KR102796710B1

KR102796710B1 - 신규 잔토필 카로테노이드를 생산하는 해양 미생물 Erythrobacter sp. SDW2 균주 및 이를 이용한 잔토필 카로테노이드 대량생산방법

Info

Publication number: KR102796710B1
Application number: KR1020210193830A
Authority: KR
Inventors: 최용준; 정선욱
Original assignee: 서울시립대학교 산학협력단
Priority date: 2021-12-31
Filing date: 2021-12-31
Publication date: 2025-04-15
Anticipated expiration: 2041-12-31
Also published as: KR20230103168A

Abstract

본 발명은 우수한 항산화능을 나타내는 신규 잔토필 카로테노이드를 생합성하는 신규한 에리스로박터 종(Erythrobacter sp.) SDW2 균주를 제공하고 상기 균주를 배양하여 이로부터 신규 잔토필 카로테노이드를 대량생산하는 방법에 관한 것이다. 본 발명에서 제공하는 신종 SDW2 균주가 생산하는 신규 잔토필 카로테노이드를 포함하는 추출물은 기존 카로테노이드 보다 우수한 항산화능을 나타내므로, 건강보조제, 기능성 화장품, 의약 등에 천연 항산화 원료로써 널리 활용될 수 있다. 또한, SDW2 균주는 상기 카로테노이드의 대량생산 및 상용화를 위한 원천 생물산업 활용소재가 될 수 있다.

Description

신규 잔토필 카로테노이드를 생산하는 해양 미생물 Erythrobacter sp. SDW2 균주 및 이를 이용한 잔토필 카로테노이드 대량생산방법{MANUFACTURING METHOD OF ERYTHROBACTER SP. STRAIN SDW2 PRODUCING A NOVEL YELLOW XANTHOPHYLL CARPTENOID AND THE METHOD FOR XANTHOPHYLL CAROTENOID OVERPRODUCTION USING THIS STRAIN}

본 발명은 대한민국 제주시 색달해수욕장 연안 해수로부터 분리된 신규 잔토필 카로테노이드 생산능을 갖는 에리스로박터 종(Erythrobacter sp.) SDW2 균주 및 이를 이용한 신규 잔토필 카로테노이드 생산방법에 관한 것이다.

카로테노이드(Carotenoid)는 8개의 이소프레노이드 (Isoprenoid)로 구성된 생리활성을 가진 유색색소를 의미한다. 현재까지 약 700여 종의 카로테노이드가 발견되었으며, 주로 식물, 곰팡이, 조류, 박테리아등에서 생합성되는 것으로 알려져 있다. 카로테노이드는 그 구조의 골격탄소수에 따라 C₃₀, C₄₀, C₅₀ 계열로 구분되며, 산소 작용기 (oxygenated functional group)의 유무에 따라 카로틴 (carotene) 계열 및 잔토필 (xanthophyll) 계열 카로테노이드로 구분된다.

현재 상업적으로 이용되는 대표적인 잔토필 카로테노이드는 아스타잔틴(astaxanthin), 루테인(lutein), 지아잔틴(zeaxanthin) 등이 있으며, 이들은 항산화, 항암, 항염 등 인간의 질병 및 건강증진에 유효한 기능을 하는 것으로 알려져 있다.

구체적으로, 아스타잔틴은 가장 강력한 항산화제로 붉은색 색소이다. 자외선으로부터 피부를 보호하고 고밀도 지방단백(high-density lipoproteins: HDL)을 증가시키며, 면역 기능성 향상, 구강 암 및 유방 암의 성장을 감소시키는 것으로 알려져 있다.

또한, 루테인 및 지아잔틴은 자외선으로부터 눈을 보호하며, 특히 노화와 관련한 눈 질환 연구 결과에서 루테인 및 지아잔틴을 보충했을 때 후기노인성 황반 변성의 악화를 감소시킨다고 알려져 있다. 또한, 백내장과 황반 퇴화를 예방하고, 시각 퇴화 속도를 지연시키는 것으로 알려져 있다.

그러나, 화학합성 카로테노이드 소재에 대하여 부작용 및 유해성등의 소비자의 우려가 증대됨에 따라 천연 카로테노이드에 대한 관심이 더욱 증가하고 있는 추세이다.

이에, 카로테노이드는 전체 시장의 약 80%의 비중을 차지하고 있는 화학합성 카로테노이드의 대체소재로써 천연 카로테노이드의 생산을 위한 산업 미생물 개발 및 고기능성 신규 카로테노이드 발굴에 관한 연구가 활발히 진행되고 있다.

한편, 카로테노이드는 항산화능을 비롯한 카로테노이드 안정성 (stability) 및 생리활성도 (bioactivity)가 카로테노이드 종류에 따라 그 수준의 차이를 보이는 것으로 알려져 있다. 특히, 잔토필계 카로테노이드는 카로틴계 카로테노이드와 유사한 분자구조를 가지고 있으나, 산소원자로 치환된 수소 원자쌍을 가지고 있어, 카로틴계 카로테노이드 보다 더 극성을 띄므로, 체네 흡수율이 높고 카로틴보다 더 우수한 항산화능을 지니는 것으로 알려져 있다. 그 예로써, 대표적인 잔토필계 카로테노이드인 아스타잔틴 (astaxanthin)은 베타카로틴 (β-carotene)보다 약 10배 더 우수한 항산화능을 가진다.

최근, 해양 유래 미생물로부터 유용 잔토필 카로테노이드를 발굴하고 이를 대량으로 생산하고자하는 연구가 활발히 수행되고 있다. 해양 미생물 유래 잔토필은 해양 미생물의 극한 서식지 (낮은 온도, 고염, 자외선등)로부터 생존하기 위해 합성되는 천연대사물질 중 하나로 우수한 생리활성과 함께 인체에 다양한 기능을 수행한다고 보고된 바 있다. Shindo등은 신규 해양 미생물인 플라보박테리아시애 (Flavobacteriaceae) o4OKA-13-27과 YM6-073균주가 신규 잔토필 카로테노이드인 사프로잔틴 (Saproxanthin)과 믹솔 (mixol)을 생산한다는 것을 발견하였고, 이들은 육상 미생물 유래 잔토필인 지아잔틴보다 약 2.2배 이상 높은 지질산화(lipid oxidation) 억제 활성을 지니는 것을 확인하였다. 또한, 해수에서 발견된 극한환경미생물 데이노코쿠스 종 AJ005균주로부터 아스타잔틴 보다 2배이상 높은 항산화능을 가진 신규 카로테노이드 데이노잔틴이 발견되었다.

그러나, 상기 잔토필 카로테노이드를 생산하는 해양 미생물들은 대부분 클로로필 a (chlorophyll a) 및 카로테이드 전구체등 기타 중간대사체 (carotenoid intermediates)를 동시에 생산하므로 목적하는 카로테노이드의 순도가 낮아 추가적인 정제과정을 거쳐야 하며, 이에 따른 생산수율이 매우 낮은 한계가 존재한다.

따라서, 우수한 항산화능을 갖는 높은 순도의 잔토필을 생산하는 미생물의 발굴은 식품, 화장품, 의약 등 다양한 산업분야에 유용한 용도를 갖는 천연 카로테노이드의 대량 생산에 활용할 수 있고, 공급의 측면에서 높은 경제성 및 상용화에 매우 유리할 것으로 사료된다. 이에, 본 발명자들은 높은 순도, 높은 생산성 및 우수한 항산화능을 가진 잔토필 카로테노이드를 생합성하는 균주를 발굴하고자 노력하여 신규한 에리스로박터 종(Erythrobacter sp.) 균주를 발견하였다.

본 발명의 목적은 우수한 항산화능 및 고순도의 잔토필 카로테노이드를 생합성하는 신규 미생물을 제공하는 것이며, 구체적으로는 신규 잔토필 카로테노이드를 생산하는 에리스로박터 종(Erythrobacter sp.) SDW2 균주를 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 잔토필 카로테노이드 대량생산을 위한 상기 미생물의 배양 방법 및 잔토필 카로테노이드의 추출 방법을 제공하는 것이다.

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 제주 색달해수욕장 연안으로부터 해수샘플을 채취하고, Marine agar 배지에서 색소를 띄는 신규 해양 미생물을 순수분리하여 잔토필 카로테노이드 (xanthophyll carotenoid)를 생산할 수 있는 수탁번호 KACC 81198BP로 기탁된 에리스로박터 종 (Erythrobacter sp.) SDW2 균주를 제공한다.

또한, 본 발명은 배양배지 최적화를 통한 에리스로박터 종 SDW2 균주를 배양하는 단계를 포함하는 잔토필 카로테노이드 (xanthophyll carotenoid) 생산 방법을 제공한다.

또한, 본 발명은 에리스로박터 종 SDW2 균주 또는 상기 균주의 배양액으로부터 얻은 추출물 및 이의 항산화용 조성물을 제공한다.

본 발명에서 순수분리한 해양 미생물 Erythrobacer sp. SDW2 균주 (이하 SDW2 균주)는 95% 이상의 고순도 및 우수한 항산화능을 지닌 노란색의 신규 잔토필 카로테노이드를 생합성 할 수 있으며, 상기 미생물의 배지조성 및 배양조건의 최적화로 단시간 (48시간) 배양에 높은 균체 생산에 이르는 데에 성공하였다. 또한, 균체로부터 추출을 통해 얻은 고순도의 신규 잔토필 카로테노이드는 기존의 강력한 항산화능을 지닌 카로테노이드인 베타-카로틴, 루테인, 푸코잔틴, 푸코잔티놀, 아스타잔틴, 데이노잔틴 보다 더 높은 항산화능을 가진 것으로 확인되었다.

따라서, 본 발명의 신규 잔토필 카로테노이드를 생합성하는 SDW2 균주는 우수한 생산효율을 보이는 것으로 나타나 생산 비용 절감 효과를 제공하며, 기존 카로테노이드 보다 우수한 항산화능을 가져 식품, 화장품, 의약 등의 고부가가치 산업에 활용될 것으로 기대된다.

도 1은 Marine agar 배지에서 순수배양 된 Erythrobacter sp. SDW2 균주를 나타낸 도이다.
도 2는 Erythrobacter sp. SDW2 균주의 분류학적 계통도를 나타낸 도이다.
도 3a은 Erythrobacter sp. SDW2 균주로부터 추출된 잔토필의 UV-Visible 스펙트럼 분석그래프이다.
도 3b는 Erythrobacter sp. SDW2 균주로부터 메탄올로 추출된 신규 잔토필의 HPLC분석 그래프 및 Thin layer chromatography (TLC) 결과를 나타낸 도이다.
도 3c은 Erythrobacter sp. SDW2 균주로부터 추출된 신규 잔토필의 LC-MS분석 그래프이다.
도 4는 잔토필계 카로테노이드 생합성 경로를 나타낸 도이다.
도 5는 신규 잔토필과 기존 카로테노이드의 HPLC분석 그래프이다.
도 6a는 탄소원에 따른 Erythrobacter sp. SDW2의 생장곡선 그래프이다.
도 6b는 탄소원에 따른 Erythrobacter sp. SDW2의 신규 잔토필의 생산량 (Titer)와 세포건조중량당 생산량 (Content)를 비교 그래프이다.
도 7은 기존 카로테노이드와 신규 잔토필의 두 종의 활성산소종 (DPPH, ABTS)에 대한 소거능을 비교한 그래프이다.

이하, 본 발명을 상세히 설명한다.

본 발명은 제주 연안의 해수로부터 신규 분리 동정한 에리스로박터 종 (Erythrobacter sp.) 균주를 제공한다.

상기 에리스로박터 종 균주는 수탁번호 KACC 81198BP로 기탁된 Erythrobacter sp. SDW2 균주(이하 SDW2 균주)이다.

상기 SDW2 균주는 Marine broth(기산바이오, MB-M1512) 및 Bacto agar(BD, 프랑스)를 정제수에 용해하여 제조된 Marine agar 배지에 제주 연안으로부터 채취한 해수를 멸균된 식염수에 희석하여 희석액을 도말하고 35 내지 39℃, 36 내지 38℃ 및 36.5 내지 37.5℃에서 5 내지 9일 및 6 내지 8일간 배양한 후, 생장한 여러 콜로니 가운데 노란색을 띄는 콜로니만 취하여, 새로운 Marine agar 배지에 계대하여 노란색 색소를 지닌 단일 종의 미생물만을 순수분리하여 얻은 것이다(도 1).

상기 Marine broth는 주성분으로 MgCl₂, MgSO₄, peptone 등을 포함하지만, 이에 제한되지 않는다.

상기 과정에서 수득한 미생물의 동정을 위하여 DNA를 추출하고 서열번호 1 및 서열번호 2로 기재된 16s universial primer를 이용하여 수득된 미생물의 16s rRNA 유전자 염기서열(약 1.5kb, 서열번호 3)을 PCR로 분석하였다(표 1).

상기 과정으로부터 수득된 16s rRNA 유전자 염기서열로 NCBI BLAST program을 이용하여 상기 미생물의 종을 파악하였고, Mega 7.0 program을 이용한 계통분석을 통하여 제주 연안 해수로부터 분리된 노란색 색소를 띄는 미생물은 Erythrobacter sp. SDW2로 명명하였다(도 2).

본 발명자들은 상기 Erythrobacter sp. SDW2 균주를 국립농업과학원 미생물은행 (Korean Agricultural Culture Collection, KACC)에 수탁번호 KACC 81198BP로 기탁하였다.

상기 SDW2 균주는 잔토필 카로테노이드(xanthophyll carotenoid)를 생산할 수 있고, 이를 순도 95% 이상 100% 이하, 예를 들어, 96% 이상 97% 이하, 97% 이상 98% 이하, 98% 이상 99% 이하, 99% 이상 100% 이하의 고순도로 얻을 수 있다.

상기 SDW2 균주로부터 수득된 추출물을 300 nm에서 700 nm사이의 파장으로 microplate reader (Biotek, Winooski, VY, USA)을 이용하여 흡광도를 스캔한 결과, 450 nm 및 480nm 부근에서 높은 흡광도를 보이는 이중 피크 그래프를 나타내었다. 이는 일반적인 노란색을 띄는 잔토필 카로테노이드(푸코잔틴, 푸코잔티놀, 아스타잔틴, 노스토잔틴, 지아잔틴, 베타크립토잔틴 등)는 450 nm 및 480nm 부근에서 높은 흡광도를 보이는 이중 피크 그래프를 나타내는 것과 동일하였고, 이를 통해 SDW2 균주로부터 수득된 추출물에 잔토필 카로테노이드가 포함되어 있는 것을 확인하였다(도 3a).

상기 순도는 SDW2 균주로부터 수득된 추출물을 TCL 분석과 HPLC 분석을 수행한 결과, 단일 밴드 및 약 1.9 min의 머무름 시간(retention time)에서 95.2% area 가장 높은 단일 피크가 검출되는 것을 통해 확인하였다(도 3b). 이는 고순도의 단일 화합물이 나온 것을 의미한다. 따라서, 본 발명은 신규한 SDW2 균주를 통해 추가적인 정제과정 없이 고순도의 잔토필 카로테노이드를 얻을 수 있다는 장점을 가진다.

이후, SDW2 균주의 색소 추출물의 LC-MS분석 이온 스펙트럼 분석 결과 C₄₀H₅₆O₅의 화학식(분자량 616.4 g/mol)을 갖는 것으로 예측되었다(도 3c). 이는 기존에 보고된 잔토필계 카로테노이드인 푸코잔티놀(Fucoxanthinol, C₄₀H₅₆O₅)과 같은 화학식과 분자량을 나타낸다. 그러나, 카로테노이드 생산 박테리아 중 현재까지 푸코잔티놀을 생합성하는 균주는 보고된 바 없으며, 특히 Erythrobacter sp. 내에서 푸코잔티놀의 전구체인 푸코잔틴을 생산한 사례 또한 존재하지 않은 바, SDW2 균주가 생산하는 잔토필 카로테노이드는 푸코잔티놀과 같은 물질이라 예상하기 어렵다.

이에, Erythrobacter sp. SDW2의 유전체 분석을 통해 상기 미생물의 카로테노이드 합성경로를 분석한 결과, 상기 균주는 지아잔틴 (Zeaxanthin, C₄₀H₅₆O₂) 생합성경로 및 합성 유전자등 잔토필계 카로테노이드 생합성경로를 갖는 것으로 확인되었다(도 4).

또한, SDW2균주가 생산하는 색소추출물과 지아잔틴, 루테인, 푸코잔틴, 푸코잔티놀과 함께 분석한 HPLC 분석결과, SDW2의 카로테노이드는 상기 잔토필 카로테노이드들과는 서로 다른 머무름 시간에서 검출되는 것을 확인한 바 (도 5), SDW2 균주가 생합성하는 주요 카로테노이드는 지아잔틴을 전구체로하여 생합성된 신규 잔토필 카로테노이드임을 최종적으로 확인하였다.

또한, 본 발명은 Marine broth 및 Bacto agar를 정제수에 용해하여 Marine agar 배지를 제조하는 단계; 상기 Marine agar 배지에 해수샘플 희석액을 도말하여 배양하는 단계; 및 색을 띄는 콜로니를 분리하고 계대 배양하여 단일 콜로니를 얻는 단계를 포함하는 에리스로박터 종 SDW2 균주 배양 방법을 제공한다.

상기 Marine agar 배지는 Marine broth:Bacto agar의 특정 질량(g)비로 혼합하고 1 ℓ의 정제수에 용해하여 제조한다. 여기서, 상기 질량(g)비는 1:1, 1.5:1, 2:1, 2.5:1, 3:1, 3.5:1, 4:1일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

또한, 본 발명은 상기 배양 방법으로 얻은 상기 단일 콜로니를 Marine broth에 교반하며 배양하는 단계; 상기 배양 후 원심분리하여 세포를 회수하여 동결건조하는 단계; 및 상기 동결건조 후 얻은 균체에 메탄올, 에탄올 및 이들의 혼합물 중 어느 하나의 용매를 첨가하는 단계를 포함하는 에리스로박터 종 SDW2 균주 추출물 제조 방법을 제공한다.

상기 용매 중 메탄올은 100%, 90%, 80%, 60%, 50%, 40%, 30%, 20%, 10% 용액일 수 있으나, 이에 제한되지 않고, 최적의 추출 효율을 갖는 비율을 사용할 수 있다.

상기 용매 중 에탄올은 100%, 90%, 80%, 60%, 50%, 40%, 30%, 20%, 10% 용액일 수 있으나, 이에 제한되지 않고, 최적의 추출 효율을 갖는 비율을 사용할 수 있다.

상기 용매 중 이들의 혼합물은 메탄올:에탄올이 1:9, 2:8, 3:7, 4:6, 5:5 부피비일 수 있으나, 이에 제한되지 않고, 최적의 추출 효율을 갖는 부피비를 사용할 수 있다.

또한, 본 발명은 상기 배양 방법으로 얻은 상기 단일 콜로니를 탄소원을 첨가한 Marine broth에 배양하는 단계를 포함하는 에리스로박터 종 SDW2 균주의 대량 생산 방법을 제공한다.

상기 SDW2 균주의 높은 균체량을 수득하기 위해 Marine broth를 기본배지로 하고, 상기 탄소원으로 글루코오스 (glucose), 프럭토즈 (fructose), 글리세롤 (glycerol), 수크로즈 (sucrose), 자일로즈 (xylose)를 첨가하여 교반배양 하면서 SDW2 균주를 생장시킨다. 그 결과, 탄소원이 포함되지 않은 marine broth에서 배양된 SDW2 균주의 최종 균체량 대비 글루코오스, 수크로즈, 자일로즈가 포함된 marine broth에서는 높은 최종 균체량을 나타내었다. 따라서, SDW2 균주의 최대 균체생산을 위한 탄소원으로 글루코오스, 수크로즈, 자일로즈가 적합함을 확인하였다(도 6a 및 6b).

또한, 본 발명은 상기 에리스로박터 종 SDW2 균주 추출물 제조 방법에 의해 제조된 추출물을 포함하는 항산화용 조성물을 제공한다.

본 발명의 일 실험예에서 자유라디칼 (free radical)인 2,2-Diphenyl-1-picrylhydrazyl (DPPH)와 2,2'-azino-bis(3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid) (ABTS)를 이용하여 SDW2가 생합성하는 잔토필 카로테노이드의 항산화능을 확인하고, 상업적으로 활용되고 있는 다른 잔토필 카로테노이드들과 비교하였다.

그 결과, 본 발명의 SDW2 균주가 생산한 신규 잔토필 카로테노이드는 다른 잔토필 카로테노이드들 보다 약 25.8% ~ 60.6% 더 우수한 항산화능을 가진 것으로 확인되었다(도 7).

상기 조성물은 건강기능식품 조성물, 화장료 조성물, 약학적 조성물 등을 포함하지만, 이에 제한되지 않는다.

본 발명의 건강기능식품은 식품 제조 시 통상적으로 첨가되는 성분을 포함하며, 예를 들어, 단백질, 탄수화물, 지방, 영양소 및 조미제를 포함한다. 예컨대, 드링크제로 제조되는 경우에는 유효성분으로서 에리스로박터 종 SDW2 균주 추출물 이외에 향미제 또는 천연 탄수화물을 추가 성분으로 포함시킬 수 있다.

본 발명의 건강기능식품은 담체, 희석제, 부형제 및 첨가제 중 하나 이상을 더 포함하여 정제, 환제, 산제, 과립제, 분말제, 캡슐제 및 액제 제형으로 이루어진 군에서 선택된 하나로 제형될 수 있다. 본 발명의 추출물을 첨가할 수 있는 식품으로는, 각종 식품류, 분말, 과립, 정제, 캡슐, 시럽제, 음료, 껌, 차, 비타민 복합제, 건강기능성 식품류 등이 있다.

본 발명에서 화장료 조성물은 기능성 화장료 조성물임을 특징으로 한다. 기능성 화장료 조성물이란, 특정 피부의 관리와 예방을 위해 특정 기능을 강조해 만든 화장료 조성물, 또는 유전적, 환경적 요인에 의한 각종 피부질환의 예방과 적당한 관리를 위한 화장료 조성물을 말한다.

본 발명의 일 구현 예에 따른 화장료 조성물에서, 상기 화장료 조성물은 주름 예방 및 개선 효과를 갖는 화장품 및 세안제 등에 다양하게 이용될 수 있는데, 특히 피부외용연고, 크림, 유연화장수, 영양화장수, 팩, 에센스, 헤어토닉, 샴푸, 헤어컨디셔너, 젤, 스킨로션, 스킨토너, 아스트린젠트, 로션, 모이스처 로션, 영양크림, 모이스처 크림, 핸드크림, 파운데이션, 영양에센스, 선스크린, 비누, 클렌징폼, 클렌징로션, 바디로션 및 바디클렌저로 이루어지는 군으로부터 선택된 어느 하나의 제형을 갖는 화장료 조성물일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

본 발명에 따른 약학적 조성물은 유효성분을 단독으로 포함하거나, 하나 이상의 약학적으로 허용되는 담체, 부형제 또는 희석제를 포함하여 약학적 조성물로 제공될 수 있다.

본 발명에서 "약학적으로 허용되는"이란 상기 조성물에 노출되는 세포나 인간에게 독성이 없는 특성을 나타내는 것을 의미한다.

본 발명의 조성물은 경구 또는 비경구 투여할 수 있으며, 비경구 투여시 피부 외용 또는 복강내주사, 직장내주사, 피하주사, 정맥주사, 근육내 주사 또는 흉부내 주사 주입방식을 선택하는 것이 바람직하며, 이에 한정되는 것은 아니다.

본 발명의 조성물의 바람직한 투여량은 환자의 상태 및 체중, 질병의 정도, 약물형태, 투여경로 및 기간에 따라 다르지만, 당업자에 의해 적절하게 선택될 수 있다. 그러나, 바람직한 효과를 위해서, 상기 조성물은 0.01~1000mg/kg/day로, 바람직하게는 0.1~500㎎/kg/day로 투여하는 것이 바람직하나 이에 한정되지 않는다. 상기 투여는 하루에 한번 투여할 수도 있고, 수회 나누어 투여할 수도 있다. 상기 투여량은 어떠한 면으로든 본 발명의 범위를 한정하는 것은 아니다.

이하, 본 발명을 하기 실시예 및 실험예에 의해 상세히 설명한다. 단, 하기 실시예 및 실험예는 본 발명을 예시하기 위한 것일 뿐, 본 발명이 이들에 의해 제한되는 것은 아니다.

실시예 1. 해수샘플로부터 신규 잔토필 생합성능을 갖는 미생물의 분리동정

실시예 1-1. 색소 생산 해양 미생물의 순수 배양 및 염기서열 분석

37.35 g의 Marine broth (기산바이오, MB-M1512), 15 g의 Bacto agar (BD, 프랑스)를 1 ℓ의 정제수에 용해하여 Marine agar 배지를 제조 후 121℃에서 15분간 가압멸균 하였다.

상기 제조된 배지에 제주 연안 (33°14’42.2 “N 126°24’41.7 "E)으로부터 채취한 해수를 멸균된 식염수에 희석하여 100 ㎕의 희석액을 도말하고 37℃에서 7일간 정치 배양하였다. 배양 이후, 생장한 여러 콜로니 가운데 노란색을 띄는 콜로니만 취하여, 새로운 Marine agar 배지에 2 내지 3 회 계대하여 노란색 색소를 지닌 단일 종의 미생물만을 순수분리하였다(도 1). 이후, 상기 과정에서 수득한 미생물의 동정을 위하여 순수배양된 미생물의 DNA를 추출하고 서열번호 1 및 서열번호 2로 기재된 16s universial primer를 이용하여 PCR을 수행하여 수득된 미생물의 서열번호 3으로 기재된 약 1.5kb의 16s rRNA 유전자 염기서열을 분석하였다(표 1).

서열번호	이름	서열(5'→3')
1	16s universial primer F	agagtttgatcmtggctcag
2	16s universial primer R	tacggytaccttgttacgactt

상기 과정으로부터 수득된 16s rRNA 유전자 염기서열은 NCBI GenBank에 등록하였다(GenBank accession number: MZ437366). NCBI BLAST program을 이용하여 상기 미생물의 종을 파악하였고, Mega 7.0 program을 이용한 계통분석을 통하여 제주 연안 해수로부터 분리된 노란색 색소를 띄는 미생물은 Erythrobacter sp. SDW2로 명명하였다(도 2).

본 발명자들은 신규 잔토필을 생산하는 상기 Erythrobacter sp. SDW2 균주를 국립농업과학원 미생물은행(Korean Agricultural Culture Collection, KACC)에 수탁번호 KACC 81198BP로 기탁하였다.

실시예 1-2. SDW2 균주가 생합성하는 색소의 추출

상기 실시예 1-1에서 수득된 SDW2 균주의 단일콜로니를 Marine broth 3 ㎖에 200 rpm의 조건으로 24시간 동안 교반하며 배양하였다. 배양 후, 1%의 배양액을 새로운 50 ㎖의 Marine broth에 재접종하여 37℃, 200 rpm의 조건으로 48시간 동안 교반하며 배양하였다. 배양 후, 배양액을 15분간, 4℃, 10,000 rpm의 조건으로 원심분리하여 세포를 회수하고, 동결건조 후 수득된 균체에 5 ㎖의 메탄올를 첨가하여 균체로부터 색소를 완전히 추출하였다. 수득된 추출물은 0.25 ㎛의 포어(pore) 크기를 갖는 여과지를 이용하여 여과하여 세포잔여물이 최종제거된 순수 추출물을 수득하였다.

실시예 1-3. UV 스펙트럼, TLC, 고성능 액체크로마토그래피(HPLC) 및 LC-MS 분석을 통한 SDW2 추출물의 성상분석

먼저, 실시예 1-2에서 수득된 색소 추출물에 UV 스펙트럼을 조사하였다.

구체적으로, 200 ㎕의 추출액을 96-well clear plate에 넣고, 300 nm에서 700 nm사이의 파장으로 microplate reader (Biotek, Winooski, VY, USA)을 이용하여 스캔하였다. 그 결과, 추출물은 일반적인 노란색을 띄는 잔토필 카로테노이드 (노스토잔틴, 지아잔틴, 베타크립토잔틴등)와 같은 450 nm과 480nm의 파장을 가장 높게 흡수하는 것으로 확인되었다(도 3a).

이후, 상기 추출물은 실리카겔이 코팅된 TLC (Merck, KGaA, Darmstadt) plate와 전개액 (ethyl acetate:hexane, 6:4, v/v)을 이용하여 TCL 분석과 HPLC [Agilent 1260 Infinity II (Agilent Corp., Santa Clara, CA, USA)] 분석을 수행하였다. 추출물의 분리를 위한 컬럼은 Zorbax Eclipse XDB-C18 5 ㎛(4.6 x 150 ㎜)를 사용하였고, 컬럼온도는 30℃, 유속은 1 ㎖/min으로 설정하고, UV파장은 450nm로 설정하여 10분간 분석하였다. 준비된 추출물은 5 ㎕를 주입하였다. 이동상은 아세토니트릴, 메탄올 및 이소프로판올이 40:50:10으로 배합된 것을 사용하였다.

그 결과, 도 3b에 나타낸 것과 같이 SDW2의 색소 추출물은 약 1.9 min의 머무름 시간(retention time)에서 95.2% area, 2.3 min의 머무름 시간에서 4.6% area에 해당하는 피크가 각각 검출됨을 확인하였다. 특히, 1.9min의 머무름 시간에서 가장 높은 피크가 검출됨을 확인하였다.

상기의 결과는 카로테노이드를 생산하는 Erythobacter 종인 E. flavus KJ5, E. longus, 및 E. nanhaesediminis 과는 달리 SDW2 균주는 주요 카로테노이드로 95% 이상의 순도를 가지는 카로테노이드 생합성하는 것으로 확인되었고, 이는 기존의 해양 미생물 카로테노이드의 추가적인 정제과정을 배제할 수 있어 높은 경제성을 가지는 장점을 가진다.

이후, SDW2 균주의 색소 추출물의 LC-MS분석 이온 스펙트럼 분석결과 617.42 m/z [M+H], 599.42 m/z [M-H₂O]에서 검출됨을 확인하였고, 그 결과 C₄₀H₅₆O₅의 화학식(분자량 616.4 g/mol)을 갖는 것으로 예측되었다(도 3c).이는 기존에 보고된 잔토필 카로테노이드인 푸코잔티놀(Fucoxanthinol, C₄₀H₅₆O₅)과 같은 화학식과 분자량을 나타낸다.

그러나, 카로테노이드 생산 박테리아 중 현재까지 푸코잔티놀을 생합성하는 균주는 보고된 바 없으며, 특히 Erythrobacter종내에서 푸코잔티놀의 전구체인 푸코잔틴을 생산한 사례 또한 존재하지 않은 바, SDW2균주가 생산하는 카로테노이드는 푸코잔티놀도 같은 물질이라 예상하기 어렵다.

또한, SDW2균주가 생산하는 색소추출물과 지아잔틴, 루테인, 푸코잔틴, 푸코잔티놀과 함께 분석한 HPLC 분석결과, SDW2의 카로테노이드는 상기 잔토필 카로테노이드들과는 서로 다른 머무름 시간에서 검출되는 것을 확인한 바(도 5), SDW2 균주가 생합성하는 주요 카로테노이드는 지아잔틴을 전구체로하여 생합성된 신규 잔토필 카로테노이드계 색소임을 최종적으로 확인하였다.

실시예 2. 탄소원 종류에 따른 Erythrobacter sp. SDW2 균주의 균체생산 및 잔토필 카로테노이드 생산

상시 실시예 1-1에서 순수 분리된 SDW2 균주의 높은 균체량을 수득하기 위해 Marine broth를 기본배지로 하고, 각각 5 g/L의 글루코오스 (glucose), 프럭토즈 (fructose), 글리세롤 (glycerol), 수크로즈 (sucrose), 자일로즈 (xylose)이 포함된 50 ㎖의 marine broth를 준비하여 24시간 동안 배양된 SDW2 균체액을 1% (v/v)가 되도록 접종하여, 30℃, 200 rpm의 조건으로 48시간 동안 교반배양 하면서 600nm의 흡광도에서 SDW2 균주의 생장양상을 관찰하였다.

탄소원이 포함되지 않은 marine broth에서 배양된 SDW2는 48시간 동안 약 3.2 (Optical density at 600 nm wavelength, O.D₆₀₀)의 최종 균체량을 나타내었다. 글리세롤과 프럭토즈는 균체생장향상에 영향을 주지 않았으며, 글루코오스, 수크로즈, 자일로즈가 포함된 marine broth에서는 각각 7.4, 7, 6.4로 확인되었다. 따라서, SDW2 균주의 최대 균체생산을 위한 탄소원으로 글루코오스가 가장 적합함을 확인하였다(도 6a).

또한, 상기 과정에서 배양한 각각의 SDW2 균주를 원심분리를 통해 회수하고, 동결건조하여 수분을 모두 제거한 뒤 5 ㎖의 메탄올을 첨가하여 현탁하였다. 현탁액은 다시 원심분리와 여과를 통해 순수 추출물로 분리하고 HPLC를 통해 각각 탄소원을 첨가한 marine broth에서 배양된 SDW2 균주의 잔토필 카로테노이드 생산량을 측정하였다. 도 6b에 나타낸 바와 같이 최대 균체 생산량을 나타내었던 조건인 글루코오스가 포함된 marine broth에서 SDW2 균주는 약 263 mg/L, 균체량 g당 48.1 mg의 잔토필 카로테노이드를 생산하는 것으로 확인되었다.

이는 다른 탄소원이 포함된 조건보다 더 우수한 생산성을 보이며 특히, 탄소원이 포함되지 않은 배지보다 약 69.1% (mg/L 단위 기준)향상된 생산성을 나타내는 것으로 확인되었다. 탄소원 종류에 따른 SDW2 균주의 균체량 및 잔토필 카로테노이드 생산능을 표 2에 나타내었다.

탄소원 별 Erythrobacter sp. SDW2의 균체량 및 잔토필 카로테노이드 생산능

탄소원	균체량 (OD600)	잔토필 카로테노이드 생산량 (mg/L)	세포건중량당 잔토필 카로테노이드 생산량 (mg/g dcw)
marine broth only	3.2 ± 0.2	79.8 ± 2.1	48.1 ± 0.3
Glucose	7.4 ± 0.2	263 ± 12.9	89.7 ± 5.4
Glycerol	3.4 ±0.7	83.2 ± 0.3	47.2 ± 1.7
Fructose	4.4 ±0.7	122.3 ± 1.2	63.6 ± 2.8
Xylose	6.4 ±0.4	186.5 ± 2.2	68 ± 4.6
Sucrose	7.0 ±0.6	234.8 ± 22.1	80.7 ± 11.6

실험예 1. Erythrobacter sp. SDW2 균주로부터 생산된 신규 잔토필 카로테노이드의 항산화능 확인.

자유라디칼 (free radical)인 2,2-Diphenyl-1-picrylhydrazyl (DPPH)와 2,2'-azino-bis(3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid) (ABTS)를 이용하여 SDW2가 생합성하는 잔토필 카로테노이드의 항산화능을 확인하고, 상업적으로 활용되고 있는 다른 잔토필 카로테노이드들과 비교하였다.

구체적으로는 상기 실시예 2의 SDW2 균주의 잔토필 카로테노이드 생산 최적 배양조건에서 수득된 SDW2 균체로부터 메탄올을 이용하여 잔토필 카로테노이드를 추출한 뒤, 20 mg/L의 농도가 되도록 이를 정량하였다.

데이노잔틴은 데이노코쿠스 라디오두란스 DX균주 (Deinococcus radiodurans R1 야생형 균주에서 CrtB 및 DXS 유전자가 과발현하도록 제작된 균주, KR102160203)로부터 추출하여 표준품으로 사용하였다. 또 다른 잔토필 카로테노이드는 표준품을 사용하였으며, 그 종류는 아스타잔틴 (cayman, 미국), 푸코잔틴, 푸코잔티놀, 루테인 (Sigma, 미국)을 각각 20 mg/L 사용하였으며, 양성대조군으로 20 mg/L 농도의 아스코브산 (대정화금, 한국)을 사용하였다. DPPH (TCI,일본)용액은 최종농도 0.2 mM가 되도록 메탄올에 용해하여 제조하였고, ABTS (Sigma, USA)용액은 ABTS 분말을 7mM의 농도가 되도록 메탄올에 용해하고, 2.45 mM 과황산칼륨 용액 (potassium persulfate, 대정화금)과 1:1 비율로 혼합하여 상온에서 24시간 암반응하여 제조하였다.

SDW2 균주로부터 생합성된 잔토필 카로테노이드의 항산화능을 시험하기 위하여 100 ㎕의 각각의 자유라디칼(ABTS, DPPH)용액을 96 well titer plate에 분주하고, 미리 제조된 20 mg/L의 SDW2 균주 추출물 및 상기 다른 잔토필 카로테노이드들 각각 100 ㎕를 첨가한 뒤, 암조건 (dark condition)에서 30분간, 반응하고 이를 517nm 파장(DPPH)과 734nm 파장(ABTS)에서 각각의 흡광도를 측정하였다.

측정된 흡광도는 일련의 계산식[(Control_{A517nm (또는 A734nm)} - Sample_{A517 (또는 A734nm)}/Control_{A517nm (또는 A734nm)})X 100]을 통하여 DPPH 또는 ABTS 소거능 (%)을 계산하였다. 도 7 에 나타난 바와 같이 SDW2가 생산한 신규 잔토필 카로테노이드는 다른 잔토필계 카로테노이드들 보다 약 25.8% ~ 60.6% 더 우수한 항산화능을 가진 것으로 확인되었다.

농업생명공학연구원

KACC81198BP

20211209

<110> University of Seoul Industry Cooperation Foundation <120> MANUFACTURING METHOD OF ERYTHROBACTER SP. STRAIN SDW2 PRODUCING A NOVEL YELLOW XANTHOPHYLL CARPTENOID AND THE METHOD FOR XANTHOPHYLL CAROTENOID OVERPRODUCTION USING THIS STRAIN <130> 2021P-12-023 <160> 3 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 16s universial primer F <400> 1 agagtttgat cmtggctcag 20 <210> 2 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 16s universial primer R <400> 2 tacggytacc ttgttacgac tt 22 <210> 3 <211> 1347 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Erythrobacter sp. SDW2 <400> 3 tgctacacat gcagtcgaac gaagccttcg ggcttagtgg cgcacgggtg cgtaacgcgt 60 gggaacctgc ctttaggttc ggaataactc agagaaattt gagctaatac cggataatgt 120 cttcggacca aagatttatc gcctttagat gggcccgcgt aggattagct agttggtggg 180 gtaaaggcct accaaggcga cgatccttag ctggtctgag aggatgatca gccacactgg 240 gactgagaca cggcccagac tcctacggga ggcagcagtg gggaatattg gacaatgggc 300 gaaagcctga tccagcaatg ccgcgtgagt gatgaaggcc ttagggttgt aaagctcttt 360 taccagggat gataatgaca gtacctggag aataagctcc ggctaactcc gtgccagcag 420 ccgcggtaat acggagggag ctagcgttgt tcggaattac tgggcgtaaa gcgcacgtag 480 gcggcttttt aagtcagggg tgaaatcccg gggctcaacc ccggaactgc ccttgaaact 540 ggaaagctag aatactggag aggtgagtgg aattccgagt gtagaggtga aattcgtaga 600 tattcggaag aacaccagtg gcgaaggcga ctcactggac agttattgac gctgaggtgc 660 gaaagcgtgg ggagcaaaca ggattagata ccctggtagt ccacgccgta aacgatgata 720 actagctgtc cgggttcatg gaacttgggt ggcgcagcta acgcattaag ttatccgcct 780 ggggagtacg gtcgcaagat taaaactcaa aggaattgac gggggcctgc acaagcggtg 840 gagcatgtgg tttaattcga agcaacgcgc agaaccttac cagcctttga catcctagga 900 cgacttctgg agacagattt cttcccttcg gggacctagt gacaggtgct gcatggctgt 960 cgtcagctcg tgtcgtgaga tgttgggtta agtcccgcaa cgagcgcaac cctcgtcctt 1020 agttgccatc attaagttgg gcactttaag gaaactgccg gtgataatgg ggatgacgtc 1080 aagtcctcat ggcccttaca ggctgggcta cacacgtgct acaatggcaa ctacagtggg 1140 cagctatccc gcgagggtga gctaatctcc aaaagttgtc tcagttcgga ttgttctctg 1200 caactcgaga gcatgaaggc ggaatcgcta gtaatcgcgg atcagcatgc cgcggtgaat 1260 acgttcccag gccttgtaca caccgcccgt cacaccatgg gagttggatt cacccgaagg 1320 cagtgcgcta accgcaagga ggcagct 1347

Claims

95% 이상의 순도를 나타내는 잔토필 카로테노이드를 생산할 수 있고, 서열번호 3으로 기재되는 16s rRNA 염기서열을 가지는 것을 특징으로 하는, 수탁번호 KACC 81198BP로 기탁된 에리스로박터 종(Erythrobacter sp.) SDW2 균주.
삭제
제1항에 있어서,
상기 잔토필 카로테노이드는 95% 내지 100%의 순도로 수득되는 것을 특징으로 하는 에리스로박터 종 SDW2 균주.
제1항에 있어서,
상기 잔토필 카로테노이드는 항산화능을 나타내는 것을 특징으로 하는 에리스로박터 종 SDW2 균주.
1) 제주 연안에서 채취한 해수를 멸균수에 희석하여 희석액을 준비하는 단계;
2) Marine broth 및 Bacto agar를 정제수에 용해하여 Marine agar 배지를 제조하는 단계;
3) 상기 Marine agar 배지에 상기 단계 1)의 희석액을 도말하여 배양하는 단계; 및
4) 노란색을 띄는 콜로니를 분리하고 계대 배양하여 단일 콜로니를 얻는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는, 제1항에 따른 에리스로박터 종 SDW2 균주의 스크리닝 방법.
제1항의 에리스로박터 종 SDW2 균주의 단일 콜로니를 Marine broth에 교반하며 배양하는 단계;
상기 배양 후 원심분리하여 세포를 회수하여 동결건조하는 단계; 및
상기 동결건조 후 얻은 균체에 메탄올, 에탄올 및 이들의 혼합물 중 어느 하나의 용매를 첨가하여 추출하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는, 에리스로박터 종 SDW2 균주로부터 잔토필 카로테노이드를 포함하는 추출물을 제조하는 방법.
제1항의 에리스로박터 종 SDW2 균주의 단일 콜로니를 탄소원을 첨가한 Marine broth에 배양하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는, 잔토필 카로테노이드를 생산하는 에리스로박터 종 SDW2 균주의 대량 생산 방법.
제7항에 있어서,
상기 탄소원은 글루코오스 (glucose), 프럭토즈 (fructose), 글리세롤 (glycerol), 수크로즈 (sucrose), 자일로즈 (xylose) 중 어느 하나 이상을 포함하는 것을 특징으로 하는, 잔토필 카로테노이드를 생산하는 에리스로박터 종 SDW2 균주의 대량 생산 방법.
제6항의 잔토필 카로테노이드를 포함하는 추출물을 제조하는 방법에 의해 제조된 추출물을 포함하는 것을 특징으로 하는 항산화용 조성물.
제1항의 에리스로박터 종 SDW2 균주를 배양하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 잔토필 카로테노이드(xanthophyll carotenoid) 생산 방법.
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