KR102786057B1

KR102786057B1 - 오토파지 활성을 유도하는 비파나무 잎 추출물을 유효성분으로 포함하는 피부 개선용 조성물

Info

Publication number: KR102786057B1
Application number: KR1020220120707A
Authority: KR
Inventors: 이상한; 김지홍; 송보림
Original assignee: 경북대학교 산학협력단
Priority date: 2022-09-23
Filing date: 2022-09-23
Publication date: 2025-03-24
Anticipated expiration: 2042-09-23
Also published as: KR20240041558A; WO2024063587A1

Abstract

본 발명은 오토파지 활성을 유도하는 비파나무 잎 추출물을 유효성분으로 포함하는 피부 개선용 조성물에 관한 것으로, 주름 개선, 피부 장벽 강화, 보습, 피부 자극 완화 효과가 있어 화장료 조성물, 건강기능식품 조성물로 사용할 수 있다.

Description

오토파지 활성을 유도하는 비파나무 잎 추출물을 유효성분으로 포함하는 피부 개선용 조성물{Composition for improving skin with Eriobotrya japonica (Thunb.) Lindl extract to induce autophagy activity}

본 발명은 오토파지 활성을 유도하는 비파나무 잎 추출물을 유효성분으로 포함하는 피부 개선용 조성물에 관한 것이다.

표피, 진피 및 피하조직으로 구성되는 신체의 가장 큰 기관인 피부는 외부 환경 스트레스로부터 신체를 보호하는 신체의 1차 방어선 역할을 하므로, 피부의 기능을 유지하는 것은 필수적이다. 피부 노화는 크게 내인성 노화(Intrinsic aging)와 외인성 노화(Extrinsic aging)로 분류할 수 있다. 내인성 노화는 유전적 요인과 시간의 흐름에 따라 발생하는 반면, 외인성 노화는 자외선 등의 외부 환경적 요소에 의해 발생한다.

자외선은 파장에 따라 UVA(320~400 nm), UVB(280~320 nm), UVC(200~280 nm)로 분류되는데, 특히 UVB는 피부에 침투하여 광노화, 광독성 반응, 홍반 등을 유발하며, 활성산소종의 생성을 유발한다. 또한 과도한 활성산소종은 MAPK(mitogen-activated protein kinase) 신호 전달 캐스케이드를 활성화하여 NF-κB 및 AP-1 활성화에 기여한다. 그런 다음, 콜라겐, 엘라스틴, 히알루로산과 같은 세포 외 기질의 분해를 유도하는 MMP의 발현을 증가시켜 피부 노화를 가속화한다. UVB에 의해 유도된 광노화는 깊은 주름, 경표피수분손실, 건조, 피부 탄력 감소 등의 증상을 유발한다.

한편, 본 발명은 비파나무 잎 추출물의 주름 개선, 피부 장벽 강화, 피부 보습, 피부 자극 완화 효과를 확인하여 이를 활용한 화장료 조성물, 건강기능식품 조성물을 제공한다.

KR

10-1413105

B1

본 발명은 오토파지 활성을 유도하는 비파나무 잎 추출물을 이용하여 자외선에 의해 손상되는 피부를 개선할 수 있는 화장료 조성물, 건강기능식품 조성물을 제공하고자 한다.

본 발명은 비파나무 잎 추출물을 유효성분으로 포함하는 주름 개선용 화장료 조성물을 제공한다.

본 발명에 있어서, 상기 비파나무 잎 추출물은, 바람직하게는 95~100%(v/v) 에탄올을 추출용매로 하여, 60~65℃에서 2~3시간 추출한 것이 좋다.

본 발명에 있어서, 상기 비파나무 잎 추출물은, 바람직하게는 엘라스타아제(elastase) 활성을 억제하는 것이 좋다.

본 발명에 있어서, 상기 비파나무 잎 추출물은, 바람직하게는 자외선에 의한 피부 세포 손상을 보호하는 것이 좋다.

본 발명에 있어서, 상기 비파나무 잎 추출물은, 바람직하게는 자외선에 의한 활성산소종 생성을 억제하는 것이 좋다.

본 발명에 있어서, 상기 비파나무 잎 추출물은, 바람직하게는 자외선에 의해 발현 증가된 MMP-1의 발현을 감소시키는 것이 좋다.

본 발명에 있어서, 상기 비파나무 잎 추출물은, 바람직하게는 자외선에 의해 발현 감소된 TIMP-1, SIRT1, COL1A1, ELN 또는 HAS2 중 어느 하나 이상을 발현 증가시키는 것이 좋다.

본 발명에 있어서, 상기 비파나무 잎 추출물은, 바람직하게는 자외선에 의해 증가된 MAPKs/AP-1/NF-κB의 인산화를 감소시키는 것이 좋다.

본 발명에 있어서, 상기 비파나무 잎 추출물은, 바람직하게는 자외선에 의해 유발되는 주름, 홍반, 각질화 증상을 개선하는 것이 좋다.

본 발명에 있어서, 상기 비파나무 잎 추출물은, 바람직하게는 자외선에 의해 증가된 피부 두께를 감소시키는 것이 좋다.

본 발명에 있어서, 상기 비파나무 잎 추출물은, 바람직하게는 자외선에 의해 감소한 진피 내 콜라겐 섬유 밀도를 증가시키는 것이 좋다.

또한, 본 발명은 비파나무 잎 추출물을 유효성분으로 포함하는 피부 장벽 강화용 화장료 조성물을 제공한다.

본 발명에 있어서, 상기 비파나무 잎 추출물은, 바람직하게는 자외선에 의해 증가한 경피수분손실량을 감소시키는 것이 좋다.

본 발명에 있어서, 상기 비파나무 잎 추출물은, 바람직하게는 자외선에 의해 감소한 Cldn-1, FLG 또는 LASS3 중 선택되는 어느 하나 이상의 발현을 증가시키는 것이 좋다.

또한, 본 발명은 비파나무 잎 추출물을 유효성분으로 포함하는 보습용 화장료 조성물을 제공한다.

또한, 본 발명은 비파나무 잎 추출물을 유효성분으로 포함하는 피부 자극 완화용 화장료 조성물을 제공한다.

본 발명에 있어서, 상기 비파나무 잎 추출물은, 바람직하게는 자외선에 의해 증가한 TNF-α, IL-6 또는 IL-1β 중 선택되는 어느 하나 이상의 발현을 감소하는 것이 좋다.

또한, 본 발명은 비파나무 잎 추출물을 유효성분으로 포함하는 주름 개선용 건강기능식품 조성물을 제공한다.

또한, 본 발명은 비파나무 잎 추출물을 유효성분으로 포함하는 피부 장벽 강화용 건강기능식품 조성물을 제공한다.

또한, 본 발명은 비파나무 잎 추출물을 유효성분으로 포함하는 보습용 건강기능식품 조성물을 제공한다.

또한, 본 발명은 비파나무 잎 추출물을 유효성분으로 포함하는 피부 자극 완화용 건강기능식품 조성물을 제공한다.

본 발명은 오토파지 활성을 유도하는 비파나무 잎 추출물을 유효성분으로 포함함에 따라 주름 개선, 피부 장벽 강화, 보습, 피부 자극 완화 효과가 있는 피부 개선용 조성물을 제공한다.

도 1은 본 발명의 일 실시예에 있어서, 비파나무 잎 추출물의 세포독성 평가 실험 결과를 나타낸 것으로, 도 1a는 피부각질세포(HaCaT)에 대한 세포독성 평가 결과를 나타낸 도이고, 도 1b는 진피섬유아세포(HDF)에 대한 세포독성 평가 결과를 나타낸 도이다.
도 2는 본 발명의 일 실시예에 있어서, 비파나무 잎 추출물의 엘라스타아제(elastase) 활성 억제 효과를 나타낸 도이다.
도 3은 본 발명의 일 실시예에 있어서, 비파나무 잎 추출물의 피부각질세포(HaCaT)에서 자외선에 의한 피부 세포 손상 보호 효과를 나타낸 것으로, 도 3a는 UVB 처리에 따른 세포 독성 평가 결과를 나타낸 도이고, 도 3b는 UVB 및 비파나무 잎 추출물 처리에 따른 세포 독성 평가 결과를 나타낸 도이다.
도 4는 본 발명의 일 실시예에 있어서, 비파나무 잎 추출물의 진피섬유아세포(HDF)에서 자외선에 의한 피부 세포 손상 보호 효과를 나타낸 것으로, 도 4a는 UVB 처리에 따른 세포 독성 평가 결과를 나타낸 도이고, 도 4b는 UVB 및 비파나무 잎 추출물 처리에 따른 세포 독성 평가 결과를 나타낸 도이다.
도 5는 본 발명의 일 실시예에 있어서, 비파나무 잎 추출물의 자외선에 의한 활성산소종 생성 억제 효과를 나타낸 것으로, 도 5a는 피부각질세포(HaCaT)에서 활성산소종 생성 억제 효과를 나타낸 도이고, 도 5b는 진피섬유아세포(HDF)에서 활성산소종 생성 억제 효과를 나타낸 도이다.
도 6은 본 발명의 일 실시예에 있어서, 비파나무 잎 추출물이 항산화 인자 발현에 미치는 영향을 확인한 도이다.
도 7은 본 발명의 일 실시예에 있어서, 비파나무 잎 추출물의 Nrf2/HO-1 경로 활성에 미치는 영향을 확인한 도이다.
도 8은 본 발명의 일 실시예에 있어서, 비파나무 잎 추출물의 자외선에 의한 피부 노화 관련 인자 발현에 미치는 영향을 확인한 것으로, 도 8a는 피부각질세포(HaCaT)에 대한 실험 결과를 나타낸 도이고, 도 8b는 진피섬유아세포(HDF)에 대한 실험 결과를 나타낸 도이다.
도 9는 본 발명의 일 실시예에 있어서, 비파나무 잎 추출물이 MAPKs/AP-1/NF-κB의 인산화에 미치는 영향을 확인한 도이다.
도 10은 본 발명의 일 실시예에 있어서, 비파나무 잎 추출물이 MAPKs/AP-1/NF-κB 신호전달 경로에 미치는 영향을 확인한 도이다.
도 11은 본 발명의 일 실시예에 있어서, 마우스 모델에서, 비파나무 잎 추출물이 자외선에 의한 주름, 홍반, 각질화를 개선하는 효과를 확인한 도이다.
도 12는 본 발명의 일 실시예에 있어서, 마우스 모델에서, 비파나무 잎 추출물이 자외선에 의해 증가한 피부 두께를 감소시키는 효과를 확인한 도이다.
도 13은 본 발명의 일 실시예에 있어서, 마우스 모델에서, 비파나무 잎 추출물이 자외선에 의해 증가한 표피 두께를 감소시키는 효과를 확인한 도이다.
도 14는 본 발명의 일 실시예에 있어서, 마우스 모델에서, 비파나무 잎 추출물이 자외선에 의해 감소한 진피 내 콜라겐 섬유 밀도를 증가시키는 효과를 확인한 도이다.
도 15는 본 발명의 일 실시예에 있어서, 마우스 모델에서, 비파나무 잎 추출물이 자외선에 의해 증가한 경피수분손실량을 감소시키는 효과를 확인한 도이다.
도 16은 본 발명의 일 실시예에 있어서, 마우스 모델에서, 비파나무 잎 추출물이 피부 장벽기능 관련 단백질 발현에 미치는 영향을 확인한 도이다.
도 17은 본 발명의 일 실시예에 있어서, 마우스 모델에서, 비파나무 잎 추출물이 염증성 사이토카인 발현에 미치는 영향을 확인한 도이다.
도 18은 본 발명의 일 실시예에 있어서, 마우스 모델에서, 비파나무 잎 추출물이 노화 관련 단백질 발현에 미치는 영향을 확인한 도이다.
도 19는 본 발명의 일 실시예에 있어서, 마우스 모델에서, 비파나무 잎 추출물이 항산화 관련 단백질 발현에 미치는 영향을 확인한 도이다.
도 20은 본 발명의 일 실시예에 있어서, 마우스 모델에서, 비파나무 잎 추출물이 MAPKs/AP-1/NF-κB의 인산화에 미치는 영향을 확인한 도이다.
도 21은 본 발명의 일 실시예에 있어서, 비파나무 잎 추출물의 최적조건 도출을 위한 반응표면분석을 수행한 결과를 3차원으로 확인한 도이다.
도 22는 본 발명의 일 실시예에 있어서 비파나무 잎 추출물의 오토파지 관련 단백질 발현을 확인한 도이다(T:비파나무 잎 추출물 150 mg/kg 도포군, O:비파나무 잎 추출물 150 mg/kg/day 경구 투여군).

본 발명은 비파나무 잎 추출물을 유효성분으로 포함하는 피부 개선용 조성물에 관한 것이다.

비파나무(Eriobotrya japonica (Thunb.) Lindl)는 중국 남동부를 원산지로 하며, 스페인, 포르투갈, 일본, 한국 등에서 재배된다. 비파나무는 관상용으로 기르는 상록 작은키나무로, 어린 가지에 갈색 털이 있고, 꽃은 10~12월에 흰색으로 피며, 열매는 노란색이다.

본 발명의 비파나무 잎 추출물은, 바람직하게는 95~100%(v/v) 에탄올을 추출용매로 하여, 60~65℃에서 2~3시간 추출한 것이 좋다.

본 발명은 비파나무 잎 추출물을 유효성분으로 포함하는 주름 개선용 화장료 조성물 또는 건강기능식품 조성물을 제공한다.

또한, 본 발명은 비파나무 잎 추출물을 유효성분으로 포함하는 피부 장벽 강화용 화장료 조성물 또는 건강기능식품 조성물을 제공한다.

또한, 본 발명은 비파나무 잎 추출물을 유효성분으로 포함하는 보습용 화장료 조성물 또는 건강기능식품 조성물을 제공한다.

또한, 본 발명은 비파나무 잎 추출물을 유효성분으로 포함하는 피부 자극 완화용화장료 조성물 또는 건강기능식품 조성물을 제공한다.

본 발명에 있어서, 상기 비파나무 잎 추출물은, 당업계에 공지된 추출 및 분리방법을 사용하여 천연으로부터 추출 및 분리하여 수득한 것을 사용할 수 있으며, 본 발명에서 정의된 "추출물"은 적절한 용매를 이용하여 비파나무(Eriobotrya japonica (Thunb.) Lindl)의 잎으로부터 추출한 것이며, 예를 들어, 조추출물, 극성용매 가용 추출물 또는 비극성용매 가용 추출물을 모두 포함한다. 상기 비파나무(Eriobotrya japonica (Thunb.) Lindl)의 잎으로부터 추출물을 추출하기 위한 적절한 용매로는 식품학 또는 약학적으로 허용되는 유기용매라면 어느 것을 사용해도 무방하며, 물 또는 유기용매를 사용할 수 있으며, 이에 제한되지는 않으나, 예를 들어, 정제수, 메탄올(Methanol), 에탄올(Ethanol), 프로판올(Propanol), 이소프로판올(Isopropanol), 부탄올(Butanol) 등을 포함하는 탄소수 1 내지 4의 알콜, 아세톤(Acetone), 에테르(Ether), 벤젠(Benzene), 클로로포름(Chloroform), 에틸아세테이트(Ethyl acetate), 메틸렌클로라이드(Methylene chloride), 헥산(Hexane) 및 시클로헥산 (Cyclohexane) 등의 각종 용매를 단독으로 혹은 혼합하여 사용할 수 있다. 추출 방법으로는 열수추출법, 냉침추출법, 환류냉각추출법, 용매추출법, 수증기증류법, 초음파추출법, 용출법, 압착법 등의 방법 중 어느 하나를 선택하여 사용할 수 있다. 또한, 목적하는 추출물은 추가로 통상의 분획 공정을 수행할 수도 있으며, 통상의 정제 방법을 이용하여 정제될 수도 있다.

본 발명의 추출물의 제조방법에는 제한이 없으며, 공지되어 있는 어떠한 방법도 이용될 수 있다. 예를 들면, 본 발명의 조성물에 포함되는 추출물은 상기한 열수 추출 또는 용매 추출법으로 추출된 1차 추출물을, 감압 증류 및 동결 건조 또는 분무 건조 등과 같은 추가적인 과정에 의해 분말상태로 제조할 수 있다. 또한 상기 1차 추출물을 실리카겔 컬럼 크로마토그래피(Silica gel column chromatography), 박층 크로마토그래피(Thin layer chromatography), 고성능 액체 크로마토그래피(High performance liquid chromatography) 등과 같은 다양한 크로마토그래피를 이용하여 추가로 정제된 분획을 얻을 수도 있다. 따라서, 본 발명에 있어서 추출물은 추출, 분획 또는 정제의 각 단계에서 얻어지는 모든 추출액, 분획 및 정제물, 그들의 희석액, 농축액 또는 건조물을 모두 포함하는 개념이다.

본 발명의 “화장료 조성물”은 상술한 본 발명의 비파나무(Eriobotrya japonica (Thunb.) Lindl)의 잎에서 추출한 추출물의 화장품학적 유효량(Cosmetically effective amount) 및 화장품학적으로 허용되는 담체를 포함하여 제조할 수 있다.

본 명세서에서 “화장품학적 유효량”은 상술한 본 발명의 피부 개선 효과를 달성하는 데 충분한 양을 의미한다.

화장료 조성물의 외형은 화장품학 또는 피부과학적으로 허용 가능한 매질 또는 기제를 함유한다. 이는 국소적용에 적합한 모든 제형으로, 예를 들면, 용액, 겔, 고체, 반죽 무수 생성물, 수상에 유상을 분산시켜 얻은 에멀젼, 현탁액, 마이크로에멀젼, 마이크로캡슐, 미세과립구 또는, 이온형(리포좀) 및 비이온형의 소낭 분산제의 형태로, 또는 크림, 스킨, 로션, 파우더, 연고, 스프레이 또는 콘실 스틱의 형태로 제공될 수 있다. 이들 조성물은 당해 분야의 통상적인 방법에 따라 제조될 수 있다. 본 발명에 따른 조성물은 또한 포말(Foam)의 형태로 또는 압축된 추진제를 더 함유한 에어로졸 조성물의 형태로도 사용될 수 있다.

본 발명의 일 실시예에 따른 상기 화장료 조성물은 그 제형에 있어서 특별히 한정되는 바가 없으며, 예를 들면, 유연화장수, 수렴화장수, 영양화장수, 영양크림, 마사지크림, 에센스, 아이크림, 아이에센스, 클렌징크림, 클렌징폼, 클렌징워터, 팩, 파우더, 바디로션, 바디크림, 바디오일 및 바디에센스 등의 화장품으로 제형화될 수 있다.

본 발명의 화장료 조성물의 제형이 페이스트, 크림 또는 겔인 경우에는 담체 성분으로서 동물섬유, 식물섬유, 왁스, 파라핀, 전분, 트라칸트, 셀룰로오스 유도체, 폴리에틸렌 글리콜, 실리콘, 벤토나이트, 실리카, 탈크 또는 산화아연 등이 이용될 수 있다.

본 발명의 화장료 조성물의 제형이 파우더 또는 스프레이인 경우에는 담체 성분으로서 락토스, 탈크, 실리카, 알루미늄히드록시드, 칼슘 실리케이트 또는 폴리아미드 파우더가 이용될 수 있고, 특히 스프레이인 경우에는 추가적으로 클로로플루오로히드로카본, 프로판/부탄 또는 디메틸 에테르와 같은 추진체를 포함할 수 있다.

본 발명의 화장료 조성물의 제형이 용액 또는 유탁액의 경우에는 담체 성분으로서 용매, 용매화제 또는 유탁화제가 이용되고, 예컨대 물, 에탄올, 이소프로판올, 에틸 카보네이트, 에틸 아세테이트, 벤질 알콜, 벤질 벤조에이트, 프로필렌글리콜, 1,3-부틸글리콜 오일, 글리세롤 지방족 에스테르, 폴리에틸렌 글리콜 또는 소르비탄의 지방산 에스테르가 있다.

본 발명의 화장료 조성물의 제형이 현탁액인 경우에는 담체 성분으로서 물, 에탄올 또는 프로필렌 글리콜과 같은 액상 희석제, 에톡실화 이소스테아릴 알콜, 폴리옥시에틸렌 소르비톨 에스테르 및 폴리옥시에틸렌 소르비탄 에스테르와 같은 현탁제, 미소결정성 셀룰로오스, 알루미늄 메타히드록시드, 벤토나이트, 아가 또는 트라칸트 등이 이용될 수 있다.

본 발명의 화장료 조성물의 제형이 계면-활성제 함유 클린징인 경우에는 담체 성분으로서 지방족 알콜 설페이트, 지방족 알콜 에테르 설페이트, 설포숙신산 모노에스테르, 이세티오네이트, 이미다졸리늄 유도체, 메틸타우레이트, 사르코시네이트, 지방산 아미드 에테르 설페이트, 알킬아미도베타인, 지방족 알콜, 지방산 글리세리드, 지방산 디에탄올아미드, 식물성 유, 리놀린 유도체 또는 에톡실화 글리세롤 지방산 에스테르 등이 이용될 수 있다.

본 발명의 화장료 조성물은 스킨, 로션, 크림, 에센스, 팩, 파운데이션, 색조화장품, 선크림, 투웨이케이크, 페이스파우더, 콤팩트, 메이크업베이스, 스킨커버, 아이쉐도우, 립스틱, 립글로스, 립픽스, 아이브로우 펜슬, 화장수 등의 화장품 및 샴푸, 비누 등의 세정제에 적용될 수 있다.

본 발명의 일 실시예에 따른 화장료 조성물에는 상기 비파나무(Eriobotrya japonica (Thunb.) Lindl)의 잎에서 추출한 추출물 이외에 기능성 첨가물 및 일반적인 화장료 조성물에 포함되는 성분이 추가로 포함될 수 있다. 상기 기능성 첨가물로는 수용성 비타민, 유용성 비타민, 고분자 펩티드, 고분자 다당, 스핑고 지질 및 해초 엑기스로 이루어진 군에서 선택된 성분을 포함할 수 있다.

본 발명의 화장료 조성물에는 또한, 상기 기능성 첨가물과 더불어 필요에 따라 일반적인 화장료 조성물에 포함되는 성분을 배합해도 된다. 이외에 포함되는 배합 성분으로서는 유지 성분, 보습제, 에몰리엔트제, 계면 활성제, 유기 및 무기 안료, 유기 분체, 자외선 흡수제, 방부제, 살균제, 산화 방지제, 식물 추출물, pH 조정제, 알콜, 색소, 향료, 혈행 촉진제, 냉감제, 제한(制汗)제, 정제수 등을 들 수 있다.

한편, 본 발명의 건강기능식품 조성물은 유효성분인 추출물을 함유하는 것 외에 통상의 식품 조성물과 같이 여러 가지 향미제 또는 천연 탄수화물 등을 추가 성분으로서 함유할 수 있다.

상술한 천연 탄수화물의 예는 모노사카라이드, 예를 들어, 포도당, 과당 등; 디사카라이드, 예를 들어 말토스, 슈크로스 등; 및 폴리사카라이드, 예를 들어 덱스트린, 시클로덱스트린 등과 같은 통상적인 당, 및 자일리톨, 소르비톨, 에리트리톨 등의 당알콜이다. 상술한 향미제는 천연 향미제(타우마틴), 스테비아 추출물(예를 들어 레바우디오시드 A, 글리시르히진 등) 및 합성 향미제(사카린, 아스파르탐 등)를 유리하게 사용할 수 있다. 본 발명의 식품 조성물은 하기 약학적 조성물과 동일한 방식으로 제제화 되어 기능성 식품으로 이용하거나, 각종 식품에 첨가할 수 있다. 본 발명의 조성물을 첨가할 수 있는 식품으로는 예를 들어, 음료류, 육류, 초코렛, 식품류, 과자류, 피자, 라면, 기타 면류, 껌류, 사탕류, 아이스크림류, 알콜 음료류, 비타민 복합제 및 건강보조식품류 등이 있다.

또한, 상기 식품 조성물은 유효성분인 추출물 외에 여러 가지 영양제, 비타민, 광물(전해질), 합성 풍미제 및 천연 풍미제 등의 풍미제, 착색제 및 중진제(치즈, 초콜릿 등), 펙트산 및 그의 염, 알긴산 및 그의 염, 유기산, 보호성 콜로이드 증점제, pH 조절제, 안정화제, 방부제, 글리세린, 알콜, 탄산음료에 사용되는 탄산화제 등을 함유할 수 있다. 그밖에 본 발명의 식품 조성물은 천연 과일 주스 및 과일 주스 음료 및 야채 음료의 제조를 위한 과육을 함유할 수 있다.

본 발명의 건강기능식품 조성물은, 정제, 캅셀, 분말, 과립, 액상, 환 등의 형태로 제조 및 가공될 수 있다. 본 발명에서 '건강기능식품 조성물'이라 함은 건강기능식품에 관한 법률 제6727호에 따른 인체에 유용한 기능성을 가진 원료나 성분을 사용하여 제조 및 가공한 식품을 말하며, 인체의 구조 및 기능에 대하여 영양소를 조절하거나 생리학적 작용 등과 같은 보건용도에 유용한 효과를 얻을 목적으로 섭취하는 것을 의미한다. 본 발명의 건강 기능성 식품은 통상의 식품 첨가물을 포함할 수 있으며, 식품 첨가물로서의 적합 여부는 다른 규정이 없는 한, 식품의약품안전처에 승인된 식품 첨가물 공전의 총칙 및 일반시험법 등에 따라 해당 품목에 관한 규격 및 기준에 의하여 판정한다. 상기 '식품 첨가물 공전'에 수재된 품목으로는 예를 들어, 케톤류, 글리신, 구연산칼슘, 니코틴산, 계피산 등의 화학적 합성물; 감색소, 감초추출물, 결정셀룰로오스, 고량색소, 구아검 등의 천연첨가물; L-글루타민산나트륨 제제, 면류첨가알칼리제, 보존료 제제, 타르색소제제 등의 혼합제제류 등을 들 수 있다. 예를 들어, 정제 형태의 건강 기능성 식품은 본 발명의 유효성분을 부형제, 결합제, 붕해제 및 다른 첨가제와 혼합한 혼합물을 통상의 방법으로 과립화한 다음, 활택제 등을 넣어 압축성형하거나, 상기 혼합물을 직접 압축 성형할 수 있다. 또한 상기 정제 형태의 건강 기능성 식품은 필요에 따라 교미제 등을 함유할 수도 있다. 캅셀 형태의 건강 기능성 식품 중 경질 캅셀제는 통상의 경질 캅셀에 본 발명의 유효성분을 부형제 등의 첨가제와 혼합한 혼합물을 충진하여 제조할 수 있으며, 연질 캅셀제는 본 발명의 유효성분을 부형제 등의 첨가제와 혼합한 혼합물을 젤라틴과 같은 캅셀 기제에 충진하여 제조할 수 있다. 상기 연질 캅셀제는 필요에 따라 글리세린 또는 소르비톨 등의 가소제, 착색제, 보존제 등을 함유할 수 있다. 환 형태의 건강 기능성 식품은 본 발명의 유효성분과 부형제, 결합제, 붕해제 등을 혼합한 혼합물을 기존에 공지된 방법으로 성형하여 조제할 수 있으며, 필요에 따라 백당이나 다른 제피제로 제피할 수 있으며, 또는 전분, 탈크와 같은 물질로 표면을 코팅할 수도 있다. 과립 형태의 건강 기능성 식품은 본 발명의 유효성분의 부형제, 결합제, 붕해제 등을 혼합한 혼합물을 기존에 공지된 방법으로 입상으로 제조할 수 있으며, 필요에 따라 착향제, 교미제 등을 함유할 수 있다.

모든 결과는 최소 3번의 독립적인 실험의 평균 ± SD로 표시되었으며 SigmaPlot Software V.12.5(Systat Software Inc.)를 활용한 Dunnett’s Multiple Comparison Test와 함께 일원 분산 분석에 의해 결정하였다. 통계적 유의성은 *P<0.05, **P<0.01로 설정되었다. 또한 RSM 결과의 통계 분석은 Design Expert 소프트웨어 V.11(Stat-Ease Inc.)을 사용하여 분석하였다.

이하, 실시예 및 실험예를 통하여 본 발명을 보다 자세히 설명한다. 다만, 하기 실시예 및 실험예는 본 발명에 대한 예시로 제시되는 것으로, 당업자에게 주지 저명한 기술 또는 구성에 대한 구체적인 설명이 본 발명의 요지를 불필요하게 흐릴 수 있다고 판단되는 경우에는 그 상세한 설명을 생략할 수 있고, 이에 의해 본 발명이 제한되지는 않는다. 본 발명은 후술하는 특허청구범위의 기재 및 그로부터 해석되는 균등 범주 내에서 다양한 변형 및 응용이 가능하다.

<실시예 1> 비파나무 잎 추출물의 제조

비파나무(Eriobotrya japonica) 잎을 건조시킨 후 분쇄하였다. 비파나무 잎 분말 15g을 97.8%(v/v) 에탄올 150 mL와 혼합하고 62.7℃에서 2.5시간씩 3회 반복하여 환류냉각추출하였다. 상등액을 여과한 뒤, 회전식 진공농축기를 이용하여 농축하고, 동결건조기를 사용하여 3일간 동결건조하여 비파나무 잎 추출물(Eriobotrya japonica leaf extract, EJLE)을 제조하였다.

<실시예 2> 세포독성 평가

피부각질세포(HaCaT)와 진피섬유아세포(HDF)를 96 well plate에 각각 1×10⁵ cells/well로 분주하고, 배지로 10% FBS(fetal bovine serum) 및 1% Penicillin/Streptomycin이 첨가된 DMEM(Dulbecco's modified Eagle's medium)을 사용하여, 5% CO₂, 37℃에서 24시간 배양하였다. 상기 실시예 1에 따른 비파나무 잎 추출물을 농도별(1, 3, 10, 30, 100 ㎍/mL)로 처리하고 24시간 반응시켰다. 이후 배지를 회수하고 세포를 DPBS로 세척한 뒤, MTT 시약을 처리하고 37℃에서 3시간 반응시켰다. 세포 내 형성된 formazan을 DMSO로 용해한 후, microplate reader(Perkin Elmer, Wallac Victor3, MA, USA)를 이용하여 595 nm에서 흡광도를 측정하였다.

도 1a는 피부각질세포(HaCaT)에 대한 세포독성 평가 결과를 나타낸 도이고, 도 1b는 진피섬유아세포(HDF)에 대한 세포독성 평가 결과를 나타낸 도이다. 도 1에서 보듯이, 본 발명의 비파나무 잎 추출물은 모든 농도에서 80% 이상의 세포생존율을 보여 피부각질세포(HaCaT)와 진피섬유아세포(HDF)에 대한 세포독성을 유발하지 않음을 확인하였다. 따라서, 본 발명의 비파나무 잎 추출물은 인체 세포에 독성이 없고, 인체에 무해하고, 안전성이 우수하므로, 인체에 적용되는 화장품, 식품, 의약품, 의외약품 등에 활용 시 유용하게 사용될 수 있음을 확인하였다.

<실시예 3> Elastase 억제 활성

엘라스타아제(elastase)는 엘라스틴(elastin)을 분해하는 단백질 분해효소로, 피부의 주름생성을 촉진시킨다. 본 실험에서는 본 발명의 비파나무 잎 추출물이 엘라스타제의 활성을 저해함에 따른 피부 주름 개선 또는 예방 효과를 확인하였다.

96 웰 플레이트(well plate)에 상기 실시예 1에 따른 비파나무 잎 추출물을 농도별(1, 3, 10, 30, 100 ㎍/mL)로 2 μL 처리 후, 0.1 M Tris-HCl buffer(pH 8.8)를 사용하여 녹인 0.78 mM substrate(N-succinyl-(Ala)3-p-nitroanilide)과 0.04 U elastase 100 μL를 반응시켰다. 이후 icroplate reader(Perkin Elmer, Wallac Victor3, MA, USA)를 이용하여 405nm에서 1분 간격으로 총 25분간 측정하였다. 대조군으로는 Epigallocatechin gallate(EGCG; PHR1333; Sigma-Aldrich Korea)를 사용하였다.

도 2에서 보듯이, 본 발명의 비파나무 잎 추출물은 농도가 증가함에 따라 엘라스타아제 저해 활성이 증가하였으며, 양성대조군인 EGCG에 비해 월등히 높은 엘라스타아제 저해 활성을 확인하였다.

<실시예 4> 자외선으로부터 피부 세포 보호 효과

피부각질세포(HaCaT)와 진피섬유아세포(HDF)를 96 well plate에 각각 1×10⁵ cells/well로 분주하고, 배지로 10% FBS(fetal bovine serum) 및 1% Penicillin/Streptomycin이 첨가된 DMEM(Dulbecco's modified Eagle's medium)을 사용하여, 5% CO₂, 37℃에서 24시간 배양하였다. 상기 실시예 1에 따른 비파나무 잎 추출물을 농도별(1, 3, 10, 30, 100 ㎍/mL)로 처리하고 24시간 반응시켰다. 이후 배지를 회수하고 세포를 DPBS로 세척한 뒤, 세포를 살짝 덮을 만큼의 DPBS를 첨가하고 UVB를 조사하였다. 이후 무혈청 DMEM으로 교체하여 24시간 배양하고, 세포를 DPBS로 세척한 후, MTT 시약을 처리하고 37℃에서 3시간 반응시켰다. 세포 내 형성된 formazan을 DMSO로 용해한 후, microplate reader(Perkin Elmer, Wallac Victor3, MA, USA)를 이용하여 595 nm에서 흡광도를 측정하였다. 대조군으로는 Epigallocatechin gallate(EGCG; PHR1333; Sigma-Aldrich Korea)를 사용하였다.

도 3에 피부각질세포(HaCaT)에 대한 실험 결과를, 도 4에 진피섬유아세포(HDF)에 대한 실험 결과를 나타내었다. 도 3 및 도 4에서 보듯이, UVB를 조사할 경우 세포 생존률이 크게 감소하였다. 구체적으로, UVB(40 mJ/cm²) 조사에 따라 피부각질세포(HaCaT)의 세포 생존율이 82%, 진피섬유아세포(HDF)의 세포 생존율이 77%로 감소하였다. 반면, 비파나무 잎 추출물을 처리한 경우에는 세포 생존율이 농도 의존적으로 증가하였다. 즉, 본 발명의 비파나무 잎 추출물은 자외선으로부터의 세포 손상을 보호하는 효과가 있음을 확인하였다.

<실시예 5> 자외선 조사에 따른 활성산소종 생성 억제 효과

자외선에 의해 생성되는 세포 내의 활성산소는 피부 노화에 가장 중요한 요인으로 간주되고 있다. 본 실험에서는 본 발명의 비파나무 잎 추출물이 활성산소를 억제하는 효과가 있는지 확인하였다.

피부각질세포(HaCaT)와 진피섬유아세포(HDF)를 black 96 well plate에 각각 1×10⁵ cells/well로 분주하여 24시간 배양하였다. 상기 실시예 1에 따른 비파나무 잎 추출물을 농도별(1, 3, 10, 30, 100 ㎍/mL)로 처리하고 24시간 반응시켰다. UVB(40 mJ/cm²)를 조사한 뒤, 무혈청 DMEM에서 24시간 배양 후, 40 μM DCFH-DA를 첨가하여 1시간 배양하였다. 세포를 DPBS로 세척한 후 Synergy HT Multi-Mode Microplate Reader(BIO-TEK Instruments Inc., Ex : 485/20 nm / Em : 528/20 nm)를 이용하여 형광도를 측정하였다. 대조군으로는 Epigallocatechin gallate (EGCG; PHR1333; Sigma-Aldrich Korea)와 gallic acid(GA)를 사용하였다.

도 5a는 피부각질세포(HaCaT)에서 활성산소종 생성 억제 효과를 나타낸 도이고, 도 5b는 진피섬유아세포(HDF)에서 활성산소종 생성 억제 효과를 나타낸 도이다. 도 5에서 보듯이, UVB 조사에 따라 활성산소종이 대폭 증가하였으나, 본 발명의 비파나무 잎 추출물 처리에 따라 활성산소종의 생성이 유의하게 억제되는 것을 확인하였다.

<실시예 6> 자외선 조사에 따른 항산화 인자 발현

상기 실시예 4와 동일하게 진피섬유아세포(HDF)에 비파나무 잎 추출물(1, 3, 10 ㎍/mL)과 UVB를 조사한 뒤, 1% protease inhibitor cocktail과 1% phosphatase inhibitor cocktail을 포함하는 RIPA buffer에 의해 단백질을 추출하였다. 총 단백질 농도는 BCA 단백질 분석 키트로 정량한 다음 SDS-PAGE(6-15% 겔)로 분리하고 membrane으로 transfer하였다. membrane을 5% BSA 또는 skim milk로 1시간 동안 blocking한 후 1차 항체와 함께 4℃에서 overnight하고 상온에서 2시간 2차 항체를 사용하여 반응시켰다. 이후 membrane에 ECL 용액을 처리하고 ChemiDoc™ XRS+ System과 Image Lab™ Software를 사용하여 밴드를 확인하고 정량하였다.

도 6에서 보듯이, UVB(40 mJ/cm²) 조사에 따라 Nrf2, CAT, SOD-1, HO-1, TRXR1의 발현은 감소하였고 TXNIP의 발현은 증가하였으나, 본 발명의 비파나무 잎 추출물 처리에 따라 Nrf2, CAT, SOD-1, HO-1, TRXR1의 발현은 증가하고 TXNIP의 발현은 감소하였다. Nrf2가 산화적 스트레스에 영향을 받는 전사인자이고, 항산화 효소인 CAT, SOD-1, HO-1, TRXR1과, TRX의 활성을 저해하는 TXNIP의 발현 양상을 볼 때, 본 발명의 비파나무 잎 추출물은 산화적 스트레스를 감소시키며, 항산화 효과를 나타냄을 확인하였다.

<실시예 7> Nrf2/HO-1 경로 활성화에 의한 활성산소종의 생성 억제 효과

상기 실시예 5 및 실시예 6의 실험 결과를 바탕으로, 본 발명의 비파나무 잎 추출물(10 ㎍/mL)이 Nrf2/HO-1 경로 활성화를 통해 활성산소종의 생성 억제 효과를 발휘하는지 확인하였다.

상기 실시예 6을 참고하여, Nrf2 억제제인 Brusatol을 사용하여 동일하게 실험을 진행하였다. 도 7a에서 보듯이, Brusatol 처리에 따라 Nrf2와 HO-1의 발현이 감소하였으며, 이에 따라 HO-1 발현은 Nrf2 활성화를 필요로 함을 확인할 수 있었다.

또한, 상기 실시예 5를 참고하여, 본 발명의 비파나무 잎 추출물(10 ㎍/mL)의 진피섬유아세포(HDF)에서 Brusatol(Nrf2 억제제), ZnPP(HO-1 억제제) 및 CoPP(HO-1 유도제)의 존재 및 부재 하에 활성산소종 생성 억제 효과를 확인하였다. 도 7b에서 보듯이, Brusatol과 ZnPP는 비파나무 잎 추출물의 활성산소종 생성 억제 효과를 감소시킨 반면, CoPP는 비파나무 잎 추출물의 활성산소종 생성 억제 효과를 증가시켰다. 따라서, 본 발명의 비파나무 잎 추출물은 Nrf2/HO-1 경로 활성화를 통해 활성산소종 생성 억제 효과를 발휘하는 것으로 판단되었다.

<실시예 8> UVB 조사에 의한 피부 노화 관련 인자의 발현

상기 실시예 6과 동일하게, 피부각질세포(HaCaT)와 진피섬유아세포(HDF)에서 UVB 조사에 의한 피부 노화 관련 인자의 단백질 발현을 분석하였다.

도 8a에 피부각질세포(HaCaT)의 실험 결과를, 도 8b에 진피섬유아세포(HDF)의 실험 결과를 나타내었다. UVB(40 mJ/cm²) 조사에 따라 MMP-1의 발현이 증가하고, TIMP-1, SIRT1, COL1A1, ELN 및 HAS2의 발현은 감소하였으나, 본 발명의 비파나무 잎 추출물 처리에 따라 MMP-1 발현이 감소하고, TIMP-1, SIRT1, COL1A1, ELN 및 HAS2의 발현은 증가하였다.

MMP-1은 피부 광노화에 영향을 미치는 인자이며, MMP-1의 억제제인 TIMP-1의 발현 양상을 볼 때, 본 발명의 비파나무 잎 추출물은 피부 광노화를 개선 또는 완화하는 효과가 있음을 알 수 있다

또한, SIRT1이 광노화에 따른 콜라겐 분해를 억제하는 것으로 알려져 있는바, 본 발명의 비파나무 잎 추출물은 콜라겐 분해 억제 효과가 있음을 알 수 있다.

또한, UVB는 세포 외 기질을 분해하고 주름을 증가시키는 것으로 알려져 있는바, 세포외 기질을 구성하는 주요 성분인 type 1 pro-collagen(COL1A1), elastin(ELN) 및 hyaluronan synthase 2(HAS2)의 발현 양상을 볼 때, 본 발명의 비파나무 잎 추출물은 세포 외 기질 분해를 억제하며, 주름 개선 효과가 있음을 알 수 있다.

<실시예 9> UVB 조사에 의한 MAPKs/AP-1/NF-κB의 인산화

상기 실시예 6과 동일하게, 진피섬유아세포(HDF)에서 비파나무 잎 추출물이 UVB 조사에 의한 MAPKs/AP-1/NF-κB의 인산화에 미치는 영향을 확인하였다.

도 9a에 NF-κB, 도 9b에 AP-1, 도 9c에 MAPKs 신호 전달 경로의 인산화 확인 결과를 나타내었다. UVB(40 mJ/cm²) 조사에 따라 MAPKs/AP-1/NF-κB의 인산화가 증가한 반면, 본 발명의 비파나무 잎 추출물 처리에 따라 MAPKs/AP-1/NF-κB의 인산화가 감소함을 확인하였다.

<실시예 10> MAPKs/AP-1/NF-κB 신호전달 경로 확인

상기 실시예 9를 참고하여, 본 발명의 비파나무 잎 추출물이 MAPKs/AP-1/NF-κB 경로 억제를 통해 MMP-1 발현이 감소하고, TIMP-1 및 COL1A1 발현이 증가하는 것인지 확인하기 위해, MAPKs/AP-1/NF-κB 억제제를 사용하였다.

상기 실시예 8을 참고하여, U0126(ERK 억제제), SP600125(JNK 억제제), SB202190(P38 억제제), SP100030(AP-1 억제제) 및 PDTC(NF-κB 억제제)의 존재 또는 부존재 하에 진피섬유아세포(HDF)에서 UVB 조사에 의한 MMP-1, TIMP-1 및 COL1A1의 단백질 발현 수준을 확인하였다.

실험 결과를 도 10에 나타내었다. 본 발명의 비파나무 잎 추출물은 MAPKs/AP-1/NF-κB 경로 억제를 통한 자외선에 따른 피부노화 억제 효과를 발휘하는 것으로 확인되었다.

<실시예 11> 동물모델에서 비파나무 잎 추출물의 효과 확인

본 실험은 경북대학교 동물실험 윤리위원회(Institutional Animal Care and Use Committee)의 승인(KNU-2022-0001)을 받았다. 실험동물(6주령의 수컷 마우스(BALB/C mice, Samtako, Osan, Korea), n=30)는 온도 22 ± 2℃, 습도 60 ± 5%, 12시간 명암 주기에서 음식과 물에 자유롭게 접근 가능하도록 유지되었으며, 일주일간 사육실 환경에 적응시켰다. 이후, 동물용 클리퍼와 제모 크림을 사용하여 각 마우스의 등쪽 피부 털을 제모한 뒤, 5마리씩 무작위로 그룹을 배정하여 실험을 진행하였다.

실험군	실험물질 처리상태의 설명
G1	정상군 : Normal control group; UVB 무처리군
G2	대조군 : Control group; UVB 단독 처리군
G3	UVB + EGCG 100 mg/kg 투여군
G4	UVB + 비파나무 잎 추출물 50 mg/kg 도포군
G5	UVB + 비파나무 잎 추출물 150 mg/kg 도포군
G6	UVB + 비파나무 잎 추출물 150 mg/kg/day 경구 투여군

실험군은 정상군((G1) Normal control group; UVB 무처리군), 대조군((G2) Control group; UVB 단독 처리군), 양성대조군(자외선에 의한 피부 손상으로부터 피부 건강 유지에 도움을 주는 EGCG 100 mg/kg 투여군(G3)), 비파나무 잎 추출물 50 mg/kg 도포군((G4)), 비파나무 잎 추출물 150 mg/kg 도포군((G5)), 비파나무 잎 추출물 150 mg/kg/day 경구투여군((G6))으로 하였다.

정상군을 제외한 모든 그룹은 비파나무 잎 추출물 또는 EGCG 처리 후 주 5회 총 4주간 자외선을 조사하였다. UVB 조사량은 75 mJ/cm²으로 시작하여 점차 증가시켰다(1 MED(1 minimal erythema dose = 75 mJ/cm²): 3일, 2 MED: 3일, 3 MED: 4일, 4 MED: 10일). 사육 종료일에 마우스를 흡입마취 후, 피부조직을 채취하여 실험에 사용하였다.

11-1. 주름, 홍반, 각질화 개선 효과

도 11에 실험 종료 후 마우스 등을 촬영한 사진을 나타내었다. 실험군 G2에서 주름이 형성되고 홍반, 각질화가 나타난 반면, 비파나무 잎 추출물을 도포(G4, G5)하거나 경구 투여한 그룹(G6)은 주름, 홍반, 각질화가 개선된 것을 확인하였다.

11-2. 피부 두께 변화

마우스 등 중앙 부위에서 너비 1 cm 아래 부분을 잡아 두겹의 형태로 만든 후, 디지털 캘리퍼(Absolute Digimatic Thickness Gauge (Mitutoyo Corp.))를 이용하여 피부 두께를 측정하였다.

도 12에서 보듯이, 실험군 G2에서 피부 두께가 증가한 반면, 비파나무 잎 추출물을 도포(G4, G5)하거나 경구 투여한 그룹(G6)은 피부 두께가 감소하였다. 특히 실험군 G5는 UVB 처리군(G2)에 비해 30.3% 가량 유의적인 감소가 확인되었다.

또한, 절취한 피부조직을 10% 포르말린으로 고정한 후, 파라핀에 포매(embedding)하여 파라핀 블럭을 제작하였다. 4 μm 두께로 박절하여 조직 절편을 제조하고, hematoxylin and eosin 염색 한 뒤, 현미경(Eclipse TE2000-U, Nikon)을 사용하여 관찰하였다.

도 13에서 보듯이, 실험군 G2에서 표피 두께(Epidermis thickness)가 증가한 반면, 비파나무 잎 추출물을 도포(G4, G5)하거나 경구 투여한 그룹(G6)은 표피 두께가 감소하였다.

11-3. 콜라겐 섬유 밀도 변화

4 μm 두께의 조직 절편을 Masson's trichrome 염색 한 뒤, 현미경(Eclipse TE2000-U, Nikon)을 사용하여 관찰하였다.

도 14에서 보듯이, 실험군 G2에서 진피 내 콜라겐 섬유 밀도가 감소한 반면, 비파나무 잎 추출물을 도포(G4, G5)하거나 경구 투여한 그룹(G6)은 진피 내 콜라겐 섬유 밀도가 증가하였다.

11-4. 피부 장벽기능 강화

경피수분손실량(transepidermal water loss, TEWL) 수치는 피부로부터 발산되는 수분량으로서, 수치가 높을수록 피부의 보습 기능이 떨어져 있음을 의미하며, 피부 고유의 장벽 기능이 손상되었음을 나타낸다. 마우스 등 피부의 경피수분손실량의 변화를 Vapometer (Delfin Technologies Ltd)를 사용하여 측정하였다.

도 15에서 보듯이, 실험군 G2에서 경피수분손실량이 증가하였으나, 비파나무 잎 추출물을 도포(G4, G5)하거나 경구 투여한 그룹(G6)은 경피수분손실량이 감소하였으며, 특히, 비파나무 잎 추출물 경구 투여군(G6)은 실험군 G2 대비 75.5% 가량 유의적인 감소를 보였다.

또한, 상기 실시예 6과 동일하게, UVB 조사에 의한 피부 장벽기능 관련 단백질 발현을 확인하였다.

도 16에서 보듯이, 실험군 G2에서 Cldn-1, FLG 및 LASS3 발현이 감소하였으나, 비파나무 잎 추출물을 도포(G4, G5)하거나 경구 투여한 그룹(G6)은 Cldn-1, FLG 및 LASS3 발현이 증가하였다.

11-5. 염증성 사이토카인 발현 변화

균질화된 마우스 등 피부조직으로부터 TRIzol™을 이용하여 총 RNA를 분리하였다. 분리된 RNA는 260 nm/280 nm의 비율로 1.8-2.0 사이의 RNA 순도를 흡광도로 측정하여 정량하였다. 2 μg의 RNA가 cDNA Synthesis & Go Kit에 의해 cDNA 합성에 사용되었다. 염증성 사이토카인과 관련된 유전자의 mRNA 발현을 결정하기 위해, RT-PCR은 특정 프라이머를 이용하여 제조된 cDNA에 대한 PCR Thermal Cycler(Takara Bio Inc.)에 의해 수행되었다. RT-PCR을 통해 얻어진 cDNA를 이용하여 PCR 후 1% agarose gel과 StaySafeTM Nucleic Acid Gel Stain로 전기영동을 하여 ChemiDoc™과 Image Lab™ Software를 사용하여 결과를 확인하였다.

도 17에서 보듯이, 실험군 G2에서 TNF-α, IL-6, IL-1β의 발현이 증가하였으나, 비파나무 잎 추출물을 도포(G4, G5)하거나 경구 투여한 그룹(G6)은 TNF-α, IL-6, IL-1β의 발현이 감소하였다.

11-6. 노화 관련 인자 발현 변화

상기 실시예 6과 동일하게, 마우스 등 피부에서 UVB 조사에 의한 피부 노화 관련 인자의 단백질 발현을 분석하였다.

도 18에서 보듯이, 실험군 G2에서 MMP-1 MMP-9의 발현이 증가하고, TIMP-1, SIRT1, COL1A1, ELN 및 HAS2의 발현은 감소하였으나, 비파나무 잎 추출물을 도포(G4, G5)하거나 경구 투여한 그룹(G6)은 MMP-1 MMP-9의 발현이 감소하고, TIMP-1, SIRT1, COL1A1, ELN 및 HAS2의 발현이 증가하였다.

11-8. 항산화 관련 인자 발현 변화

상기 실시예 6과 동일하게, 마우스 등 피부에서 UVB 조사에 의한 항산화 관련 인자 발현에 미치는 영향을 확인하였다.

도 19에서 보듯이, 실험군 G2에서 Nrf2, HO-1의 발현이 감소하였으나, 비파나무 잎 추출물을 도포(G4, G5)하거나 경구 투여한 그룹(G6)은 Nrf2, HO-1의 발현이 증가하였다.

11-9. MAPKs/AP-1/NF-κB의 인산화

상기 실시예 6과 동일하게, 마우스 등 피부에서 UVB 조사에 의한 MAPKs/AP-1/NF-κB의 인산화에 미치는 영향을 확인하였다.

도 20에서 보듯이, 실험군 G2에서 MAPKs/AP-1/NF-κB의 인산화가 증가하였으나, 비파나무 잎 추출물을 도포(G4, G5)하거나 경구 투여한 그룹(G6)은 MAPKs/AP-1/NF-κB의 인산화가 감소하였다.

<실시예 12> 비파나무 잎 추출물의 최적 추출조건 도출

비파나무 잎 추출물의 Elastase 저해 활성을 최대로 나타내는 최적 추출조건을 도출하기 위해 반응표면분석법을 이용하였다. 반응표면분석법의 모델은 3-level-3-factor 실험계획인 Box-Behnken Design(BBD)를 사용하였다. 표 3에 주요 변수를 나타내었다. 에탄올 농도(0, 50 및 100%)를 X₁, 추출 시간(2, 3 및 4h)을 X₂, 추출온도(60, 75, 90°C)를 X₃로 설정하였다. 상기 세 가지 추출 요소를 각각 +1, 0 및 -1의 3 단계로 부호화 하였으며, BBD에 따라 표 4와 같이 15구로 설정하여 추출실험을 실시하였다. 또한 상기의 독립변수에 영향을 받는 종속변수는 Elastase 억제 활성(%)으로 하여 3회 반복 측정하여 그 평균값을 회귀분석에 사용하였다.

비파나무 잎을 건조시킨 후 분쇄하였다. 비파나무 잎 분말 15g을 하기 표 4에 나열된 추출조건(에탄올 농도, 추출 시간, 추출 온도)에 따라 150 mL의 용매로 추출하여 얻어진 종속변수의 결과를 표 4에 나타내었다. 상기 결과를 이용한 Box-Behnken 설계모델을 통해 각 종속변수와 독립변수의 관계를 보여주는 회귀방정식과 결정계수 R², p-value, F-value 값을 표 5에 나타내었다.

하기 표 6과 같이 분산분석(Analysis of variance, ANOVA)을 수행하여 반응모델의 적합성 뿐만 아니라 각 항의 계수와 유의성에 대해 확인하였다.

비파나무 잎의 최적 추출조건을 도출하기 위해, 상기 회귀방정식을 통해 각 독립변수의 최적화된 값을 결정하고 각 변수의 상호작용에 따라 반응표면 등고선을 형성하였다. 3차원 반응 표면곡선에 회귀방정식의 그래픽 표현으로 나타내었으며, 각각의 등고선 곡선은 세 가지의 독립변수 중 한 가지는 고정시키고 나머지 두 변수 조합의 무한 값으로 나타내었다(도 21). 회귀방정식 및 반응표면 등고선의 분석을 통하여 가장 높은 Elastase 억제 활성을 나타내는 비파나무 잎의 최적 추출 조건은 에탄올 농도(X₁) 97.8%, 추출 시간(X₂) 2.5h, 추출온도(X₃) 62.7℃로 도출되었다. 이와 같은 추출 조건으로 예측되는 Elastase 억제 활성은 88.35%이며, 실제 실험 결과 Elastase 억제 활성은 예측값과 유사한 88.93%으로 나타났다.

<실시예 13> 비파나무 잎 추출물의 오토파지 관련 단백질 발현

상기 실시예 6과 동일하게, 진피섬유아세포(HDF)에서 UVB 조사에 의한 오토파지(autophagy) 관련 단백질 발현을 분석하였다.

도 22a에서 보듯이, 진피섬유아세포(HDF)에서 UVB(40 mJ/cm²) 조사에 따라 p-mTOR 및 p62 단백질의 발현이 증가하였고 Beclin1, ATG5, LC3 단백질의 발현이 감소하였으나, 본 발명의 비파나무 잎 추출물 처리(low:1 ㎍/mL, high: 10 ㎍/mL)에 따라 p-mTOR 및 p62 단백질의 발현은 감소하고 Beclin1, ATG5, LC3 단백질의 발현은 증가하였다.

또한, 마우스 모델에서 비파나무 잎 추출물을 처리한 경우 오토파지 관련 단백질 발현 결과를 도 22b에 나타내었다. 본 발명의 비파나무 잎 추출물을 도포(UV+T)하거나 경구 투여한(UV+O) 경우, 처리하지 않은 실험군(NT)에 비해 Beclin1, ATG5, LC3 단백질의 발현이 증가하였다. UVB(40 mJ/cm²) 단독 처리군(UV)은 p-mTOR 및 p62 단백질의 발현이 증가하였고 Beclin1, ATG5, LC3 단백질의 발현이 감소하였으나, 본 발명의 비파나무 잎 추출물을 도포(UV+T)하거나 경구 투여한(UV+O) 경우 p-mTOR 및 p62 단백질의 발현은 감소하고 Beclin1, ATG5, LC3 단백질의 발현은 증가하였다.

즉, 본 발명의 비파나무 잎 추출물은 초기 오토파지의 단계를 상향조절하며, UVB 자외선 등의 스트레스 상황에서 오토파지를 조절하는 것을 의미한다.

Claims

비파나무 잎 추출물을 유효성분으로 포함하는 주름 개선용 화장료 조성물에서,
상기 비파나무 잎 추출물은 95~100%(v/v) 에탄올을 추출용매로 하여, 60~65℃에서 2~3시간 동안 추출한 것인, 조성물.
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제1항에 있어서,
상기 비파나무 잎 추출물은,
엘라스타아제(elastase) 활성을 억제하는 것인, 조성물.
제1항에 있어서,
상기 비파나무 잎 추출물은,
자외선에 의한 피부 세포 손상을 보호하는 것인, 조성물.
제1항에 있어서,
상기 비파나무 잎 추출물은,
자외선에 의한 활성산소종 생성을 억제하는 것인, 조성물.
제1항에 있어서,
상기 비파나무 잎 추출물은,
자외선에 의해 발현 증가된 MMP-1의 발현을 감소시키는 것인, 조성물.
제1항에 있어서,
상기 비파나무 잎 추출물은,
자외선에 의해 발현 감소된 TIMP-1, SIRT1, COL1A1, ELN 또는 HAS2 중 어느 하나 이상을 발현 증가시키는 것인, 조성물.
제1항에 있어서,
상기 비파나무 잎 추출물은,
자외선에 의해 증가된 MAPKs/AP-1/NF-κB의 인산화를 감소시키는 것인, 조성물.
제1항에 있어서,
상기 비파나무 잎 추출물은,
자외선에 의해 유발되는 주름, 홍반, 각질화 증상을 개선하는 것인, 조성물.
제1항에 있어서,
상기 비파나무 잎 추출물은,
자외선에 의해 증가된 피부 두께를 감소시키는 것인, 조성물.
제1항에 있어서,
상기 비파나무 잎 추출물은,
자외선에 의해 감소한 진피 내 콜라겐 섬유 밀도를 증가시키는 것인, 조성물.
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비파나무 잎 추출물을 유효성분으로 포함하는 주름 개선용 건강기능식품 조성물에서,
상기 비파나무 잎 추출물은 95~100%(v/v) 에탄올을 추출용매로 하여, 60~65℃에서 2~3시간 동안 추출한 것인, 조성물.
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