 과정에 따라, 분리되고 해리된 다능성 줄기 세포를 흡인하고 세포 배양 용기의 웰로부터 폐기하여 추가 배양 또는 처리를 위해 웰 바닥에 부착된 관심의 (분화) 콜로니를 생성할 수 있다.
본원에서 설명된 출원인의 교시는 예시 목적을 위해 다양한 실시예와 관련되어 있지만, 본 출원인의 교시는, 본원에 설명된 실시예가 예시이도록 의도된 바와 같이, 이러한 실시예에 제한되는 것으로 의도되지 않는다. 반대로, 본원에 설명되고 예시된 출원인의 교시는, 본원에서 설명된 실시예, 즉 첨부된 청구범위에서 정의된 일반적 범위를 벗어나지 않으면서, 다양한 대안, 수정 및 등가물을 포함한다.

Claims (73)

  1. 세포 배양 용기 내의 세포 배양 배지에서 세포 배양물을 적응적으로 계대(passaging)하기 위한 자동화 시스템에 있어서, 상기 자동화 시스템은:
    제1 시점 및 하나 이상의 후속 시점에서 상기 세포 배양물의 하나 이상의 이미지를 캡처하기 위한 이미징 모듈;
    하나 이상의 피펫(pipette)의 단부와 결합 가능한 피펫 팁(tip)을 통해 상기 세포 배양 용기로부터 유체를 끌어들이기 위한 상기 하나 이상의 피펫을 갖는 피펫 모듈;
    상기 피펫 모듈로부터 이격되고, 둘 이상의 용액 리저버(reservoir)와 유체 연통되며, 상기 둘 이상의 용액 리저버 각각에 담긴 용액을 상기 세포 배양 용기로 분배시키고, 상기 둘 이상의 용액 리저버 중 어느 하나와 유체 연통되는 둘 이상의 도관을 포함하는 액체 디스펜서(dispenser) 모듈;
    상기 자동화 시스템 내에서 상기 세포 배양 용기 또는 딸 세포 배양 용기를 잡고 운반하기 위한, 그리고 상기 세포 배양 용기의 뚜껑 또는 상기 딸 세포 배양 용기의 뚜껑을 잡고 운반하기 위한 한 쌍의 대향 가능한 아암(opposable arm)을 갖는 핸들링 모듈; 및
    상기 이미징 모듈, 상기 피펫 모듈, 상기 액체 디스펜서 모듈 및 상기 핸들링 모듈과 통신하는 적어도 하나의 프로세서를 포함하되,
    상기 프로세서는:
    상기 이미징 모듈로부터 상기 하나 이상의 이미지를 수신하고;
    상기 이미징 모듈로부터 수신된 상기 하나 이상의 이미지에 기반하여, 상기 세포 배양물의 하나 이상의 특성을 계산하고;
    상기 세포 배양물을 계대시키게끔 자동화된 계대 프로토콜을 실행하도록 구성되며,
    상기 프로토콜은, 상기 세포 배양물의 상기 계산된 하나 이상의 특성을:
    a) 상기 하나 이상의 특성에 대한 학습된 임계 레벨; 또는
    b) 상기 하나 이상의 특성에 대한 입력된 임계 레벨
    과 비교하는 것에 기반하여, 상기 피펫 모듈, 상기 액체 디스펜서 모듈 및 상기 이미징 모듈의 작업을 조정하는 것을 포함하는, 자동화 시스템.
  2. 제1항에 있어서,
    상기 하나 이상의 특성은:
    a) 상기 세포 배양물의 컨플루언스(confluence)의 측정치;
    b) 상기 세포 배양물의 콜로니(colony) 또는 세포의 형태의 측정치;
    c) 상기 세포 배양물의 콜로니 또는 세포의 분화의 측정치;
    d) 상기 세포 배양물의 콜로니 크기 분포의 측정치;
    e) 상기 제1 시점으로부터 상기 하나 이상의 후속 시점까지 a), b), c) 또는 d)의 변화의 측정치; 또는
    f) b), c) 또는 d)에 대한 a)의 측정치, a), c) 또는 d)에 대한 b)의 측정치, a), b) 또는 d)에 대한 c)의 측정치, 또는 a), b) 또는 c)에 대한 d)의 측정치를 포함하는, 자동화 시스템.
  3. 제2항에 있어서,
    상기 학습된 또는 상기 입력된 임계 레벨은:
    i. a)의 경우, 세포 또는 콜로니 컨플루언스에 대해 30 내지 90%;
    ii. b)의 경우, 대조군 배양물의 ±30%;
    iii. c)의 경우, 유지 프로토콜에서 대조군 배양물의 0 내지 30% 또는 분화 프로토콜에서 대조군 배양물의 50% 내지 100%; 또는
    iv. d)의 경우, 대조군 배양물의 평균 콜로니 크기 분포의 15% 이내 또는 이의 하위분획(subfraction)
    으로 하는, 자동화 시스템.
  4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 세포 배양 용기에서의 상기 세포 배양물 및 제2 세포 배양 용기에서의 제2 세포 배양물에 대해 계산된 상기 하나 이상의 특성이, 상기 제1 시점에서 또는 상기 하나 이상의 후속 시점에서 상이하고, 상기 하나 이상의 특성은 후속 계대 동안 더 일관성이 있게 되는, 자동화 시스템.
  5. 삭제
  6. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 세포 배양 용기를 지지하기 위한 스테이지(stage) 모듈을 더 포함하는, 자동화 시스템.
  7. 제6항에 있어서,
    상기 스테이지 모듈은 제1 축선 또는 제2 축선, 또는 둘 모두를 따라 제1 평면에서 이동 가능한, 자동화 시스템.
  8. 제6항에 있어서,
    상기 스테이지 모듈 또는 이의 하위 구성요소는 제3 축선을 따른 이의 에지(edge)를 중심으로 피벗(pivot)되는, 자동화 시스템.
  9. 삭제
  10. 삭제
  11. 삭제
  12. 삭제
  13. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서,
    적어도 상기 이미징 모듈, 피펫 모듈, 액체 디스펜서 모듈, 스테이지 모듈 및 핸들링 모듈을 하우징(housing)하는 인클로저(enclosure)를 더 포함하는, 자동화 시스템.
  14. 제13항에 있어서,
    상기 인클로저는 멸균인, 자동화 시스템.
  15. 제13항에 있어서,
    (i) 둘 이상의 용액 리저버 중 하나 이상을 저장하기 위한 냉동 모듈; 및 (ii) 폐기물 리저버; 를 더 포함하되, 상기 둘 이상의 용액 리저버, 상기 냉동 모듈 및 상기 폐기물 리저버는 상기 인클로저의 외부에 있는, 자동화 시스템.
  16. 제15항에 있어서,
    상기 폐기물 리저버는 상기 인클로저 내의 폐기물 트로프(trough)와 유체 연통되는, 자동화 시스템.
  17. 제16항에 있어서,
    상기 폐기물 트로프는 소수성 코팅물로 코팅되는, 자동화 시스템.
  18. 제15항에 있어서,
    하나 이상의 센서를 더 포함하되, 상기 하나 이상의 센서는,
    a) 상기 이미징 모듈 상의, 상기 스테이지 모듈 상의, 또는 상기 둘 이상의 용액 리저버 내의 로드의 질량을 검출하고;
    b) 상기 로드의 상기 질량이 예상과 다를 때 경고를 트리거(trigger)하도록 구성되는, 자동화 시스템.
  19. 제13항에 있어서,
    상기 인클로저와 인큐베이터 모듈을 연결하고 상기 세포 배양 용기를 상기 인큐베이터 모듈로부터 상기 핸들링 모듈의 부근으로 운반하기 위한, 폐쇄된 컨베이어 모듈을 더 포함하는, 자동화 시스템.
  20. 삭제
  21. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서,
    그래픽 사용자 인터페이스를 더 포함하는, 자동화 시스템.
  22. 제21항에 있어서,
    상기 그래픽 사용자 인터페이스는 상기 둘 이상의 용액 리저버 각각에 대한 유체 레벨 보고를 표시하는, 자동화 시스템.
  23. 삭제
  24. 삭제
  25. 삭제
  26. 삭제
  27. 삭제
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  41. 삭제
  42. 삭제
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  44. 삭제
  45. 세포 배양물을 적응적으로 계대(passaging)하기 위한 자동화 방법에 있어서, 상기 방법은:
    세포 배양 용기 내의 세포 배양 배지에 상기 세포 배양물을 제공하는 단계;
    상기 세포 배양 용기 내의 상기 세포 배양 배지에서 상기 세포 배양물을 적응적으로 계대하기 위한 자동화 시스템을 제공하는 단계;
    제1 시점 및 하나 이상의 후속 시점에서 상기 세포 배양물의 하나 이상의 이미지를 이미징 모듈에 의하여 캡처하는 단계;
    상기 하나 이상의 이미지에 기반하여 상기 이미징 모듈에 통신적으로 결합된 적어도 하나의 프로세서에 의해 상기 세포 배양물의 하나 이상의 특성을 계산하는 단계; 및
    상기 계산된 세포 배양물의 하나 이상의 특성을:
    a) 상기 하나 이상의 특성에 대한 학습된 임계 레벨; 또는
    b) 상기 하나 이상의 특성에 대한 미리 결정된 임계 레벨
    과 비교하는 것에 기반하여, 자동화된 계대 프로토콜을 적어도 하나의 프로세서에 의해 실행하는 단계;를 포함하되,
    상기 자동화 시스템은, 피펫 모듈로부터 이격되고 둘 이상의 용액 리저버와 유체 연통되는 액체 디스펜서 모듈을 포함하고, 상기 둘 이상의 용액 리저버 각각에 담긴 용액은 상기 액체 디스펜서 모듈을 통해 상기 세포 배양 용기로 분배되며, 상기 액체 디스펜서 모듈은 둘 이상의 도관을 포함하고, 상기 도관 각각은 상기 둘 이상의 용액 리저버와 유체 연통되는 것을 특징으로 하는, 자동화 방법.
  46. 제45항에 있어서,
    상기 하나 이상의 특성은:
    a) 상기 세포 배양의 컨플루언스(confluence)의 측정치;
    b) 상기 세포 배양의 콜로니(colony) 또는 세포의 형태의 측정치;
    c) 상기 세포 배양의 콜로니 또는 세포의 분화의 측정치;
    d) 상기 세포 배양물의 콜로니 크기 분포의 측정치;
    e) 상기 제1 시점으로부터 상기 하나 이상의 후속 시점까지 a), b), c) 또는 d)의 변화의 측정치; 또는
    f) b), c) 또는 d)에 대한 a)의 측정치, a), c) 또는 d)에 대한 b)의 측정치, a), b) 또는 d)에 대한 c)의 측정치, 또는 a), b) 또는 c)에 대한 d)의 측정치
    를 포함하는, 자동화 방법.
  47. 제46항에 있어서,
    상기 학습된 또는 상기 미리 결정된 임계 레벨은:
    i. a)의 경우, 세포 또는 콜로니 컨플루언스에 대해 30 내지 90%;
    ii. b)의 경우, 대조군 배양물의 ±30%;
    iii. c)의 경우, 유지 프로토콜에서 대조군 배양물의 0 내지 30% 또는 분화 프로토콜에서 대조군 배양물의 50% 내지 100%; 또는
    iv. d)의 경우, 대조군 배양물의 평균 콜로니 크기 분포의 15% 이내 또는 이의 하위분획(subfraction)
    으로 하는, 자동화 방법.
  48. 제45항 내지 제47항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 세포 배양 용기에서의 상기 세포 배양물 및 제2 세포 배양 용기에서의 제2 세포 배양물에 대해 계산된 상기 하나 이상의 특성이, 상기 제1 시점에서 또는 상기 하나 이상의 후속 시점에서 상이하고, 상기 하나 이상의 특성은 후속 계대 동안 더 일관성이 있게 되는, 자동화 방법.
  49. 제45항 내지 제47항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 세포 배양물을 제공하는 단계는 인큐베이터로부터 상기 세포 배양물을 전달하는 단계를 포함하는, 자동화 방법.
  50. 제45항 내지 제47항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 세포 배양 용기를 스테이지(stage) 모듈 상에 위치시키는 단계를 더 포함하는, 자동화 방법.
  51. 제45항 내지 제47항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 세포 배양물로부터 세포 현탁액을 수득하는 단계, 및 딸 세포 배양 용기의 세포 현탁액의 일부 또는 전부를 시딩(seeding)하는 단계를 더 포함하는, 자동화 방법.
  52. 제51항에 있어서,
    상기 딸 세포 배양 용기에 시딩하는 단계 전에, 상기 세포 현탁액이 제1 피펫 팁을 통과하여, 상기 세포 배양물을 단일 세포 현탁액 안으로, 또는 평균 직경이 상기 제1 피펫 팁의 보어(bore) 직경을 초과하지 않는 복수의 덩어리로 해리시키는, 자동화 방법.
  53. 제51항에 있어서,
    상기 세포 현탁액을 수득하는 단계는, 상기 세포 배양 용기로부터 상기 세포 배양 배지를 흡인하는 단계, 및 상기 세포 배양 용기 내의 상기 세포 배양물을 분리 용액과 접촉시키는 단계를 포함하는, 자동화 방법.
  54. 제53항에 있어서,
    상기 분리 용액이 분획 용액이고, 상기 분획 용액이 상기 세포 배양 용기의 벽으로부터 분화된 세포의 제1 집단 또는 미분화 세포의 제2 집단을 선택적으로 분리하는, 자동화 방법.
  55. 삭제
  56. 삭제
  57. 제45항 내지 제47항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 세포 배양물은 다능성(pluripotent) 줄기 세포인, 자동화 방법.
  58. 제57항에 있어서,
    상기 다능성 줄기 세포는 인간 다능성 줄기 세포인, 자동화 방법.
  59. 제57항에 있어서,
    상기 다능성 줄기 세포는 덩어리로서 계대되는, 자동화 방법.
  60. 삭제
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