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KR102784691B1 - Il-12 및 항-cd20 항체를 포함하는 융합단백질 및 이의 용도 - Google Patents

Il-12 및 항-cd20 항체를 포함하는 융합단백질 및 이의 용도 Download PDF

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KR102784691B1
KR102784691B1 KR1020210105691A KR20210105691A KR102784691B1 KR 102784691 B1 KR102784691 B1 KR 102784691B1 KR 1020210105691 A KR1020210105691 A KR 1020210105691A KR 20210105691 A KR20210105691 A KR 20210105691A KR 102784691 B1 KR102784691 B1 KR 102784691B1
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Abstract

본 발명은 IL-12 또는 이의 변이체 및 CD20에 특이적으로 결합하는 항원 결합 부위를 포함하는 이중 특이적 항체를 제공한다. 상기 이중 특이적 항체는 IL-12에 의한 항암 효과를 나타낸다. 특히, 상기 항-CD20 항체를 하나의 항체에서 구현할 경우, 종양 내에서 특이적으로 발현이 높은 CD20을 대상으로 하여 IL-12를 종양 부위에 특이적으로 위치화(localization) 시킴으로써 효율적으로 암을 치료할 수 있다. 따라서, 상기 이중 특이적 항체는 항암 치료용 약학 조성물로서 활용할 수 있어 산업적 활용 가능성이 높다.

Description

IL-12 및 항-CD20 항체를 포함하는 융합단백질 및 이의 용도{FUSION PROTEIN COMPRISING IL-12 AND ANTI-CD20 ANTIBODY AND USE THEREOF}
본 발명은 IL-12 또는 이의 변이체; 및 항-CD20 항체를 포함하는 신규한 융합단백질 및 이를 포함하는 항암용 약학 조성물에 관한 것이다.
인터루킨-12(Interleukin-12)는 대표적인 염증성 사이토카인으로서 세포성 면역 반응을 효과적으로 유도하는데 필수적인 역할을 한다. IL-12는 이황화결합으로 연결된 40 kDa(p40) 및 35 kDa(p35) 서브유닛을 포함하는 헤테로다이머(heterodimeric) 단백질이며, 활성화된 대식세포, 단핵구, 수지상세포 및 활성 B 림프구에 의해 생성된다. IL-12는 T-helper 1 세포 면역을 증진시킬 수 있고, 세포성 T-림프구의 세포독성을 증가시키며, 혈관신생을 억제시킬 수 있다. 일반적으로 IL-12는 T 세포 및 NK 세포에서 IFN-γ 생산을 활성화시킨다.
IL-12의 국소적 발현은 종양세포가 T-세포 매개 세포독성에 민감하게 반응하도록 하며, 결과적으로 종양 성장 억제 및 체액성 면역의 구축을 가져온다. 그러나, IL-12의 임상 적용에 있어서의 단점은 투여 시 사이토카인 연관 독성이 전신에 나타날 수 있다는 점이다. 이러한 임상 결과는 암의 치료를 위한 단일치료제로서의 IL-12의 한계를 보여준다.
또한, CD20은 분자량이 대략 35 kDa인 미성숙 B(pre B) 림프구 및 성숙한 B 림프구 상에 위치하는 소수성 횡막 단백질로, B 세포 비-호지킨 림프종(NHL)에서 90% 이상 발현된다. 그러나, 조혈 줄기세포, 정상 형질세포 또는 기타 정상 조직에서는 발견되지 않는다. 인간 CD20 항원에 대한 항체인 리툭시맙(rituximab)은 B 세포 비-호지킨 림프종을 앓고 있는 환자의 치료를 위해 사용되어 왔으며, 미국등록특허 제5,776,456호에 "C2B8"로 언급된 항체이다. 상기 C2B8과 같은 항체의 성공에도 불구하고, 향상된 특성을 갖는 항-CD20에 대한 지속적인 요구가 있다.
US 5,776,456 B
이에 본 발명자들은 항암 효과를 가지는 신규한 융합단백질을 개발하기 위해 연구한 결과, IL-12 및 항-CD20 항체를 포함한 융합단백질이 전신 독성을 줄이면서 항암 활성이 증가함을 확인함으로써 본 발명을 완성하였다.
본 발명의 일 측면은, IL-12 또는 이의 변이체를 포함하는 제1 단량체; 및 CD20에 특이적으로 결합하는 항원 결합 부위를 포함하는 제2 단량체를 포함하는 융합단백질을 제공한다.
본 발명의 다른 측면은, 상기 융합단백질을 유효성분으로 포함하는 암 예방 또는 치료용 약학 조성물을 제공한다.
본 발명의 다른 측면은, 상기 제1 단량체를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 제공한다.
본 발명의 다른 측면은, 상기 제2 단량체를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 제공한다.
본 발명의 다른 측면은, 상기 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터를 제공한다.
본 발명의 다른 측면은, 상기 벡터가 도입된 형질전환 세포를 제공한다.
본 발명의 다른 측면은, i) 상기 형질전환 세포를 배양하는 단계; 및 ii) 제1 단량체 및 제2 단량체를 포함하는 융합단백질을 회수하는 단계를 포함하는 융합단백질의 생산방법을 제공한다.
IL-12 및 CD20에 특이적으로 결합하는 항원 결합 부위를 포함하는 융합단백질은 IL-12에 의한 항암 효과를 나타낼 수 있다. 뿐만 아니라, 상기 항-CD20 항체를 하나의 항체에서 구현할 경우, 종양에 특이적으로 IL-12를 축적시킴으로써 전신 독성(systemic toxicity)을 줄이고, 종양 특이적 항암 효과를 나타냄을 확인하였다. 즉, 종양 내에서 특이적으로 발현이 높은 CD20을 대상으로 하여 IL-12를 종양 부위에 특이적으로 위치화(localization) 시킴으로써 효율적으로 암을 치료할 수 있다.
도 1은 일 실시예에 따른 T2.01, T2.02, T2.03, T2.04, T2.05, T2.06 및 T2.07에 대한 SDS-PAGE 결과이다.
도 2는 일 실시예에 따른 T2.08, T2.09, T2.10, T2.11, T2.12 및 T2.13에 대한 SDS-PAGE 결과이다.
도 3은 일 실시예에 따른 T2.14, T2.15, T2.16, T2.17 및 Rituximab에 대한 SDS-PAGE 결과이다.
도 4는 일 실시예에 따른 T2.01m, T2.02m, T2.03m, T2.04m, T2.05m, T2.06m 및 T2.07m에 대한 SDS-PAGE 결과이다.
도 5는 일 실시예에 따른 T2.08m, T2.09m, T2.10m, T2.11m, T2.12m 및 T2.13m에 대한 SDS-PAGE 결과이다.
도 6은 일 실시예에 따른 T2.15m, T2.16m, T2.17m 및 18B12에 대한 SDS-PAGE 결과이다.
도 7은 재조합 인간 CD20(recombinant human CD20, rhCD20)에 대한 T2.01 및 T2.02의 결합력을 표면 플라즈몬 공명 분석방법을 통해 나타낸 그래프이다.
도 8은 Raji 세포, Ramos 세포 및 Jurkat 세포에 대한 Rituximab, T2.01 및 T2.02의 결합력을 유세포 분석을 통해 나타낸 그래프이다.
도 9는 A20 세포에 대한 18B12, T2.01m 및 T2.02m의 결합력을 유세포 분석을 통해 나타낸 그래프이다.
도 10은 Rituximab, T2.01 및 T2.02의 IL-12 수용체 베타 1과의 결합력을 효소 결합 면역 침강 분석법을 통해 나타낸 그래프이다.
도 11은 Rituximab, T2.01, T2.02 및 T2.12의 항체 의존 독성능을 ADCC 리포터 분석을 통해 나타낸 도면이다.
도 12는 T2.01m, T2.02m, T2.03m 및 18B12의 IL-12 활성을 HEKblue 리포터 세포에서의 흡광도를 통해 확인한 그래프이다.
도 13은 T2.01, T2.02 및 T2.17의 IL-12 활성을 인간 T 세포의 신호전달능을 통해 나타낸 그래프이다.
도 14는 Rituximab, T2.01, T2.02 및 T2.03에 의해 인간 T 세포의 사이토카인 IFN-γ 분비능을 측정한 그래프이다.
도 15는 Rituximab, T2.01 및 T2.02를 혼합 림프구와 반응시킨 후, IFN-γ 분비능을 효소 결합 면역 침강 분석법을 통해 나타낸 그래프이다.
도 16은 A20 세포가 동종이식된 마우스 모델에 T2.01m, T2.02m 및 화학요법(chemotherapy)을 농도별 처리한 후 각 마우스의 종양 크기의 변화를 측정하여 스파이더 플랏(spider plot)으로 나타낸 그래프이다.
도 17은 A20 세포가 동종이식된 마우스 모델에 T2.01m, T2.02m 및 화학요법(chemotherapy)을 처리한 후 종양 크기의 변화를 측정하여 나타낸 그래프이다.
도 18은 A20 세포가 동종이식된 마우스 모델에 T2.01m, T2.02m 및 화학요법을 처리한 후, 부작용 확인을 위해 마우스의 무게를 측정하여 나타낸 그래프이다.
도 19는 A20 세포가 동종이식된 마우스 모델에 T2.01m, T2.02m 및 화학요법을 처리한 후 9일째에 마우스의 종양조직을 수확(harvest)하고, 그 무게를 측정하여 나타낸 그래프이다.
도 20은 A20 세포가 동종이식된 마우스 모델에 T2.01m, T2.02m 및 화학요법을 처리한 후 9일째에 수확된 종양조직으로부터 면역세포를 분리하고, 종양 내 면역세포의 분포도를 유세포분석을 통해 나타낸 그래프이다.
도 21은 A20 세포가 동종이식된 마우스 모델에 대해 T2.02m을 처리하여 완전관해가 일어난 마우스에 A20 세포와 4T1 세포를 세포를 동종이식하여 종양재발 모델을 구축하였다. 이후 A20 종양 크기의 변화를 나타낸 그래프이다.
도 22는 A20 세포가 동종이식된 마우스 모델에 대해 T2.02m을 처리하여 완전관해가 일어난 마우스에 A20 세포와 4T1 세포를 세포를 동종이식하여 종양재발 모델을 구축하였다. 이후 4T1 종양 크기의 변화를 나타낸 그래프이다.
도 23은 A20 세포가 동종이식된 마우스 모델에 대해 T2.02m을 처리하여 완전관해가 일어난 마우스에 A20 세포와 4T1 세포를 세포를 동종이식하여 종양재발 모델을 구축하였다. 이후 부작용 확인을 위해 마우스의 무게를 측정하여 나타낸 그래프이다.
도 24는 A20 세포가 동종이식된 마우스 모델에 T2.02m, 또는 18B12를 처리한 후 종양 크기의 변화를 측정하여 나타낸 그래프이다.
도 25는 A20 세포가 동종이식된 마우스 모델에 T2.02m 또는 T2.13m을 처리한 후 종양 크기의 변화를 측정하여 나타낸 그래프이다.
도 26은 A20 세포가 동종이식된 마우스 모델에 T2.02m 또는 18B12 및 T2.13m을 병용처리한 후 종양 크기의 변화를 측정하여 나타낸 그래프이다.
도 27은 A20 세포가 동종이식된 마우스 모델에 T2.01m, T2.02m 또는 T2.03m을 처리한 후 종양 크기의 변화를 측정하여 나타낸 그래프이다.
도 28은 A20 세포가 동종이식된 마우스 모델에 T2.01m, T2.02m 또는 T2.03m을 처리한 후, 부작용 확인을 위해 마우스의 무게를 측정하여 나타낸 그래프이다.
도 29는 재조합 인간 CD20에 대한 T2.04, T2.05, T2.06 및 T2.07의 결합력을 표면 플라즈몬 공명 분석을 통해 나타낸 그래프이다.
도 30은 재조합 인간 CD20에 대한 T2.08, T2.09, T2.10 및 T2.11의 결합력을 표면 플라즈몬 공명 분석을 통해 나타낸 그래프이다.
도 31은 항-CD20/IL-12 융합단백질(왼쪽으로부터 첫번째; 도면 중 왼쪽은 anti-CD20의 단량체이고, 오른쪽은 IL-12를 포함하는 단량체이다), 이중 가변 도메인을 가지는 항-CD20/IL-12 융합단백질, CD20에 특이적인 단일쇄 가변영역 단편(scFv)이 결합된 항-CD20/IL-12 이중 항체(세번째 및 네번째), IL-12가 Fc의 C 말단에 결합된 항-CD20/IL-12 융합단백질(다섯번째)의 모식도이다.
도 32는 CD20에 특이적인 Fab/CD20에 특이적인 단일쇄 가변영역 단편(scFv) 및 IL-12 융합단백질(왼쪽), CD20에 특이적인 Fab 및 IL-12를 포함하는 융합단백질 이량체(가운데) 및 CD20에 특이적인 단일쇄 가변영역 단편(scFv) 및 IL-12를 포함하는 융합단백질 이량체(오른쪽)의 모식도이다.
IL-12 및 CD20 항체를 포함하는 융합단백질
본 발명의 일 측면은, IL-12 또는 이의 변이체 및 CD20에 특이적으로 결합하는 항원 결합 부위를 포함하는 융합단백질을 제공한다. 구체적으로, 상기 융합단백질은 면역글로불린 Fc 영역을 포함할 수 있다. 이때, 상기 IL-12 또는 이의 변이체는 헤파린 결합능이 낮아진 변이체일 수 있다.
일 구체예로, IL-12 또는 이의 변이체를 포함하는 제1 단량체; 및 CD20에 특이적으로 결합하는 항원 결합 부위를 포함하는 제2 단량체를 포함하는 융합단백질을 제공한다.
또 다른 구체예로서, IL-12 또는 이의 변이체 및 CD20에 특이적으로 결합하는 항원 결합 부위를 포함하는 융합단백질의 이량체를 제공한다.
IL-12 또는 이의 변이체
본 명세서에서 사용된 용어, "IL-12"는 각각 IL-12A 및 IL-12B의 2개의 개별적인 유전자에 의해 코딩되는 p35 및 p40 서브유닛으로 구성되는 이종이량체 사이토카인이다. IL-12는 대식세포와 같은 항원제시세포에 의해 생성되어 활성화된 T 세포 및 NK 세포들의 세포표면의 수용체에 결합한다. 상기 IL-12는 T 세포와 NK 세포들의 증식을 촉진하며, T 세포, NK 세포 및 대식세포의 세포독성 효과를 증진시킨다. 또한, IL-12는 IFN-γ, TNF-α 및 GM-CSF의 생성을 유도하며, Th1 세포의 활성화를 유도하는 작용을 한다. 한편, IL-12는 IL-12Rβ1 및 IL-12Rβ2에 의해 형성된 이종이량체 수용체인 IL-12 수용체에 결합한다.
본 명세서에서 사용된 용어, IL-12의 "변이체"는 야생형 IL-12 단백질과 유사하거나 동일한 기능을 가지는 아미노산 서열을 포함한다. 구체적으로, IL-12를 구성하는 p35 및 p40 서브유닛의 아미노산 서열이 야생형과 비교하여 치환, 삽입 또는 결실된 것일 수 있다.
상기 IL-12 또는 이의 변이체는 IL-12A(p35) 또는 이의 변이체 및 IL-12B(p40) 또는 이의 변이체를 포함할 수 있다.
또한, 상기 IL-12 또는 이의 변이체는 IL-12A 또는 이의 변이체; 및 IL-12B 또는 이의 변이체가 펩타이드 링커로 결합된 구조를 포함할 수 있다.
일 구체예에 있어서, 상기 IL-12 또는 이의 변이체는 하기 구조식 (I) 또는 구조식 (II)를 포함하는 융합단백질 일 수 있다.
N'-Y-[링커(1)]o-Z-C' (I)
N'-Z-[링커(1)]o-Y-C' (II)
이때, 상기 구조식 (I) 및 (II)에 있어서,
상기 N'은 융합단백질의 N-말단이고, 상기 C'는 융합단백질의 C-말단이며,
상기 Y는 IL-12A 또는 이의 변이체이고, 상기 Z는 IL-12B 또는 이의 변이체이며, 상기 링커(1)는 펩타이드 링커이고, 상기 o는 O 또는 1일 수 있다.
상기 IL-12 또는 이의 변이체의 일 구체예는 N 말단으로부터 IL-12B 또는 이의 변이체, 펩타이드 링커 및 IL-12A 또는 이의 변이체가 순차적으로 결합된 구조일 수 있다. 또한, 상기 IL-12 또는 이의 변이체의 일 구체예는 N 말단으로부터 IL-12A 또는 이의 변이체, 펩타이드 링커 및 IL-12B 또는 이의 변이체가 순차적으로 결합된 구조일 수 있다.
본 명세서에서 사용된 용어, "IL-12A"는 IL-12의 35 kDa 서브유닛(p35)으로서, 이황화 결합을 통해 IL-12의 40 kDa 서브유닛(p40)에 결합하여 활성 사이토카인을 생성한다.
상기 IL-12A의 아미노산 서열은 GenBank accession NO. AAK84425에 기재된 것일 수 있다(마우스 p35의 아미노산 서열은 GenBank accession No. AAA39292 참조). 또한, 상기 IL-12A 서브유닛을 코딩하는 서열로서 IL-12A(p35) 유전자는 GenBank accession No. AF404773에 기재된 서열 중 CDS(coding sequence)에 해당하는 뉴클레오타이드 서열일 수 있다(마우스 서열은 GenBank accession No. M86672 참조).
본 명세서에서 사용하는 용어, IL-12A의 "변이체"는 야생형 IL-12A 단백질과 유사하거나 동일한 기능을 가지는 아미노산 서열을 포함한다. 구체적으로, IL-12A의 아미노산 서열이 야생형과 비교하여 치환, 삽입 또는 결실을 갖는 것을 의미한다. 구체적으로, IL-12A 변이체는 IL-12A의 단편일 수 있으며, 서열번호 138의 1 내지 22번째 아미노산이 결실된 아미노산 서열을 가질 수 있다. 보다 구체적으로, IL-12A의 변이체는 서열번호 125의 아미노산 서열을 가질 수 있다.
또한, 본 발명의 일 실시예에서 사용된 IL-12A는 인간 IL-12A로서 서열번호 125의 아미노산 서열일 수 있다. 일 실시예에서 마우스 IL-12A는 서열번호 132의 아미노산 서열일 수 있다.
본 명세서에서 사용된 용어, "IL-12B"는 IL-12의 40 kDa 서브유닛(p40)으로서, 이황화 결합을 통해 IL-12의 35 kDa 서브유닛(p35)에 결합하여 IL-12를 형성하고, 이와 더불어 IL-23의 서브유닛 p19에 결합하여 IL-23을 형성하기도 한다. 한편, IL-12B는 자연살해세포 자극 인자 2(natural killer cell stimulating factor 2)라고도 한다.
상기 "IL-12B"의 아미노산 서열은 GenBank accession No. AAD56386에 기재된 것일 수 있다(마우스 p40의 아미노산 서열은 GenBank accession No. AAA39296 참조). 또한, 상기 IL-12B 서브유닛을 코딩하는 서열로서 IL-12B(p40) 유전자는 GenBank accession No. AF180563에 기재된 서열 중 CDS(coding sequence)에 해당하는 뉴클레오타이드 서열일 수 있다(마우스 서열은 GenBank accession No.M86671 참조).
또한, 본 발명의 일 실시예에서 사용된 IL-12B는 인간 IL-12B일 수 있으며, IL-12B는 구체적으로 서열번호 124의 아미노산 서열일 수 있다. 일 실시예에서 마우스 IL-12B는 서열번호 131의 아미노산 서열을 가질 수 있다.
본 명세서에서 사용된 용어, IL-12B의 "변이체"는 야생형 IL-12B 단백질과 유사하거나 동일한 기능을 가지는 아미노산 서열을 포함한다. 구체적으로, IL-12B의 야생형 아미노산 서열로부터 치환, 삽입 또는 결실을 갖는 것을 의미한다.
구체적으로, IL-12B 변이체는 서열번호 137의 1 내지 22번째 아미노산이 결실된 것일 수 있다. 보다 구체적으로, IL-12B 변이체는 상기 서열번호 124의 서열에서 1개 내지 8개의 아미노산이 치환된 것일 수 있다. 또한, 상기 IL-12B 변이체는 서열번호 139의 1 내지 22번째 아미노산이 결실된 것일 수 있다. 보다 구체적으로, IL-12B 변이체는 상기 서열번호 131의 서열에서 최대 1개 내지 8개의 아미노산이 치환된 것일 수 있다.
상기 IL-12B(p40)의 변이체는 IL-12의 헤파린 결합에 관여하는 아미노산이 치환된 것일 수 있다.
일 구체예에 있어서, 상기 IL-12B(p40)의 변이체는 IL-12B 내의 헤파린과 결합하는 라이신(K)이 다른 아미노산으로 치환된 형태일 수 있다. 구체적으로, 서열번호 124의 258번, 260번, 263번 및 264번의 라이신이 다른 아미노산으로 치환된 형태일 수 있다. 구체적으로, 상기 IL-12B(p40)의 변이체는 서열번호 124의 아미노산 서열에서 K258A, K260A, K263A 및 K264A으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 하나 이상의 치환이 일어난 아미노산 서열을 포함하는 것일 수 있다. 구체적으로, 상기 IL-12B(p40)의 변이체는 서열번호 124의 아미노산 서열에서 K258A 및 K263A의 치환이 일어난 아미노산 서열을 포함하거나, 서열번호 124의 아미노산 서열에서 K260A 및/또는 K264A의 변이를 더 포함하는 것일 수 있다.
일 구체예에 있어서, 상기 IL-12B(p40)의 변이체는 IL-12B 내의 헤파린과 결합하는 알지닌(R) 또는 라이신(K)이 다른 아미노산으로 치환된 형태일 수 있다. 구체적으로, 서열번호 131의 254번의 알지닌 및/또는 255번, 256번 및 260번의 라이신이 다른 아미노산으로 치환된 형태일 수 있다. 구체적으로, 상기 IL-12B(p40)의 변이체는 서열번호 131의 아미노산 서열에서 R254A, K255A, K256A 및 K260A으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 하나 이상의 치환이 일어난 아미노산 서열을 포함하는 것일 수 있다. 구체적으로, 상기 IL-12B(p40)의 변이체는 서열번호 131의 아미노산 서열에서 R254A 및 K260A의 치환이 일어난 아미노산 서열을 포함하거나, 서열번호 131의 아미노산 서열에서 K255A 및/또는 K256A의 변이를 더 포함하는 것일 수 있다.
일 구체예에 있어서, IL-12B(p40)의 변이체는 상기 서열번호 127, 서열번호 129, 서열번호 134 또는 서열번호 136의 아미노산 서열을 포함하는 것일 수 있다.
일 구체예에 있어서, 상기 인간 IL-12B 변이체는 하기 [구조식 A]로 이루어진 것일 수 있다.
[구조식 A]
X1-L-X2
여기서, X1은 서열번호 141의 아미노산 서열이고,
X2는 서열번호 142의 아미노산 서열이며,
L은 V-A1-A2-Q-A3-K*-A4-A5-A6-A7-K*-A8로 이루어진 아미노산 서열이다.
상기 A1은 R 또는 Q이고, A2는 V, A 또는 I이며, A3은 G 또는 R*이고, A4는 S, N 또는 K*이며, A5는 K*, N 또는 E이고, A6은 R 또는 K이며, A7은 E, M 또는 T이고, A8은 K* 또는 E이다.
상기 "*"로 표시된 하나 이상의 아미노산 잔기는 이에 제한되지는 않으나, A, G, I, L, M, F, P 및 V로 이루어진 군으로부터 선택된 비극성 아미노산 잔기로 치환될 수 있다.
일 구체예에 있어서, 상기 IL-12B(p40)의 변이체는 헤파린 결합에 관여하는 아미노산의 치환을 포함하여 암세포에 대한 사멸 효과는 유지하면서도, IL-12의 사이토카인 연관 독성을 감소시키는 것일 수 있다.
CD20 및 CD20에 특이적으로 결합하는 항원 결합 부위
본 명세서에서 사용된 용어, "CD20"은 pre-B 및 성숙 B 림프구 림프구의 표면 상에 발현되는 약 35 kDa의 분자량을 갖는 소수성 막관통 단백질이다. CD20은 B 세포 비-호지킨 림프종(NHL)의 90%에서 고도로 발현되나, 조혈 줄기세포, pro-B 세포, 정상 원형질 세포 또는 다른 정상 조직에서는 발견되지 않는다.
상기 CD20은 'CD20 항원'과 혼용될 수 있으며, 세포에 의해 천연적으로 발현되거나 CD20 유전자로 형질감염된 세포 상에서 발현되는 인간 CD20의 임의의 변이체, 동형 및 종 상동체를 포함한다. 본 발명의 항체는 CD20에 결합하여 CD20을 발현하는 세포(예컨대, 종양 세포)의 사멸을 매개할 수 있다. CD20을 발현하는 세포의 사멸은 ADCC(antibody-dependent cell cytotoxicity) 및 CDC(complement dependent cytotoxicity) 기작 중 하나 이상에 의해 일어날 수 있다.
본 명세서에서 사용된 용어 "특이적으로 결합하는"은 비-특이적 상호작용과 측정가능하게 상이한 결합을 의미한다. 특이적 결합은 결합 활성을 갖지 않는 표적과 유사한 대조군 분자와 경쟁함으로써 결정될 수 있다.
본 명세서에서 사용된 용어 "항원 결합 부위(Epitope)"는 항체의 가변 영역에서 특이적 항원 결합 부위와 상호작용하는 결정인자를 지칭한다. 상기 항원 결합 부위는 아미노산 또는 당 측쇄와 같은 분자의 그룹이며, 보통 특이적 구조적 특징뿐만 아니라 특이적 하전 특징을 가진다. 상기 CD20에 특이적으로 결합하는 항원 결합 부위는 CD20에 특이적으로 항원-항체 결합을 할 수 있는 분자를 총칭할 수 있다.
또한, 상기 항체 또는 이의 단편은 CD20과 특이적으로 결합할 수 있는 항원 결합 도메인을 포함하는 한 어떠한 형태로도 이용될 수 있다.
상기 항원 결합 부위는 결합에 직접적으로 수반되지 않는 다른 아미노산, 또는 항원 결합 부위의 아미노산 잔기에 의해 효과가 차단되는 아미노산을 포함할 수 있다.
구체적으로, 상기 항원 결합 부위는 CD20에 특이적으로 결합하는 항체 또는 이의 단편일 수 있다.
본 명세서에서 사용된 용어 "항체"는, 항원 결합 부위를 함유하는 분자, 및 항원 결합 부위를 함유하는 면역글로불린 분자의 면역학적 활성 단편을 지칭한다. 면역글로불린 분자는 IgG, IgE, IgM, IgD, IgA, IgY 또는 이의 하위부류(subclass)의 면역글로불린 분자일 수 있다. 항체는 합성 항체, 모노클로날 항체, 단일 도메인 항체, 단쇄 항체, 재조합적으로 생산된 항체, 다중특이적 항체(이중특이적 항체를 포함함), 인간 항체, 인간화 항체, 키메라 항체, 인트라바디(intrabody), scFv(예를 들어, 단일특이적 및 이중특이적 등을 포함함), Fab 단편, F(ab') 단편, 이황화-연결 Fv(sdFv), 항-이디오타입(anti-idiotypic)(항-Id) 항체, 및 상기 항체의 항원 결합 단편을 포함하나, 이에 제한되지 않는다.
본 명세서에서 사용된 용어 "항체 단편"은 항체의 일부, 예컨대, F(ab')2, F(ab)2, Fab', Fab, Fv, scFv일 수 있다. 구조와 상관없이, 항체 단편은 온전한(intact) 항체에 의해 인지되는 동일한 항원과 결합한다.
일 구체예에 있어서, 상기 CD20에 특이적으로 결합하는 항원 결합 부위는 서열번호 107의 HCDR1, 서열번호 108의 HCDR2 및 서열번호 109의 HCDR3를 포함하는 중쇄가변영역 및 서열번호 110의 LCDR1, 서열번호 111의 LCDR2, 서열번호 112의 LCDR3를 포함하는 경쇄가변영역을 포함할 수 있다. 이때, 일 구체예로, 상기 CD20에 특이적으로 결합하는 항원 결합 부위는 서열번호 113의 중쇄가변영역 및 서열번호 114의 경쇄가변영역을 가질 수 있다.
또한, 일 구체예로 서열번호 115의 HCDR1, 서열번호 116의 HCDR2 및 서열번호 117의 HCDR3를 포함하는 중쇄가변영역 및 서열번호 118의 LCDR1, 서열번호 119의 LCDR2, 서열번호 120의 LCDR3를 포함하는 경쇄가변영역을 포함할 수 있다. 이때, 일 구체예로 상기 CD20에 특이적으로 결합하는 항원 결합 부위는 서열번호 121의 중쇄 가변 영역 및 서열번호 122의 경쇄가변영역을 가질 수 있다.
일 구체예에 있어서, 상기 CD20에 특이적으로 결합하는 항원 결합 부위는 scFv일 수 있다. 이때, 상기 scFv는 상술한 중쇄 및 경쇄 CDR을 포함할 수 있다. 상기 CD20에 특이적으로 결합하는 scFv의 일 구체예로 서열번호 88 또는 서열번호 89의 아미노산 서열을 가질 수 있다.
또한, 상기 CD20에 특이적으로 결합하는 항원 결합 부위는 공지된 항-CD20 항체 또는 이의 단편을 포함하는 것일 수 있다. 상기 항-CD20 항체 또는 이의 단편은 당업자에게 알려진 항체를 제한 없이 의미할 수 있다.
상기 항-CD20 항체 또는 이의 단편은 Ocrelizumab(RG-1594), Obinutuzumab(RG-7159), Ofatumumab(GSK-1841157), 2B8(Biogen), Tositumomab(Bexxar), Ublituximab(EMAB-603), Epcortitamab(GEN-3013)의 7D8, Divozilimab(BCD-132), Odronextabmab(REGN-1979), Veltuzumab, MB-CART2019.1, Ocaratuzumab(LY-2469298), ADI-001의 3H7, Pamotamab(THG-338), DNL-1의 hA20 및 mAb-1.5.3으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 하나 이상의 가변영역을 포함하는 것일 수 있다.
다른 한가지 예로, 상기 항체는 국제공개특허 WO 2004-056312 A2, 국제공개특허 WO 2005-044859 A2, 미국등록특허 US 8,529,902 B2, 미국등록특허 US 8,563,269 B2, 미국등록특허 US 9,694,071 B2, 국제공개특허 WO 2019-155008 A1, 국제공개특허 WO 2020-091634 A1, 미국공개특허 US 2017-0174781 A1, 국제공개특허 WO 2003-068821 A2, 미국공개특허 US 2020-0109210 A1, 미국등록특허 US 8,153,125 B2, 국제공개특허 WO 2020-072536 A1, 미국공개특허 US 2021-0095027 A1, 국제공개특허 WO 2003-068821 A2 또는 미국공개특허 US 2011-0129412 A1에 개시된 항-CD20 항체 또는 이의 단편을 사용할 수 있다.
일 구체예에 있어서, 상기 항-CD20 항체는 Ocrelizumab의 가변영역을 포함할 수 있다. 구체적으로, 상기 항체는 서열번호 143의 HCDR1, 서열번호 144의 HCDR2, 서열번호 145의 HCDR3을 포함하는 중쇄가변영역 및 서열번호 146의 LCDR1, 서열번호 147의 LCDR2, 서열번호 148의 LCDR3을 포함하는 경쇄가변영역을 포함할 수 있다. 또한, 상기 항-CD20 항체는 서열번호 240의 중쇄가변영역 및 서열번호 241의 경쇄가변영역을 포함할 수 있다.
일 구체예에 있어서, 상기 항-CD20 항체는 Afutuzumab 또는 Obinutuzumab의 가변영역을 포함할 수 있다. 구체적으로, 상기 항체는 서열번호 149의 HCDR1, 서열번호 150의 HCDR2, 서열번호 151의 HCDR3을 포함하는 중쇄가변영역 및 서열번호 152의 LCDR1, 서열번호 153의 LCDR2, 서열번호 154의 LCDR3을 포함하는 경쇄가변영역을 포함할 수 있다. 또한, 상기 항-CD20 항체는 서열번호 242의 중쇄가변영역 및 서열번호 243의 경쇄가변영역을 포함할 수 있다.
일 구체예에 있어서, 상기 항-CD20 항체는 Ofatumumab의 가변영역을 포함할 수 있다. 구체적으로, 상기 항체는 서열번호 155의 HCDR1, 서열번호 156의 HCDR2, 서열번호 157의 HCDR3을 포함하는 중쇄가변영역 및 서열번호 158의 LCDR1, 서열번호 159의 LCDR2, 서열번호 160의 LCDR3을 포함하는 경쇄가변영역을 포함할 수 있다. 또한, 상기 항-CD20 항체는 서열번호 244의 중쇄가변영역 및 서열번호 245의 경쇄가변영역을 포함할 수 있다.
일 구체예에 있어서, 상기 항-CD20 항체는 2B8의 가변영역을 포함할 수 있다. 구체적으로, 상기 항체는 서열번호 161의 HCDR1, 서열번호 162의 HCDR2, 서열번호 163의 HCDR3을 포함하는 중쇄가변영역 및 서열번호 164의 LCDR1, 서열번호 165의 LCDR2, 서열번호 166의 LCDR3을 포함하는 경쇄가변영역을 포함할 수 있다. 또한, 상기 항-CD20 항체는 서열번호 246의 중쇄가변영역 및 서열번호 247의 경쇄가변영역을 포함할 수 있다.
일 구체예에 있어서, 상기 항-CD20 항체는 Tositumomab의 가변영역을 포함할 수 있다. 구체적으로, 상기 항체는 서열번호 167의 HCDR1, 서열번호 168의 HCDR2, 서열번호 169의 HCDR3을 포함하는 중쇄가변영역 및 서열번호 170의 LCDR1, 서열번호 171의 LCDR2, 서열번호 172의 LCDR3을 포함하는 경쇄가변영역을 포함할 수 있다. 또한, 상기 항-CD20 항체는 서열번호 248의 중쇄가변영역 및 서열번호 249의 경쇄가변영역을 포함할 수 있다.
일 구체예에 있어서, 상기 항-CD20 항체는 Ublituximab의 가변영역을 포함할 수 있다. 구체적으로, 상기 항체는 서열번호 173의 HCDR1, 서열번호 174의 HCDR2, 서열번호 175의 HCDR3을 포함하는 중쇄가변영역 및 서열번호 176의 LCDR1, 서열번호 177의 LCDR2, 서열번호 178의 LCDR3을 포함하는 경쇄가변영역을 포함할 수 있다. 또한, 상기 항-CD20 항체는 서열번호 250의 중쇄가변영역 및 서열번호 251의 경쇄가변영역을 포함할 수 있다.
일 구체예에 있어서, 상기 항-CD20 항체는 Epcortitamab의 가변영역을 포함할 수 있다. 구체적으로, 상기 항체는 서열번호 179의 HCDR1, 서열번호 180의 HCDR2, 서열번호 181의 HCDR3을 포함하는 중쇄가변영역 및 서열번호 182의 LCDR1, 서열번호 183의 LCDR2, 서열번호 184의 LCDR3을 포함하는 경쇄가변영역을 포함할 수 있다. 또한, 상기 항-CD20 항체는 서열번호 252의 중쇄가변영역 및 서열번호 253의 경쇄가변영역을 포함할 수 있다.
일 구체예에 있어서, 상기 항-CD20 항체는 Divozilimab의 가변영역을 포함할 수 있다. 구체적으로, 상기 항체는 서열번호 185의 HCDR1, 서열번호 186의 HCDR2, 서열번호 187의 HCDR3을 포함하는 중쇄가변영역 및 서열번호 188의 LCDR1, 서열번호 189의 LCDR2, 서열번호 190의 LCDR3을 포함하는 경쇄가변영역을 포함할 수 있다. 또한, 상기 항-CD20 항체는 서열번호 254의 중쇄가변영역 및 서열번호 255의 경쇄가변영역을 포함할 수 있다.
일 구체예에 있어서, 상기 항-CD20 항체는 Odronextabmab의 가변영역을 포함할 수 있다. 구체적으로, 상기 항체는 서열번호 191의 HCDR1, 서열번호 192의 HCDR2, 서열번호 193의 HCDR3을 포함하는 중쇄가변영역 및 서열번호 194의 LCDR1, 서열번호 195의 LCDR2, 서열번호 196의 LCDR3을 포함하는 경쇄가변영역을 포함할 수 있다. 또한, 상기 항-CD20 항체는 서열번호 256의 중쇄가변영역 및 서열번호 257의 경쇄가변영역을 포함할 수 있다.
일 구체예에 있어서, 상기 항-CD20 항체는 Veltuzumab의 가변영역을 포함할 수 있다. 구체적으로, 상기 항체는 서열번호 197의 HCDR1, 서열번호 198의 HCDR2, 서열번호 199 또는 서열번호 200의 HCDR3을 포함하는 중쇄가변영역 및 서열번호 201의 LCDR1, 서열번호 202의 LCDR2, 서열번호 203의 LCDR3을 포함하는 경쇄가변영역을 포함할 수 있다. 또한, 상기 항-CD20 항체는 서열번호 258의 중쇄가변영역 및 서열번호 259의 경쇄가변영역을 포함할 수 있다.
일 구체예에 있어서, 상기 항-CD20 항체는 MB-CART2019.1의 가변영역을 포함할 수 있다. 구체적으로, 상기 항체는 서열번호 204의 HCDR1, 서열번호 205의 HCDR2, 서열번호 206의 HCDR3을 포함하는 중쇄가변영역 및 서열번호 207의 LCDR1, 서열번호 208의 LCDR2, 서열번호 209의 LCDR3을 포함하는 경쇄가변영역을 포함할 수 있다. 또한, 상기 항-CD20 항체는 서열번호 260의 중쇄가변영역 및 서열번호 261의 경쇄가변영역을 포함할 수 있다.
일 구체예에 있어서, 상기 항-CD20 항체는 Ocaratuzumab의 가변영역을 포함할 수 있다. 구체적으로, 상기 항체는 서열번호 210의 HCDR1, 서열번호 211의 HCDR2, 서열번호 212의 HCDR3을 포함하는 중쇄가변영역 및 서열번호 213의 LCDR1, 서열번호 214의 LCDR2, 서열번호 215의 LCDR3을 포함하는 경쇄가변영역을 포함할 수 있다. 또한, 상기 항-CD20 항체는 서열번호 262의 중쇄가변영역 및 서열번호 263의 경쇄가변영역을 포함할 수 있다.
일 구체예에 있어서, 상기 항-CD20 항체는 ADI-001의 가변영역을 포함할 수 있다. 구체적으로, 상기 항체는 서열번호 216의 HCDR1, 서열번호 217의 HCDR2, 서열번호 218의 HCDR3을 포함하는 중쇄가변영역 및 서열번호 219의 LCDR1, 서열번호 220의 LCDR2, 서열번호 221의 LCDR3을 포함하는 경쇄가변영역을 포함할 수 있다. 또한, 상기 항-CD20 항체는 서열번호 264의 중쇄가변영역 및 서열번호 265의 경쇄가변영역을 포함할 수 있다.
일 구체예에 있어서, 상기 항-CD20 항체는 Pamotamab의 가변영역을 포함할 수 있다. 구체적으로, 상기 항체는 서열번호 222의 HCDR1, 서열번호 223의 HCDR2, 서열번호 224의 HCDR3을 포함하는 중쇄가변영역 및 서열번호 225의 LCDR1, 서열번호 226의 LCDR2, 서열번호 227의 LCDR3을 포함하는 경쇄가변영역을 포함할 수 있다. 또한, 상기 항-CD20 항체는 서열번호 266의 중쇄가변영역 및 서열번호 267의 경쇄가변영역을 포함할 수 있다.
일 구체예에 있어서, 상기 항-CD20 항체는 DNL-1의 가변영역을 포함할 수 있다. 구체적으로, 상기 항체는 서열번호 228의 HCDR1, 서열번호 229의 HCDR2, 서열번호 230의 HCDR3을 포함하는 중쇄가변영역 및 서열번호 231의 LCDR1, 서열번호 232의 LCDR2, 서열번호 233의 LCDR3을 포함하는 경쇄가변영역을 포함할 수 있다. 또한, 상기 항-CD20 항체는 서열번호 268의 중쇄가변영역 및 서열번호 269의 경쇄가변영역을 포함할 수 있다.
일 구체예에 있어서, 상기 항-CD20 항체는 mAb-1.5.3의 가변영역을 포함할 수 있다. 구체적으로, 상기 항체는 서열번호 234의 HCDR1, 서열번호 235의 HCDR2, 서열번호 236의 HCDR3을 포함하는 중쇄가변영역 및 서열번호 237의 LCDR1, 서열번호 238의 LCDR2, 서열번호 239의 LCDR3을 포함하는 경쇄가변영역을 포함할 수 있다. 또한, 상기 항-CD20 항체는 서열번호 270의 중쇄가변영역 및 서열번호 271의 경쇄가변영역을 포함할 수 있다.
상기 항-CD20 항체는 암세포상에 존재하는 CD20에 특이적으로 결합하여, 암세포의 사멸을 유발할 수 있는 한 어떠한 항체도 이용될 수 있다.
제1 단량체의 구조
상기 제1 단량체는 IL-12 또는 이의 변이체를 포함한다.
상기 제1 단량체는 CD20에 특이적으로 결합하는 항원 결합 부위를 추가적으로 포함하는 것일 수 있다.
일 구체예에 있어서, 상기 제1 단량체는 IL-12 또는 이의 변이체; 및 Fc 영역 단편 또는 이의 변이체를 포함하는 것일 수 있다.
일 구체예에 있어서, 상기 제1 단량체는 IL-12 또는 이의 변이체, Fc 영역 단편 또는 이의 변이체 및 CD20에 특이적으로 결합하는 항원 결합 부위를 포함하는 것일 수 있다.
상기 제1 단량체는 하기 구조식 (III) 또는 구조식 (IV)를 포함하는 것일 수 있다.
N'-X-[링커(2)]p-Fc 영역 단편 또는 이의 변이체-[링커(3)]q-(T)r-C' (III)
N'-(T)r-[링커(2)]q -Fc 영역 단편 또는 이의 변이체-[링커(3)]p-X-C' (IV)
이때, 상기 구조식 (III) 및 (IV)에 있어서,
상기 N'은 융합단백질의 N-말단이고, 상기 C'는 융합단백질의 C-말단이며,
상기 X는 상기 구조식 (I) 또는 (II)이고,
상기 T는 CD20에 특이적으로 결합하는 항원 결합 부위이며,
상기 링커(2) 및 링커(3)는 펩타이드 링커이고, 상기 p, q 및 r은 각각 독립적으로 O 또는 1일 수 있다.
일 구체예에 있어서, 상기 r이 0인 경우, 상기 제1 단량체는 IL-12 또는 이의 변이체 및 Fc 영역 단편 또는 이의 변이체가 펩타이드 링커로 연결된 융합단백질 형태일 수 있다.
이때, 상기 제1 단량체는 서열번호 3번, 서열번호 4번, 서열번호 5번, 서열번호 13번, 서열번호 14번, 서열번호 15번, 서열번호 24번, 서열번호 25번, 서열번호 26번, 서열번호 34번, 서열번호 35번 또는 서열번호 36번의 아미노산 서열을 포함하는 것일 수 있다.
이때, 상기 구조식 (III)에서 상기 r이 1인 경우, 상기 제1 단량체는 IL-12 또는 이의 변이체에 항-CD20 항체의 단량체가 결합된 형태일 수 있다.
이때, 상기 구조식 (III)에서 r이 1인 경우, 상기 제1 단량체는 서열번호 272, 서열번호 273, 서열번호 276, 서열번호 277, 서열번호 278, 서열번호 279, 서열번호 282 또는 서열번호 283의 아미노산 서열을 포함하는 것일 수 있다.
이때, 상기 구조식 (IV)에서 r이 1인 경우, 상기 제1 단량체는 서열번호 274, 서열번호 275, 서열번호 280 또는 서열번호 281의 아미노산 서열을 포함하는 것일 수 있다.
일 구체예에 있어서, 상기 r이 1인 경우, 상기 구조식 (III)은 하기 구조식 (III') 및 (III'')를 포함하는 것일 수 있다.
N'-X-[링커(2)]p-Fc 영역 단편 또는 이의 변이체-[링커(3)]q-(T')-C' (III')
N'-(T'')-C' (III'')
이때, 상기 구조식 (III') 및 (III'')에 있어서,
T'은 CD20에 특이적으로 결합하는 항체의 중쇄 영역으로서 가변영역 및 CH1 영역을 포함하거나 또는 항체의 경쇄 영역이고;
T''은 CD20에 특이적으로 결합하는 항체의 경쇄 영역이거나, 또는 항체의 중쇄 영역으로서 가변영역 및 CH1 영역을 포함하며;
이때, T' 및 T''은 결합하여 항체의 가변 영역을 형성하고, 이때, 상기 가변 영역은 CD20에 특이적으로 결합하며;
상기 링커(2) 내지 링커(3)는 펩타이드 링커이며, 상기 p 및 q은 각각 독립적으로 0 또는 1이고, N', X 및 C'는 상기에서 정의한 바와 같다.
일 구체예에 있어서, 상기 r이 1인 경우, 상기 구조식 (IV)는 하기 구조식 (IV') 및 (IV'')를 포함하는 것일 수 있다.
N'-(T')-[링커(2)]q-Fc 영역 단편 또는 이의 변이체-[링커(3)]p-X-C' (IV'); 및
N'-(T'')-C' (IV'')
이때, 상기 구조식 (IV') 및 (IV'')에 있어서,
T'은 CD20에 특이적으로 결합하는 항체의 중쇄 영역으로서 가변영역 및 CH1 영역을 포함하거나, 또는 항체의 경쇄 영역이고;
T''은 CD20에 특이적으로 결합하는 항체의 경쇄 영역이거나, 또는 항체의 중쇄 영역으로서 가변영역 및 CH1 영역을 포함하며;
이때, T' 및 T''은 결합하여 항체의 가변 영역을 형성하고, 이때, 상기 가변 영역은 CD20에 특이적으로 결합하며;
상기 링커(2) 내지 링커(3)는 펩타이드 링커이며, 상기 p 및 q은 각각 독립적으로 0 또는 1이고, N', X 및 C'는 상기에서 정의한 바와 같다.
이때, 상기 제1 단량체는 서열번호 10 및 서열번호 2; 서열번호 11 및 서열번호 2; 서열번호 31 및 서열번호 23; 또는 서열번호 32 및 서열번호 23; 서열번호 274 및 서열번호 2; 서열번호 275 및 서열번호 2; 서열번호 280 및 서열번호 23; 또는 서열번호 281 및 서열번호 23의 아미노산 서열을 포함하는 것일 수 있다.
제2 단량체의 구조
상기 제2 단량체는 CD20에 특이적으로 결합하는 항원 결합 부위를 추가적으로 더 포함하는 것일 수 있다.
일 구체예에 있어서, 상기 제2 단량체는 제1 CD20 결합 부위; 및 제2 CD20 결합 부위를 포함하는 것일 수 있다.
상기 CD20에 특이적으로 결합하는 항원 결합 부위는 Fab, scFv, Fv 또는 이의 단편일 수 있다. 이때, 제1 CD20 결합 부위는 Fab이며, 제2 CD20 결합 부위는 Fv 또는 scFv일 수 있다.
상기 제2 CD20 결합 부위는 제2 단량체의 N 말단 또는 C 말단에 결합하는 것일 수 있다. 구체적으로, 제2 CD20 결합 부위는 중쇄의 C 말단, 경쇄의 C 말단, 가변부위의 N 말단에 추가적으로 결합된 것일 수 있다.
상기 제2 단량체는 하기 구조식 (V)를 포함하는 것일 수 있다.
N'-(R)s-[링커(4)]t-Q-[링커(5)]u-Fc 영역 단편 또는 이의 변이체-[링커(6)]v-(W)a-C' (V)
상기 구조식 (V)에 있어서,
상기 N'은 융합단백질의 N-말단이고, 상기 C'는 융합단백질의 C-말단이며,
상기 R 및 Q는 CD20에 특이적으로 결합하는 항원 결합 부위이고,
상기 W는 CD20에 특이적으로 결합하는 scFv; 또는 구조식 (I) 또는 (II)의 IL-12 또는 이의 변이체이고,
상기 링커(4), 링커(5) 및 링커(6)은 각각 펩타이드 링커이며, 상기 s, t, u, v 및 a는 각각 독립적으로 O 또는 1일 수 있다.
일 구체예에 있어서, 상기 구조식 (V)는 서열번호 1, 서열번호 2, 서열번호 6, 서열번호 7, 서열번호 8, 서열번호 9, 서열번호 12, 서열번호 21, 서열번호 22, 서열번호 23, 서열번호 27, 서열번호 28, 서열번호 29, 서열번호 30, 서열번호 33, 서열번호 42, 서열번호 274, 서열번호 275, 서열번호 280 및 서열번호 281으로 이루어지는 군으로부터 선택된 하나 이상의 아미노산 서열을 포함할 수 있다.
일 구체예에 있어서, 상기 구조식 (V)는 하기 구조식 (V') 및 (V'')을 포함하는 것일 수 있다.
N'-(R')s-[링커(4)]t-Q'-[링커(5)]u-Fc 영역 단편 또는 이의 변이체-[링커(6)]p-(W)a-C' (V')
N'-(R'')s-[링커(4)]t-Q''-[링커(7)]x-(W)b-C' (V'')
상기 구조식 (V') 및 (V'')에 있어서,
R'은 CD20에 특이적으로 결합하는 항체의 중쇄 영역으로서 가변영역 및 CH1 영역을 포함하거나, 또는 항체의 경쇄 영역이고;
R''은 CD20에 특이적으로 결합하는 항체의 경쇄 영역이거나, 또는 항체의 중쇄 영역으로서 가변영역 및 CH1 영역을 포함하며;
이때, R' 및 R''은 결합하여 항체의 가변 영역을 형성하고, 이때, 상기 가변 영역은 CD20에 특이적으로 결합하며;
Q'은 CD20에 특이적으로 결합하는 항체의 중쇄 영역으로서 가변영역 및 CH1 영역을 포함하거나, 또는 항체의 경쇄 영역이고;
Q''은 CD20에 특이적으로 결합하는 항체의 경쇄 영역이거나, 또는 항체의 중쇄 영역으로서 가변영역 및 CH1 영역을 포함하며;
이때, Q' 및 Q''는 결합하여 항체의 가변 영역을 형성하고, 이때, 상기 가변 영역은 CD20에 특이적으로 결합하며,
상기 W는 CD20에 특이적으로 결합하는 scFv; 또는 구조식 (I) 또는 (II)의 IL-12 또는 이의 변이체이고,
상기 링커(4), 링커(5), 링커(6) 및 링커(7)은 각각 펩타이드 링커이며, 상기 s, t, u, x, a 및 b는 각각 독립적으로 O 또는 1일 수 있다.
일 구체예에 있어서, 상기 구조식 (V')는 서열번호 1, 서열번호 6, 서열번호 8, 서열번호 12, 서열번호 21, 서열번호 22, 서열번호 27, 서열번호 29, 서열번호 33, 서열번호 42, 서열번호 274, 서열번호 275, 서열번호 280 또는 서열번호 281일 수 있다.
일 구체예에 있어서, 상기 구조식 (V'')는 서열번호 2, 서열번호 7, 서열번호 9, 서열번호 23, 서열번호 28 또는 서열번호 30일 수 있다.
일 구체예에 있어서, 상기 제2 단량체는 서열번호 113의 아미노산 서열로 이루어진 중쇄 및 서열번호 114의 아미노산 서열로 이루어진 경쇄; 또는 서열번호 121의 아미노산 서열로 이루어진 중쇄 및 서열번호 122의 아미노산 서열로 이루어진 경쇄를 포함하는 것일 수 있다.
또한, W가 scFv인 경우, 상기 W는 서열번호 88 또는 서열번호 89의 아미노산 서열을 가질 수 있다.
펩타이드 링커
본 명세서에서 사용하는 용어, "펩타이드 링커"는 융합 단백질 내에서 도메인과 도메인 사이에 물리 화학적 거리를 두거나, 혹은 연결을 위하여 사용되는 펩타이드이다. 상기 링커는 면역글로불린의 힌지 영역을 포함할 수 있다.
상기 펩타이드 링커(1) 내지 (7)은 아미노산으로 구성된 펩타이드 링커를 의미한다. 구체적으로, 상기 펩타이드 링커(2) 또는 펩타이드 링커(5)는 5 내지 80개의 연속된 아미노산, 7 내지 70개의 연속된 아미노산, 또는 10 내지 60개의 연속된 아미노산, 또는 12 내지 50개의 아미노산으로 이루어질 수 있다. 상기 펩타이드 링커는 (G4S)n(이때, n은 1 내지 10의 정수)을 포함할 수 있다. 이때, (G4S)n에서 n은 각각 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10일 수 있다.
상기 펩타이드 링커(2) 또는 펩타이드 링커(5)는 5 내지 80개의 연속된 아미노산, 7 내지 70개의 연속된 아미노산, 또는 10 내지 60개의 연속된 아미노산, 또는 12 내지 50개의 아미노산으로 이루어질 수 있다. 일 구체예로 펩타이드 링커(2)는 30개의 아미노산으로 이루어질 수 있다. 또한, 펩타이드 링커(2)는 적어도 하나의 시스테인을 포함할 수 있다. 구체적으로, 한 개, 두 개 또는 세 개의 시스테인을 포함할 수 있다. 또한, 상기 펩타이드 링커(2)는 면역글로불린의 힌지에서 유래된 것일 수 있고 (G4S)n(이때, n은 1 내지 10의 정수)을 추가로 더 포함할 수 있다. 구체적으로, 펩타이드 링커(2) 또는 펩타이드 링커(5)는 서열번호 94, 서열번호 95, 서열번호 96, 서열번호 97, 서열번호 98, 서열번호 99, 서열번호 100, 서열번호 101 및 서열번호 102 중 어느 하나의 아미노산 서열로 이루어진 힌지 영역을 포함할 수 있다.
또한, 펩타이드 링커(3), 펩타이드 링커(4), 펩타이드 링커(6) 및 펩타이드 링커(7)은 1 내지 30개의 연속된 아미노산, 5 내지 20개의 연속된 아미노산, 또는 10 내지 15개의 연속된 아미노산으로 이루어질 수 있다. 상기 펩타이드 링커는 (G4S)n(이때, n은 1 내지 10의 정수)을 포함할 수 있다. 이때, (G4S)n에서 n은 각각 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10일 수 있다.
일 구체예에 있어서, 상기 펩타이드 링커(1)은 서열번호 91, 서열번호 92 또는 서열번호 93의 아미노산 서열로 이루어진 펩타이드 링커일 수 있다.
또한, 구체적으로, 상기 펩타이드 링커(2), 펩타이드 링커(3) 또는 펩타이드 링커(5)는 서열번호 91 또는 서열번호 92을 포함할 수 있다.
본 발명의 일 실시예에서 펩타이드 링커(2) 또는 펩타이드 링커 (5)는 서열번호 100 또는 서열번호 102의 아미노산 서열을 포함하는 펩타이드 링커일 수 있다.
Fc 영역 또는 이의 단편
이때, 상술한 면역글로불린 단편은 면역글로불린의 Fc 영역일 수 있다. 상기 면역글로불린의 Fc 영역은 야생형 Fc 도메인뿐만 아니라, Fc 도메인 변이체일 수 있다. 이때, 상기 Fc 영역은 IgG, IgA, IgE, IgD 또는 IgM의 Fc 영역일 수 있으며, 구체적으로, IgG1 또는 IgG2a에서 유래한 것일 수 있다.
본 명세서에서 사용된 용어 "Fc 도메인 변이체"는 야생형 Fc 도메인의 당쇄 형태(glycosylation pattern)와 다르거나, 야생형 Fc 도메인에 비해 증가된 당쇄, 야생형 Fc 도메인에 비해 감소한 당쇄, 또는 당쇄가 제거된(deglycosylated) 형태일 수 있다. 또한 무당쇄(aglycosylated) Fc 도메인도 포함된다. Fc 도메인 혹은 변이체는 배양조건 혹은 호스트의 유전자 조작을 통해 조정된 숫자의 시알산(sialic acid), 퓨코실화(fucosylation), 당화(glycosylation)를 갖도록 한 것일 수 있다.
또한, 화학적 방법, 효소적 방법 및 미생물을 사용한 유전공학적 엔지니어링 방법 등과 같이 통상적인 방법으로 면역글로불린의 Fc 도메인의 당쇄를 변형시킬 수 있다. 또한, 상기 Fc 도메인 변이체는 면역글로불린 IgG, IgA, IgE, IgD 또는 IgM의 Fc 영역이 혼합된 형태일 수 있다. 또한, 상기 Fc 도메인 변이체는 상기 Fc 도메인의 일부 아미노산이 다른 아미노산으로 치환된 형태일 수 있다.
상기 치환 및/또는 부가에 의해 도입되는 "아미노산"은 라이신(K), 알라닌(A), 알지닌(R), 아스파라진(N), 아스파르트산(D), 시스테인(C), 글루타민(Q), 글루탐산(E), 글라이신(G), 히스티딘(H), 이소류신(I), 류신(L), 메티오닌(M), 페닐알라닌(F), 프롤린(P), 세린(S), 트레오닌(T), 트립토판(W), 타이로신(Y) 및 발린(V)으로 구성된 군에서 선택되는 어느 하나일 수 있다.
또한, 상기 Fc 영역은 놉 구조 또는 홀 구조를 포함할 수 있다.
본 명세서에서 사용된 용어 "놉-인투-홀(knob-into-hole)"은 이중특이적 항체, 다중특이적 항체, 또는 이종이량체 항체 등과 같이, 서로 다른 영역에 특이적으로 결합하는 항체를 제조하기 위한 설계 전략이다. 일반적으로, 이러한 기술은 제1 폴리펩티드의 경계면(가령, 제1 항체 중쇄의 제1 CH3 도메인)에 놉(knob)을 그리고 제2 폴리펩티드의 경계면(가령, 제2 항체 중쇄의 제2 CH3 도메인)에 상응하는 홀(hole)을 도입하는 것을 포함하고, 그리하여 놉을 홀 내에 위치시켜 이종이량체 형성을 촉진시키고 동종이량체 형성을 방해하도록 할 수 있다.
'놉'은 제1 폴리펩티드의 경계면(가령, 제1 항체 중쇄의 제1 CH3 도메인)으로부터의 소형 아미노산 측쇄들을 보다 큰 측쇄들(예컨대, 알지닌, 페닐알라닌, 타이로신 또는 트립토판)로 대체함으로써 구축된다. 상기 놉에 동일하거나 유사한 크기의 상보적 '홀'은 제2 폴리펩티드의 경계면(가령, 제2 항체 중쇄의 제2 CH3 도메인)에서 대형 아미노산 측쇄를 보다 작은 측쇄들(예컨대, 알라닌, 세린, 발린, 또는 트레오닌)로 대체함으로써 생성된다. 상기 놉 및 홀은 폴리펩티드를 인코딩하는 핵산을, 예컨대, 부위-특이적 돌연변이 유발에 의해, 또는 펩티드 합성에 의해 변경함으로써 생성될 수 있다.
일 구체예에 있어서, 상기 IgG1의 놉 구조는 서열번호 19 또는 103일 수 있고, 홀 구조는 서열번호 20 또는 104일 수 있다. 상기 놉 구조 또는 홀 구조는 서열번호 284의 아미노산 서열의 146번째, 148번째 및 187번째 아미노산이 다른 아미노산으로 치환된 형태일 수 있다. 구체적으로, 본 발명의 일 실시예에서 놉 구조 또는 홀 구조는 서열번호 284의 아미노산 서열이 T146W, T146S, L148A 및 Y187A로 치환된 형태일 수 있다. 구체적으로, 놉 구조는 T146W로 치환된 형태일 수 있고, 홀 구조는 T146S, L148A 및 Y187V로 치환된 형태일 수 있다.
한편, 본 발명의 일 실시예에서 IgG2a의 놉 구조는 서열번호 40 또는 105일 수 있고, 홀 구조는 서열번호 41 또는 106일 수 있다. 상기 놉 구조 또는 홀 구조는 서열번호 285의 아미노산 서열의 152번째, 154번째 및 193번째 아미노산이 다른 아미노산으로 치환된 형태일 수 있다. 구체적으로, 본 발명의 일 실시예에서 놉 구조 또는 홀 구조는 서열번호 285의 아미노산 서열이 T152W 또는 T152S, M154A 및 Y193V로 치환된 형태일 수 있다. 구체적으로, 놉 구조는 T152W로 치환된 형태일 수 있고, 홀 구조는 T152S, M154A 및 Y193V으로 치환된 형태일 수 있다.
일 구체예에 있어서, 상기 Fc 도메인 변이체는 DANG 변이 또는 NG 변이를 포함하는 것일 수 있다. 이때, "DANG 변이"는 인간 IgG1 또는 마우스 IgG2a 내의 효과기 기능을 제거하기 위한 D265A/N297G 돌연변이를 지칭한다.
IgG 분자에서 상기 Fc 영역이 매개하는 효과기 기능은 C1q 결합, 보체 의존성 세포독성, Fc 수용체 결합, 항체 의존성 세포 매개의 세포독성(ADCC), 식균작용, 세포 표면 수용체(예컨대, B 세포 수용체, BCR)의 저하 조절 등을 포함한다. 이러한 효과기 기능은 일반적으로 Fc 영역을 결합 도메인(예컨대, 항체 가변 도메인)과 결합시키는 것을 필요로 한다.
비변이 Fc 영역의 아미노산 서열의 치환으로 효과기 기능을 변화시킬 수 있으며, 효과기 기능이 변화된 Fc 영역은 예를 들어 C1q 결합 및/또는 FcR 결합을 변형시켜 이에 따라 CDC 활성 및/또는 ADCC 활성을 변화시킴으로써 설계할 수 있다. 즉, 상기 'DANG 변이'는 항체 제조시 원하지 않는 효과기 작용이 발생하지 않도록 IgG 분자에서 상기 Fc 영역이 매개하는 효과기 기능을 제거함을 의미한다.
일 실시예에 있어서, 상기 DANG 변이는 서열번호 104의 인간 IgG1 내 아미노산이 D45A/N77G로 치환된 형태일 수 있다. 또한, 서열번호 106의 마우스 IgG2a 내 아미노산이 D51A/N83G로 치환된 형태일 수 있다.
융합단백질의 구조
상기 융합단백질은 항체일 수 있다. 구체적으로, 상기 항체는 놉-인투-홀 구조를 포함하는 헤테로다이머 항체일 수 있다.
상기 융합단백질은 구조식 (III) 및 구조식 (V); 또는 구조식 (IV) 및 구조식 (V)를 포함하는 것일 수 있다.
보다 구체적으로, 상기 융합단백질의 일 구체예는 하기 (i) 또는 (ii)의 제1 단량체; 및 하기 (iii), (iv), (v) 또는 (vi)의 제2 단량체를 포함할 수 있다:
제1 단량체의 예시:
(i) r이 0인 경우의 구조식 (III)
(ii) r이 1인 경우의 구조식 (IV)
제2 단량체의 예시:
(iii) s, a 및 b가 0인 구조식 (V') 및 구조식 (V'')
(iv) s는 1이고, a 및 b가 0인 구조식 (V') 및 구조식 (V'')
(v) s 및 b는 0이고, a는 1인 구조식 (V') 및 구조식 (V'')
(vi) b는 1이고, s 및 a가 0인 구조식 (V') 및 구조식 (V'').
일 구체예에 있어서, 상기 융합단백질은 상기 (i)을 포함하는 제1 단량체; 및 상기 (iii)을 포함하는 제2 단량체를 포함할 수 있다(도 31의 왼쪽으로부터 첫번째). 이때, 상기 융합단백질은 서열번호 1, 서열번호 2, 서열번호 3, 서열번호 4, 서열번호 5, 서열번호 12, 서열번호 13, 서열번호 14, 서열번호 22, 서열번호 23, 서열번호 24, 서열번호 25, 서열번호 26, 서열번호 33, 서열번호 34 및 서열번호 35으로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 아미노산 서열을 포함하는 것일 수 있다. 구체적으로, 상기 융합단백질은 서열번호 1, 서열번호 2 및 서열번호 3; 서열번호 1, 서열번호 2 및 서열번호 4; 서열번호 1, 서열번호 2 및 서열번호 5; 서열번호 2, 서열번호 12 및 서열번호 13; 서열번호 2, 서열번호 12 및 서열번호 14; 서열번호 22, 서열번호 23 및 서열번호 24; 서열번호 22, 서열번호 23 및 서열번호 25; 서열번호 22, 서열번호 23 및 서열번호 26; 서열번호 23, 서열번호 33 및 서열번호 34; 또는 서열번호 23, 서열번호 33 및 서열번호 35을 포함하는 것일 수 있다.
일 구체예에 있어서, 상기 융합단백질은 상기 (i)을 포함하는 제1 단량체; 및 상기 (iv)를 포함하는 제2 단량체를 포함할 수 있다(도 31의 왼쪽으로부터 두번째). 이때, 상기 융합단백질은 서열번호 3, 서열번호 5, 서열번호 6, 서열번호 7, 서열번호 24, 서열번호 26, 서열번호 27 및 서열번호 28로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 아미노산 서열을 포함하는 것일 수 있다. 구체적으로, 상기 융합단백질은 서열번호 3, 서열번호 6 및 서열번호 7; 서열번호 5, 서열번호 6 및 서열번호 7; 서열번호 24, 서열번호 27 및 서열번호 28; 또는 서열번호 26, 서열번호 27 및 서열번호 28을 포함하는 것일 수 있다.
일 구체예에 있어서, 상기 융합단백질은 상기 (i)을 포함하는 제1 단량체; 및 상기 (v)를 포함하는 제2 단량체를 포함할 수 있다(도 31의 왼쪽으로부터 세번째). 이때, 상기 융합단백질은 서열번호 2, 서열번호 3, 서열번호 5, 서열번호 8, 서열번호 23, 서열번호 24, 서열번호 26 및 서열번호 29로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 아미노산 서열을 포함하는 것일 수 있다. 구체적으로, 상기 융합단백질은 서열번호 2, 서열번호 3 및 서열번호 8; 서열번호 2, 서열번호 5 및 서열번호 8; 서열번호 23, 서열번호 24 및 서열번호 29; 또는 서열번호 23, 서열번호 26 및 서열번호 29을 포함하는 것일 수 있다.
일 구체예에 있어서, 상기 융합단백질은 상기 (i)을 포함하는 제1 단량체; 및 상기 (vi)을 포함하는 제2 단량체를 포함할 수 있다(도 31의 왼쪽으로부터 네번째). 이때, 상기 융합단백질은 서열번호 1, 서열번호 3, 서열번호 5, 서열번호 9, 서열번호 22, 서열번호 24, 서열번호 26 및 서열번호 30으로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 아미노산 서열을 포함하는 것일 수 있다. 구체적으로, 상기 융합단백질은 서열번호 1, 서열번호 3 및 서열번호 9; 서열번호 1, 서열번호 5 및 서열번호 9; 서열번호 22, 서열번호 24 및 서열번호 30; 또는 서열번호 22, 서열번호 26 및 서열번호 30을 포함하는 것일 수 있다.
일 구체예에 있어서, 상기 융합단백질은 상기 (ii)을 포함하는 제1 단량체; 및 상기 (iii)을 포함하는 제2 단량체를 포함할 수 있다(도 31의 왼쪽으로부터 다섯번째). 이때, 상기 융합단백질은 서열번호 1, 서열번호 2, 서열번호 10, 서열번호 11, 서열번호 22, 서열번호 23, 서열번호 31 및 서열번호 32으로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 아미노산 서열을 포함하는 것일 수 있다. 구체적으로, 상기 융합단백질은 서열번호 1, 서열번호 2 및 서열번호 10; 서열번호 1, 서열번호 2 및 서열번호 11; 서열번호 22, 서열번호 23 및 서열번호 31; 또는 서열번호 22, 서열번호 23 및 서열번호 32를 포함하는 것일 수 있다.
또한, 일 구체예에 있어서, IL-12 또는 이의 변이체 및 CD20에 특이적으로 결합하는 항원 결합 부위를 포함하는 융합단백질 이량체는 상기 구조식 (III)의 단량체 및 상기 구조식 (V)의 단량체를 포함하는 융합단백질 이량체일 수 있다(도 32의 왼쪽). 이때, 상기 상기 구조식 (III)에서 r은 1이고, 상기 구조식 (V)에서 s, a 및 t는 0이다. 이때, 상기 구조식 (V)는 (V') 및 (V'')를 포함할 수 있다. 이때, 상기 (V') 및 (V'')에서 s, a, t 및 b는 0이다. 또한, 상기 이량체의 Fc 영역은 놉-인투-홀 구조를 가지며, 이러한 구조를 통해 서로 상이한 융합단백질이 결합될 수 있다.
구체적으로, 상기 융합단백질은 서열번호 1, 서열번호 2, 서열번호 22, 서열번호 23, 서열번호 272, 서열번호 273, 서열번호 278 및 서열번호 279로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 아미노산 서열을 포함하는 것일 수 있다. 구체적으로, 상기 융합단백질은 서열번호 1, 서열번호 2 및 서열번호 272; 서열번호 1, 서열번호 2 및 서열번호 273; 서열번호 22, 서열번호 23 및 서열번호 278; 또는 서열번호 22, 서열번호 23 및 서열번호 279를 포함하는 것일 수 있다.
또한, IL-12 또는 이의 변이체 및 CD20에 특이적으로 결합하는 항원 결합 부위를 포함하는 융합단백질 이량체는 상기 구조식 (V)의 구조를 포함하는 융합단백질 이량체일 수 있다(도 32의 가운데). 이때, 상기 융합단백질 이량체는 (V') 및 (V'')를 포함할 수 있다. 이때, 상기 구조식 (V)에서 s 및 t는 0, a는 1이다. 또한, 상기 (V') 및 (V'')에서 s, t 및 b는 0, a는 1이다. 또한, 상기 융합단백질 이량체는 상기 구조식 (IV)의 구조를 포함하는 융합단백질 이량체일 수 있다. 이때, 상기 구조식 (IV)에서 r은 1이다.
구체적으로, 상기 융합단백질은 서열번호 2, 서열번호 23, 서열번호 274, 서열번호 275, 서열번호 280 및 서열번호 281으로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 아미노산 서열을 포함하는 것일 수 있다. 구체적으로, 상기 융합단백질은 서열번호 2 및 서열번호 274; 서열번호 2 및 서열번호 275; 서열번호 23 및 서열번호 280 또는 서열번호 23 및 서열번호 281을 포함하는 것일 수 있다.
일 구체예에 있어서, IL-12 또는 이의 변이체 및 CD20에 특이적으로 결합하는 항원 결합 부위를 포함하는 융합단백질 이량체는 상기 구조식 (III)의 구조를 포함하는 융합단백질 이량체일 수 있다(도 32의 오른쪽). 이때, 상기 구조식 (III)에서 r은 1이다.
구체적으로, 상기 융합단백질은 서열번호 276, 서열번호 277, 서열번호 282 또는 서열번호 283을 포함하는 것일 수 있다.
본원 다중 특이적 융합 단백질은 화학적으로 변형된 형태일 수 있다. 일 실시예에서, 상기 융합 단백질은 글리코실화, 아세틸화, 페길화, 인산화, 아미드화, 공지된 보호기/차단기에 의한 유도체화, 단백질 분해 절단 및/또는 세포 리간드 또는 다른 단백질을 결합하여 화학적으로 변형될 수 있다. 이처럼 수많은 화학적 변형은 알려진 기술에 의해 수행될 수 있다.
융합단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드
본 발명의 다른 측면은, 상기 제1 단량체를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 또는 상기 제2 단량체를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 제공한다.
일 구체예에 있어서, 상기 제1 단량체의 폴리펩티드는 서열번호 3, 서열번호 4, 서열번호 5, 서열번호 10, 서열번호 11, 서열번호 13, 서열번호 14, 서열번호 15, 서열번호 24, 서열번호 25, 서열번호 26, 서열번호 31, 서열번호 32, 서열번호 34, 서열번호 35, 서열번호 36, 서열번호 272, 서열번호 273, 서열번호 274, 서열번호 275, 서열번호 276, 서열번호 277, 서열번호 278, 서열번호 279, 서열번호 280, 서열번호 281, 서열번호 282, 또는 서열번호 283과 적어도 약 70%, 적어도 약 75%, 적어도 약 80%, 적어도 약 85%, 적어도 약 86%, 적어도 약 87%, 적어도 약 88%, 적어도 약 89%, 적어도 약 90%, 적어도 약 91%, 적어도 약 92%, 적어도 약 93%, 적어도 약 94%, 적어도 약 95%, 적어도 약 96%, 적어도 약 97%, 적어도 약 98%, 적어도 약 99%, 또는 적어도 약 100%의 동일성을 가지는 아미노산 서열을 포함할 수 있다.
일 구체예에 있어서, 상기 제1 단량체를 코딩하는 폴리뉴클레오티드는 서열번호 45, 서열번호 46, 서열번호 47, 서열번호 52, 서열번호 53, 서열번호 55, 서열번호 56, 서열번호 57, 서열번호 66, 서열번호 67, 서열번호 68, 서열번호 73, 서열번호 74, 서열번호 76, 서열번호 77, 서열번호 78과 적어도 약 70%, 적어도 약 75%, 적어도 약 80%, 적어도 약 85%, 적어도 약 86%, 적어도 약 87%, 적어도 약 88%, 적어도 약 89%, 적어도 약 90%, 적어도 약 91%, 적어도 약 92%, 적어도 약 93%, 적어도 약 94%, 적어도 약 95%, 적어도 약 96%, 적어도 약 97%, 적어도 약 98%, 적어도 약 99%, 또는 적어도 약 100%의 동일성을 가지는 것일 수 있다.
일 구체예에 있어서, 상기 제2 단량체의 폴리펩티드는 서열번호 1, 서열번호 2, 서열번호 6, 서열번호 7, 서열번호 8, 서열번호 9, 서열번호 12, 서열번호 21, 서열번호 22, 서열번호 23, 서열번호 27, 서열번호 28, 서열번호 29, 서열번호 30, 서열번호 33, 서열번호 42, 서열번호 274, 서열번호 275, 서열번호 280 또는 서열번호 281와 약 70%, 적어도 약 75%, 적어도 약 80%, 적어도 약 85%, 적어도 약 86%, 적어도 약 87%, 적어도 약 88%, 적어도 약 89%, 적어도 약 90%, 적어도 약 91%, 적어도 약 92%, 적어도 약 93%, 적어도 약 94%, 적어도 약 95%, 적어도 약 96%, 적어도 약 97%, 적어도 약 98%, 적어도 약 99%, 또는 적어도 약 100%의 동일성을 가지는 아미노산 서열을 포함할 수 있다.
일 구체예에 있어서, 상기 제2 단량체를 코딩하는 폴리뉴클레오티드는 서열번호 43, 서열번호 44, 서열번호 48, 서열번호 49, 서열번호 50, 서열번호 51, 서열번호 54, 서열번호 63, 서열번호 64, 서열번호 65, 서열번호 69, 서열번호 70, 서열번호 71, 서열번호 72, 서열번호 75, 서열번호 84와 적어도 약 70%, 적어도 약 75%, 적어도 약 80%, 적어도 약 85%, 적어도 약 86%, 적어도 약 87%, 적어도 약 88%, 적어도 약 89%, 적어도 약 90%, 적어도 약 91%, 적어도 약 92%, 적어도 약 93%, 적어도 약 94%, 적어도 약 95%, 적어도 약 96%, 적어도 약 97%, 적어도 약 98%, 적어도 약 99%, 또는 적어도 약 100%의 동일성을 가지는 것일 수 있다.
상기 폴리뉴클레오티드는 신호서열(Signal sequence) 또는 리더 서열(Leader sequence)을 코딩하는 핵산을 추가적으로 포함할 수 있다. 본 명세서에서 사용한 용어 "신호서열"은 목적 단백질의 분비를 지시하는 신호펩타이드를 의미한다. 상기 신호펩타이드는 숙주 세포에서 번역된 후에 절단된다. 구체적으로, 상기 신호서열은 ER(Endoplasmic reticulum) 막을 관통하는 단백질의 이동을 개시하는 아미노산 서열이다.
상기 신호서열은 당업계에 그 특징이 잘 알려져 있으며, 통상 16 내지 30개의 아미노산 잔기를 포함하나, 그보다 더 많거나 적은 아미노산 잔기를 포함할 수 있다. 통상적인 신호 펩타이드는 기본 N-말단 영역, 중심의 소수성 영역, 및 보다 극성인(polar) C-말단 영역의 세 영역으로 구성된다. 중심 소수성 영역은 미성숙 폴리펩타이드가 이동하는 동안 막지질 이중층을 통하여 신호서열을 고정시키는 4 내지 12개의 소수성 잔기를 포함한다.
개시 이후에, 신호서열은 흔히 신호 펩티다아제(Signal peptidase)로 알려진 세포 효소에 의하여 ER의 루멘(Lumen) 내에서 절단된다. 이때, 상기 신호서열은 tPa(Tissue Plasminogen Activation), HSV gDs(Signal sequence of Herpes simplex virus glycoprotein D), 또는 성장 호르몬(Growth hormone)의 분비신호서열일 수 있다. 바람직하게, 포유동물 등을 포함하는 고등 진핵 세포에서 사용되는 분비 신호서열을 사용할 수 있다. 또한, 상기 신호서열은 야생형 신호서열을 사용하거나, 숙주세포에서 발현 빈도가 높은 코돈으로 치환하여 사용할 수 있다.
폴리뉴클레오티드가 적재된 벡터
본 발명의 다른 측면은, 상기 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터를 제공한다.
상기 벡터는 숙주 세포에 도입되어 숙주 세포 유전체 내로 재조합 및 삽입될 수 있다. 또는 상기 벡터는 에피좀으로서 자발적으로 복제될 수 있는 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하는 핵산 수단으로 이해된다. 상기 벡터는 선형 핵산, 플라스미드, 파지미드, 코스미드, RNA 벡터, 바이러스 벡터 및 이의 유사체들을 포함한다. 바이러스 벡터의 예로는 레트로바이러스, 아데노바이러스, 및 아데노-관련 바이러스를 포함하나 이에 제한되지 않는다.
구체적으로, 상기 벡터는 플라스미드 DNA, 파아지 DNA 등이 될 수 있고, 상업적으로 개발된 플라스미드(pUC18, pBAD, pIDTSAMRT-AMP 등), 대장균 유래 플라스미드(pYG601BR322, pBR325, pUC118, pUC119 등), 바실러스 서브틸리스 유래 플라스미드(pUB110, pTP5 등), 효모-유래 플라스미드(YEp13, YEp24, YCp50 등), 파아지 DNA(Charon4A, Charon21A, EMBL3, EMBL4, λgt10, λgt11, λZAP 등), 동물 바이러스 벡터(레트로바이러스(Retrovirus), 아데노바이러스(Adenovirus), 백시니아 바이러스(Vaccinia virus) 등), 곤충 바이러스 벡터(배큘로바이러스(Baculovirus) 등)이 될 수 있다. 상기 벡터는 숙주 세포에 따라서 단백질의 발현량과 수식 등이 다르게 나타나므로, 목적에 가장 적합한 숙주세포를 선택하여 사용함이 바람직하다.
본 명세서에서 사용된 용어, 목적 단백질의 "유전자 발현" 또는 "발현"은, DNA 서열의 전사, mRNA 전사체의 번역 및 융합단백질 생산물 또는 이의 단편의 분비를 의미하는 것으로 이해된다. 유용한 발현 벡터는 RcCMV(Invitrogen, Carlsbad) 또는 이의 변이체일 수 있다. 상기 발현 벡터는 포유류 세포에서 목적 유전자의 연속적인 전사를 촉진하기 위한 인간 CMV(Cytomegalovirus) 프로모터, 및 전사 후 RNA의 안정상태 수준을 높이기 위한 우태 성장 인자(Bovine growth hormone) 폴리아데닐레이션 신호서열을 포함할 수 있다.
융합단백질을 발현하는 형질전환 세포
본 발명의 다른 측면은, 상기 벡터가 도입된 형질전환 세포를 제공한다.
상기 형질전환 세포의 숙주세포로서, 원핵세포, 진핵세포, 포유동물, 식물, 곤충, 균류 또는 세포성 기원의 세포를 포함할 수 있지만 이에 한정되지 않는다. 상기 원핵세포의 일 예로는 대장균을 사용할 수 있다. 또한, 진핵세포의 일 예로는 효모를 사용할 수 있다. 또한, 상기 포유동물 세포로 CHO 세포, F2N 세포, CSO 세포, BHK 세포, 바우스(Bowes) 흑색종 세포, HeLa 세포, 911 세포, AT1080 세포, A549 세포, HEK293 세포 또는 HEK293T 세포 등을 사용할 수 있으나, 이에 한정되지 않으며, 당업자에게 알려진 포유동물 숙주세포로 사용 가능한 세포는 모두 이용 가능하다.
또한, 숙주세포로 발현벡터를 도입하는 경우, CaCl2 침전법, CaCl2 침전법에 DMSO(Dimethyl sulfoxide)라는 환원물질을 사용함으로써 효율을 높인 Hanahan 방법, 전기천공법(Electroporation), 인산칼슘 침전법, 원형질 융합법, 실리콘 카바이드 섬유를 이용한 교반법, 아그로박테리아 매개된 형질전환법, PEG를 이용한 형질전환법, 덱스트란 설페이트, 리포펙타민 및 건조/억제 매개된 형질전환 방법 등이 사용될 수 있다.
전술한 바와 같이, 융합단백질의 치료제로서의 특성을 최적하거나 기타 다른 목적을 위해 호스트 세포가 갖고 있는 당화(Glycosylation) 관련 유전자를 당업자에게 알려져 있는 방법을 통해 조작하여 융합단백질의 당쇄 패턴(예를 들어, 시알산, 퓨코실화, 당화)을 조정할 수 있다.
융합단백질의 생산방법
본 발명의 다른 측면은, i) 상기 형질전환 세포를 배양하는 단계; 및 ii) 제1 단량체 및 제2 단량체를 포함하는 융합단백질을 회수하는 단계를 포함하는 융합단백질의 생산방법을 제공한다.
상기 형질전환 세포를 배양하는 방법은 당업계에 널리 알려져 있는 방법을 이용하여 수행할 수 있다. 구체적으로, 상기 배양은 배치 공정 또는 주입 배치 또는 반복 주입 배치 공정(Fed batch 또는 Repeated fed batch process)에서 연속식으로 배양할 수 있다.
융합단백질의 용도
본 발명의 다른 측면은, 상기 융합단백질을 유효성분으로 포함하는 암 예방 또는 치료용 약학 조성물을 제공한다.
이때, 상기 암은 위암, 간암, 폐암, 대장암, 유방암, 전립선암, 피부암, 골암, 다발성골수종, 신경교종, 난소암, 췌장암, 자궁경부암, 갑상선암, 후두암, 급성 골수성 백혈병, 만성 골수성 백혈병, 급성 림프모구성 백혈병, 만성 림프모구성 백혈병, 뇌종양, 신경모세포종, 망막 모세포종, 두경부암, 침샘암 및 림프종으로 구성된 군에서 선택되는 어느 하나일 수 있다.
상기 약학 조성물의 바람직한 투여량은 환자의 상태 및 체중, 질병의 정도, 약물형태, 투여경로 및 기간에 따라 다르지만, 당업자에 의해 적절하게 선택될 수 있다. 본 발명의 종양 치료용 또는 예방용 약학 조성물에서 그 유효성분은 종양 치료 활성을 나타내거나, 특히, 암에 치료 효과를 나타낼 수 있는 한, 용도, 제형, 배합 목적 등에 따라 임의의 양(유효량)으로 포함될 수 있는데, 통상적인 유효량은 조성물 전체 중량을 기준으로 할 때 0.001 중량% 내지 20.0 중량% 범위 내에서 결정될 것이다. 여기서 "유효량"이란 질환의 상태 개선 또는 치료(treatment) 효과, 특히 암의 상태 개선 또는 치료 효과를 유도할 수 있는 유효성분의 양을 말한다. 이러한 유효량은 당업자의 통상의 능력 범위 내에서 실험적으로 결정될 수 있다.
본 명세서에서 사용된 용어, "치료"는 치료학적 처리 및 예방적 처리를 모두 포함하는 의미로 사용될 수 있다. 이때, 예방은 개체의 병리학적 상태 또는 질환을 완화시키거나 감소시키는 의미로 사용될 수 있다. 일 구체예에서, 용어 "치료"는 인간을 포함한 포유류에서 질환을 치료하기 위한 적용이나 어떠한 형태의 투약을 모두 포함한다. 또한, 상기 용어는 질환의 진행을 억제하거나 늦추는 것을 포함하며; 손상되거나, 결손된 기능을 회복시키거나, 수리하여, 질환을 부분적이거나 완전하게 완화시키거나; 또는 비효율적인 프로세스를 자극하거나; 심각한 질환을 완화하는 의미를 포함한다.
생체이용률과 같은 약동학적 파라미터(Pharmacokinetic parameters) 및 클리어런스율(clearance rate)과 같은 기본적인 파라미터(underlying parameters)도 효능에 영향을 줄 수 있다. 따라서, "향상된 효능" (예를 들어, 효능의 개선)은 향상된 약동학적 파라미터 및 향상된 효능에 기인할 수 있으며, 시험 동물 또는 인간 대상체에서 클리어런스율 및 종양 치료 또는 개선과 같은 파라미터를 비교하여 측정될 수 있다.
여기서 "치료학적으로 유효한 양" 또는 "약학적으로 유효한 양"이란 대상 질환을 예방 또는 치료하는데 유효한 화합물 또는 조성물의 양으로서, 의학적 치료에 적용 가능한 합리적인 수혜/위험 비율로 질환을 치료하기에 충분하며 부작용을 일으키지 않을 정도의 양을 의미한다. 상기 유효량의 수준은 환자의 건강상태, 질환의 종류, 중증도, 약물의 활성, 약물에 대한 민감도, 투여 방법, 투여 시간, 투여 경로 및 배출 비율, 치료 기간, 배합 또는 동시 사용되는 약물을 포함한 요소 및 기타 의학 분야에 잘 알려진 요소에 따라 결정될 수 있다. 일 구체예에서 치료학적으로 유효한 양은 암을 치료하는데 효과적인 약물의 양을 의미한다.
이때, 상기 약학 조성물은 약학적으로 허용 가능한 담체를 더 포함할 수 있다. 상기 약학적으로 허용 가능한 담체는 환자에게 전달하기에 적절한 비-독성 물질이면 어떠한 담체라도 가능하다. 증류수, 알코올, 지방, 왁스 및 비활성 고체가 담체로 포함될 수 있다. 약물학적으로 허용되는 애쥬번트(완충제, 분산제) 또한 약학 조성물에 포함될 수 있다.
구체적으로, 상기 약학 조성물은 유효성분 이외에 약제학적으로 허용되는 담체를 포함하여 당업계에 공지된 통상의 방법으로 투여 경로에 따라 비경구용 제형으로 제조될 수 있다. 여기서 "약제학적으로 허용되는" 의미는 유효성분의 활성을 억제하지 않으면서 적용(처방) 대상이 적응 가능한 이상의 독성을 지니지 않는다는 의미이다.
상기 약학 조성물이 비경구용 제형으로 제조될 경우, 적합한 담체와 함께 당업계에 공지된 방법에 따라 주사제, 경피 투여제, 비강 흡입제 및 좌제의 형태로 제제화될 수 있다. 주사제로 제제화할 경우 적합한 담체로서는 멸균수, 에탄올, 글리세롤이나 프로필렌 글리콜 등의 폴리올 또는 이들의 혼합물을 사용할 수 있으며, 바람직하게는 링거 용액, 트리에탄올 아민이 함유된 PBS(phosphate buffered saline)나 주사용 멸균수, 5% 덱스트로스 같은 등장 용액 등을 사용할 수 있다. 약제학적 조성물의 제제화와 관련하여서는 당업계에 공지되어 있으며, 구체적으로 문헌[Remington's Pharmaceutical Sciences(19th ed., 1995)] 등을 참조할 수 있다. 상기 문헌은 본 명세서의 일부로서 간주된다.
상기 약학 조성물의 바람직한 투여량은 환자의 상태, 체중, 성별, 연령, 환자의 중증도, 투여 경로에 따라 1일 0.01 ㎍/㎏ 내지 10 g/㎏ 범위, 또는 0.01 ㎎/㎏ 내지 1 g/㎏ 범위일 수 있다. 투여는 1일 1회 또는 수회로 나누어 이루어질 수 있다. 이러한 투여량은 어떠한 측면으로든 본원 발명의 범위를 제한하는 것으로 해석되어서는 아니 된다.
상기 약학 조성물이 적용(처방)될 수 있는 대상은 포유동물 및 인간이며, 특히 인간인 경우가 바람직하다. 본원의 약학 조성물은 유효성분 이외에, 종양 치료 효과를 갖는 것으로 공지된 임의의 화합물이나 천연 추출물을 추가로 포함할 수 있다.
본 발명의 다른 측면은, 암을 치료하기 위한 IL-12 또는 이의 변이체를 포함하는 제1 단량체; 및 CD20에 특이적으로 결합하는 항원 결합 부위를 포함하는 제2 단량체를 포함하는 융합단백질의 용도를 제공한다.
본 발명의 다른 측면은, 암을 치료하기 위한 약을 제조하기 위한 IL-12 또는 이의 변이체를 포함하는 제1 단량체; 및 CD20에 특이적으로 결합하는 항원 결합 부위를 포함하는 제2 단량체를 포함하는 융합단백질의 용도를 제공한다.
본 발명의 또 다른 측면은, IL-12 또는 이의 변이체를 포함하는 제1 단량체; 및 CD20에 특이적으로 결합하는 항원 결합 부위를 포함하는 제2 단량체를 포함하는 융합단백질을 개체에 투여하는 단계를 포함하는 암을 치료 또는 예방하는 방법을 제공한다.
이때, 상기 개체는 암에 걸린 개체일 수 있다. 또한 상기 개체는 포유동물일 수 있으며, 바람직하게는 인간일 수 있다.
상기 융합단백질 또는 융합단백질 이량체의 투여경로, 투여량 및 투여횟수는 환자의 상태 및 부작용의 유무에 따라 다양한 방법 및 양으로 대상에게 투여될 수 있고, 최적의 투여방법, 투여량 및 투여횟수는 통상의 기술자가 적절한 범위로 선택할 수 있다. 또한, 상기 융합 단백질 또는 융합단백질 이량체는 치료하고자 하는 질환에 대하여 치료효과가 공지된 다른 약물 또는 생리학적 활성물질과 병용하여 투여되거나, 다른 약물과의 조합 제제 형태로 제형화될 수 있다.
이하, 본원 발명을 하기 실시예에 의하여 더욱 상세하게 설명한다. 단, 하기 실시예는 본원 발명을 예시하기 위한 것일 뿐, 본원 발명의 범위가 한정되는 것은 아니다.
준비예 1. anti-CD20/IL-12 IgG1 인간 버전 융합단백질의 개요
Code Format Description 해당서열
T2.01 K&H anti-hu CD20/hu IL-12, hu IgG1 seq1, seq2, seq3
T2.02 K&H anti-hu CD20/hu IL-12 mut1, hu IgG1 seq1, seq2, seq4
T2.03 K&H anti-hu CD20/hu IL-12 mut2, hu IgG1 seq1, seq2, seq5
T2.04 K&H anti-hu CD20/hu IL-12, hu IgG1 (2+1) seq3, seq6, seq7
T2.05 K&H anti-hu CD20/hu IL-12 mut2, hu IgG1 (2+1) seq5, seq6, seq7
T2.06 K&H anti-hu CD20/hu IL-12, hu IgG1 (2+1, HC scFv) seq2, seq3, seq8
T2.07 K&H anti-hu CD20/hu IL-12 mut2, hu IgG1 (2+1, HC scFv) seq2, seq5, seq8
T2.08 K&H anti-hu CD20/hu IL-12, hu IgG1 (2+1, LC scFv) seq1, seq3, seq9
T2.09 K&H anti-hu CD20/hu IL-12 mut2, hu IgG1 (2+1, LC scFv) seq1, seq5, seq9
T2.10 K&H anti-hu CD20/anti-hu CD20-hu IL-12, hu IgG1 (2+1) seq1, seq2, seq10
T2.11 K&H anti-hu CD20/anti-hu CD20-hu IL-12 mut2, hu IgG1 (2+1) seq1, seq2, seq11
T2.12 K&H anti-hu CD20/hu IL-12 mut1, hu IgG1 DANG seq2, seq12, seq14
T2.13 K&H null/hu IL-12, hu IgG1 DANG seq13, seq19
T2.14 K&H null/hu IL-12 mut1, hu IgG1 DANG seq14, seq19
T2.15 Fc-fusion hu IL-12 mut2, huIgG1 seq15
T2.16 K&H anti-hu FAP/hu IL-12 mut1, hu IgG1 seq4, seq16, seq17
T2.17 K&H anti-hu FAP/null, hu IgG1 DANG seq17, seq18, seq20
Rituximab Mab anti-hu CD20 (Rituximab) seq2, seq21
T2.18 K&H anti-hu CD20/hu IL-12-anti-hu CD20 scFv, hu IgG1 (2+1) seq1, seq2, seq272
T2.19 K&H anti-hu CD20/hu IL-12 mut2-anti-hu CD20 scFv, hu IgG1 (2+1) seq1, seq2, seq273
T2.20 Fc-fusion anti-hu CD20-hu IL-12, hu IgG1 seq2, seq274
T2.21 Fc-fusion anti-hu CD20-hu IL-12 mut2, hu IgG1 seq2, seq275
T2.22 Fc-fusion hu IL-12-anti-hu CD20 scFv, hu IgG1 Seq276
T2.23 Fc-fusion hu IL-12 mut2-anti-hu CD20 scFv, hu IgG1 Seq277
[seq1]은 인간 항-CD20(anti-CD20) 중쇄 가변영역 서열과 T366W 변이로 놉 구조를 형성한 인간 IgG1 Fc로 구성된다.
[seq2]는 인간 항-CD20(anti-CD20) 경쇄 서열로 구성된다.
[seq3]은 인간 IL-12 p40(베타) 영역 서열과 링커 GGGGSGGGGSGGGGS, 인간 인터루킨 12 p35(알파) 영역 서열, 링커 GGGGSGGGGS와 T366S, L368A 및 Y407V 변이로 홀 구조를 형성한 인간 IgG1 Fc로 구성된다.
[seq4]는 인간 IL-12 p40(베타) 영역에서 헤파린 결합에 관여하는 아미노산 280번, 285번 라이신(K)을 알라닌(A)으로 변이한 서열, 링커 GGGGSGGGGSGGGGS, 인간 IL-12 p35(알파) 영역 서열, 링커 GGGGSGGGGS 및 인간 IgG1 Fc hole로 구성된다.
[seq5]는 인간 IL-12 p40(베타) 영역에서 헤파린 결합에 관여하는 아미노산 280번, 282번, 285번, 286번 라이신(K)을 알라닌(A)으로 변이한 서열, 링커 GGGGSGGGGSGGGGS, 인간 IL-12 p35(알파) 영역 서열, 링커 GGGGSGGGGS 및 인간 IgG1 Fc hole로 구성된다.
[seq6]은 인간 항-CD20(anti-CD20) 중쇄 가변영역 서열, 링커 GGGGSGGGGSGGGGS, 인간 항-CD20(anti-CD20) 중쇄 가변영역 서열 및 인간 IgG1 Fc knob으로 구성된다.
[seq7]은 인간 항-CD20(anti-CD20) 경쇄 가변영역 서열, 링커 GGGGSGGGGSGGGGS, 인간 항-CD20(anti-CD20) 경쇄 서열로 구성된다.
[seq8]은 인간 항-CD20(anti-CD20) 중쇄 가변영역 서열과 인간 IgG1 Fc knob, 링커 GGGGSGGGGSGGGGS, 인간 항-CD20(anti-CD20) 중쇄 가변영역 서열, 링커 GGGGSGGGGSGGGGSGGGGS 및 인간 항-CD20(anti-CD20) 경쇄 가변영역 서열로 구성된다.
[seq9]는 인간 항-CD20(anti-CD20) 경쇄 서열, 링커 GGGGSGGGGSGGGGS, 인간 항-CD20(anti-CD20) 중쇄 가변영역 서열, 링커 GGGGSGGGGSGGGGSGGGGS 및 인간 항-CD20(anti-CD20) 경쇄 가변영역 서열로 구성된다.
[seq10]은 인간 항-CD20(anti-CD20) 중쇄 서열과 인간 IgG1 Fc hole, 링커 GGGGSGGGGSGGGGS, 인간 IL-12의 p40(베타) 영역 서열, 링커 GGGGSGGGGSGGGGS 및 인간 IL-12 p35(알파) 영역 서열로 구성된다.
[seq11]은 인간 항-CD20(anti-CD20) 중쇄 서열과 인간 IgG1 Fc hole, 링커 GGGGSGGGGSGGGGS, 헤파린 결합에 관여하는 아미노산의 변이(4개)가 포함된 인간 IL-12의 p40(베타) 영역 서열, 링커 GGGGSGGGGSGGGGS 및 인간 IL-12 p35(알파) 영역 서열로 구성된다.
[seq12]는 인간 항-CD20(anti-CD20) 항체의 중쇄 서열 및 인간 IgG1 Fc knob DANG으로 구성된다.
[seq13]은 인간 IL-12 p40(베타) 영역 서열, 링커 GGGGSGGGGSGGGGS, 인간 IL-12 p35(알파) 영역 서열, 링커 GGGGSGGGGS 및 인간 IgG1 Fc hole DANG으로 구성된다.
[seq14]는 헤파린 결합에 관여하는 아미노산의 변이(2개)가 포함된 인간 IL-12 p40(베타) 영역 서열, 링커 GGGGSGGGGSGGGGS, 인간 IL-12 p35(알파) 영역 서열, 링커 GGGGSGGGGS 및 인간 IgG1 Fc hole DANG으로 구성된다.
[seq15]는 헤파린 결합에 관여하는 아미노산의 변이(4개)가 포함된 인간 IL-12 p40 (베타) 영역 서열, 링커 GGGGSGGGGSGGGGS, 인간 IL-12 p35(알파) 영역 서열 및 링커 GGGGSGGGGS과 인간 IgG1 Fc로 구성된다.
[seq16]은 인간 항-FAP(anti-FAP) 중쇄 가변영역 서열 및 인간 IgG1 Fc knob으로 구성된다.
[seq17]은 인간 항-FAP(anti-FAP) 경쇄 서열로 구성된다.
[seq18]은 인간 항-FAP(anti-FAP) 중쇄 가변영역 서열 및 인간 IgG1 Fc knob DANG으로 구성된다.
[seq19]는 인간 IgG1 Fc knob DANG만으로 구성된다.
[seq20]은 인간 IgG1 Fc hole DANG만으로 구성된다.
[seq21]은 인간 항-CD20(anti-CD20) 항체 리툭시맙의 중쇄 서열이다.
[seq272]는 인간 IL-12 p40(베타) 영역 서열과 링커 GGGGSGGGGSGGGGS, 인간 IL-12 p35(알파) 영역 서열, 링커 GGGGSGGGGS 및 인간 IgG1 Fc hole, 링커 GGGGSGGGGSGGGGS, 인간 항-CD20(anti-CD20) 중쇄 가변영역 서열, 링커 GGGGSGGGGSGGGGSGGGGS 및 인간 항-CD20(anti-CD20) 경쇄 가변영역 서열로 구성된다.
[seq273]은 헤파린 결합에 관여하는 아미노산 변이(4개)가 포함된 인간 IL-12 p40(베타) 영역 서열과 링커 GGGGSGGGGSGGGGS, 인간 IL-12 p35(알파) 영역 서열, 링커 GGGGSGGGGS 및 인간 IgG1 Fc hole, 링커 GGGGSGGGGSGGGGS, 인간 항-CD20(anti-CD20) 중쇄 가변영역 서열, 링커 GGGGSGGGGSGGGGSGGGGS 및 인간 항-CD20(anti-CD20) 경쇄 가변영역 서열로 구성된다.
[seq274]는 인간 항-CD20(anti-CD20) 중쇄 서열과 인간 IgG1 Fc, 링커 GGGGSGGGGSGGGGS, 인간 IL-12의 p40(베타) 영역 서열, 링커 GGGGSGGGGSGGGGS 및 인간 IL-12 p35(알파) 영역 서열로 구성된다.
[seq275]는 인간 항-CD20(anti-CD20) 중쇄 서열과 인간 IgG1 Fc, 링커 GGGGSGGGGSGGGGS, 헤파린 결합에 관여하는 아미노산의 변이(4개)가 포함된 인간 IL-12의 p40(베타) 영역 서열, 링커 GGGGSGGGGSGGGGS 및 인간 IL-12 p35(알파) 영역 서열로 구성된다.
[seq276]은 인간 IL-12 p40(베타) 영역 서열과 링커 GGGGSGGGGSGGGGS, 인간 IL-12 p35(알파) 영역 서열, 링커 GGGGSGGGGS 및 인간 IgG1 Fc, 링커 GGGGSGGGGSGGGGS, 인간 항-CD20(anti-CD20) 중쇄 가변영역 서열, 링커 GGGGSGGGGSGGGGSGGGGS 및 인간 항-CD20(anti-CD20) 경쇄 가변영역 서열로 구성된다.
[seq277]은 헤파린 결합에 관여하는 아미노산 변이(4개)가 포함된 인간 IL-12 p40(베타) 영역 서열과 링커 GGGGSGGGGSGGGGS, 인간 IL-12 p35(알파) 영역 서열, 링커 GGGGSGGGGS 및 인간 IgG1 Fc, 링커 GGGGSGGGGSGGGGS, 인간 항-CD20(anti-CD20) 중쇄 가변영역 서열, 링커 GGGGSGGGGSGGGGSGGGGS 및 인간 항-CD20(anti-CD20) 경쇄 가변영역 서열로 구성된다.
T2.01(seq1, seq2, seq3)은 단백질 CD20를 표적으로 하는 인간 항-CD20 서열 및 인간 IL-12 서열이 놉-인투-홀 구조를 이루는 이중 항체이다.
T2.02(seq1, seq2, seq4)는 단백질 CD20를 표적으로 하는 인간 항-CD20 서열과 헤파린 결합에 관여하는 아미노산의 변이(2개)가 포함된 인간 IL-12 서열이 놉-인투-홀 구조를 이루는 이중 항체이다.
T2.03(seq1, seq2, seq5)은 단백질 CD20를 표적으로 하는 인간 항-CD20 서열과 헤파린 결합에 관여하는 아미노산의 변이(4개)가 포함된 인간 IL-12 서열이 놉-인투-홀 구조를 이루는 이중 항체이다.
T2.04(seq3, seq6, seq7)는 이중 가변 도메인 면역글로블린(dual variable domain Immunoglobulin, DVD-Ig) 형태의 인간 항-CD20 서열 및 인간 IL-12 서열이 놉-인투-홀 구조를 이루는 이중 항체이다.
T2.05(seq5, seq6, seq7)는 이중 가변 도메인 면역글로블린(dual variable domain Immunoglobulin, DVD-Ig) 형태의 인간 항-CD20 서열과 헤파린 결합에 관여하는 아미노산의 변이(4개)가 포함된 인간 IL-12 서열이 놉-인투-홀 구조를 이루는 이중 항체이다.
T2.06(seq2, seq3, seq8)은 중쇄의 C 말단에 단백질 CD20을 표적으로 하는 인간 항-CD20 서열의 단일쇄 가변영역 단편 (single chain fragment variable, scFv)이 연결된 인간 항-CD20 서열과 인간 IL-12 서열이 놉-인투-홀 구조를 이루는 이중 항체이다.
T2.07(seq2, seq5, seq8)은 중쇄의 C 말단에 단백질 CD20을 표적으로 하는 인간 항-CD20 서열의 단일쇄 가변영역 단편(single chain fragment variable, scFv)이 연결된 인간 항-CD20 서열과 헤파린 결합에 관여하는 아미노산의 변이(4개)가 포함된 인간 IL-12 서열이 놉-인투-홀 구조를 이루는 이중 항체이다.
T2.08(seq1, seq3, seq9)은 경쇄의 C 말단에 단백질 CD20를 표적으로 하는 인간 항-CD20 서열의 단일쇄 가변영역 단편(single chain fragment variable, scFv)이 연결된 인간 항-CD20 서열 및 인간 IL-12 서열이 놉-인투-홀 구조를 이루는 이중 항체이다.
T2.09(seq1, seq5, seq9)는 경쇄의 C 말단에 단백질 CD20를 표적으로 하는 인간 항-CD20 서열의 단일쇄 가변영역 단편(single chain fragment variable, scFv)이 연결된 인간 항-CD20 서열과 헤파린 결합에 관여하는 아미노산의 변이(4개)가 포함된 인간 IL-12 서열이 놉-인투-홀 구조를 이루는 이중 항체이다.
T2.10(seq1, seq2, seq10)은 단백질 CD20을 표적으로 하는 인간 항-CD20 서열과 중쇄의 C말단에 인간 IL-12 서열이 연결된 인간 항-CD20 서열이 놉-인투-홀 구조를 이루는 항체이다.
T2.11(seq1, seq2, seq11)은 단백질 CD20을 표적으로 하는 인간 항-CD20 서열과 중쇄의 C말단에 헤파린 결합에 관여하는 아미노산의 변이(4개)가 포함된 인간 IL-12 서열이 연결된 인간 항-CD20 서열이 놉-인투-홀 구조를 이루는 항체이다.
T2.12(seq2, seq12, seq14)는 단백질 CD20를 표적으로 하는 인간 항-CD20 서열과 헤파린 결합에 관여하는 아미노산의 변이(2개)가 포함된 인간 IL-12 서열이 놉-인투-홀 구조를 이루며, 이펙터 기능이 제거된 이중 항체이다.
T2.13(seq13, seq19)은 인간 IL-12 서열만을 갖는 놉-인투-홀 구조의 이펙터 기능이 제거된 항체이다.
T2.14(seq14, seq19)는 헤파린 결합에 관여하는 아미노산의 변이(2개)가 포함된 인간 IL-12 서열만을 갖는 놉-인투-홀 구조의 이펙터 기능이 제거된 항체이다.
T2.15(seq15)는 헤파린 결합에 관여하는 아미노산의 변이(4개)가 포함된 인간 IL-12 서열만을 갖는 Fc-퓨전-단백질이다.
T2.16(seq4, seq16, seq17)은 단백질 FAP을 표적으로 하는 인간 항-FAP 서열과 헤파린 결합에 관여하는 아미노산의 변이(2개)가 포함된 인간 IL-12 서열이 놉-인투-홀 구조를 이루는 이중 항체이다.
T2.17(seq17, seq18, seq20)은 단백질 FAP을 표적으로 하는 인간 항-FAP 서열만을 갖는 놉-인투-홀 구조의 이펙터 기능이 제거된 항체이다.
Rituximab(seq2, seq21)은 단백질 CD20을 표적으로 하는 인간 항-CD20(리툭시맙) 항체이다.
T2.18(seq1, seq2, seq272)은 인간 항-CD20 서열과 C 말단에 인간 항-CD20 서열의 단일쇄 가변영역 단편(single chain fragment variable, scFv)이 연결된 인간 IL-12 서열이 놉-인투-홀 구조를 이루는 이중 항체이다.
T2.19(seq1, seq2, seq273)는 인간 항-CD20 중쇄 서열과 C 말단에 인간 항-CD20 서열의 단일쇄 가변영역 단편(single chain fragment variable, scFv)이 연결된 채 헤파린 결합에 관여하는 아미노산의 변이(4개)가 포함된 인간 IL-12 서열이 놉-인투-홀 구조를 이루는 이중 항체이다.
T2.20(seq2, seq274)은 중쇄의 C 말단에 인간 IL-12 서열이 연결된 인간 항-CD20 서열을 포함한 Fc-퓨전 단백질 이량체이다.
T2.21(seq2, seq275)은 중쇄의 C 말단에 헤파린 결합에 관여하는 아미노산의 변이(4개)가 포함된 인간 IL-12 서열이 연결된 인간 항-CD20 서열을 포함한 Fc-퓨전 단백질 이량체이다.
T2.22(seq276)는 C 말단에 인간 항-CD20 서열의 단일쇄 가변영역 단편(single chain fragment variable, scFv)이 연결된 인간 IL-12 서열을 포함한 Fc-퓨전 단백질 이량체이다.
T2.23(seq277)은 C 말단에 인간 항-CD20 서열의 단일쇄 가변영역 단편(single chain fragment variable, scFv)이 연결된 채 헤파린 결합에 관여하는 아미노산의 변이(4개)를 포함한 인간 IL-12 서열로 구성된 Fc-퓨전 단백질 이량체이다.
[seq1] anti-hu CD20 HC hu IgG1 Fc knob
QVQLQQPGAELVKPGASVKMSCKASGYTFTSYNMHWVKQTPGRGLEWIGAIYPGNGDTSYNQKFKGKATLTADKSSSTAYMQLSSLTSEDSAVYYCARSTYYGGDWYFNVWGAGTTVTVSAASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLWCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
[seq2] anti-hu CD20 LC
QIVLSQSPAILSASPGEKVTMTCRASSSVSYIHWFQQKPGSSPKPWIYATSNLASGVPVRFSGSGSGTSYSLTISRVEAEDAATYYCQQWTSNPPTFGGGTKLEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
[seq3] hu scIL-12-hu IgG1 Fc hole
IWELKKDVYVVELDWYPDAPGEMVVLTCDTPEEDGITWTLDQSSEVLGSGKTLTIQVKEFGDAGQYTCHKGGEVLSHSLLLLHKKEDGIWSTDILKDQKEPKNKTFLRCEAKNYSGRFTCWWLTTISTDLTFSVKSSRGSSDPQGVTCGAATLSAERVRGDNKEYEYSVECQEDSACPAAEESLPIEVMVDAVHKLKYENYTSSFFIRDIIKPDPPKNLQLKPLKNSRQVEVSWEYPDTWSTPHSYFSLTFCVQVQGKSKREKKDRVFTDKTSATVICRKNASISVRAQDRYYSSSWSEWASVPCSGGGGSGGGGSGGGGSRNLPVATPDPGMFPCLHHSQNLLRAVSNMLQKARQTLEFYPCTSEEIDHEDITKDKTSTVEACLPLELTKNESCLNSRETSFITNGSCLASRKTSFMMALCLSSIYEDLKMYQVEFKTMNAKLLMDPKRQIFLDQNMLAVIDELMQALNFNSETVPQKSSLEEPDFYKTKIKLCILLHAFRIRAVTIDRVMSYLNASGGGGSGGGGSDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLSCAVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLVSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
[seq4] hu scIL-12 mut1-hu IgG1 Fc hole
IWELKKDVYVVELDWYPDAPGEMVVLTCDTPEEDGITWTLDQSSEVLGSGKTLTIQVKEFGDAGQYTCHKGGEVLSHSLLLLHKKEDGIWSTDILKDQKEPKNKTFLRCEAKNYSGRFTCWWLTTISTDLTFSVKSSRGSSDPQGVTCGAATLSAERVRGDNKEYEYSVECQEDSACPAAEESLPIEVMVDAVHKLKYENYTSSFFIRDIIKPDPPKNLQLKPLKNSRQVEVSWEYPDTWSTPHSYFSLTFCVQVQGASKREAKDRVFTDKTSATVICRKNASISVRAQDRYYSSSWSEWASVPCSGGGGSGGGGSGGGGSRNLPVATPDPGMFPCLHHSQNLLRAVSNMLQKARQTLEFYPCTSEEIDHEDITKDKTSTVEACLPLELTKNESCLNSRETSFITNGSCLASRKTSFMMALCLSSIYEDLKMYQVEFKTMNAKLLMDPKRQIFLDQNMLAVIDELMQALNFNSETVPQKSSLEEPDFYKTKIKLCILLHAFRIRAVTIDRVMSYLNASGGGGSGGGGSDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLSCAVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLVSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
[seq5] hu scIL-12 mut2-hu IgG1 Fc hole
IWELKKDVYVVELDWYPDAPGEMVVLTCDTPEEDGITWTLDQSSEVLGSGKTLTIQVKEFGDAGQYTCHKGGEVLSHSLLLLHKKEDGIWSTDILKDQKEPKNKTFLRCEAKNYSGRFTCWWLTTISTDLTFSVKSSRGSSDPQGVTCGAATLSAERVRGDNKEYEYSVECQEDSACPAAEESLPIEVMVDAVHKLKYENYTSSFFIRDIIKPDPPKNLQLKPLKNSRQVEVSWEYPDTWSTPHSYFSLTFCVQVQGASAREAADRVFTDKTSATVICRKNASISVRAQDRYYSSSWSEWASVPCSGGGGSGGGGSGGGGSRNLPVATPDPGMFPCLHHSQNLLRAVSNMLQKARQTLEFYPCTSEEIDHEDITKDKTSTVEACLPLELTKNESCLNSRETSFITNGSCLASRKTSFMMALCLSSIYEDLKMYQVEFKTMNAKLLMDPKRQIFLDQNMLAVIDELMQALNFNSETVPQKSSLEEPDFYKTKIKLCILLHAFRIRAVTIDRVMSYLNASGGGGSGGGGSDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLSCAVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLVSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
[seq6] (anti-hu CD20 VH)2-hu IgG1 Fc knob
QVQLQQPGAELVKPGASVKMSCKASGYTFTSYNMHWVKQTPGRGLEWIGAIYPGNGDTSYNQKFKGKATLTADKSSSTAYMQLSSLTSEDSAVYYCARSTYYGGDWYFNVWGAGTTVTVSAGGGGSGGGGSGGGGSQVQLQQPGAELVKPGASVKMSCKASGYTFTSYNMHWVKQTPGRGLEWIGAIYPGNGDTSYNQKFKGKATLTADKSSSTAYMQLSSLTSEDSAVYYCARSTYYGGDWYFNVWGAGTTVTVSAASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLWCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
[seq7] (anti-hu CD20 VL)2
QIVLSQSPAILSASPGEKVTMTCRASSSVSYIHWFQQKPGSSPKPWIYATSNLASGVPVRFSGSGSGTSYSLTISRVEAEDAATYYCQQWTSNPPTFGGGTKLEIKGGGGSGGGGSGGGGSQIVLSQSPAILSASPGEKVTMTCRASSSVSYIHWFQQKPGSSPKPWIYATSNLASGVPVRFSGSGSGTSYSLTISRVEAEDAATYYCQQWTSNPPTFGGGTKLEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
[seq8] anti-hu CD20 HC hu IgG1 Fc knob-anti-hu CD20 scFv
QVQLQQPGAELVKPGASVKMSCKASGYTFTSYNMHWVKQTPGRGLEWIGAIYPGNGDTSYNQKFKGKATLTADKSSSTAYMQLSSLTSEDSAVYYCARSTYYGGDWYFNVWGAGTTVTVSAASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLWCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGKGGGGSGGGGSGGGGSQVQLQQPGAELVKPGASVKMSCKASGYTFTSYNMHWVKQTPGRGLEWIGAIYPGNGDTSYNQKFKGKATLTADKSSSTAYMQLSSLTSEDSAVYYCARSTYYGGDWYFNVWGAGTTVTVSAGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSQIVLSQSPAILSASPGEKVTMTCRASSSVSYIHWFQQKPGSSPKPWIYATSNLASGVPVRFSGSGSGTSYSLTISRVEAEDAATYYCQQWTSNPPTFGGGTKLEIK
[seq9] anti-hu CD20 LC-anti-hu CD20 scFv
QIVLSQSPAILSASPGEKVTMTCRASSSVSYIHWFQQKPGSSPKPWIYATSNLASGVPVRFSGSGSGTSYSLTISRVEAEDAATYYCQQWTSNPPTFGGGTKLEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGECGGGGSGGGGSGGGGSQVQLQQPGAELVKPGASVKMSCKASGYTFTSYNMHWVKQTPGRGLEWIGAIYPGNGDTSYNQKFKGKATLTADKSSSTAYMQLSSLTSEDSAVYYCARSTYYGGDWYFNVWGAGTTVTVSAGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSQIVLSQSPAILSASPGEKVTMTCRASSSVSYIHWFQQKPGSSPKPWIYATSNLASGVPVRFSGSGSGTSYSLTISRVEAEDAATYYCQQWTSNPPTFGGGTKLEIK
[seq10] anti-hu CD20 HC hu IgG1 Fc hole-hu scIL-12
QVQLQQPGAELVKPGASVKMSCKASGYTFTSYNMHWVKQTPGRGLEWIGAIYPGNGDTSYNQKFKGKATLTADKSSSTAYMQLSSLTSEDSAVYYCARSTYYGGDWYFNVWGAGTTVTVSAASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLSCAVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLVSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGKGGGGSGGGGSGGGGSIWELKKDVYVVELDWYPDAPGEMVVLTCDTPEEDGITWTLDQSSEVLGSGKTLTIQVKEFGDAGQYTCHKGGEVLSHSLLLLHKKEDGIWSTDILKDQKEPKNKTFLRCEAKNYSGRFTCWWLTTISTDLTFSVKSSRGSSDPQGVTCGAATLSAERVRGDNKEYEYSVECQEDSACPAAEESLPIEVMVDAVHKLKYENYTSSFFIRDIIKPDPPKNLQLKPLKNSRQVEVSWEYPDTWSTPHSYFSLTFCVQVQGKSKREKKDRVFTDKTSATVICRKNASISVRAQDRYYSSSWSEWASVPCSGGGGSGGGGSGGGGSRNLPVATPDPGMFPCLHHSQNLLRAVSNMLQKARQTLEFYPCTSEEIDHEDITKDKTSTVEACLPLELTKNESCLNSRETSFITNGSCLASRKTSFMMALCLSSIYEDLKMYQVEFKTMNAKLLMDPKRQIFLDQNMLAVIDELMQALNFNSETVPQKSSLEEPDFYKTKIKLCILLHAFRIRAVTIDRVMSYLNAS
[seq11] anti-hu CD20 HC hu IgG1 Fc hole-hu scIL-12 mut2
QVQLQQPGAELVKPGASVKMSCKASGYTFTSYNMHWVKQTPGRGLEWIGAIYPGNGDTSYNQKFKGKATLTADKSSSTAYMQLSSLTSEDSAVYYCARSTYYGGDWYFNVWGAGTTVTVSAASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLSCAVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLVSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGKGGGGSGGGGSGGGGSIWELKKDVYVVELDWYPDAPGEMVVLTCDTPEEDGITWTLDQSSEVLGSGKTLTIQVKEFGDAGQYTCHKGGEVLSHSLLLLHKKEDGIWSTDILKDQKEPKNKTFLRCEAKNYSGRFTCWWLTTISTDLTFSVKSSRGSSDPQGVTCGAATLSAERVRGDNKEYEYSVECQEDSACPAAEESLPIEVMVDAVHKLKYENYTSSFFIRDIIKPDPPKNLQLKPLKNSRQVEVSWEYPDTWSTPHSYFSLTFCVQVQGASAREAADRVFTDKTSATVICRKNASISVRAQDRYYSSSWSEWASVPCSGGGGSGGGGSGGGGSRNLPVATPDPGMFPCLHHSQNLLRAVSNMLQKARQTLEFYPCTSEEIDHEDITKDKTSTVEACLPLELTKNESCLNSRETSFITNGSCLASRKTSFMMALCLSSIYEDLKMYQVEFKTMNAKLLMDPKRQIFLDQNMLAVIDELMQALNFNSETVPQKSSLEEPDFYKTKIKLCILLHAFRIRAVTIDRVMSYLNAS
[seq12] anti-hu CD20 HC hu IgG1 Fc knob DANG
QVQLQQPGAELVKPGASVKMSCKASGYTFTSYNMHWVKQTPGRGLEWIGAIYPGNGDTSYNQKFKGKATLTADKSSSTAYMQLSSLTSEDSAVYYCARSTYYGGDWYFNVWGAGTTVTVSAASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVAVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYGSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLWCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
[seq13] hu scIL-12-hu IgG1 Fc hole DANG
IWELKKDVYVVELDWYPDAPGEMVVLTCDTPEEDGITWTLDQSSEVLGSGKTLTIQVKEFGDAGQYTCHKGGEVLSHSLLLLHKKEDGIWSTDILKDQKEPKNKTFLRCEAKNYSGRFTCWWLTTISTDLTFSVKSSRGSSDPQGVTCGAATLSAERVRGDNKEYEYSVECQEDSACPAAEESLPIEVMVDAVHKLKYENYTSSFFIRDIIKPDPPKNLQLKPLKNSRQVEVSWEYPDTWSTPHSYFSLTFCVQVQGKSKREKKDRVFTDKTSATVICRKNASISVRAQDRYYSSSWSEWASVPCSGGGGSGGGGSGGGGSRNLPVATPDPGMFPCLHHSQNLLRAVSNMLQKARQTLEFYPCTSEEIDHEDITKDKTSTVEACLPLELTKNESCLNSRETSFITNGSCLASRKTSFMMALCLSSIYEDLKMYQVEFKTMNAKLLMDPKRQIFLDQNMLAVIDELMQALNFNSETVPQKSSLEEPDFYKTKIKLCILLHAFRIRAVTIDRVMSYLNASGGGGSGGGGSDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVAVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYGSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLSCAVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLVSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
[seq14] hu scIL-12 mut1-hu IgG1 Fc hole DANG
IWELKKDVYVVELDWYPDAPGEMVVLTCDTPEEDGITWTLDQSSEVLGSGKTLTIQVKEFGDAGQYTCHKGGEVLSHSLLLLHKKEDGIWSTDILKDQKEPKNKTFLRCEAKNYSGRFTCWWLTTISTDLTFSVKSSRGSSDPQGVTCGAATLSAERVRGDNKEYEYSVECQEDSACPAAEESLPIEVMVDAVHKLKYENYTSSFFIRDIIKPDPPKNLQLKPLKNSRQVEVSWEYPDTWSTPHSYFSLTFCVQVQGASKREAKDRVFTDKTSATVICRKNASISVRAQDRYYSSSWSEWASVPCSGGGGSGGGGSGGGGSRNLPVATPDPGMFPCLHHSQNLLRAVSNMLQKARQTLEFYPCTSEEIDHEDITKDKTSTVEACLPLELTKNESCLNSRETSFITNGSCLASRKTSFMMALCLSSIYEDLKMYQVEFKTMNAKLLMDPKRQIFLDQNMLAVIDELMQALNFNSETVPQKSSLEEPDFYKTKIKLCILLHAFRIRAVTIDRVMSYLNASGGGGSGGGGSDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVAVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYGSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLSCAVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLVSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
[seq15] hu scIL-12 mut2-hu IgG1 Fc
IWELKKDVYVVELDWYPDAPGEMVVLTCDTPEEDGITWTLDQSSEVLGSGKTLTIQVKEFGDAGQYTCHKGGEVLSHSLLLLHKKEDGIWSTDILKDQKEPKNKTFLRCEAKNYSGRFTCWWLTTISTDLTFSVKSSRGSSDPQGVTCGAATLSAERVRGDNKEYEYSVECQEDSACPAAEESLPIEVMVDAVHKLKYENYTSSFFIRDIIKPDPPKNLQLKPLKNSRQVEVSWEYPDTWSTPHSYFSLTFCVQVQGASAREAADRVFTDKTSATVICRKNASISVRAQDRYYSSSWSEWASVPCSGGGGSGGGGSGGGGSRNLPVATPDPGMFPCLHHSQNLLRAVSNMLQKARQTLEFYPCTSEEIDHEDITKDKTSTVEACLPLELTKNESCLNSRETSFITNGSCLASRKTSFMMALCLSSIYEDLKMYQVEFKTMNAKLLMDPKRQIFLDQNMLAVIDELMQALNFNSETVPQKSSLEEPDFYKTKIKLCILLHAFRIRAVTIDRVMSYLNASGGGGSGGGGSDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
[seq16] anti-hu FAP HC IgG1 Fc knob
QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKTSRYTFTEYTIHWVRQAPGQRLEWIGGINPNNGIPNYNQKFKGRVTITVDTSASTAYMELSSLRSEDTAVYYCARRRIAYGYDEGHAMDYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLWCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
[seq17] anti-hu FAP LC
DIVMTQSPDSLAVSLGERATINCKSSQSLLYSRNQKNYLAWYQQKPGQPPKLLIFWASTRESGVPDRFSGSGFGTDFTLTISSLQAEDVAVYYCQQYFSYPLTFGQGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
[seq18] anti-hu FAP HC hu IgG1 Fc knob DANG
QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKTSRYTFTEYTIHWVRQAPGQRLEWIGGINPNNGIPNYNQKFKGRVTITVDTSASTAYMELSSLRSEDTAVYYCARRRIAYGYDEGHAMDYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVAVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYGSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLWCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
[seq19] hu IgG1 Fc knob DANG
DKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVAVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYGSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLWCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
[seq20] hu IgG1 Fc hole DANG
DKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVAVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYGSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLSCAVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLVSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
[seq21] anti-hu CD20 (Rituximab) HC
QVQLQQPGAELVKPGASVKMSCKASGYTFTSYNMHWVKQTPGRGLEWIGAIYPGNGDTSYNQKFKGKATLTADKSSSTAYMQLSSLTSEDSAVYYCARSTYYGGDWYFNVWGAGTTVTVSAASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
[seq272] hu scIL-12-hu IgG1 Fc hole-anti-hu CD20 scFv
IWELKKDVYVVELDWYPDAPGEMVVLTCDTPEEDGITWTLDQSSEVLGSGKTLTIQVKEFGDAGQYTCHKGGEVLSHSLLLLHKKEDGIWSTDILKDQKEPKNKTFLRCEAKNYSGRFTCWWLTTISTDLTFSVKSSRGSSDPQGVTCGAATLSAERVRGDNKEYEYSVECQEDSACPAAEESLPIEVMVDAVHKLKYENYTSSFFIRDIIKPDPPKNLQLKPLKNSRQVEVSWEYPDTWSTPHSYFSLTFCVQVQGKSKREKKDRVFTDKTSATVICRKNASISVRAQDRYYSSSWSEWASVPCSGGGGSGGGGSGGGGSRNLPVATPDPGMFPCLHHSQNLLRAVSNMLQKARQTLEFYPCTSEEIDHEDITKDKTSTVEACLPLELTKNESCLNSRETSFITNGSCLASRKTSFMMALCLSSIYEDLKMYQVEFKTMNAKLLMDPKRQIFLDQNMLAVIDELMQALNFNSETVPQKSSLEEPDFYKTKIKLCILLHAFRIRAVTIDRVMSYLNASGGGGSGGGGSDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLSCAVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLVSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGGGGGSGGGGSGGGGSQVQLQQPGAELVKPGASVKMSCKASGYTFTSYNMHWVKQTPGRGLEWIGAIYPGNGDTSYNQKFKGKATLTADKSSSTAYMQLSSLTSEDSAVYYCARSTYYGGDWYFNVWGAGTTVTVSAGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSQIVLSQSPAILSASPGEKVTMTCRASSSVSYIHWFQQKPGSSPKPWIYATSNLASGVPVRFSGSGSGTSYSLTISRVEAEDAATYYCQQWTSNPPTFGGGTKLEIK
[seq273] hu scIL-12 mut2-hu IgG1 Fc hole-anti-hu CD20 scFv
IWELKKDVYVVELDWYPDAPGEMVVLTCDTPEEDGITWTLDQSSEVLGSGKTLTIQVKEFGDAGQYTCHKGGEVLSHSLLLLHKKEDGIWSTDILKDQKEPKNKTFLRCEAKNYSGRFTCWWLTTISTDLTFSVKSSRGSSDPQGVTCGAATLSAERVRGDNKEYEYSVECQEDSACPAAEESLPIEVMVDAVHKLKYENYTSSFFIRDIIKPDPPKNLQLKPLKNSRQVEVSWEYPDTWSTPHSYFSLTFCVQVQGASAREAADRVFTDKTSATVICRKNASISVRAQDRYYSSSWSEWASVPCSGGGGSGGGGSGGGGSRNLPVATPDPGMFPCLHHSQNLLRAVSNMLQKARQTLEFYPCTSEEIDHEDITKDKTSTVEACLPLELTKNESCLNSRETSFITNGSCLASRKTSFMMALCLSSIYEDLKMYQVEFKTMNAKLLMDPKRQIFLDQNMLAVIDELMQALNFNSETVPQKSSLEEPDFYKTKIKLCILLHAFRIRAVTIDRVMSYLNASGGGGSGGGGSDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLSCAVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLVSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGGGGGSGGGGSGGGGSQVQLQQPGAELVKPGASVKMSCKASGYTFTSYNMHWVKQTPGRGLEWIGAIYPGNGDTSYNQKFKGKATLTADKSSSTAYMQLSSLTSEDSAVYYCARSTYYGGDWYFNVWGAGTTVTVSAGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSQIVLSQSPAILSASPGEKVTMTCRASSSVSYIHWFQQKPGSSPKPWIYATSNLASGVPVRFSGSGSGTSYSLTISRVEAEDAATYYCQQWTSNPPTFGGGTKLEIK
[seq274] anti-hu CD20 HC hu IgG1 Fc-hu scIL-12
QVQLQQPGAELVKPGASVKMSCKASGYTFTSYNMHWVKQTPGRGLEWIGAIYPGNGDTSYNQKFKGKATLTADKSSSTAYMQLSSLTSEDSAVYYCARSTYYGGDWYFNVWGAGTTVTVSAASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGGGGGSGGGGSGGGGSIWELKKDVYVVELDWYPDAPGEMVVLTCDTPEEDGITWTLDQSSEVLGSGKTLTIQVKEFGDAGQYTCHKGGEVLSHSLLLLHKKEDGIWSTDILKDQKEPKNKTFLRCEAKNYSGRFTCWWLTTISTDLTFSVKSSRGSSDPQGVTCGAATLSAERVRGDNKEYEYSVECQEDSACPAAEESLPIEVMVDAVHKLKYENYTSSFFIRDIIKPDPPKNLQLKPLKNSRQVEVSWEYPDTWSTPHSYFSLTFCVQVQGKSKREKKDRVFTDKTSATVICRKNASISVRAQDRYYSSSWSEWASVPCSGGGGSGGGGSGGGGSRNLPVATPDPGMFPCLHHSQNLLRAVSNMLQKARQTLEFYPCTSEEIDHEDITKDKTSTVEACLPLELTKNESCLNSRETSFITNGSCLASRKTSFMMALCLSSIYEDLKMYQVEFKTMNAKLLMDPKRQIFLDQNMLAVIDELMQALNFNSETVPQKSSLEEPDFYKTKIKLCILLHAFRIRAVTIDRVMSYLNAS
[seq275] anti-hu CD20 HC hu IgG1 Fc-hu scIL-12 mut2
QVQLQQPGAELVKPGASVKMSCKASGYTFTSYNMHWVKQTPGRGLEWIGAIYPGNGDTSYNQKFKGKATLTADKSSSTAYMQLSSLTSEDSAVYYCARSTYYGGDWYFNVWGAGTTVTVSAASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGGGGGSGGGGSGGGGSIWELKKDVYVVELDWYPDAPGEMVVLTCDTPEEDGITWTLDQSSEVLGSGKTLTIQVKEFGDAGQYTCHKGGEVLSHSLLLLHKKEDGIWSTDILKDQKEPKNKTFLRCEAKNYSGRFTCWWLTTISTDLTFSVKSSRGSSDPQGVTCGAATLSAERVRGDNKEYEYSVECQEDSACPAAEESLPIEVMVDAVHKLKYENYTSSFFIRDIIKPDPPKNLQLKPLKNSRQVEVSWEYPDTWSTPHSYFSLTFCVQVQGASAREAADRVFTDKTSATVICRKNASISVRAQDRYYSSSWSEWASVPCSGGGGSGGGGSGGGGSRNLPVATPDPGMFPCLHHSQNLLRAVSNMLQKARQTLEFYPCTSEEIDHEDITKDKTSTVEACLPLELTKNESCLNSRETSFITNGSCLASRKTSFMMALCLSSIYEDLKMYQVEFKTMNAKLLMDPKRQIFLDQNMLAVIDELMQALNFNSETVPQKSSLEEPDFYKTKIKLCILLHAFRIRAVTIDRVMSYLNAS
[seq276] hu scIL-12-hu IgG1 Fc-anti-hu CD20 scFv
IWELKKDVYVVELDWYPDAPGEMVVLTCDTPEEDGITWTLDQSSEVLGSGKTLTIQVKEFGDAGQYTCHKGGEVLSHSLLLLHKKEDGIWSTDILKDQKEPKNKTFLRCEAKNYSGRFTCWWLTTISTDLTFSVKSSRGSSDPQGVTCGAATLSAERVRGDNKEYEYSVECQEDSACPAAEESLPIEVMVDAVHKLKYENYTSSFFIRDIIKPDPPKNLQLKPLKNSRQVEVSWEYPDTWSTPHSYFSLTFCVQVQGKSKREKKDRVFTDKTSATVICRKNASISVRAQDRYYSSSWSEWASVPCSGGGGSGGGGSGGGGSRNLPVATPDPGMFPCLHHSQNLLRAVSNMLQKARQTLEFYPCTSEEIDHEDITKDKTSTVEACLPLELTKNESCLNSRETSFITNGSCLASRKTSFMMALCLSSIYEDLKMYQVEFKTMNAKLLMDPKRQIFLDQNMLAVIDELMQALNFNSETVPQKSSLEEPDFYKTKIKLCILLHAFRIRAVTIDRVMSYLNASGGGGSGGGGSDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGGGGGSGGGGSGGGGSQVQLQQPGAELVKPGASVKMSCKASGYTFTSYNMHWVKQTPGRGLEWIGAIYPGNGDTSYNQKFKGKATLTADKSSSTAYMQLSSLTSEDSAVYYCARSTYYGGDWYFNVWGAGTTVTVSAGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSQIVLSQSPAILSASPGEKVTMTCRASSSVSYIHWFQQKPGSSPKPWIYATSNLASGVPVRFSGSGSGTSYSLTISRVEAEDAATYYCQQWTSNPPTFGGGTKLEIK
[seq277] hu scIL-12 mut2-hu IgG1 Fc-anti-hu CD20 scFv
IWELKKDVYVVELDWYPDAPGEMVVLTCDTPEEDGITWTLDQSSEVLGSGKTLTIQVKEFGDAGQYTCHKGGEVLSHSLLLLHKKEDGIWSTDILKDQKEPKNKTFLRCEAKNYSGRFTCWWLTTISTDLTFSVKSSRGSSDPQGVTCGAATLSAERVRGDNKEYEYSVECQEDSACPAAEESLPIEVMVDAVHKLKYENYTSSFFIRDIIKPDPPKNLQLKPLKNSRQVEVSWEYPDTWSTPHSYFSLTFCVQVQGASAREAADRVFTDKTSATVICRKNASISVRAQDRYYSSSWSEWASVPCSGGGGSGGGGSGGGGSRNLPVATPDPGMFPCLHHSQNLLRAVSNMLQKARQTLEFYPCTSEEIDHEDITKDKTSTVEACLPLELTKNESCLNSRETSFITNGSCLASRKTSFMMALCLSSIYEDLKMYQVEFKTMNAKLLMDPKRQIFLDQNMLAVIDELMQALNFNSETVPQKSSLEEPDFYKTKIKLCILLHAFRIRAVTIDRVMSYLNASGGGGSGGGGSDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGGGGGSGGGGSGGGGSQVQLQQPGAELVKPGASVKMSCKASGYTFTSYNMHWVKQTPGRGLEWIGAIYPGNGDTSYNQKFKGKATLTADKSSSTAYMQLSSLTSEDSAVYYCARSTYYGGDWYFNVWGAGTTVTVSAGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSQIVLSQSPAILSASPGEKVTMTCRASSSVSYIHWFQQKPGSSPKPWIYATSNLASGVPVRFSGSGSGTSYSLTISRVEAEDAATYYCQQWTSNPPTFGGGTKLEIK
준비예 2. anti-CD20/IL-12 IgG2a, mouse version 융합단백질의 개요
PROTEIN Format Description 해당서열
T2.01m K&H anti-mu CD20/mu IL-12, mu IgG2a seq22, seq23, seq24
T2.02m K&H anti-mu CD20/mu IL-12 mut1, mu IgG2a seq22, seq23, seq25
T2.03m K&H anti-mu CD20/mu IL-12 mut2, mu IgG2a seq22, seq23, seq26
T2.04m K&H anti-mu CD20/mu IL-12, mu IgG2a (2+1) seq24, seq27, seq28
T2.05m K&H anti-mu CD20/mu IL-12 mut2, mu IgG2a (2+1) seq26, seq27, seq28
T2.06m K&H anti-mu CD20/mu IL-12, mu IgG2a (2+1, HC scFv) seq23, seq24, seq29
T2.07m K&H anti-mu CD20/mu IL-12 mut2, mu IgG2a (2+1, HC scFv) seq23, seq26, seq29
T2.08m K&H anti-mu CD20/mu IL-12, mu IgG2a (2+1, LC scFv) seq22, seq24, seq30
T2.09m K&H anti-mu CD20/mu IL-12 mut2, mu IgG2a (2+1, LC scFv) seq22, seq26, seq30
T2.10m K&H anti-mu CD20/anti-mu CD20-mu IL-12, mu IgG2a (2+1) seq22, seq23, seq31
T2.11m K&H anti-mu CD20/anti-mu CD20-mu IL-12 mut2, mu IgG2a (2+1) seq22, seq23, seq32
T2.12m K&H anti-mu CD20/mu IL-12 mut1, mu IgG2a DANG seq23, seq33, seq35
T2.13m K&H null/mu IL-12, mu IgG2a DANG seq34, seq40
T2.14m K&H null/mu IL-12 mut1, mu IgG2a DANG seq35, seq40
T2.15m Fc-fusion mu IL-12 mut2, mu IgG2a seq36
T2.16m K&H anti-mu FAP/mu IL-12 mut1, mu IgG2a seq25, seq37, seq38
T2.17m K&H anti-mu FAP/null, mu IgG2a DANG seq38, seq39, seq41
18B12 Mab anti-mu CD20 (18B12) seq23, seq42
T2.18m K&H anti-mu CD20/mu IL-12-anti-mu CD20 scFv, mu IgG2a (2+1) seq22, seq23, seq278
T2.19m K&H anti-mu CD20/mu IL-12 mut2-anti-mu CD20 scFv, mu IgG2a (2+1) seq22, seq23, seq279
T1.20m Fc-fusion anti-mu CD20-mu IL-12, mu IgG2a seq23, seq280
T1.21m Fc-fusion anti-mu CD20-mu IL-12 mut2, mu IgG2a seq23, seq281
T1.22m Fc-fusion mu IL-12-anti-mu CD20 scFv, mu IgG2a seq282
T1.23m Fc-fusion mu IL-12 mut2-anti-mu CD20 scFv, mu IgG2a seq283
[seq22]는 마우스 항-CD20(anti-CD20) 항체 중쇄 서열에 T321W 변이를 통해 놉 구조를 형성한 마우스 IgG2a Fc로 구성된다.[seq23]은 마우스 항-CD20(anti-CD20) 항체 18B12의 경쇄 서열로 구성된다.
[seq24]는 마우스 IL-12 p40(베타) 영역 서열과 링커 GGGGSGGGGSGGGGS, 마우스 IL-12 p35 (알파) 영역 서열, 링커 GGGGSGGGGS 및 T321S, M323A, Y362V 변이를 통해 홀 구조를 형성한 마우스 IgG2a Fc로 구성된다.
[seq25]는 마우스 IL-12 p40(베타) 영역에서 헤파린 결합에 관여하는 아미노산 277번, 282번 라이신(K)을 알라닌(A)으로 변이한 서열, 링커 GGGGSGGGGSGGGGS, 마우스 IL-12 p35(알파) 영역 서열, 링커 GGGGSGGGGS 및 마우스 IgG2a Fc hole로 구성된다.
[seq26]은 마우스 IL-12 p40(베타) 영역에서 헤파린 결합에 관여하는 아미노산 276번 알지닌(R)을 알라닌(A)으로, 277번, 278번, 282번 라이신(K)을 알라닌(A)으로 변이한 서열, 링커 GGGGSGGGGSGGGGS, 마우스 IL-12 p35 (알파) 영역 서열, 링커 GGGGSGGGGS 및 마우스 IgG2a Fc hole로 구성된다.
[seq27]은 마우스 항-CD20(anti-CD20) 중쇄 가변영역 서열과 링커 GGGGSGGGGSGGGGS, 마우스 항-CD20(anti-CD20) 중쇄 가변영역 서열 및 마우스 IgG2a Fc knob으로 구성된다.
[seq28]은 마우스 항-CD20(anti-CD20) 경쇄 가변영역 서열과 링커 GGGGSGGGGSGGGGS, 마우스 항-CD20(anti-CD20) 경쇄 서열로 구성된다.
[seq29]는 마우스 항-CD20(anti-CD20) 중쇄 가변영역 서열과 마우스 IgG2a Fc knob, 링커 GGGGSGGGGSGGGGS, 마우스 항-CD20(anti-CD20) 중쇄 가변영역 서열, 링커 GGGGSGGGGSGGGGSGGGGS 및 마우스 항-CD20(anti-CD20) 경쇄 가변영역 서열로 구성된다.
[seq30]은 마우스 항-CD20(anti-CD20) 경쇄 서열과 링커 GGGGSGGGGSGGGGS, 마우스 항-CD20(anti-CD20) 중쇄 가변영역 서열, 링커 GGGGSGGGGSGGGGSGGGGS 및 마우스 항-CD20(anti-CD20) 경쇄 가변영역 서열로 구성된다.
[seq31]은 마우스 항-CD20(anti-CD20) 중쇄 가변영역 서열과 마우스 IgG2a Fc hole, 링커 GGGGSGGGGSGGGGS, 마우스 IL-12의 p40(베타) 영역 서열, 링커 GGGGSGGGGSGGGGS 및 마우스 IL-12 p35(알파) 영역 서열로 구성된다.
[seq32]는 마우스 항-CD20(anti-CD20) 중쇄 가변영역 서열과 마우스 IgG2a Fc hole, 링커 GGGGSGGGGSGGGGS, 헤파린 결합에 관여하는 아미노산의 변이(4개)가 포함된 마우스 IL-12의 p40(베타) 영역 서열, 링커 GGGGSGGGGSGGGGS 및 마우스 IL-12 p35(알파) 영역 서열로 구성된다.
[seq33]은 마우스 항-CD20(anti-CD20) 항체의 중쇄 가변영역 서열과 마우스 IgG2a Fc knob DANG으로 구성된다.
[seq34]는 마우스 IL-12 p40(베타) 영역 서열과 링커 GGGGSGGGGSGGGGS, 마우스 IL-12 p35 (알파) 영역 서열, 링커 GGGGSGGGGS 및 마우스 IgG2a Fc hole DANG으로 구성된다.
[seq35]는 헤파린 결합에 관여하는 아미노산의 변이(2개)가 포함된 마우스 IL-12 p40 (베타) 영역 서열, 링커 GGGGSGGGGSGGGGS, 마우스 IL-12 p35(알파) 영역 서열, 링커 GGGGSGGGGS 및 마우스 IgG2a Fc hole DANG으로 구성된다.
[seq36]은 헤파린 결합에 관여하는 아미노산의 변이(4개)가 포함된 마우스 IL-12 p40(베타) 영역 서열, 링커 GGGGSGGGGSGGGGS, 마우스 IL-12 p35(알파) 영역 서열 및 링커 GGGGSGGGGS과 마우스 IgG2a Fc로 구성된다.
[seq37]은 마우스 항-FAP(anti-FAP) 중쇄 가변영역 서열 및 마우스 IgG2a Fc knob으로 구성된다.
[seq38]은 마우스 항-FAP(anti-FAP) 경쇄 서열로 구성된다.
[seq39]는 마우스 항-FAP(anti-FAP) 중쇄 가변영역 서열 및 마우스 IgG2a Fc knob DANG으로 구성된다.
[seq40]은 마우스 IgG2a Fc knob DANG만으로 구성된다.
[seq41]은 마우스 IgG2a Fc hole DANG만으로 구성된다.
[seq42]는 마우스 항-CD20(anti-CD20) 항체 18B12의 중쇄 서열이다.
[seq278]은 마우스 IL-12 p40(베타) 영역 서열과 링커 GGGGSGGGGSGGGGS, 마우스 IL-12 p35(알파) 영역 서열, 링커 GGGGSGGGGS 및 마우스 IgG2a Fc hole, 링커 GGGGSGGGGSGGGGS, 마우스 항-CD20(anti-CD20) 중쇄 가변영역 서열, 링커 GGGGSGGGGSGGGGSGGGGS 및 마우스 항-CD20(anti-CD20) 경쇄 가변영역 서열로 구성된다.
[seq279]는 헤파린 결합에 관여하는 아미노산 변이(4개)가 포함된 마우스 IL-12 p40(베타) 영역 서열 과 링커 GGGGSGGGGSGGGGS, 마우스 IL-12 p35(알파) 영역 서열, 링커 GGGGSGGGGS 및 마우스 IgG2a Fc hole, 링커 GGGGSGGGGSGGGGS, 마우스 항-CD20(anti-CD20) 중쇄 가변영역 서열, 링커 GGGGSGGGGSGGGGSGGGGS 및 마우스 항-CD20(anti-CD20) 경쇄 가변영역 서열로 구성된다.
[seq280]은 마우스 항-CD20(anti-CD20) 중쇄 서열과 마우스 IgG2a Fc, 링커 GGGGSGGGGSGGGGS, 마우스 IL-12의 p40(베타) 영역 서열, 링커 GGGGSGGGGSGGGGS 및 마우스 IL-12 p35(알파) 영역 서열로 구성된다.
[seq281]은 마우스 항-CD20(anti-CD20) 중쇄 서열과 마우스 IgG2a Fc, 링커 GGGGSGGGGSGGGGS, 헤파린 결합에 관여하는 아미노산의 변이(4개)가 포함된 마우스 IL-12의 p40(베타) 영역 서열, 링커 GGGGSGGGGSGGGGS 및 마우스 IL-12 p35(알파) 영역 서열로 구성된다.
[seq282]는 마우스 IL-12 p40(베타) 영역 서열과 링커 GGGGSGGGGSGGGGS, 마우스 IL-12 p35(알파) 영역 서열, 링커 GGGGSGGGGS 및 마우스 IgG2a Fc, 링커 GGGGSGGGGSGGGGS, 마우스 항-CD20(anti-CD20) 중쇄 가변영역 서열, 링커 GGGGSGGGGSGGGGSGGGGS 및 마우스 항-CD20(anti-CD20) 경쇄 가변영역 서열로 구성된다.
[seq283]은 헤파린 결합에 관여하는 아미노산 변이(4개)가 포함된 마우스 IL-12 p40(베타) 영역 서열과 링커 GGGGSGGGGSGGGGS, 마우스 IL-12 p35(알파) 영역 서열, 링커 GGGGSGGGGS 및 마우스 IgG2a Fc, 링커 GGGGSGGGGSGGGGS, 마우스 항-CD20(anti-CD20) 중쇄 가변영역 서열, 링커 GGGGSGGGGSGGGGSGGGGS 및 마우스 항-CD20(anti-CD20) 경쇄 가변영역 서열로 구성된다.
T2.01m(seq22, seq23, seq24)은 단백질 CD20를 표적으로 하는 마우스 항-CD20 서열 및 마우스 IL-12 서열이 놉-인투-홀 구조를 이루는 이중 항체이다.
T2.02m(seq22, seq23, seq25)은 단백질 CD20를 표적으로 하는 마우스 항-CD20 서열과 헤파린 결합에 관여하는 아미노산의 변이(2개)가 포함된 마우스 IL-12 서열이 놉-인투-홀 구조를 이루는 이중 항체이다.
T2.03m(seq22, seq23, seq26)은 단백질 CD20를 표적으로 하는 마우스 항-CD20 서열과 헤파린 결합에 관여하는 아미노산의 변이(4개)가 포함된 마우스 IL-12 서열이 놉-인투-홀 구조를 이루는 이중 항체이다.
T2.04m(seq24, seq27, seq28)은 이중 가변 도메인 면역글로블린(dual variable domain Immunoglobulin, DVD-Ig) 형태의 마우스 항-CD20 서열과 마우스 IL-12 서열이 놉-인투-홀 구조를 이루는 이중 항체이다.
T2.05m(seq26, seq27, seq28)은 이중 가변 도메인 면역글로블린(dual variable domain Immunoglobulin, DVD-Ig) 형태의 마우스 항-CD20 서열 및 헤파린 결합에 관여하는 아미노산의 변이(4개)가 포함된 마우스 IL-12 서열이 놉-인투-홀 구조를 이루는 이중 항체이다.
T2.06m(seq23, seq24, seq29)은 중쇄의 C 말단에 단백질 CD20를 표적으로 하는 마우스 항-CD20 서열의 단일쇄 가변영역 단편(single chain fragment variable, scFv)이 연결된 마우스 항-CD20 서열 및 마우스 IL-12 서열이 놉-인투-홀 구조를 이루는 이중 항체이다.
T2.07m(seq23, seq26, seq29)은 중쇄의 C 말단에 단백질 CD20를 표적으로 하는 마우스 항-CD20 서열의 단일쇄 가변영역 단편(single chain fragment variable, scFv)이 연결된 마우스 항-CD20 서열 및 헤파린 결합에 관여하는 아미노산의 변이(4개)가 포함된 마우스 IL-12 서열이 놉-인투-홀 구조를 이루는 이중 항체이다.
T2.08m(seq22, seq24, seq30)은 경쇄의 C 말단에 단백질 CD20를 표적으로 하는 마우스 항-CD20 서열의 단일쇄 가변영역 단편(single chain fragment variable, scFv)이 연결된 마우스 항-CD20 서열 및 마우스 IL-12 서열이 놉-인투-홀 구조를 이루는 이중 항체이다.
T2.09m(seq22, seq26, seq30)은 경쇄의 C 말단에 단백질 CD20를 표적으로 하는 마우스 항-CD20 서열의 단일쇄 가변영역 단편(single chain fragment variable, scFv)이 연결된 마우스 항-CD20 서열과 헤파린 결합에 관여하는 아미노산의 변이(4개)가 포함된 마우스 IL-12 서열이 놉-인투-홀 구조를 이루는 이중 항체이다.
T2.10m(seq22, seq23, seq31)은 단백질 CD20를 표적으로 하는 마우스 항-CD20 서열과 중쇄의 C말단에 마우스 IL-12 서열이 연결된 마우스 항-CD20 서열이 놉-인투-홀 구조를 이루는 항체이다.
T2.11m(seq22, seq23, seq32)은 단백질 CD20를 표적으로 하는 마우스 항-CD20 서열과 중쇄의 C말단에 헤파린 결합에 관여하는 아미노산의 변이(4개)가 포함된 마우스 IL-12 서열이 연결된 마우스 항-CD20 서열이 놉-인투-홀 구조를 이루는 항체이다.
T2.12m(seq23, seq33, seq35)은 단백질 CD20를 표적으로 하는 마우스 항-CD20 서열 및 헤파린 결합에 관여하는 아미노산의 변이(2개)가 포함된 마우스 IL-12 서열이 놉-인투-홀 구조를 이루며, 이펙터 기능이 제거된 이중 항체이다.
T2.13m(seq34, seq40)은 마우스 IL-12 서열만을 갖는 놉-인투-홀 구조의 이펙터 기능이 제거된 항체이다.
T2.14m(seq35, seq40)은 헤파린 결합에 관여하는 아미노산의 변이(2개)가 포함된 마우스 IL-12 서열만을 갖는 놉-인투-홀 구조의 이펙터 기능이 제거된 항체이다.
T2.15m(seq36)은 헤파린 결합에 관여하는 아미노산의 변이(4개)가 포함된 마우스 IL-12 서열만을 갖는 Fc-퓨전 단백질이다.
T2.16m(seq25, seq37, seq38)은 단백질 FAP을 표적으로 하는 마우스 항-FAP 서열과 헤파린 결합에 관여하는 아미노산의 변이(2개)가 포함된 마우스 IL-12 서열이 놉-인투-홀 구조를 이루는 이중 항체이다.
T2.17m(seq38, seq39, seq41)은 단백질 FAP을 표적으로 하는 마우스 항-FAP 서열만을 갖는 놉-인투-홀 구조의 이펙터 기능이 제거된 항체이다.
18B12(seq23, seq42)은 단백질 CD20를 표적으로 하는 마우스 항-CD20(18B12) 항체이다.
T2.18m(seq22, seq23, seq278)은 마우스 항-CD20 서열과 C 말단에 마우스 항-CD20 서열의 단일쇄 가변영역 단편(single chain fragment variable, scFv)이 연결된 마우스 IL-12 서열이 놉-인투-홀 구조를 이루는 이중 항체이다.
T2.19m(seq22, seq23, seq279)은 마우스 항-CD20 중쇄 서열과 C 말단에 마우스 항-CD20 서열의 단일쇄 가변영역 단편(single chain fragment variable, scFv)이 연결된 채 헤파린 결합에 관여하는 아미노산의 변이(4개)가 포함된 마우스 IL-12 서열이 놉-인투-홀 구조를 이루는 이중 항체이다.
T2.20m(seq23, seq280)은 중쇄의 C 말단에 마우스 IL-12 서열이 연결된 마우스 항-CD20 서열을 포함한 Fc-퓨전 단백질 이량체이다.
T2.21m(seq23, seq281)은 중쇄의 C 말단에 헤파린 결합에 관여하는 아미노산의 변이(4개)가 포함된 마우스 IL-12 서열이 연결된 마우스 항-CD20 서열을 포함한 Fc-퓨전 단백질 이량체이다.
T2.22m(seq282)은 C 말단에 마우스 항-CD20 서열의 단일쇄 가변영역 단편(single chain fragment variable, scFv)이 연결된 마우스 IL-12 서열을 포함한 Fc-퓨전 단백질 이량체이다.
T2.23m(seq283)은 C 말단에 마우스 항-CD20 서열의 단일쇄 가변영역 단편(single chain fragment variable, scFv)이 연결된 채 헤파린 결합에 관여하는 아미노산의 변이(4개)를 포함한 마우스 IL-12 서열로 구성된 Fc-퓨전 단백질 이량체이다.
[seq22] anti-mu CD20 HC mu IgG2a Fc knob
QVQLQQPGAELVRPGTSVKLSCKASGYTFTSYWMHWIKQRPGQGLEWIGVIDPSDNYTKYNQKFKGKATLTVDTSSSTAYMQLSSLTSEDSAVYFCAREGYYGSSPWFAYWGQGTLVTVSSAKTTAPSVYPLAPVCGDTTGSSVTLGCLVKGYFPEPVTLTWNSGSLSSGVHTFPAVLQSDLYTLSSSVTVTSSTWPSQSITCNVAHPASSTKVDKKIEPRGPTIKPCPPCKCPAPNLLGGPSVFIFPPKIKDVLMISLSPIVTCVVVDVSEDDPDVQISWFVNNVEVHTAQTQTHREDYNSTLRVVSALPIQHQDWMSGKEFKCKVNNKDLPAPIERTISKPKGSVRAPQVYVLPPPEEEMTKKQVTLWCMVTDFMPEDIYVEWTNNGKTELNYKNTEPVLDSDGSYFMYSKLRVEKKNWVERNSYSCSVVHEGLHNHHTTKSFSRTPGK
[seq23] anti-mu CD20 LC
QIVMSQSPAILSASPGEKVTMTCRARSSVSYIHWYQQKPGSSPKPWIYATSNLASGVPGRFSGSGSGTSYSLTITRVEAEDAATYYCQQWSSKPPTFGGGTKLEIKRTDAAPTVSIFPPSSEQLTSGGASVVCFLNNFYPKDINVKWKIDGSERQNGVLNSWTDQDSKDSTYSMSSTLTLTKDEYERHNSYTCEATHKTSTSPIVKSFNRNEC
[seq24] mu scIL-12-mu IgG2a Fc hole
MWELEKDVYVVEVDWTPDAPGETVNLTCDTPEEDDITWTSDQRHGVIGSGKTLTITVKEFLDAGQYTCHKGGETLSHSHLLLHKKENGIWSTEILKNFKNKTFLKCEAPNYSGRFTCSWLVQRNMDLKFNIKSSSSSPDSRAVTCGMASLSAEKVTLDQRDYEKYSVSCQEDVTCPTAEETLPIELALEARQQNKYENYSTSFFIRDIIKPDPPKNLQMKPLKNSQVEVSWEYPDSWSTPHSYFSLKFFVRIQRKKEKMKETEEGCNQKGAFLVEKTSTEVQCKGGNVCVQAQDRYYNSSCSKWACVPCRVRSGGGGSGGGGSGGGGSRVIPVSGPARCLSQSRNLLKTTDDMVKTAREKLKHYSCTAEDIDHEDITRDQTSTLKTCLPLELHKNESCLATRETSSTTRGSCLPPQKTSLMMTLCLGSIYEDLKMYQTEFQAINAALQNHNHQQIILDKGMLVAIDELMQSLNHNGETLRQKPPVGEADPYRVKMKLCILLHAFSTRVVTINRVMGYLSSAGGGGSGGGGSEPRGPTIKPCPPCKCPAPNLLGGPSVFIFPPKIKDVLMISLSPIVTCVVVDVSEDDPDVQISWFVNNVEVHTAQTQTHREDYNSTLRVVSALPIQHQDWMSGKEFKCKVNNKDLPAPIERTISKPKGSVRAPQVYVLPPPEEEMTKKQVTLSCAVTDFMPEDIYVEWTNNGKTELNYKNTEPVLDSDGSYFMVSKLRVEKKNWVERNSYSCSVVHEGLHNHHTTKSFSRTPGK
[seq25] mu scIL-12 mut1-mu IgG2a Fc hole
MWELEKDVYVVEVDWTPDAPGETVNLTCDTPEEDDITWTSDQRHGVIGSGKTLTITVKEFLDAGQYTCHKGGETLSHSHLLLHKKENGIWSTEILKNFKNKTFLKCEAPNYSGRFTCSWLVQRNMDLKFNIKSSSSSPDSRAVTCGMASLSAEKVTLDQRDYEKYSVSCQEDVTCPTAEETLPIELALEARQQNKYENYSTSFFIRDIIKPDPPKNLQMKPLKNSQVEVSWEYPDSWSTPHSYFSLKFFVRIQRAKEKMAETEEGCNQKGAFLVEKTSTEVQCKGGNVCVQAQDRYYNSSCSKWACVPCRVRSGGGGSGGGGSGGGGSRVIPVSGPARCLSQSRNLLKTTDDMVKTAREKLKHYSCTAEDIDHEDITRDQTSTLKTCLPLELHKNESCLATRETSSTTRGSCLPPQKTSLMMTLCLGSIYEDLKMYQTEFQAINAALQNHNHQQIILDKGMLVAIDELMQSLNHNGETLRQKPPVGEADPYRVKMKLCILLHAFSTRVVTINRVMGYLSSAGGGGSGGGGSEPRGPTIKPCPPCKCPAPNLLGGPSVFIFPPKIKDVLMISLSPIVTCVVVDVSEDDPDVQISWFVNNVEVHTAQTQTHREDYNSTLRVVSALPIQHQDWMSGKEFKCKVNNKDLPAPIERTISKPKGSVRAPQVYVLPPPEEEMTKKQVTLSCAVTDFMPEDIYVEWTNNGKTELNYKNTEPVLDSDGSYFMVSKLRVEKKNWVERNSYSCSVVHEGLHNHHTTKSFSRTPGK
[seq26] mu scIL-12 mut2-mu IgG2a Fc hole
MWELEKDVYVVEVDWTPDAPGETVNLTCDTPEEDDITWTSDQRHGVIGSGKTLTITVKEFLDAGQYTCHKGGETLSHSHLLLHKKENGIWSTEILKNFKNKTFLKCEAPNYSGRFTCSWLVQRNMDLKFNIKSSSSSPDSRAVTCGMASLSAEKVTLDQRDYEKYSVSCQEDVTCPTAEETLPIELALEARQQNKYENYSTSFFIRDIIKPDPPKNLQMKPLKNSQVEVSWEYPDSWSTPHSYFSLKFFVRIQAAAEKMAETEEGCNQKGAFLVEKTSTEVQCKGGNVCVQAQDRYYNSSCSKWACVPCRVRSGGGGSGGGGSGGGGSRVIPVSGPARCLSQSRNLLKTTDDMVKTAREKLKHYSCTAEDIDHEDITRDQTSTLKTCLPLELHKNESCLATRETSSTTRGSCLPPQKTSLMMTLCLGSIYEDLKMYQTEFQAINAALQNHNHQQIILDKGMLVAIDELMQSLNHNGETLRQKPPVGEADPYRVKMKLCILLHAFSTRVVTINRVMGYLSSAGGGGSGGGGSEPRGPTIKPCPPCKCPAPNLLGGPSVFIFPPKIKDVLMISLSPIVTCVVVDVSEDDPDVQISWFVNNVEVHTAQTQTHREDYNSTLRVVSALPIQHQDWMSGKEFKCKVNNKDLPAPIERTISKPKGSVRAPQVYVLPPPEEEMTKKQVTLSCAVTDFMPEDIYVEWTNNGKTELNYKNTEPVLDSDGSYFMVSKLRVEKKNWVERNSYSCSVVHEGLHNHHTTKSFSRTPGK
[seq27] (anti-mu CD20 VH)2-mu IgG2a Fc knob
QVQLQQPGAELVRPGTSVKLSCKASGYTFTSYWMHWIKQRPGQGLEWIGVIDPSDNYTKYNQKFKGKATLTVDTSSSTAYMQLSSLTSEDSAVYFCAREGYYGSSPWFAYWGQGTLVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSQVQLQQPGAELVRPGTSVKLSCKASGYTFTSYWMHWIKQRPGQGLEWIGVIDPSDNYTKYNQKFKGKATLTVDTSSSTAYMQLSSLTSEDSAVYFCAREGYYGSSPWFAYWGQGTLVTVSSAKTTAPSVYPLAPVCGDTTGSSVTLGCLVKGYFPEPVTLTWNSGSLSSGVHTFPAVLQSDLYTLSSSVTVTSSTWPSQSITCNVAHPASSTKVDKKIEPRGPTIKPCPPCKCPAPNLLGGPSVFIFPPKIKDVLMISLSPIVTCVVVDVSEDDPDVQISWFVNNVEVHTAQTQTHREDYNSTLRVVSALPIQHQDWMSGKEFKCKVNNKDLPAPIERTISKPKGSVRAPQVYVLPPPEEEMTKKQVTLWCMVTDFMPEDIYVEWTNNGKTELNYKNTEPVLDSDGSYFMYSKLRVEKKNWVERNSYSCSVVHEGLHNHHTTKSFSRTPGK
[seq28] (anti-mu CD20 VL)2
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[seq29] anti-mu CD20 HC mu IgG2a Fc knob-anti-mu CD20 scFv
QVQLQQPGAELVRPGTSVKLSCKASGYTFTSYWMHWIKQRPGQGLEWIGVIDPSDNYTKYNQKFKGKATLTVDTSSSTAYMQLSSLTSEDSAVYFCAREGYYGSSPWFAYWGQGTLVTVSSAKTTAPSVYPLAPVCGDTTGSSVTLGCLVKGYFPEPVTLTWNSGSLSSGVHTFPAVLQSDLYTLSSSVTVTSSTWPSQSITCNVAHPASSTKVDKKIEPRGPTIKPCPPCKCPAPNLLGGPSVFIFPPKIKDVLMISLSPIVTCVVVDVSEDDPDVQISWFVNNVEVHTAQTQTHREDYNSTLRVVSALPIQHQDWMSGKEFKCKVNNKDLPAPIERTISKPKGSVRAPQVYVLPPPEEEMTKKQVTLWCMVTDFMPEDIYVEWTNNGKTELNYKNTEPVLDSDGSYFMYSKLRVEKKNWVERNSYSCSVVHEGLHNHHTTKSFSRTPGKGGGGSGGGGSGGGGSQVQLQQPGAELVRPGTSVKLSCKASGYTFTSYWMHWIKQRPGQGLEWIGVIDPSDNYTKYNQKFKGKATLTVDTSSSTAYMQLSSLTSEDSAVYFCAREGYYGSSPWFAYWGQGTLVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSQIVMSQSPAILSASPGEKVTMTCRARSSVSYIHWYQQKPGSSPKPWIYATSNLASGVPGRFSGSGSGTSYSLTITRVEAEDAATYYCQQWSSKPPTFGGGTKLEIK
[seq30] anti-mu CD20 LC-anti-mu CD20 scFv
QIVMSQSPAILSASPGEKVTMTCRARSSVSYIHWYQQKPGSSPKPWIYATSNLASGVPGRFSGSGSGTSYSLTITRVEAEDAATYYCQQWSSKPPTFGGGTKLEIKRTDAAPTVSIFPPSSEQLTSGGASVVCFLNNFYPKDINVKWKIDGSERQNGVLNSWTDQDSKDSTYSMSSTLTLTKDEYERHNSYTCEATHKTSTSPIVKSFNRNECGGGGSGGGGSGGGGSQVQLQQPGAELVRPGTSVKLSCKASGYTFTSYWMHWIKQRPGQGLEWIGVIDPSDNYTKYNQKFKGKATLTVDTSSSTAYMQLSSLTSEDSAVYFCAREGYYGSSPWFAYWGQGTLVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSQIVMSQSPAILSASPGEKVTMTCRARSSVSYIHWYQQKPGSSPKPWIYATSNLASGVPGRFSGSGSGTSYSLTITRVEAEDAATYYCQQWSSKPPTFGGGTKLEIK
[seq31] anti-mu CD20 HC mu IgG2a Fc hole-mu scIL-12
QVQLQQPGAELVRPGTSVKLSCKASGYTFTSYWMHWIKQRPGQGLEWIGVIDPSDNYTKYNQKFKGKATLTVDTSSSTAYMQLSSLTSEDSAVYFCAREGYYGSSPWFAYWGQGTLVTVSSAKTTAPSVYPLAPVCGDTTGSSVTLGCLVKGYFPEPVTLTWNSGSLSSGVHTFPAVLQSDLYTLSSSVTVTSSTWPSQSITCNVAHPASSTKVDKKIEPRGPTIKPCPPCKCPAPNLLGGPSVFIFPPKIKDVLMISLSPIVTCVVVDVSEDDPDVQISWFVNNVEVHTAQTQTHREDYNSTLRVVSALPIQHQDWMSGKEFKCKVNNKDLPAPIERTISKPKGSVRAPQVYVLPPPEEEMTKKQVTLSCAVTDFMPEDIYVEWTNNGKTELNYKNTEPVLDSDGSYFMVSKLRVEKKNWVERNSYSCSVVHEGLHNHHTTKSFSRTPGKGGGGSGGGGSGGGGSMWELEKDVYVVEVDWTPDAPGETVNLTCDTPEEDDITWTSDQRHGVIGSGKTLTITVKEFLDAGQYTCHKGGETLSHSHLLLHKKENGIWSTEILKNFKNKTFLKCEAPNYSGRFTCSWLVQRNMDLKFNIKSSSSSPDSRAVTCGMASLSAEKVTLDQRDYEKYSVSCQEDVTCPTAEETLPIELALEARQQNKYENYSTSFFIRDIIKPDPPKNLQMKPLKNSQVEVSWEYPDSWSTPHSYFSLKFFVRIQRKKEKMKETEEGCNQKGAFLVEKTSTEVQCKGGNVCVQAQDRYYNSSCSKWACVPCRVRSGGGGSGGGGSGGGGSRVIPVSGPARCLSQSRNLLKTTDDMVKTAREKLKHYSCTAEDIDHEDITRDQTSTLKTCLPLELHKNESCLATRETSSTTRGSCLPPQKTSLMMTLCLGSIYEDLKMYQTEFQAINAALQNHNHQQIILDKGMLVAIDELMQSLNHNGETLRQKPPVGEADPYRVKMKLCILLHAFSTRVVTINRVMGYLSSA
[seq32] anti-mu CD20 HC mu IgG2a Fc hole-mu scIL-12 mut2
QVQLQQPGAELVRPGTSVKLSCKASGYTFTSYWMHWIKQRPGQGLEWIGVIDPSDNYTKYNQKFKGKATLTVDTSSSTAYMQLSSLTSEDSAVYFCAREGYYGSSPWFAYWGQGTLVTVSSAKTTAPSVYPLAPVCGDTTGSSVTLGCLVKGYFPEPVTLTWNSGSLSSGVHTFPAVLQSDLYTLSSSVTVTSSTWPSQSITCNVAHPASSTKVDKKIEPRGPTIKPCPPCKCPAPNLLGGPSVFIFPPKIKDVLMISLSPIVTCVVVDVSEDDPDVQISWFVNNVEVHTAQTQTHREDYNSTLRVVSALPIQHQDWMSGKEFKCKVNNKDLPAPIERTISKPKGSVRAPQVYVLPPPEEEMTKKQVTLSCAVTDFMPEDIYVEWTNNGKTELNYKNTEPVLDSDGSYFMVSKLRVEKKNWVERNSYSCSVVHEGLHNHHTTKSFSRTPGKGGGGSGGGGSGGGGSMWELEKDVYVVEVDWTPDAPGETVNLTCDTPEEDDITWTSDQRHGVIGSGKTLTITVKEFLDAGQYTCHKGGETLSHSHLLLHKKENGIWSTEILKNFKNKTFLKCEAPNYSGRFTCSWLVQRNMDLKFNIKSSSSSPDSRAVTCGMASLSAEKVTLDQRDYEKYSVSCQEDVTCPTAEETLPIELALEARQQNKYENYSTSFFIRDIIKPDPPKNLQMKPLKNSQVEVSWEYPDSWSTPHSYFSLKFFVRIQAAAEKMAETEEGCNQKGAFLVEKTSTEVQCKGGNVCVQAQDRYYNSSCSKWACVPCRVRSGGGGSGGGGSGGGGSRVIPVSGPARCLSQSRNLLKTTDDMVKTAREKLKHYSCTAEDIDHEDITRDQTSTLKTCLPLELHKNESCLATRETSSTTRGSCLPPQKTSLMMTLCLGSIYEDLKMYQTEFQAINAALQNHNHQQIILDKGMLVAIDELMQSLNHNGETLRQKPPVGEADPYRVKMKLCILLHAFSTRVVTINRVMGYLSSA
[seq33] anti-mu CD20 HC mu IgG2a Fc knob DANG
QVQLQQPGAELVRPGTSVKLSCKASGYTFTSYWMHWIKQRPGQGLEWIGVIDPSDNYTKYNQKFKGKATLTVDTSSSTAYMQLSSLTSEDSAVYFCAREGYYGSSPWFAYWGQGTLVTVSSAKTTAPSVYPLAPVCGDTTGSSVTLGCLVKGYFPEPVTLTWNSGSLSSGVHTFPAVLQSDLYTLSSSVTVTSSTWPSQSITCNVAHPASSTKVDKKIEPRGPTIKPCPPCKCPAPNLLGGPSVFIFPPKIKDVLMISLSPIVTCVVVAVSEDDPDVQISWFVNNVEVHTAQTQTHREDYGSTLRVVSALPIQHQDWMSGKEFKCKVNNKDLPAPIERTISKPKGSVRAPQVYVLPPPEEEMTKKQVTLWCMVTDFMPEDIYVEWTNNGKTELNYKNTEPVLDSDGSYFMYSKLRVEKKNWVERNSYSCSVVHEGLHNHHTTKSFSRTPGK
[seq34] mu scIL-12-mu IgG2a Fc hole DANG
MWELEKDVYVVEVDWTPDAPGETVNLTCDTPEEDDITWTSDQRHGVIGSGKTLTITVKEFLDAGQYTCHKGGETLSHSHLLLHKKENGIWSTEILKNFKNKTFLKCEAPNYSGRFTCSWLVQRNMDLKFNIKSSSSSPDSRAVTCGMASLSAEKVTLDQRDYEKYSVSCQEDVTCPTAEETLPIELALEARQQNKYENYSTSFFIRDIIKPDPPKNLQMKPLKNSQVEVSWEYPDSWSTPHSYFSLKFFVRIQRKKEKMKETEEGCNQKGAFLVEKTSTEVQCKGGNVCVQAQDRYYNSSCSKWACVPCRVRSGGGGSGGGGSGGGGSRVIPVSGPARCLSQSRNLLKTTDDMVKTAREKLKHYSCTAEDIDHEDITRDQTSTLKTCLPLELHKNESCLATRETSSTTRGSCLPPQKTSLMMTLCLGSIYEDLKMYQTEFQAINAALQNHNHQQIILDKGMLVAIDELMQSLNHNGETLRQKPPVGEADPYRVKMKLCILLHAFSTRVVTINRVMGYLSSAGGGGSGGGGSEPRGPTIKPCPPCKCPAPNLLGGPSVFIFPPKIKDVLMISLSPIVTCVVVAVSEDDPDVQISWFVNNVEVHTAQTQTHREDYGSTLRVVSALPIQHQDWMSGKEFKCKVNNKDLPAPIERTISKPKGSVRAPQVYVLPPPEEEMTKKQVTLSCAVTDFMPEDIYVEWTNNGKTELNYKNTEPVLDSDGSYFMVSKLRVEKKNWVERNSYSCSVVHEGLHNHHTTKSFSRTPGK
[seq35] mu scIL-12 mut1-mu IgG2a Fc hole DANG
MWELEKDVYVVEVDWTPDAPGETVNLTCDTPEEDDITWTSDQRHGVIGSGKTLTITVKEFLDAGQYTCHKGGETLSHSHLLLHKKENGIWSTEILKNFKNKTFLKCEAPNYSGRFTCSWLVQRNMDLKFNIKSSSSSPDSRAVTCGMASLSAEKVTLDQRDYEKYSVSCQEDVTCPTAEETLPIELALEARQQNKYENYSTSFFIRDIIKPDPPKNLQMKPLKNSQVEVSWEYPDSWSTPHSYFSLKFFVRIQRAKEKMAETEEGCNQKGAFLVEKTSTEVQCKGGNVCVQAQDRYYNSSCSKWACVPCRVRSGGGGSGGGGSGGGGSRVIPVSGPARCLSQSRNLLKTTDDMVKTAREKLKHYSCTAEDIDHEDITRDQTSTLKTCLPLELHKNESCLATRETSSTTRGSCLPPQKTSLMMTLCLGSIYEDLKMYQTEFQAINAALQNHNHQQIILDKGMLVAIDELMQSLNHNGETLRQKPPVGEADPYRVKMKLCILLHAFSTRVVTINRVMGYLSSAGGGGSGGGGSEPRGPTIKPCPPCKCPAPNLLGGPSVFIFPPKIKDVLMISLSPIVTCVVVAVSEDDPDVQISWFVNNVEVHTAQTQTHREDYGSTLRVVSALPIQHQDWMSGKEFKCKVNNKDLPAPIERTISKPKGSVRAPQVYVLPPPEEEMTKKQVTLSCAVTDFMPEDIYVEWTNNGKTELNYKNTEPVLDSDGSYFMVSKLRVEKKNWVERNSYSCSVVHEGLHNHHTTKSFSRTPGK
[seq36] mu scIL-12 mut2-mu IgG2a Fc
MWELEKDVYVVEVDWTPDAPGETVNLTCDTPEEDDITWTSDQRHGVIGSGKTLTITVKEFLDAGQYTCHKGGETLSHSHLLLHKKENGIWSTEILKNFKNKTFLKCEAPNYSGRFTCSWLVQRNMDLKFNIKSSSSSPDSRAVTCGMASLSAEKVTLDQRDYEKYSVSCQEDVTCPTAEETLPIELALEARQQNKYENYSTSFFIRDIIKPDPPKNLQMKPLKNSQVEVSWEYPDSWSTPHSYFSLKFFVRIQAAAEKMAETEEGCNQKGAFLVEKTSTEVQCKGGNVCVQAQDRYYNSSCSKWACVPCRVRSGGGGSGGGGSGGGGSRVIPVSGPARCLSQSRNLLKTTDDMVKTAREKLKHYSCTAEDIDHEDITRDQTSTLKTCLPLELHKNESCLATRETSSTTRGSCLPPQKTSLMMTLCLGSIYEDLKMYQTEFQAINAALQNHNHQQIILDKGMLVAIDELMQSLNHNGETLRQKPPVGEADPYRVKMKLCILLHAFSTRVVTINRVMGYLSSAGGGGSGGGGSEPRGPTIKPCPPCKCPAPNLLGGPSVFIFPPKIKDVLMISLSPIVTCVVVDVSEDDPDVQISWFVNNVEVHTAQTQTHREDYNSTLRVVSALPIQHQDWMSGKEFKCKVNNKDLPAPIERTISKPKGSVRAPQVYVLPPPEEEMTKKQVTLTCMVTDFMPEDIYVEWTNNGKTELNYKNTEPVLDSDGSYFMYSKLRVEKKNWVERNSYSCSVVHEGLHNHHTTKSFSRTPGK
[seq37] anti-mu FAP HC mu IgG2a Fc knob
QVQLQQSGAELARPGASVNLSCKASGYTFTNNGINWLKQRTGQGLEWIGEIYPRSTNTLYNEKFKGKATLTADRSSNTAYMELRSLTSEDSAVYFCARTLTAPFAFWGQGTLVTVSAAKTTAPSVYPLAPVCGDTTGSSVTLGCLVKGYFPEPVTLTWNSGSLSSGVHTFPAVLQSDLYTLSSSVTVTSSTWPSQSITCNVAHPASSTKVDKKIEPRGPTIKPCPPCKCPAPNLLGGPSVFIFPPKIKDVLMISLSPIVTCVVVDVSEDDPDVQISWFVNNVEVHTAQTQTHREDYNSTLRVVSALPIQHQDWMSGKEFKCKVNNKDLPAPIERTISKPKGSVRAPQVYVLPPPEEEMTKKQVTLWCMVTDFMPEDIYVEWTNNGKTELNYKNTEPVLDSDGSYFMYSKLRVEKKNWVERNSYSCSVVHEGLHNHHTTKSFSRTPGK
[seq38] anti-mu FAP LC
QIVLTQSPAIMSASPGEKVTMTCSASSGVNFMHWYQQKSGTSPKRWIFDTSKLASGVPARFSGSGSGTSYSLTISSMEAEDAATYYCQQWSFNPPTFGGGTKLEIKRADAAPTVSIFPPSSEQLTSGGASVVCFLNNFYPKDINVKWKIDGSERQNGVLNSWTDQDSKDSTYSMSSTLTLTKDEYERHNSYTCEATHKTSTSPIVKSFNRNEC
[seq39] anti-mu FAP HC mu IgG2a Fc knob DANG
QVQLQQSGAELARPGASVNLSCKASGYTFTNNGINWLKQRTGQGLEWIGEIYPRSTNTLYNEKFKGKATLTADRSSNTAYMELRSLTSEDSAVYFCARTLTAPFAFWGQGTLVTVSAAKTTAPSVYPLAPVCGDTTGSSVTLGCLVKGYFPEPVTLTWNSGSLSSGVHTFPAVLQSDLYTLSSSVTVTSSTWPSQSITCNVAHPASSTKVDKKIEPRGPTIKPCPPCKCPAPNLLGGPSVFIFPPKIKDVLMISLSPIVTCVVVAVSEDDPDVQISWFVNNVEVHTAQTQTHREDYGSTLRVVSALPIQHQDWMSGKEFKCKVNNKDLPAPIERTISKPKGSVRAPQVYVLPPPEEEMTKKQVTLWCMVTDFMPEDIYVEWTNNGKTELNYKNTEPVLDSDGSYFMYSKLRVEKKNWVERNSYSCSVVHEGLHNHHTTKSFSRTPGK
[seq40] mu IgG2a Fc knob DANG
EPRGPTIKPCPPCKCPAPNLLGGPSVFIFPPKIKDVLMISLSPIVTCVVVAVSEDDPDVQISWFVNNVEVHTAQTQTHREDYGSTLRVVSALPIQHQDWMSGKEFKCKVNNKDLPAPIERTISKPKGSVRAPQVYVLPPPEEEMTKKQVTLWCMVTDFMPEDIYVEWTNNGKTELNYKNTEPVLDSDGSYFMYSKLRVEKKNWVERNSYSCSVVHEGLHNHHTTKSFSRTPGK
[seq41] mu IgG2a Fc hole DANG
EPRGPTIKPCPPCKCPAPNLLGGPSVFIFPPKIKDVLMISLSPIVTCVVVAVSEDDPDVQISWFVNNVEVHTAQTQTHREDYGSTLRVVSALPIQHQDWMSGKEFKCKVNNKDLPAPIERTISKPKGSVRAPQVYVLPPPEEEMTKKQVTLSCAVTDFMPEDIYVEWTNNGKTELNYKNTEPVLDSDGSYFMVSKLRVEKKNWVERNSYSCSVVHEGLHNHHTTKSFSRTPGK
[seq42] anti-mu CD20 (18B12) HC
QVQLQQPGAELVRPGTSVKLSCKASGYTFTSYWMHWIKQRPGQGLEWIGVIDPSDNYTKYNQKFKGKATLTVDTSSSTAYMQLSSLTSEDSAVYFCAREGYYGSSPWFAYWGQGTLVTVSSAKTTAPSVYPLAPVCGDTTGSSVTLGCLVKGYFPEPVTLTWNSGSLSSGVHTFPAVLQSDLYTLSSSVTVTSSTWPSQSITCNVAHPASSTKVDKKIEPRGPTIKPCPPCKCPAPNLLGGPSVFIFPPKIKDVLMISLSPIVTCVVVDVSEDDPDVQISWFVNNVEVHTAQTQTHREDYNSTLRVVSALPIQHQDWMSGKEFKCKVNNKDLPAPIERTISKPKGSVRAPQVYVLPPPEEEMTKKQVTLTCMVTDFMPEDIYVEWTNNGKTELNYKNTEPVLDSDGSYFMYSKLRVEKKNWVERNSYSCSVVHEGLHNHHTTKSFSRTPGK
[seq278] mu scIL-12-mu IgG2a Fc hole-anti-mu CD20 scFv
MWELEKDVYVVEVDWTPDAPGETVNLTCDTPEEDDITWTSDQRHGVIGSGKTLTITVKEFLDAGQYTCHKGGETLSHSHLLLHKKENGIWSTEILKNFKNKTFLKCEAPNYSGRFTCSWLVQRNMDLKFNIKSSSSSPDSRAVTCGMASLSAEKVTLDQRDYEKYSVSCQEDVTCPTAEETLPIELALEARQQNKYENYSTSFFIRDIIKPDPPKNLQMKPLKNSQVEVSWEYPDSWSTPHSYFSLKFFVRIQRKKEKMKETEEGCNQKGAFLVEKTSTEVQCKGGNVCVQAQDRYYNSSCSKWACVPCRVRSGGGGSGGGGSGGGGSRVIPVSGPARCLSQSRNLLKTTDDMVKTAREKLKHYSCTAEDIDHEDITRDQTSTLKTCLPLELHKNESCLATRETSSTTRGSCLPPQKTSLMMTLCLGSIYEDLKMYQTEFQAINAALQNHNHQQIILDKGMLVAIDELMQSLNHNGETLRQKPPVGEADPYRVKMKLCILLHAFSTRVVTINRVMGYLSSAGGGGSGGGGSEPRGPTIKPCPPCKCPAPNLLGGPSVFIFPPKIKDVLMISLSPIVTCVVVDVSEDDPDVQISWFVNNVEVHTAQTQTHREDYNSTLRVVSALPIQHQDWMSGKEFKCKVNNKDLPAPIERTISKPKGSVRAPQVYVLPPPEEEMTKKQVTLSCAVTDFMPEDIYVEWTNNGKTELNYKNTEPVLDSDGSYFMVSKLRVEKKNWVERNSYSCSVVHEGLHNHHTTKSFSRTPGGGGGSGGGGSGGGGSQVQLQQPGAELVRPGTSVKLSCKASGYTFTSYWMHWIKQRPGQGLEWIGVIDPSDNYTKYNQKFKGKATLTVDTSSSTAYMQLSSLTSEDSAVYFCAREGYYGSSPWFAYWGQGTLVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSQIVMSQSPAILSASPGEKVTMTCRARSSVSYIHWYQQKPGSSPKPWIYATSNLASGVPGRFSGSGSGTSYSLTITRVEAEDAATYYCQQWSSKPPTFGGGTKLEIK
[seq279] mu scIL-12 mut2-mu IgG2a Fc hole-anti-mu CD20 scFv
MWELEKDVYVVEVDWTPDAPGETVNLTCDTPEEDDITWTSDQRHGVIGSGKTLTITVKEFLDAGQYTCHKGGETLSHSHLLLHKKENGIWSTEILKNFKNKTFLKCEAPNYSGRFTCSWLVQRNMDLKFNIKSSSSSPDSRAVTCGMASLSAEKVTLDQRDYEKYSVSCQEDVTCPTAEETLPIELALEARQQNKYENYSTSFFIRDIIKPDPPKNLQMKPLKNSQVEVSWEYPDSWSTPHSYFSLKFFVRIQAAAEKMAETEEGCNQKGAFLVEKTSTEVQCKGGNVCVQAQDRYYNSSCSKWACVPCRVRSGGGGSGGGGSGGGGSRVIPVSGPARCLSQSRNLLKTTDDMVKTAREKLKHYSCTAEDIDHEDITRDQTSTLKTCLPLELHKNESCLATRETSSTTRGSCLPPQKTSLMMTLCLGSIYEDLKMYQTEFQAINAALQNHNHQQIILDKGMLVAIDELMQSLNHNGETLRQKPPVGEADPYRVKMKLCILLHAFSTRVVTINRVMGYLSSAGGGGSGGGGSEPRGPTIKPCPPCKCPAPNLLGGPSVFIFPPKIKDVLMISLSPIVTCVVVDVSEDDPDVQISWFVNNVEVHTAQTQTHREDYNSTLRVVSALPIQHQDWMSGKEFKCKVNNKDLPAPIERTISKPKGSVRAPQVYVLPPPEEEMTKKQVTLSCAVTDFMPEDIYVEWTNNGKTELNYKNTEPVLDSDGSYFMVSKLRVEKKNWVERNSYSCSVVHEGLHNHHTTKSFSRTPGGGGGSGGGGSGGGGSQVQLQQPGAELVRPGTSVKLSCKASGYTFTSYWMHWIKQRPGQGLEWIGVIDPSDNYTKYNQKFKGKATLTVDTSSSTAYMQLSSLTSEDSAVYFCAREGYYGSSPWFAYWGQGTLVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSQIVMSQSPAILSASPGEKVTMTCRARSSVSYIHWYQQKPGSSPKPWIYATSNLASGVPGRFSGSGSGTSYSLTITRVEAEDAATYYCQQWSSKPPTFGGGTKLEIK
[seq280] anti-mu CD20 HC mu IgG2a Fc-mu scIL-12
QVQLQQPGAELVRPGTSVKLSCKASGYTFTSYWMHWIKQRPGQGLEWIGVIDPSDNYTKYNQKFKGKATLTVDTSSSTAYMQLSSLTSEDSAVYFCAREGYYGSSPWFAYWGQGTLVTVSSAKTTAPSVYPLAPVCGDTTGSSVTLGCLVKGYFPEPVTLTWNSGSLSSGVHTFPAVLQSDLYTLSSSVTVTSSTWPSQSITCNVAHPASSTKVDKKIEPRGPTIKPCPPCKCPAPNLLGGPSVFIFPPKIKDVLMISLSPIVTCVVVDVSEDDPDVQISWFVNNVEVHTAQTQTHREDYNSTLRVVSALPIQHQDWMSGKEFKCKVNNKDLPAPIERTISKPKGSVRAPQVYVLPPPEEEMTKKQVTLTCMVTDFMPEDIYVEWTNNGKTELNYKNTEPVLDSDGSYFMYSKLRVEKKNWVERNSYSCSVVHEGLHNHHTTKSFSRTPGGGGGSGGGGSGGGGSMWELEKDVYVVEVDWTPDAPGETVNLTCDTPEEDDITWTSDQRHGVIGSGKTLTITVKEFLDAGQYTCHKGGETLSHSHLLLHKKENGIWSTEILKNFKNKTFLKCEAPNYSGRFTCSWLVQRNMDLKFNIKSSSSSPDSRAVTCGMASLSAEKVTLDQRDYEKYSVSCQEDVTCPTAEETLPIELALEARQQNKYENYSTSFFIRDIIKPDPPKNLQMKPLKNSQVEVSWEYPDSWSTPHSYFSLKFFVRIQRKKEKMKETEEGCNQKGAFLVEKTSTEVQCKGGNVCVQAQDRYYNSSCSKWACVPCRVRSGGGGSGGGGSGGGGSRVIPVSGPARCLSQSRNLLKTTDDMVKTAREKLKHYSCTAEDIDHEDITRDQTSTLKTCLPLELHKNESCLATRETSSTTRGSCLPPQKTSLMMTLCLGSIYEDLKMYQTEFQAINAALQNHNHQQIILDKGMLVAIDELMQSLNHNGETLRQKPPVGEADPYRVKMKLCILLHAFSTRVVTINRVMGYLSSA
[seq281] anti-mu CD20 HC mu IgG2a Fc-mu scIL-12 mut2
QVQLQQPGAELVRPGTSVKLSCKASGYTFTSYWMHWIKQRPGQGLEWIGVIDPSDNYTKYNQKFKGKATLTVDTSSSTAYMQLSSLTSEDSAVYFCAREGYYGSSPWFAYWGQGTLVTVSSAKTTAPSVYPLAPVCGDTTGSSVTLGCLVKGYFPEPVTLTWNSGSLSSGVHTFPAVLQSDLYTLSSSVTVTSSTWPSQSITCNVAHPASSTKVDKKIEPRGPTIKPCPPCKCPAPNLLGGPSVFIFPPKIKDVLMISLSPIVTCVVVDVSEDDPDVQISWFVNNVEVHTAQTQTHREDYNSTLRVVSALPIQHQDWMSGKEFKCKVNNKDLPAPIERTISKPKGSVRAPQVYVLPPPEEEMTKKQVTLTCMVTDFMPEDIYVEWTNNGKTELNYKNTEPVLDSDGSYFMYSKLRVEKKNWVERNSYSCSVVHEGLHNHHTTKSFSRTPGGGGGSGGGGSGGGGSMWELEKDVYVVEVDWTPDAPGETVNLTCDTPEEDDITWTSDQRHGVIGSGKTLTITVKEFLDAGQYTCHKGGETLSHSHLLLHKKENGIWSTEILKNFKNKTFLKCEAPNYSGRFTCSWLVQRNMDLKFNIKSSSSSPDSRAVTCGMASLSAEKVTLDQRDYEKYSVSCQEDVTCPTAEETLPIELALEARQQNKYENYSTSFFIRDIIKPDPPKNLQMKPLKNSQVEVSWEYPDSWSTPHSYFSLKFFVRIQAAAEKMAETEEGCNQKGAFLVEKTSTEVQCKGGNVCVQAQDRYYNSSCSKWACVPCRVRSGGGGSGGGGSGGGGSRVIPVSGPARCLSQSRNLLKTTDDMVKTAREKLKHYSCTAEDIDHEDITRDQTSTLKTCLPLELHKNESCLATRETSSTTRGSCLPPQKTSLMMTLCLGSIYEDLKMYQTEFQAINAALQNHNHQQIILDKGMLVAIDELMQSLNHNGETLRQKPPVGEADPYRVKMKLCILLHAFSTRVVTINRVMGYLSSA
[seq282] mu scIL-12-mu IgG2a Fc-anti-mu CD20 scFv
MWELEKDVYVVEVDWTPDAPGETVNLTCDTPEEDDITWTSDQRHGVIGSGKTLTITVKEFLDAGQYTCHKGGETLSHSHLLLHKKENGIWSTEILKNFKNKTFLKCEAPNYSGRFTCSWLVQRNMDLKFNIKSSSSSPDSRAVTCGMASLSAEKVTLDQRDYEKYSVSCQEDVTCPTAEETLPIELALEARQQNKYENYSTSFFIRDIIKPDPPKNLQMKPLKNSQVEVSWEYPDSWSTPHSYFSLKFFVRIQRKKEKMKETEEGCNQKGAFLVEKTSTEVQCKGGNVCVQAQDRYYNSSCSKWACVPCRVRSGGGGSGGGGSGGGGSRVIPVSGPARCLSQSRNLLKTTDDMVKTAREKLKHYSCTAEDIDHEDITRDQTSTLKTCLPLELHKNESCLATRETSSTTRGSCLPPQKTSLMMTLCLGSIYEDLKMYQTEFQAINAALQNHNHQQIILDKGMLVAIDELMQSLNHNGETLRQKPPVGEADPYRVKMKLCILLHAFSTRVVTINRVMGYLSSAGGGGSGGGGSEPRGPTIKPCPPCKCPAPNLLGGPSVFIFPPKIKDVLMISLSPIVTCVVVDVSEDDPDVQISWFVNNVEVHTAQTQTHREDYNSTLRVVSALPIQHQDWMSGKEFKCKVNNKDLPAPIERTISKPKGSVRAPQVYVLPPPEEEMTKKQVTLTCMVTDFMPEDIYVEWTNNGKTELNYKNTEPVLDSDGSYFMYSKLRVEKKNWVERNSYSCSVVHEGLHNHHTTKSFSRTPGGGGGSGGGGSGGGGSQVQLQQPGAELVRPGTSVKLSCKASGYTFTSYWMHWIKQRPGQGLEWIGVIDPSDNYTKYNQKFKGKATLTVDTSSSTAYMQLSSLTSEDSAVYFCAREGYYGSSPWFAYWGQGTLVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSQIVMSQSPAILSASPGEKVTMTCRARSSVSYIHWYQQKPGSSPKPWIYATSNLASGVPGRFSGSGSGTSYSLTITRVEAEDAATYYCQQWSSKPPTFGGGTKLEIK
[seq283] mu scIL-12 mut2-mu IgG2a Fc-anti-mu CD20 scFv
MWELEKDVYVVEVDWTPDAPGETVNLTCDTPEEDDITWTSDQRHGVIGSGKTLTITVKEFLDAGQYTCHKGGETLSHSHLLLHKKENGIWSTEILKNFKNKTFLKCEAPNYSGRFTCSWLVQRNMDLKFNIKSSSSSPDSRAVTCGMASLSAEKVTLDQRDYEKYSVSCQEDVTCPTAEETLPIELALEARQQNKYENYSTSFFIRDIIKPDPPKNLQMKPLKNSQVEVSWEYPDSWSTPHSYFSLKFFVRIQAAAEKMAETEEGCNQKGAFLVEKTSTEVQCKGGNVCVQAQDRYYNSSCSKWACVPCRVRSGGGGSGGGGSGGGGSRVIPVSGPARCLSQSRNLLKTTDDMVKTAREKLKHYSCTAEDIDHEDITRDQTSTLKTCLPLELHKNESCLATRETSSTTRGSCLPPQKTSLMMTLCLGSIYEDLKMYQTEFQAINAALQNHNHQQIILDKGMLVAIDELMQSLNHNGETLRQKPPVGEADPYRVKMKLCILLHAFSTRVVTINRVMGYLSSAGGGGSGGGGSEPRGPTIKPCPPCKCPAPNLLGGPSVFIFPPKIKDVLMISLSPIVTCVVVDVSEDDPDVQISWFVNNVEVHTAQTQTHREDYNSTLRVVSALPIQHQDWMSGKEFKCKVNNKDLPAPIERTISKPKGSVRAPQVYVLPPPEEEMTKKQVTLTCMVTDFMPEDIYVEWTNNGKTELNYKNTEPVLDSDGSYFMYSKLRVEKKNWVERNSYSCSVVHEGLHNHHTTKSFSRTPGGGGGSGGGGSGGGGSQVQLQQPGAELVRPGTSVKLSCKASGYTFTSYWMHWIKQRPGQGLEWIGVIDPSDNYTKYNQKFKGKATLTVDTSSSTAYMQLSSLTSEDSAVYFCAREGYYGSSPWFAYWGQGTLVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSQIVMSQSPAILSASPGEKVTMTCRARSSVSYIHWYQQKPGSSPKPWIYATSNLASGVPGRFSGSGSGTSYSLTITRVEAEDAATYYCQQWSSKPPTFGGGTKLEIK
제조예 1. 융합단백질의 제조
하기 표 3 및 표 4에 시약 및 장비를 기재하였다.
시약 제조사 Catalog#
pTT5 chempartner
In-Fusion HD cloning kit Clontech 639648
Accuprime pfx DNA polymerase Invitrogen 12344-04
Gel DNA fragment purication Kit TaKaRa D823A
FastDigest®BamHI Fermentas FD0055
FastDigest®EcoRI Fermentas FD0275
장비 및 도구 제조사 모델명
생물 안전 작업대 NUAIRE LabGard class ±
원심분리기 Eppendorf 5424
젤 이미징 시스템 Tanon 2500R
PCR을 통해 합성한 DNA 단편을 증폭시키고, 젤로 PCR 생성물을 정제하였다. 제한효소 EcoRI와 BamHI로 pTT5 벡터를 자르고 난 후 젤을 정제하였다. In-Fusion 키트를 이용해 각각의 PCR 생성물과 선형 벡터를 연결하였다. 생성된 벡터를 ECOS101 DH5α competent cell에 형질전환 시키고, 100 ㎍/㎖ 엠피실린을 함유하는 2xYT 한천 판에 배양하였다. 모든 조작 과정은 표준 형질 전환 프로토콜을 따라 수행하였다. 콜로니 PCR로 양성 재조합체를 확인하고, 재조합 플라스미드를 sequence-verify sequencing을 수행하였다. 단일 콜로니를 선택하여 100 ㎍/㎖ 엠피실린을 함유하는 5 ㎖ 2xYT 배지에 종균을 접종하였다. 37℃에서 8시간 동안 흔들면서 배양하였다.
이후, 종균을 1:1,000의 비율로 200 ㎖의 선택적 2xYT 배지에 희석하였다. 37℃에서 16시간 동안 흔들면서 배양하였다. 4℃, 4,700 rpm에서 10분 동안 원심 분리하여 박테리아 세포를 수확하였다. 12 ㎖의 RES-EF 용액에 박테리아 펠릿을 재부유 시켰다. 그 후, 12 ㎖의 LYS-EF 용액을 첨가하고, 밀봉한 튜브를 힘차게 뒤집어 완전히 혼합한 뒤, 실온에서 5분간 배양하였다. 12 ㎖의 NEU-EF 용액을 용해물에 첨가하고, 힘차게 뒤집어 빠르게 완전히 혼합하였다.
NucleoBond® Xtra 컬럼 필터에 용해물을 주입하기 전, 필터의 막힘을 방지하기 위해 용해물 튜브를 3번 정도 뒤집어 침전물의 균질한 현탁을 제조하였다. 그 후, 10 ㎖의 필터 세척 용액 FIL-EF로 NucleoBond® Xtra 컬럼 필터와 NucleoBond® Xtra 컬럼을 세척하였다. NucleoBond® Xtra 컬럼 필터를 빼내거나 컬럼을 거꾸로 뒤집어 제거하였다. 90 ㎖의 세척 용액 ENDO로 NucleoBond® Xtra 컬럼을 세척하였다.
45 ㎖의 세척 용액 WASH-EF로 NucleoBond® Xtra 컬럼을 세척하였다. 15 ㎖의 용출 용액 ELU로 플라스미드 DNA를 용출시켰다. 용출액은 50 ㎖ 원심분리 튜브에 수집하였다. 10.5 ㎖의 상온 이소프로판올을 첨가하여 용출된 플라스미드 DNA를 침전시켰다. Vortex 후, 혼합물을 2분간 그대로 방치하였다.
그 후, 5 ㎖의 70% 에탄올을 펠릿에 첨가하였다. 파이펫 팁을 이용해 튜브에서 에탄올을 조심스럽게 완전히 제거하였다. 펠릿을 상온(20℃)에서 건조시켰다. 그 후, DNA 펠릿을 1,000 ㎕의 H2O로 용해시켰다.
제조예 2. 세포 형질 주입과 단백질 발현
제조예 2.1. 세포 형질 주입
하기 표 5에 사용한 재료 및 시약 기재하였다.
재료 및 시약 제조사 (Product #)
293F cells Invitrogen (R790-07)
OPM 293 OPM (81075-001)
Pluronic®F-68, 10% (100X) Gibco (24040-032)
1 ㎎/㎖ PEI Polyscience (23966)
OPTI MEM I Gibco (31985088)
Peptone (20x) FLUKA(P0521-1KG)
셰이커 플라스크
ISF1-X 배양기 셰이커 Kuhner shaker
Complete 배지를 넣은 293F seed strain을 130 rpm, 37℃, 8% CO2의 배양기 셰이커에서 유지하였다. 0.3 내지 0.4 x 106 cell/㎖의 밀도로 배양하고, 매 2 내지 3일마다 배지를 교환하였다. 형질 주입 24시간 전, 새로운 계대수의 293F 세포를 2.6 x 106 cell/㎖로 준비하였다. 준비한 세포는 130 rpm, 37℃, 8% CO2의 배양기 셰이커에서 배양하였다. 형질 주입 당일, 새로운 배지를 사용하여 5.0 x 106 cells/㎖의 밀도로 세포를 조정하였다. 3 L 셰이커 플라스크에서 1 L의 총 부피로 수행하였다. 0.4 ㎎ HC 및 0.6 ㎎ LC 플라스미드를 50 ㎖ OPTI MEM I으로 희석하고, 0.22 ㎛ 필터로 여과하였다. 그 후, 2 ㎎ PEI를 50 ㎖ OPTI MEM I으로 희석하여 형질 주입 시약을 준비하였다.
희석된 PEI를 DNA 혼합물에 첨가한 뒤, 즉시 혼합하였다. 이후 15분간 상온에서 배양하였다. 2.6 x 106 cell/㎖로 준비한 293F 세포에 DNA-PEI 혼합물을 첨가하였다. 이후, 세포는 130 rpm, 37℃, 8% CO2의 배양기 셰이커에서 24시간 동안 계속 배양하였다. 형질 주입 24시간 후, 최종 농도가 0.5%가 되도록 배양액의 1/20에 10% 펩톤을 첨가하였다. 이후 세포는 130 rpm, 37℃, 8% CO2의 배양기 셰이커에서 계속 배양하였다. 형질 주입 후 2 내지 5일 기간에는 매일 세포 밀도/생존 능력을 측정하고 기록하였다. 형질 주입 7일 후 혹은 세포 생존 능력이 70% 미만에서 정제를 위해 세포를 수확하였다.
제조예 2.2. 단백질 정제
하기 표 6 내지 표 8에 단백질 정제를 위해 사용한 시약, 용액의 구성 및 장비를 기술하였다.
시약 제조사 Catalog#
Mabselect SuRe GE Healthcare 11003493
Tris SIGMA 77-86-1
NaCl ACROS ORGANIVS 7647-14-5
Sodium citrate Adamas-beta 76198B
Citric acid GENERAL-Reagent G83162B
Arginine VETEC V900343-500G
Succinic acid Sigma-Aldrich S9512-500G
Triton X-100 ABCONE X10010-1L
TRITON X-114 SIGMA-ALDRICH X114
Millex-GP Filter Unit 0.22 μm Sterile MILLIPORE SLGP033RS
NaOH Merck B146369740
용액 A 25 mM Tris, 150 mM NaCl, pH 8.0
용액 B 25 mM Tris, 150 mM NaCl,0.1% Triton X-100, 0.1% Triton X-114 pH 8.0
용액 C 100 mM Sodium Citrate, 150 mM NaCl, pH 3.0
용액 D 1 M Arginine, 400 mM Succinic acid, pH 9.0
용액 E 20 mM PB pH 6.5, 1 M (NH4)2SO4
용액 F 20 mM PB pH 6.5, 25% isopropyl alcohol
최종용액 20 mM HEPES, pH 7.5, 240 mM sucrose 혹은 20 mM his acetate pH 5.5, 240 mM sucrose
기기 제조사 모델명
AKTA Pure GE Healthcare 29-0182-24
원심분리기 Beckman J-26xp
젤 이미징 시스템 Tanon 2500R
Sartopore 2 filter Sartorius 5445307H9-OO-A
Mabselect sure 컬럼을 통한 단백질을 정제하였다. 구체적으로, 2,000 x g, 4℃에서 20분간 원심 분리하여 상층액을 수확하였다. 그 후, Sartopore 2 필터로 상층액을 여과하였다. 용액 A로 평형화된 5 ㎖ MabSelect Sure 컬럼에 정화된 상층액을 로딩하였다. 그 후, A280 흡광도가 기준치에 도달할 때까지 용액 A로 컬럼을 세척하였다. 10 CV 용액 B로 컬럼을 세척하였다. 10 CV 용액 A로 컬럼을 세척하였다. 6 CV 용액 C로 결합된 단백질을 용출하고, 1/6 부피의 용액 D를 넣어 용출한 물질을 중화하였다. SDS-PAGE와 SEC-HPLC 분석을 진행하였다.
그 후, HIC 컬럼을 이용해 단백질을 정제하였다. 그 후, 밤새 4℃에서 용액 E에 대해 단백질을 투석하였다. 용액 E로 평형화된 HIC 컬럼에 상층액을 로딩하였다. 그 후, A280 흡광도가 기준치에 도달할 때까지 용액 E로 컬럼을 세척하였다. 기울기 용리(10 CV 용액 F 0%-40%)로 결합된 단백질을 용출하였다. 2 CV 100% 용액 F로 결합된 단백질을 용출하였다. SDS-PAGE 분석을 진행하였다.
정제된 단백질들을 한 군데로 모아준 후, 밤새 4℃에서 최종 용액에 대해 단백질을 투석하였다. 그 후, SDS-PAGE와 SEC-HPLC 분석을 수행하였다.
그 결과, 도 1 내지 도 6에 나타낸 것과 같이, 일 실시예의 융합 단백질이 정제되었음을 확인하였다.
제조예 3. 이중 항체 생산량 개선
제조예 3.1. 인간 IL-12를 포함하는 융합단백질 생산량 개선 변화 확인
하기 표 9에는 인간 IL-12 변이에 따른 인간 항-CD20/IL-12 이중 항체 생산량의 변화를 나타내었다. 괄호는 단백질의 생산 규모를 의미하며, 단위는 L이다. 괄호 앞의 숫자는 정제된 단백질의 양을 생산규모로 나누어 얻은 1L 당 생산량이다.
PROTEIN Description Protein A column을 거친 후 단백질의 양 (mg)(생산 규모, L)
T2.01 anti-hu CD20/hu IL-12, hu IgG1 208 (1)
T2.02 anti-hu CD20/hu IL-12 mut1, hu IgG1 234 (1)
T2.03 anti-hu CD20/hu IL-12 mut2, hu IgG1 315 (1)
상기 표 9에 나타낸 것과 같이, 인간 IL-12 p40(베타) 영역에서 헤파린 결합에 관여하는 아미노산의 변이 개수를 증가시킴에 따라 Protein A 컬럼 (MabSelect Sure 컬럼)을 통한 정제된 단백질의 양이 향상되었다. 아미노산 280번, 285번의 라이신(K)을 알라닌(A)으로 변이한 이중 항체 T2.02는 T2.01과 비교하여 생산량이 개선되었음을 확인하였다. 아미노산 280번, 282번, 285번, 286번의 라이신(K)을 알라닌(A)으로 변이한 이중항체 T2.03은 T2.01과 비교하여 생산량이 약 1.5배 개선되었음을 확인하였다.
제조예 3.2. 마우스 IL-12를 포함하는 융합단백질 생산량 개선 변화 확인
하기 표 10에는 마우스 IL-12 변이에 따른 마우스 항-CD20/IL-12 이중 항체 생산량의 변화를 나타내었다.
PROTEIN Description Protein A column을 거친 후 단백질의 양 (mg)(생산 규모, L)
T2.01m anti-mu CD20/mu IL-12, mu IgG2a 17.1 (1), 36.9 (3), 21.7 (7.5)
T2.02m anti-mu CD20/mu IL-12 mut1, mu IgG2a 18.9 (1), 40.067 (3)
T2.03m anti-mu CD20/mu IL-12 mut2, mu IgG2a 32.8 (1), 114.4 (1), 96.7 (8)
상기 표 10에 나타낸 것과 같이, 마우스 IL-12 p40(베타) 영역에서 헤파린 결합에 관여하는 아미노산의 변이 개수를 증가시킴에 따라 Protein A 컬럼 (MabSelect Sure 컬럼)을 통해 정제하여 얻은 단백질의 양이 증가되었다.
각 표에서 Protein A 컬럼을 거친 후 단백질의 양은 총 단백질 생산량을 생산규모로 나누어 비교하였다. 아미노산 277번, 282번 라이신(K)을 알라닌(A)으로 변이한 이중 항체 T2.02m은 T2.01m과 비교하였을 때, 생산량이 개선되었음을 확인하였다. 또한, 아미노산 276번 알지닌(R)을 알라닌(A)으로, 277번, 278번, 282번 라이신(K)을 알라닌(A)으로 변이한 이중 항체 T2.03m은 T2.01m 및 T2.02m과 비교하여 단백질 생산량이 개선되었음을 확인하였다. 이와 함께, CHO 세포주를 이용한 T2.03m의 생산은 HEK293 세포주를 이용한 생산량과 비교하여 약 3배 개선됨을 확인하였다.
제조예 4. 세포주 및 세포주 배양
인간 B-세포 림포마 세포주 Raji, 인간 B-세포 림포마 세포주 Ramos, 인간 T-계열 세포주 Jurkat, 마우스 B-세포 림포마 세포주 A20은 ATCC(American Type Culture Collection, Manassas, VA, USA)로부터 공급받아 사용하였다. Raji, Ramos 및 Jurkat 세포는 10% FBS(GIBCO)를 포함하는 RPMI-1640(GIBCO, Grand Island, NY, USA)에서 유지되었다. A20 세포는 10% FBS(GIBCO), 0.05 mM 2-메르캅토에탄올(2-Mercaptoethanol)을 포함하는 RPMI-1640(GIBCO)에서 유지되었다.
인간 배아 신장 섬유아세포(Human embryonic kidney fibroblast)인 HEK293 세포에 IL-12 수용체 유전자와 STAT4 유도적인 SEAP 리포터 유전자를 형질전환 시킨 HEK-Blue IL-12 세포주는 Invivogen(San Diego, USA)로부터 공급받아 사용하였다.
HEK-Blue IL-12 세포는 10% FBS(GIBCO), 100 ㎍/㎖ 노르모신(Normocin)과 1ХHEK-Blue 선별(selection)을 포함하는 DMEM(GIBCO)에서 유지되었다.
제조예 5. 인간 면역세포 분리 및 활성화
IRB(Institutional Review Board)의 승인을 받아 대한적십자사(Korean Red Cross, Korea)로부터 혈액팩을 공급받아 말초 혈액 단핵구 세포(Peripheral blood mononuclear cell, PBMC)를 분리하여 동결하였다. 해동한 PBMC는 양성선택(Positive selection) 방법으로 Easy sep(Stem cell, Vancouver, BC, CA) 키트(Kit)로 인간 단핵구 세포를 분리하였다. 분리한 단핵구 세포는 수지상 세포 배양 키트(Stem cell) 방법으로 5일간 미성숙 수지상 세포로 분화시켰다. 미성숙 수지상 세포는 수지상 세포 배양 키트(Stem cell) 방법으로 5일간 성숙되었다.
해동한 PBMC는 음성선택(Negative selection) 방법으로 Easy sep(Stem cell) 키트(Kit)로 인간 T 세포를 분리하였다. 인간 T 세포는 1 ㎍/㎖ 항-CD3(OKT3, Invitrogen)가 코팅된 플레이트에서 배양하여 72시간 활성화시켰다. 인간 T 세포는 10% FBS(GIBCO)가 포함된 RPMI-1640(GIBCO)에서 유지되었다.
실시예 1. 융합단백질의 결합 친화도 확인
실시예 1.1. 재조합 인간 CD20에 대한 융합 단백질의 결합 확인
T2.01 및 T2.02의 재조합 인간 CD20에 대한 결합을 표면 플라즈몬 공명(Surface plasmon resonance, SPR)으로 확인하였다.
구체적으로, CM5 칩의 표면을 50 nM NHS(N-hydroxysuccinimide)와 200 nM EDC(1-Ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimide)의 1:1 혼합물로 활성화시키고 25 ㎍/㎖의 항-인간 IgG(Fc) 항체를 10 ㎕/min의 속도로 400초간 고정화(Immobilization) 하였다. 남아있는 활성화 에스터 그룹(Active ester groups)은 1 M 에탄올아민(ethanolamine)으로 블로킹(Blocking) 하였다. T2.01 및 T2.02을 2 ㎍/㎖로 희석하여 항-인간 IgG(Fc) 항체가 고정화된 CM5 칩에 반응시켰다. 재조합 인간 CD20을 1ХHBS-EP+ 버퍼용액에 200 nM로 희석하고 연속 희석법으로 희석하였다. 희석한 재조합 인간 CD20을 30 ㎕/min의 속도로 반응시켰다. 결합과 해리 시간은 각각 180초와 400초였다. 해리 단계 후 60초간 안정화한 후, 10 mM 글라이신(Glycine) pH 1.5 용액으로 30 ㎕/min의 속도로 30초간 재생(Regeneration) 단계를 수행하였다.
그 결과, 도 7에 나타낸 것과 같이, T2.01 및 T2.02이 재조합 인간 CD20에 특이적으로 결합할 수 있음을 확인하였다.
또한 T2.04, T2.05, T2.06, T2.07, T2.08, T2.09, T2.10 및 T2.11의 재조합 인간 CD20에 대한 결합을 표면 플라즈몬 공명으로 확인하였다. T2.04, T2.05, T2.06, T2.07, T2.08, T2.09, T2.10 및 T2.11을 각각 15 ㎍/㎖, 2 ㎍/㎖, 2 ㎍/㎖, 2 ㎍/㎖, 10 ㎍/㎖, 2 ㎍/㎖, 20 ㎍/㎖, 20 ㎍/㎖로 희석하여 단백질 A가 고정된 칩에 반응시켰다. 재조합 인간 CD20을 1xHBS-EP+, 0.05% DDM(detergent dodecylmatoside), 0.01% CHS(cholesteryl hemisuccinate) 버퍼용액에 100 nM 혹은 200 nM로 희석하고 연속 희석법으로 희석하였다. 희석한 재조합 인간 CD20을 30 ㎕/min의 속도로 반응시켰다. 결합과 해리 시간은 각각 180초와 400초였다. 해리 단계 후 60초간 안정화한 후, 10 mM 글라이신 pH 1.5 용액으로 30 ㎕/min의 속도로 30초간 재생(Regeneration) 단계를 수행하였다.
그 결과, 도 29 내지 도 30에 나타낸 것과 같이, T2.04, T2.05, T2.06, T2.07, T2.08, T2.09, T2.10 및 T2.11이 재조합 인간 CD20에 결합하여, CD20을 특이적으로 표적할 수 있음을 확인하였다.
실시예 1.2. CD20 발현 세포와의 결합 확인
T2.01 및 T2.02가 CD20을 발현하는 세포주인 Raji 및 Ramos에 결합하는지 확인하였다.
구체적으로, Raji, Ramos 및 Jurkat 세포에 T2.01 및 T2.02를 처리하여 결합 정도를 확인하였다. CD20을 발현하지 않는 Jurkat T 세포는 대조군으로 사용하였다.
항-CD20 단일 클론 항체(Anti-CD20 monoclonal antibody; 리툭시맙(Rituximab), Roche)는 CD20 특이적인 결합을 할 수 있다고 알려진 FDA(Food and Drug Administration) 승인 약물이다.
세포주를 1 x 105 cells/100 ㎕로 FACS 완충용액에 부유하여 준비하였다. Rituximab, T2.01 및 T2.02를 각각 1 ㎍ 처리하였다. 세포들은 FACS 완충용액을 이용하여 두 차례 세척되었다. 세포들은 항-인간 IgG 항체(Biolegend)를 사용하여 염색하였다. 음성대조군(Negative control)시료는 항-인간 IgG Fc 항체(Biolegend)로만 염색되었다. 염색된 세포들의 발현 비율은 BD LSR을 사용하여 측정되었고, 플로우조(FlowJo) 소프트웨어에서 분석되었다.
그 결과, 도 8에 나타낸 것과 같이, T2.01 및 T2.02가 CD20을 발현하는 세포주에 95% 이상 결합함을 확인하였다.
다음으로, 마우스 대용(Mouse surrogate) 항체 단백질, 18B12, T2.01m 및 T2.02m의 A20 세포에 대한 결합 정도를 확인하였다.
세포주를 1 x 105 cells/100 ㎕로 FACS 완충용액에 부유하여 준비하고 18B12, T2.01m 및 T2.02m을 각각 1 ㎍ 처리하였다. 세포들은 FACS 완충용액을 이용하여 두 차례 세척되었다. 세포들은 항-마우스 IgG2a 항체(Biolegend)를 사용하여 염색하였다. 음성대조군(Negative control) 시료는 항-마우스 IgG2a 항체(Biolegend)로만 염색되었다. 염색된 세포들의 발현 비율은 BD LSR을 사용하여 측정되었고, 플로우조(FlowJo) 소프트웨어에서 분석되었다.
그 결과, 도 9에 나타낸 것과 같이, T2.01m 및 T2.02m가 CD20을 발현하는 세포주에 85% 이상 결합함을 확인하였다.
실시예 1.3. 재조합 인간 IL-12 수용체에 대한 융합 단백질의 결합 확인
융합 단백질의 IL-12가 작용하기 위해서는, 융합단백질이 IL-12 수용체에 결합해야 함을 고려하여, T2.01 및 T2.02이 재조합 인간 IL-12 수용체에 결합하는 것을 확인하였다.
Rituximab, T2.01 및 T2.02를 플레이트에 고정하고 겨자무과산화효소(Horseradish peroxidase, HRP)가 접합된 재조합 인간 IL-12 수용체 단백질을 결합시켰다. 이때, Rituximab은 대조군으로 사용하였다.
구체적으로, 하기와 같이 재조합 인간 IL-12 수용체에 대한 본 발명에 따른 융합 단백질이 결합하는 것을 확인하였다.
(i) Rituximab, T2.01 및 T2.02를 100 nM로 부유하여 연속 희석법으로 희석하였다. 희석한 Rituximab, T2.01 및 T2.02를 96-웰 면역 플레이트(96-well immune plate)에 분주하고 24시간 처리하였다.
(ii) 세척용액으로 웰(well)을 세척한 후, 1% BSA(Bovine serum albumin, Sigma) 용액으로 1시간 블로킹(Blocking) 하였다.
(iii) 세척용액으로 웰을 세척한 후, 1 nM의 IL-12 수용체 베타 1-바이오틴(IL-12Rβ1-Biotin; Acrobiosystems, Newark, USA)을 2시간 처리하였다.
(iv) 세척용액으로 웰을 세척한 후, 스트렙타비딘-HRP(Streptavidin-HRP)로 20분간 처리되었다.
(v) 세척용액으로 웰을 세척한 후, 기질 용액(Substrate solution)이 20분간 처리되었다.
(vi) 정지 용액(Stop solution)을 처리하고 450 ㎚ 흡광도에서 측정되었다.
그 결과, 도 10에 나타낸 것과 같이, T2.01 및 T2.02가 농도 의존적인 방법(Concentration dependent manner)으로 재조합 인간 IL-12 수용체 단백질에 결합함을 확인하였다
실시예 1.4. 융합 단백질의 항체의존성 세포독성능 확인
항-CD20 단일 클론 항체(Anti-CD20 monoclonal antibody)는 B-세포 림포마(B-cell lymphoma)에 결합하여 항체의존성 세포독성능을 통해 세포를 사멸한다. 따라서, CD20을 표적하는 1가(Monovalent) 형태의 융합 단백질의 B-세포 림포마(Raji)에 대한 항체의존성 세포 독성능을 확인하였다.
구체적으로, Rituximab, T2.01, T2.02 및 T2.12의 항체의존성 세포독성능(Antibody-Dependent cellular cytotoxicity, ADCC)을 ADCC 리포터 바이오 어세이(ADCC Reporter Bioassay; Promega, Wisconsin, USA) 키트(Kit)로 하기와 같이 확인하였다.
(i) 타겟 세포(Target cell, Raji)를 4% 저(Low) 수준의 IgG 혈청(serum)이 포함된 RPMI-1640에 5 x 105 cells/㎖ 농도로 부유하여 각 25 ㎕씩 분주하였다.
(ii) Rituximab, T2.01, T2.02 및 T2.12를 4% 저(Low) 수준의 IgG 혈청이 포함된 RPMI-1640에 250 ㎍/㎖로 부유하여 연속 희석법(Serial dilution)으로 희석하였다. 희석한 Rituximab, T2.01, T2.02 및 T2.12를 각 25 ㎕씩 분주하였다.
(iii) 효과 세포(Effector cell)를 4% 저(Low) 수준의 IgG 혈청이 포함된 RPMI-1640에 3 x 106 cells/㎖ 농도로 부유하여 각 25 ㎕씩 분주하였다.
(iv) 6시간 배양 후, BioGloTM 루시퍼라아제 어세이 시약(BioGlo luciferase assay reagent; Promega)를 처리하고 발광값(Luminescence, RLU(Relative Luminescence Unit))을 측정하였다.
그 결과, 도 11에 나타낸 것과 같이, 항-CD20 단일 클론 항체인 Rituximab을 처리한 시료에서는 반수유효농도(50% Effective concentration, EC50) 31.1 ㎍/㎖의 높은 항체의존성 세포독성능을 보였지만 T2.01을 처리한 시료에서는 EC50 5.3 x 103 ㎍/㎖, T2.02를 처리한 시료에서는 EC50 6.7 x 103 ㎍/㎖의 낮은 항체의존성 세포독성능을 보였다. Fc 부분이 변이되어 이펙터 기능 (effector function)이 없는 컨트롤 T2.12을 처리한 시료에서는 항체의존성 세포독성능이 보이지 않았다.
실시예 2. 융합단백질의 신호전달 유도능 확인
실시예 2.1. IL-12 감지 세포에서의 신호전달능 확인
IL-12는 IL-12 수용체에 결합하였을 때 신호전달 매개 물질인 STAT4(Signal transducer and activator or transcription 4)의 인산화를 유도하여 신호전달을 진행한다고 알려져 있음을 고려하여, IL-12 수용체를 발현하는 IL-12 감지 세포에서 일 실시예의 융합 단백질의 신호전달능력을 평가하였다.
구체적으로, IL-12 감지 세포인 HEK-Blue IL-12 세포주를 2.8 x 105 cells/㎖로 희석하여 180 ㎕/well로 분배되었다. 재조합 인간 IL-12(Recombinant human IL-12), T2.01m, T2.02m, T2.03m 및 18B12를 4 nM로 부유하여 연속 희석법으로 희석하였다. 희석한 재조합 인간 IL-12(Recombinant human IL-12), T2.01m, T2.02m, T2.03m 및 18B12를 HEK-Blue IL-12 세포에 처리하였다. 처리 24시간 후, 세포 상층액이 수집되었고, 96-웰(well) 플레이트에서 QUANTI-Blue Solution(Invivogen)과 혼합되었다. 분광광도계(Spectrophotometer, Thermo Fisher)로 620 ㎚에서 리포터 발현 정도를 측정하였다.
그 결과, 도 12에 나타낸 것과 같이, 재조합 인간 IL-12, T2.01m, T2.02m 및 T2.03m의 경우 620 ㎚ 흡광도에서 IL-12를 감지하여 STAT4가 인산화됨으로서 리포터 유전자를 발현시켰음을 확인하였다. 더불어, 18B12는 IL-12 감지 세포에 처리하였을 때, IL-12를 감지하지 못함을 확인하였다. 이러한 결과는, 일 구체예의 융합 단백질이 IL-12 수용체에 특이적으로 결합하여 신호전달을 유도함을 의미한다.
실시예 2.2. 인간 T 세포에서의 신호전달능 확인
인간 T 세포의 IL-12 수용체에 IL-12가 결합하였을 때 신호전달 매개 물질인 STAT4의 인산화를 유도하여 신호전달을 진행하는지 확인하였다
구체적으로, 항-CD3(OKT3, Invitrogen)으로 활성화시킨 인간 T 세포를 AlphaLISA SureFire Ultra p-STAT4(Tyr693) Assay Kit(PerkinElmer, Massachusetts, USA)를 사용하여 인간 T 세포에서의 신호전달능을 확인하였다. 재조합 인간 IL-12, T2.01, T2.02 및 T2.17를 100 ng/㎖로 부유하여 연속 희석법으로 희석하였다. 희석한 재조합 인간 IL-12, T2.01, T2.02 및 T2.17를 활성화시킨 인간 T 세포에 처리하였다. 처리 2시간 후, 세포를 용해시키고 p-STAT4(phosphorylated STAT4)를 감지하는 시약(PerkinElmer)을 처리하였다. 분광광도계(Spectrophotometer)로 자극파장 680 ㎚ 및 발광파장 615 ㎚에서 p-STAT4를 감지하였다.
그 결과, 도 13에 나타낸 것과 같이, 재조합 인간 IL-12를 처리한 시료에서는 반수유효농도(EC50) 0.1946 ng/㎖, T2.01을 처리한 시료에서는 EC50 0.5547 ng/㎖, T2.02를 처리한 시료에서는 EC50 1.555 ng/㎖을 보였다. EC50 비교를 통해 IL-12 mutation으로 인해 T 세포 신호전달 능력이 약화되었음을(attenuated) 확인하였다. T2.17을 처리한 시료에서는 인산화된 STAT4가 확인되지 않았다. 이러한 결과는, IL-12 돌연변이가 T 세포 신호전달 능력을 약화시켰음을 의미한다.
실시예 3. 융합단백질의 사이토카인 분비능 확인
실시예 3.1. 사이토카인 측정을 위한 효소 결합 면역 침강 분석
사이토카인 측정을 위해, 하기와 같은 단계로 -20℃에서 보관된 상층액에서 사이토카인 측정을 위한 효소 결합 면역 침강 분석(Enzyme-linked immunosorbent assay, ELISA, R&D systems)을 진행하였다.
(i) 포획 항체(Capture antibody)를 분석증명서(Certificate of Analysis, CoA)에 따라 희석하여 96-웰 플레이트(96-well plate)에 24시간 코팅하였다.
(ii) 세척용액으로 웰(well)을 세척한 후, 1% BSA(Bovine serum albumin, Sigma) 용액으로 1시간 블로킹(Blocking) 하였다.
(iii) 세척용액으로 웰을 세척한 후, 시료를 2시간 처리하였다.
(iv) 세척용액으로 웰을 세척한 후, 탐지 항체(Detection antibody)를 분석증명서에 따라 희석하여 웰에 분주한 후 2시간 처리하였다.
(v) 세척용액으로 웰을 세척한 후, 스트렙타비딘-HRP(Streptavidin-HRP)로 20분간 처리되었다.
(vi) 세척용액으로 웰을 세척한 후, 기질 용액(Substrate solution)으로 20분간 처리되었다.
(vii) 정지 용액(Stop solution)을 처리하고 450 ㎚에서 흡광도를 측정하였다.
실시예 3.2. 인간 T 세포에서의 사이토카인 분비능 확인
인간 T 세포에 IL-12를 처리하였을 때 주요 면역반응인 IFN-γ(Interferon-gamma) 분비가 일어남을 고려하여, 인간 T 세포에 재조합 인간 IL-12, Rituximab, T2.01, T2.02 및 T2.03를 처리하였을 경우의 효소 결합 면역 침강 분석을 통해 세포 상층액 내의 IFN-γ 분비능을 평가하였다.
구체적으로, 항-CD3(OKT3, Invitrogen)으로 활성화시킨 인간 T 세포를 5 x 105 cells/㎖로 희석하여 96-웰(well) 플레이트에 200 ㎕/well로 분배하였다. 재조합 인간 IL-12, Rituximab, T2.01, T2.02 및 T2.03는 10 nM로 희석하여 20 ㎕/well로 분배하였다. 재조합 인간 IL-12, Rituximab, T2.01, T2.02 및 T2.03를 각 250 pM씩 처리하였다. 처리 48시간 후, 세포 상층액이 수집되었고, 시료들은 -80℃에서 보관되었다.
그 결과, 도 14에 나타낸 것과 같이, 재조합 인간 IL-12를 처리한 시료에서는 평균 1,640 pg/㎖, T2.01을 처리한 시료에서는 평균 1,170 pg/㎖, T2.02를 처리한 시료에서는 평균 956 ng/㎖, T2.03를 처리한 시료에서는 평균 662 pg/㎖의 IFN-γ가 확인되었다. Rituximab를 처리한 시료에서는 IFN-γ가 확인되지 않았다. 이러한 결과는, T2.01, T2.02 및 T2.03이 인간 T 세포에 작용하여 IFN-γ 분비를 유도함을 의미한다.
실시예 3.3. 혼합림프구반응 시험을 통한 사이토카인 분비능 확인
인간 T 세포와 동종의 수지상 세포를 혼합하여 인위적인 동종 면역반응을 일으켰을 때 융합 단백질이 사이토카인 분비를 유도하는지 확인하였다. 효소 결합 면역 침강 분석을 통해 세포 상층액 내의 IFN-γ 농도를 평가하였다.
구체적으로, 성숙된 인간 수지상 세포를 4 x 105 cells/㎖로 희석하여 96-웰(well) 플레이트에 50 ㎕/well로 분배하였다. 항-CD3로 활성화시킨 서로 다른 혈액공여자로부터의 인간 T 세포를 2 x 106 cells/㎖로 희석하여 100 ㎕/well로 분배하여 분배된 성숙된 인간 수지상세포와 혼합하였다(Mixed Lymphocyte Reaction, MLR). Rituximab, T2.01 및 T2.02는 1 uM로 희석하여 50 ㎕/well로 분배하였다. 혼합 배양 5일 후, 세포 상층액이 수집되었고, 시료들은 -80℃에서 보관되었다.
그 결과, 도 15에 나타낸 것과 같이, T2.01을 처리한 시료에서는 평균 487 pg/㎖, T2.02를 처리한 시료에서는 평균 587 pg/㎖의 IFN-γ가 확인되었다. 이에 반해, Rituximab를 처리한 시료에서는 IFN-γ가 확인되지 않았다. 이러한 결과는, 혼합림프구 면역반응시 T2.01 및 T2.02가 IFN-γ 분비를 유도함을 의미한다.
실시예 4. 동종이식 마우스 모델에서의 항암효능 평가
실시예 4.1. 동종이식 마우스 모델의 확립 및 항암효능 평가
생명윤리위원회(Institutional animal care and use committee, IACUC, Crownbio, U.S)의 승인을 받아 인비보(in vivo)를 진행하였다. 6 주령 암컷 BALB/c 마우스는 Shanghai Lingchang Biotechnology Co,.Ltd(Shanghai, China)에서 공급받아 사용하였다. A20 세포를 PBS(Phosphate-buffered saline, GIBCO)에 5 x 105 cells/100 ㎕ 농도로 부유시킨 후 마우스의 오른쪽 옆구리에 5Х105 cells씩 피하주사하였다.
종양의 크기가 100 ㎣에 도달하였을 때, 무작위로 나누어 그룹화하였다. 100 ㎍의 T2.01m, 50 ㎍의 T2.02m, 100 ㎍의 T2.02m 및 300 ㎍의 T2.02m를 3일 간격으로 3회 복강주사하였다. 화학요법(Chemotherapy) 그룹은 CHOP1(100 ㎎/㎏ Cyclophosphamide, 6 ㎎/㎏ Doxolubicin, 0.1 ㎎/㎏ Vincristine, 0.2 ㎎/㎏ Dexamethasone)을 1회 복강주사, CHOP2(50 ㎎/㎏ Cyclophosphamide, 3 ㎎/㎏ Doxolubicin, 0.1 ㎎/㎏ Vincristine, 0.2 ㎎/㎏ Dexamethasone)을 1주 간격 2회 복강주사하였다. 마우스는 그룹별 10마리가 사용되었다. 종양의 크기와 몸무게를 주 2회 측정하였다. 항암능력은 두 달간 평가되었다.
그 결과, 도 16 및 17에 나타낸 것과 같이, 첫 복강주사 후 20일 째에, T2.02m을 50 ㎍/㎖ 처리한 군에서 완전관해반응(Complete response, CR) 43%(3/7), T2.02m을 100 ㎍/㎖ 처리한 군에서 CR 100%(7/7), T2.02m을 300 ㎍/㎖ 처리한 군에서 CR 100%(7/7)이 확인되어 T2.02m의 항암효과가 뛰어남을 확인하였다. T2.01m을 100 ㎍/㎖ 처리한 군에서는 CR 86%(6/7)을 확인하였다. 반면, 화학요법 CHOP1을 처리한 군에서 CR 28.5%(2/7)을 확인하였고, 화학요법 CHOP2를 처리한 군에서는 CR을 확인할 수 없었다.
더불어, T2.01m, T2.02m, CHOP1 및 CHOP2를 복강주사하고 이에 따른 부작용을 몸무게 변화로 나타내었다.
그 결과, 도 18에 나타낸 것과 같이, T2.01m, T2.02m, CHOP1 및 CHOP2를 복강주사로 인한 몸무게 변화는 관찰되지 않았다. 이러한 결과는, 일 실시예의 융합단백질의 복강주사 후 부작용이 없음을 의미한다.
다음으로, 화학요법 그룹과 일 실시예의 융합단백질의 항암효과를 비교하기 위하여, T2.01m, T2.02m, CHOP1 및 CHOP2를 복강주사 후 9일 째에 각 그룹별 3마리로부터 종양조직을 분리하여 그룹별 상대적인 종양조직 무게를 비교하였다.
구체적으로, 상기 실험군에서 각 그룹별 3마리는 첫 복강주사 후 9일 째에 IACUC 규정에 따른 처치방법을 통해 종양조직을 수확(Harvest)하였다. 수확한 종양조직은 전자저울로 무게가 측정되었다. 종양조직은 종양분리(Tumor dissociation, Miltenyi, Germany) 키트(kit)를 사용하여 면역세포를 분리하였다. 세포들은 항-마우스 CD45 항체(Biolegend), 항-마우스 CD3 항체(BD), 항-마우스 CD4 항체(Biolegend), 항-마우스 CD8 항체(eBioscience), 항-마우스 CD19 항체(Biolegend), 항-마우스 CD49/b(Biolegend), Live/Dead(eBioscience) 및 Counting beads(eBioscience)를 사용하여 염색하였다. 염색된 세포들의 발현 비율은 BD LSR을 사용하여 측정되었고, 플로우조(FlowJo) 소프트웨어에서 분석되었다.
그 결과, 도 19에 나타낸 것과 같이, 복강주사한 T2.02m의 용량이 클수록 종양조직 무게가 줄어든 것을 확인할 수 있었다. 이러한 결과는, T2.02m의 용량에 비례하여 항암효과가 뛰어남을 의미한다.
또한, 종양조직내 면역세포 분포 분석을 통해 상기와 같은 효과가 융합 단백질에 의한 면역세포의 활성에 따른 항암효과인지 확인하였다.
그 결과, 도 20에 나타낸 것과 같이, T2.02m을 처리한 군의 CD3+ CD4+ T 세포 또는 CD3+ CD8+ T 세포의 분포도가 대조군, 화학요법 CHOP1 및 화학요법 CHOP2 군과 비교했을 때 차이는 없지만, 절대적인 면역세포의 수가 차이남을 확인하였다. 이러한 결과는, 상기와 같은 결과가 T2.02m에 의한 효과 세포의 침투 증가에 따른 항암효과임을 의미한다.
실시예 4.2. 종양 재발 모델에서의 종양 재발 억제 평가
완전관해가 나타난 마우스를 이용하여 종양재발평가(Tumor re-challenge)를 수행하였다.
A20 세포가 동종이식(Syngeneic)된 마우스에 T2.02m를 처리하여 완전관해(Complete response, CR)가 나타난 마우스를 대상으로 종양 재발 모델을 유도하였다.
구체적으로, A20 세포를 PBS(Phosphate-buffered saline, GIBCO)에 5 x 105 cells/100 ㎕ 농도로 부유하고 마우스의 오른쪽 옆구리에 5 x 105 cells를 피하주사하였다. 4T1 세포를 PBS(Phosphate-buffered saline, GIBCO)에 5 x 105 cells/100 ㎕ 농도로 부유하고 마우스의 왼쪽 옆구리에 5 x 105 cells를 피하주사하였다. 대조군으로는 실험군과 주령이 같은 비처리(untreated)마우스를 사용하였다. 대조군 그룹의 마우스는 실험군과 주령이 동일한 마우스를 사용하였다. 마우스는 그룹별 5마리가 사용되었다. 종양의 크기와 몸무게를 주 2회 측정하였다.
그 결과, 도 21 및 도 22에 나타낸 것과 같이, T2.02m을 처리하여 완전관해가 일어난 군에서는 4T1 종양이 자라지만, A20 종양은 자라지 않음을 확인하였다. 반면, 대조군은 4T1 종양과 A20 종양 모두 자랐음을 확인하였다. 이러한 결과는, 융합 단백질에 의해 종양재발을 억제할 수 있음을 의미한다.
또한, 상기 완전관해모델의 몸무게를 측정하여 부작용 여부 또한 확인하였다. 그 결과, 도 23에 나타낸 것과 같이, 융합 단백질에 의한 종양재발은 부작용이 없이 나타남을 확인하였다.
실시예 4.3. 동종이식 마우스 모델에서 CD20 특이적인 융합 단백질과 CD20 항체의 항종양 능력 평가 비교
일 실시예에 따른 CD20 특이적 융합단백질과, 비특이적 융합단백질의 항종양 효과를 비교하였다.
구체적으로, 생명윤리위원회(Institutional animal care and use committee, IACUC, Crownbio, U.S)의 승인을 받아 인비보(in vivo)를 진행하였다. 6 주령 암컷 BALB/c 마우스는 Shanghai Lingchang Biotechnology Co,.Ltd(Shanghai, China)에서 공급받아 사용하였다. A20 세포는 PBS(Phosphate-buffered saline, GIBCO)에 5 x 105 cells/100 ㎕ 농도로 부유하고 마우스의 오른쪽 옆구리에 5Х105 cells씩 피하주사하였다.
종양의 크기가 100 ㎣에 도달하였을 때, 무작위로 나누어 그룹화하였다. 준비된 25 ㎍의 T2.02m 및 25 ㎍의 18B12를 3일 간격으로 3회 복강주사하였다. 마우스는 그룹별 8마리가 사용되었다. 종양의 크기와 몸무게를 주 2회 측정하였고, 한달간 항암능력을 평가하였다.
그 결과, 도 24에 나타낸 것과 같이, 첫 복강주사 후 11일 째에, T2.02m을 처리한 군에서 완전관해반응(CR)이 일어났고, 첫 복강주사 후 18일 째에는 CR 100%(8/8)이 확인되어 T2.02m의 항암효과가 뛰어남을 보여주었다. 반면, 비융합 단백질인 18B12를 처리한 군의 경우 항암효과를 확인할 수 없었다. 이러한 결과는, 비융합 단백질보다 일 실시예의 융합단백질의 항암효과가 더 뛰어남을 의미한다.
실시예 4.4. 동종이식 마우스 모델에서 CD20 특이적인 융합 단백질의 타겟 특이적인 항암효능 평가
일 실시예에 따른 타겟 특이적 융합단백질 및 비특이적 비융합 단백질의 항종양 효과를 비교하였다.
생명윤리위원회(Institutional animal care and use committee, IACUC, Crownbio, U.S)의 승인을 받아 인비보(in vivo)를 진행하였다. 6 주령 암컷 BALB/c 마우스는 Shanghai Lingchang Biotechnology Co,.Ltd(Shanghai, China)에서 공급받아 사용하였다. A20 세포는 PBS(Phosphate-buffered saline, GIBCO)에 5 x 105 cells/100 ㎕ 농도로 부유하고 마우스의 오른쪽 옆구리에 5Х105 cells를 피하주사하였다.
종양의 크기가 100 ㎣에 도달하였을 때, 무작위로 나누어 그룹화하였다. 준비된 0.2 ㎍의 T2.02m 및 0.2 ㎍의 T2.13m을 일주일 간격으로 2회 정맥주사하였다. 마우스는 그룹별 7마리가 사용되었다. 종양의 크기와 몸무게를 주 2회 측정하였다.
그 결과, 도 25에 나타낸 것과 같이, 첫 정맥주사 후 11일 째에, T2.02m을 처리한 군에서 63%의 종양성장억제율(Tumor growth inhibition percent, TGI)이 확인되었고, 반면 T2.13m을 처리한 군에서는 20%의 종양성장억제율이 확인되었다. 이러한 결과는, 일 실시예의 타겟 특이적인 융합단백질이 타겟 특이적이지 않은 비융합 단백질보다 항암효과가 뛰어남을 의미한다.
실시예 4.5. 동종이식 마우스 모델에서 CD20 특이적인 융합 단백질과 CD20 항체와 사이토카인 병용투여의 항암효능 평가 비교
일 실시예의 타겟 특이적 융합단백질과 비특이적 융합단백질의 병용요법 간 효과를 비교하였다.
구체적으로, 생명윤리위원회(Institutional animal care and use committee, IACUC, Crownbio, U.S)의 승인을 받아 인비보(in vivo)를 진행하였다. 6 주령 암컷 BALB/c 마우스는 Shanghai Lingchang Biotechnology Co,.Ltd(Shanghai, China)에서 공급받아 사용하였다. A20 세포는 PBS(Phosphate-buffered saline, GIBCO)에 5 x 105 cells/100 ㎕ 농도로 부유하고 마우스의 오른쪽 옆구리에 5 x 105 cells를 피하주사하였다.
종양의 크기가 100 ㎣에 도달하였을 때, 무작위로 나누어 그룹화하였다. 준비된 0.2 ㎍의 T2.02m을 처리한 군; 및 0.2 ㎍의 T2.13m 및 0.2 ㎍의 18B12를 처리한 군으로 그룹화하였다. 각 투여는 일주일 간격으로 3회 정맥주사하였으며 이주간 평가하였다. 마우스는 그룹별 7마리가 사용되었다. 종양의 크기와 몸무게를 주 2회 측정하였다.
그 결과, 도 26에 나타낸 것과 같이, 첫 정맥주사 후 10일 째에, T2.02m을 처리한 군에서 80% 종양성장억제율(Tumor growth inhibition percent, TGI)이 확인되었고, 18B12와 T2.13m을 함께 처리한 군에서는 65%의 종양성장억제율이 확인되었다. 이러한 결과는 타겟 특이적인 융합단백질이 타겟 특이적이지 않은 비융합 단백질들의 병용요법보다 항암효과가 뛰어남을 의미하고, 일 실시예의 융합단백질 구조의 동반상승효과를 확인한다.
실시예 4.6. 동종이식 마우스 모델에서 CD20 특이적인 융합 단백질의 약화된 사이토카인의 항암효능 평가 비교
헤파린 결합부위 변이를 포함하는 T2.03m과 T2.02m의 IL-12의 효과가 T2.01m에 비해 약화되는지 확인하였다.
생명윤리위원회(Institutional animal care and use committee, IACUC, Crownbio, U.S)의 승인을 받아 인비보(in vivo)를 진행하였다. 6 주령 암컷 BALB/c 마우스는 Shanghai Lingchang Biotechnology Co,.Ltd(Shanghai, China)에서 공급받아 사용하였다. A20 세포는 PBS(Phosphate-buffered saline, GIBCO)에 5 x 105 cells/100 ㎕ 농도로 부유하고 마우스의 오른쪽 옆구리에 5 x 105 cells씩 피하주사하였다.
종양의 크기가 100 ㎣에 도달하였을 때, 무작위로 나누어 그룹화하였다. 준비된 2 ㎍의 T2.01m, 2 ㎍의 T2.02m 및 2 ㎍의 T2.03m을 일주일 간격으로 3회 정맥주사하여 마우스모델에서의 항암능력을 한달간 평가하였다. 마우스는 그룹별 7마리가 사용되었다. 종양의 크기와 몸무게를 주 2회 측정하였다.
그 결과, 도 27에 나타낸 것과 같이, 첫 복강주사 후 20일 째에, T2.01m을 처리한 군에서 87%의 종양성장억제율(Tumor growth inhibition percent, TGI), T2.02m을 처리한 군에서 98%의 TGI, T2.03m을 처리한 군에서 40%의 TGI가 확인되었다.
더불어, T2.01m, T2.02m 및 T2.03m을 정맥주사하고 이에 따른 부작용을 몸무게 변화로 나타내었다.
그 결과, 도 28에 나타낸 것과 같이, T2.01m, T2.02m 및 T2.03m가 정맥주사 후 부작용이 없음을 확인하였다.
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Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val 145 150 155 160 Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala 165 170 175 Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val 180 185 190 Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His 195 200 205 Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys 210 215 220 Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly 225 230 235 240 Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met 245 250 255 Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His 260 265 270 Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val 275 280 285 His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr 290 295 300 Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly 305 310 315 320 Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile 325 330 335 Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val 340 345 350 Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser 355 360 365 Leu Trp Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu 370 375 380 Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro 385 390 395 400 Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val 405 410 415 Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met 420 425 430 His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser 435 440 445 Pro Gly Lys 450 <210> 2 <211> 213 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> anti-hu CD20 LC <400> 2 Gln Ile Val Leu Ser Gln Ser Pro Ala Ile Leu Ser Ala Ser Pro Gly 1 5 10 15 Glu Lys Val Thr Met Thr Cys Arg Ala Ser Ser Ser Val Ser Tyr Ile 20 25 30 His Trp Phe Gln Gln Lys Pro Gly Ser Ser Pro Lys Pro Trp Ile Tyr 35 40 45 Ala Thr Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro Val Arg Phe Ser Gly Ser 50 55 60 Gly Ser Gly Thr Ser Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Arg Val Glu Ala Glu 65 70 75 80 Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Trp Thr Ser Asn Pro Pro Thr 85 90 95 Phe Gly Gly Gly 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cagcaggacc 780 cctgaggtga catgcgtggt ggtggacgtg tcccacgagg acccagaggt gaagttcaac 840 tggtacgtgg atggcgtgga ggtgcacaat gccaagacaa agccacggga ggagcagtac 900 aactctacct atagagtggt gagcgtgctg acagtgctgc accaggattg gctgaacggc 960 aaggagtata agtgcaaggt gtctaataag gccctgcccg cccctatcga gaagaccatc 1020 agcaaggcca agggccagcc tagggagcca caggtgtaca ccctgcctcc atctcgcgac 1080 gagctgacaa agaaccaggt gagcctgtgg tgtctggtga agggcttcta tccaagcgat 1140 atcgccgtgg agtgggagtc caatggccag cccgagaaca attacaagac cacaccccct 1200 gtgctggaca gcgatggctc cttctttctg tattccaagc tgaccgtgga taagtctaga 1260 tggcagcagg gcaacgtgtt ttcctgttct gtgatgcacg aggccctgca caatcactac 1320 acacagaaga gcctgtccct gtctcctggc aag 1353 <210> 44 <211> 639 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> anti-hu CD20 LC <400> 44 cagatcgtgc tgagccagtc cccagcaatc ctgtctgcca gccctggaga gaaggtgacc 60 atgacatgcc gggccagctc ctctgtgagc tacatccact ggttccagca gaagccaggc 120 agctccccta agccatggat ctatgccaca agcaacctgg catccggagt gcccgtgcgg 180 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Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile 35 40 45 Gly Val Ile Asp Pro Ser Asp Asn Tyr Thr Lys Tyr Asn Gln Lys Phe 50 55 60 Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Val Asp Thr Ser Ser Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Met Gln Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Phe Cys 85 90 95 Ala Arg Glu Gly Tyr Tyr Gly Ser Ser Pro Trp Phe Ala Tyr Trp Gly 100 105 110 Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Lys Thr Thr Ala Pro Ser 115 120 125 Val Tyr Pro Leu Ala Pro Val Cys Gly Asp Thr Thr Gly Ser Ser Val 130 135 140 Thr Leu Gly Cys Leu Val Lys Gly Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Leu 145 150 155 160 Thr Trp Asn Ser Gly Ser Leu Ser Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala 165 170 175 Val Leu Gln Ser Asp Leu Tyr Thr Leu Ser Ser Ser Val Thr Val Thr 180 185 190 Ser Ser Thr Trp Pro Ser Gln Ser Ile Thr Cys Asn Val Ala His Pro 195 200 205 Ala Ser Ser Thr Lys Val Asp Lys Lys Ile Glu Pro Arg Gly Pro Thr 210 215 220 Ile Lys Pro Cys Pro Pro Cys Lys Cys Pro Ala Pro Asn Leu Leu Gly 225 230 235 240 Gly Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Lys Ile Lys Asp Val Leu Met 245 250 255 Ile Ser Leu Ser Pro Ile Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser Glu 260 265 270 Asp Asp Pro Asp Val Gln Ile Ser Trp Phe Val Asn Asn Val Glu Val 275 280 285 His Thr Ala Gln Thr Gln Thr His Arg Glu Asp Tyr Asn Ser Thr Leu 290 295 300 Arg Val Val Ser Ala Leu Pro Ile Gln His Gln Asp Trp Met Ser Gly 305 310 315 320 Lys Glu Phe Lys Cys Lys Val Asn Asn Lys Asp Leu Pro Ala Pro Ile 325 330 335 Glu Arg Thr Ile Ser Lys Pro Lys Gly Ser Val Arg Ala Pro Gln Val 340 345 350 Tyr Val Leu Pro Pro Pro Glu Glu Glu Met Thr Lys Lys Gln Val Thr 355 360 365 Leu Thr Cys Met Val Thr Asp Phe Met Pro Glu Asp Ile Tyr Val Glu 370 375 380 Trp Thr Asn Asn Gly Lys Thr Glu Leu Asn Tyr Lys Asn Thr Glu Pro 385 390 395 400 Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Tyr Phe Met Tyr Ser Lys Leu Arg Val 405 410 415 Glu Lys Lys Asn Trp Val Glu Arg Asn Ser Tyr Ser Cys Ser Val Val 420 425 430 His Glu Gly Leu His Asn His His Thr Thr Lys Ser Phe Ser Arg Thr 435 440 445 Pro Gly Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly 450 455 460 Ser Met Trp Glu Leu Glu Lys Asp Val Tyr Val Val Glu Val Asp Trp 465 470 475 480 Thr Pro Asp Ala Pro Gly Glu Thr Val Asn Leu Thr Cys Asp Thr Pro 485 490 495 Glu Glu Asp Asp Ile Thr Trp Thr Ser Asp Gln Arg His Gly Val Ile 500 505 510 Gly Ser Gly Lys Thr Leu Thr Ile Thr Val Lys Glu Phe Leu Asp Ala 515 520 525 Gly Gln Tyr Thr Cys His Lys Gly Gly Glu Thr Leu Ser His Ser His 530 535 540 Leu Leu Leu His Lys Lys Glu Asn Gly Ile Trp Ser Thr Glu Ile Leu 545 550 555 560 Lys Asn Phe Lys Asn Lys Thr Phe Leu Lys Cys Glu Ala Pro Asn Tyr 565 570 575 Ser Gly Arg Phe Thr Cys Ser Trp Leu Val Gln Arg Asn Met Asp Leu 580 585 590 Lys Phe Asn Ile Lys Ser Ser Ser Ser Ser Pro Asp Ser Arg Ala Val 595 600 605 Thr Cys Gly Met Ala Ser Leu Ser Ala Glu Lys Val Thr Leu Asp Gln 610 615 620 Arg Asp Tyr Glu Lys Tyr Ser Val Ser Cys Gln Glu Asp Val Thr Cys 625 630 635 640 Pro Thr Ala Glu Glu Thr Leu Pro Ile Glu Leu Ala Leu Glu Ala Arg 645 650 655 Gln Gln Asn Lys Tyr Glu Asn Tyr Ser Thr Ser Phe Phe Ile Arg Asp 660 665 670 Ile Ile Lys Pro Asp Pro Pro Lys Asn Leu Gln Met Lys Pro Leu Lys 675 680 685 Asn Ser Gln Val Glu Val Ser Trp Glu Tyr Pro Asp Ser Trp Ser Thr 690 695 700 Pro His Ser Tyr Phe Ser Leu Lys Phe Phe Val Arg Ile Gln Ala Ala 705 710 715 720 Ala Glu Lys Met Ala Glu Thr Glu Glu Gly Cys Asn Gln Lys Gly Ala 725 730 735 Phe Leu Val Glu Lys Thr Ser Thr Glu Val Gln Cys Lys Gly Gly Asn 740 745 750 Val Cys Val Gln Ala Gln Asp Arg Tyr Tyr Asn Ser Ser Cys Ser Lys 755 760 765 Trp Ala Cys Val Pro Cys Arg Val Arg Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly 770 775 780 Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Arg Val Ile Pro Val Ser Gly 785 790 795 800 Pro Ala Arg Cys Leu Ser Gln Ser Arg Asn Leu Leu Lys Thr Thr Asp 805 810 815 Asp Met Val Lys Thr Ala Arg Glu Lys Leu Lys His Tyr Ser Cys Thr 820 825 830 Ala Glu Asp Ile Asp His Glu Asp Ile Thr Arg Asp Gln Thr Ser Thr 835 840 845 Leu Lys Thr Cys Leu Pro Leu Glu Leu His Lys Asn Glu Ser Cys Leu 850 855 860 Ala Thr Arg Glu Thr Ser Ser Thr Thr Arg Gly Ser Cys Leu Pro Pro 865 870 875 880 Gln Lys Thr Ser Leu Met Met Thr Leu Cys Leu Gly Ser Ile Tyr Glu 885 890 895 Asp Leu Lys Met Tyr Gln Thr Glu Phe Gln Ala Ile Asn Ala Ala Leu 900 905 910 Gln Asn His Asn His Gln Gln Ile Ile Leu Asp Lys Gly Met Leu Val 915 920 925 Ala Ile Asp Glu Leu Met Gln Ser Leu Asn His Asn Gly Glu Thr Leu 930 935 940 Arg Gln Lys Pro Pro Val Gly Glu Ala Asp Pro Tyr Arg Val Lys Met 945 950 955 960 Lys Leu Cys Ile Leu Leu His Ala Phe Ser Thr Arg Val Val Thr Ile 965 970 975 Asn Arg Val Met Gly Tyr Leu Ser Ser Ala 980 985 <210> 282 <211> 1025 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> mu scIL-12-mu IgG2a Fc-anti-mu CD20 scFv <400> 282 Met Trp Glu Leu Glu Lys Asp Val Tyr Val Val Glu Val Asp Trp Thr 1 5 10 15 Pro Asp Ala Pro Gly Glu Thr Val Asn Leu Thr Cys Asp Thr Pro Glu 20 25 30 Glu Asp Asp Ile Thr Trp Thr Ser Asp Gln Arg His Gly Val Ile Gly 35 40 45 Ser Gly Lys Thr Leu Thr Ile Thr Val Lys Glu Phe Leu Asp Ala Gly 50 55 60 Gln Tyr Thr Cys His Lys Gly Gly Glu Thr Leu Ser His Ser His Leu 65 70 75 80 Leu Leu His Lys Lys Glu Asn Gly Ile Trp Ser Thr Glu Ile Leu Lys 85 90 95 Asn Phe Lys Asn Lys Thr Phe Leu Lys Cys Glu Ala Pro Asn Tyr Ser 100 105 110 Gly Arg Phe Thr Cys Ser Trp Leu Val Gln Arg Asn Met Asp Leu Lys 115 120 125 Phe Asn Ile Lys Ser Ser Ser Ser Ser Pro Asp Ser Arg Ala Val Thr 130 135 140 Cys Gly Met Ala Ser Leu Ser Ala Glu Lys Val Thr Leu Asp Gln Arg 145 150 155 160 Asp Tyr Glu Lys Tyr Ser Val Ser Cys Gln Glu Asp Val Thr Cys Pro 165 170 175 Thr Ala Glu Glu Thr Leu Pro Ile Glu Leu Ala Leu Glu Ala Arg Gln 180 185 190 Gln Asn Lys Tyr Glu Asn Tyr Ser Thr Ser Phe Phe Ile Arg Asp Ile 195 200 205 Ile Lys Pro Asp Pro Pro Lys Asn Leu Gln Met Lys Pro Leu Lys Asn 210 215 220 Ser Gln Val Glu Val Ser Trp Glu Tyr Pro Asp Ser Trp Ser Thr Pro 225 230 235 240 His Ser Tyr Phe Ser Leu Lys Phe Phe Val Arg Ile Gln Arg Lys Lys 245 250 255 Glu Lys Met Lys Glu Thr Glu Glu Gly Cys Asn Gln Lys Gly Ala Phe 260 265 270 Leu Val Glu Lys Thr Ser Thr Glu Val Gln Cys Lys Gly Gly Asn Val 275 280 285 Cys Val Gln Ala Gln Asp Arg Tyr Tyr Asn Ser Ser Cys Ser Lys Trp 290 295 300 Ala Cys Val Pro Cys Arg Val Arg Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly 305 310 315 320 Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Arg Val Ile Pro Val Ser Gly Pro 325 330 335 Ala Arg Cys Leu Ser Gln Ser Arg Asn Leu Leu Lys Thr Thr Asp Asp 340 345 350 Met Val Lys Thr Ala Arg Glu Lys Leu Lys His Tyr Ser Cys Thr Ala 355 360 365 Glu Asp Ile Asp His Glu Asp Ile Thr Arg Asp Gln Thr Ser Thr Leu 370 375 380 Lys Thr Cys Leu Pro Leu Glu Leu His Lys Asn Glu Ser Cys Leu Ala 385 390 395 400 Thr Arg Glu Thr Ser Ser Thr Thr Arg Gly Ser Cys Leu Pro Pro Gln 405 410 415 Lys Thr Ser Leu Met Met Thr Leu Cys Leu Gly Ser Ile Tyr Glu Asp 420 425 430 Leu Lys Met Tyr Gln Thr Glu Phe Gln Ala Ile Asn Ala Ala Leu Gln 435 440 445 Asn His Asn His Gln Gln Ile Ile Leu Asp Lys Gly Met Leu Val Ala 450 455 460 Ile Asp Glu Leu Met Gln Ser Leu Asn His Asn Gly Glu Thr Leu Arg 465 470 475 480 Gln Lys Pro Pro Val Gly Glu Ala Asp Pro Tyr Arg Val Lys Met Lys 485 490 495 Leu Cys Ile Leu Leu His Ala Phe Ser Thr Arg Val Val Thr Ile Asn 500 505 510 Arg Val Met Gly Tyr Leu Ser Ser Ala Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly 515 520 525 Gly Gly Ser Glu Pro Arg Gly Pro Thr Ile Lys Pro Cys Pro Pro Cys 530 535 540 Lys Cys Pro Ala Pro Asn Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Ile Phe 545 550 555 560 Pro Pro Lys Ile Lys Asp Val Leu Met Ile Ser Leu Ser Pro Ile Val 565 570 575 Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser Glu Asp Asp Pro Asp Val Gln Ile 580 585 590 Ser Trp Phe Val Asn Asn Val Glu Val His Thr Ala Gln Thr Gln Thr 595 600 605 His Arg Glu Asp Tyr Asn Ser Thr Leu Arg Val Val Ser Ala Leu Pro 610 615 620 Ile Gln His Gln Asp Trp Met Ser Gly Lys Glu Phe Lys Cys Lys Val 625 630 635 640 Asn Asn Lys Asp Leu Pro Ala Pro Ile Glu Arg Thr Ile Ser Lys Pro 645 650 655 Lys Gly Ser Val Arg Ala Pro Gln Val Tyr Val Leu Pro Pro Pro Glu 660 665 670 Glu Glu Met Thr Lys Lys Gln Val Thr Leu Thr Cys Met Val Thr Asp 675 680 685 Phe Met Pro Glu Asp Ile Tyr Val Glu Trp Thr Asn Asn Gly Lys Thr 690 695 700 Glu Leu Asn Tyr Lys Asn Thr Glu Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser 705 710 715 720 Tyr Phe Met Tyr Ser Lys Leu Arg Val Glu Lys Lys Asn Trp Val Glu 725 730 735 Arg Asn Ser Tyr Ser Cys Ser Val Val His Glu Gly Leu His Asn His 740 745 750 His Thr Thr Lys Ser Phe Ser Arg Thr Pro Gly Gly Gly Gly Gly Ser 755 760 765 Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gln Val Gln Leu Gln Gln 770 775 780 Pro Gly Ala Glu Leu Val Arg Pro Gly Thr Ser Val Lys Leu Ser Cys 785 790 795 800 Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr Trp Met His Trp Ile Lys 805 810 815 Gln Arg Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile Gly Val Ile Asp Pro Ser 820 825 830 Asp Asn Tyr Thr Lys Tyr Asn Gln Lys Phe Lys Gly Lys Ala Thr Leu 835 840 845 Thr Val Asp Thr Ser Ser Ser Thr Ala Tyr Met Gln Leu Ser Ser Leu 850 855 860 Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Phe Cys Ala Arg Glu Gly Tyr Tyr 865 870 875 880 Gly Ser Ser Pro Trp Phe Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr 885 890 895 Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly 900 905 910 Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gln Ile Val Met Ser Gln Ser Pro Ala 915 920 925 Ile Leu Ser Ala Ser Pro Gly Glu Lys Val Thr Met Thr Cys Arg Ala 930 935 940 Arg Ser Ser Val Ser Tyr Ile His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Ser 945 950 955 960 Ser Pro Lys Pro Trp Ile Tyr Ala Thr Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val 965 970 975 Pro Gly Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Ser Tyr Ser Leu Thr 980 985 990 Ile Thr Arg Val Glu Ala Glu Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln 995 1000 1005 Trp Ser Ser Lys Pro Pro Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile 1010 1015 1020 Lys 102 <210> 283 <211> 1025 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> mu scIL-12 mut2-mu IgG2a Fc-anti-mu CD20 scFv <400> 283 Met Trp Glu Leu Glu Lys Asp Val Tyr Val Val Glu Val Asp Trp Thr 1 5 10 15 Pro Asp Ala Pro Gly Glu Thr Val Asn Leu Thr Cys Asp Thr Pro Glu 20 25 30 Glu Asp Asp Ile Thr Trp Thr Ser Asp Gln Arg His Gly Val Ile Gly 35 40 45 Ser Gly Lys Thr Leu Thr Ile Thr Val Lys Glu Phe Leu Asp Ala Gly 50 55 60 Gln Tyr Thr Cys His Lys Gly Gly Glu Thr Leu Ser His Ser His Leu 65 70 75 80 Leu Leu His Lys Lys Glu Asn Gly Ile Trp Ser Thr Glu Ile Leu Lys 85 90 95 Asn Phe Lys Asn Lys Thr Phe Leu Lys Cys Glu Ala Pro Asn Tyr Ser 100 105 110 Gly Arg Phe Thr Cys Ser Trp Leu Val Gln Arg Asn Met Asp Leu Lys 115 120 125 Phe Asn Ile Lys Ser Ser Ser Ser Ser Pro Asp Ser Arg Ala Val Thr 130 135 140 Cys Gly Met Ala Ser Leu Ser Ala Glu Lys Val Thr Leu Asp Gln Arg 145 150 155 160 Asp Tyr Glu Lys Tyr Ser Val Ser Cys Gln Glu Asp Val Thr Cys Pro 165 170 175 Thr Ala Glu Glu Thr Leu Pro Ile Glu Leu Ala Leu Glu Ala Arg Gln 180 185 190 Gln Asn Lys Tyr Glu Asn Tyr Ser Thr Ser Phe Phe Ile Arg Asp Ile 195 200 205 Ile Lys Pro Asp Pro Pro Lys Asn Leu Gln Met Lys Pro Leu Lys Asn 210 215 220 Ser Gln Val Glu Val Ser Trp Glu Tyr Pro Asp Ser Trp Ser Thr Pro 225 230 235 240 His Ser Tyr Phe Ser Leu Lys Phe Phe Val Arg Ile Gln Ala Ala Ala 245 250 255 Glu Lys Met Ala Glu Thr Glu Glu Gly Cys Asn Gln Lys Gly Ala Phe 260 265 270 Leu Val Glu Lys Thr Ser Thr Glu Val Gln Cys Lys Gly Gly Asn Val 275 280 285 Cys Val Gln Ala Gln Asp Arg Tyr Tyr Asn Ser Ser Cys Ser Lys Trp 290 295 300 Ala Cys Val Pro Cys Arg Val Arg Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly 305 310 315 320 Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Arg Val Ile Pro Val Ser Gly Pro 325 330 335 Ala Arg Cys Leu Ser Gln Ser Arg Asn Leu Leu Lys Thr Thr Asp Asp 340 345 350 Met Val Lys Thr Ala Arg Glu Lys Leu Lys His Tyr Ser Cys Thr Ala 355 360 365 Glu Asp Ile Asp His Glu Asp Ile Thr Arg Asp Gln Thr Ser Thr Leu 370 375 380 Lys Thr Cys Leu Pro Leu Glu Leu His Lys Asn Glu Ser Cys Leu Ala 385 390 395 400 Thr Arg Glu Thr Ser Ser Thr Thr Arg Gly Ser Cys Leu Pro Pro Gln 405 410 415 Lys Thr Ser Leu Met Met Thr Leu Cys Leu Gly Ser Ile Tyr Glu Asp 420 425 430 Leu Lys Met Tyr Gln Thr Glu Phe Gln Ala Ile Asn Ala Ala Leu Gln 435 440 445 Asn His Asn His Gln Gln Ile Ile Leu Asp Lys Gly Met Leu Val Ala 450 455 460 Ile Asp Glu Leu Met Gln Ser Leu Asn His Asn Gly Glu Thr Leu Arg 465 470 475 480 Gln Lys Pro Pro Val Gly Glu Ala Asp Pro Tyr Arg Val Lys Met Lys 485 490 495 Leu Cys Ile Leu Leu His Ala Phe Ser Thr Arg Val Val Thr Ile Asn 500 505 510 Arg Val Met Gly Tyr Leu Ser Ser Ala Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly 515 520 525 Gly Gly Ser Glu Pro Arg Gly Pro Thr Ile Lys Pro Cys Pro Pro Cys 530 535 540 Lys Cys Pro Ala Pro Asn Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Ile Phe 545 550 555 560 Pro Pro Lys Ile Lys Asp Val Leu Met Ile Ser Leu Ser Pro Ile Val 565 570 575 Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser Glu Asp Asp Pro Asp Val Gln Ile 580 585 590 Ser Trp Phe Val Asn Asn Val Glu Val His Thr Ala Gln Thr Gln Thr 595 600 605 His Arg Glu Asp Tyr Asn Ser Thr Leu Arg Val Val Ser Ala Leu Pro 610 615 620 Ile Gln His Gln Asp Trp Met Ser Gly Lys Glu Phe Lys Cys Lys Val 625 630 635 640 Asn Asn Lys Asp Leu Pro Ala Pro Ile Glu Arg Thr Ile Ser Lys Pro 645 650 655 Lys Gly Ser Val Arg Ala Pro Gln Val Tyr Val Leu Pro Pro Pro Glu 660 665 670 Glu Glu Met Thr Lys Lys Gln Val Thr Leu Thr Cys Met Val Thr Asp 675 680 685 Phe Met Pro Glu Asp Ile Tyr Val Glu Trp Thr Asn Asn Gly Lys Thr 690 695 700 Glu Leu Asn Tyr Lys Asn Thr Glu Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser 705 710 715 720 Tyr Phe Met Tyr Ser Lys Leu Arg Val Glu Lys Lys Asn Trp Val Glu 725 730 735 Arg Asn Ser Tyr Ser Cys Ser Val Val His Glu Gly Leu His Asn His 740 745 750 His Thr Thr Lys Ser Phe Ser Arg Thr Pro Gly Gly Gly Gly Gly Ser 755 760 765 Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gln Val Gln Leu Gln Gln 770 775 780 Pro Gly Ala Glu Leu Val Arg Pro Gly Thr Ser Val Lys Leu Ser Cys 785 790 795 800 Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr Trp Met His Trp Ile Lys 805 810 815 Gln Arg Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile Gly Val Ile Asp Pro Ser 820 825 830 Asp Asn Tyr Thr Lys Tyr Asn Gln Lys Phe Lys Gly Lys Ala Thr Leu 835 840 845 Thr Val Asp Thr Ser Ser Ser Thr Ala Tyr Met Gln Leu Ser Ser Leu 850 855 860 Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Phe Cys Ala Arg Glu Gly Tyr Tyr 865 870 875 880 Gly Ser Ser Pro Trp Phe Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr 885 890 895 Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly 900 905 910 Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gln Ile Val Met Ser Gln Ser Pro Ala 915 920 925 Ile Leu Ser Ala Ser Pro Gly Glu Lys Val Thr Met Thr Cys Arg Ala 930 935 940 Arg Ser Ser Val Ser Tyr Ile His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Ser 945 950 955 960 Ser Pro Lys Pro Trp Ile Tyr Ala Thr Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val 965 970 975 Pro Gly Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Ser Tyr Ser Leu Thr 980 985 990 Ile Thr Arg Val Glu Ala Glu Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln 995 1000 1005 Trp Ser Ser Lys Pro Pro Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile 1010 1015 1020 Lys 102 <210> 284 <211> 227 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> hu IgG1 Fc <400> 284 Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly 1 5 10 15 Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met 20 25 30 Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His 35 40 45 Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val 50 55 60 His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr 65 70 75 80 Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly 85 90 95 Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile 100 105 110 Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val 115 120 125 Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser 130 135 140 Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu 145 150 155 160 Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro 165 170 175 Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val 180 185 190 Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met 195 200 205 His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser 210 215 220 Pro Gly Lys 225 <210> 285 <211> 233 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> mu IgG2a Fc <400> 285 Glu Pro Arg Gly Pro Thr Ile Lys Pro Cys Pro Pro Cys Lys Cys Pro 1 5 10 15 Ala Pro Asn Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Lys 20 25 30 Ile Lys Asp Val Leu Met Ile Ser Leu Ser Pro Ile Val Thr Cys Val 35 40 45 Val Val Asp Val Ser Glu Asp Asp Pro Asp Val Gln Ile Ser Trp Phe 50 55 60 Val Asn Asn Val Glu Val His Thr Ala Gln Thr Gln Thr His Arg Glu 65 70 75 80 Asp Tyr Asn Ser Thr Leu Arg Val Val Ser Ala Leu Pro Ile Gln His 85 90 95 Gln Asp Trp Met Ser Gly Lys Glu Phe Lys Cys Lys Val Asn Asn Lys 100 105 110 Asp Leu Pro Ala Pro Ile Glu Arg Thr Ile Ser Lys Pro Lys Gly Ser 115 120 125 Val Arg Ala Pro Gln Val Tyr Val Leu Pro Pro Pro Glu Glu Glu Met 130 135 140 Thr Lys Lys Gln Val Thr Leu Thr Cys Met Val Thr Asp Phe Met Pro 145 150 155 160 Glu Asp Ile Tyr Val Glu Trp Thr Asn Asn Gly Lys Thr Glu Leu Asn 165 170 175 Tyr Lys Asn Thr Glu Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Tyr Phe Met 180 185 190 Tyr Ser Lys Leu Arg Val Glu Lys Lys Asn Trp Val Glu Arg Asn Ser 195 200 205 Tyr Ser Cys Ser Val Val His Glu Gly Leu His Asn His His Thr Thr 210 215 220 Lys Ser Phe Ser Arg Thr Pro Gly Lys 225 230

Claims (31)

  1. IL-12 또는 이의 변이체를 포함하는 제1 단량체; 및
    CD20에 특이적으로 결합하는 항원 결합 부위를 포함하는 제2 단량체;를 포함하고,
    상기 IL-12 또는 이의 변이체는 IL-12A(p35) 또는 이의 변이체; 및 IL-12B(p40) 또는 이의 변이체를 포함하는 것이며,
    상기 IL-12 또는 이의 변이체는 하기 구조식(I) 또는 구조식(II)로 이루어진 것이고,
    상기 제1 단량체는 하기 구조식 (III) 또는 구조식 (IV)로 이루어진 것이며,
    상기 제2 단량체는 하기 구조식 (V)를 포함하는 것인, 융합단백질:
    N'-Y-[링커(1)]o-Z-C' (I)
    N'-Z-[링커(1)]o-Y-C' (II)
    N'-X-[링커(2)]p-Fc 영역 단편 또는 이의 변이체-[링커(3)]q-(T)r-C' (III)
    N'-(T)r-[링커(2)]q -Fc 영역 단편 또는 이의 변이체-[링커(3)]p-X-C' (IV)
    N'-(R)s-[링커(4)]t-Q-[링커(5)]u-Fc 영역 단편 또는 이의 변이체-[링커(6)]v-(W)a-C' (V)
    이때, 상기 구조식(I), (II), (III), (IV) 및 (V)에 있어서,
    상기 N'은 융합단백질의 N-말단이고,
    상기 C'는 융합단백질의 C-말단이며,
    상기 Y는 IL-12A 또는 이의 변이체이고,
    상기 Z는 IL-12B 또는 이의 변이체이며,
    상기 링커(1)는 펩타이드 링커이고,
    상기 o는 O 또는 1이며,
    상기 X는 상기 구조식 (I) 또는 (II)이고,
    상기 T는 CD20에 특이적으로 결합하는 항원 결합 부위이며,
    상기 링커(2) 및 링커(3)은 펩타이드 링커이고,
    상기 p, q 및 r은 각각 독립적으로 O 또는 1이며,
    상기 R은 CD20에 특이적으로 결합하는 항원 결합 부위이고,
    상기 Q는 CD20에 특이적으로 결합하는 항원 결합 부위이며,
    상기 W는 CD20에 특이적으로 결합하는 scFv; 또는 구조식 (I) 또는 (II)의 IL-12 또는 이의 변이체이고,
    상기 링커(4) 내지 링커(6)는 펩타이드 링커이며,
    상기 s, t, u, v 및 a는 각각 독립적으로 O 또는 1이다.
  2. 삭제
  3. 삭제
  4. 제1항에 있어서,
    상기 IL-12B(p40)의 변이체는 서열번호 124의 아미노산 서열에서 K258A, K260A, K263A 및 K264A로 이루어지는 군으로부터 선택되는 하나 이상의 치환이 일어난 아미노산 서열을 포함하는 것인, 융합단백질.
  5. 제1항에 있어서,
    상기 IL-12B(p40)는 서열번호 124 또는 서열번호 131의 아미노산 서열을 포함하는 것인, 융합단백질.
  6. 제4항에 있어서,
    상기 IL-12B(p40)의 변이체는 서열번호 127, 서열번호 129, 서열번호 134 또는 서열번호 136의 아미노산 서열을 포함하는 것인, 융합단백질.
  7. 제1항에 있어서,
    상기 IL-12A(p35)는 서열번호 125 또는 서열번호 132의 아미노산 서열을 포함하는 것인, 융합단백질.
  8. 제1항에 있어서,
    상기 IL-12는 서열번호 123, 서열번호 126, 서열번호 128, 서열번호 130, 서열번호 133 또는 서열번호 135의 아미노산 서열을 포함하는 것인, 융합단백질.
  9. 제1항에 있어서,
    상기 CD20에 특이적으로 결합하는 항원 결합 부위는
    서열번호 107의 HCDR1, 서열번호 108의 HCDR2 및 서열번호 109의 HCDR3를 포함하는 중쇄가변영역 및 서열번호 110의 LCDR1, 서열번호 111의 LCDR2, 서열번호 112의 LCDR3를 포함하는 경쇄가변영역;
    서열번호 115의 HCDR1, 서열번호 116의 HCDR2 및 서열번호 117의 HCDR3를 포함하는 중쇄가변영역 및 서열번호 118의 LCDR1, 서열번호 119의 LCDR2, 서열번호 120의 LCDR3를 포함하는 경쇄가변영역;
    서열번호 143의 HCDR1, 서열번호 144의 HCDR2, 서열번호 145의 HCDR3을 포함하는 중쇄가변영역 및 서열번호 146의 LCDR1, 서열번호 147의 LCDR2, 서열번호 148의 LCDR3을 포함하는 경쇄가변영역;
    서열번호 149의 HCDR1, 서열번호 150의 HCDR2, 서열번호 151의 HCDR3을 포함하는 중쇄가변영역 및 서열번호 152의 LCDR1, 서열번호 153의 LCDR2, 서열번호 154의 LCDR3을 포함하는 경쇄가변영역;
    서열번호 155의 HCDR1, 서열번호 156의 HCDR2, 서열번호 157의 HCDR3을 포함하는 중쇄가변영역 및 서열번호 158의 LCDR1, 서열번호 159의 LCDR2, 서열번호 160의 LCDR3을 포함하는 경쇄가변영역;
    서열번호 161의 HCDR1, 서열번호 162의 HCDR2, 서열번호 163의 HCDR3을 포함하는 중쇄가변영역 및 서열번호 164의 LCDR1, 서열번호 165의 LCDR2, 서열번호 166의 LCDR3을 포함하는 경쇄가변영역;
    서열번호 167의 HCDR1, 서열번호 168의 HCDR2, 서열번호 169의 HCDR3을 포함하는 중쇄가변영역 및 서열번호 170의 LCDR1, 서열번호 171의 LCDR2, 서열번호 172의 LCDR3을 포함하는 경쇄가변영역;
    서열번호 173의 HCDR1, 서열번호 174의 HCDR2, 서열번호 175의 HCDR3을 포함하는 중쇄가변영역 및 서열번호 176의 LCDR1, 서열번호 177의 LCDR2, 서열번호 178의 LCDR3을 포함하는 경쇄가변영역;
    서열번호 179의 HCDR1, 서열번호 180의 HCDR2, 서열번호 181의 HCDR3을 포함하는 중쇄가변영역 및 서열번호 182의 LCDR1, 서열번호 183의 LCDR2, 서열번호 184의 LCDR3을 포함하는 경쇄가변영역;
    서열번호 185의 HCDR1, 서열번호 186의 HCDR2, 서열번호 187의 HCDR3을 포함하는 중쇄가변영역 및 서열번호 188의 LCDR1, 서열번호 189의 LCDR2, 서열번호 190의 LCDR3을 포함하는 경쇄가변영역;
    서열번호 191의 HCDR1, 서열번호 192의 HCDR2, 서열번호 193의 HCDR3을 포함하는 중쇄가변영역 및 서열번호 194의 LCDR1, 서열번호 195의 LCDR2, 서열번호 196의 LCDR3을 포함하는 경쇄가변영역;
    서열번호 197의 HCDR1, 서열번호 198의 HCDR2, 서열번호 199 또는 서열번호 200의 HCDR3을 포함하는 중쇄가변영역 및 서열번호 201의 LCDR1, 서열번호 202의 LCDR2, 서열번호 203의 LCDR3을 포함하는 경쇄가변영역;
    서열번호 204의 HCDR1, 서열번호 205의 HCDR2, 서열번호 206의 HCDR3을 포함하는 중쇄가변영역 및 서열번호 207의 LCDR1, 서열번호 208의 LCDR2, 서열번호 209의 LCDR3을 포함하는 경쇄가변영역;
    서열번호 210의 HCDR1, 서열번호 211의 HCDR2, 서열번호 212의 HCDR3을 포함하는 중쇄가변영역 및 서열번호 213의 LCDR1, 서열번호 214의 LCDR2, 서열번호 215의 LCDR3을 포함하는 경쇄가변영역;
    서열번호 216의 HCDR1, 서열번호 217의 HCDR2, 서열번호 218의 HCDR3을 포함하는 중쇄가변영역 및 서열번호 219의 LCDR1, 서열번호 220의 LCDR2, 서열번호 221의 LCDR3을 포함하는 경쇄가변영역;
    서열번호 222의 HCDR1, 서열번호 223의 HCDR2, 서열번호 224의 HCDR3을 포함하는 중쇄가변영역 및 서열번호 225의 LCDR1, 서열번호 226의 LCDR2, 서열번호 227의 LCDR3을 포함하는 경쇄가변영역;
    서열번호 228의 HCDR1, 서열번호 229의 HCDR2, 서열번호 230의 HCDR3을 포함하는 중쇄가변영역 및 서열번호 231의 LCDR1, 서열번호 232의 LCDR2, 서열번호 233의 LCDR3을 포함하는 경쇄가변영역; 또는
    서열번호 234의 HCDR1, 서열번호 235의 HCDR2, 서열번호 236의 HCDR3을 포함하는 중쇄가변영역 및 서열번호 237의 LCDR1, 서열번호 238의 LCDR2, 서열번호 239의 LCDR3을 포함하는 경쇄가변영역;
    을 포함하는 것인, 융합단백질.
  10. 제1항에 있어서,
    상기 CD20에 특이적으로 결합하는 항원 결합 부위는
    서열번호 113의 중쇄가변영역 및 서열번호 114의 경쇄가변영역;
    서열번호 121의 중쇄가변영역 및 서열번호 122의 경쇄가변영역;
    서열번호 240의 중쇄가변영역 및 서열번호 241의 경쇄가변영역;
    서열번호 242의 중쇄가변영역 및 서열번호 243의 경쇄가변영역;
    서열번호 244의 중쇄가변영역 및 서열번호 245의 경쇄가변영역;
    서열번호 246의 중쇄가변영역 및 서열번호 247의 경쇄가변영역;
    서열번호 248의 중쇄가변영역 및 서열번호 249의 경쇄가변영역;
    서열번호 250의 중쇄가변영역 및 서열번호 251의 경쇄가변영역;
    서열번호 252의 중쇄가변영역 및 서열번호 253의 경쇄가변영역;
    서열번호 254의 중쇄가변영역 및 서열번호 255의 경쇄가변영역;
    서열번호 256의 중쇄가변영역 및 서열번호 257의 경쇄가변영역;
    서열번호 258의 중쇄가변영역 및 서열번호 259의 경쇄가변영역;
    서열번호 260의 중쇄가변영역 및 서열번호 261의 경쇄가변영역;
    서열번호 262의 중쇄가변영역 및 서열번호 263의 경쇄가변영역;
    서열번호 264의 중쇄가변영역 및 서열번호 265의 경쇄가변영역;
    서열번호 266의 중쇄가변영역 및 서열번호 267의 경쇄가변영역;
    서열번호 268의 중쇄가변영역 및 서열번호 269의 경쇄가변영역;
    서열번호 270의 중쇄가변영역 및 서열번호 271의 경쇄가변영역;
    서열번호 88의 scFv를 포함하는 것; 또는
    서열번호 89의 scFv를 포함하는 것인, 융합단백질.
  11. 제1항에 있어서,
    제1 단량체는 CD20에 특이적으로 결합하는 항원 결합 부위를 추가적으로 포함하는 것인, 융합단백질.
  12. 삭제
  13. 제1항에 있어서,
    상기 링커는 (G4S)n 링커를 포함할 수 있으며,
    상기 n은 1 내지 10의 정수 중 어느 하나인 것인, 융합단백질.
  14. 제1항에 있어서,
    상기 제1 단량체의 Fc 영역은 인간 IgG1 또는 마우스 IgG2a 유래인, 융합단백질.
  15. 제1항에 있어서,
    상기 제1 단량체의 Fc는 놉 구조 또는 홀 구조를 포함하는 것인, 융합단백질.
  16. 제1항에 있어서,
    상기 제2 단량체는 CD20에 특이적으로 결합하는 항원 결합 부위를 추가적으로 포함하는 것인, 융합단백질.
  17. 제16항에 있어서,
    상기 CD20에 특이적으로 결합하는 항원 결합 부위는 Fab, scFv, Fv 또는 이의 단편인 것인, 융합단백질.
  18. 제16항에 있어서,
    상기 추가적으로 결합된 CD20에 특이적으로 결합하는 항원 결합 부위는 제2 단량체의 N 말단 또는 C 말단에 결합되는 것인, 융합단백질.
  19. 삭제
  20. 제1항에 있어서,
    상기 구조식 (V)는 하기 구조식 (V') 및 (V'')을 포함하는 것인, 융합단백질:
    N'-(R')s-[링커(4)]t-Q'-[링커(5)]u-Fc 영역 단편 또는 이의 변이체-[링커(6)]p-(W)a-C' (V')
    N'-(R'')s-[링커(4)]t-Q''-[링커(7)]x-(W)b-C' (V'')
    이때, 상기 구조식 (V') 및 (V'')에 있어서,
    R'은 CD20에 특이적으로 결합하는 항체의 중쇄 영역으로서 가변영역 및 CH1 영역을 포함하거나, 또는 항체의 경쇄 영역이고;
    R''은 CD20에 특이적으로 결합하는 항체의 경쇄 영역이거나, 또는 항체의 중쇄 영역으로서 가변영역 및 CH1 영역을 포함하며;
    이때, R' 및 R''은 결합하여 항체의 가변 영역을 형성하고, 이때, 상기 가변 영역은 CD20에 특이적으로 결합하며;
    Q'은 CD20에 특이적으로 결합하는 항체의 중쇄 영역으로서 가변영역 및 CH1 영역을 포함하거나, 또는 항체의 경쇄 영역이고;
    Q''은 CD20에 특이적으로 결합하는 항체의 경쇄 영역이거나, 또는 항체의 중쇄 영역으로서 가변영역 및 CH1 영역을 포함하며;
    이때, Q' 및 Q''는 결합하여 항체의 가변 영역을 형성하고, 이때, 상기 가변 영역은 CD20에 특이적으로 결합하며,
    R' 및 Q'은 각각 항체의 중쇄 영역으로서 가변영역 및 CH1 영역을 포함하거나, 또는 항체의 경쇄 영역이고;
    R'' 및 Q''은 각각 항체의 경쇄 영역이거나, 또는 항체의 중쇄 영역으로서 가변영역 및 CH1 영역을 포함하며;
    이때, R' 및 R''; 및 Q' 및 Q''은 결합하여 항체의 가변 영역을 형성하고, 이때, 상기 가변 영역은 CD20에 특이적으로 결합하며,
    상기 W는 CD20에 특이적으로 결합하는 scFv이고,
    상기 링커(4), 링커(5) 및 링커(7)은 펩타이드 링커이며,
    상기 s, t, u, x, a 및 b는 각각 독립적으로 O 또는 1이다.
  21. 제1항에 있어서,
    상기 융합단백질은 구조식 (III) 및 구조식 (V); 구조식 (IV) 및 구조식 (V); 구조식 (III) 및 구조식 (III); 구조식 (IV) 및 구조식 (IV); 또는 구조식 (V) 및 구조식 (V)를 포함하는 것인, 융합단백질.
  22. 제1항에 있어서,
    상기 제2 단량체는 서열번호 113의 아미노산 서열로 이루어진 중쇄 및 서열번호 114의 아미노산 서열로 이루어진 경쇄; 또는
    서열번호 121의 아미노산 서열로 이루어진 중쇄 및 서열번호 122의 아미노산 서열로 이루어진 경쇄를 포함하는 것인, 융합단백질.
  23. 제1항에 있어서,
    상기 제2 단량체의 Fc는 놉 구조 또는 홀 구조를 포함하는 것인, 융합단백질.
  24. 제1항, 제4항 내지 제11항, 제13항 내지 제18항, 제20항 내지 제23항 중 어느 한 항의 융합단백질을 유효성분으로 포함하는 암 예방 또는 치료용 약학 조성물.
  25. 제24항에 있어서,
    상기 암은 위암, 간암, 폐암, 대장암, 유방암, 전립선암, 피부암, 골암, 다발성골수종, 신경교종, 난소암, 췌장암, 자궁경부암, 갑상선암, 후두암, 급성 골수성 백혈병, 만성 골수성 백혈병, 급성 림프모구성 백혈병, 만성 림프모구성 백혈병, 뇌종양, 신경모세포종, 망막 모세포종, 두경부암, 침샘암 및 림프종으로 구성된 군에서 선택되는 어느 하나인, 약학 조성물.
  26. 제1항의 상기 제1 단량체를 코딩하는 폴리뉴클레오티드.
  27. 제26항의 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터.
  28. 제1항의 상기 제2 단량체를 코딩하는 폴리뉴클레오티드.
  29. 제28항의 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터.
  30. 제27항 및 제29항의 벡터가 도입된 형질전환 세포.
  31. i) 제30항의 형질전환 세포를 배양하는 단계; 및
    ii) 제1 단량체 및 제2 단량체를 포함하는 융합단백질을 회수하는 단계를 포함하는 융합단백질의 생산방법.
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