KR102781599B1 - 새꼬막 원산지 판별용 단일 핵산염기 다형 마커 및 이의 용도 - Google Patents
새꼬막 원산지 판별용 단일 핵산염기 다형 마커 및 이의 용도 Download PDFInfo
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Abstract
본 발명은 새꼬막의 원산지 판별용 SNP 마커 및 이의 용도에 관한 것으로, 본 발명에서 개발한 새꼬막 원산지를 판별용 SNP 마커는 약 10 mg 정도의 소량의 조직 또는 이에 준하는 체액만 있으면 원산지 판별이 가능하여, 개체를 희생시키지 않고도 원산지 판별이 가능하므로, 빠른 시간 내에 경제적으로 새꼬막의 유통 과정에서 발생하는 원산지 표기 위반 등을 단속할 수 있을 뿐만 아니라 수산물 원산지 관리에 대한 국민의 신뢰도 상승 및 어가 소득 증대의 효과도 있다.
Description
본 발명은 새꼬막의 원산지 판별용 SNP 마커 및 이의 용도에 관한 것이다.
새꼬막 (Scapharca subcrenata)은 돌조개목 (Arcoida) 돌조개과 (Arcidae)에 속하는 패류로 한국의 남해와 서해, 중국, 일본, 서태평양 연안에 분포하며, 대륙 연안의 조간대부터 수심 10m 사이의 펄에 서식한다. 새꼬막은 고단백의 알칼리성 식품으로 비타민과 필수아미노산, 칼슘, 철분 등이 풍부하며, 식용으로 활용하기 위해 남해와 서해에서 양식으로 생산되는 경제적으로 중요한 수산 자원이다.
국내에서 새꼬막은 대한제국 말 이전부터 양식이 이루어졌다고 기록되어 있다. 하지만 본격적인 양식은 1960년대 순천만에서 자연 채묘 성공으로 종패 생산이 가능해진 이 후 본격적으로 이루어졌다. 새꼬막 양식은 주로 여자만 광양만 등에서 이루어졌디만, 1990년대 광양제철소 준공으로 광양만의 양식이 불가능해져 현재는 여자만에서 주로 생산되고 있다. 최근 새꼬막의 연도별 생산량을 보면 2016년부터 2019년까지 연간 생산량이 각각 4,993, 2,682, 4,967, 10,501톤으로 증가하였지만, 2020년과 2021년 연간 생산량이 각각 7,423, 5296톤으로 점차 감소하였다. 감소한 국내 새꼬막 생산량을 대체할 수요를 충족시키기 위해 새꼬막 수입량은 2019년 141톤에서 2021년 304톤으로 두 배가량 증가하였다. 새꼬막의 원산지 판별은 패각 표면의 색깔, 골의 개수 등 형태학적 구별 방법이 사용된다. 하지만 이런 형태학적인 구분법으로는 정확한 원산지 판별이 힘들고, 전문적인 지식이 필요하다. 또한 수입되는 새꼬막 중 일부는 현지에서 꼬막살로 가공되어 수입되며, 이러한 경우 패각의 형태에 따른 구별 방법으로 수입산을 구분할 수 없다. 또한, 수입산 수산물에 대한 우려와 안전한 수산물 먹거리에 대한 수요가 증가하고 있는 실정이며 일부 유통업자들이 수입산 새꼬막을 국내산으로 속여 유통하려는 사례가 발생하고 있다. 따라서 이를 방지하기 위해 검역과정에서 객관적인 새꼬막 원산지 판별 기법이 필요하며, 새꼬막 패각의 형태학적인 분류 방법 이외에 새로운 분석 방법이 필요하다. 수산물의 품종 판별 또는 집단 유전적 유연관계 분석에 있어서 DNA의 유전자 분석이 주로 사용된다. 대표적인 DNA 분석 방법에는 미토콘드리아 16S 또는 COI (cytochrome oxidase subunit I) 염기 서열 분석, single nucleotide polymorphism(SNP), 마이크로새틀라이트(Microsatellite, MS), restriction fragment length polymorphism(RFLP), allozyme, mitochondrial DNA, random amplified polymorphic DNA(RAPD), amplified fragment length polymorphism(AFLP) 등이 존재한다.
한편, SNP 마커는 1990년대부터 유전적 유연관계 분석에 사용된 분자 마커이다. SNP는 대립유전자의 DNA에서 특정 염기쌍이 서로 다른 염기로 차이를 보이는 유전적 변이를 의미한다. SNP는 1990년대부터 포유류, 식물 등을 포함하는 다양한 생물체를 대상으로 한 혈통, 집단 유전적 관계 분석, 개체식별을 위한 유전형(genotyping) 분석 기술 등으로 활용되고 있으며, 인간의 유전 질환 분석에도 사용된다.
본 발명의 목적은 새꼬막 원산지 판별용 SNP 마커 조성물을 제공하는 것이다.
또한, 본 발명의 목적은 새꼬막 원산지 판별용 조성물을 제공하는 것이다.
또한, 본 발명의 목적은 새꼬막 원산지 판별용 프라이머 세트를 제공하는 것이다.
또한, 본 발명의 목적은 새꼬막 원산지 판별용 키트를 제공하는 것이다.
또한, 본 발명의 목적은 새꼬막 원산지 판별용 마이크로어레이를 제공하는 것이다.
아울러, 본 발명의 목적은 새꼬막 원산지 판별 방법을 제공하는 것이다.
상기 과제를 해결하기 위하여, 본 발명은 새꼬막 원산지 판별용 SNP 마커 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은 새꼬막 원산지 판별용 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은 새꼬막 원산지 판별용 프라이머 세트를 제공한다.
또한, 본 발명은 새꼬막 원산지 판별용 키트를 제공한다.
또한, 본 발명은 새꼬막 원산지 판별용 마이크로어레이를 제공한다.
아울러, 본 발명은 새꼬막 원산지 판별 방법을 제공한다.
본 발명에서 개발한 새꼬막 원산지를 판별용 SNP 마커는 약 10 mg 정도의 소량의 조직 또는 이에 준하는 체액만 있으면 원산지 판별이 가능하여, 개체를 희생시키지 않고도 원산지 판별이 가능하므로, 빠른 시간 내에 경제적으로 새꼬막의 유통 과정에서 발생하는 원산지 표기 위반 등을 단속할 수 있을 뿐만 아니라 수산물 원산지 관리에 대한 국민의 신뢰도 상승 및 어가 소득 증대의 효과도 있다.
도 1은 본 발명의 SNP 마커 개발 과정 및 개발한 SNP 마커를 이용하여 한국산과 중국산 새꼬막을 판별하는 방법을 나타낸 모식도이다.
도 2는 GBS 데이터를 토대로 선정한 25개의 SNP 후보군에 대한 프라이머 세트를 이용하여 한국산 새꼬막 3 개체 및 중국산 새꼬막 3 개체의 유전체 DNA를 주형으로 하여 PCR을 수행한 결과를 나타낸 도이다.
도 3은 PCR로 분석한 Shell_SNP_I_001 SNP 부분을 포함하는 DNA 염기서열을 다중 정렬(multiple alignment)하여 분석한 결과 및 이를 실시간 qPCR로 검출하기 위한 프라이머 부착 위치를 나타낸 도이다.
도 4는 PCR로 분석한 Shell_SNP_021 SNP 부분을 포함하는 DNA 염기서열을 다중 정렬하여 분석한 결과 및 이를 실시간 qPCR로 검출하기 위한 프라이머 부착 위치를 나타낸 도이다.
도 5는 본 발명의 새꼬막 원산지 판별용 프라이머 세트들을 이용하여 실시간 PCR을 수행하기 위한 조건을 나타낸 S도이다.
도 6은 실시간 qPCR 반응 종료 후 산출된 한국산 및 중국산 새꼬막 DNA 시료에 대한 Ct 값을 분석 결과를 나타낸 도이다.
도 7은 본 발명의 새꼬막 원산지 판별용 프라이머 세트들의 원산지 분류 특이도를 나타낸 도이다.
도 2는 GBS 데이터를 토대로 선정한 25개의 SNP 후보군에 대한 프라이머 세트를 이용하여 한국산 새꼬막 3 개체 및 중국산 새꼬막 3 개체의 유전체 DNA를 주형으로 하여 PCR을 수행한 결과를 나타낸 도이다.
도 3은 PCR로 분석한 Shell_SNP_I_001 SNP 부분을 포함하는 DNA 염기서열을 다중 정렬(multiple alignment)하여 분석한 결과 및 이를 실시간 qPCR로 검출하기 위한 프라이머 부착 위치를 나타낸 도이다.
도 4는 PCR로 분석한 Shell_SNP_021 SNP 부분을 포함하는 DNA 염기서열을 다중 정렬하여 분석한 결과 및 이를 실시간 qPCR로 검출하기 위한 프라이머 부착 위치를 나타낸 도이다.
도 5는 본 발명의 새꼬막 원산지 판별용 프라이머 세트들을 이용하여 실시간 PCR을 수행하기 위한 조건을 나타낸 S도이다.
도 6은 실시간 qPCR 반응 종료 후 산출된 한국산 및 중국산 새꼬막 DNA 시료에 대한 Ct 값을 분석 결과를 나타낸 도이다.
도 7은 본 발명의 새꼬막 원산지 판별용 프라이머 세트들의 원산지 분류 특이도를 나타낸 도이다.
이하, 첨부된 도면을 참조하여 본 발명의 구현예로 본 발명을 상세히 설명하기로 한다. 다만, 하기 구현예는 본 발명에 대한 예시로 제시되는 것으로, 당업자에게 주지 저명한 기술 또는 구성에 대한 구체적인 설명이 본 발명의 요지를 불필요하게 흐릴 수 있다고 판단되는 경우에는 그 상세한 설명을 생략할 수 있고, 이에 의해 본 발명이 제한되지는 않는다. 본 발명은 후술하는 특허청구범위의 기재 및 그로부터 해석되는 균등 범주 내에서 다양한 변형 및 응용이 가능하다.
또한, 본 명세서에서 사용되는 용어(terminology)들은 본 발명의 바람직한 실시예를 적절히 표현하기 위해 사용된 용어들로서, 이는 사용자, 운용자의 의도 또는 본 발명이 속하는 분야의 관례 등에 따라 달라질 수 있다. 따라서, 본 용어들에 대한 정의는 본 명세서 전반에 걸친 내용을 토대로 내려져야 할 것이다. 명세서 전체에서, 어떤 부분이 어떤 구성요소를 "포함"한다고 할 때, 이는 특별히 반대되는 기재가 없는 한 다른 구성요소를 제외하는 것이 아니라 다른 구성 요소를 더 포함할 수 있는 것을 의미한다.
일 측면에서, 본 발명은 서열번호 1 및 2, 서열번호 3 및 2, 서열번호 4 및 5, 또는 서열번호 6 및 5의 염기서열을 포함하는 프라이머 세트를 포함하는 새꼬막 원산지 판별용 프라이머 세트에 관한 것이다.
일 구현예에서, 서열번호 1 및 2의 염기서열을 포함하는 프라이머 세트, 또는 서열번호 4 및 5의 염기서열을 포함하는 프라이머 세트는 SNP를 포함하는 전체 영역을 PCR하여 염기서열 분석을 통해 SNP의 존재를 확인하기 위한 프라이머 세트일 수 있다.
일 구현예에서, 서열번호 3 및 2의 염기서열을 포함하는 프라이머 세트, 또는 서열번호 6 및 5의 염기서열을 포함하는 프라이머 세트는 실시간 PCR 분석을 통해 SNP를 검출하기 위한 프라이머 세트일 수 있다.
일 구현예에서, 본 발명의 프라이머 세트는 새꼬막의 원산지 판별용 SNP 마커를 검출할 수 있다.
일 구현예에서, 원산지는 한국 또는 중국일 수 있다.
본 발명에서 사용된, 용어 "프라이머"는 짧은 자유 3말단 수산화기 (free 3 hydroxyl group)를 가지는 핵산 서열로 상보적인 주형(template)서열과 염기쌍 (base pair)를 형성할 수 있고 주형 가닥 복사를 위한 시작 지점으로 기능을 하는 짧은 핵산 서열로, 중합효소연쇄반응법(PCR)에서 이용되는 표적 핵산에 인접해 있는 5' 말단 서열 및 3' 말단 서열에 상보적인 단일가닥의 올리고뉴클레오티드를 의미한다. 또한, "정방향 프라이머(forward primer)" 및 "역방향 프라이머(reverse primer)"라는 용어는 중합 효소 연쇄 반응에 의해 증폭되는 주형의 일정한 부위의 3' 말단 및 5' 말단에 각각 결합하는 프라이머를 의미한다. 프라이머의 서열은 주형의 일부 서열과 완전하게 상보적인 서열을 가질 필요는 없으며, 주형과 혼성화 되어 프라이머 고유의 작용을 할 수 있는 범위 내에서의 충분한 상보성을 가지면 충분하다. 따라서, 일 구체예에 따른 프라이머 세트는 주형인 뉴클레오티드 서열에 완벽하게 상보적인 서열을 가질 필요는 없으며, 이 서열에 혼성화(hybridization)되어 프라이머 작용을 할 수 있는 범위 내에서 충분한 상보성을 가지면 충분한 것으로 해석된다.
본 발명의 프라이머는 포스포르아미다이트 고체 지지체 방법, 또는 기타 널리 공지된 방법을 사용하여 화학적으로 합성할 수 있다. 이러한 핵산 서열은 또한 당해 분야에 공지된 많은 수단을 이용하여 변형시킬 수 있다. 이러한 변형의 비-제한적인 예로는 메틸화, 캡화, 천연 뉴클레오타이드 하나 이상의 동족체로의 치환및 뉴클레오타이드 간의 변형, 예를 들면, 하전되지 않은 연결체 (예: 메틸 포스포네이트, 포스소트리에스테르, 포스포로아미데이트, 카바메이트 등) 또는 하전된 연결체 (예: 포스포로티오에이트, 포스포로디티오에이트 등)로의 변형이 있다.
본 발명에서 사용된, 용어 "단일염기다형성(SNP) 마커"는 유전학에서 유전적 유연관계 분석에 사용되는 분자마커로서 대립유전자의 DNA 상에 존재하는 한 쌍의 염기가 차이가 나는 것을 의미한다. SNP는 1990년대부터 포유류, 식물 등을 포함하는 다양한 생물체를 대상으로 한 혈통, 집단 유전적 관계 분석, 개체식별을 위한 유전형(genotyping) 분석 기술 등으로 활용되고 있으며, 인간의 유전 질환 분석에도 사용된다.
여기서, '다형성(polymorphism)'은 하나의 유전자 좌위(locus)에 두 가지 이상의 대립유전자(allele)가 존재하는 경우를 의미하며 다형성 부위 중에서, 개체에 따라 단일 염기만이 다른 것을 단일 염기 다형성이라 한다. 바람직한 다형성 마커는 선택된 집단에서 1% 이상, 더욱 바람직하게는 5% 또는 10% 이상의 발생빈도를 나타내는 두 가지 이상의 대립유전자를 가진다. '대립유전자'는 상동염색체의 동일한 유전자 좌위에 존재하는 한 유전자의 여러 타입을 의미한다. 대립유전자는 다형성을 나타내는데 사용되기도 하며, 예컨대, SNP는 두 종류의 대립인자(biallele)를 갖는다.
일 구현예에서, 본 발명의 프라이머는 형광물질로 표지될 수 있으며, Real time PCR 조건에 따라 프라이머의 서열을 제거하여 짧아지거나 프라이머 주변 서열을 포함하여 길어질 수 있으며, 프라이머 서열 바깥 부분의 염기서열로 새로 프라이머를 설계할 수 있다.
일 구현예에서, 본 발명의 서열번호 3 및 2의 프라이머 세트, 및 서열번호 6 및 5의 프라이머 세트는 Real time PCR 분석용일 수 있다.
일 측면에서, 본 발명은 본 발명의 새꼬막 원산지 판별용 프라이머 세트를 포함하는 새꼬막 원산지 판별용 마이크로어레이에 관한 것이다.
일 측면에서, 본 발명은 본 발명의 새꼬막 원산지 판별용 프라이머 세트를 포함하는 새꼬막 원산지 판별용 SNP 마커 조성물에 관한 것이다.
일 측면에서, 본 발명은 본 발명의 새꼬막 원산지 판별용 프라이머 세트를 포함하는 새꼬막 원산지 판별용 조성물에 관한 것이다.
일 측면에서, 본 발명은 본 발명의 새꼬막 원산지 판별용 프라이머 세트를 포함하는 새꼬막 원산지 판별용 키트에 관한 것이다.
일 구현예에서, 상기 키트는 PCR 키트, DNA 분석용 키트일 수 있다.
본 발명의 키트는 상기 조성물을 이용하여 본 발명에서 제공하는 SNP 마커의 유전자형을 증폭을 통해 확인할 수 있다. 본 발명에서 제공하는 상기 키트는 RT-PCR을 수행하기 위해 필요한 필수 요소를 포함하는 키트일 수 있다.
예를 들어, RT-PCR 키트는, 상기 SNP 마커가 포함된 부위를 포함하는 폴리뉴클레오티드 또는 이의 상보적인 폴리뉴클레오티드에 대한 특이적인 프라이머 쌍 이외에도 튜브 또는 다른 적절한 컨테이너, 반응 완충액(pH 및 마그네슘 농도는 다양), 데옥시뉴클레오티드(dNTPs), Taq-폴리머라제 및 역전사 효소와 같은 효소, DNase 억제제, RNase 억제제, DEPC-수(DEPC-water) 및 멸균수 등을 포함할 수 있다. 한편, 키트에 포함되는 성분들은 액상 형태로 제조될 수도 있고, 포함 성분들의 자유도를 낮추어 제품의 안정성을 제고하기 위해 건조된 형태로 제조될 수도 있다. 이러한 건조된 형태로의 제조를 위해서는 건조 단계의 적용이 필요하고, 이때 가온건조, 자연건조, 감압건조, 동결건조 또는 이들의 복합 공정이 사용될 수 있다.
본 발명에 있어서, PCR 증폭과정에 적용되는 경우, "키트"는 선택적으로, PCR 증폭에 필요한 시약, 예컨대, 완충액, DNA 중합효소(예컨대, Thermus aquaticus(Taq), Thermus thermophilus(Tth), Thermus filiformis, Thermisflavus, Thermococcus literalis 또는 Pyrococcus furiosus(Pfu)로부터 수득한 열 안정성 DNA 중합효소), DNA 중합 효소 조인자 및 dNTPs를 포함할 수 있다. 상기 키트는 상기한 시약 성분을 포함하는 다수의 별도 패키징 또는 컴파트먼트로 제작될 수 있다
일 측면에서, 본 발명은 새꼬막 개체에서 핵산 시료를 분리하는 단계; 본 발명의 새꼬막 원산지 판별용 프라이머 세트를 이용하여 실시간 PCR을 수행하는 단계; 및 Ct(threshold cycle) 값을 분석하는 단계를 포함하는 새꼬막 원산지 판별 방법에 관한 것이다.
일 구현예에서, 핵산 시료는 DNA일 수 있다.
일 구현예에서, Ct 값이 28 이하일 경우 한국산인 것으로 판별하는 단계를 추가로 포함할 수 있다.
일 구현예에서, Ct 값이 28 초과일 경우 중국산으로 판별하는 단계를 추가로 포함할 수 있다.
일 구현예에서, 서열번호 3 및 2의 프라이머 세트, 및 서열번호 6 및 5의 프라이머 세트를 이용할 수 있다.
본 발명에서 사용된, 용어 "개체"는 원산지를 확인하고자 하는 대상인 새꼬막(Scapharca subcrenata.)를 의미하며, 상기 새꼬막으로부터 얻어진 검체를 이용하여 상기 SNP 마커의 유전자형을 분석함으로써 상기 새꼬막의 원산지를 판단할 수 있다. 상기 검체로는 새꼬막으로부터 분리된 조직, 또는 분리된 세포와 같은 시료 등이 될 수 있으나, 이에 특별히 제한되지는 않는다.
하기의 실시예를 통하여 본 발명을 보다 상세하게 설명한다. 그러나 하기 실시예는 본 발명의 내용을 구체화하기 위한 것일 뿐 이에 의해 본 발명이 한정되는 것은 아니다.
실시예 1. 시료 확보 및 유전체 DNA 분리
원산지 판별을 위한 유전형(genotyping) 분석에 쓰인 국내산 새꼬막 90 개체는 국내의 어시장에서 구입하였으며 중국산 새꼬막 90 개체는 수산물 전문 수입업체를 통해 구입하였다. 새꼬막의 각 개체별 근육 조직을 약 0.3cm로 절단하고, AccuPrep® Genomic DNA Extraction 키트 (Bioneer, Korea)를 이용하여 이로부터 유전체 DNA(genomic DNA)를 정제한 뒤, 이를 희석하여 10ng/μl의 농도로 일정하게 조정하였다.
실시예 2. 새꼬막 원산지에 따라 구분되는 SNP 선별
새로운 SNP 마커 후보군을 확보하기 위해서 한국산/중국산 새꼬막 180 개체 (한국산 새꼬막 90 개체 및 중국산 새꼬막 90 개체)를 GBS(Genotyping by sequencing) 라이브러리 구축을 통해 분석하였다. GBS 리드(reads)로부터 얻은 데이터베이스에서 1432개의 SNP 염기서열을 확보하였으며 이 가운데 한국산 및 중국산 새꼬막 판별을 위한 25개의 후보 SNP를 선발한 뒤, 이를 검출하기 위한 프라이머를 설계하였다 (표 1). 한국산 새꼬막 3 개체 및 중국산 새꼬막 3 개체로부터 유전체 DNA를 분리한 뒤, 이를 주형으로 이용하여 설계한 프라이머로 하기 표 2 및 표 3의 조건으로 PCR을 수행하고 그 산물을 아가로즈 젤 전기영동 방법으로 확인하였다 (도 2). PCR로 분석한 SNP 부분을 포함하는 DNA 염기서열을 다중 정렬(multiple alignment)한 뒤, GBS 데이터 상에서 확보한 SNP 후보 영역에서 변화(variation)를 확인하였다.
| 서열번호 | Oligo NAME | SEQUENCE (5' --> 3') | 비고 |
| 1 | Shell_SNP_I_001_F | TGCGTGAATGCATTGGGATG | 새꼬막 SNP 분석용 |
| 2 | Shell_SNP_I_001_R | CGGATATGGAGAACGAGGCT | 새꼬막 SNP 분석용, real time PCR용 |
| 3 | KRS001_F | GCAGAATGCTTACAGAAAGAC | real time PCR용 |
| 4 | Shell_SNP_021_F | CAACGCTTGTCAGCCTTGTC | 새꼬막 SNP 분석용 |
| 5 | Shell_SNP_021_R | ACGTAACTGAGAACATGGCGT | 새꼬막 SNP 분석용, real time PCR용 |
| 6 | KRS211_F | AGAACTGCTTCAGAAATTAGTTTG | real time PCR용 |
| 성 분 | 최종 농도(well) | 1회 분량(μL) |
| AccuPower® PCR Premix (2X) | 10 | |
| Forward primer | 10 pmol | 1 |
| Reverse primer | 10 pmol | 1 |
| Template DNA (10 ng/μL) | 1 ∼ 10 ng | 1 |
| Distilled water | 반응 총액이 20 μL가 되도록 첨가 | 17 |
| 전 체 량 | 20 | |
| 초기 변성 (온도/시간) |
변성 (온도/시간) |
결합 (온도/시간) |
신장 (온도/시간) |
최종 신장 (온도/시간) |
| 94℃/5분 | 94℃/30초 | 60℃/30초 | 72℃/1분 | 72℃/7분 |
| 35 Cycles | ||||
그 결과, 25개의 SNP들 중 새꼬막의 원산지에 따라 구분되는 SNP 마커는 Shell_SNP_I_001 및 Shell_SNP_021로 나타났으며, 서열번호 1의 Shell_SNP_I_001_F 및 서열번호 2의 Shell_SNP_I_001_R 프라이머 세트, 및 서열번호 4의 Shell_SNP_021_F 및 서열번호 5의 Shell_SNP_021_R 프라이머 세트로 각각 PCR을 수행한 각각의 PCR 산물을 Shell_SNP_I_001_F 및 Shell_SNP_021_F 프라이머를 이용하여 분석하여 생어 시퀸싱 분석을 수행하였다 (도 3 및 4).
실시예 3, 새꼬막 원산지 판별용 SNP의 검증
3-1. 실시간 qPCR 분석
상기 실시예 2에서 선정한 2개의 SNP 마커를 이용하여 실시간(Real time) qPCR 분석을 수행하였다. 이를 위해, 상기 실시예 2에서 선정한 2개의 SNP 영역을 포함하는 SNP 부위에 특이적인 프라이머 (Shell_SNP_I_001: KRS001_F 및 Shell_SNP_I_001_R; 및 Shell_SNP_021: KRS211_F 및 Shell_SNP_021_R)를 제작하고 (표 1), AccuPower 2X GreenStar qPCR Master Mix (Bioneer)를 이용하여 하기 표 4의 조성 및 도 5의 반응 조건으로 실시간 qPCR을 수행하였다. 이 때, Real-time qPCR 기기는 QuantStudio 6 Flex Real-Time PCR System (Applied biosystems)를 이용하였으며, 하나의 프라이머 세트에 대해 동일한 실시간 qPCR 반응액을 제조하여 3회 반복하여 분석을 수행하였다.
| 성 분 | 최종 농도(well) | 1회 분량(μL) |
| qPCR master mix (2X) | 10 | |
| Forward primer | 10 pmol | 1 |
| Reverse primer | 10 pmol | 1 |
| Template DNA (10 ng/μL) | 1 | |
| Distilled water | 반응 총액이 20 μL가 되도록 첨가 | 7 |
| 전 체 량 | 20 | |
3-2. Ct 값 분석 및 원산지 판별
상기 실시예 3-1의 실시간 qPCR 분석 결과를 이용하여 원산지 집단 사이의 증폭 양상을 분석하기 위해, 실시간 qPCR 반응 종료 후 산출된 한국산 및 중국산 새꼬막 DNA 시료에 대한 Ct 값을 분석하였다.
Ct 값 분석 결과, Shell_SNP_I_001 마커에서 한국산 새꼬막 시료는 Ct 값이 주로 24 내지 27로 나타났으며, 중국산 새꼬막의 경우 Ct 값이 32 내지 34 사이로 확인되었다 (도 6). 또한, Shell_SNP_021 마커에서 한국산 새꼬막 시료는 Ct 값이 주로 22 내지 26로 나타났으며, 중국산 새꼬막의 경우 Ct 값이 32 내지 35로 확인되었다 (도 6).
따라서, 상기의 분석 결과를 토대로 Shell_SNP_I_001 마커의 실시간 qPCR Ct 값 28을 한국산과 중국산의 판별 기준으로 설정하였으며, Shell_SNP_021 마커의 실시간 qPCR Ct 값 28을 한국산과 중국산의 판별 기준으로 설정하였다.
3-3. SNP 마커 모델 평가도 분석
상기 실시예 3-2에서 도출한 결과를 바탕으로, 한국산 40 개체 및 중국산 40 개체의 시료에 대해 Shell_SNP_I_001 마커를 평가한 결과, 한국산 시료 40 개체 중 22 개체를 한국산으로 판별하였으며, 중국산으로 판별되는 시료가 18 개체인 것으로 분석되었다. 중국산 새꼬막 시료의 경우 40 개체 모두 중국산으로 분석되었다. 따라서, Shell_SNP_I_001 마커의 모델 평가도에서 정확도는 77.5%, 민감도는 55% 및 특이도는 100%인 것으로 나타났다 (도 7). 또한, Shell_SNP_021 마커를 평가한 결과 한국산 시료 40 개체 중 35 개체에 대해서 한국산으로 판별하였으며, 중국산으로 판별되는 시료는 5 개체로 나타났다. 중국산 새꼬막 시료의 경우 40 개체 중에서 35 개체가 중국산으로 분석되었으며 5 개체가 한국산으로 분석되었다. 따라서, Shell_SNP_021 마커의 모델 평가도에서 정확도는 87.5%, 민감도는 87.5% 및 특이도는 87.5%인 것으로 나타났다 (도 7).
상기의 실시예의 새꼬막 시료 확보 및 유전체 DNA 분리, 새꼬막 원산지에 따라 구분되는 SNP 서열 선정, 선정된 2개의 SNP 마커를 이용한 Real time PCR 분석, 원산지 집단 사이의 증폭 양상 분석, 및 Real time PCR 결과에서 새꼬막 시료의 Ct 값 분석을 통한 한국산 및 중국산 새꼬막의 원산지 판별 결과를 통해 (도 1), 본 발명의 2개의 SNP 마커를 단독 또는 조합하여 사용하면 한국산 및 중국산 새꼬막을 효과적으로 판별할 수 있음을 확인하였다.
서열목록 전자파일 첨부
Claims (6)
- 서열번호 1 및 2, 서열번호 3 및 2, 서열번호 4 및 5, 또는 서열번호 6 및 5의 염기서열을 포함하는 프라이머 세트를 포함하는 새꼬막 원산지 판별용 프라이머 세트.
- 제 1항에 있어서, 원산지는 한국 또는 중국인, 새꼬막 원산지 판별용 프라이머 세트.
- 제 1항의 새꼬막 원산지 판별용 프라이머 세트를 포함하는 새꼬막 원산지 판별용 키트.
- (a) 새꼬막 개체에서 핵산 시료를 분리하는 단계;
(b) 제 1항의 새꼬막 원산지 판별용 프라이머 세트를 이용하여 실시간 PCR을 수행하는 단계; 및
(c) Ct(threshold cycle) 값을 분석하는 단계를 포함하는 새꼬막 원산지 판별 방법. - 제 4항에 있어서, Ct 값이 28 이하일 경우 한국산인 것으로 판별하는 단계를 추가로 포함하는, 새꼬막 원산지 판별 방법.
- 제 4항에 있어서, Ct 값이 28 초과일 경우 중국산으로 판별하는 단계를 추가로 포함하는, 새꼬막 원산지 판별 방법.
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| KIM, S.-Y. 등, Korean J. Malacol., 2009, 25권, 1호, 페이지 5-13 |
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| YOON, J.-M., Development& Reproduction, 2021, 25권, 4호, 페이지 305-311 |
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Legal Events
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Comment text: Registration of Establishment Patent event date: 20250311 Patent event code: PR07011E01D |
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| PG1601 | Publication of registration |