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KR102819998B1 - 혈액 샘플의 혈소판 분석 방법 - Google Patents

혈액 샘플의 혈소판 분석 방법 Download PDF

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KR102819998B1
KR102819998B1 KR1020217004940A KR20217004940A KR102819998B1 KR 102819998 B1 KR102819998 B1 KR 102819998B1 KR 1020217004940 A KR1020217004940 A KR 1020217004940A KR 20217004940 A KR20217004940 A KR 20217004940A KR 102819998 B1 KR102819998 B1 KR 102819998B1
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캐서린 앙제뉴
라 살르 앙리 드
크리스티앙 가쉐
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에따블리스망 프랑세 뒤 상
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Abstract

본 발명은 혈액 샘플에 존재하는 혈소판을 분석하는 방법에 관한 것이며, 상기 방법은 a) 상기 샘플에 형광색소에 커플링된 MHC I에 결합하는 리간드를 첨가하는 단계; b) 혈소판의 평균 형광 강도 (MFI혈소판)를 유세포 측정기로 측정하는 단계; 및 c) 평균 "전방 산란" 파라미터 (FSC)를 상기 유세포 측정기로 측정하고 MFI혈소판/FSC 비를 결정하는 단계를 포함한다. 본 발명은 또한 대상체에서 말초 또는 중추성 혈소판감소증을 진단하기 위한 시험관내 방법에 관한 것이다.

Description

혈액 샘플의 혈소판 분석 방법
본 발명은 시험관내 혈액 분석 방법의 분야, 특히 혈액 샘플에 존재하는 혈소판 분석 방법의 분야에 관한 것이다. 보다 특히, 본 발명에 따른 방법은 대상체에서 시험관내 말초(peripheral) 또는 중추성(central) 혈소판감소증(thrombocytopenia)을 진단하는데 사용될 수 있다.
혈소판은 핵이 없는 혈액 세포이며 골수에 있는 거대핵세포(megakaryocyte)의 단편화에 의해 생산된다. 이는 통상 인간에서 150　000 내지 400　000 /μL의 평균 농도로 혈액에 존재하며 출혈을 예방하고 중지시키는 모든 현상을 포함하는 생물학적 과정인 지혈(hemostasis)에 필수적인 역할을 한다.
다수의 병상(pathology)은 혈중 혈소판 수의 이상과 관련이 있다. 이는 혈중 혈소판 농도의 증가, 즉, 혈소판증가증(thrombocytosis), 혈중 혈소판 농도의 감소, 즉, 혈소판감소증일 수 있다.
대부분의 혈소판증가증은 심각한 골수 손상 (특히 골수증식 증후군)으로부터 생긴다. 적절한 의학적 치료를 채택 가능하기 위해 이러한 유형의 혈소판증가증을 검출하는 것이 필수적이다. 혈액 혈소판과 신생 혈소판(young platelet)의 백분율에 대한 초기 분석은 탐색 단계를 쉽게 지시할 수 있는 간단한 절차이며, 이는 훨씬 더 침습적 절차인, 골수 생검 분석을 포함할 수 있다.
두 가지 유형의 혈소판감소증을 구별할 수 있다:
- 질 및/또는 수, 거대핵세포 형성의 결함으로부터 생기며 낮은 혈소판 생성 및, 결과적으로, 낮은 혈중 혈소판 농도로서 표시되는, 중추성, 또는 본태성(essential), 혈소판감소증. 중추성 혈소판감소증은 기원이 유전적이거나 후천적일 수 있는 상이한 원인, 예컨대 비타민 B12 결핍, 일부 암, 골수형성이상(myelodysplasia), 간 손상, 또는 특정 치료 예컨대 화학요법 또는 방사선요법을 가질 수 있다. 특정 경우에, 원인이 확인되지 않는다. 일부 질환은 중추성 혈소판감소증, 예컨대 베르나르-술리에 증후군(Bernard-Soulier syndrome) 또는 메이-헤글린 이상(May-Hegglin anomaly) (MYH9)과 관련이 있는 것으로 공지되어 있다.
- 말초 혈소판감소증은 순환 혈소판 수의 감소, 거대핵세포형성(megakaryocytopoiesis)의 보상적 증가, 그리고 따라서 혈소판의 더 높은 생성을 특징으로 한다. 말초 혈소판감소증은 일반적으로, 순환 혈소판의 파괴에 의해, 예를 들어 특정 의약 (예를 들어, 헤파린(heparin), 퀴닌(quinine))의 존재 하에 혈소판에 결합하는 자가항체 또는 항체의 작용에 의해 유발된다. 따라서 말초 혈소판감소증은 신생 혈소판(때때로 미성숙 혈소판이라고도 함)의 더 높은 비율을 특징으로 한다. 자가면역 기원의 특발성 혈소판감소성 자반증(Idiopathic thrombocytopenic purpura; ITP)은 말초 혈소판감소증의 가장 흔한 원인이다. 말초 혈소판감소증은 또한 순환 혈소판의 소모(consumption)를 야기하거나 알레르기 기원일 수 있는 환자의 염증 상태에 의해 설명될 수 있다.
혈소판감소증은 점상출혈(petechiae) 또는 자반증(purpura)의 형태로 보이는 출혈, 코와 입으로부터의 비정상적인 출혈, 심한 월경을 야기할 수 있으며, 혈종(hematomas)이 또한 발생할 수 있다.
혈소판감소증의 치료는 그의 원인에 따라 다르다. 따라서 중추성 혈소판감소증과 말초 혈소판감소증을 구별할 수 있는 것이 필수적이다.
혈소판감소증은, 일반적으로 "온혈구 계산(complete blood count)" 또는 "CBC" 또는 "혈액상(hemogram)"이라고 하는 혈액 검사에 의해, 혈중 혈소판 수를 측정함으로써 확인된다. 혈소판감소증은 혈소판 수가 혈액 L당 150 x109 미만인 경우 진단된다. 그러나, 혈소판 수를 측정하는 것만으로는 중추성 및 말초 혈소판감소증을 구별할 수 없다.
따라서, 혈중 신생 혈소판, 즉 골수에 의해 막 생성된 혈소판의 양을 결정하는 것이, 중추성 혈소판감소증과 말초 혈소판감소증을 구별하는 데 특히 중요하다. 신생 혈소판은 더 높은 함량의 큰 RNA 함량 (메신저 및 리보솜 RNA) 및 약간 더 큰 크기에 의해 다른 순환 혈소판과 구별된다. 티아졸 오렌지 (TO) 또는 그의 유사체 (예를 들어, 아크리딘 오렌지), RNA에 결합한 후 형광 방출이 1000배 증가한 염료는 유세포 측정(flow cytometry)에 의해 신생 혈소판을 구별하는 데 사용된다. 그러나, 신생 혈소판의 분석을 위해 TO 및 그의 유사체를 사용하는 것은, 특별히 신생 혈소판의 집단이 통상 전체 혈소판의 단지 1 내지 2%를 나타내는 인간에서 신중을 요한다. 실제로, 혈소판에서 TO (또는 그의 유사체)의 형광의 일부는 세포질 RNA를 표적으로 하는 RNase를 사용한 치료에 민감하지 않으며, 이는 미토콘드리아 핵산에 또는 조밀한 과립에 존재하는 뉴클레오티드에 결합한 후 형광에 의해 설명될 수 있다. 따라서, TO (또는 그의 유사체)로 혈소판을 표지화(labelilng)하면 두 집단이 드러난다: 첫 번째는 "TO밝음(bright)"이라고 하며, 이는 RNase 처리에 의해 그의 강한 형광이 대폭 감소되므로 더 높은 RNA 함량을 갖고 실질적으로 신생 혈소판에 해당하며, 두 번째는 "TO어둑함(dim)"이라고 하며, 이는 TO (또는 그의 유사체)의 형광이 더 약하고 RNase 처리에 민감하지 않으므로, 세포질 RNA를 거의 또는 전혀 함유하지 않고 신생 혈소판에 해당하지 않는다.
이러한 한계에도 불구하고, 지금까지 혈소판감소증의 원인 (즉, 중추성 또는 말초)을 확인하는 데 사용된 절차는 전혈(whole blood) 샘플에서, "미성숙 혈소판 분획" 또는 "IPF"라고 하는 신생 혈소판의 비율을 결정하기 위해 TO 유사체의 사용을 기반으로 한다. 이는 예를 들어 시스멕스(Sysmex)®로 공지된 방법일 수 있다. 시스멕스® 방법은 RNA와 관련하여 TO와 유사한 특성을 갖는 분자인 아크리딘 오렌지 유도체의 존재 하에 혈소판 크기와 형광을 통합하는 알고리즘을 사용한다. 이 방법은 단리된 혈소판감소증에 직면하여 임상 진단을 내리는 데 사용할 수 있는 IPF의 백분율을 수득하는 데 사용된다. 높은 IPF 수준은 말초 혈소판감소증을 반영하는 것으로 간주되며, 한편 시스멕스 방법에 의해 측정된 통상적인 IPF 수준 (15% 미만)은 중추성 혈소판감소증을 반영할 수 있다. 그러나, 상기에 설명한 바와 같이, 일부 아크리딘 오렌지는 미토콘드리아 핵산에 또는 조밀한 과립에서의 뉴클레오티드에 결합하며, 후자는 RNase 처리에 민감하지 않아, 위양성(false positive)을 생성할 수 있다.
따라서, 특히 말초 혈소판감소증 또는 중추성 혈소판감소증의 시험관내 진단을 위해, 신뢰할 수 있고 재현 가능한 방식으로 혈액 샘플에 존재하는 혈소판을 분석할 수 있도록 티아졸 오렌지 (TO) 또는 그의 유사체 중 하나 (예를 들어, 아크리딘 오렌지)의 사용을 필요 없게 할 수 있는 사용하기 쉬운 방법이 진정으로 필요하다.
본 발명자들은 혈소판의 원형질막에서 주 조직적합성 복합체 클래스 I(major histocompatibility complex class I; MHC I) 분자의 발현 수준에 대한 유세포 측정이 혈소판 연령, 즉 "신생 혈소판"에 해당하는 더 높은 수준의 발현과 상관관계가 있음을 입증하였다. 따라서, 본 발명자들은 형광색소(fluorochrome)에 커플링된(coupled) 항-MHC I 알파 쇄 리간드를 사용하여, 유세포 측정에 의해 혈액 샘플에서 혈소판을 분석하는 방법을 개발하였다. 이 분석 방법은 말초 혈소판감소증과 중추성 혈소판감소증을 구별하는 데 특히 적합하다.
본 발명의 첫 번째 목적은 하기 단계를 포함하는, 혈액 샘플에 존재하는 혈소판을 분석하는 방법에 관한 것이다:
a) 상기 샘플에 형광색소에 커플링된 MHC I에 결합하는 리간드를 첨가하는 단계;
b) 혈소판의 평균 형광 강도 (MFI혈소판)를 유세포 측정기로 측정하는 단계; 및
c) 평균 전방 산란(mean forward scatter; FSC) 파라미터를 상기 유세포 측정기로 측정하고 MFI혈소판/FSC 비를 결정하는 단계.
본 발명의 두 번째 목적은 하기 단계를 포함하는, 혈액 샘플에 존재하는 혈소판의 집단을 확인하는 방법에 관한 것이다:
a) 본 발명에 따른 방법을 수행함으로써 혈액 샘플에 존재하는 혈소판을 분석하는 단계; 및
b) 단계 a)의 결과를 사용하여 혈소판의 집단을 확인하는 단계.
본 발명의 세 번째 목적은 하기 단계를 포함하는, 대상체에서 말초 또는 중추성 혈소판감소증의 시험관내 진단을 위한 방법에 관한 것이다:
a) 본 발명에 따른 분석 방법을 수행함으로써 대상체의 혈액 샘플에 존재하는 혈소판을 분석하거나, 본 발명에 따른 확인 방법을 수행함으로써 대상체의 혈액 샘플에 존재하는 혈소판의 집단을 확인하는 단계; 및
b) 단계 a)의 결과를 말초 또는 중추성 혈소판감소증 진단에서 사용하는 단계.
본 발명의 네 번째 목적은 하기 단계를 포함하는, 중추성 또는 말초 혈소판감소증에 대한 치료의 치료 효능을 모니터링하기 위한 시험관내 방법에 관한 것이다:
a) 본 발명에 따른 분석 방법을 수행함으로써 중추성 또는 말초 혈소판감소증 치료를 받은 환자의 혈액 샘플에 존재하는 혈소판을 분석하거나, 본 발명에 따른 확인 방법을 수행함으로써 중추성 또는 말초 혈소판감소증을 겪은 환자의 혈액 샘플에 존재하는 혈소판의 집단을 확인하는 단계;
b) 단계 a)의 결과를 말초 또는 중추성 혈소판감소증 치료의 치료 효능을 결정하는 데 사용하는 단계.
본 발명의 다섯 번째 목적은 하기 단계를 포함하는, 염증성 또는 심혈관 질환의 발병(development)을 예지(prognosing)하기 위한 시험관내 방법에 관한 것이다:
a) 본 발명에 따른 분석 방법을 수행함으로써 대상체의 혈액 샘플에 존재하는 혈소판을 분석하거나, 본 발명에 따른 확인 방법을 수행함으로써 대상체의 혈액 샘플에 존재하는 혈소판의 집단을 확인하는 단계;
b) 단계 a)의 결과를 염증성 또는 심혈관 질환의 발병의 예후(prognosis)에서 사용하는 단계.
본 발명의 여섯 번째 목적은 다음을 포함하는, 본 발명에 따른 염증성 또는 심혈관 질환의 진단, 치료의 치료 효능 모니터링, 또는 발병의 예지(prognosing)를 위한 방법을 이행하기 위한 키트(kit)에 관한 것이다:
- 형광색소에 커플링된 MHC I에 결합하는 리간드;
- 내부 표준; 및
- 설명서.
도 1. MHC I 분자의 표면 발현은 신생 뮤린 혈소판에서 더 높다 A) 뮤린 혈소판에서 TO 및 MHC I 발현의 대표적인 FACS 분석 그래프. 혈소판은 PE 또는 알렉사(Alexa)-647-접합된 항-GPIb 베타 항체 및 티아졸 오렌지 (TO)로 표지되었다 (왼쪽 패널). GPIb 베타+ 혈소판을 선택하고 MHC I 발현을 PE-접합된 항-MHC I 항체 또는 알렉사-647-접합된 염소 항-마우스 2차 항체로 밝혀진 항-β2m 항체로 공동-표지화함으로써 분석하였다 (오른쪽 패널). TO밝음 혈소판은 연회색으로 강조되어 있다 (왼쪽 및 오른쪽 패널). B) MHC I 및 GP1bβ 분자의 표면 발현은 TO어둑함 또는 TO밝음 혈소판에서의 FSC 파라미터의 평균 형광 강도 (MFI)에 대한 GPIbβ의 MFI 또는 MHC I의 MFI의 비를 계산함으로써 평가하였다 (* p<0.05, *** p<0.001, ns p>0.05; n=3).
도 2. MHC I 분자의 표면 발현은 혈소판 노화 동안 생체내에서 감소한다.
디프테리아 독소 (DT)로 처리된 iDTR PF4 cre 마우스로부터의 혈소판을 단리하고, 비오티닐화하고 WT 마우스에 수혈하였다. 수혈 후 5 min, 24 h, 48 h 및 72 h에 비오티닐화 수혈된 혈소판 (▲) 및 내인성 TO어둑함 (□) 또는 TO밝음 () 혈소판에서 A) MHC I 발현 B) GPIbβ 발현 및 C) TO 표지화의 유세포 측정 분석. 결과는 표지화의 MFI와 FSC 파라미터의 MFI 사이의 비로서 표시된다 (n=3, 3개의 독립적 실험의 대표).
도 3. HLA I 분자는 티아졸 오렌지에 대한 고 형광 인간 혈소판에 의해 우선적으로 발현된다. A) 인간 혈소판에서 TO 및 MHC I 발현의 대표적인 FACS 그래프. 혈소판은 PE-접합된 항-GPIb 및 TO로 표지되었다 (왼쪽 패널). GPIbβ+ 혈소판을 선택하고 MHC I 발현을 A647-접합된 항-MHC I 및 PE-CY7-접합된 항-β2m 항체로 염색함으로써 분석하였다 (오른쪽 패널). TO밝음 혈소판은 연회색으로 강조되어 있다 (왼쪽 및 오른쪽 패널). B) MHC I 및 GP1bβ 분자의 세포 표면 발현은 TO어둑함 또는 TO밝음 혈소판에서 MHC I MFI (항-β2m 또는 항-HLA I 표지화) 또는 GPIbβ MFI과 FSC 파라미터 MFI의 비를 계산함으로써 평가하였다 (* p<.05, ** p*<.01, ns p>.05; n=7).
도 4. 고밀도의 MHC I 분자를 발현하는 인간 혈소판은 신생 혈소판의 특성을 나타낸다.
인간 혈소판에서 리보솜 단백질 발현, TO 및 MHC I 분자 발현의 대표적인 FACS 그래프. 인간 혈소판을 고정하고, 투과시키고, PE-접합된 항-GPIb, mAb 리보솜 P 단백질 항체, A647-접합된 항-MHC I, PE-CY7-접합된 항-β2m 항체, 및 TO로 공동-표지한 다음에 FACS에 의해 분석하였다. A) GPIbβ+ 혈소판을 선택하였다. 리보솜 단백질 발현은 TO밝음 혈소판을 짙은 회색으로 강조함으로써 분석하였다 (오른쪽 상단 패널). MHC I 분자의 발현은 TO밝음 또는 P-리보솜 고 혈소판을 짙은 회색으로 강조함으로써 분석하였다 (하단 패널). B) HLA I 분자를 강하게 또는 약하게 발현하는 집단에서 리보솜 P 단백질 또는 TO밝음 표지화의 분포 분석.
도 5. MHC I의 세포 표면 발현은 환자에서 신생 혈소판의 비율을 결정하기 위한 신뢰할 수 있는 기준이다.
A) 건강한 공여자로부터의 혈액 샘플을 FACS 분석 및 시스멕스® 시스템을 사용한 MFI 백분율 (n=6)에 의해 TO밝음 및 HLA I높음 혈소판 백분율에 대해 시험하였다 B) 건강한 공여자 또는 MyH9 결핍 환자로부터의 혈액 샘플을 분석하고 혈소판에서 TO 및 HLA I의 MFI를 FACS 분석에 의해 결정하였다. 결과는 FSC MFI에 대한 HLA I (W6/32 또는 β2m) 또는 TO 표지화의 MFI 사이의 비로서 표시한다. C) RNase 처리 전후의 상이한 혈액 샘플에 대한 TO 표지화의 FACS 그래프. TO밝음 혈소판의 백분율을 각각의 상태에 대해 나타냈다. D) 건강한 공여자로부터의 시트르산 처리된 혈액 샘플을 IPF 백분율을 시스멕스®에 의해 추정하기 전에 0.1, 0.5, 1, 10, 50 또는 100 μM TRAP으로 활성화하거나 (상단 패널) HLA I/FSC 또는 β2m/FSC 비를 유세포 측정 에 의해 분석하였다(하단 패널) (n=3-5).
본 출원인은 정확하고 재현 가능한 방식으로 혈액 샘플에서 혈소판을 분석하는 방법을 개발하였다. 이 방법을 사용하면, 특히, 혈소판감소증의 기원 (중심성 또는 말초)을 시험관내에서 결정할 수 있다.
정의
"혈소판"은 골수에 있는 거대핵세포의 단편화에 의해 생성되는 혈액 세포이다. 혈소판은 포유동물에서는 핵이 없으며 인간에서 그의 수명은 비장 또는 간에서 대식세포에 의해 제거되기 전 약 7 내지 10일이다. 혈소판은 일차 지혈의 필수 성분이다. 인간에서, 혈소판은 2 내지 4 미크론의 직경을 갖고 그의 혈중 정상 농도는 혈액 1 리터당 150 내지 400x109 혈소판이다. 이의 수는 나이가 들면서 감소하는 경향이 있다. 혈소판은 그의 표면에 주 조직적합성 복합체 (MHC) 클래스 I 분자를 발현한다.
용어 "신생 혈소판"은 골수에 의해 새로 생성된 혈소판, 즉 24시간 미만 연령, 예를 들어 12시간 미만의 혈소판을 지칭한다.
혈소판 농도가 혈액 1 리터당 150 x109 미만의 혈소판인 경우, 혈소판 수준은 낮은 것으로 간주되며 저혈소판증(thrombopenia)" 또는 "혈소판감소증"으로서 지칭되며, 여기서 출혈 위험이 증가된다.
혈소판 농도가 혈액 1 리터당 400 x109 초과의 혈소판인 경우, 혈소판 수준은 높은 것으로 간주되며 혈전증(thrombosis)과 연관된 위험과 함께, "혈소판증가증"으로서 지칭된다.
두 가지 유형의 혈소판감소증을 구별할 수 있다:
- 질 및/또는 수, 거대핵세포 형성의 결함으로부터 생기며 낮은 혈소판 생성 (혈액 1 리터당 150 x109 미만의 혈소판의 혈중 혈소판 농도)을 초래하는, 중추성, 또는 본태성, 혈소판감소증. 중추성 혈소판감소증은 기원이 유전적이거나 후천적일 수 있는 상이한 원인, 예컨대 비타민 B12 결핍, 일부 암, 골수형성이상, 간 손상, 또는 특정 치료 예컨대 화학요법 또는 방사선요법을 가질 수 있다. 특정 경우에, 원인이 확인되지 않는다. 일부 질환은 중추성 혈소판감소증, 예컨대 베르나르-술리에 증후군 또는 메이-헤글린 이상 (MYH9)과 관련이 있는 것으로 공지되어 있다.
- 말초 혈소판감소증은 순환 혈소판 수의 감소, 거대핵세포형성의 보상적 증가, 그리고 따라서 혈소판의 더 높은 생성을 특징으로 한다. 말초 혈소판감소증은 일반적으로, 혈소판의 파괴에 의해, 예를 들어 특정 의약 (예를 들어, 헤파린, 퀴닌)의 존재 하에 혈소판에 결합하는 자가항체 또는 항체의 작용에 의해 유발된다. 따라서 말초 혈소판감소증은 신생 혈소판의 더 높은 비율을 특징으로 한다 (때때로 미성숙 혈소판이라고도 함). 자가면역 기원의 특발성 혈소판감소성 자반증 (ITP)은 말초 혈소판감소증의 가장 흔한 원인이다. 말초 혈소판감소증은 또한 순환 혈소판의 소비를 야기하거나 면역 기원일 수 있는 환자의 염증 상태에 의해 설명될 수 있다.
주 조직적합성 복합체 클래스 I (MHC I) 분자는 자기-인식 시스템을 구성하고 T 림프구에 대한 펩티드 항원을 제시한다. 인간에서, MHC I은 인간 백혈구 항원 (HLA) 클래스 I(human leukocyte antigen (HLA) class I)이라고 한다. 이러한 분자는 거의 모든 유핵 세포의 원형질막과 혈소판에서 발현된다. 이는 알파 쇄 (3개의 면역글로불린-유사 도메인: α1, α2 및 α3 포함)과 베타-2 마이크로글로불린 (β2m)의 비공유 회합으로 이루어진다. 원형질막에서 발현되는 MHC I은 항상 펩티드와 연관되어 있으며, 이는 MHC I을 안정화시킨다. MHC I은 CD8 T 림프구에 대한 항원의 제시에 특히 관여하여, 자신을 비자신과 구별할 수 있게 한다.
본원에 사용된 바와 같은, 용어 "혈액 샘플"은 혈소판을 함유하는 임의의 샘플을 포함한다. 혈액 샘플은, 예를 들어, 대상체의 혈액으로부터 수득한다. 바람직하게는, 이는 전혈 샘플이며, 유리하게는 관련 기술분야의 통상의 기술자의 최선 실시에 따라 항응고제의 존재 하에 취해진다. 항응고제는 EDTA 또는 시트레이트일 수 있다.
본 발명의 의미 내에서 용어 "리간드"는 표적에 특이적으로 결합하는 분자를 나타낸다. 예를 들어, 본 발명의 맥락에서, MHC I에 결합하는 리간드는 따라서 MHC I에 특이적으로 결합하는 리간드를 나타낸다.
본 발명의 특정한 실시양태에서, 리간드는 알파 쇄와 연관되지 않은 β2m 쇄, 즉 가용성 β2m 쇄에 결합할 수 없다.
본 발명의 또 다른 특정한 실시양태에서, 리간드는 알파 쇄와 연관되지 않은 β2m 쇄에 결합할 수 있다. 이 특정한 실시양태에서, 충분히 높은 농도의 리간드가 유리하게 사용되어 혈액 샘플에 존재하는 가용성 β2m 쇄가 본 발명에 따른 방법을 수행할 때 MHC I에 대한 결합을 방해하지 않도록 한다.
본 발명의 특정한 실시양태에서, 리간드는 MHC I의 모든 이소형, 즉 이소형 A (HLA A), B (HLA B) 및 C (HLA C)에 결합할 수 있다.
리간드는 항체, 항체 단편, 압타머(aptamer), 단백질, 펩티드 또는 소분자일 수 있다. 본 발명의 맥락에서 사용될 수 있는 리간드는 관련 기술분야의 통상의 기술자에 의해 쉽게 수득될 수 있다. 예를 들어, 압타머에 대한 셀렉스(Selex) 방법 또는 항체에 대한 면역화 및 클로닝 방법이 언급될 수 있다. 바람직한 실시양태에서, 리간드는 항체 또는 항체 단편이다. 본 발명에서 사용될 수 있는 몇몇 항체는 상업적으로 이용 가능하며, 예를 들어 하이브리도마 ATCC HB-95에 의해 생성된 항체 W6/32, 예를 들어 바이오레전드(Biolegend)로부터 이용 가능한 APC에 이미 커플링된 항체 W6/32, 또는 바이오레전드 (항목 번호: 316318)로부터 이용 가능한 형광단 PE/Cy7에 이미 커플링된 항-인간 β2m 항체이다.
용어 "항체"는 본원에서 그의 가장 넓은 의미로 사용되며 원하는 항원-결합 활성을 갖는 다양한 항체 구조, 특히 모노클로날 항체를 포함한다. 이는 인간, 인간화, 키메라, 또는 비인간 종 항체, 예를 들어 뮤린 항체일 수 있다.
본 발명의 맥락에서, 리간드는 유세포 측정에서 그의 검출을 가능하게 하는 수단, 바람직하게는 형광색소 (또는 형광단)에 커플링된다. 용어 "형광색소"는 여기(excitation) 후에 형광(fluorescent light)을 방출할 수 있는 분자를 지칭한다. 형광색소에 의해 방출되는 형광 강도 (또는 MFI)는 임의의 공지된 수단에 의해, 예를 들어 형광색소의 형광 강도를 검출하고 측정할 수 있는 유세포 측정기를 사용하여 측정할 수 있다.
"유세포 측정"은 입자 또는 세포가 레이저 빔을 통해 고속으로 이동하게 하여, 세포를 계수 및 특성화하는 널리 사용되는 기술이다. 유세포 측정은 레이저 빔 앞에서 개별 입자, 분자 또는 세포를 하나씩 통과시킴으로써 이의 형광 강도를 측정할 수 있기 때문에 특히 유리한 기술이다.
본 발명의 의미 내에서 "내부 표준"은 유세포 측정에서 측정된 형광 강도 (MFI)의 정규화를 가능하게 한다. 본 발명의 맥락에서, 내부 표준은 바람직하게는 리간드에 결합하는 요소이다. 이는, 특히, 리간드가 흡착할 수 있는 폴리스티렌 마이크로비드(microbead)일 수 있다. 상이한 유형의 리간드에 적응된 수많은 내부 표준이 상업적으로 이용 가능하며, 예를 들어 리간드가 마우스 항체의 카파 쇄를 포함하는 항체인 경우 사용할 수 있는, "BD 콤프비드(BD Compbead) 번호 552843" 표준이다.
본 발명의 의미 내에서, "대상체"는 포유동물, 예를 들어 개, 고양이, 양, 소 또는 인간을 지칭하고, 바람직하게는 대상체는 인간이다. 본 발명의 의미 내에서, "건강한 대상체"는 비정상적인 혈소판 수를 유발하는 임의의 병상을 나타내지 않고 약물을 복용하고 있지 않은 대상체를 지칭한다.
용어 "진단"은 본원에서 그의 가장 넓은 의미로 사용되며, 통상적으로 사용되고 관련 기술분야의 통상의 기술자에 의해 잘 이해된다. 이 용어는, 예를 들어, 대상체에서 병상을 가질 개연성, 위험 또는 가능성의 결정을 지정한다.
본 발명의 의미 내에서 용어 "치료" 또는 "치료하다" 또는 "치료에 반응하다"는 병상의 진행의 개선, 약화, 반전 또는 억제를 지칭한다. 특히, 병상의 치료는 골수에 의한 정상적인 혈소판 생성을 회복하는 것으로 이루어질 수 있다.
혈소판 분석 또는 혈소판의 집단 확인 방법
본 설명은 하기 단계를 포함하는, 혈액 샘플에 존재하는 혈소판을 분석하는 방법에 관한 것이다:
a) 상기 샘플에 형광색소에 커플링된 MHC I에 결합하는 리간드를 첨가하는 단계;
b) 혈소판의 평균 형광 강도 (MFI혈소판)를 유세포 측정기로 측정하는 단계.
본 설명은 하기 단계를 포함하는, 혈액 샘플에 존재하는 혈소판을 분석하는 방법에 관한 것이다:
a) 상기 샘플에 형광색소에 커플링된 MHC I에 결합하는 리간드를 첨가하는 단계;
b) 혈소판의 평균 형광 강도 (MFI혈소판)를 유세포 측정기로 측정하는 단계; 및 유리하게는
c) 평균 전방 산란 (FSC) 파라미터를 상기 유세포 측정기로 측정하고 MFI혈소판/FSC 비를 결정하는 단계.
본 출원인은 실제로 혈소판 표면에서의 MHC I 발현 수준이 혈소판 연령과 상관계가 있음을 밝혀냈다. 따라서, 보다 신생의 혈소판은 보다 오래된(older) 혈소판보다 그의 원형질막에서 보다 많은 MHC I을 발현한다.
특히, 본 출원인은 FSC 파라미터로 정규화된 혈소판 표면에서의 MHC I 발현 수준이 연령과 상관관계가 있음을 밝혀냈다. 따라서, 보다 신생의 혈소판은 보다 오래된 혈소판보다 그의 원형질막에서 보다 높은 MHC I 분자의 밀도를 갖는다.
단계 a)
단계 a)는 상기 샘플에 형광색소에 커플링된 MHC I에 결합하는 리간드를 첨가하는 것으로 이루어진다. 이 단계는 형광색소-커플링된 리간드를, 예를 들어 진탕하면서, 혈액 샘플에 첨가함으로써 수행한다. 표지된 리간드와 혈소판 사이의 접촉을 용이하게 위해 혼합물을 균질화하는 데 진탕이 사용된다.
인큐베이션 시간은 표지된 리간드를 혈소판과 접촉시키기에 충분하여야 한다. 전형적으로, 관련 기술분야의 통상의 기술자가 사용하는 인큐베이션 시간은 항체의 경우 20 내지 30분이나, 이는 사용되는 리간드에 따라 단축될 수 있으며 이어서 5분 미만, 예를 들어 4분 미만, 3분 미만, 2분 미만, 1분 미만, 30초 미만일 수 있다. 인큐베이션 시간은 또한 5분 초과, 10분 초과 또는 심지어 15분 초과일 수 있다.
본 발명에 따른 분석 방법은 전혈 샘플을 사용하여 수행될 수 있기 때문에 특히 이행하기 쉽다. 그럼에도 불구하고, 상기 방법이 특정 혈액 샘플의 사용에 제한되지는 않는다. 예를 들어, 혈소판이 풍부한 혈장 (platelet-rich plasma; PRP) 또는 전혈로부터 단리된 혈소판과 같은 혈소판을 함유하는 전혈의 임의의 분획(fraction)일 수 있다. 바람직하게는 혈액 샘플은 전혈 샘플이다.
특정한 실시양태에서, 혈액 샘플은 혈액 샘플에 자연적으로 존재하는 것들 이외의 성분, 예를 들어 pH 조정을 위한 완충제, 또는 EDTA 또는 시트레이트와 같은 적합한 항응고제를 함유할 수 있다.
특정한 실시양태에서, 리간드는 항체, 항체 단편, 압타머, 단백질, 펩티드 또는 소분자로부터 선택될 수 있다. 적절한 양의 리간드는 실험자에 의해 쉽게 결정될 수 있다. 예를 들어, 리간드가 항체인 경우, 이는 0.1 μg/mL 내지 10 μg/mL 범위의 농도로 첨가할 수 있다. 리간드는 적절한 혈소판 표지화를 보장하기 위해 포화 상태의 샘플에 첨가된다.
특정한 실시양태에서, 리간드는 항체 또는 항체 단편이고, 예를 들어 하이브리도마 ATCC HB-95에 의해 생성된 W6/32 항체이거나 MHC I에 결합하는 그의 능력을 보유한 단편이다. 또한, 이는 β2m에 결합하는 항체일 수 있으며, 이 경우에 혈액에 존재하는 가용성 β2m이 방법의 이행을 방해하지 않도록 충분히 높은 농도의 항체를 사용하여야 한다.
리간드는 유세포 측정기, 바람직하게는 형광색소 (또는 형광단)를 사용하여 그의 검출을 가능하게 하는 수단에 커플링된다. 리간드는 형광색소에 직접 또는 간접, 바람직하게는 직접 커플링될 수 있다. 리간드와 형광색소를 커플링하는 방법은 문헌에 널리 기재되어 있다. 따라서 커플링은 어떤 특별한 기술적 어려움도 나타내지 않는다.
방법은 유세포 측정기로 검출할 수 있는 한, 특정한 형광색소에 제한되지는 않는다. 유리하게는, 형광색소는 그의 여기 및 방출 파장이 RNA 검출에 사용되는 시약을 방해하지 않는 형광색소이다. 형광단의 비제한적 예는 하기 및 실시예에서 인용된다: FITC (플루오레세인 이소티오시아네이트), PE (R-피코에리트린), APC (알로피코시아닌), PerCP (페리디닌 클로로필 단백질), PE-CF594, 페리디닌 클로로필 단백질 (PerCP)-Cy5.5, PE-텍사스 레드(Texas Red), GFP (녹색 형광 단백질), YFP (황색 형광 단백질) 또는 CFP (시안 형광 단백질).
단계 b)
단계 b)는 유세포 측정기를 사용하여 혈소판 (MFI 혈소판)의 평균 형광 강도를 측정하는 것으로 이루어진다. 물론, 유세포 측정기는 형광색소의 형광을 검출하고 측정할 수 있다. 측정은 유세포 측정기에 의해 자동으로 수행된다. 유세포 측정기의 파라미터화는 임의의 특정한 기술적 어려움을 나타내지 않는다. 특히, 통상의 기술자는 선택된 형광색소에 따라 유세포 측정기를 설정하는 방법을 알 것이다.
단계 b)에서 수행된 측정은 표지된 리간드에 의해 결합된 혈소판의 확인을 가능하게 하고, 혈소판의 하나 이상의 집단(들), 특히 신생 혈소판 집단의 확인을 가능하게 한다.
단계 c)
단계 c)는 평균 전방 산란 (FSC) 파라미터를 상기 유세포 측정기로 측정하고 MFI혈소판/FSC 비를 결정하는 단계로 이루어진다. 형광 강도 외에도, 유세포 측정기는 입자 크기, 예를 들어, 혈소판의 크기의 표시를 제공할 수 있는 다른 파라미터를 측정할 수 있다. 혈소판 크기의 표시를 제공하기 위해 가장 흔히 측정되는 파라미터는 전방 산란 (FSC)이며, 이후 "FSC혈소판"이라고도 지칭된다. 이는 FSC-A, FSC-H 또는 FCS-W일 수 있다. FSC-A가 일반적으로 사용된다.
특정한 실시양태에서, MFI혈소판 측정은 정규화된 혈소판의 평균 형광 강도 (MFI정규화된 혈소판)를 수득하기 위해 내부 표준의 평균 형광 강도 (MFI표준)로 정규화된다. 내부 표준은 바람직하게는 단계 a)에서, 리간드 전 또는 후에, 또는 리간드와 동시에, 바람직하게는 리간드 전에 상기 샘플에 첨가된다. 적절한 내부 표준 물질의 양은, 바람직하게는 혈소판 수와 동위(same order)의 크기 양을 넣음으로써 실험자에 의해 쉽게 결정될 수 있다.
내부 표준에 대한 MFI혈소판 측정의 정규화는 그것이 실험-간, 실험실-간 및/또는 실험자-간 가변성을 극복하기 때문에 특히 유리하다.
특정한 실시양태에서, 내부 표준은 형광색소-커플링된 리간드에 결합하고, 예를 들어 형광색소-커플링된 리간드는 내부 표준에 흡착한다. 따라서, 이 특정한 실시양태에서, MFI표준은 표준에 결합된 형광색소에 의해 방출되는 평균 형광 강도이며 형광색소의 형광을 검출 및 측정할 수 있는 유세포 측정기로 측정된다. 유세포 측정기는 표지된 혈소판과 표지된 내부 표준을 구별하도록 조정되어야한다. 일반적으로, 구분은 크기에 의해 이루어진다. 따라서 구분이 크기에 의해 이루어지는 경우, 표준이 혈소판과 쉽게 구별될 수 있도록 표지된 표준의 크기를 선택하는 것이 필수적이다.
유리하게는, 내부 표준은 형광색소-커플링된 리간드가 흡착된 폴리스티렌 마이크로비드이다. 이는, 예를 들어, 상기 형광색소-커플링된 리간드에 결합하는 항체로 코팅된 폴리스티렌 마이크로비드일 수 있다. 예를 들어, 리간드가 마우스 항체의 카파 쇄를 포함하는 항체 (예를 들어, 키메라 항체)인 경우에 사용될 수 있는 시판 제품 "BD 콤프비드 번호 552843"이 언급될 수 있다.
바람직한 실시양태에서, 본 발명의 방법은 상기 유세포 측정기로 평균 FSC 확산 파라미터 (FSC)를 측정하고 MFI혈소판/FSC 또는 MFI정규화된 혈소판/FSC 비를 결정하는 단계 c)를 추가로 포함한다. MFI혈소판/FSC 또는 MFI정규화된 혈소판/FSC 비의 결정은 그것이 혈소판의 더 세밀한 분석을 가능하게 하기 때문에 특히 유리하다. 이것은 혈소판의 하나 이상의 집단, 특별히 신생 혈소판의 집단을 보다 세밀하게 구별하는 것을 가능하게 한다. 단계 c)는 단계 b)와 동시에 유세포 측정기에 의해 자동으로 수행된다. 이 특정한 실시양태에서, 비의 결정은 유세포 측정기에 의해 측정된 값으로 자동으로 행해질 수 있다. MFI정규화된 혈소판/FSC 비는, 예를 들어, (MFI혈소판/FSC혈소판)/(MFI표준/FSC표준) 비를 계산함으로써 수득할 수 있다. 혈소판 크기의 표시를 제공하는 FSC혈소판와 마찬가지로, FSC표준 파라미터는 표준 입자 크기의 표시를 제공한다.
본 발명은 또한 하기 단계를 포함하는, 혈액 샘플에 존재하는 혈소판의 집단, 바람직하게는 신생 혈소판의 집단을 확인하는 방법에 관한 것이다:
a) 본 발명에 따른 방법을 수행함으로써 혈액 샘플에 존재하는 혈소판을 분석하는 단계; 및
b) 단계 a)의 결과를 사용하여 혈소판의 집단, 바람직하게는 신생 혈소판의 집단을 확인하는 단계.
혈소판 집단의 확인은 상기에 기재된 파라미터에 따라 유세포 측정기에 의해 자동으로 행해진다.
진단 방법
본 발명은 하기 단계를 포함하는, 대상체에서 말초 또는 중추성 혈소판감소증의 시험관내 진단을 위한 방법에 관한 것이다:
a) 본 발명에 따른 혈소판 분석 방법을 수행함으로써 대상체의 혈액 샘플에 존재하는 혈소판을 분석하는 단계; 및
b) 단계 a)의 결과를 말초 또는 중추성 혈소판감소증 진단에서 사용하는 단계.
본 발명에 따라 혈소판을 분석함으로써 수득한 결과는 대상체에서 말초 혈소판감소증을 진단할 수 있게 한다. 특히, 말초 혈소판감소증의 양성 진단은 건강한 대상체에서 측정된 동일한 파라미터(들)에 비해 파라미터(들) MFI혈소판, MFI정규화된 혈소판, MFI혈소판/FSC 비 및/또는 MFI정규화된 혈소판/FSC 비의 상기 대상체에서의 증가에 의해 제공된다.
건강한 대상체에서 측정된 동일한 파라미터(들)와 비교하여 고려된 대상체에서 상기 언급된 파라미터(들)의 증가는, 고려된 상기 대상체에서 신생 혈소판 양의 증가를 반영하고 증가된 골수 활성을 입증하므로 말초 혈소판감소증의 진단을 가능하게 한다.
바람직한 실시양태에서, 상기-언급된 파라미터들 중 하나 이상에서의 증가는 대략 1.5배 초과, 예를 들어 2배 초과, 2.5배 초과, 3배 초과, 또는 3.5배 초과이다.
본 발명에 따라 혈소판을 분석하여 수득한 결과는 대상체에서 중추성 혈소판감소증을 진단할 수 있게 한다. 특히, 중추성 혈소판감소증에 대한 양성 진단은 건강한 대상체에서 측정된 동일한 파라미터(들)와 유사하거나 동일한 상기 대상체에서 MFI혈소판, MFI정규화된 혈소판, MFI혈소판/FSC 비 및/또는 MFI정규화된 혈소판/FSC 비에 의해 제공된다.
특정한 실시양태에서, 상기 대상체는 이전에 혈소판감소증으로 갖고 있거나 혈소판감소증을 가질 가능성이 있는 것으로 진단된 적이 있다. 이어서 본 발명에 따른 진단 방법은 혈소판감소증의 기원 (중추성 또는 말초)을 알 수 있게 할 것이다.
치료의 치료 효능을 모니터링하는 방법
본 발명은 또한 하기 단계를 포함하는, 중추성 또는 말초 혈소판감소증에 대한 치료의 치료 효능을 모니터링하기 위한 시험관내 방법에 관한 것이다:
a) 본 발명에 따른 분석 방법을 이행함으로써 중추성 또는 말초 혈소판감소증 치료를 받은 환자의 혈액 샘플에 존재하는 혈소판을 분석하는 단계;
b) 중추성 또는 말초 혈소판감소증 치료의 치료 효능을 결정하는데 단계 a)의 결과를 사용하는 단계.
예지 방법(Prognostic process)
본 발명은 또한 하기 단계를 포함하는, 염증성 또는 심혈관 질환의 발병을 예지하기 위한 시험관내 방법에 관한 것이다
a) 본 발명에 따른 분석 방법을 이행함으로써 대상체에서 혈액 샘플에 존재하는 혈소판을 분석하는 단계;
b) 단계 a)의 결과를 염증성 또는 심혈관 질환의 발병의 예후에서 사용하는 단계.
특정한 실시양태에서, 염증성 질환은 패혈증이다. 또 다른 특정한 실시양태에서, 심혈관 질환은 죽상동맥경화증이다.
진단 키트
본 발명은 또한 다음을 포함하는, 대상체에서 말초 혈소판감소증 또는 중추성 혈소판감소증의 진단, 염증성 또는 심혈관 질환의 치료의 치료 효능 모니터링, 또는 발병의 예지를 위한 키트에 관한 것이다:
- 형광색소에 커플링된 MHC I에 결합하는 리간드;
- 내부 표준; 및
- 본 발명에 따른 시험관내 진단 방법을 이행하기 위한 설명서.
치료 방법
본 발명은 또한 하기 단계를 포함하는, 대상체에서 말초 혈소판감소증 또는 중추성 혈소판감소증을 치료하는 방법에 관한 것이다:
- 본 발명에 따른 시험관내 진단 방법을 이행하는 단계; 및
- 진단이 양성인 경우, 대상체의 적절한 치료를 시작하는 단계.
적절한 치료는 특히 본 출원에 참조로 포함된 참고문헌 [8], 특히 섹션 "제일-선 요법(First-line therapy)", "제이-선 요법(Second-line therapy)", "제삼-선 요법(Third-line therapy)", "기타 신규 작용제(Other new agent)" 및 표 2 (18면 및 19면)에 기재되어 있다.
실시예
물질 및 방법
시약
시약은 상업적으로 이용 가능하다. 티아졸 오렌지 (TO)는 시그마-알드리치(Sigma-Aldrich)로부터의 것이다. 크실라진(Xylazine) (롬펀(Rompun)®) 및 케타민 (이말겐(Imalgene) 1,000®)은 각각 바이엘(Bayer) 및 메이얼(Merial)로부터의 것이다. 비오틴은 써모피셔(ThermoFischer)에 의해 그리고 디프테리아 독소 (DT)는 산타 크루즈(Santa Cruz)에 의해 공급된다.
항체 및 유세포 측정
혈소판 당단백질 GPIb 베타 (Ram1, [7])의 세포외 도메인에 대한 래트 모노클로날 항체를 생성시켜 본 발명자들의 실험실에서 알렉사647 또는 488에 커플링하였다. 알로피코시아닌 (APC)에 커플링된 항-HLAI 마우스 항체 (클론 W6/32) (항목 번호: 311410), PE-CY7에 커플링된 인간 항-β2m (항목 번호: 316318) 및 APC-cy7에 커플링된 인간 항-CD45 (클론 2D1) (항목 번호: 368516)은 바이오레전드로부터의 것이다. 피코에리트린 (PE)에 커플링된 마우스 항-H2 (클론 M1/42) (항목 번호: 125506) 및 APC-CY7에 커플링된 스트렙타비딘 (항목 번호: 405208)은 바이오레전드로부터 구입하였다. 마우스 (클론 S19.8) 항-b2 마이크로글로불린 항체 (β2m) (항목 번호: 555299)는 BD 파르밍겐(Pharmingen)으로부터의 것이다. PE-cy7에 커플링된 마우스 항-CD45 항체 (클론 30-F11) (항목 번호: 25-0451)는 인비트로겐(Invitrogen)에 의해 공급되었다. 인간 항-리보솜 P 단백질 항체는 대만 국립 양밍 대학교(National Yang-Ming University)의 선(Sun) 교수에 의해 친절하게 제공되었다 [1].
전혈은 1% BSA 및 6 mM EDTA를 함유하는 10 부피의 PBS에 희석하였다. Fcγ 수용체는 항체 또는 항체들로 표지화기 전에 1/200 희석된 "FcR 차단" 시약 (밀테니 바이오텍(Milteny Biotec))에 의해 차단되었다. 세척 단계 후, 세포를 PBS에서 1 μg/ml TO로 15분 동안 카운터-표지하였다. 이어서 샘플을 20 부피의 1% 파라 포름알데히드에 희석하고 45분 이내에 유세포 측정 (LSR포르테사(LSRFortessa)™ 세포 분석기, BD 바이오사이언시즈(Biosciences))으로 분석하였다. 데이터는 BD FACSDiva 소프트웨어로 분석하였다.
마우스
실험은 찰스 리버 래보러토리즈(Charles River Laboratories)로부터 구입한 8- 내지 10주령 C57Bl6/J 마우스에서 수행하였다. 디프테리아 독소 수용체 트랜스진(transgene) 및 PF4 (텍스트에서 PF4-cre/iDTR에 의해 지정됨) 둘 다에 대해 양성인 마우스를 이전에 기재된 바와 같이 생성시켰다 [2].
혈소판 수혈
PF4-cre/iDTR 마우스는 4일 동안 디프테리아 독소 (DT) (100 ng/일, i.p.)를 주사하여 심한 혈소판감소증을 유발하였다. 마지막 주사 8일 후, 항응고제로서 사용된 시트레이트 (3.8%)에 마취된 마우스의 복부 대동맥으로부터 혈액을 채취하고 이전에 기재된 바와 같이 혈소판을 단리하였다 [3]. 세척된 가교결합된 혈소판을 비오티닐화하고, 1.2.106/μL로 재현탁하고 150 μL의 현탁액을 WT 마우스의 안와정맥총(retroorbital sinus)에 주입하였다. 혈액 샘플을 수혈 후 5분 (시간 0) 및 30분, 2 h, 24, 48 및 72 h 후에 수집하였다.
윤리 성명
인간 혈액 샘플은 연구가 수행된 프랑스 헌혈 당국-그헝 에스트(Etablissement Fran ais du Sang - Grand Est)(EFS-Alsace)(EFS-Alsace)에 의해 모집된 자발적 및 무급 공여자로부터 수득하였다. 각각의 혈액 수집에서, 공여자는 샘플이 연구 목적으로 사용될 수 있음을 나타내는 고지에 입각한 동의에 서명하였다. 동물 실험의 윤리적 승인은 유럽 연합 지침 2010/63/EU에 따라 이루어졌다. 이 연구는 동물 실험을 위한 스트라스부르 지역 윤리위원회(Comit r gional d' thique pour l'exp rimentation animale de Strasbourg), C.R.E.M.E.A.S. (CEEA 35)에 의해 승인되었다.
통계 분석
통계 분석은 그패르패드(GraphPad) 소프트웨어 (프리즘 5.02)를 사용하여 행하였다.
결과
신생 뮤린 혈소판은 그의 표면에 보다 많은 MHC I 분자를 발현한다
먼저, 마우스 혈소판 표면에서 클래스 I 분자의 발현이 그의 연령에 따라 달라지는 지 분석하였다. 마우스에서, 티아졸 오렌지 (TO) 표지화의 사용은 두 개의 혈소판 집단을 쉽게 구별할 수 있으며, 이 중 약 10%는 강한 TO 형광 (TO밝음)을 나타내고 (도 1A, 왼쪽) 12시간 미만 연령이다 [2]. 혈소판 표면에서의 MHC I 분자의 발현은 항-β2m 또는 항-MHC I (H2) 항체로 표지화한 후 TO 표지화한 후 유세포 측정에 의해 추정하였다. 클래스 I 분자의 발현은 TO어둑함 혈소판보다 TO밝음 혈소판에서 더 높은 것으로 나타났다 (도 1A, 오른쪽). 보다 신생의 혈소판이 그의 보다 더 큰 크기로 인해 보다 많은 MHC I 분자를 발현할 수 있다는 사실을 배제하기 위해, 본 발명자들은 TO어둑함 및 TO밝음 집단 둘 다에서 평균 FSC 파라미터 (파라미터는 세포 크기와 상관관계가 있었다)에 대한 β2m 또는 중쇄 (H2) 표지화의 평균 형광 강도 (MFI)의 비를 계산하였다 (도 1B). 비는 TO어둑함 혈소판 집단에서보다 TO밝음 집단에서 유의하게 더 높았다 (H2/FSC 비 TO밝음에서 14.55 +/- 0.46 대 TO어둑함에서 8.35 +/- 0.14; p< 0.001 및 β2m/FSC 비 TO밝음에서 44.78 +/- 16.50 대 TO어둑함에서 8.25 +/- 2.32; n=3; p < 0.05). 대조적으로, 본 발명자들이 주요 혈소판-특이적 당단백질인 GPIbβ의 발현을 분석한 경우, 비는 혈소판 집단 둘 다에서 유사하였다 (GPIb/FSC 비 TO밝음에서 247.07 +/- 3.57 대 TO어둑함에서 254.70 +/- 8.15; n=3; ns).
전반적으로, 이러한 데이터는 항상성 조건 하에, 신생의 뮤린 혈소판이 그의 표면에 보다 많은 MHC I 분자를 발현한다는 것을 나타냈다.
혈소판이 노화됨에 따라 클래스 I 분자의 표면 발현이 생체내에서 감소한다
이어서 본 발명자들은 혈소판에서 MHC I의 표면 발현이 생체내에서 그의 노화에 의해 영향을 받는지를 결정하였다. 본 발명자들은 iDTR PF4 cre 마우스를 이용하여 신생 동시발생 혈소판의 집단을 수득하였다 [2]. 4일 동안 디프테리아 독소 (DT)를 매일 투여하면 성숙한 거대핵세포의 절제가 유도되어, 혈소판 생성을 차단하고 진행성 혈소판감소증을 야기한다. 치료를 중지한 4일 후 (8일째), 거대핵세포형성(megakaryopoiesis) 및 혈전형성(thrombopoiesis)이 유의하게 개선되어, 대다수의 신생 혈소판의 일시적 존재를 초래하였다 (데이터는 표시되지 않음 및 [2]). 따라서, DT-처리된 iDTR PF4 cre 마우스로부터의 혈소판은 8일째에 단리되었고, 비오티닐화되고 WT 마우스에 수혈되었다. 비오티닐화된 수혈된 혈소판 상의 MHC I 발현을 분석하고 수혈 후 상이한 시간에서 유세포 측정에 의해 내인성 혈소판 상의 MHC I 발현과 비교하였다. 결과는 (TO 평균 형광)/(평균 FSC) 비가 수혈 후 5분 후 비오티닐화된 혈소판에 대해 높았으며 내인성 TO밝음 혈소판에 필적하는 것으로 나타났다. 24 h 후, 이는 내인성 TO어둑함 혈소판의 것과 동일하였으며 (도 2C), 이는 수혈된 혈소판의 생체내 노화를 확인해 주었다. 현저하게, 비오티닐화된 수혈된 혈소판에 대한 MHC I 발현은 시간이 지남에 따라 점차 감소하였다. 수혈 5분 후, 비오티닐화된 혈소판에서의 MHC I 발현은 내인성 TO밝음 혈소판에서의 발현 수준과 유사하였다. 24시간 후, 이 발현 수준은 내인성 TO어둑함 혈소판에서와 동일한 수준의 발현으로 유의하게 감소하였다 (도 2A). 이 실험은 생체내에서 혈소판 표면에서 MHC I 분자의 발현 수준이 그의 연령과 관련이 있음을 나타낸다. 대조적으로, GPIbβ 발현은 72시간의 기간에 걸쳐 수혈된 혈소판에서 안정적이었다 (도 2B).
전반적으로, 이러한 데이터는 24 h 미만 연령의 신생 혈소판을 구별하는 데 있어 MHC I 발현 파라미터의 관련성을 강조하였다.
HLA I 분자는 TO 밝음 인간 혈소판에 의해 우선적으로 발현된다.
인간에서, TO밝음 혈소판은 전체 혈소판 집단의 1 내지 2%를 나타낸다 (도 3A, 왼쪽 패널). 인간 혈소판의 표면에서 HLA I 분자의 발현을 특성화하기 위해, 후자는 항-β2m 항체, pan 항-HLA 클래스 I 항체, W6/32 [4]-로 공동-표지한 후, TO로 카운터-표지화하였다. 유세포 측정 분석은, 마우스에서 관찰된 바와 같이, TO밝음 혈소판이 더 높은 수준의 HLA I 분자를 발현하는 것으로 나타났다 (도 3A, 오른쪽 패널, 회색으로 강조됨).
혈소판 크기와 무관하게 혈소판 집단에서 HLA I 분자의 분포를 분석하기 위해, 본 발명자들은 뮤린 혈소판과 동일한 접근 방식, 즉 HLA I MFI/FSC 파라미터의 비를 사용하였다 (도 3B). 다시, 본 발명자들은 이 비가 TO어둑함 혈소판보다 TO밝음 혈소판에서 더 높음을 밝혀냈다 (TO밝음에서 β2m/FSC 비 11.58 ± 1.25 대 TO어둑함에서 6.59 ± 0.762, n=7, p< 0.05 및 W632/FSC 비 TO밝음에서 16.02 ± 1.99 대 TO어둑함에서 8.46 ± 0.93, n=7, p< 0.001). 정반대로, GPIbβ MFI/FSC 비는 TO어둑함과 TO밝음 간에 유사하여, 신생 혈소판에서 HLA I 분자 발현의 특이성을 강조하였다.
HLA I 분자를 강하게 발현하는 인간 혈소판은 신생 혈소판의 특징인, 더 높은 리보솜 단백질 함량을 갖는다.
리보솜 P 단백질 항원은 mRNA 번역에 필요한 3개의 리보솜 서브유닛 (RLP0, 2 및 3)의 C-말단 부분에 존재한다 [5]. mRNA 번역은 혈소판의 생후 처음 몇 시간에 주로 발생하기 때문에 [2], 적어도 TO밝음 혈소판에서 리보솜 P 단백질 항원을 검출할 것으로 예상될 것이다.
인간 혈소판을 고정하고, 투과시키고, 리보솜 P 단백질 항원, 항-β2m 항체, pan 항-HLA I 항체, W6/32 및 TO에 대한 항체와 공동-표지한 후, 유세포 측정에 의해 분석하였다 (도 4A).
리보솜 P 단백질에 대한 항체로의 표지화는 인간 혈소판의 13.3±% (n=4)가 이러한 단백질을 발현하며 한편 TO밝음 혈소판 부분모집단에서 83±% (n=4)이며, 이는 이 항원이 보다 신생의 혈소판에서 더 많이 발현되었음을 나타낸다. 더욱이, MHC I 분자 발현의 분석은 TO밝음 또는 리보솜 P-고 혈소판에서 진한 회색에서 증가된 존재를 나타냈다 (하단 패널). 이어서 본 발명자들은 HLA I 분자의 발현이 높거나 낮은 집단에서 리보솜 P 단백질의 분포를 분석하였다 (W6/32 또는 항-β2m으로 표지). 도 4B에 나타난 바와 같이, 리보솜 P 단백질은 대부분의 HLA I높음 혈소판에서 발현되었으나 소수의 HLA I낮음 혈소판에서만 발현되었다 (각각 82.77±10.63%, 10.47±3.59%, n=4) (도 4B).
혈소판에서 HLA I 분자의 발현 수준은 환자에서 신생 혈소판의 비율을 평가하는 기준으로서 사용될 수 있다.
임상 적용에서 이들 관찰의 관련성을 연구하기 위해, 본 발명자들은 순환에서 신생 혈소판의 비율 증가와 연관된 병상을 가진 환자 또는 건강한 공여자로부터의 인간 혈소판의 표면에서 HLA I 분자의 발현을 평가하였다. 본 발명자들은 먼저 "HLA I높음" 및 TO밝음 혈소판의 백분율을 건강한 지원자에게 시스멕스®에 의해 공여된 IPF의 백분율과 비교하였다 (도 5A, n=6). "HLA I높음" 및 TO밝음 혈소판의 백분율은 유사하였지만 (2.25% ± 0.26 대 2.17% ± 0.19, n=6), IPF의 백분율은 더 이질적이었으나 건강한 지원자에서 여전히 15% 미만이었다 (6.7% ± 1.6, n=6).
마지막으로, 본 발명자들은 시스멕스® 분석이 높은 백분율의 IPF (각각 64.9 및 42.7% IPF)를 나타낸 미오신 9 결손을 가진 2명의 환자의 혈소판의 표면에서 HLA I 분자의 발현을 분석하였다.
각각의 환자의 시트르산 처리된 혈액은 β2m에 대한 항체, pan 항-HLA I 항체, W6/32, 및 TO와 공동-표지된 후 유세포 측정에 의해 분석되었다. 현저하게, 단지 한명의 환자 (P1)가 대조군과 비교하여 높은 비의 β2m/FSC 및 W6/32/FSC를 가졌으나, 건강한 지원자와 비교하여 TO/FSC 비가 환자 둘 다 (P1 및 P2)에서 더 높았다 (도 5B). TO가 RNA뿐만 아니라 과립의 내용물에도 결합할 수 있다는 점을 고려하여, TO 표지화전에 RNaseA 처리를 수행하였다. 유세포 측정 분석은 RNaseA 처리가 환자 1에서 TO밝음 혈소판의 비율을 유의하게 감소시켰으며 (RNaseA 처리 후 4.9% TO밝음 대 RNaseA 처리 전 15.9% TO밝음), 한편 이 처리는 환자 2에서 TO밝음 혈소판 집단에 영향을 미치지 않았음을 나타냈다 (RNaseA 처리 후 26.1% TO밝음 대 RNaseA 처리 전 29.4% TO밝음) (도 5C).
IPF의 추정은, 특히 응집체의 존재로 인해, 혈소판 활성화에 의해 잠재적으로 편향되는 것으로 공지되어 있기 때문에 [6], 본 발명자들은 HLA I 분자의 표면 발현이 신생 혈소판의 비율을 평가하는 데 더 신뢰할 수 있는 기준이 될 수 있는지 확인하였다.
따라서 시트르산 처리된 혈액은 혈소판 응집 시약 TRAP (0.1, 0.5, 1, 10, 50 또는 100 μM)의 상이한 농도로 인큐베이션된 후, 유세포 측정 또는 시스멕스® 기술로 분석되었다. 0.5 μM TRAP로부터, 시스멕스® 기술을 사용한 IPF의 유의한 증가가 관찰되었지만 (0.5 μM TRAP 조건의 경우 10.7±8% IPF 대 비활성화된 조건의 경우 4.2±0.8% IPF, n=3), β2m/FSC 또는 W632/FSC 비가 안정적으로 유지되었다 (0.5 μM TRAP 조건에서 1.3±0.4 대 활성화되지 않은 조건에서 1.5±0.3, n=3). 더 높은 용량의 TRAP (100 μM)에서는, HLA I/FSC 비가 증가되었으며, 이는 과립에 존재하는 HLA I 복합체의 원형질막에 대한 노출 때문일 수 있는 것으로 나타났다 (도 5D). 그러나, 이 증가가 건강한 지원자에서 발견된 기준 값 내에 남아 있다는 점을 강조하는 것이 흥미롭다.
이러한 데이터는 HLA I 분자의 발현 수준이 신생 혈소판의 높은 비율을 가진 환자 샘플을 검출하기 위해 TO 표지화 또는 시스멕스® 기술보다 더 신뢰할 수 있음을 시사한다.
FSC (FSC-A)에 대한 정규화의 이점
a) 7명의 건강한 공여자 및 베르나르-술리에 증후군을 가진 1명의 환자로부터의 혈액 샘플을 본 발명에 따른 방법으로 분석하고, 임의로 FSC 비 (즉, FSC 정규화 포함 및 제외)를 계산하였다. 결과는 도 6에 제시하였다.
정규화하지 않고 수득한 결과와 관련하여, BSS 환자는 말초 혈소판감소증을 앓고 있을 것이다. 실제로, 정규화되지 않은 데이터는 BSS 환자의 혈소판이 그의 표면에 보다 많은 HLA I 분자를 발현함을 나타내는 것으로 보인다. 따라서 이 환자는 건강한 공여자보다 신생 혈소판을 더 많이 가질 것이다.
FSC를 사용한 비의 계산은 BSS 환자의 혈소판이 그의 표면에 보다 많은 HLA I 분자를 발현하지 않음을 나타낸다. 따라서 BSS 환자는 건강한 공여자와 마찬가지로 신생 혈소판을 갖지 않는다. 따라서 정규화는 위양성을 피한다.
b) 21명의 건강한 공여자, 골수섬유증(myelofibrosis) (MF)을 가진 1명의 환자, 메이-헤글린 이상 (MYH9)을 가진 2명의 환자 및 혈소판감소성 혈전성 자반증(thrombocytopenic thrombotic purpura) (ITP)을 가진 2명의 환자로부터의 혈액 샘플을 본 발명에 따른 방법으로 분석하고, 임의로 FSC와의 비 (즉, FSC 정규화 포함 및 제외)를 계산하였다. 결과는 도 7에 제시하였다.
혈소판 크기에 관계없이, 모든 환자는 보다 많은 신생 혈소판을 가진 것으로 의심될 것이며 따라서 "말초 혈소판감소증"으로 표지될 것이다. 이 조사결과는 MF 및 ITP (골수 활성 증가) 환자의 병상과 일치하며, 한편 MYH9 환자는 골수 활성이 증가하지 않을 수 있다.
혈소판 크기에 대한 비는 MYH9 2 환자가 실제로 건강한 공여자와 마찬가지로 신생 혈소판을 갖지 않는 위양성임을 나타낸다.
논고
결과는 혈소판 크기와 관련하여 유세포 측정에서 MHC I 발현의 수준을 측정하는 것이 혈소판 분석, 특히 신생 혈소판을 확인하는 데 유용하다는 것을 나타냈다. 실제로 신생 혈소판은 그의 표면에서 보다 많은 MHC I을 발현하는 것으로 나타났으며, 이 수준은 혈소판의 연령에 따라 감소한다. 이러한 모든 결과는 대상체에서 신생 혈소판의 비율을 평가하는 데 MHC I/FSC 비의 관심을 강조한다.
현재까지, 임상의는 일반적으로 샘플에 존재하는 신생 혈소판을 분석하기 위해 TO로 RNA 표지화를 시각화한다 (TO밝음). 그러나, 이 기술은 세포질 RNA (TO)를 결합하는 데 사용되는 시약이 과립에 함유된 뉴클레오티드를 또한 결합할 수 있다는 점을 고려하면 한계가 있다. MHC I 발현의 측정은 RNA의 비특이적 표지화를 피한다.
더욱이, MHC I 발현의 측정은 시스멕스® 방법에서 위양성을 생성하는, 분석된 샘플에 응집체의 존재라는 또 다른 단점을 피한다.
본 발명자들에 의해 수득된 결과는
MHC I 발현 수준의 측정이, MFI혈소판 파라미터를 측정함으로써, 특히, 입자 크기, 예를 들어 혈소판의 크기의 표시를 제공할 수 있게 하는, FSC 파라미터로 정규화된 후, 내부 표준의 형광 강도 (MFI표준)로 정규화되었을 때 특히 정확했다. 이러한 정규화는 특히 그것이 실험-간, 실험실-간 및/또는 실험자-간 가변성을 보상하는 것을 가능하게 한다.
본 발명자들이 (MFI혈소판/FSC혈소판)/(MFI표준/FSC표준) 비 (즉, MFI정규화된 혈소판/FSC)를 결정함으로써 혈소판을 분석한 경우 훨씬 더 정확한 결과를 수득하였다. 이 비는 혈소판을 놀라운 기교로 분석할 수 있게 한다. 궁극적으로, 이는 혈소판의 하나 이상의 집단, 특별히 신생 혈소판의 집단 사이의 더 세밀한 구별을 가능하게 한다. 결론적으로, 유세포 측정에서 측정된 MHC I 발현의 수준은 혈액 샘플에 존재하는 혈소판 분석하기 위한, 특히 신생 혈소판의 비율을 결정하기 위한 양호한 마커이다. 따라서 MHC I 분자의 발현 밀도는 대상체에서 말초 또는 중추성 혈소판감소증을 진단하고 중추성 또는 말초 혈소판감소증에 대한 치료의 치료 효능을 모니터링하기 위한 선택 마커를 구성한다.
"[참조 번호]"로서 본 출원에서 인용된 참고문헌:
1. Sun, K.H., et al., Monoclonal antibodies against human ribosomal P proteins penetrate into living cells and cause apoptosis of Jurkat T cells in culture. Rheumatology (Oxford), 2001. 40(7): p. 750-6.
2. Angenieux, C., et al., Time-Dependent Decay of mRNA and Ribosomal RNA during Platelet Aging and Its Correlation with Translation Activity. PLoS One, 2016. 11(1): p. e0148064.
3. Hechler, B., et al., Platelets are dispensable for antibody-mediated transfusion-related acute lung injury in the mouse. J Thromb Haemost, 2016. 14(6): p. 1255-67.
4. Tran, T.M., et al., The epitope recognized by pan-HLA class I-reactive monoclonal antibody W6/32 and its relationship to unusual stability of the HLA-B27/beta2-microglobulin complex. Immunogenetics, 2001. 53(6): p. 440-6.
5. Derylo, K., et al., The uL10 protein, a component of the ribosomal P-stalk, is released from the ribosome in nucleolar stress. Biochim Biophys Acta, 2018. 1865(1): p. 34-47.
6. Miyazaki, K., et al., Immature platelet fraction measurement is influenced by platelet size and is a useful parameter for discrimination of macrothrombocytopenia. Hematology, 2015. 20(10): p. 587-92.
7. Perrault, C. et al., Novel Monoclonal Antibody against the Extracellular Domain of GPIbModulates vWF Mediated Platelet Adhesion, Thromb Haemost, 2001. 86: p. 1238-48.
8. Nomura, S., Advances in Diagnosis and Treatments for Immune Thrombocytopenia, Clinical Medicine Insights: Blood Disorders, 2016. 9: p. 15-22.

Claims (15)

  1. 하기 단계를 포함하는, 혈액 샘플에 존재하는 혈소판을 분석하는 방법:
    a) 형광색소(fluorochrome)에 커플링된(coupled) MHC I에 결합하는 리간드를 상기 샘플에 첨가하는 단계;
    b) 혈소판의 평균 형광 강도(MFI혈소판)를 유세포 측정기(flow cytometer)로 측정하는 단계; 및
    c) 평균 전방 산란(forward scatter; FSC) 파라미터를 상기 유세포 측정기로 측정하고 MFI혈소판/FSC 비를 결정하는 단계.
  2. 제1항에 있어서, 상기 혈액 샘플이 전혈(whole blood)의 샘플, 또는 혈소판을 포함하는 전혈 분획(fraction)의 샘플인 방법.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 리간드가 항체 또는 항체 단편이고, 예를 들어 상기 항체가 하이브리도마 ATCC HB-95에 의해 생산된 W6/32 항체이거나 MHC I에 결합하는 그의 능력을 보유한 유도체인 방법.
  4. 제1항에 있어서, 상기 형광색소가, 형광색소의 여기(excitation) 및 방출 파장이 RNA 검출용 시약을 방해하지 않는 형광색소인 방법.
  5. 제1항에 있어서, 상기 MFI혈소판 측정이 정규화된 혈소판 평균 형광 강도(MFI정규화된 혈소판)를 수득하기 위해 내부 표준의 평균 형광 강도(MFI표준)로 정규화되며 단계 c)가 MFI정규화된 혈소판/FSC 비를 결정하기 위해 상기 유세포 측정기로 평균 전방 산란(FSC) 파라미터를 측정하는 것으로 이루어진 것인 방법.
  6. 제5항에 있어서, 상기 내부 표준이 상기 형광색소에 커플링된 MHC I에 결합하는 리간드에 결합하고, 예를 들어 내부 표준이 형광색소에 커플링된 MHC I에 결합하는 리간드에 결합하는 폴리스티렌 마이크로비드(microbead)인 방법.
  7. 제1항에 있어서, 리간드가 MHC I 알파 쇄에 적어도 부분적으로 결합하는 것인 방법.
  8. 하기 단계를 포함하는, 혈액 샘플에 존재하는 혈소판의 집단을 확인하는 방법:
    a) 제1항에 청구된 바와 같은 방법을 수행함으로써 혈액 샘플에 존재하는 혈소판을 분석하는 단계; 및
    b) 단계 a)의 결과를 사용하여 혈소판의 집단을 확인하는 단계.
  9. 제8항에 있어서, 혈소판의 집단이 신생 혈소판(young platelet)의 집단인 방법.
  10. 하기 단계를 포함하는, 대상체에서 말초 또는 중추성 혈소판감소증(thrombocytopenia)의 시험관내 진단을 위한 정보를 제공하기 위한 방법:
    a) 제1항의 방법을 수행함으로써 대상체의 단리된 혈액 샘플에 존재하는 혈소판을 분석하거나, 제8항 또는 제9항의 방법을 수행함으로써 대상체의 단리된 혈액 샘플에 존재하는 혈소판의 집단을 확인하는 단계; 및
    b) 단계 a)의 결과를 말초 또는 중추성 혈소판감소증 진단을 위한 정보를 제공하는 데 사용하는 단계.
  11. 제10항에 있어서, 상기 대상체에서 MFI혈소판/FSC 비 및/또는 MFI정규화된 혈소판/FSC 비가 건강한 대상체에서 측정된 동일한 파라미터(들)에 비해 증가된 것으로 확인되는 경우, 상기 대상체가 말초 혈소판감소증에 대해 양성인 방법.
  12. 제10항에 있어서, 상기 대상체에서 MFI혈소판/FSC 비 및/또는 MFI정규화된 혈소판/FSC 비의 파라미터가 건강한 대상체에서 측정된 동일한 파라미터(들)와 유사하거나 동일한 것으로 확인되는 경우, 상기 대상체가 중추성 혈소판감소증에 대해 양성인 방법.
  13. 하기 단계를 포함하는, 염증성 질환 또는 심혈관 질환의 발병(development)을 예지(prognosing)하기 위한 정보를 제공하기 위한 시험관내 방법:
    a) 제1항의 분석 방법을 수행함으로써 대상체로부터의 단리된 혈액 샘플에 존재하는 혈소판을 분석하거나, 제8항 또는 제9항에 청구된 바와 같은 방법을 수행함으로써 대상체로부터의 단리된 혈액 샘플에 존재하는 혈소판의 집단을 확인하는 단계;
    b) 단계 a)의 결과를 염증성 질환 또는 심혈관 질환의 발병의 예후(prognosis)를 위한 정보를 제공하는 데 사용하는 단계.
  14. 하기 단계를 포함하는, 중추성 또는 말초 혈소판감소증에 대한 치료의 치료 효능을 모니터링(monitoring)하기 위한 정보를 제공하기 위한 시험관내 방법:
    a) 제1항의 분석 방법을 수행함으로써 중추성 또는 말초 혈소판감소증 치료를 받은 환자의 단리된 혈액 샘플에 존재하는 혈소판을 분석하거나, 제8항 또는 제9항에 청구된 바와 같은 분석 방법을 수행함으로써 중추성 또는 말초 혈소판감소증 치료를 받은 환자의 단리된 혈액 샘플에 존재하는 혈소판의 집단을 확인하는 단계;
    b) 단계 a)의 결과를 중추성 또는 말초 혈소판감소증 치료의 치료 효능을 결정하기 위한 정보를 제공하는 데 사용하는 단계.
  15. 다음을 포함하는, 제6항에 청구된 바와 같은 방법을 수행하기 위한 키트(kit):
    - 형광색소에 커플링된 MHC I에 결합하는 리간드;
    - 내부 표준; 및
    - 설명서.
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