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KR102813034B1 - 쇠돌고래 라브도바이러스에 특이적으로 결합하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편, 및 이들의 용도 - Google Patents

쇠돌고래 라브도바이러스에 특이적으로 결합하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편, 및 이들의 용도 Download PDF

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KR102813034B1
KR102813034B1 KR1020230163366A KR20230163366A KR102813034B1 KR 102813034 B1 KR102813034 B1 KR 102813034B1 KR 1020230163366 A KR1020230163366 A KR 1020230163366A KR 20230163366 A KR20230163366 A KR 20230163366A KR 102813034 B1 KR102813034 B1 KR 102813034B1
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KR
South Korea
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antibody
hprv
antigen
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scfv
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KR1020230163366A
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이택견
정승원
이석찬
아구스 리니 이카
마리오 마르웨스리
미사에 키바
이아림
Original Assignee
한국해양과학기술원
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Abstract

본 발명은 쇠돌고래 라브도바이러스(Harbour Porpoise Rhabdovirus : HPRV)에 특이적으로 결합하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편, 및 이들의 용도에 관한 것이다. 본 발명의 HPRV GP 항원 단백질에 대한 scFv 항체를 이용하면, HPRV GP에 높은 특이성, 결합력 및 친화도를 나타내는 scFv를 얻을 수 있어서, 감염 시 집단폐사를 야기할 수 있는 HPRV를 정확하고 신속하며 경제적으로 검출할 수 있다.

Description

쇠돌고래 라브도바이러스에 특이적으로 결합하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편, 및 이들의 용도{Antibody or antigen binding fragment thereof specifically binding to Harbour Porpoise Rhabdovirus and Uses thereof}
본 발명은 쇠돌고래 라브도바이러스(Harbour Porpoise Rhabdovirus : HPRV)에 특이적으로 결합하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편, 및 이들의 용도에 대한 것으로, 보다 구체적으로는 인간 scFv 라이브러리를 이용하여 분리한 쇠돌고래 라브도바이러스(HPRV) 당단백질 특이적 scFv, 이의 제조 방법 및 이를 이용한 검출용 조성물에 관한 것이다.
바이러스 검출하는 방법 중 하나인 혈청학적 분석 방법은 항체를 이용하는 분석 방법이다. 이러한 항체를 생산하기 위해서는 동물의 희생을 필요로 하거나 동물세포 배양에서 높은 비용이 요구되며, 많은 시간이 소요된다.
또한, 이러한 항체를 생산하기 위해서는 바이러스 항원을 확보해야 하는데, 국내에서 얻기 어려운 바이러스의 경우, 항원 확보에 어려움이 있어 새로운 바이러스에 대한 대응속도가 떨어진다.
한편, 쇠돌고래 라브도바이러스(HPRV)는 라브도바이러스과(Rhabdoviridae)에 속하는 바이러스로서, 가오리 지느러미 어류와 해양 포유류의 중요한 병원균을 포함하는 음성 가닥 RNA 바이러스이다. 라브도바이러스과는 생태학적으로 다양한 대규모 바이러스과로 식물, 척추동물 및/또는 무척추동물을 감염시키고, 전 세계적으로 어업 생산에 높은 손실을 유발한다. 그러나, HPRV를 조기에 검출하거나 이의 감염 여부를 진단하고, HPRV에 의한 질병을 예방, 제어 또는 치료하는 데에 효과적인 확립된 방법이 없는 실정이다.
대한민국 공개특허 제10-2023-0016193호 (2023.02.01. 공개)
본 발명자들은 가오리 지느러미 어류와 해양 포유류 등에 감염되었을 시 매우 심각한 피해를 야기할 수 있는 것으로 보고되고 있는 HPRV 항원 단백질의 대량 생산 및 이를 검출하는 scFv(single-chain variable fragment)를 선발하는 시스템을 개발하고자 예의 연구 노력하였다. 그 결과, HPRV에 대한 진단 항원을 확보하고 이에 대한 scFv 항체를 신속하게 개발함으로써, 바이러스에 신속한 대응이 가능하며 항체 유전자를 확보하여 항체 공학을 통한 혈청학적 분석 키트를 완성하였다.
따라서, 본 발명의 목적은 쇠돌고래 라브도바이러스(HPRV)에 특이적으로 결합하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 제공하는 것이다.
또한, 본 발명의 또 다른 목적은 본 발명에 따른 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 포함하는 HPRV 검출용 조성물을 제공하는 것이다.
또한, 본 발명의 다른 목적은 본 발명에 따른 HPRV 검출용 조성물을 포함하는 HPRV 검출용 키트를 제공하는 것이다.
또한, 본 발명의 또 다른 목적은 본 발명에 따른 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 핵산 분자를 제공하는 것이다.
또한, 본 발명의 다른 목적은 본 발명에 따른 핵산 분자를 포함하는 재조합 벡터를 제공하는 것이다.
또한, 본 발명의 또 다른 목적은 본 발명에 따른 재조합 벡터를 포함하는 분리된 숙주세포를 제공하는 것이다.
또한, 본 발명의 다른 목적은 본 발명에 따른 HPRV에 특이적으로 결합하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편의 제조방법을 제공하는 것이다.
또한, 본 발명의 또 다른 목적은 본 발명에 따른 HPRV 검출용 조성물을 이용한 HPRV 검출 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 일 실시형태는, 다음을 포함하는 쇠돌고래 라브도바이러스(Harbour Porpoise Rhabdovirus : HPRV)에 특이적으로 결합하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편이다:
i) 서열번호 8로 표시되는 아미노산 서열로 이루어진 CDR(complementarity determining region)-H1, 서열번호 9로 표시되는 아미노산 서열로 이루어진 CDR-H2, 및 서열번호 10으로 표시되는 아미노산 서열로 이루어진 CDR-H3를 포함하는 중쇄가변영역(variable heavy chain); 및 서열번호 15로 표시되는 아미노산 서열로 이루어진 CDR-L1, 서열번호 16으로 표시되는 아미노산 서열로 이루어진 CDR-L2, 및 서열번호 17로 표시되는 아미노산 서열로 이루어진 CDR-L3을 포함하는 경쇄가변영역(variable light chain); 또는
ii) 서열번호 22로 표시되는 아미노산 서열로 이루어진 CDR-L1, 서열번호 23으로 표시되는 아미노산 서열로 이루어진 CDR-L2, 및 서열번호 24로 표시되는 아미노산 서열로 이루어진 CDR-L3을 포함하는 경쇄가변영역(variable light chain).
본 명세서에서 '쇠돌고래 라브도바이러스(Harbour Porpoise Rhabdovirus : HPRV)'는 라브도바이러스과(Rhabdoviridae)에 속하는 바이러스로서, 해양 동물 중에서 주로 쇠돌고래에서 발견되고, 기후 변화로 인해 위협적인 인수공통전염병의 가능성을 가진다.
라브도바이러스과(Rhabdoviridae)는 가오리 지느러미 어류와 해양 포유류의 중요한 병원균을 포함하는 음성 가닥 RNA 바이러스의 큰 과이다. 라브도바이러스과는 생태학적으로 다양한 대규모 바이러스과로서 식물, 척추동물 및/또는 무척추동물을 감염시키며, 대부분의 라브도바이러스는 절지동물의 벡터를 통해 복제되어 전염된다. 일반적으로 라브도바이러스 음성 단일 가닥의 RNA 게놈은 5개의 구조 단백질 유전자(N, P, M, G, L)를 포함하고, 비구조적 보조 단백질을 코딩하는 추가 유전자를 포함한다. 동물성 라브도바이러스의 경우, 외피로 둘러싸인 Virion은 일반적으로 표면 돌출부가 두드러진 총알 모양이며 나선형 대칭으로 단단히 조립된 관 형태의 뉴클레오캡시드를 포함한다. 어류와 해양 포유류를 감염시키는 라브도바이러스는 어류 양식업에 상당한 경제적 영향을 미치고 야생 어류 개체군에 환경적 영향을 미칠 수 있는 중요한 병원균을 포함한다.
그 중에서 HPRV는 돌고래 라브도바이러스(DRV)와 계통 발생학적으로 군집을 이루며, 이 고래류 라브도바이러스 군집은 북극곰, 피니피즈, 쇠돌고래 등 어류와 기타 해양 포유류를 감염시키는 페브라도바이러스(Perhabdovirus) 속과 자매 그룹인 것으로 밝혀졌다.
이러한 라브도바이러스(Rhabdovirus : RV)들은 어류에서 숙주로 이동 후 발생 가능성이 있으며, 라브도바이러스과에 속하는 새로운 속(屬)에 속한다. 또한, 이 바이러스의 감염은 HPRV 분리와 관련된 궤양성 귀두염 외에도 여러 장기에서 다양한 기생충 병변을 나타내는 것으로 알려졌다. 또한 해양 동물에게 많은 사망을 초래할 수 있다. 더욱이, HPRV에 의한 해양 바이러스 감염의 또 다른 문제는 종간 감염과 인수공통전염병의 발생 가능성이다.
이에 따라, HPRV에 대한 우수한 검출 시스템 개발이 시급한 실정이었다.
앞서 언급한 바와 같이, 항체를 이용한 ELISA 등의 분석 방법은 항체를 생산하는 데에 동물의 희생, 높은 비용 및 많은 시간이 요구된다. 또한, 항체를 생산하기 위한 바이러스 항원의 확보에 어려움이 있는 경우, 새로운 바이러스에 대한 대응 속도가 떨어지는 단점이 있다.
본 발명자들은 DNA 염기서열로부터 쇠돌고래 라브도바이러스 당단백질(HPRV GP) 항원을 합성하고, HPRV GP의 항원 펩타이드(BSA 접합물)와 scFv 라이브러리 간의 바이오-패닝을 통해 수득한 HPRV GP에 대해 높은 특이성과 결합력을 갖는 scFv를 수득하였으며, 수득한 scFv를 이용하여 유의한 HPRV에 대한 진단능을 확인하였다. 따라서, 본 발명의 scFv는 종래의 HPRV의 조기 검출 및 진단 방법에 대한 유망한 대안이다.
항체는 바이러스 감염을 무력화하며, 탐지 시스템의 도구로 사용한다. 대표적인 항체 기술 중 하나가 scFv(single chain Fragment variable)이다. scFv는 짧은 펩타이드 링커로 연결된 가변 영역, 경쇄(VL)와 중쇄(VH)로 구성된다. scFv의 장점은 작은 크기, 낮은 면역원성, 높은 특이성, 유전자 조작이 가능한 점이다. scFv는 대장균 발현 시스템에서 생산할 수 있으며 대량 생산이 가능하다. scFv는 전장 IgG보다 작지만 완전한 항원 결합 부위를 유지한다. 따라서 바이러스성 질병의 예방 및 치료를 위한 잠재적 시약으로 여긴다. 그 결과, 본 발명자들은 HPRV의 진단 항원을 확보하고 이에 대한 scFv 항체를 빠르게 개발함으로써 바이러스에 빠르게 대응하고 항체 유전자를 확보하여 항체 엔지니어링을 통해 혈청학적 분석 키트를 완성하였다.
본 명세서에서, 용어 “HPRV GP(Glyco Protein of Harbour Porpoise Rhabdovirus)"는 쇠돌고래 라브도바이러스의 당단백질(Glyco Protein, GP)을 의미한다. HPRV GP는 라브도바이러스과에서 보존된 부위(ORF72, open reading frame 72)로 간주되므로, 본 발명에서 항원 표적으로 선택되었다.
후술하는 실시예에서 확인할 수 있는 바와 같이, 본 발명자들은 HPRV GP의 항원 펩타이드(BSA 접합물)와 scFv 라이브러리 간의 바이오-패닝을 4번째 라운드까지 거쳐 높은 친화도를 보인 23개의 scFv 후보를 선별하였고, 그 중에서도 scFv E4 및 C8의 경우는 정지 코돈이 없는 scFv의 전체 서열을 가지면서, 정지 코돈이나 돌연변이가 없어서 생산성이 우수하다는 것을 확인한 후, 본 발명을 완성하였다.
이렇게 선정된 본 발명에 따른 scFv 클론인 E4는, i) 서열번호 8로 표시되는 아미노산 서열로 이루어진 CDR(complementarity determining region)-H1, 서열번호 9로 표시되는 아미노산 서열로 이루어진 CDR-H2, 및 서열번호 10으로 표시되는 아미노산 서열로 이루어진 CDR-H3를 포함하는 중쇄가변영역(variable heavy chain); 및 서열번호 15로 표시되는 아미노산 서열로 이루어진 CDR-L1, 서열번호 16으로 표시되는 아미노산 서열로 이루어진 CDR-L2, 및 서열번호 17로 표시되는 아미노산 서열로 이루어진 CDR-L3을 포함하는 경쇄가변영역(variable light chain)을 가진다.
또한, 본 발명에 따른 scFv 클론인 C8는 ii) 서열번호 22로 표시되는 아미노산 서열로 이루어진 CDR-L1, 서열번호 23으로 표시되는 아미노산 서열로 이루어진 CDR-L2, 및 서열번호 24로 표시되는 아미노산 서열로 이루어진 CDR-L3을 포함하는 경쇄가변영역(variable light chain)을 가진다.
본 발명에 따른 scFv 클론인 E4와 C8은 모두 HPRV GP 단백질과의 결합 친화도가 우수하였고, HPRV에 특이적으로 결합하였다. 그리고, C8에는 VL 서열만 있지만, E4는 VH와 VL에 해당하는 scFv 전체 서열을 갖고 있어서, 결합력이 더 높은 것으로 확인되었다.
이와 같이, 본 발명의 HPRV GP 항원 단백질에 대한 scFv 항체를 이용하면, HPRV GP에 높은 특이성, 결합력 및 친화도를 나타내는 scFv를 얻을 수 있어서, 감염 시 집단폐사를 야기할 수 있는 HPRV를 정확하고 신속하며 경제적으로 검출할 수 있는 효과가 있다.
본 발명의 일 예로서, 상기 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 다음을 포함하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편이다: i) 서열번호 29로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 중쇄가변영역 및 서열번호 30으로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 경쇄가변영역; 또는 ii) 서열번호 31로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 경쇄가변영역.
본 발명의 일례로서 scFv 클론인 C8는 경쇄가변영역(VL)만을 가지고도, 후술하는 실시예 및 실험예에서 확인할 수 있는 바와 같이, HPRV에 특이적으로 결합하는 친화력을 가진다.
이에 따르면, 본 발명에 따른 scFv HPRV-C8의 경우 VL 서열과 함께 다른 VH 서열(예를 들어, 상기 VL과 동일하거나 유사한 서열을 가진 VH)을 가진다면, 더욱 높은 결합 친화력을 가질 것으로 보여진다.
그래서, 본 발명의 다른 일례는 상기 scFv HPRV-C8이 VL 서열과 함께 상기 VL과 동일한 서열을 가지는 VH을 포함하는 것이다.
즉, 본 발명의 다른 일례는 다음을 포함하는 쇠돌고래 라브도바이러스(Harbour Porpoise Rhabdovirus : HPRV)에 특이적으로 결합하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편이다: ii) 서열번호 22로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H1, 서열번호 23으로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H2, 및 서열번호 24로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H3을 포함하는 중쇄가변영역(variable heavy chain); 및 서열번호 22로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L1, 서열번호 23으로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L2, 및 서열번호 24로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L3을 포함하는 경쇄가변영역(variable light chain).
또한, 상기 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 다음을 포함하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편일 수 있다: ii) 서열번호 31로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 중쇄가변영역 및 서열번호 31로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 경쇄가변영역.
본 발명의 일 예로서, 상기 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 상기 중쇄가변영역 및 경쇄가변영역을 포함하는 모노클로날 항체, 폴리클로날 항체, scFv, Fab, F(ab), F(ab)2, scFv-Fc, 미니바디, 다이아바디, 트리아바디, 테트라바디, 이중항체, 다중특이적 항체, 인간항체, 인간화 항체, 키메라 항체 또는 이들의 항원 결합 단편이다.
본 발명의 항체는 당 업계에 알려져 있는 다양한 파지 디스플레이(phage display)방법을 사용하여 생성될 수 있다.
본 명세서에서, 용어 “항체(antibody)”는 쇠돌고래 라브도바이러스 당단백질(HPRV GP)에 대한 특이 항체로서, 완전한 항체 형태 뿐 만 아니라 항체 분자의 항원 결합 단편(antigen binding fragment)을 포함한다.
완전한 항체는 2개의 전체 길이의 경쇄 및 2개의 전체 길이의 중쇄를 가지는 구조이며 각각의 경쇄는 중쇄와 다이설파이드 결합으로 연결되어 있다. 중쇄 불변 영역은 감마(γ), 뮤(μ), 알파(α), 델타(δ) 및 엡실론(ε)타입을 가지고 서브클래스로 감마1(γ1), 감마2(γ2), 감마3(γ3), 감마4(γ4), 알파1(α1) 및 알파2(α 2)를 가진다. 경쇄의 불변영역은 카파(kappa) 및 람다(lambda) 타입을 가진다.
본 명세서에서, 용어 "항원 결합 단편"은 항원 결합 기능을 보유하고 있는 단편을 의미하며, Fab, F(ab'), F(ab')2, 화학적으로 연결된 F(ab')2 및 Fv 등을 포함한다. 항체 단편 중 Fab는 경쇄 및 중쇄의 가변영역과 경쇄의 불변 영역 및 중쇄의 첫 번째 불변 영역(CH1)을 가지는 구조로 1개의 항원 결합 부위를 가진다. Fab'는 중쇄 CH1 도메인의 C-말단에 하나 이상의 시스테인 잔기를 포함하는 힌지 영역(hinge region)을 가진다는 점에서 Fab와 차이가 있다. F(ab')2 항체는 Fab'의 힌지 영역의 시스테인 잔기가 다이설파이드 결합을 이루면서 생성된다. Fv는 중쇄 가변부위 및 경쇄 가변부위만을 가지고 있는 최소의 항체조각으로 Fv 단편을 생성하는 재조합 기술은 PCT 국제 공개특허출원 WO 88/10649 등에 개시되어 있다. 이중쇄 Fv(two-chain Fv)는 비공유 결합으로 중쇄 가변부위와 경쇄 가변부위가 연결되어 있고 단쇄Fv(single-chain Fv)는 일반적으로 펩타이드 링커를 통하여 중쇄의 가변 영역과 단쇄의 가변 영역이 공유 결합으로 연결되거나 또는 C-말단에서 바로 연결되어 있어서 이중쇄 Fv와 같이 다이머와 같은 구조를 이룰 수 있다. 이러한 항체 단편은 단백질 가수분해 효소를 이용해서 얻을 수 있고(예를 들어, 전체 항체를 파파인으로 제한절단하면 Fab를 얻을 수 있고 펩신으로 절단하면 F(ab')2 단편을 얻을 수 있다), 또는 유전자 재조합 기술을 통하여 제작할 수 있다.
본 발명에서 항체는 구체적으로 scFv(single-chain variable fragment) 형태이거나 완전한 항체 형태이다. 또한, 중쇄 불변 영역은 감마(γ), 뮤(μ), 알파(α), 델타(δ) 또는 엡실론(ε) 중의 어느 한 이소타입으로부터 선택될 수 있다. 바람직하게는, 불변 영역은 감마1(IgG1), 감마2(IgG2), 감마3(IgG3) 및 감마4(IgG4)이고, 가장 구체적으로는 감마4(IgG4) 이소타입이다. 경쇄 불변 영역은 카파 또는 람다 형일 수 있으며, 바람직하게는 카파 형이다. 따라서, 본 발명의 구체적인 항체는 카파(kappa) 경쇄와 감마4(gamma4) 중쇄를 가지는 scFv형태 또는 IgG4 형태이다.
본 명세서에서, 용어 “중쇄(heavy chain)”는 항원에 특이성을 부여하기 위한 충분한 가변 영역 서열을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 가변 영역 도메인 VH 및 3개의 불변 영역 도메인 CH1, CH2 및 CH3를 포함하는 전체길이 중쇄 및 이의 단편을 모두 의미한다. 또한 본 명세서에서 용어“ 경쇄(light chain)”는 항원에 특이성을 부여하기 위한 충분한 가변 영역 서열을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 가변 영역 도메인 VL 및 불변 영역 도메인CL을 포함하는 전체길이 경쇄 및 이의 단편을 모두 의미한다.
본 명세서에서, 용어 “CDR(complementarity determining region)”은 면역글로불린 중쇄 및 경쇄의 고가변영역(hypervariable region)의 아미노산 서열을 의미한다. 중쇄(CDR-H1, CDR-H2 및 CDR-H3) 및 경쇄(CDR-L1, CDR-L2 및 CDR-L3)에는 각각 3개의 CDR이 포함되어 있다. CDR은 항체가 항원 또는 에피토프에 결합하는 데 있어서 주요한 접촉 잔기를 제공한다.
본 명세서에서 상기 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 전장 또는 원래 그대로의 폴리클로날 또는 모노클로날 항체뿐만 아니라, 이의 항원 결합 단편들(예를 들어, Fab, Fab', F(ab')2, Fab3, Fv 및 이의 변이체들), 하나 또는 그 이상의 항체 부분을 포함하는 융합 단백질, 인간항체, 인간화 항체, 키메라 항체, 미니바디, 다이아바디, 트리아바디, 테트라바디, 선형 항체, 단일 체인 항체(scFv), scFv-Fc, 이중특이적 항체, 다중특이적 항체, 필요한 특이성의 항원 인식 부위를 포함하는 면역 글로불린 분자의 다른 변형된 배열형태로서 항체의 글리코실화 변이체, 항체의 아미노산 서열 변이체 및 공유결합으로 변형된 항체를 포함한다. 변형된 항체 및 이의 항원 결합 단편의 구체적인 예에는 나노바디, AlbudAbs, DARTs(dual affinity re-targeting), BiTEs(bispecific Tcell engager), TandAbs(tandem diabodies), DAFs(dual acting Fab), two-in-one antibodies, SMIPs(small modular immunopharmaceuticals), FynomAbs(fynomers fused to antibodies), DVD-Igs(dual variable domain immunoglobulin), CovX-bodies(peptide modified antibodies), 듀오바디 및 triomAbs이 포함된다. 이와 같은 항체 및 이의 항원 결합 단편들의 목록은 상기에 한정되는 것은 아니다.
본 명세서에서, 용어 "프레임 워크(Framework)" 또는 "FR"은 초가변 영역 (hypervariable region, HVR) 잔기 이외의 가변 도메인 잔기를 나타낸다. 가변 도메인의 FR은 일반적으로 4 개의 FR 도메인 FR1, FR2, FR3 및 FR4로 구성된다. 따라서, HVR 및 FR 서열은 일반적으로 VH (또는 VL/Vk)에서 다음의 순서로 나타난다:
(a) (FR-H1, Framework region 1 of Heavy chain)-(CDR-H1, complementarity determining region 1 of Heavy chain)-(FR-H2)-(CDR-H2)-(FR-H3)-(CDR-H3)-(FR-H4); 및
(b) (FR-L1, Framework region 1 of Light chain)-(CDR-L1, complementarity determining region 1 of Light chain)-(FR-L2)-(CDR-L2)-(FR-L3)-(CDR-L3)-(FR-L4).
본 명세서에서, 용어 "가변 영역(variable region)" 또는 "가변 도메인(variable domain)"은 항체를 항원에 결합시키는 것과 관련되는 항체 중쇄 또는 경쇄의 도메인을 의미한다. Native 항체의 중쇄 및 경쇄의 가변 도메인(각각 VH 및 VL)은 일반적으로 유사한 구조를 가지며, 각 도메인은 4 개의 보존된 프레임워크 영역(framework regions, FR) 및 3 개의 초가변 영역 (hypervariable regions, HVR)을 포함한다. 단일 VH 또는 VL 도메인은 항원-결합 특이성을 부여하기에 충분할 수 있다. 또한, 특정 항원에 결합하는 항체는, 항원과 결합하여 각각 상보적인 VL 또는 VH 도메인의 라이브러리를 스크리닝하는 항체로부터, VH 또는 VL 도메인을 사용하여 분리될 수 있다.
본 명세서에서, 용어 "특이적으로 결합한다" 또는 이와 같은 것은, 항체 또는 이의 항원 결합 단편, 또는 scFv와 같은 다른 구성물이 생리적 조건 하에서 비교적 안정한 항원과 복합체를 형성한다는 것을 의미한다. 특이적 결합은 적어도 약 1 x 10-6 M 이하(예컨대, 9 x 10-7 M, 8 x 10-7 M, 7 x 10-7 M, 6 x 10-7 M, 5 x 10-7 M, 4 x10-7M, 3 x 10-7M, 2 x 10-7M, 또는 1 x 10-7 M), 바람직하게는 1 x 10-7 M 이하(예컨대, 9 x 10-8 M, 8 x 10-8M, 7 x 10-8M, 6 x 10-8M, 5 x 10-8M, 4 x 10-8M, 3 x 10-8M, 2 x 10-8M, 또는 1 x 10-8 M), 보다 바람직하게는 1 x 10-8 M 이하(예컨대, 9 x 10-9 M, 8 x 10-9 M, 7 x 10-9 M, 6 x 10-9 M, 5 x 10-9 M, 4 x 10-9 M, 3 x 10-9M, 2 x 10-9M, 또는 1 x 10-9 M)의 평형 해리 상수(예를 들어, 이보다 작은 KD는 보다 단단한 결합을 나타냄)로 특성화될 수 있다. 2개의 분자가 특이적으로 결합하는지 여부를 결정하는 방법은 당업계에 잘 알려져 있으며, 예를 들어 평형 투석, 표면 플라스몬 공명 등을 포함한다.
본 명세서에서, 용어 "친화도(Affinity)"는 분자(예를 들어, 항체)의 단일 결합 부위와 그 결합 파트너(예를 들어, 항원) 사이의 비공유 상호 작용의 총합의 강도를 의미한다. 달리 명시하지 않는 한, 본원에 사용된 바와 같이, "결합 친화력(binding affinity)"은 결합 쌍(예를 들어, 항체 및 항원)의 구성원 간의 1:1 상호 작용을 반영하는 내인성(intrinsic) 결합 친화력을 나타낸다. 분자 Y와 그의 파트너 Y의 친화도는 일반적으로 해리 상수(Kd)로 나타낼 수 있다. 친화도는 본원에 기술된 것들을 포함하여 당업계에 공지된 통상적인 방법에 의해 측정될 수 있다.
또한 본 명세서에서 용어, "인간 항체(human antibody)"는 인간 또는 인간 세포에 의해 생성된 항체, 또는 인간항체 레퍼토리(repertoires) 또는 다른 인간 항체 코딩 서열을 이용하는 비인간 근원으로부터 유래된 항체의 아미노산 서열에 상응하는 아미노산 서열을 보유한다. 인간 항체의 이러한 정의는 비인간 항원 결합 잔기를 포함하는 인간화(humanized) 항체를 배제한다.
본 명세서에서 용어, "키메라(chimeric)" 항체는 중쇄 및/또는 경쇄의 일부가 특정 근원(source) 또는 종(species)으로부터 유래되고, 중쇄 및/또는 경쇄의 나머지가 상이한 근원 또는 종에서 유래한 항체를 의미한다.
본 명세서에서 용어 "인간화 항체"란, 비-인간(예를 들어, 마우스) 항체의 비-인간 면역글로불린으로부터 유래된 최소 서열을 함유하는 키메릭 면역글로불린, 그의 면역글로불린 쇄 또는 단편(예를 들어 Fv, Fab, Fab', F(ab')2 또는 항체의 다른 항원-결합 하위서열)이다. 대부분의 경우에, 인간화 항체는 수용자의 상보성-결정 영역(CDR)의 잔기가, 목적하는 특이성, 친화성 및 능력을 갖는 비-인간 종(공여자 항체), 예를 들어 마우스, 래트 또는 토끼의 CDR의 잔기에 의해 대체된 인간 면역글로불린(수용자 항체)이다. 일부의 경우에, 상기 인간 면역글로불린의 Fv 프레임워크 영역(framework region, FR) 잔기는 상응하는 비-인간 잔기에 의해 대체된다. 또한, 인간화 항체는 수용자 항체에서도 또는 수입된 CDR 또는 프레임워크 서열에서도 발견되지 않는 잔기를 포함할 수 있다. 이러한 변형은 항체 성능을 추가로 개선 및 최적화하기 위해 이루어진다. 일반적으로, 상기 인간화된 항체는 적어도 하나, 및 전형적으로 2개의 실질적으로 모든 가변 도메인을 포함할 것이며, 상기 도메인에서 상기 CDR 영역의 전부 또는 실질적 전부는 비-인간 면역글로불린의 CDR 영역에 상응하고, 상기 FR 영역의 전부 또는 실질적 전부는 인간 면역글로불린의 FR 영역의 서열을 가진다. 상기 인간화 항체는 면역글로불린 불변 영역(Fc region)의 적어도 일부 내지 실질적인 인간 면역글로불린의 불변 영역(Fc region)서열을 포함한다.
상기 변이체는 "실질적 유사성"을 가지는 것으로, 2개의 펩타이드 서열이 디폴트 갭 가중치를 사용하는 프로그램 GAP 또는 BESTFIT에 의해서와 같이 최적으로 정렬되는 경우에 적어도 약 90%의 서열 동일성, 더욱 바람직하게는 적어도 약 95%, 98% 또는 99%의 서열 동일성을 공유함을 의미한다. 바람직하게는, 동일하지 않은 잔기 위치는 보존적 아미노산 치환에 의해 상이하다. "보존적 아미노산 치환"은 아미노산 잔기가 유사한 화학적 특성(예: 전하 또는 소수성)을 갖는 측쇄(R 기)를 갖는 또 다른 아미노산 잔기에 의해 치환된 것이다. 일반적으로, 보존적 아미노산 치환은 단백질의 기능성을 실질적으로 변화시키지 않는다. 2개 이상의 아미노산 서열이 보존적 치환에 의해 서로 상이한 경우에, 유사성의 퍼센트 또는 정도는 치환의 보존적 성질을 보정하기 위해 상향 조절될 수 있다.
이러한 아미노산 변이는 아미노산 곁사슬 치환체의 상대적 유사성, 예컨대, 소수성, 친수성, 전하, 크기 등에 기초하여 이루어진다. 아미노산 곁사슬 치환체의 크기, 모양 및 종류에 대한 분석에 의하여, 아르기닌, 라이신과 히스티딘은 모두 양전하를 띤 잔기이고; 알라닌, 글라이신과 세린은 유사한 크기를 갖으며; 페닐알라닌, 트립토판과 타이로신은 유사한 모양을 갖는다는 것을 알 수 있다. 따라서, 이러한 고려 사항에 기초하여, 아르기닌, 라이신과 히스티딘; 알라닌, 글라이신과 세린; 그리고 페닐알라닌, 트립토판과 타이로신은 생물학적으로 기능 균등물이라 할 수 있다.
변이를 도입하는 데 있어서, 아미노산의 소수성 인덱스(hydropathic idex)가 고려될 수 있다. 각각의 아미노산은 소수성과 전하에 따라 소수성 인덱스가 부여되어 있다: 아이소루이신(+4.5); 발린(+4.2); 루이신(+3.8); 페닐알라닌(+2.8); 시스테인/시스타인(+2.5); 메티오닌(+1.9); 알라닌(+1.8); 글라이신(-0.4); 쓰레오닌(-0.7);세린(-0.8); 트립토판(-0.9); 타이로신(-1.3); 프롤린(-1.6); 히스티딘(-3.2); 글루타메이트(-3.5); 글루타민(-3.5); 아스파르테이트(-3.5); 아스파라긴(-3.5); 라이신(-3.9); 및 아르기닌(-4.5).
단백질의 상호적인 생물학적 기능(interactive biological function)을 부여하는 데 있어서 소수성 아미노산 인덱스는 매우 중요하다. 유사한 소수성 인덱스를 가지는 아미노산으로 치환하여야 유사한 생물학적 활성을 보유할 수 있다는 것은 공지된 사실이다. 소수성 인덱스를 참조하여 변이를 도입시키는 경우, 바람직하게는 ± 2 이내, 보다 바람직하게는 ± 1 이내, 보다 더 바람직하게는 ± 0.5 이내의 소수성 인덱스 차이를 나타내는 아미노산 사이에서 치환을 한다.
한편, 유사한 친수성 값(hydrophilicity value)을 가지는 아미노산 사이의 치환이 균등한 생물학적 활성을 갖는 단백질을 초래한다는 것도 잘 알려져 있다. 미국 특허 제4,554,101호에 개시된 바와 같이, 다음의 친수성 값이 각각의 아미노산 잔기에 부여되어 있다: 아르기닌(+3.0); 라이신(+3.0); 아스팔테이트(+3.0± 1); 글루타메이트 (+3.0± 1); 세린(+0.3); 아스파라긴(+0.2); 글루타민(+0.2); 글라이신(0); 쓰레오닌(-0.4); 프롤린(-0.5 ±1); 알라닌(-0.5); 히스티딘(-0.5); 시스테인(-1.0); 메티오닌(-1.3); 발린(-1.5); 루이신(-1.8); 아이소루이신(-1.8); 타이로신(-2.3); 페닐알라닌(-2.5); 트립토판(-3.4).
친수성 값을 참조하여 변이를 도입시키는 경우, 바람직하게는 ± 2 이내, 보다 바람직하게는 ± 1 이내, 보다 더 바람직하게는 ± 0.5 이내의 친수성 값 차이를 나타내는 아미노산 사이에서 치환을 한다.
분자의 활성을 전체적으로 변경시키지 않는 단백질에서의 아미노산 교환은 당해 분야에 공지되어 있다. 가장 통상적으로 일어나는 교환은 아미노산 잔기 Ala/Ser, Val/Ile, Asp/Glu, Thr/Ser, Ala/Gly, Ala/Thr, Ser/Asn, Ala/Val, Ser/Gly, Thy/Phe, Ala/Pro, Lys/Arg, Asp/Asn, Leu/Ile, Leu/Val, Ala/Glu, Asp/Gly 간의 교환이다.
본 발명의 쇠돌고래 라브도바이러스 당단백질(HPRV GP)에 대한 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 상술한 아미노산 서열에 대하여 소폭의 변화, 즉, 3차 구조 및 항체의 기능에 거의 영향을 미치지 않는 변형을 포함하는 항-HPRV GP 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 포함한다. 따라서 어떤 구현예의 경우 상술한 서열과 일치하지 않더라도 적어도 100%, 93%, 95%, 96%, 97%, 또는 98% 이상의 유사성을 가질 수 있다.
본 발명의 일 구현예에 따르면, 본 발명의 쇠돌고래 라브도바이러스에 특이적으로 결합하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 상술한 서열의 CDR을 포함하는 중쇄가변영역 및 경쇄가변영역을 포함하는 단일클론 항체, 이중특이적 항체, 다중특이적 항체, 인간 항체, 인간화 항체, 키메라 항체, 단일 체인 항체(scFv), Fab단편, F(ab')단편, 다이설파이드-결합 Fvs(sdFV) 및 항-이디오타입(항-Id) 항체, 그리고 상기 항체들의 에피토프-결합 단편 등을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명의 다른 구현예에서 본 발명의 쇠돌고래 라브도바이러스 당단백질(HPRV GP)에 특이적으로 결합하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 항-HPRV GP scFv이다.
본 발명의 구체적인 구현예에서, 상기 항체 또는 이의 항원 결합 단편에 포함되는 중쇄가변영역 및 경쇄가변영역은 (Gly-Ser)n, (Gly2-Ser)n, (Gly3-Ser)n 또는 (Gly4-Ser)n 등의 링커에 의해 연결된다. 여기서 n은 1 내지 6의 정수이고, 구체적으로는 3 내지 4이나 이에 한정되는 것은 아니다. 상기 scFv의 경쇄가변영역 및 중쇄가변 영역은 예를 들어 다음의 배향으로 존재할 수 있다: 경쇄가변영역-링커-중쇄가변영역 또는 중쇄가변영역-링커-경쇄가변영역. 상기 경쇄가변영역은 카파가변영역일 수 있다.
본 발명의 구체적인 일 구현예에서, 본 발명의 HPRV GP 항원 단백질에 특이적으로 결합하는 항체 또는 항원 결합 단편은 i) 서열번호 29로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 중쇄가변영역 및 서열번호 30으로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 경쇄가변영역; 또는 ii) 서열번호 31로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 경쇄가변영역을 포함하는 scFv이다.
본 발명의 또 다른 양태에 따르면, 본 발명은 본 발명의 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 포함하는, 쇠돌고래 라브도바이러스(HPRV) 검출용 조성물을 제공한다.
본 발명의 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 쇠돌고래 라브도바이러스 당단백질(HPRV GP)에 높은 특이성, 결합력 및 친화도로 결합하므로, 쇠돌고래 라브도바이러스(HPRV) 검출을 위한 조성물에 유용하게 사용될 수 있다.
본 발명의 또 다른 양태에 따르면, 본 발명의 쇠돌고래 라브도바이러스(HPRV) 검출용 조성물을 포함하는, 쇠돌고래 라브도바이러스(HPRV) 검출용 키트를 제공한다.
본 발명의 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 쇠돌고래 라브도바이러스 당단백질(HPRV GP)에 높은 특이성, 결합력 및 친화도로 결합하므로, 쇠돌고래 라브도바이러스(HPRV) 검출을 위한 키트에 유용하게 사용될 수 있다.
본 발명의 일 구현예에 있어서, 상기 키트는 면역분석(immunoassay)용 키트이다.
본 발명의 일 구현예에 있어서, 상기 면역분석용 키트는 단백질 마이크로어레이 또는 ELISA 분석 키트이다.
상술한 조성물 또는 키트는 본 발명의 항-쇠돌고래 라브도바이러스 당단백질(HPRV GP) 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 포함하기 때문에, 기본적으로 다양한 면역분석(immunoassay) 또는 면역염색(immunostaining)에 적합하게 제작될 수 있다. 상기 면역분석 또는 면역염색은 방사능면역분석, 방사능면역침전, 면역침전, ELISA(enzyme-linked immunosorbent assay), 캡처-ELISA, 억제 또는 경쟁 분석, 샌드위치 분석, 유세포 분석(flow cytometry), 면역형광염색 및 면역친화성 정제를 포함하지만, 이에 한정되는 것은 아니다.
예를 들어, 본 발명의 방법이 방사능면역분석 방법에 따라 실시되는 경우, 방사능동위원소(예컨대, C14, I125, P32 및 S35)로 레이블링된 항체가 쇠돌고래 라브도바이러스 당단백질(HPRV GP)을 검출하는 데 이용될 수 있다.
본 발명이 ELISA 방식으로 실시되는 경우, 본 발명의 특정 실시예는 (i) 분석하고자 하는 시료를 고체 기질의 표면에 코팅하는 단계; (ii) 일차 항체로서 본 발명의 쇠돌고래 라브도바이러스 당단백질(HPRV GP)에 특이적으로 결합하는 항체와 상기 시료를 반응시키는 단계; (iii) 상기 단계 (ii)의 결과물을 효소가 결합된 이차항체와 반응시키는 단계; 및 (iv) 상기 효소의 활성을 측정하는 단계를 포함한다.
상기 고체 기질로 적합한 것은 탄화수소 폴리머(예컨대, 폴리스틸렌 및 폴리프로필렌), 유리, 금속 또는 젤이며, 가장 구체적으로는 마이크로타이터 플레이트이다.
상기 이차 항체에 결합된 효소는 발색반응, 형광반응, 발광반응 또는 적외선 반응을 촉매하는 효소를 포함하나, 이에 한정되지 않으며, 예를 들어, 알칼린 포스파타아제, beta-갈락토시다아제, 호스 래디쉬 퍼옥시다아제, 루시퍼라아제 및 사이토크롬 P450을 포함한다. 상기 이차항체에 결합하는 효소로서 알칼린 포스파타아제가 이용되는 경우에는, 기질로서 브로모클로로인돌일 포스페이트(BCIP), 니트로 블루 테트라졸리움(NBT), 나프톨-ASB1-포스페이트(naphthol-AS-B1-phosphate) 및 ECF(enhanced chemifluorescence)와 같은 발색반응 기질이 이용되고, 호스 래디쉬 퍼옥시다아제가 이용되는 경우에는 클로로나프톨, 아미노에틸카바졸, 디아미노벤지딘, D-루시페린, 루시게닌(비스-N-메틸아크리디늄 니트레이트), 레소루핀 벤질 에테르, 루미놀, 암플렉스 레드 시약(10-아세틸-3,7-디하이드록시페녹사진), HYR(p-phenylenediamine-HCl and pyrocatechol), TMB(tetramethylbenzidine), ABTS(2,2-Azine-di[3-ethylbenzthiazoline sulfonate]), o-페닐렌디아민(OPD) 및 나프톨/파이로닌, 글루코스 옥시다아제와 t-NBT(nitroblue tetrazolium) 및 m-PMS(phenzaine methosulfate)과 같은 기질이 이용될 수 있다.
본 발명이 캡처-ELISA 방식으로 실시되는 경우, 본 발명의 특정 실시예는 (i) 포획항체(capturing antibody)로서 쇠돌고래 라브도바이러스 당단백질(HPRV GP)에 특이적으로 결합하는 항체를 고체 기질의 표면에 코팅하는 단계; (ii) 포획항체와 시료를 반응시키는 단계; (iii) 상기 단계 (ii)의 결과물을 시그널을 발생시키는 레이블이 결합되어 있는 검출항체(detecting antibody)와 반응시키는 단계; 및 (iv) 상기 레이블로부터 발생하는 시그널을 측정하는 단계를 포함한다.
본 발명의 상기 검출 항체는 검출 가능한 시그널을 발생시키는 레이블을 가지고 있다. 상기 레이블은 화학물질(예컨대, 바이오틴), 효소(알칼린 포스파타아제, beta-갈락토시다아제, 호스 래디쉬 퍼옥시다아제 및 사이토크롬 P450), 방사능물질(예컨대, C14, I125, P32 및 S35), 형광물질(예컨대, 플루오레신), 발광물질, 화학발광물질(chemiluminescent) 및 FRET(fluorescence resonance energy transfer)을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 다양한 레이블 및 레이블링 방법은 Ed Harlow and David Lane, Using Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1999에 기재되어 있다.
상기 ELISA 방법 및 캡처-ELISA 방법에서 최종적인 효소의 활성 측정 또는 시그널의 측정은 당업계에 공지된 다양한 방법에 따라 실시될 수 있다. 만일, 레이블로서 바이오틴이 이용된 경우에는 스트렙타비딘으로, 루시퍼라아제가 이용된 경우에는 루시페린으로 시그널을 용이하게 검출할 수 있다.
상기 포획항체 및 검출항체로는 본 발명의 항-쇠돌고래 라브도바이러스 당단백질(HPRV GP) 항체 또는 항원 결합 단편의 클론 중 서로 다른 에피토프에 결합하는 2종의 항체 또는 항원 결합 단편을 이용할 수 있다.
본 발명의 키트에 적용될 수 있는 시료는 세포, 조직 또는 조직-유래 추출물, 파쇄물(lysate) 또는 정제물, 혈액, 혈장, 혈청, 림프 또는 복수를 포함하나, 이에 한정되지 않는다.
본 발명의 항체는 인 비보 또는 인 비트로 이미징에 이용될 수 있다. 본 발명의 다른 양태에 따르면, 본 발명은 상술한 본 발명의 항체 및 상기 항체에 결합된 검출 가능한 신호를 발생시키는 레이블이 결합된 결합체를 포함하는 이미지용 조성물을 제공한다.
상기 검출 가능한 신호를 발생시키는 레이블은 T1 조영물질(예컨대, Gd 킬레이트 화합물), T2 조영물질(예컨대, 초상자성 물질(예: 마그네타이트, Fe3O4, γ -Fe2O3, 망간 페라이트, 코발트 페라이트 및 니켈 페라이트)), 방사성 동위 원소(예컨대, 11C, 15O, 13N, P32, S35, 44Sc, 45Ti, 118I, 136La, 198Tl, 200Tl, 205Bi 및 206Bi), 형광물질(플루오리신(fluorescein), 피코에리트린(phycoerythrin), 로다민, 리사민(lissamine), 그리고 Cy3와 Cy5), 화학발광단, 자기입자, 매스 표지 또는 전자밀집입자를 포함하나 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명의 또 다른 일 양태에 따르면, 본 발명의 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는, 핵산 분자를 제공한다.
본 명세서에서 용어 "핵산 분자”는 DNA(gDNA 및 cDNA) 그리고 RNA 분자를 포괄적으로 포함하는 의미를 가지며, 핵산 분자에서 기본 구성 단위인 뉴클레오타이드는 자연의 뉴클레오타이드뿐만 아니라, 당 또는 염기 부위가 변형된 유사체(analogue)도 포함한다.
본 발명의 상기 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열은 상기 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 구성하는 아미노산 서열을 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열인 것으로 족하며, 어느 특정 뉴클레오타이드 서열에 한정되지 않는다는 것은 당업자에게 자명하다.
이는 뉴클레오타이드 서열의 변이가 발생하더라도 변이된 뉴클레오타이드 서열을 단백질로 발현하면 단백질 서열에서 변화를 가져오지 않는 경우도 있기 때문이다. 이를 코돈의 축퇴성이라고 한다. 따라서 상기 뉴클레오타이드 서열은 기능적으로 균등한 코돈 또는 동일한 아미노산을 코딩하는 코돈 (예를 들어, 코돈의 축퇴성에 의해, 아르기닌 또는 세린에 대한 코돈은 여섯 개이다), 또는 생물학적으로 균등한 아미노산을 코딩하는 코돈을 포함하는 뉴클레오타이드 서열을 포함한다.
상술한 생물학적 균등 활성을 갖는 변이를 고려한다면, 상기 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 구성하는 아미노산 서열을 코딩하는 본 발명의 핵산 분자는 이와 실질적인 동일성(substantial identity)을 나타내는 서열도 포함하는 것으로 해석된다.
상기의 실질적인 동일성은, 상기한 본 발명의 서열과 임의의 다른 서열을 최대한 대응되도록 얼라인(align)하고, 당업계에서 통상적으로 이용되는 알고리즘을 이용하여 얼라인된 서열을 분석한 경우에, 최소 60% 이상의 상동성(예컨대 61%, 62%, 63%, 64%, 65%, 66%, 67%, 68%, 또는 69%), 보다 구체적으로는 70% 이상의 상동성(예컨대 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 또는 79%), 보다 더 구체적으로는 80% 이상의 상동성(예컨대 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 또는 89%), 보다 더욱더 구체적으로는 90% 이상의 상동성(예컨대 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99%), 가장 구체적으로는 95% 이상의 상동성(예컨대 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99%)을 나타내는 서열을 의미한다. 상기 60% 이상 100% 이하의 모든 정수 및 이 사이에 존재하는 소수는 % 상동성과 관련하여 본 발명의 범위 내에 포함된다.
서열비교를 위한 얼라인먼트 방법은 당업계에 공지되어 있다. BLAST는 NCBI 웹사이트의 BLAST 페이지를 통하여 접속 가능하다. 이 프로그램을 이용한 서열 상동성 비교 방법은 NCBI 웹사이트의 BLAST help 페이지에서 확인할 수 있다.
본 발명의 구체적인 구현예에 따르면, 상기 본 발명의 쇠돌고래 라브도바이러스 당단백질(HPRV GP)에 대한 항체 또는 이의 항원 결합 단편의 중쇄 CDR, 경쇄 CDR, 중쇄 가변영역, 경쇄 가변영역, 중쇄, 또는 경쇄를 이루는 폴리펩타이드와 이를 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열은 본 명세서의 첨부된 서열목록에 수록되어 있다.
본 발명의 또 다른 양태에 따르면, 본 발명은 상술한 핵산 분자를 포함하는 재조합 벡터를 제공한다.
구체적으로, 본 발명은 상술한 쇠돌고래 라브도바이러스 당단백질(HPRV GP)에 대한 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 핵산 분자를 포함하는 재조합 벡터를 제공한다.
본 명세서에서 용어 "벡터"는 숙주 세포에서 목적 유전자를 발현시키기 위한 수단으로 파지미드 벡터; 플라스미드 벡터; 코즈미드 벡터; 박테리오파아지 벡터, 아데노바이러스 벡터, 레트로바이러스 벡터 및 아데노-연관 바이러스 벡터 같은 바이러스 벡터 등을 포함하나 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명의 일 구현예에 따르면, 본 발명의 벡터에서 중쇄가변영역을 코딩하는 핵산 분자 및 경쇄가변영역을 코딩하는 핵산 분자는 프로모터와 작동적으로 결합(operatively linked)되어 있다.
본 명세서에서, 용어 "작동적으로 결합된(operatively linked)"은 핵산 발현 조절 서열(예: 프로모터, 시그널 서열, 또는 전사조절인자 결합 위치의 어레이)과 다른 핵산 서열사이의 기능적인 결합을 의미하며, 이에 의해 상기 조절 서열은 상기 다른 핵산 서열의 전사 및/또는 번역을 조절하게 된다.
본 발명의 재조합 벡터 시스템은 당업계에 공지된 다양한 방법을 통해 구축될 수 있으며, 이에 대한 구체적인 방법은 Sambrook et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press(2001)에 개시되어 있으며, 이 문헌은 본 명세서에 참조로서 삽입된다.
본 발명의 벡터는 전형적으로 클로닝을 위한 벡터 또는 발현을 위한 벡터로서 구축될 수 있다. 또한, 본 발명의 벡터는 원핵 세포 또는 진핵 세포를 숙주로 하여 구축될 수 있다.
예를 들어, 본 발명의 벡터가 발현 벡터이고, 진핵 세포를 숙주로 하는 경우에는, 포유동물 세포의 지놈으로부터 유래된 프로모터(예: 메탈로티오닌 프로모터, beta-액틴 프로모터, 사람 헤로글로빈 프로모터 및 사람 근육 크레아틴 프로모터) 또는 포유동물 바이러스로부터 유래된 프로모터(예: 아데노바이러스 후기 프로모터, 백시니아 바이러스 7.5K 프로모터, SV40 프로모터, 사이토메갈로바이러스 프로모터, HSV의 tk 프로모터, 마우스 유방 종양 바이러스(MMTV) 프로모터, HIV의 LTR 프로모터, 몰로니 바이러스의 프로모터 엡스타인 바 바이러스(EBV)의 프로모터 및 로우스 사코마 바이러스(RSV)의 프로모터)가 이용될 수 있으며, 전사 종결 서열로서 폴리아데닐화 서열을 일반적으로 갖는다.
본 발명의 벡터는 그로부터 발현되는 항체의 정제를 용이하게 하기 위하여, 다른 서열과 융합될 수도 있다. 융합되는 서열은 예컨대, 글루타티온 S-트랜스퍼라제(Pharmacia, USA), 말토스 결합 단백질(NEB, USA), FLAG(IBI, USA) 및 6x His(hexahistidine; Quiagen, USA) 등이 있다.
또한, 본 발명의 벡터에 의해 발현되는 단백질이 항체이기 때문에, 정제를 위한 추가적인 서열 없이도, 발현된 항체는 단백질 A 컬럼 등을 통하여 용이하게 정제할 수 있다.
한편, 본 발명의 발현 벡터는 선택표지로서, 당업계에서 통상적으로 이용되는 항생제 내성 유전자를 포함하며, 예를 들어 암피실린, 겐타마이신, 카베니실린, 클로람페니콜, 스트렙토마이신, 카나마이신, 제네티신, 네오마이신 및 테트라사이클린에 대한 내성 유전자가 있다.
선택적으로, 상기 벡터는 리포터 분자(예: 루시퍼라아제 및 -글루쿠로니다아제)를 코딩하는 유전자를 추가적으로 운반할 수 있다.
본 발명의 일 구현예에 따르면, 상기 발현 벡터는 상기 쇠돌고래 라브도바이러스 당단백질(HPRV GP)에 특이적으로 결합하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 인코딩하는 핵산 분자가 삽입된 벡터로서, 상기 핵산 분자의 뉴클레오타이드 서열에 작동적으로 결합(operatively linked)되어 있고 숙주세포에서 RNA 분자를 형성시키는 프로모터 및 숙주세포에서 작용하여 RNA 분자의 3'-말단의 폴리아데닐화를 야기시키는 폴리 A 시그널 서열을 포함하는 숙주세포 발현용 재조합 벡터이다.
본 발명의 벡터를 안정되면서 연속적으로 클로닝 및 발현시킬 수 있는 숙주 세포는 당업계에 공지되어 어떠한 숙주 세포도 이용할 수 있으며, 예컨대, 상기 벡터의 적합한 진핵세포 숙주 세포는 이스트(Saccharomyce cerevisiae), 곤충 세포, 원숭이 신장 세포7(COS7: monkey kidney cells), NSO 세포, SP2/0, 차이니즈 햄스터난소(CHO: Chinese hamster ovary) 세포, W138, 어린 햄스터 신장(BHK: baby hamster kidney) 세포, MDCK, 골수종 세포주, HuT 78 세포 및 HEK-293 세포를 포함하나 이에 한정되지 않는다.
본 발명의 또 다른 양태에 따르면, 본 발명은 상술한 재조합 벡터를 포함하는, 분리된 숙주세포를 제공한다.
본 발명의 일 구현예에 있어서, 상기 분리된 숙주세포는 본 발명의 재조합 벡터로 형질전환된 것이다.
본 명세서에서 용어 "형질전환된", "형질도입된" 또는 "형질감염된” 은 외인성 핵산이 숙주세포 내로 전달되거나 도입되는 과정을 지칭한다. "형질전환된” , "형질도입된" 또는 "형질감염된" 세포는 외인성 핵산으로 형질전환, 형질도입 또는 형질감염된 세포이며, 상기 세포는 당해 세포 및 그의 계대 배양으로 인한 자손 세포를 포함한다.
본 발명의 벡터를 숙주 세포 내로 운반하는 방법은, 숙주세포가 진핵 세포인 경우에는, 미세 주입법, 칼슘 포스페이트 침전법, 전기 천공법, 리포좀-매개 형질감염법, DEAE-덱스트란 처리법, 및 유전자 밤바드먼트 등에 의해 벡터를 숙주 세포 내로 주입할 수 있다.
본 발명에서 숙주세포 내로 주입된 재조합 벡터는 숙주 세포 내에서 재조합된 상기의 항체를 발현할 수 있으며, 이러한 경우에는 다량의 항체를 얻게 된다. 예를 들어, 상기 발현 벡터가 갈락토오스 유도성 프로모터를 포함하는 경우에는 숙주 세포에 IPTG를 처리하여 유전자 발현을 유도할 수 있다.
상기 배양은 통상적으로 진탕 배양 또는 회전기에 의한 회전에 의한 것과 같은 호기성 조건하에서 행한다. 배양온도는 바람직하게는 10 내지 40℃ 의 범위에서 행하고, 배양시간은 일반적으로 5 시간 내지 7 일간 행한다. 배지의 pH는 배양 중에서 바람직하게는 3.0 내지 9.0의 범위를 유지한다. 배지의 pH는 무기 또는 유기산, 알칼리용액, 우레아, 칼슘 카보네이트, 암모니아 등으로 조절할 수 있다. 배양 중에는 필요한 경우 재조합 벡터의 유지 및 발현을 위해 암피실린, 스트렙토마이신, 클로람페니콜, 카나마이신 및 테트라사이클린과 같은 항생제를 첨가할 수 있다. 유도(induction) 가능한 프로모터를 갖는 재조합 발현 벡터로 형질전환된 숙주세포를 배양하는 경우 필요하다면 배지에 적합한 유도제(inducer)를 첨가할 수 있다. 예를 들어, 발현 벡터가 lac 프로모터 또는 락토오스 유도성 프로모터를 함유하는 경우 IPTG (isopropyl-beta-D-thiogalactopyranoside)를 첨가하고, trp프로모터를 포함하는 경우 인돌아크릴산(indoleacrylic acid)을 배지에 첨가할 수 있다.
본 발명의 여전히 다른 일 양태에 따르면, 본 발명은 일 구현예에 따른 숙주세포를 배양하는 단계를 포함하는, 쇠돌고래 라브도바이러스(HPRV)에 특이적으로 결합하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편의 제조방법을 제공한다.
본 발명의 다른 일 양태에 따르면, 본 발명은 일 구현예에 따른 쇠돌고래 라브도바이러스(HPRV) 검출용 조성물을 시료와 반응시키는 단계; 및 상기 쇠돌고래 라브도바이러스(HPRV) 검출용 조성물과 당단백질의 결합을 탐지하는 단계를 포함하는, 쇠돌고래 라브도바이러스(HPRV) 검출 방법을 제공한다.
본 발명의 일 구현예에 있어서, 상기 시료는 검출 대상 어류의 아가미, 비장, 근육 조직, 뇌, 심장, 지느러미, 간, 췌장, 위, 장, 신장, 배설강, 유문수, 피부 조직, 분변, 체액, 점액 및 혈액으로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상이다. 상기 시료는 검출 대상 어류의 피부 스왑(skin swab)일 수 있다. 상기 시료는 검출 대상 어류의 전혈(whole blood), 혈장(plasma) 또는 혈청(serum)일 수 있다. 상기 시료는 검출 대상 어류의 백혈구(white blood cell)일 수 있다. 상기 시료는 검출 대상 어류의 뇌의 과립층일 수 있다.
본 발명의 구체적인 구현예에 있어서, 상기 검출 대상은 쇠돌고래(Harbour Porpoise), 돌고래(Dolphin), 고래류, 가오리(ray) 및 그 밖의 해양 어류나 포유류일 수 있고, 나아가 넙치(olive flounder, Paralichthys olivaceus), 무지개송어(Rainbow trout/Steelhead trout, Oncorhynchus mykiss), 대서양연어(Atlantic salmon, Salmosalar), 브라운트라우트(Brown trout, Salmo trutta), 은연어(Coho salmon, Oncorhynchus kisutch), 회색숭어(Grayling, Thymallus thymallus), 왕연어(Chinook salmon, Oncorhynchus tshawytscha), 대구(cod, Gadus macrocephalus), 터봇(Turbot, Scophthalmus maximus), 정어리(South American pilchard, Sardinops sagax), 명태(Alaska Pollock, Theragra chalcogramma)일 수 있다.
본 발명의 특징 및 이점을 요약하면 다음과 같다:
본 발명은 쇠돌고래 라브도바이러스(HPRV)에 특이적으로 결합하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 제공한다.
본 발명은 쇠돌고래 라브도바이러스(HPRV) 검출용 조성물, 검출용 키트를 제공한다.
본 발명의 HPRV GP 항원 단백질에 대한 scFv 항체를 이용하면, HPRV GP에 높은 특이성, 결합력 및 친화도를 나타내는 scFv를 얻을 수 있어, 감염 시 집단폐사를 야기할 수 있는 HPRV를 정확하고 신속하며 경제적으로 검출할 수 있다.
도 1은 본 발명의 일 실시예에 따라 합성된 HPRV GP 단백질 유전자의 뉴클레오티드 서열을 나타내는 모식도이고,
도 2는 본 발명의 일 실시예에 따라 합성된 HPRV GP 단백질 유전자와 야생형 HPRV GP 단백질 유전자의 뉴클레오티드 서열을 비교한 모식도이고,
도 3은 본 발명의 일 실시예에 따라 합성된 HPRV GP 단백질 유전자를 복제하기 위한 발현 벡터 pET22b를 나타내는 개략도이고,
도 4는 본 발명의 일 실시예에 따른 4번의 라운드 과정 동안의 바이오패닝 결과를 나타내는 다이어그램이고,
도 5는 본 발명의 일 실시예에 따라 정제된 scFv 클론인 C8과 E4의 아미노산 서열을 나타내는 표이고,
도 6은 본 발명의 일 실시예에 따른 scFv 유전자를 복제하기 위한 발현 벡터 pIg20을 나타내는 개략도이고,
도 7은 본 발명의 일 실시예에 따라 정제된 scFv 클론 C8, E4를 서로 다른 온도 조건에서 웨스턴 블롯 분석한 결과이고,
도 8은 본 발명의 일 실시예에 따라 정제된 scFv 클론인 C8과 E4의 HPRV GP 단백질과의 결합 친화도를 확인하기 위해 수행한 ELISA 분석 결과이고,
도 9는 본 발명의 일 실시예에 따라 정제된 scFv 클론인 E4의 다양한 농도에서 항원과의 ELISA 분석 결과이고,
도 10은 본 발명의 일 실시예에 따라 정제된 scFv 클론인 C8과 E4의 다양한 항원 펩타이드에 대한 특이성 분석 결과이다.
본 발명은 다양한 변환을 가할 수 있고 여러 가지 실시 예를 가질 수 있는 바, 특정 실시 예들을 도면에 예시하고 상세한 설명에서 상세하게 설명하고자 한다. 그러나, 이는 본 발명을 특정한 실시 형태에 대해 한정하려는 것이 아니며, 본 발명의 사상 및 기술 범위에 포함되는 모든 변환, 균등물 내지 대체물을 포함하는 것으로 이해되어야 한다. 본 발명을 설명함에 있어서 관련된 공지 기술에 대한 구체적인 설명이 본 발명의 요지를 흐릴 수 있다고 판단되는 경우 그 상세한 설명을 생략한다.
본 출원에서 사용한 용어는 단지 특정한 실시예를 설명하기 위해 사용된 것으로, 본 발명을 한정하려는 의도가 아니다. 단수의 표현은 문맥상 명백하게 다르게 뜻하지 않는 한, 복수의 표현을 포함한다. 본 출원에서, "포함하다" 또는 "가지다" 등의 용어는 명세서상에 기재된 특징, 숫자, 단계, 동작, 구성요소, 부품 또는 이들을 조합한 것이 존재함을 지정하려는 것이지, 하나 또는 그 이상의 다른 특징들이나 숫자, 단계, 동작, 구성요소, 부품 또는 이들을 조합한 것들의 존재 또는 부가 가능성을 미리 배제하지 않는 것으로 이해되어야 한다.
제1, 제2 등의 용어는 다양한 구성요소들을 설명하는데 사용될 수 있지만, 상기 구성요소들은 상기 용어들에 의해 한정되어서는 안 된다. 상기 용어들은 하나의 구성요소를 다른 구성요소로부터 구별하는 목적으로만 사용된다.
본 명세서 전체에 걸쳐, 특정 물질의 농도를 나타내기 위하여 사용되는 "%"는 별도의 언급이 없는 경우, 고체/고체는 (중량/중량) %, 고체/액체는 (중량/부피) %, 그리고 액체/액체는 (부피/부피) %이다.
본 발명은 하기의 실시예에 의하여 보다 더 잘 이해 될 수 있으며, 하기의 실시예는 본 발명의 예시 목적을 위한 것이며, 첨부된 특허청구범위에 의하여 한정되는 보호범위를 제한하고자 하는 것은 아니다.
본 발명에서는 쇠돌고래 라브도바이러스 당단백질(Harbour Porpoise Rhabdovirus Glycoprotein : HPRV GP) 유전자를 합성하고, scFv 선택을 위한 항원으로서 결합된 항원 펩타이드 BSA(antigen peptide BSA conjugated)를 이용하였다. 즉, 상기 HPRV GP의 에피토프 구조 및 표면 단백질 코딩 유전자를 분석한 후, 항원 펩타이드를 결정해서 서열번호 3, 4, 또는 5의 아미노산 서열을 가지는 항원 펩타이드를 합성하였다.
그리고, 인간 scFv 라이브러리로부터 HPRV GP에 특이적으로 결합하는 scFv를 분리하기 위해서, HPRV GP의 항원 펩타이드-BSA(접합물)와 인간 scFv 파지-디스플레이 라이브러리를 접촉시켜 특이적으로 결합한 파지를 용출하는 바이오-패닝을 수행하였다. 총 4차례의 바이오-패닝을 수행하여, 확보한 파지 농도를 증가시키고, 파지 scFv 클론을 선발하였다.
선발된 파지 scFv 클론을 대장균에 형질전환하고 IPTG로 유도하여 scFv 발현을 확인하고, 농축 및 정제하였으며, 정제된 scFv를 이용한 ELISA 분석을 통해 이의 HPRV GP 진단능을 확인하였다.
<실시예 1> 쇠돌고래 라브도바이러스 당단백질(HPRV GP)의 수집 (항원 선택)
1-1: HPRV GP의 유전자 수집
본 발명자들은, 종래의 혈청학적 방법과 같이 바이러스로부터 항원을 직접 정제하는 것이 아닌, 쇠돌고래 라브도바이러스(Harbour Porpoise Rhabdovirus, HPRV)의 당단백질(Glyco Protein : GP)에 대한 DNA 염기서열 합성 후 이의 발현을 통해 HPRV GP, 즉 바이러스 항원을 확보하였다.
본 실시예에서 항원 선택은 이전에 발생한 데이터베이스와 역학 사례를 기반으로 진행하였다. 여러 참고 문헌에 따르면, 동일한 속/과를 가진 바이러스는 유사한 일차 숙주 면역 반응을 일으킬 수 있다. 바이러스의 단백질 구조는 항원 선택 결정 요소 중 하나이며, 이 경우 항체를 사용하여 검출할 때 쉽게 결합할 수 있도록 표면 단백질을 선택하였다.
HPRV의 당단백질(또는 G 단백질)의 DNA 염기서열 합성을 위해서, 미국 국립생물정보센터(National Center for Biotechnology Information, NCBI)에서 제공하는 생물체 핵산 정보 데이터베이스인 진뱅크(Genbank)에 기존에 보고된 HPRV GP의 염기서열 정보(진뱅크 접근번호(GenBank accession number): QDZ59980를 이용하였다. 이를 바탕으로 하여, 본 발명자들은 HPRV GP를 합성하였다.
도 1은 본 발명의 일 실시예에 따라 합성된 HPRV GP 단백질 유전자의 뉴클레오티드 서열을 나타내는 모식도이고, 도 2는 본 발명의 일 실시예에 따라 합성된 HPRV GP 단백질 유전자와 야생형 HPRV GP 단백질 유전자의 뉴클레오티드 서열을 비교한 모식도이다.
본 발명의 일 실시예에 따라 합성된 HPRV GP의 아미노산 서열은 서열번호 1로 나타내었고, 뉴클레오타이드 서열은 서열번호 2 및 도 1에 나타내었다(표 1 참조). 도 2에 나타난 바와 같이, 야생형 HPRV GP와 본 발명에 따른 합성된 HPRV GP를 비교했을 때, 아미노산 서열의 차이가 없음을 확인하였다.
Seq ID NO: 명칭 서열 종류
1 Synthesized amino acids of HPRV Glycoprotein MAGTLIAILLCVTGVYSTIEFVPSGHLNWTPENVKNLTCPSFLADESVRQYGKSIGVKTAPRSKDIPHDGYICVTSQWSVTCDFRWYGSKYISNDVIRVPTTESMCRESIQKVMKGIPVVPFMPTENCGWNNVLVEEKQFTTATKHTVKKDPFGMMYIDSEFSDGKCGKEVCDAPNHMGIWIANKDNNDACSDLEVSAIDAYPSTRTRDWDADSFILTLSQKPLRIADSCKLRLCGLNGYRFKNGEWYSLTTQIDSGMQKQLDKVPNCPSDIQVHVHDSHSEAARIESLGMELALQVLCIQELRRSQDTGKVSNFLLSFLAPIHSGYGRVHRINKGKLETALGFYNKVTLARKPKLSKIGSSGSKNIAYEDTVVMKEGSKTMSLFNGNTYEDGEIKWIKNSIRTNVITDLDKEDFIASYIDHPHADHLPSKFNYTMIHKTGYGESENVFSSIQHWAGGLWQSITSTLLMLVAIAFFIILFLWIIRTCCLTRHKTPTIVMRDHDTVPLTSGRDVNLFSGMSV aa
2 Synthesized nucleotide of HPRV Glycoprotein cccgggatggctggtactttgattgctattttgttgtgtgttactggtgtttattctactattgaattcgttccatctggtcatttgcagtggactccagaaaatgttaaacagttgacttgtccatctttcttggctgatgaatctgttagacaatatggtaaatctattggtgttaaaactgctccaagatctaaagatattccacatgatggttatatttgtgttacttctcaatggtctgttacttgtgatttcagatggtatggttctaaatatatttctaatgatgttattagagttccaactactgaatctatgtgtagagaatctattcaaaaagttatgaaaggtattccagttgttccattcatgccaactgaaaattgtggttggaataatgttttggttgaagaaaaacaattcactactgctactaaacatactgttaaaaaagatccattcggtatgatgtatattgattctgaattctctgatggtaaatgtggtaaagaagtttgtgatgctccaaatcatatgggtatttggattgctaataaagataataatgatgcttgttctgatttggaagtttctgctattgatgcttatccatctactagaactagagattgggatgctgattctttcattttgactttgtctcaaaaaccattgagaattgctgattcttgtaaattgagattgtgtggtttgaatggttatagattcaaaaatggtgaatggtattctttgactactcaaattgattctggtatgcaaaaacaattggataaagttccaaattgtccatctgatattcaagttcatgttcatgattctcattctgaagctgctagaattgaatctttgggtatggaattggctttgcaagttttgtgtattcaagaattgagaagatctcaagatactggtaaagtttctaatttcttgttgtctttcttggctccaattcattctggttatggtagagttcatagaattaataaaggtaaattggaaactgctttgggtttctataataaagttactttggctagaaaaccaaaattgtctaaaattggttcttctggttctaaaaatattgcttatgaagatactgttgttatgaaagaaggttctaaaactatgtctttgttcaatggtaatacttatgaagatggtgaaattaaatggattaaaaattctattagaactaatgttattactgatttggataaagaagatttcattgcttcttatattgatcatccacatgctgatcatttgccatctaaattccagtatactatgattcataaaactggttatggtgaatctgaaaatgttttctcttctattcaacattgggctggtggtttgtggcaatctattacttctactttgttgatgttggttgctattgctttcttcattattttgttcttgtggattattagaacttgttgtttgactagacataaaactccaactattgttatgagagatcatgatactgttccattgacttctggtagagatgttaatttgttctctggtatgtctgttgcggccgc nt
1-2: HPRV GP 의 클로닝 (pET22b 벡터의 제조)
도 2에 따르면 합성된 HPRV GP(HPRV_synthesis)와 야생형 HPRV GP(HPRV_ori)에 대한 각각의 아미노산 서열은 HPRV 유래 G 단백질의 뉴클레오타이드 서열을 포함함을 확인하였다.
본 발명자들은 scFv 선택을 위한 항원으로서, 결합된 항원 펩타이드 BSA(antigen peptide BSA conjugated)를 합성하였다. 상기 HPRV GP의 에피토프 구조 및 표면 단백질 코딩 유전자를 분석한 후, 항원 펩타이드를 결정해서 서열번호 3, 4, 또는 5에 표시된 대로 합성하였다. 상기 항원 펩타이드의 서열은 각 표면 단백질의 에피토프에서 유래되었기 때문에 3가지 서로 다른 서열을 가지고 있다.
Seq ID NO: 명칭 서열 종류
3 HPRV_A3 LEVSAIDAY aa
4 HPRV_A3’ KVTLARKPK aa
5 HPRV_B44 RVHRINKGK aa
또한, 상기 항원 펩타이드는 면역원성을 가지고 있는바, 안정성을 향상하기 위해 상기 항원 펩타이드에 BSA를 부착하였다. 도 3은 본 발명의 일 실시예에 따라 합성된 HPRV GP 단백질 유전자를 복제하기 위한 발현 벡터 pET22b를 나타내는 개략도이고, 도 3에 나타낸 바와 같이, 상기 생물 핵산 정보 데이터베이스에 보고된 HPRV GP의 염기서열 정보를 복제용 공통 벡터인 pUC 벡터로 합성하였고, 발현 벡터로는 pET22b를 사용하였다. 합성된 HPRV GP 유전자의 양 말단에는 제한효소 인식 부위가 추가되어 있다. 보다 상세하게, 양 말단에 제한효소 인식 부위의 추가는 클로닝을 위한 것으로, HPRV GP의 5'-말단 및 3'-말단에 각각 제한효소 SmaI 및 NotI에 대한 제한효소 인식 부위(restriction enzyme recognition site)를 추가하였다.
<실시예 2> scFv 라이브러리로부터 HPRV GP에 결합하는 scFv 분리
상기 HPRV GP에 대한 항원 펩타이드와 scFv 라이브러리를 이용하여 HPRV GP에 결합하는 scFv 분리 실험을 진행하였다. 본 발명에 사용된 scFv 라이브러리는 아주대학교 의과대학 미생물학교실의 권명희 교수 연구실로부터 제공받은 pRGA-scFv(A) 인간 scFv 라이브러리를 이용하였다.
2-1: 바이오-패닝을 이용한 scFv 선정 (+ 유전자 분리 및 분석)
상기 실시예 1에 따라 서열번호 3, 4, 또는 5를 갖는 각 HPRV GP 항원 펩타이드-BSA(접합물)을 96 웰 면역 플레이트(well immunoplate)의 60개 웰(well)에 각각 2 μg/mL씩, 100 ul의 PBS를 사용하여 희석하고 4℃에서 24시간 동안 배양하여 well을 항원으로 코팅시켜서 “HPRV 웰”로 지칭하였다. 이와 동시에, 96 웰 면역 플레이트의 60개 웰에 각각 100 ul의 PBS를 동일한 공정으로 코팅하여 “negative 플레이트”로 지칭하였다.
상기 “negative 플레이트”를 TBST 1x로 4회 세척한 후, TBST 1x에 희석한 5% BSA 100 ul를 각 웰에 첨가하고 실온(RT)에서 2시간 동안 블로킹을 수행하였다. “negative 플레이트”의 블로킹 버퍼를 폐기한 후, PBST에 cfu/ml로 희석한 scFv 라이브러리 100μl를 웰당 추가하고 실온(RT)에서 2시간 동안 배양하였다.
이후 “HPRV 웰”의 블로킹 버퍼를 버리고 “negative 플레이트”의 scFv 라이브러리 용액을 웰당 100 μl씩 “HPRV 웰”에 옮겨 실온(RT)에서 2시간 동안 배양하였다. “HPRV 웰”에서 용액을 버린 후, 각 플레이트를 TBST 1x를 사용하여 4회 세척하고 웰당 100mM 트리에틸아민을 첨가하여 실온(RT)에서 10분 동안 파지 용출을 수행하였다. 그 후 웰당 1M 트리스(tris, pH 7.5) 50μl를 추가하고, 각 웰의 모든 상층액을 새로운 튜브에 모았다. 여기까지의 과정을 바이오-패닝(bio-panning)이라고 한다.
도 4는 본 발명의 일 실시예에 따른 scFv 에 대한 4번의 라운드 과정 동안의 바이오패닝 결과를 나타내는 다이어그램이고, 도 4에 나타난 바와 같이, 바이오패닝 ELISA 데이터를 기반으로 높은 친화성을 가진 것을 본 발명에 따른 scFv 후보로 선정하였다.
도 4는 본 발명의 일 실시예에 따른 4번의 라운드 과정 동안의 바이오패닝 결과를 나타내는 다이어그램이고, 상기 바이오-패닝 과정을 4번째 라운드까지 거쳐 높은 친화도를 보이면서도, FR1-4 및 CDR 1-3을 포함하는 scFv의 전체 서열을 가지는 23개의 scFv 후보를 선별하였으며, 아래 표 3에 나타난 바와 같다.
이어서, 상기 표 3에 나타난 23개의 scFv 후보에 대하여 IgBLAST로 분석을 하였다. 즉, IgBLAST로 중쇄 가변 및 경쇄 가변의 CDR 영역을 분석함으로서, 정지 코돈이나 돌연변이가 없어서 생산성이 높은 scFv를 선정하고자 하였다.
그 결과, 23개의 scFv 후보 중에서 scFv HPRV인 E4 와 C8가 scFv의 전체 서열을 가지면서, 정지 코돈이나 돌연변이가 없어서 E. coli에서 발현이 가능하며, 생산성이 우수할 것으로 나타났다. 다른 scFv 후보들은 정지 코돈 및/또는 돌연변이가 있어서 생산성이 낮은 것으로 분석되었다.
상기와 같이, 선정된 본 발명에 따른 scFv의 아미노산 서열은 도 5에 나타내었다. 도 5는 본 발명의 일 실시예에 따라 정제된 scFv 클론인 C8과 E4의 아미노산 서열을 나타내는 표이다. 그리고, 본 발명에 따른 scFv 클론인 C8과 E4의 각 영역에 대한 아미노산 서열은 하기 표 4에 나타난 바와 같다.
Seq ID NO: 명칭 서열 종류
8 E4:CDR1 of Variable Heavy Region GFTFSSYA aa
9 E4: CDR2 of Variable Heavy Region IYPWGGVT aa
10 E4: CDR3 of Variable Heavy Region AKHFTPFDY aa
11 E4: FR1 of Variable Heavy Region EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAAS aa
12 E4: FR2 of Variable Heavy Region MSWVRQAPGKGLEWVST aa
13 E4: FR3 of Variable Heavy Region YSADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYC aa
14 E4:FR4 of Variable Heavy Region WGQGTLVTV aa
15 E4:CDR1 of Variable Kappa Region QSISSY aa
16 E4: CDR2 of Variable Kappa Region AAS aa
17 E4: CDR3 of Variable Kappa Region QQKRPAPHT aa
18 E4: FR1 of Variable Kappa Region DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRAS aa
19 E4: FR2 of Variable Kappa Region LNWYQQKPGKAPKLLIY aa
20 E4: FR3 of Variable Kappa Region SLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYC aa
21 E4:FR4 of Variable Kappa Region FGQGTKVEIK aa
22 C8:CDR1 of Variable Kappa Region QSISSY aa
23 C8: CDR2 of Variable Kappa Region AAS aa
24 C8: CDR3 of Variable Kappa Region QQSYSTPNT aa
25 C8: FR1 of Variable Kappa Region DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRAS aa
26 C8: FR2 of Variable Kappa Region LNWYQQKPGKAPKLLIY aa
27 C8: FR3 of Variable Kappa Region SLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYC aa
28 C8:FR4 of Variable Kappa Region FGQGTKVEIK aa
29 E4: Heavy Chain Variable Region (VH) EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYA MSWVRQAPGKGLEWVSTIYPWGGVTYSADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKHFTPFDYWGQGTLVTV aa
30 E4: Light Chain Variable Region (VL) DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQSISSYLNWYQQKPGKAPKLLIYAASSLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQKRPAPHTFGQGTKVEIK aa
31 C8: Light Chain Variable Region (VL) DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQSISSYLNWYQQKPGKAPKLLIYAASSLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQSYSTPNTFGQGTKVEIK aa
상기 표 4에서, 서열번호 8은 본 발명에 따른 E4 scFv의 중쇄 CDR1의 아미노산 서열이고, 서열번호 9는 본 발명에 따른 E4 scFv의 중쇄 CDR2의 아미노산 서열이고,
서열번호 10은 본 발명에 따른 E4 scFv의 중쇄 CDR3의 아미노산 서열이고,
서열번호 11은 본 발명에 따른 E4 scFv의 중쇄 FR1의 아미노산 서열이고,
서열번호 12는 본 발명에 따른 E4 scFv의 중쇄 FR2의 아미노산 서열이고,
서열번호 13은 본 발명에 따른 E4 scFv의 중쇄 FR3의 아미노산 서열이고,
서열번호 14는 본 발명에 따른 E4 scFv의 중쇄 FR4의 아미노산 서열이고,
서열번호 15는 본 발명에 따른 E4 scFv의 경쇄 CDR1의 아미노산 서열이고,
서열번호 16은 본 발명에 따른 E4 scFv의 경쇄 CDR2의 아미노산 서열이고,
서열번호 17은 본 발명에 따른 E4 scFv의 경쇄 CDR3의 아미노산 서열이고,
서열번호 18은 본 발명에 따른 E4 scFv의 경쇄 FR1의 아미노산 서열이고,
서열번호 19는 본 발명에 따른 E4 scFv의 경쇄 FR1의 아미노산 서열이고,
서열번호 20은 본 발명에 따른 E4 scFv의 경쇄 FR2의 아미노산 서열이고,
서열번호 21은 본 발명에 따른 E4 scFv의 경쇄 FR4의 아미노산 서열이고,
서열번호 22는 본 발명에 따른 C8 scFv의 경쇄 CDR1의 아미노산 서열이고,
서열번호 23은 본 발명에 따른 C8 scFv의 경쇄 CDR2의 아미노산 서열이고,
서열번호 24는 본 발명에 따른 C8 scFv의 경쇄 CDR3의 아미노산 서열이고,
서열번호 25는 본 발명에 따른 C8 scFv의 경쇄 FR1의 아미노산 서열이고,
서열번호 26는 본 발명에 따른 C8 scFv의 경쇄 FR2의 아미노산 서열이고,
서열번호 27은 본 발명에 따른 C8 scFv의 경쇄 FR3의 아미노산 서열이고,
서열번호 28은 본 발명에 따른 C8 scFv의 경쇄 FR4의 아미노산 서열이고,
서열번호 29는 본 발명에 따른 E4 scFv의 중쇄 가변영역의 아미노산 서열이고,
서열번호 30은 본 발명에 따른 E4 scFv의 경쇄 가변영역의 아미노산 서열이고,
서열번호 31은 본 발명에 따른 C8 scFv의 경쇄 가변영역의 아미노산 서열이다.
<실시예 3> ScFv 발현을 위한 클로닝
3-1: 플라스미드에 클로닝하기 위한 scFv 증폭
상기 실시예 2에 따른 바이오-패닝 과정에서 ELISA 결과(도 4)에 따른 높은 친화력을 가진 E4 및 C8 양성 클론의 염기서열을 분석하여 중쇄와 경쇄 모두에 대한 CDR을 결정하는 scFv 유전자의 전체 염기서열을 결정하고자 하였다. 즉, SmaI 및 NotI 측면 제한 효소를 갖는 특정 프라이머(하기 표 5의 서열번호 6 및 서열번호 7에 표시된 서열을 갖는 프라이머)를 사용하여 본 발명에 따른 scFv E4 및 C8 유전자를 분리하기 위해 PCR 복제를 수행하였다.
Seq ID NO: 명칭 서열 종류
6 SmaI-VL-Universal F CAAACACCCGGGACATCCAGATGACCCAGT nt
7 NcoI-VL-Universal_R ACAAACCCATGGCGTTTGATTTCCACCTTG nt
3-2: pIg20 플라스미드에 scFv 유전자 삽입
본 발명에 따른 scFv E4 및 C8 유전자를 scFv 유전자의 복제 및 발현 플라스미드인 pIg20 플라스미드에 클로닝하였다(도 6). 도 6은 본 발명의 일 실시예에 따른 scFv 유전자를 복제하기 위한 발현 벡터 pIg20을 나타내는 개략도이다. 플라스미드 추출은 제조업체의 지침에 따라 AccuPrep® 플라스미드 미니 추출 키트를 사용하여 정제하였다.
분리된 DNA 플라스미드는 마크로젠의 DNA 시퀀싱 서비스인 제한효소 SmaI 및 NotI 분해 과정을 통해 선택된 scFv 유전자 서열을 증폭한 것으로 확인하였다. scFv 전체 서열은 ~700bp인 반면, VH만 또는 VL만의 길이는 ~300bp 이다. scFv 유전자는 클로닝(복제) 과정을 위해 대장균 DH5α에서, 단백질 발현을 위해 BL21 (DE3) pLysE에서 형질 전환되었다.
<실시예 4> scFv 단백질의 발현 테스트 및 정제
4-1: pIg20-scFv 플라스미드의 대장균 균주 BL21(DE3)pLysE로의 형질전환
대장균 발현 플라스미드 벡터인 pIg20은 PhoA 신호 서열(alkaline phosphatase signal sequence)이 존재하여 발현한 단백질이 페리플라즘(periplasm, 주변세포질)에 위치하게 하고, 그 결과 대장균을 이용해 발현한 단백질이 상층액에 존재할 수 있도록 한다. 플라스미드 내에 존재하는 6x 히스티딘 태그(6x Histidine tag)를 정제용 태깅(tagging) 단백질로 활용하였다. 서열이 확인된 pIg20-scFv 플라스미드를 단백질 발현을 위한 대장균 균주인 BL21(DE3)pLysE에 형질전환하였다.
-85℃에서 보관한 BL21 (DE3) pLysE 가용성(수용성) 세포를 scFv가 포함된 DNA 플라스미드와 혼합하고 4℃에서 10분간 배양한 후 반응 튜브에 넣고 혼합한 후 42℃에서 55초간 열 충격을 가하여 형질 전환하였다. 그 후, 세포를 4℃에서 5분간 배양하고, LB 배지 900 ul을 추가한 후 37°C 의 진탕배양기에서 1시간 동안 배양했다. 그 후, 암피실린(50 μl/ml)과 클로람페니콜(25 μg/ml)을 함유한 LB 고체 배지에 퍼뜨리고 37°C에서 16시간 배양하여 플레이트에 단일 콜로니를 형성하였다. 이후 상기 플레이트를 이용하여 단백질 발현에 사용하였다.
4-2: scFv 정제 및 농축
본 발명에 따른 E4 및 C8의 정제된 HPRV scFv에 대한 고농도의 단백질을 얻기 위해서, 최적의 발현 조건을 얻기 위해 최적화(Optimization)를 수행하였다. scFv의 최적 발현 조건은 25°C에서 120rpm의 에어레이션으로 정하였다. 항-HPRV scFv의 발현은 트립톤 10 g/L, 효모 추출물 5 g/L, NaCl 5 g/L을 함유한 루리아-베르타니(LB) 용액(Luria-Bertani(LB) broth)에서 수행하였다. 항-HPRV scFv 클론을 포함하는 BL21을 모아서 수집하고 5 mL LB 신선 배지에 다시 현탁시켰다. 이후 혼합물 4 mL를 암피실린 100 μg/mL와 클로람페니콜 25 μg/mL가 포함된 1 L LB 배양액에 접종하고 OD600이 0.7~0.8에 도달할 때까지 37℃에서 150r pm으로 배양하였다. 최종 농도 1 mM IPTG를 첨가하여 발현을 유도하고, 24℃에서 120 rpm으로 16시간 동안 추가 배양하였다. 7,000 rpm에서 20 분간 원심분리하여 배양 상층액을 수집하였다. 최적의 발현 조건에서 scFv 단백질은 Capto-L 수지를 사용하여 정제하였다.
4-3: scFv 발현 확인 - 웨스턴 블롯
상기 E4 및 C8에 대한 정제된 HPRV scFv에 대한 발현된 단백질의 양은 웨스턴 블롯 분석을 기반으로 분석하였고, 그 결과를 도 7에 나타내었다. 도 7은 본 발명의 일 실시예에 따라 정제된 scFv 클론 C8, E4를 서로 다른 온도 조건에서 웨스턴 블롯 분석한 결과이다.
젤을 만들기 위해 30% 아크릴아마이드-비스 용액을 사용하였다. 농도는 스태킹 젤의 경우 4%, 리졸브 젤의 경우 12%이다. 샘플을 6X 로딩 버퍼와 함께 95℃ 열 블록에서 10분간 변성시켰다. 샘플을 120V에서 약 1시간 동안 미니 겔 탱크(Thermo Fisher Scientific, 미국 매사추세츠주)를 사용하여 실행하였다. 크기 측정을 위해 Prestained protein ladder를 함께 로딩하였다. 이 젤은 웨스턴 블롯 분석에 추가로 사용하였다. 항-HPRV scFv의 시각화를 위해 웨스턴 블롯 분석이 수행되었다. 0.2 μm PVDF Membrane(미국 매사추세츠주 말보로 소재 Cytiva)을 사용하여 단백질을 이동하였다. 차단 완충액으로 TBS-T(0.05% Tween 20이 포함된 삼중 완충 식염수)의 5% 탈지유를 사용했고, 항단백질 A 단일 클론 항체(1:10000, 독일 시그마)와 염소 항-마우스 IgG HRP 접합 2차 항체(1:10000, 영국 캠브리지 Abcam)를 각각 1차 및 2차 항체로 사용하였다. 형광염색을 위한 ECL 용액(Thermo Fisher Scientific, 미국 매사추세츠주)을 적용하였다. Membrane은 iBright FL1000(Invitrogen, Thermo Fisher Scientific)을 사용하여 이미지 파일로 캡처하였다.
<실험예 1> 정제된 scFv을 이용한 ELISA - HPRV GP 진단 능력 확인
상기 실시예 4에서 얻은 E4 또는 C8에 대한 정제된 scFv의 HPRV G 단백질 결합 능력을 확인하기 위해 ELISA 분석을 수행하였다. HPRV 항원 펩타이드 BSA 접합체를 최종 부피 2 μg/mL로 PBS에 희석하여 웰당 100 μL씩 96개의 웰 플레이트에 코팅한 후 4℃에서 24시간 배양하였다. TBST로 물로 세척한 후, 5% 탈지분유를 TBST에 넣어 25℃에서 2시간 동안 차단하였다. 그런 다음 scFv 단백질(1차 항체)을 PBS로 희석하여 100 μg/ml 농도로 만든 후, 다시 5% 탈지유를 1:100 비율로 희석하여 96 웰 플레이트의 웰당 100 μL를 추가하고 25℃에서 2시간 동안 코팅된 항원과 반응시켰다. TBST로 세척한 후 각 웰에 100 μl의 TMB 기질 용액 첨가로 발색 반응을 진행하였고, 10분 후 50 μl의 1M H2SO4를 첨가하여 발색 반응을 중지하였다. 분광광도계를 통해 450nm 파장에서 흡광도를 측정했으며, 그 결과는 도 8, 9, 및 10에 나타내었다.
도 8은 본 발명의 일 실시예에 따라 정제된 scFv 클론인 C8과 E4의 HPRV GP 단백질과의 결합 친화도를 확인하기 위해 수행한 ELISA 분석 결과이고, 도 8에 나타낸 바와 같이, 서열번호 3, 4, 및 5를 포함한 각 항원 펩타이드 BSA 접합물에 대한 결합친화력을 나타내었다. 이는 항원 펩타이드 B44가 scFv와 높은 결합친화력을 가지고 있음을 보여주었다. 또한, E4는 HPRV 항원 펩타이드에 대해 상당한 결합친화력을 보여주었다. 따라서 E4에 대한 HPRV scFv 단백질은 진단 특성에 대한 높은 적합성을 가짐을 확인하였다.
도 9는 본 발명의 일 실시예에 따라 정제된 scFv 클론인 E4의 다양한 농도에서 항원과의 ELISA 분석 결과이고, 도 9에 나타낸 바와 같이, E4에 대한 HPRV scFv는 50μg/mL의 낮은 농도에서도 항원 펩티드에 결합함으로써 높은 흡광도를 나타내며 항원이 없는 대조군과 유의미한 차이를 나타내었다(**** p<0.001). 그러나 더 높은 농도에서는 대조군과 비교하여 차이가 없었다. 이는 높은 농도로 인해 항체 응집이 발생하여 위음성 결과가 나올 수 있기 때문인 것으로 보여진다.
도 10은 본 발명의 일 실시예에 따라 정제된 scFv 클론인 C8과 E4의 다양한 항원 펩타이드에 대한 특이성 분석 결과이고, 도 10에 나타낸 바와 같이, 다양한 항원 펩타이드 중 HPRV에 대한 scFv HPRV-E4의 특이성을 나타낸 결과로서, HAV에 대한 450nm에서의 흡광도(abs) 값은 통계적으로 유의한 차이가 없었지만(ns: 신호차 없음), E4에 대한 정제된 scFv 단백질이 표적 바이러스인 HPRV에 대해 특히 높은 반응성을 보이는 것을 확인하였다(**** p<0.0001). 즉, 본 발명에 따른 scFv E4와 C8은 모두 HPRV에 특이적으로 결합하였다.
그리고, C8에는 VL 서열만 있지만, E4는 VH와 VL에 해당하는 scFv 전체 서열을 갖고 있어서, 결합 친화력이 더 높은 것으로 보여진다.
이에 따르면, 본 발명에 따른 scFv HPRV-C8의 경우 VL 서열과 함께 다른 VH 서열(예를 들어, 상기 VL과 동일하거나 유사한 서열을 가진 VH)을 가진다면, 더욱 높은 결합 친화력을 가질 것으로 보여진다.
상기에서는 본 발명을 특정의 바람직한 실시예에 관련하여 도시하고 설명하였지만, 이하의 특허청구범위에 의해 마련되는 본 발명의 기술적 특징이나 분야를 이탈하지 않는 한도 내에서 본 발명이 다양하게 개조 및 변화될 수 있다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 명백한 것이다.
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Claims (17)

  1. 다음을 포함하는 쇠돌고래 라브도바이러스(Harbour Porpoise Rhabdovirus : HPRV)에 특이적으로 결합하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편:
    i) 서열번호 8로 표시되는 아미노산 서열로 이루어진 CDR(complementarity determining region)-H1, 서열번호 9로 표시되는 아미노산 서열로 이루어진 CDR-H2, 및 서열번호 10으로 표시되는 아미노산 서열로 이루어진 CDR-H3를 포함하는 중쇄가변영역(variable heavy chain); 및
    서열번호 15로 표시되는 아미노산 서열로 이루어진 CDR-L1, 서열번호 16으로 표시되는 아미노산 서열로 이루어진 CDR-L2, 및 서열번호 17로 표시되는 아미노산 서열로 이루어진 CDR-L3을 포함하는 경쇄가변영역(variable light chain).
  2. 제1항에 있어서,
    상기 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 다음을 포함하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편:
    i) 서열번호 29로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 중쇄가변영역 및 서열번호 30으로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 경쇄가변영역.
  3. 삭제
  4. 삭제
  5. 삭제
  6. 삭제
  7. 제1항에 있어서,
    상기 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 상기 중쇄가변영역 및 경쇄가변영역을 포함하는 모노클로날 항체, 폴리클로날 항체, scFv, Fab, F(ab'), F(ab')2, scFv-Fc, 미니바디, 다이아바디, 트리아바디, 테트라바디, 이중항체, 다중특이적 항체, 인간항체, 인간화 항체, 키메라 항체 또는 이들의 항원 결합 단편인, 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
  8. 제1항 또는 제2항의 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 포함하는, 쇠돌고래 라브도바이러스(HPRV) 검출용 조성물.
  9. 제8항의 조성물을 포함하는 쇠돌고래 라브도바이러스(HPRV) 검출용 키트.
  10. 삭제
  11. 삭제
  12. 제1항 또는 제2항의 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 핵산 분자.
  13. 제12항의 핵산 분자를 포함하는 재조합 벡터.
  14. 제13항의 재조합 벡터를 포함하는, 분리된 숙주세포.
  15. 제14항의 숙주세포를 배양하는 단계를 포함하는,
    쇠돌고래 라브도바이러스(HPRV)에 특이적으로 결합하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편의 제조방법.
  16. 제8항의 쇠돌고래 라브도바이러스(HPRV) 검출용 조성물을 시료와 반응시키는 단계; 및
    상기 쇠돌고래 라브도바이러스(HPRV) 검출용 조성물과 당단백질의 결합을 탐지하는 단계를 포함하는,
    쇠돌고래 라브도바이러스(HPRV) 검출 방법.
  17. 제16항에 있어서,
    상기 시료는 검출 대상 어류의 아가미, 비장, 근육 조직, 뇌, 심장, 지느러미, 간, 췌장, 위, 장, 신장, 배설강, 유문수, 피부 조직, 분변, 체액, 점액 및 혈액으로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상인 것인, 쇠돌고래 라브도바이러스(HPRV) 검출 방법.
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