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KR102757369B1 - 면역원성 치쿤구니야 바이러스 chikv-델타5nsp3을 포함하는 약제학적 조성물의 생산 방법 - Google Patents

면역원성 치쿤구니야 바이러스 chikv-델타5nsp3을 포함하는 약제학적 조성물의 생산 방법 Download PDF

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KR102757369B1 KR1020207004686A KR20207004686A KR102757369B1 KR 102757369 B1 KR102757369 B1 KR 102757369B1 KR 1020207004686 A KR1020207004686 A KR 1020207004686A KR 20207004686 A KR20207004686 A KR 20207004686A KR 102757369 B1 KR102757369 B1 KR 102757369B1
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로버트 슈레글
아르노 레옹
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Abstract

본 발명은 면역원성 생 약독화 치쿤구니야 바이러스(live attenuated Chikungunya virus)를 생산하는 방법, 뿐만 아니라 그를 포함하는 약제학적 조성물에 관한 것이다.

Description

면역원성 치쿤구니야 바이러스 CHIKV-델타5NSP3을 포함하는 약제학적 조성물의 생산 방법
본 발명은 면역원성 생 약독화 치쿤구니야 바이러스(live attenuated Chikungunya virus)를 생산하는 방법, 뿐만 아니라 그를 포함하는 약제학적 조성물에 관한 것이다.
치쿤구니야 바이러스(CHIKV)는 토가바이러스과(family Togaviridae) 알파바이러스 속(genus Alphavirus)의 양의 방향 단일 가닥 RNA이다. 치쿤구니야 바이러스 질병은 주로 집단 발병하며 높은 공격률과 관련된다. 바이러스는 모기 벡터를 통해 인간에게 전염되고 열, 발진, 피로 및 심한 다발성 관절통을 야기한다. CHIKV의 감염은 일반적으로 자연스럽게 해결되고 사망률이 10 내지 30 퍼센트인 CNS 감염을 수반하는 드문 사례를 제외하고는 보통 치명적이지 않다. 특히 CHIKV CNS 질병에 대한 위험은 1세 미만의 영아 및 65세 이상의 성인에게 있으며, 감염률은 일반 집단보다 각각 25배 및 6배 더 높다. CHIKV 뇌염 후 어린이에서의 지속적인 장애 비율은 30 내지 45 퍼센트로 추정된다(Gerardin P, et al. Chikungunya Virus-associated encephalitis A cohort study on La Reunion Island, 2005-2009 (2016) Neurology 86:1-9). 또한, 모든 치쿤구니야 환자의 약 30 퍼센트가 회복 후 수개월 내지 수년 동안 관절통을 경험한다. 일부 경우에, 신경학적, 신장, 심장, 호흡기 또는 간 합병증이 발생할 수 있다.
현재 치쿤구니야 바이러스 질병의 예방 또는 치료에 이용가능한 백신이나 약제는 없다. 과거에 집단발병은 주로 아프리카에서 발생하였지만, 동-중앙 남 아프리카(ECSA) 유전자형은 최근 지리적 범위를 확장하여, 인도, 아시아, 및 심지어 온대 유럽에서도 집단발병을 초래하였다(Weaver, S., Arrival of Chikungunya Virus in the New World: Prospects for Spread and Impact on Public Health (2014) PLOS Neglected Tropical Diseases 8(6): e2921). CHIKV가 1995년 이후 미국으로 반복적으로 유입되었지만, 자생 전파는 카리브해에서 2013년까지 보고되지 않았다. 2015년에, 전염병은 본토로 퍼져 미 대륙의 27개 국가에서 백만 건 이상의 의심 사례가 발생하였다(Pan-American Health Organization (2015) Number of Cumulative Cases of Chikungunya Fever in the Americas). 또한 전염병은 CHIKV 모기 벡터가 비-풍토병 영역으로 확산되는 것 뿐만 아니라 CHIKV가 현지 모기 종에 적응하는 능력에 의해 부분적으로 도움을 받을 수 있었다(Vega-Rua A, et al., Chikungunya Virus Transmission Potential by Local Aedes Mosquitoes in the Americas and Europe (2015) PLOS Neglected Tropical Diseases DOI:10.1371/journal.pntd.0003780). 치쿤구니야 바이러스의 높은 전염률, 그의 지리적 확산, 및 오래 지속되는 합병증 가능성은 백신과 같은 예방적 조치를 개발할 필요성을 강조한다.
치쿤구니야 바이러스에 대한 백신은 생 약독화(live attenuated) CHIKV 입자; 즉, 병독성을 감소시키도록 변경되었지만, 여전히 면역원성을 유지하는 생 CHIKV 입자를 포함할 수 있다. 약독화 CHIKV의 한 예는 비-구조 단백질 3에서 결실 돌연변이를 함유한다(CHIKV-Δ5nsP3; 도 2 참조). CHIKV-Δ5nsP3은 마우스(Hallengrd D, et al. Novel attenuated Chikungunya vaccine candidates elicit protective immunity in C57Bl/6 mice (2014) J. Virol. 88:2858-2866) 및 비-인간 영장류(Roques P, et al. Attenuated and vectored vaccines protect non-human primates against Chikungunya virus (2017) J. Clin. Invest. Insight 2(6):e83527)에서 보호 면역력을 부여하는 것으로 제시되었다. 마우스 및 비-인간 영장류에서 이러한 예비 생체내 연구는 일반적으로 인간 백신을 생산하는데 선호되지 않는 세포 유형인 BHK-21 세포에서 생성된 CHIKV-Δ5nsP3 바이러스로 수행되었다. 따라서, 본원에 개시된 바와 같이, 보다 적합한 세포 배양 플랫폼에 CHIKV-Δ5nsP3 바이러스 생산을 적응시키는 것이 필요할 수 있다. 이러한 적응은 사소한 방법이 아니며; 예를 들어, 특정한 숙주 세포에 바이러스를 적응시키는 것은 바이러스 입자의 표면 전하를 변화시키는 돌연변이를 유발할 수 있는 것으로 당업계에 알려져 있다. 이러한 후천성 돌연변이는 바이러스를 약독화하는 역할을 할 수 있으며; 실제로, 연속 계대가 바이러스에 대한 많은 백신에서 사용된 이러한 약독화 바이러스 입자를 개발하는데 사용되었다. CHIKV와 관련하여, 독성 야생형 치쿤구니야 바이러스의 반복된 시험관내 계대가 특정 점 돌연변이를 유발하여, 바이러스의 부분적 또는 완전 약독화를 초래할 수 있는 것으로 제시되었다(Gardner CL, et al., Deliberate Attenuation of Chikungunya Virus by Adaptation to Heparan Sulfate-Dependent Infectivity: A Model for Rational Arboviral Vaccine Design (2014) PLOS Neglected Tropical Diseases 8(2): e2719).
이제 놀랍게도 면역원성의 손실을 초래하는 특정 점 돌연변이가 약독화 CHIKV-Δ5nsP3의 세포 기질 적응 방법 동안 초기에 발생하여, 성공적인 백신 후보의 생산을 위한 필수 요건으로 상기 돌연변이를 제어 또는 감소시킬 수 있음이 밝혀졌다. 따라서, 본 발명은 CHIKV-Δ5nsP3 백신 후보의 번식에 대해 잘 정의된 파라미터를 갖는 방법을 제공하여, 높은 면역원성 바이러스 입자의 생산을 허용하면서, 동시에 산업 적용에 적합한 세포 배양에서 높은 생산 역가를 달성한다.
본 발명은 대상체에서 중화 면역 반응; 즉, 치쿤구니야 바이러스에 의해 야기된 감염 및/또는 질병에 대해 보호되는 면역 반응을 도출하는데 충분한 양의 면역원성 치쿤구니야 바이러스를 포함하는 약제학적 조성물에 관한 것이다. 특히, 본 발명은 생 약독화 CHIKV-Δ5nsP3 입자를 포함하는 약제학적 조성물을 제공하며, 여기서 면역원성-감소 돌연변이, 특히 E2 단백질에서 면역원성-감소 돌연변이를 갖는 상기 바이러스 입자의 백분율은 최소화된다. 본 개시내용은 또한 생 약독화 CHIKV-Δ5nsP3을 포함하는 약제학적 조성물을 생산하는 방법을 제공하며, 상기 방법은 바이러스 게놈에서 면역원성-감소 돌연변이, 특히 바이러스 E2 단백질의 E168에서의 돌연변이 및/또는 다른 E2 잔기 및/또는 다른 구조 또는 비-구조 CHIKV 단백질 내 잔기의 존재를 최소화한다. 본 개시내용은 또한 본 발명의 방법에 의해 수득가능한 면역원성 생 약독화 치쿤구니야 바이러스를 포함하는 약제학적 조성물을 제공한다.
치쿤구니야 바이러스에 대한 백신을 개발하려는 노력은 현재 진행중이다. 가장 진보된 백신 후보 중 하나는 홍역 바이러스 플랫폼에서 키메라 작제물을 제공한다(http://www.themisbio.com/#/news 참조). 현재 2상 시험 중인 백신은 두 가지 용량으로 전달된다(https://clinicaltrials.gov/ct2/show/NCT02861586?term=themis&recrs=a&rank=2). 1회성(one-shot) 백신은 해당 분야에서 뚜렷한 이점을 나타낼 수 있다.
따라서, 일 구현예에서, 안정하고 잘 정의되고 안전하고 효과적인 약제학적 조성물 예컨대, 예를 들어 치쿤구니야 바이러스에 대한 백신, 바람직하게는 단지 하나의 백신 접종으로 보호를 부여하는 개선된 백신; 즉, 공통 세포 기질을 사용하여 산업 규모에서 소위 "1회성" 백신을 제공하는 것, 이러한 안정하고 잘 정의되고 안전하고 효과적인 백신을 생성하는 방법 및 상기 안정하고 잘 정의되고 안전하고 효과적인 백신에 대한 방법 및 용도를 제공하는 것이 본 발명의 목적이다.
첨부된 도면은 일정한 비율로 도시된 것은 아니다. 도면은 단지 예시적인 것이며 본 개시내용을 가능하게 하기 위해 요구되는 것은 아니다. 명확성을 위해, 모두 구성요소가 모든 도면에 표지되는 것은 아니다. 도면에 대한 설명은 다음과 같다:
도 1: 합성된 단편으로부터 CHIKV-Δ5nsP3 게놈의 전체 어셈블리에 사용된 pMX 플라스미드의 맵. CHIKV-Δ5nsP3 서열의 전체 어셈블리를 위해, 암피실린 저항성 카세트를 갖는 pMX 플라스미드(pMA)를 사용하였다. pMX 벡터 시리즈는 pUC-유사 클로닝 벡터를 기반으로 하지만, 불필요한 프로모터는 제외한다(생물안전 등급 1).
도 2: CHIKV-Δ5nsP3 게놈 구조의 개략도. 치쿤구니야 바이러스 게놈은 2개의 다단백질을 암호화한다: 비-구조 단백질 1-4(nsP1-4) 및 구조 단백질(C, E3, E2, 6K, E1). 야생형 게놈 서열과 비교하면, CHIKV-Δ5nsP3 서열(nsP1-4 다단백질에서 아미노산 1656 내지 1717)은 nsP3을 암호화하는 서열의 3' 부분에서 183-bp 결실을 함유하며, 이는 nsP3 복제 단백질에서 60개 아미노산 결실(Δ60aa로 표시됨)을 초래한다. SP, 서브게놈 프로모터; UTR, 비번역 영역. (Hallengrd D, et al., 2014, 상기 문헌에서 변형된 도면).
도 3: pMA에서 CHIKV-Δ5nsP3 게놈의 어셈블리를 위한 클로닝 전략. (a) 전체 CHIKV-Δ5nsP3 게놈을 포괄하는 합성된 폴리뉴클레오티드 단편의 설계 개략도. (b) pMA 플라스미드에서 CHIKV-Δ5nsP3 게놈의 어셈블리를 위한 클로닝 전략. 1. EcoRI 및 PacI를 통해 CHIKV-Δ5nsP3 단편 2를 pMA 함유 단편 1(pMA 단편 1)로 클로닝한다. 2. ClaI 및 PacI를 통해 단편 4 및 단편 3을 어셈블리한다. 3. 최종 전체 어셈블리를 위해 pMA에서 XhoI 및 PacI로 절단된 단편 5를 제조한다. 4. AgeI/XhoI-절단된 단편 3 및 4, 및 XhoI/PacI-절단된 단편 5를 AgeI/PacI-선형화된 pMA 단편 1 및 2와 융합하여 pMA에서 CHIKV-Δ5nsP3 게놈을 전체 어셈블리한다. 정확한 CHIKV-Δ5nsP3 게놈 어셈블리는 Sanger 서열분석을 통해 확인하였다.
도 4: Vero 세포에서 계대 후 CHIKV-Δ5nsP3의 수율, 플라크 크기 및 면역원성. 바이러스를 표 2에 상세히 기재된 바와 같이 공통 P0(구제)에서 출발하는 3개의 병행 복제물(A, B 및 C)에서 계대시켰다. (a) 계대 0에서 계대 16까지 Vero 세포의 감염 후 24 시간 바이러스 역가. 3개 복제물(A, B 및 C)의 평균 역가가 제시된다. (b) 플라크 검정에 의해 평가시 P0, P5 및 P15 CHIKV-Δ5nsP3의 상대 역가. Vero 세포를 5% FBS, 2 mM L-글루타민 및 1% 항생제-항진균제(항-항(Anti-Anti))로 보충된 MEM 중 6-웰 플레이트의 웰 당 4 x105개 세포의 밀도로 시딩하고, 35℃ 및 5% CO2에서 밤새도록 배양하였다. 다음 날, 배양 상청액을 Vero 세포로부터 제거하고 CHIKV-Δ5nsP3의 연속 희석액을 세포에 첨가하였다. 35℃/ 5% CO2에서 1 시간 동안 배양 후, 최종 농도 2%의 메틸셀룰로스 오버레이를 첨가하고, 세포를 35℃/5% CO2에서 추가로 3일 배양하였다. 최종적으로, 바이러스 역가(pfu/ml) 및 플라크 형태를 평가하기 위해 크리스탈 바이올렛 염색(5% 포름알데히드 중 0.5% 크리스탈 바이올렛) 후 플라크를 계수하였다. (c) Vero 세포에 대한 PRNT에서 CHIKV-Δ5nsP3(P0)의 중화에 의해 평가시 P0, P5B, P8B 및 P15C CHIKV-Δ5nsP3의 면역원성. Vero 세포를 3x105개 밀도로 12-웰 플레이트에 시딩하고 35℃/ 5% CO2에서 밤새도록 배양하였다. 5마리 C57Bl/6 마우스의 그룹을 각각의 CHIKV-Δ5nsP3 계대의 105 TCID50의 용량으로 1회 피하로 면역시켰다. P0(바이러스 구제), 또한 105 TCID50에서의 CHIKV-Δ5nsP3을 양성 대조군으로 사용하였다. 1:20 내지 1:327,680 범위의 4배 연속 희석으로 제21일 혈청 풀을 560 pfu/ml CHIKV-Δ5nsP3(P0에서)과 혼합하고, 1 시간 동안 배양하였다. 이어서 CHIKV-Δ5nsP3 /중화 혼합물을 Vero 세포에 첨가하고, 플레이트를 35℃/ 5% CO2에서 2 시간 동안 배양하였다. 이 단계는 2% 메틸셀룰로스 오버레이가 이어졌고, 플레이트를 35℃/ 5% CO2에서 ~60 시간 동안 배양하였다. 오버레이를 제거한 후, 세포를 크리스탈 바이올렛/5% 포름알데히드로 염색하고, 플라크를 계수하였다.
도 5: 면역원성에 대한 CHIKV-Δ5nsP3의 계대 동안 제어된 MOI(0.01)의 효과. (a) 비제어 및 제어된 조건 하에 Vero 세포에서 CHIKV-Δ5nsP3 계대의 개략도. CHIKV-Δ5nsP3 P0을 다양한 MOI로 비제어된 조건 하에 P3B에 대해 Vero 세포에서 계대시켰다(표 2에 요약됨; 복제물 B). 출발 물질로 P3B을 사용하여, 제어된 감염 방법을 0.01의 정의된 MOI에서 모든 후속 감염으로 수행하여 마우스에서 면역원성의 분석을 위한 1개의 P4 계대, 2개의 P5 계대 및 1개의 P6 계대를 생성하였다. (B) Vero 세포에 대한 PRNT에서 CHIKV-Δ5nsP3(P2)의 중화에 의해 평가시 P0(○), P2B(□), P5#1(●), P5#2(◆), P6(■) 및 P15(Δ) CHIKV-Δ5nsP3의 면역원성. 10마리 C57Bl/6 마우스의 그룹을 105 TCID50의 의도된 용량으로 각각의 CHIKV-Δ5nsP3 제제의 단일 용량으로 피하로 면역시키고, 면역화 후 제21일에, 풀링된 혈청을 도 4에 기재된 바와 같이 1:20 내지 1:327,680 범위의 4배 연속 희석으로 CHIKV-Δ5nsP3(560 pfu/ml) 중화 능력에 대해 평가하였다.
도 6: P5B 및 P8B로부터 CHIKV-Δ5nsP3의 단일 플라크 단리물의 면역원성 및 관찰된 게놈 이질성. 2개의 CHIKV-Δ5nsP3 바이러스 구제 수확물(4399gr1 P0(#1) 및 4415gr1 P0(#2)) 및 P15 CHIKV-Δ5nsP3 수확물(P15C-DS)은 각각 면역원성 및 비-면역원성 대조군의 역할을 하였다. (a) Vero 세포에 대한 PRNT에서 CHIKV-Δ5nsP3(P2)의 중화에 의해 평가된 CHIKV-Δ5nsP3 단일 플라크 단리물 P5B-11, P5B-03 및 P8B-05의 면역원성. 10마리 C57Bl/6 마우스의 그룹을, 나타낸 TCID50 용량으로 각각의 CHIKV-Δ5nsP3 단리물의 단일 용량으로 피하로 면역시키고, 면역화 후 제19일, 풀링된 혈청을 도 4에 대해 기재된 바와 같이 1:20 내지 1:327,680 범위의 4배 연속 희석으로 CHIKV-Δ5nsP3(560 pfu/ml) 중화 능력에 대해 평가하였다. (b) 확인된 점 돌연변이를 갖는 전체 CHIKV-Δ5nsP3 게놈을 포괄하는 Sanger 서열분석으로부터 유래된 CHIKV-Δ5nsP3 단일 플라크 단리물 P5B-11, P5B-03 및 P8B-05의 도시된 게놈을 나타낸다. (c) 추가 CHIKV-Δ5nsP3 단일 플라크 단리물 P5B-02, P5B-04, P5B-07 및 P8B-01의 면역원성을 (a)에서와 같이 평가하였다. (d) 확인된 점 돌연변이를 갖는 전체 CHIKV-Δ5nsP3 게놈을 포괄하는 Sanger 서열분석으로부터 유래된 CHIKV-Δ5nsP3 단일 플라크 단리물 P5B-02, P8B-01, P5B-04 및 P5B-07의 도시된 게놈을 나타낸다.
도 7: 계대 3에 의해 발생하는 E2 단백질에서의 E168K 및 E247K 이질성을 나타내는, 계대 0(P0)에서 CHIKV-Δ5nsP3 및 계대 3에서 4개의 독립적으로 생성된 CHIKV-Δ5nsP3 샘플(P3 실시예 1-4)의 Sanger 서열분석으로부터의 크로마토그램. P3에서 4개의 독립적으로 생성된 CHIKV-Δ5nsP3 샘플(P3 실시예 1-4)은 모두 동일한 MVSB(P1)로부터 유래되었다. 도시된 영역은 E2 단백질의 아미노산 168 및 247을 암호화하는 게놈 영역을 포괄하고, 나타낸 바와 같이 프라이머 쌍 16 및 17로 서열분석하였다. (프라이머 서열에 대해, 표 1 참조). 비교를 위해, 계대 0(P0)에서 CHIKV-Δ5nsP3의 서열분석 크로마토그램이 도시되어 있다. 서열 이질성 부위는 상자로 표시된다.
도 8: 마스터 바이러스 시드 뱅크(P1) 및 2개의 독립적으로 생성된 계대 3(P3) CHIKV-Δ5nsP3 제제의 차세대 서열분석(NGS): (a) P1-MVSB; (b) P3-실시예 3; (c) P3-실시예 4. 게놈 이질성의 배경 수준은 점선으로 나타낸 바와 같이 15%로 설정된다. 계대 3에 의해 발생하는 보다 빈번한 이질성은 (b) 및 (c)에 나타낸 바와 같이 E2 단백질에서 각각 E168K 및 E247K 돌연변이에 상응하는 게놈 핵산 위치 8882 및 9119에서 점 돌연변이를 포함하였다.
도 9: 균주 Senegal 37997의 CHIKV VLP의 cryo-EM 구조에서 동등한 위치에 표시된 E2 당단백질 내에서 빈번하게 관찰된 이질성을 갖는 아미노산 위치(G55R, G82R, E168K 및 E247K)의 자리(PDB 3J2W; Sun S, et al., Structural analyses at pseudo atomic resolution of Chikungunya virus and antibodies show mechanisms of neutralization (2013) eLife 2:e00435. DOI: 10.7554/eLife.00435). G55R은 사각형으로 나타내고, G82R은 원으로 나타내고, E168K는 삼각형으로 나타내고, E247K는 별표로 나타낸다. 도면은 단위-세포의 CHIKV 단백질을 도시하는데, 괄호로 나타낸 막전위 부분(TM), 및 막의 내부(아래) 면에서 캡시드 단백질(C)을 갖는 E1/E2 이량체의 4개 카피로 구성된 바이러스 막에 어셈블리될 수 있다. 3개의 E1/E2/캡시드-어셈블리는 5-배 축 근처에서 삼량체 q3-스파이크를 구성하고, 4번째 어셈블리는 3-배 축에서 i3-스파이크의 3개 요소 중 하나이며, 모두 표면에서 제시되고 3개의 상이한 각도에서 보여졌다: (a) CHIKV 단위-세포 측면도; 막 평면 위의 시점. (b) CHIKV 단위-세포 측면도; 막 평면 아래의 시점. (c) CHIKV 단위-세포, 상면도.
도 10: E168K 점 돌연변이의 존재가 CHIKV-Δ5nsP3 면역원성의 손실을 초래하는 역치를 결정하기 위한 대략 3 x 104 TCID50의 용량으로 상이한 P3:P5B-07(E168K) 비의 바이러스 제제로 C57Bl/6 마우스의 피하 면역화를 위한 그룹. 그룹 1, 3 및 5에 대해 P3 및 P5B-07(E168K 돌연변이체)의 제형 비는 3x104 TCID50의 나타낸 용량으로 각각 1:0.1, 1:1 및 1:10이었다. 따라서, 그룹 6 및 그룹 7은 각각 P3 단독 및 P5B-07(E168K) 단독을 나타낸다. 이질성 위치(뉴클레오티드 8882에 상응)에서 참조 서열(야생형)은 G였고, 1:0.1, 1:1 또는 1:10의 비에 따라, 뉴클레오티드 A를 향한 이동, 즉, G>A 내지 G=A 또는 G<A는 서열분석 크로마토그램에 따른 것이었다. P3 바이러스 집단은 ~ 20% E168K 돌연변이체를 나타냈다. P5B-07(E168K) 바이러스 집단은 이질성을 나타내지 않았다(즉, ~100%가 E2 단백질 E168K 돌연변이에 함유됨).
도 11: VRP-기반 중화 검정에 의해 평가된 상이한 P3 대 E168K-돌연변이체 CHIKV-Δ5nsP3 비의 면역원성에 대한 효과. 도 10에 요약된 바와 같이 1:0.1, 1:1 및 1:10 비에서 CHIKV-Δ5nsP3 P3:E168K의 3x104 TCID50의 의도된 용량으로 C57Bl/6 마우스를 피하 면역시켜 단일 마우스 혈청을 생성하였다. 제21일 단일 혈청을 BHK-21 세포-기반 루시퍼라제 검정을 사용하여 LR-CHIKV 바이러스 레플리콘 입자(VRP)의 중화에 대해 분석하였다. VRP는 LR2006-OPY1 야생형 바이러스의 캡시드 및 외피 단백질을 나타내는 복제-결핍 야생형 CHIKV와 유사하다. 간단히 말해서, 2x104개 BHK-21 세포를 96-웰 플레이트에 시딩하고 35℃/ 5% CO2에서 밤새도록 배양하였다. CHIKV-Δ5nsP3 VRP를 35℃에서 1 시간 동안 마우스 혈청의 연속 희석액(1:20 내지 1:312,500에서 출발)과 함께 배양하였다. CHIKV VRP/혈청 혼합물을 5의 MOI에서 BHK-21 세포에 첨가하고 35℃/5% CO2에서 1 시간 동안 배양하였다. 세포를 세척하고 신선한 배지를 첨가하였다. 루시퍼라제 활성을 레닐라 루시퍼라제 검정 시스템(Promega)을 사용하여 감염후 24 시간에 상청액에서 측정하였다. P-MVSB 양성 대조군(○), P5B-07(E168K) 음성 대조군(□) 및 각각의 P3:E168K 비로 면역화된 개별 마우스 혈청(채워진 원). (a) 1:0.1의 비에서 CHIKV-Δ5nsP3 P3:E168K의 면역원성(그룹 1). (b) 1:1의 비에서 CHIKV-Δ5nsP3 P3:E168K의 면역원성(그룹 3). (c) 1:10의 비에서 CHIKV-Δ5nsP3 P3:E168K의 면역원성(그룹 5). (d) A, B, 및 C에 도시된 면역원성 결과의 요약: P3과 비교하여 강한 면역원성(++ 양성), 낮은 면역원성(+낮은 양성) 및 음성(-).
도 12: 850 cm2 롤러 병에서 해동에서 CHIKV-Δ5nsP3으로 감염까지 Vero 세포 배양 흐름. P: 계대, M: 백만, T75: T-플라스크 75 cm2, T175: T-플라스크 175 cm2, RB850: 롤러 병 CellBIND 850cm2.
도 13: Vero 세포에서 CHIKV-Δ5nsP3의 생산 동안 세포 성장 온도, 감염 다중도 및 시딩후 감염 시간의 바이러스 역가에 대한 효과. Vero 세포를 35℃에서 MEM, 2 mM 글루타민 및 10% FBS 중에서 확장시키고, 세포 감염을 위해 850 cm2 롤러 병에 시딩하였다. 바이러스 생산을 위해, 상이한 온도(37℃, 35℃, 28℃), MOI(0.1; 0.01; 0.001 TCID50/세포) 및 Vero 세포 시딩후 세포 감염 시간(일; D2, D4, D5)을 FBS가 없는 배양 배지에서 시험하였다. 리드 앤드 뮌헨(Reed & Muench) 방법에 따라 Vero 세포에서 측정된 바이러스 생산성이 도시되어 있으며, TCID50/mL로 표현된다. (a) 37℃; (b) 35℃; (c) 28℃.
도 14: 도 13에 기재된 각각의 조건으로부터 총 CHIKV-Δ5nsP3 바이러스 생산성.
도 15: 최대 CHIKV-Δ5nsP3 바이러스 역가: 반응 표면 2차 모형. (a) 모형의 ANOVA 분석. 회색 선: 유의한 모형 항(Prob(F) < 0.05; 0.1 초과 값은 모형 항이 유의하지 않음을 나타낸다). (b) 모형의 등고선도.
도 16: CHIKV-Δ5nsP3 바이러스 안정성: 반응 표면 2차 모형. (a) 모형의 ANOVA 분석. 회색 선: 유의한 모형 항(Prob(F) < 0.05; 0.1 초과 값은 모형 항이 유의하지 않음을 나타낸다). (b) 모형의 등고선도.
도 17: 각각 E2 아미노산 168, 247 및 423에 상응하는 게놈 핵산 위치 8882, 9112 및 9649에서 CHIKV-Δ5nsP3 E2 바이러스 단백질의 이질성: 제2일 CHIKV-Δ5nsP3 샘플 수확물로부터의 모형 분석. (a) 모형의 ANOVA 분석. 회색 선: 유의한 모형 항(Prob(F) < 0.05). (b) 모형의 등고선도.
도 18: 각각 E2 아미노산 168, 247 및 423에 상응하는 게놈 핵산 위치 8882, 9112 및 9649에서 CHIKV-Δ5nsP3 E2 바이러스 단백질의 이질성: 제2일 및 제5일 CHIKV-Δ5nsP3 샘플 수확물(28℃)의 모형 분석. (a) 모형의 ANOVA 분석. 회색 선: 유의한 모형 항(Prob(F) < 0.05). (b) 모형의 등고선도.
CHIKV-Δ5nsP3 약독화 바이러스 백신 후보의 산업화 과정 동안, Vero 세포에서 바이러스의 계대는 계대가 증가함에 따라 더 높은 바이러스 역가를 초래하는 것으로 관찰되었지만; CHIKV-Δ5nsP3 바이러스 게놈의 서열 이질성에서의 동반 증가가 또한 관찰되었다. Vero 세포에서 계대 동안 발생하는 특정 점 돌연변이는 배치마다 재현가능한 것으로 밝혀졌고 새로운 세포 기질의 초기 계대에서 이미 나타났다. 놀랍게도 이들 돌연변이 중 일부가 CHIKV-Δ5nsP3 바이러스에 의해 부여된 중화 면역원성에서 상당한 손실 또는 감소와 상관관계가 있는 것으로 관찰되었다. 다른 재현가능한 돌연변이는 면역원성을 감소시키지 않았고/않았거나 면역원성-감소 돌연변이에 대해 "구제" 돌연변이로 작용하였다. CHIKV-Δ5nsP3에서 낮은 감염 다중도("MOI")와 증가된 서열 이질성의 생성 사이의 상관관계가 확인되었지만; 수년에 걸친 제조 과정에서 바이러스의 단일 공급원을 가질 필요가 있기 때문에, 높은 MOI는 일반적으로 산업 용도로 실현가능하지 않다. 따라서 재현가능하고 신뢰할 수 있는 제조 과정에 충분한 생산 수율을 갖는 면역원성 CHIKV-Δ5nsP3 입자의 생성을 허용하는 배양 조건이 발견될 수 있는지 여부는 처음부터 명확하지 않았다(본 발명의 문제).
본원에서 관찰된 면역원성-감소 돌연변이를 제어하고 최소화하면서 여전히 높은 생산 수율을 가능하게 하는 방법이 본원에 제공된다. 또한 유효량의 면역원성 치쿤구니야 바이러스와 잔류량의 치쿤구니야 바이러스의 비-면역원성 변이체를 포함하는 약제학적 조성물이 본원에 제공된다. 바람직한 구현예에서, 약제학적 조성물은 0.1 미만, 예를 들어 0.01 또는 0.001의 MOI와 같은 낮은 MOI를 사용하여 생산되지만, 본원에 기재된 바와 같은 치쿤구니야 바이러스의 비-면역원성 변이체(들)의 양을 최소화하기 위해 이러한 제어된 조건(예를 들어, 구제 후 감소된 계대 수, 최적화된 온도 및 숙주 세포 밀집도(confluency)) 하에 생산된다. 일부 구현예에서, 바이러스 입자는 생 바이러스, 키메라 바이러스, 약독화 생 바이러스, 변형된 생 바이러스, 또는 재조합 생 바이러스이다. 일 구현예에서, 본 발명의 바이러스 입자는 임의적으로 불활성화될 수 있다. 일부 구현예에서, 바이러스 입자는 바이러스 입자의 약독화 형태이다. 예를 들어, 바이러스는 야생형 바이러스와 비교하여, 숙주에서 감소된 감염성, 병독성, 및/또는 복제를 가질 수 있다. 일부 구현예에서, 바이러스는 돌연변이 또는 변형된 바이러스이며, 예를 들어 바이러스의 핵산은 치환 또는 결실과 같은 야생형 바이러스와 관련하여 적어도 하나의 돌연변이를 함유할 수 있다. 일부 구현예에서, 바이러스는 재조합 생 바이러스이며, 이는 재조합적으로 생성되고 상이한 공급원으로부터의 핵산 서열을 함유할 수 있는 바이러스를 의미한다. 일부 양태에서, 야생형 치쿤구니야 바이러스는 불활성화된다. 바람직한 구현예에서, 바이러스는 포름알데히드로 불활성화된다.
일 구현예에서, 면역원성 치쿤구니야 바이러스는 생 약독화 바이러스이다. 바람직한 구현예에서, 생 약독화 치쿤구니야 바이러스는 본원에서 CHIKV-Δ5nsP3으로 지칭되고 서열식별번호(SEQ ID NO): 1의 핵산 서열에 의해 정의된 Hallengrd D 등(상기 문헌)에 의해 기재된 바와 같은 보호 CHIKV-Δ5nsP3가다. 간단히 말해서, 야생형 CHIKV 게놈은 각각 비구조 단백질(nsP1 내지 nsP4) 및 구조 단백질(C, E3, E2, 6K, 및 E1)을 암호화하는 2개의 오픈 리딩 프레임을 함유하는 11 kb의 양의 방향 단일 가닥 RNA 게놈을 보유한다. La Reunion CHIKV 균주 LR2006-OPY1을 기반으로 하는 약독화 CHIK 바이러스, CHIKV-Δ5nsP3은 P1234 다단백질의 아미노산 잔기 1656 내지 1717을 nsP3 단백질의 초가변 영역 내 작은 링커(AA 서열 AYRAAAG)로 치환함으로써 구축되었다(도 2 참조). CHIKV-Δ5nsP3은 야생형 CHIKV로의 공격에 대해 전염성, 고도로 면역원성 및 보호성인 것으로 제시된 바 있다(Hallengrd D, et al., 상기 문헌 및 Hallengrd D, et al., Prime-Boost Immunization Strategies against Chikungunya Virus(2014) J. Virology, 88(22):13333-13343, 및 Roques P, et al. 2017, 상기 문헌). 일 구현예에서, 생 약독화 치쿤구니야 바이러스는 CHIKV-Δ5nsP3 약독화 돌연변이체 바이러스의 변이체일 수 있다. 바람직한 구현예에서, 본원에 제공된 바와 같은 생 약독화 치쿤구니야 바이러스는 서열번호: 1에 의해 정의된 핵산 서열에 의해 암호화된 CHIKV-Δ5nsP3을 포함한다. 본원에 사용된 바와 같이, 용어 "CHIKV-Δ5nsP3"은 "CHIKV-Δ5nsP3 바이러스", "CHIKV-Δ5nsP3 입자", "CHIKV-Δ5nsP3 바이러스 입자" 또는 그의 복수 버전으로 상호교환가능하게 사용된다.
유효량의 CHIKV-Δ5nsP3을 포함하는 약제학적 조성물이 본원에 제공된다. 일 양태에서, 유효량의 면역원성 CHIKV-Δ5nsP3 바이러스는 치쿤구니야 바이러스에 대한 중화 항체를 도출하는데 충분한 양으로 정의된다. 추가 양태에서, 유효량의 면역원성 CHIKV-Δ5nsP3 바이러스는 백신 접종된 대상체에서 치쿤구니야 바이러스 감염에 대한 보호 면역력을 부여하는 면역 반응을 도출하는 양으로 정의된다. 바람직한 양태에서, 유효량의 CHIKV-Δ5nsP3은 적어도 102, 적어도 103, 적어도 104, 적어도 105, 적어도 106, 바람직하게는 적어도 103개 면역원성 CHIKV-Δ5nsP3 입자로 정의된다. 일 양태에서, 면역원성 CHIKV-Δ5nsP3 입자는 서열 번호: 2의 폴리펩티드 서열에 의해 정의된 바와 같은 E2 구조 단백질을 발현시키는 CHIKV-Δ5nsP3 입자로 정의된다. 일 양태에서, E2 구조 단백질은 바이러스의 면역원성에 영향을 미치지 않는, 즉, 면역원성을 감소시키지 않는 1개 이상의 점 돌연변이를 함유한다. 일 구현예에서, 바이러스의 면역원성에 영향을 미치지 않는 점 돌연변이는 E2 단백질의 아미노산 232 및/또는 247, 예컨대 H232Y 및/또는 E247K일 수 있다. 일 구현예에서, CHIKV-Δ5nsP3의 E2 구조 단백질은 약 10개 이하의 점 돌연변이를 함유한다. 일 구현예에서, CHIKV-Δ5nsP3의 E2 구조 단백질은 9, 8, 7, 6, 5 또는 4개 이하의 점 돌연변이를 함유한다. 바람직한 구현예에서, CHIKV-Δ5nsP3의 E2 구조 단백질은 3개 이하의 점 돌연변이, 가장 바람직하게는 단지 1 또는 2개의 점 돌연변이를 함유한다.
본원에 정의된 바와 같이, 면역원성 CHIKV-Δ5nsP3은 예를 들어 약 3x104 TCID50의 용량으로 전달될 때 생체내 효과적인 면역 반응, 즉, 치쿤구니야 바이러스 질병의 징후 또는 증상을 감소 또는 예방하는데 충분한 중화 항체가 생산되는 면역 반응을 자극할 수 있는 CHIKV-Δ5nsP3가다. 바람직한 구현예에서, 본원에 정의된 면역원성 CHIKV-Δ5nsP3은 서열 번호: 2에 의해 제공된 아미노산 서열에 따라 E2 구조 단백질을 발현시키는 CHIKV-Δ5nsP3가다. 추가 바람직한 구현예에서, 본원에 정의된 면역원성 CHIKV-Δ5nsP3은 서열 번호: 1에 따른 폴리뉴클레오티드 서열에 의해 정의된다. 대안적 또는 추가적 정의로서, 본 발명의 면역원성 CHIKV-Δ5nsP3은 면역화된 대상체에서 중화 능력을 갖는 항체의 생산, 즉, 치쿤구니야 바이러스의 중화를 시험관내 검정에서 1:80 이상의 혈청 희석으로 적어도 50%, 바람직하게는 적어도 60%, 바람직하게는 적어도 70%, 보다 바람직하게는 적어도 80%, 보다 더 바람직하게는 적어도 90%, 가장 바람직하게는 적어도 95% 자극한다.
본원에 정의된 바와 같이, 비-면역원성 CHIKV-Δ5nsP3은 백신 접종된 대상체에서 치쿤구니야 바이러스 질병의 징후 또는 증상을 예방하는데 부적절한 중화 항체의 수준을 도출하는 CHIKV-Δ5nsP3가다. 바람직한 구현예에서, 비-면역원성 CHIKV-Δ5nsP3은 적어도 1개의 아미노산 치환, 특히 E2 구조 단백질에서 아미노산 치환, 특히 E168K 및/또는 G55R 치환, 특히 E168K 치환을 갖는 E2 구조 단백질을 발현시키는 CHIKV-Δ5nsP3가다. 비-면역원성 CHIKV-Δ5nsP3은 면역화된 대상체에서 시험관내 검정에서 세포의 치쿤구니야 바이러스(야생형 또는 약독화)로의 감염을 중화시키는 불량한 능력을 보이는 항체를 도출하는 것으로 추가로 정의된다. 특히, 비-면역원성 CHIKV-Δ5nsP3은 치쿤구니야 바이러스의 중화를 시험관내 중화 검정에서 1:80 이상의 혈청 희석으로 60% 미만, 50% 미만, 40% 미만, 30% 미만, 20% 미만, 특히 10% 미만으로 제공하는 중화 항체의 수준을 도출하는 것으로 정의된다.
추가 양태에서, 유효량의 CHIKV-Δ5nsP3은 야생형 치쿤구니야 바이러스에 대한 중화 항체를 도출하는데 충분한 양으로 정의된다. 일 양태에서, 약제학적 조성물은 2회성(two-shot) 약제학적 조성물이다. 바람직한 양태에서, 약제학적 조성물은 1회성 약제학적 조성물이다. 바람직한 양태에서, 약제학적 조성물은 점 돌연변이, 특히 면역원성-감소 점 돌연변이가 있거나 없이 입자의 전체 풀에 포함된 적어도 102, 적어도 103, 적어도 104, 적어도 105, 적어도 106, 바람직하게는 103 내지 105개의 총 CHIKV-Δ5nsP3 바이러스 입자, 특히 약 103 또는 104개의 CHIKV-Δ5nsP3을 포함한다. 바람직한 양태에서, 약제학적 조성물은 본원에 정의된 바와 같은 검출가능한 양의 비-면역원성 CHIKV-Δ5nsP3; 바람직하게는 서열 번호: 2에 의해 정의된 바와 같은 야생형 E2 단백질과 비교하여 적어도 1개의 점 돌연변이를 갖는 비-면역원성 CHIKV-Δ5nsP3을 포함한다.
바람직한 구현예에서, 약제학적 조성물은 CHIKV-Δ5nsP3을 포함하고, 예를 들어 Hallengrd D, et al. 2014, 상기 문헌에 기재된 마우스 연구에서 사용된 바와 같은 BHK-21 세포에서 생산된 CHIKV-Δ5nsP3을 포함하지만, 백신 접종된 대상체에서 보호 면역력을 생산하는데 충분한 CHIKV-Δ5nsP3의 면역원성 입자를 여전히 포함하는 백신 조성물과 비교하여, 증가된 양의 CHIKV-Δ5nsP3의 비-면역원성 변이체(들)를 포함한다. 예를 들어, 약제학적 조성물은 (i) 백신 접종된 대상체에서 보호 면역력을 생산하는데 충분한 양의 서열 번호: 2의 폴리펩티드 서열에 의해 정의된 바와 같은 E2 구조 단백질을 발현시키는 CHIKV-Δ5nsP3; (ii) 예를 들어 Hallengrd D, et al. 2014, 상기 문헌에 기재된 마우스 연구에 사용된 바와 같은 BHK-21에서 생산된 CHIKV-Δ5nsP3을 포함하는 백신 조성물과 비교하여, 상기 E2 구조 단백질에서 적어도 1개의 돌연변이를 갖는 증가된 양의 CHIKV-Δ5nsP3; 및 (iii) 임의적으로 약제학적으로 허용가능한 부형제를 포함할 수 있다.
Vero 세포에서 5회 이상 연속 계대에 의한 CHIKV-Δ5nsP3의 생산은 특히 E2 구조 단백질에서 높은 수준의 서열 이질성을 초래하는 것으로 본원에서 입증된다(예를 들어 하기 실시예 2 참조). 예를 들어, E2 단백질의 E168K 및/또는 G55R 돌연변이는 종종 계대 5에 의해 나타났고(예를 들어 하기 표 3 참조), 둘 다 면역원성의 하락과 상관관계가 있다. 따라서, Hallengrd D, et al. 2014, 상기 문헌에 기재된 바와 같이 Vero 세포에서 5회 이상의 계대를 사용한 CHIKV-Δ5nsP3의 생산은 백신 조성물에서 높은 수준의 CHIKV-Δ5nsP3의 비-면역원성 돌연변이체(예컨대 E168K[E2])를 바람직하지 않게 초래할 수 있다. 대조적으로, 5회 미만의 계대 후 E2 구조 단백질의 서열 이질성은 훨씬 더 낮은 것으로 입증된다(예를 들어 실시예 3 참조 - 3회 계대 후 E168K 돌연변이가 존재하지만, 그의 빈도는 단지 18%였음).
따라서, 일 양태에서 약제학적 조성물은 (i) CHIKV-Δ5nsP3; 및 (ii) 임의적으로 약제학적으로 허용가능한 부형제를 포함하며; 여기서 상기 조성물에 존재하는 CHIKV-Δ5nsP3 입자의 적어도 30%는 서열 번호: 2의 폴리펩티드 서열에 의해 정의된 바와 같은 E2 구조 단백질을 발현시킨다. 이 구현예에서, CHIKV-Δ5nsP3 입자의 적어도 30%는 E2 구조 단백질에 대하여 비-돌연변이체이며, 즉 서열 번호: 2의 E2 구조 단백질을 발현시킨다. 다시 말해서, 서열 이질성의 빈도(즉, 서열 번호: 2의 E2 구조 단백질에서 적어도 1개의 돌연변이를 발현시키는 돌연변이체 CHIKV-Δ5nsP3 입자)는 70% 이하이다. 달리 명시되지 않는 한, 일반적으로 "CHIKV-Δ5nsP3" 또는 "CHIKV-Δ5nsP3 입자"를 언급할 때, CHIKV-Δ5nsP3의 비-돌연변이체 및 돌연변이체 형태, 즉 서열 번호: 2의 E2 구조 단백질을 발현시키는 CHIKV-Δ5nsP3 및 서열 번호: 2에서 1개 이상의 돌연변이를 갖는 E2 구조 단백질을 발현시키는 CHIKV-Δ5nsP3 둘 다를 포함하는 것으로 의도된다. 일 구현예에서, CHIKV-Δ5nsP3의 E2 구조 단백질은 약 10개 이하의 점 돌연변이를 함유한다. 일 구현예에서, CHIKV-Δ5nsP3의 E2 구조 단백질은 9, 8, 7, 6, 5 또는 4개 이하의 점 돌연변이를 함유한다. 바람직한 구현예에서, CHIKV-Δ5nsP3의 E2 구조 단백질은 3개 이하의 점 돌연변이, 가장 바람직하게는 단지 1 또는 2개의 점 돌연변이를 함유한다.
바람직한 구현예에서, 상기 조성물에 존재하는 CHIKV-Δ5nsP3 입자의 적어도 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99%는 비-돌연변이체이며, 즉, 서열 번호: 2의 폴리펩티드 서열에 의해 정의된 바와 같은 E2 구조 단백질을 발현시킨다.
일 양태에서, 약제학적 조성물은 (i) CHIKV-Δ5nsP3; 및 (ii) 임의적으로 약제학적으로 허용가능한 부형제를 포함하며; 여기서 상기 조성물에 존재하는 CHIKV-Δ5nsP3 입자의 70% 미만은 서열 번호: 2의 폴리펩티드 서열에 대하여 1개 이상의 돌연변이를 갖는 E2 구조 단백질을 발현시킨다.
일 양태에서, 약제학적 조성물은 (i) CHIKV-Δ5nsP3; 및 (ii) 임의적으로 약제학적으로 허용가능한 부형제를 포함하며; 여기서 상기 조성물에 존재하는 CHIKV-Δ5nsP3 입자의 70% 미만은 서열 번호: 2의 폴리펩티드 서열에서 돌연변이 E168K를 갖는 E2 구조 단백질을 발현시킨다.
바람직한 구현예에서, E2 구조 단백질에서의 돌연변이(예를 들어 돌연변이 E168K)는 70% 이하의 빈도로 존재하며, 예를 들어 총 CHIKV-Δ5nsP3 입자의 70% 미만은 1개 이상의 돌연변이(또는 돌연변이 E168K)를 포함하고 총 CHIKV-Δ5nsP3 입자의 30% 이상은 비-돌연변이된 E2 구조 단백질, 또는 돌연변이 E168K를 포함하지 않는 E2 구조 단백질을 발현시킨다.
바람직한 구현예에서, 상기 조성물에 존재하는 CHIKV-Δ5nsP3 입자의 65%, 60%, 55%, 50%, 45%, 40%, 35%, 30%, 25%, 20%, 15%, 10%, 5%, 4%, 3%, 2% 또는 1% 미만은 서열 번호: 2의 폴리펩티드 서열에 대하여 1개 이상의 돌연변이(예컨대, 예를 들어, E168K)를 갖는 E2 구조 단백질을 발현시킨다. 예를 들어, 조성물은 조성물에 존재하는 CHIKV-Δ5nsP3 입자(돌연변이체 및 비-돌연변이체)의 총 수와 비교하여, 돌연변이체 입자(즉, 서열 번호: 2의 폴리펩티드 서열에 대하여 1개 이상의 돌연변이(예컨대, 예를 들어, E168K)를 갖는 E2 구조 단백질을 발현시키는 CHIKV-Δ5nsP3 입자)의 1-70%, 1-50%, 1-30%, 1-20%, 5-70%, 5-50%, 5-30%, 5-20%, 10-70%, 10-50%, 10-30% 또는 10-20%를 포함할 수 있다. 일 구현예에서, E168K 돌연변이를 갖는 E2 구조 단백질을 발현시키는 CHIKV-Δ5nsP3 입자는 E168K 돌연변이에 의해 부여된 면역원성의 손실을 완화시키는 돌연변이를 추가로 포함한다. 일 구현예에서, 돌연변이는 nsP1 단백질, 특히 잔기 A38에 있다. 바람직한 구현예에서, E168K 돌연변이를 갖는 E2 구조 단백질을 발현시키는 CHIKV-Δ5nsP3 입자는 또한 A38S 돌연변이가 있는 nsP1을 발현시킨다.
또한, 1) 세포주에서 CHIKV-Δ5nsP3 바이러스를 성장시키는 단계, 및 2) CHIKV-Δ5nsP3 바이러스의 면역원성-감소 돌연변이의 존재를 최소화하는 단계를 포함하는, 본 발명의 약제학적 조성물을 생산하는 방법이 본원에 제공된다. 일 구현예에서, 면역원성 CHIKV-Δ5nsP3 바이러스는 EB66 세포주, Vero 세포주, Vero-αHis 세포주, HeLa 세포주, HeLa-S3 세포주, 293 세포주, PC12 세포주, CHO 세포주, 3T3 세포주, PerC6 세포주, MDSK 세포주, 닭 배아 섬유아 세포주, 오리 세포주 및 이배체 조류 세포주로 이루어진 군으로부터 선택된 세포주에서 번식된다. 일부 구현예에서, 상기 세포주는 오리 세포주이다. 일부 구현예에서, 상기 세포주는 이배체 조류 세포주이다. 일부 구현예에서, 상기 세포주는 EB66 세포주이다. 바람직한 구현예에서, 상기 세포주는 Vero 세포주이다.
일 구현예에서, 면역원성-감소 돌연변이의 존재는 CHIKV-Δ5nsP3을 5회 미만, 바람직하게는 4회 미만, 바람직하게는 3회 미만, 바람직하게는 2회 미만, 보다 바람직하게는 단지 1회, 가장 바람직하게는 최대 3회 계대시킴으로써 최소화된다. 본원에 사용된 바와 같이, 계대 수는 바이러스 구제(P0) 후 시험관내 계대의 수를 지칭한다. 바람직한 구현예에서, 바이러스는 Vero 세포에서 계대된다. 일 양태에서, 바이러스는 최적의 온도에서 성장된다. 바람직한 구현예에서, 상기 최적의 온도는 약 28℃ 내지 37℃, 바람직하게는 약 35℃이다.
일 구현예에서, 숙주 세포 배양물은 최적의 MOI에서 CHIKV-Δ5nsP3으로 감염된다. 일 양태에서, 최적의 MOI는 과도한 양의 제조용 바이러스 시드 뱅크 배양물을 필요로 하지 않을 정도로 충분히 낮지만, 본원에 기재된 바와 같은 면역원성-감소 돌연변이를 최소화하는데 충분히 높은 MOI로 정의된다. 바람직한 양태에서, 최적화된 MOI는 0.1 미만의 MOI, 바람직하게는 약 0.1 내지 0.001의 MOI, 보다 바람직하게는 약 0.09 내지 0.0011의 MOI, 보다 더 바람직하게는 약 0.05 내지 0.005의 MOI, 가장 바람직하게는 약 0.01의 MOI이다. 일 양태에서, 숙주 세포 밀집도는 감염 전에 평가된다. 일 양태에서, 숙주 세포 밀집도는 약 20 내지 90%, 바람직하게는 약 30 내지 75%, 보다 바람직하게는 약 40 내지 60%, 특히 약 50 내지 60%이다. 일 양태에서, 세포 배양물은 숙주 세포 시딩후 최적의 시점; 즉, 숙주 세포 시딩 후 제2일 내지 제5일, 바람직하게는 숙주 세포 시딩 후 약 제4일에 감염된다. 일 양태에서, 바이러스 입자는 숙주 세포 감염 후 제1일 내지 제6일, 바람직하게는 제1일 내지 제4일, 바람직하게는 숙주 세포 감염 후 제1일 또는 제2일, 바람직하게는 숙주 세포 감염 후 제1일 및 제2일 둘 다에 수확된다.
일 양태에서, 면역원성-감소 돌연변이는 서열 번호: 1의 폴리뉴클레오티드 서열에 의해 정의된 바와 같은 CHIKV-Δ5nsP3의 게놈의 임의의 위치에서 점 돌연변이이다. 일 구현예에서, 면역원성-감소 돌연변이는 E2 단백질 이외의 위치에서 게놈에 존재한다. 바람직한 구현예에서, 면역원성-감소 돌연변이는 E2 단백질에서, 바람직하게는 아미노산 잔기 55 및/또는 168, 예를 들어, G55R 및/또는 E168K 돌연변이, 특히 E168K에 위치한다. 일부 구현예에서, 본원에 기재된 바와 같은 면역원성-감소 돌연변이는 게놈에서 다른 돌연변이에 의해 완화 또는 "구제된다". 일 구현예에서, E168K의 완화 돌연변이는 비구조 단백질 1(nsP1)의 A38S 돌연변이이다.
일 양태에서, CHIKV-Δ5nsP3의 E2 단백질의 E168K 돌연변이의 빈도는 수확된 CHIKV-Δ5nsP3의 전체 풀에서 90% 미만, 80% 미만, 70% 미만, 60% 미만, 50% 미만, 40% 미만, 30% 미만, 20% 미만, 10% 미만, 바람직하게는 50% 미만이다.
일 양태에서, 본 발명은 본원에 제공된 방법에 의해 수득가능한 면역원성 CHIKV-Δ5nsP3을 제공한다. 또 다른 양태에서, 본 발명은 본원에 기재된 방법에 의해 수득가능한 면역원성 CHIKV-Δ5nsP3을 포함하는 약제학적 조성물을 제공한다.
본 발명의 양태는 치쿤구니야 바이러스 감염에 대한 면역화를 위한 조성물을 제조하기 위해 본원에 기재된 방법의 용도를 제공한다. 바람직한 구현예에서, 조성물은 백신이다. 일 구현예에서, 백신은 대상체에게 1회, 2회 또는 3회 이상 투여된다. 일 양태에서, 면역화된 대상체로부터 단리된 CHIKV-Δ5nsP3 바이러스 입자는, 특히 E2 구조 단백질에서 점 돌연변이에 관한 투여된 백신 조성물과 유사한 점 돌연변이 프로파일을 갖는다. 일 구현예에서, 백신은 1회 또는 2회 투여된다. 바람직한 구현예에서, 백신은 단지 1회 투여되며; 예를 들어, 1회성 백신이다. 일 양태에서, 부스터 백신 접종은 임의적으로 투여된다. 특정 바람직한 양태에서, 약제학적 조성물은 동결건조된 형태로 제공된다.
다른 양태는 치쿤구니야 바이러스 감염을 치료 및/또는 예방하기 위해 본원에 기재된 방법에 의해 수득가능한 바이러스 입자를 포함하는 조성물을 제공한다. 일 양태에서, 조성물은 대상체에서 면역 반응을 자극하는 방법 및/또는 치쿤구니야 바이러스 감염을 치료 또는 예방하는 방법에서 사용하기 위한 것이다. 본원에 사용된 바와 같이, 용어 "예방하는"은 또한 "로부터 보호하는"을 의미한다. 치쿤구니야 바이러스 감염은 일 양태에서 치쿤구니야 바이러스의 서 아프리카, 동/중앙/남 아프리카(ECSA) 및/또는 아시아 유전자형에 의해 야기될 수 있다.
본원에 기재된 임의의 방법을 사용하여 생산된 바이러스 제제는 또한 추가의 여과 단계 및/또는 동결건조를 포함한 추가의 처리 단계에 적용될 수 있다. 바이러스 제제는 제제의 순도에 대한 분석에 적용될 수 있다. 예를 들어, 바이러스 제제는 예를 들어, 숙주 세포 게놈 DNA, 및/또는 숙주 세포 단백질과 같은 불순물 및 오염물의 존재에 대해 평가될 수 있다. 바이러스 제제의 순도는 크기 배제 크로마토그래피(SEC), 상이한 파장에서의 광학 밀도, 단백질 겔 전기영동(예를 들어, SDS-PAGE), 웨스턴 블롯팅, ELISA, PCR, 및/또는 qPCR과 같은 당업계에 알려진 임의의 방법을 사용하여 평가될 수 있다.
일부 구현예에서, 바이러스 제제는 잔류 불순물 또는 오염물에 대해 평가된다. 일부 구현예에서, 잔류 불순물 또는 오염물의 양은 정제 방법의 초기 단계에서, 예컨대, 예를 들어, 바이러스 수확 직후의 불순물 또는 오염물의 양과 비교된다. 일부 구현예에서, 최종 바이러스 제제에서 불순물의 상대 감소는 정제 방법의 초기 단계에서 불순물의 존재에 비해 60-95%이다. 일부 구현예에서, 최종 바이러스 제제에서 불순물의 상대 감소는 대략 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 또는 95%이다. 일부 구현예에서, 최종 바이러스 제제는 5% 미만의 불순물 또는 오염물을 함유한다. 일부 구현예에서, 최종 바이러스 제제는 5, 4, 3, 2, 1, 0.9, 0.8, 0.7, 0.6, 0.5, 0.4, 0.3, 0.2 미만, 또는 0.1% 미만의 불순물을 함유한다. 바람직한 구현예에서, 최종 바이러스 제제는 1% 미만의 불순물을 함유한다.
본원에 기재된 임의의 방법은 대상체에게 투여하기 위해 정제된 바이러스를 포함하는 조성물의 제조에 사용될 수 있다. 일부 구현예에서, 대상체는 포유류 대상체, 예컨대 인간, 또는 가축, 애완 동물 또는 반려 동물을 포함한 비-인간 동물이다. 일부 구현예에서, 조성물은 바이러스 또는 바이러스 제제의 것과 유사한 바이러스에 대한 면역화를 필요로 하는 대상체에게 투여된다. 일부 구현예에서, 본원에 기재된 방법을 사용하여 정제된 바이러스를 포함하는 바이러스 제제 또는 조성물은 바이러스 또는 바이러스 제제의 것과 유사한 바이러스로의 감염을 치료 또는 예방하기 위한 것이다. 바람직한 구현예에서, 본원에 기재된 방법을 사용하여 정제된 바이러스를 포함하는 바이러스 제제 또는 조성물은 치쿤구니야 바이러스 감염, 특히 치쿤구니야 바이러스의 서 아프리카, 동/중앙/남 아프리카(ECSA) 및/또는 아시아 유전자형에 의해 야기된 치쿤구니야 바이러스 감염을 치료 또는 예방하기 위한 것이다.
본원에 기재된 방법을 사용하여 정제된 CHIKV-Δ5nsP3 약제학적 조성물 또는 CHIKV-Δ5nsP3 바이러스는 당업계에 알려진 임의의 경로에 의해 대상체에게 투여될 수 있다. 일부 구현예에서, 제제 또는 조성물은 통상적인 경로를 통해, 예컨대 비경구 또는 경구로 투여될 수 있다. 본원에 사용된 바와 같이, "비경구" 투여는, 비제한적으로, 피하, 피내, 진피내, 정맥내, 근육내, 관절내, 복강내, 척추강내 또는 주입에 의한 투여를 포함한다.
본원에 달리 정의되지 않는 한, 본 개시내용과 관련하여 사용되는 과학적 및 기술적 용어는 당업자에 의해 통상적으로 이해되는 의미를 가질 것이다. 또한, 문맥상 달리 요구되지 않는 한, 단수형 용어는 복수형을 포함할 것이고 복수형 용어는 단수형을 포함할 것이다. 본 개시내용의 방법 및 기술은 일반적으로 당업계에 널리 알려진 통상적인 방법에 따라 수행된다. 일반적으로, 본원에 기재된 생화학, 효소학, 분자 및 세포 생물학, 미생물학, 바이러스학, 세포 또는 조직 배양, 유전학 및 단백질 및 핵산 화학과 관련하여 사용되는 명명법 및 기술은 당업계에 널리 알려져 있고 통상적으로 사용되는 것들이다. 본 개시내용의 방법 및 기술은 당업계에 널리 알려져 있고 통상적인 방법에 따라 그리고 달리 언급되지 않는 한 본 명세서 전반에 걸쳐 인용되고 논의된 다양한 일반적 및 보다 특정한 참고문헌에 기재된 바와 같이 수행된다.
표 A-1. 약어
실시예
실시예 1. CHIKV-Δ5nsP3 약물 물질(DS) 생산을 위한 초기 시험
합성된 CHIKV-Δ5nsP3 게놈의 어셈블리
CHIKV-Δ5nsP3 바이러스 게놈을 MWG Eurofins(독일)에서 5개 단편으로 합성하고 표준 클로닝 벡터인 pMA 플라스미드(암피실린 저항성이 있는 pMX 벡터)에서 완전히 어셈블리하였다. pMX 벡터 백본은 도 1에 도시되어 있다. 모든 클로닝 및 플라스미드 제조 절차는 전기-반응능 NEB10β 이. 콜라이(E. coli) 세포를 사용하여 TSE-무함유 조건 하에 수행하였다. pMA에서 CHIKV-Δ5nsP3 게놈의 전체 어셈블리를 위해 사용된 클로닝 전략은 도 3b에 요약되어 있다. 간단히 말해서, nsP1 및 nsP2의 일부를 포괄하는 pMA 플라스미드 함유 단편 1(도 3a에 도시됨)을 EcoRI/PacI 제한 절단을 통해 선형화하고 nsP2의 일부 및 nsP3을 포괄하는 단편 2를 단편 1에 용합시켰다. 동시에, 단편 3(nsP4 및 C를 포괄함) 을 ClaI/PacI 클로닝을 통해 단편 4(C 및 E2를 포괄함)에 융합시켰다. 세번째 클로닝 단계에서, 단편 3 및 4를 AgeI/XhoI를 통해 클로닝하고 단편 5를 XhoI/PacI를 통해 이미 단편 1 및 2를 함유하는 AgeI/PacI - 선형화된 pMA로 클로닝하였다. 클로닝은 서열분석에 의해 검증된 바와 같이 CHIKV-Δ5nsP3을 암호화하는 pMA_CHIKV-Δ5nsP3 벡터를 초래하였다.
Vero 세포로부터 CHIKV-Δ5nsP3 구제 ("바이러스 구제")
Vero 세포에서 조작된 pMA_CHIKV-Δ5nsP3 벡터로부터 CHIKV-Δ5nsP3 바이러스 입자를 생산하기 위해(바이러스 구제), pMA_CHIKV-Δ5nsP3 플라스미드를 NotI 제한 절단에 의해 선형화하고, Ambion의 mMessage mMachine SP6 Kit(AM130)를 사용하여 시험관내 전사에 적용하였다. RNA 무결성은 겔 전기영동을 통해 확인하였다(도시되지 않음). 동시에, 바이러스 RNA로의 전기천공을 위해 Vero 세포를 제조하였다. 간단히 말해서, Vero 세포를 TrypLESelect(Gibco)를 사용하여 세포 배양 플라스크로부터 떼어내고 PBS로 2회 세척하였다. 모든 원심분리 단계를 실온에서 300g로 수행하였다. 바이러스 RNA를 800 μl PBS 중에서 8x106개 Vero 세포와 혼합하고 Vero 세포/ RNA 혼합물을 0.4 cm 전기천공 큐벳으로 옮겼다. 850 V, 25 μF, 200 Ohm에서 2회 펄스를 수행하였다. 전기천공 후, Vero 세포를 실온에서 10 분 동안 유지하고 최종적으로 MEM/ 5% FCS/ 1% 항생제-항진균제(항-항)/ 2 mM L-글루타민 중에서 재현탁하고 T75 플라스크에서 48 시간 동안 35℃/5% CO2에서 배양하였다. 구제된 CHIKV-Δ5nsP3(계대 0; P0)을 함유하는 세포 배양 상청액을 수확하고 4℃에서 10 분 동안 3,000g로 원심분리하였다. Vero 세포에서 플라크 및 TCID50 검정에 의해 바이러스 역가를 결정하였다. 구제된 CHIKV-Δ5nsP3(P0)을 -80℃에서 보관하였다. VLA1553으로도 지칭되는, 이에 따라 수득된 CHIKV-Δ5nsP3 바이러스 백신 후보의 게놈 구조는 도 2에 도시되어 있다.
CHIKV-Δ5nsP3 서열의 검증
바이러스 게놈 서열을 검증하기 위해, 바이러스 핵산을 QIAamp MinElute Virus Spin Kit(QIAGEN #57704)를 사용하여 수확된 세포 배양 상청액으로부터 추출하고, 랜덤 헥사머를 사용하는 SuperScript III First-Strand Synthesis System(Life Technologies, Catalog# 18080-051)을 사용하여 cDNA-합성을 수행하였다. 게놈의 중첩 영역을 증폭시키는 프라이머를 사용하여 Phusion High Fidelity Polymerase로의 PCR을 수행하였고, PCR 생성물을 독일 소재 MWG Eurofins에서 Sanger 서열분석에 적용하였다. PCR 및 서열분석을 위해 사용되는 프라이머 쌍의 서열은 표 1에 제시되어 있다.
표 1. CHIKV-Δ5nsP3 게놈 서열분석을 위해 사용되는 프라이머 쌍.
Vero 세포에서 CHIKV-Δ5nsP3의 계대
CHIKV-Δ5nsP3의 구제 후, Vero 세포를 감염시키고 바이러스를 3개 복제물에서 연속적으로 계대시켰다(표 2 참조). 계대를 위해, T150 플라스크에 시딩하고 밀집도(1-3 일)로 성장시킨 Vero 세포를 1x DPBS로 2회 세척한 후 20 mL 감염 배지(혈청 무함유 EMEM)를 첨가하였다. 접종물을 나타낸 양으로 플라스크에 직접 첨가하고 세포를 24h 동안 35℃, 5% CO2에서 배양하였다. 바이러스 구제(P0)로부터 첫번째 계대에 대해 0.01의 MOI에서 Vero 세포를 감염시키면서 계대를 3개 복재물(A, B 및 C)에서 수행하였다. 20 mL 수확물을 24h p.i.에 50 mL PP 튜브로 옮기고, 세포 파편을 원심분리(3000g, 10 분)에 의해 제거하고, 상청액을 새로운 50 mL PP 튜브로 옮겼다. 49%(w/w) 수크로스 용액을 10%(w/w)의 최종 농도로 첨가하고 안정화된 수확물의 1 mL 분취액을 ≤-70℃에서 보관하였다.
후속 감염을 수크로스 무함유 수확물로 수행하였다. 이전 계대 및 병행 복제물에서 관찰된 세포변성 효과에 기초하여 대략적으로 계산된 상이한 양의 수확물을 사용하여 감염을 수행하였다. 감염을 위해 사용된 수확물의 양은 5 μL 내지 1 mL로 다양하다. 감염은 24h 후 단일 수확이 이어졌다. 계대 2-16의 생산을 위해 사용된 MOI는 TCID50 결과가 이용가능한 후 소급해서 결정되어, 실험 전반에 걸쳐 MOI의 넓은("비제어된") 범위를 초래함을 주목한다(표 2 참조). 이 과정을 Vero 세포 계대에 CHIKV-Δ5nsP3을 적응시키는 동안 다양한 파라미터의 체계적 관찰을 허용하는 3개의 병행 복제물(복제물 A, B 및 C)에서 최대 16 계대 수행하였다. 이 실험 동안, 수율(TCID50/mL), 감염량, 플라스크 당 Vero 세포의 수, Vero 세포 계대 수 및 세포변성 효과(CPE)를 기록하였다. 감염 다중도(MOI)를 측정된 TCID50에 기초하여 소급해서 결정하고 또한 기록하였다. CHIKV-Δ5nsP3 계대를 모든 3개의 복제물에서 플라크 크기에 대해 동시에 평가하였다.
표 2. 삼중으로 수행된 바이러스 구제 후 Vero 세포에서 CHIKV-Δ5nsP3의 연속 계대 . 제시된 데이터는 수확물 수율(24h; TCID50), 감염량(mL), 세포의 수/플라스크, Vero 세포 계대 수, 감염 다중도(MOI) 및 24h 감염후 관찰된 세포변성 효과(CPE)를 포함한다.
"비제어된" MOI 조건 하에 연속 계대 동안 관찰된 경향
Vero 세포 계대에 CHIKV-Δ5nsP3의 적응 동안, 총 CHIKV-Δ5nsP3 바이러스 수율은 표 2에 제시된 바와 같이 Vero 세포에서 계대 수가 증가함에 따라 실질적으로 증가하였음을 관찰하였다. 도 4a에 도시된 바와 같이, 계대 6 이상은 바이러스 구제(P0) 및 초기 계대와 비교하여 역가에서 대략 100배 증가를 산출하였다. 또한 CHIKV-Δ5nsP3 플라크 크기의 동반 감소를 관찰하였다(도 4b). 다른 세포주에서 플라크 크기에 대한 야생형 치쿤구니야 바이러스의 시험관내 계대의 효과는 Gardner CL 등(Gardner CL, et al., 2014, 상기 문헌)에 의해 이전에 기재된 바 있다. 높은 바이러스 수율은 불활성화된 바이러스의 산업 생산에 매우 바람직할 수 있지만; 도 4c에 도시된 바와 같이 CHIKV-Δ5nsP3은 계대가 증가함에 따라 덜 면역원성이 됨을 또한 본원에서 관찰하였다. 간단히 말해서, 상기 표 2에서 생성된 바와 같은 CHIKV-Δ5nsP3의 상이한 계대의 면역원성을 결정하기 위해, 5마리 C57Bl/6 마우스의 그룹을 105 TCID50 CHIKV-Δ5nsP3 계대 5(P5B), 계대 8(P8B) 또는 P15(P15C)의 용량으로 피하로 1회 면역시켰다. P0(바이러스 구제), 또한 105 TCID50에서의 CHIKV-Δ5nsP3을 양성 대조군으로 사용하였다. 제21일 혈청 풀을 1:20 내지 1:327,680 범위의 4배 연속 혈청 희석을 시험함으로써, Vero 세포에 대한 PRNT 검정에서 CHIKV-Δ5nsP3(P0)을 중화시키는 능력에 대해 평가하였다. 도 4c에 도시된 바와 같이, P5B CHIKV-Δ5nsP3의 마우스에서의 면역원성은 계대되지 않은 CHIKV-Δ5nsP3(P0)과 비교하여 약간 이동된 면역원성을 나타내는 반면, P8B 바이러스는 P15C 바이러스와 필적할만한 실질적으로 감소된 면역원성을 나타내었다. (P15C 바이러스는 비-면역원성이므로, 후속 PRNT 검정에서 음성 대조군으로 제공된다.)
최종적으로, CHIKV-Δ5nsP3의 선택된 계대를 Sanger 서열분석에 의해 유전자 안정성에 대해 시험하였다. CHIKV-Δ5nsP3을 Vero 세포에서 최대 16회 계대시, 바이러스의 약독화에 책임이 있는 nsP3 유전자에서 60개 아미노산 결실이 유전적으로 안정되어 있었음을 검증하였으며, 이는 바이러스가 생 약독화 백신에 대한 중요한 안전성 요건인 야생형으로 다시 돌아가지 않았음을 나타낸다.
제어된 MOI 조건 하에 연속 계대 동안 관찰된 경향
높은 MOI(예를 들어, 0.1 초과)의 사용은 너무 많은 출발 물질이 요구되므로 산업 규모 방법에 도움이 되지 않는다. 이와 관련하여, 3개 계대에 걸쳐 더 낮은 MOI(0.01)의 사용을 시험하였고, 생성된 계대의 면역원성을 결정하였다. 도 5a에 도시된 바와 같이, 표 2에서 복제물 B로부터의 3개 계대를 0.01 내지 2.23 범위의 MOI를 사용하여, 비제어된 조건 하에 계대시켰다. 이에 따라 수득된 계대 3(P3B)으로부터, 각각의 계대에 대해 0.01의 MOI를 사용하여 P6까지 추가 계대를 수행하였고, 도 5a에 "MOI 0.01에서 제어된 조건"으로 나타내었다. 0.01의 MOI를 사용하는 조건 하에, 생성된 바이러스의 면역원성은 도 5b에 도시된 바와 같이 매우 빠르게 손실되었다. 계대 5에 의해, CHIKV-Δ5nsP3은 비-면역원성을 제시하였다. 이 결과는 도 4c에서 훨씬 더 높은 MOI로 생산되고(표 2, 복제물 B 참조) 여전히 면역원성이 있는 P5B로 도시된 결과와 대조적이었다. 이러한 관찰은 더 낮은 MOI가 CHIKV-Δ5nsP3의 면역원성에 영향을 미치는 돌연변이에 대해 Vero 세포 계대 동안 더 빠른 선택을 야기하는 것을 나타내는 것으로 보인다.
실시예 2. 면역원성에 영향을 미치는 CHIKV-Δ5nsP3의 서열 이질성 정의
더 높은 CHIKV-Δ5nsP3 계대에서 면역원성의 관찰된 감소/손실(중화 항체 역가) 및 감소된 플라크 크기로 인해, 상이한 계대 수로 바이러스 집단 내에서 가능한 서열 이질성을 분석하는 것이 흥미로웠다. 또한, 바이러스 집단의 개별 플라크의 서열을 분석하는 것이 흥미로웠다. 계대되지 않은 CHIKV-Δ5nsP3(P0)은 Sanger 서열분석에 기초한 서열 이질성을 나타내지 않았다. 일반적으로, 계대 수가 증가함에 따라, 모든 3개 복제물에 대해 서열 이질성의 증가가 관찰되었다(복제물 A, B 및 C; 표 3). 계대 8(P8C)에서 복제물 C를 계대시키는 경우, 바이러스 집단은 여전히 이질성인 반면(표 3에 제시된 서열 이질성), P15C 계대는 정의된 점 돌연변이를 갖는 보다 균질한 바이러스 집단을 나타내었다(*로 표시됨). 도 4c에 도시된 면역원성 데이터(상기 실시예 1)는 P5B 및 P8B에 초점을 맞추었으며, 이는 하기 표 3에 제시된 바와 같이 CHIKV-Δ5nsP3 비-구조 단백질(nsP) 및 외피 단백질 E2에서 서열 이질성을 나타내었다.
표 3. 계대 P5, P8 및 P15(표 2에서 생산된 바와 같은 복제물 A, B 및 C)에서 CHIKV- Δ5nsP3의 서열 이질성. Sanger 서열분석에 의해 서열 이질성을 결정하였다. 이를 위해, 바이러스 핵산을 QIAamp MinElute Virus Spin Kit(Qiagen)를 사용하여 수확된 세포 배양 상청액으로부터 추출하였다. 랜덤 헥사머를 사용하는 SuperScript III First-Strand Synthesis System(ThermoFischer)을 사용하여 cDNA를 합성하였다. CHIKV-Δ5nsP3 게놈의 중첩 영역을 증폭시키는 프라이머(표 1)를 사용하여 Phusion High Fidelity Polymerase로의 PCR을 수행하였고, 이를 독일 소재 MWG Eurofins에서 Sanger 서열분석에 의해 서열분석하였다. 판독값은 자동화 염기 호출의 결과(>20%) 뿐만 아니라 서열분석 크로마토그램의 시각적 분석에 의해 검출된 이질성을 나타낸다. *전체 돌연변이(즉, 100%)는 별표로 나타낸다.
단일 C HIKV-Δ5nsP3 플라크의 확장 및 서열분석
면역원성에 대한 개별 돌연변이의 효과를 이해하고 결과적으로 고도의 면역원성 CHIKV-Δ5nsP3 백신에 대해 제어되고 재현가능한 생산 방법을 개발하기 위해, CHIKV-Δ5nsP3 단리물 P5B 및 P8B로부터의 개별 플라크를 선발하였다. 간단히 말해서, P5B 및 P8B CHIKV-Δ5nsP3의 연속 희석물을 플라크 검정에서 Vero 세포의 감염에 대해 사용하였고(도 4 하에 기재됨), 72 시간 배양 후, 상이한 형태의 단일 플라크를 선발하고(작은 플라크는 Vero 세포에서 여러 계대 후 나타나기 시작하므로 이들을 우선적으로 선발하였다) 6-웰 플레이트에서 Vero 세포(5x105)의 재감염을 통해 확장시켰다. 단일 플라크로부터 유래된 상이한 CHIKV-Δ5nsP3 샘플을 Vero E2 유전자 서열에서의 돌연변이에 기초하여 선택하였다. 생체내 면역원성 실험을 위해 클론 P5B-02, P5B-03, P5B-04, P5B-07, P5B-11, P8B-01 및 P8B-05를 확장시키고 정제하였다. 개별 플라크를 각각의 단리물에 대해 CellBIND 표면을 갖는 단일 850cm2 롤러 병을 사용하여 롤러 병에서 성장시킨 Vero 세포에서 확장시켰다. 밀집도에 도달하면, 세포를 100mL D-PBS + Ca+ Mg로 2회 세척한 후, 0.01의 MOI에서 접종물을 함유하는 100 mL 감염 배지(혈청 무함유 EMEM)를 첨가하였고, 상기 세포를 24시간 동안 35℃, 5% CO2에서 배양하였다. 100 mL 수확물을 24h p.i.에 50 mL PP 튜브로 옮기고, 세포 파편을 원심분리 이어서 Steriflip® 진공 여과 장치(Merck)를 사용하는 0.2μm 여과에 의해 제거하였다. 개별 정화된 바이러스 수확물을 먼저 Amicon® 원심 분리 필터 장치를 사용하여 농축하고, TBS 완충액으로 투석 여과하고 프로타민 술페이트 및 Capto™ Core700 처리에 의해 정제하였다. 이어서 정제된 CHIKV-Δ5nsP3 클론을 추가 연구에 사용하였다.
확장된 CHIKV-Δ5nsP3 샘플, P5B+1 및 P8B+1의 전체 게놈 서열; 즉 각각 단일 플라크, P5B 및 P8B로부터 유래된 상기 기재된 바와 같은 P5B-02, P5B-03, P5B-04, P5B-07, P5B-11, P8B-01 및 P8B-05를 Sanger 서열분석에 의해 평가하였다. 개별 플라크의 관찰된 점 돌연변이는 표 4에 요약되어 있고 개략적인 게놈 서열은 도 6b 및 6d에 도시되어 있다.
CHIKV-Δ5nsP3의 면역원성에 대한 특이적인 점 돌연변이의 효과를 평가하기 위해, 개별 플라크-유래된 바이러스로 면역화된 마우스로부터 제19일 마우스 혈청을 생성하고 PRNT에서 분석하였다. 간단히 말해서, 105의 의도된 TCID50 용량으로 CHIKV-Δ5nsP3의 단일 용량을 C57Bl/6 마우스(처리 그룹 당 10마리)에 피하로 투여하였고, 제19일 혈청의 풀을 그들의 바이러스 중화 능력에 대해 1:20 내지 1:327,680 범위의 4배 연속 희석에서 PRNT 검정으로 분석하였다. PRNT에서 중화된 바이러스는 계대 2 CHIKV-Δ5nsP3(P2, 560 pfu/ml)에 상응하며, 이는 서열 이질성을 나타내지 않았으므로 계대되지 않은 CHIKV-Δ5nsP3(P0)에 대한 서열과 동일하였다. 중화 혼합물(560 pfu/ml CHIKV-Δ5nsP3 P2 및 연속 혈청 희석물)을 1 시간 동안 실온에서 배양하고 Vero 세포 상에 첨가한 다음, 2 시간 동안 배양하였다. 최종적으로, 메틸셀룰로스 오버레이(0.8%)를 첨가한 후 72 시간 동안 배양하였다. 크리스탈 바이올렛 염색(5% 포름알데히드 중 0.5% 크리스탈 바이올렛) 후 플라크 판독을 수행하였다.
표 4. P5 및 P8 CHIKV-Δ5nsP3 계대의 단일 선발된 플라크에서의 돌연변이 . 표 1의 프라이머를 사용하여 전체 CHIKV-Δ5nsP3 게놈의 서열분석을 독일 소재 MWG Eurofins에서 수행하였다. 모든 P5B 및 P8B 클론은 Vero 세포에서 확장시킨 각각 P6(P5B+1) 및 P9(P8+1) CHIKV-Δ5nsP3에 상응하였다. PRNT50 역가를 비-선형 피트 - 3개 파라미터 계산을 사용하여 GraphPad Prism에서 계산하였다. 각각의 점 돌연변이가 확인된 바이러스 단백질은 괄호에 제시되어 있다. 비-면역원성 단리물에 대한 PRNT50 값은 나타낸 바와 같이 측정가능하지 않았다.
도 6a에서 볼 수 있는 바와 같이, E2 단백질에서의 단일 점 돌연변이, 각각 E247K 및 H232Y(도 6b) 둘 다를 갖는 CHIKV-Δ5nsP3 P5B-11 및 P5B-03의 면역원성은 P0 CHIKV-Δ5nsP3의 면역원성과 비교시 영향을 받지 않는다. P0 혈청의 중화 능력은 면역원성의 허용가능한 범위를 기술하는 2개의 독립적인 마우스 실험(4415; P0 #2 및 4399; P0 #1)으로부터 제시되어 있다. 다른 한편으로, 3개의 점 돌연변이, 각각 nsP2 및 E2에서 G577W, G55R 및 H232Y를 특징으로 하는 P8B-05는 마우스에서 비-면역원성이다. G55R 돌연변이는 시험관내 CHIKV 계대의 결과인 것으로 Gardner CL 등에 의한 문헌에 이미 기재되었다. 바이러스 입자는 시험관내 헤파린 술페이트 결합에 대한 증가된 의존성에 의해 영향을 받아 생체내 약독화를 야기한다(Gardner CL, et al., 2014, 상기 문헌).
도 6c에서 볼 수 있는 바와 같이, 단일 플라크로부터 유래된 4개의 CHIKV-Δ5nsP3 샘플 중 단지 1개(P5B-02)만이 여전히 면역원성이었고 2개의 점 돌연변이, 각각 nsP1 및 E2에서 A38S 및 E168K(도 6d)를 특징으로 하였다. 또한, 3개의 점 돌연변이, nsP3에서 R470S 및 E2 단백질에서 H99Y 및 E168K를 갖는 P8B-01은 마우스에서 비-면역원성이었고 음성 대조군 P15C와 필적할만하였다. P5B-04 및 P5B-07 각각은 E2에서 단일 점 돌연변이를 가졌으며, 즉, 글루탐산 168을 리신으로 돌연변이시켰으며(E168K), 이는 CHIKV-Δ5nsP3 중화 능력이 손실되었으므로 면역원성에 대한 직접 효과를 가짐을 또한 나타냈다.
요약하면, Vero 세포에서 계대 동안 발생하는 많은 돌연변이가 E2 단백질에 위치하는 것으로 관찰되었다. E2 단백질 및/또는 게놈의 다른 부분에서 확인된 점 돌연변이 중 일부; 특히 H232Y[E2] 및 E247K[E2] 돌연변이는 바이러스의 면역원성에 실질적으로 영향을 미치지 않았다. 그러나, CHIKV-Δ5nsP3에서 다른 확인된 돌연변이 중 일부; 특히 빈번하게 발생하는 E168K[E2] 돌연변이는 단독이든 다른 돌연변이와 조합하든 면역원성의 손실을 초래하였다. 흥미로운 예외는 면역원성을 유지한 E168K[E2] 및 A38S[nsP1] 돌연변이 둘 다를 갖는 돌연변이체였다. 이러한 관찰은 A38S[nsP1] 돌연변이가 E168K[E2] 돌연변이에 의해 부여된 감소된 면역원성에 대한 완화 효과를 갖는 것을 시사한다. 또한, G55R/H232Y[E2] 및 G577W[nsP2] 돌연변이를 갖는 단리물은 또한, H232Y 돌연변이 단독으로는 거의 효과가 없었으므로(P5B-03 참조), 아마 주로 E2에서 G55R 돌연변이로 인해 불량한 면역원성을 입증하였다.
치쿤구니야 바이러스 E2 단백질에서 E168K 및 G55R 돌연변이는 증가된 양성 표면 전하를 부여하여 헤파린 술페이트 및/또는 다른 글리코사미노글리칸(GAG)과의 증가된 상호작용을 야기하여, 궁극적으로 증가된 특이적 감염성을 초래하는 것으로 이전에 기재되었다. 야생형 CHIKV의 배경에서, 돌연변이는 헤파린 술페이트에 결합함으로써 매개되는 플레이트에서 더 낮은 확산으로 인해 더 작은 플라크 크기를 야기하는 것으로 제시되었다. 또한, 돌연변이는 근골격계 질병(MSD)의 마우스 모델에서 CHIKV의 약독화를 초래하였고, 이는 마우스에서 기관으로의 확산을 감소시켜 바이러스혈증의 수준이 더 낮아졌다(Gardner CL, et al., 2014, 상기 문헌; Silva LA, et al., A single-amino-acid polymorphism in Chikungunya virus E2 glycoprotein influences glycosaminoglycan utilization (2014) J Virol.; 88(5):2385-97). 달리 야생형 CHIKV에서 E168K 및 G55R 돌연변이의 존재가 중간 약독화를 초래한다는 사실은 감소된 플라크 크기 또는 감소된 생체내 면역원성에 관한 본 개시내용과 일치한다. 그러나, 약독화 CHIKV-Δ5nsP3의 배경에서 상기 2개의 돌연변이가 본원에 보고된 바와 같이 마우스에서 면역원성의 손실을 초래할 것으로 예상되지 않았다.
또한 E2에서 양으로 하전된 잔기에 대한 치환이 시험관내 향상된 헤파린-술페이트 의존성 감염성을 부여하고, 이들 돌연변이가 몇 개의 연속 시험관내 계대 내에서 선택될 수 있는 다른 세포 배양 계대된 알파바이러스, 예컨대 신드비스 바이러스(SINV; Klimstra WB, et al., Infection of neonatal mice with Sindbis virus results in a systemic inflammatory response syndrome (1999) J. Virol.; 73(12):10387-98; Klimstra WB, et al., The furin protease cleavage recognition sequence of Sindbis virus PE2 can mediate virion attachment to cell surface heparan sulfate (1999) J. Virol.; 73(8):6299-306; Byrnes and Griffin, Binding of Sindbis virus to cell surface heparan sulfate (1998) J. Virol.; 72(9):7349-56), 로스 리버 바이러스(RRV; Heil ML, et al., An amino acid substitution in the coding region of the E2 glycoprotein adapts Ross River virus to utilize heparan sulfate as an attachment moiety (2001) J. Virol.; 75(14):6303-9) 및 셈리키 삼림열 바이러스(SFV; Smit JM, et al., Adaptation of alphaviruses to heparan sulfate: interaction of Sindbis and Semliki forest viruses with liposomes containing lipid-conjugated heparin (2002) J. Virol.; 76(20):10128-37)에 대한 공통 현상으로 보고되었다. 또한, 이러한 돌연변이가 생체내 바이러스의 약독화를 야기하는 것으로 제시되었다(Byrnes AP and DE Griffin, Large-plaque mutants of Sindbis virus show reduced binding to heparan sulfate, heightened viremia, and slower clearance from the circulation (2000) J. Virol.; 74(2):644-5151; Klimstra WB, et al. 1999, 상기 문헌).
면역원성의 동반 하락에 따른 서열 이질성은 이미 CHIKV-Δ5nsP3의 계대 P5 및 P8에서 명백했기 때문에, 초기 계대에서의 서열 이질성, 뿐만 아니라 면역원성에 대한 그들의 효과를 하기 요약된 바와 같이 보다 세밀히 조사하였다.
실시예 3. 계대 P3에서 CHIKV-Δ5nsP3의 서열 이질성 및 면역원성 정의
중화 항체 역가에 의해 측정시 나중 계대에서 CHIKV-Δ5nsP3의 면역원성에 대한 역효과를 갖는 서열 이질성의 발생은 효과적인 백신의 생산에 충분한 바이러스 역가 뿐만 아니라 높은 면역원성 둘 다를 특징으로 하는 최적의 계대를 발견하는 것을 보장하였다.
MVSB(P1), WVSB(P2) 및 CHIKV-Δ5nsP3 약물 물질("VLA1553")(P3) 생산 동안 CHIKV-Δ5nsP3의 유전자 안정성을 결정하기 위해, 독립적으로 생성된 계대 1, 2 및 3을 서열분석하였다. Sanger 서열분석에 의해 결정시, P0(바이러스 구제), P1(MVSB) 및 P2(WVSB)는 어떠한 명백한 서열 이질성을 나타내지 않았다. 다음 단계는 감염 동안 P2(WVSB)를 사용하여 정제된 약물 물질(DS)로부터 유래된 P3의 유전자 안정성의 재현성을 입증하는 것이었다. 전체적으로, 조합된 제1일 및 제2일 수확물로 이루어진 4개의 독립적인 P3 수확물을 감염(MOI 0.01)을 위해 P2(WVSB)를 사용하여 2개의 T150 T-플라스크에서 생산하였다. 각각의 복제물에 대해, 제1일 및 제2일에 개별 수확물을 풀링하고(총 양 ~50 mL) 대략 10배 농축시켰다(Amicon 100 kDa 한외여과 장치). 25 mM Tris/150 mM NaCl, pH 7.4에 대해 투석 여과를 수행한 다음, 프로타민 술페이트 처리(2 mg/mL 최종 농도)하여 숙주 세포 DNA를 침전시켰다. 이어서 투명한 상청액을 CaptoCore 700 수지(Tris/NaCl 완충액 중 ~1 mL의 50% 슬러리의 첨가)를 사용하여 배치 흡착 크로마토그래피에 의해 추가로 정제하였다. 수지를 원심분리에 의해 제거하고 수크로스를 10%의 최종 농도로 첨가하여 CHIKV-Δ5nsP3을 동결 및 해동시켰다. 이어서 최종 제형을 0.2 μm 멸균 여과하고 추가 처리까지 동결 보관하였다(<-65℃).
계대 3(P3)에서, 자동화 염기 호출에 의한 이질성은 검출되지 않았다(Eurofins - 모두 < 20%). 그러나, 시각적 검사에 의해, 바이러스 집단의 작은 분획은 CHIKV 당단백질 E2에 대한 유전자에서 E168K 및 E247K 서열 이질성의 일관된 증가를 나타냈고, 이는 구제된 CHIKV-Δ5nsP3(P0) 뿐만 아니라 MVSB 및 WVSB 샘플에서 부재하였다. 도 7은 계대 0(P0)에서의 바이러스와 비교하여 4개의 독립적으로 생성된 P3 DS 샘플(실시예 1-4)에 대한 서열분석 크로마토그램을 도시한다. 상자 윤곽으로 나타낸 바와 같이, 아미노산 168에 대한 코돈(게놈 핵산 위치 8882)에서 G/A 이질성은 모든 4개의 복제물에서 검출가능하고 역방향 서열분석 반응에 의해 검증되었으며, 이는 동일한 이질성을 나타냈다. P0 샘플에서 동일한 위치는 정방향 서열분석 반응에서 G(및 역방향 서열분석 반응에서 C)에 대해 급격한 피크를 나타냈다. 다른 한편으로, E247K 이질성(게놈 핵산 위치 9119)이 존재하였지만 서열분석 크로마토그램에서는 거의 검출가능하지 않았다.
추가적으로, 바이러스 집단 내에서 E168K 및 E247K의 양을 정량화하기 위해 P3의 차세대 서열분석을 수행하고 계대 1(P1-MVSB)의 서열분석과 비교하였다. 도 8에서 볼 수 있는 바와 같이, P1-MVSB의 단계에서, 단지 매우 낮은 수준의 서열 이질성만이 검출가능하였다(모두 배경 아래; 점선으로 표시된 15% 컷 오프). 그러나, 배경에 도달하거나 또는 넘어서는 E2 유전자에서 2개의 돌연변이(바이러스 집단의 18% 및 15%에서 E168K - 게놈 핵산 위치 8882 및, 더 낮은 정도로, E247K - 게놈 핵산 위치 9119)를 갖는 2개의 대표적인 P3 샘플은 서열 이질성에서 전반적인 증가를 나타냈다.
요약하면, CHIKV-Δ5nsP3의 E2 단백질에서 E168K 돌연변이의 존재는 8개의 독립적으로 생성된 P3 샘플에서 Sanger 서열분석 및 NGS에 의해 확인되었으며, 이는 이 결과의 재현성을 입증한다. 대표적인 서열분석 예는 도 7 및 8에 도시되어 있다. 이들 데이터는 CHIKV-Δ5nsP3 바이러스의 E2 단백질에서 E168K 돌연변이의 출현이 Vero 세포에서 계대시 고도로 재현가능하였고, P5B 플라크-유래된 바이러스(도 6에서 P5B-04 및 P5B-07)가 비-면역원성인 경우 실시예 2에 제시된 바와 같이 약독화 CHIKV-Δ5nsP3 바이러스의 면역원성을 감소시켰음을 입증한다. E168K와 유사하게 Vero 세포에서 CHIKV-Δ5nsP3의 계대 동안 관찰된 2개의 추가 돌연변이, G55R 및 G82R은 바이러스의 약독화를 야기하는 CHIKV의 병독성에 영향을 미치는 것으로 보고되었다(Gardner CL, et al., 2014, 상기 문헌, Silva LA, et al., 2014, 상기 문헌, 및 Gorchakov R, et al., Attenuation of Chikungunya virus vaccine strain 181/clone 25 is determined by two amino acid substitutions in the E2 envelope glycoprotein (2012) J. Virol.; 86(11):6084-96; Epub 2012/03/30). 이러한 2개의 돌연변이는 또한 CHIKV-Δ5nsP3의 면역원성에 부정적으로 영향을 미치므로, 그들의 출현의 고도의 면역원성 CHIKV-Δ5nsP3 백신 후보의 생산을 위해 회피해야만 한다.
E1/E2 이량체 내에서 돌연변이가 발생하기 쉬운 아미노산의 위치는 도 9에 도시되어 있다. 3개의 E2 아미노산 G55, G82 및 E168은 모두 표면 상에 접근할 수 있고 이로 인해 그들의 돌연변이는 잠재적으로 CHIKV와 그의 세포 수용체의 상호작용에 영향을 미칠 수 있다. 대조적으로, E247[E2]은 단백질 구조 내에서 더 숨겨져 있고 이로 인해 동일한 정도로 표면에 노출되지 않을 수 있다. E247의 위치는 E247K 돌연변이가 상기 나타낸 바와 같이 CHIKV-Δ5nsP3의 면역원성에 현저하게 영향을 미치지 않는 하나의 이유일 수 있다.
실시예 4. 이질성 CHIKV-Δ5nsP3 바이러스 집단의 면역원성 손실에 대해 E168K 돌연변이의 역치 결정
상기 관찰은 E168K[E2] 돌연변이가 Vero 세포에서 CHIKV-Δ5nsP3의 계대 동안 초기에 빈번하게 나타나고 면역원성 손실과 관련이 있음을 나타내었다. 효과적인, 면역원성 생-약독화 치쿤구니야 바이러스 백신의 신뢰할 수 있는 제조 방법을 개발하기 위해, 상이한 비의 P3 약물 물질 및 바이러스 P5B-07(E168K 단일 돌연변이체; 표 3 참조)을 제조함으로써 CHIKV-Δ5nsP3 백신의 샘플에서 이 돌연변이에 대한 내성을 시험하였다.
약 20% E168K 이질성을 나타내는(데이터는 제시되지 않음) 계대 3(P3) 약물 물질을 P5B-07 단리물로부터의 CHIKV-Δ5nsP3(E168K 돌연변이체) 제제와 1:0.1, 1:1 및 1:10의 비로 혼합하였다. 혼합물을 서열분석하여 각각의 바이러스 제제에서 E168K 돌연변이의 대략적인 빈도를 검증하였다. 도 10에 도시된 바와 같이(이질성으로 표지된 행 참조), 야생형 뉴클레오티드 G과 비교하여 뉴클레오티드 A의 상대적 양은 첨가된 P5B-07 단리물의 수준이 증가함에 따라 증가하는 것으로 제시되었다(E168K 대조군 7에서 최대 100% A).
면역원성에 대한 E168K 돌연변이의 효과를 결정하기 위해, C57Bl/6 마우스를 3x104 TCID50의 의도된 용량(도 11d에 도시된 실제 용량)으로 도 10에 명시된 상이한 CHIKV-Δ5nsP3 샘플로 s.c. 면역시켰다. 제21일 마우스 혈청을 수집하고 1:0.1, 1:1 및 1:10 그룹으로부터의 개별 혈청을 중화 검정에 기초한 바이러스 레플리콘 입자(VRP)를 사용하여 2개의 대조군, P3(그룹 6) 및 P5B-07(E168K; 그룹 7)로부터 풀링된 혈청으로 시험 및 비교하였다(도 11). VRP는 LR2006-OPY1 바이러스의 캡시드 및 외피 단백질을 나타내는 복제 결핍 야생형 CHIKV와 유사하다. 상기 방법은 본질적으로 Glsker 등에 의해 기재된 바와 같이 수행하였다(Virus replicon particle based Chikungunya virus neutralization assay using Gaussia luciferase as readout (2013) Virol. J.; 10:235). BHK-21 세포를 가우시아 루시퍼라제(GLuc)를 발현시키는 CHIKV 레플리콘 및 각각 야생형 CHIKV 캡시드 단백질 및 나머지 구조 단백질(E3, E2, 6K 및 E1)을 발현시키는 2개의 헬퍼 RNA와 공동 형질감염시켜 VRP를 제조하였다. 생성된 단일 원형 감염성 입자는 분비된 GLuc를 판독값으로 사용하는 CHIKV 중화 검정에서 사용하였다. 루시퍼라제 검정에서 VRP의 중화시, BHK-21 세포에 의한 GLuc 발현의 감소가 측정될 수 있다. 중화 면역력을 도출하는 능력은 더 많은 양의 E168K 돌연변이체에 따라 하락함을 관찰하였다(각각 도 11a, b 및 c). 치쿤구니야 바이러스에 대한 양성, 낮은 양성 또는 음성 면역 반응을 나타내는 개별 마우스의 수는 도 11d에 도시되어 있다.
이러한 발견은 바이러스 집단에서 야생형 바이러스 입자에 대한 E168K 돌연변이체의 비가 증가함에 따라, 마우스에서 CHIKV-Δ5nsP3의 면역원성이 감소됨을 확인시켜 준다. 따라서 CHIKV-Δ5nsP3 백신의 높은 면역원성을 보장하기 위해 E2에서 위치 E168을 면밀히 모니터링하는 것이 중요하다. 이전 계대 방법 및 계대 8에서 바이러스 집단 내에서 E168K의 정량화에 기초하여, CHIKV-Δ5nsP3 집단 내에서 E168K 돌연변이의 약 70% 비율에서, 마우스 혈청 풀을 PRNT에서 분석할 때 면역원성이 손실되었음을 관찰하였다.
실시예 5. CHIKV-Δ5nsP3에서 E168K 돌연변이를 감소시키기 위한 업스트림 방법
본 실시예의 목적은 롤러 병에서 CHIKV-Δ5nsP3의 생산을 위한 방법에 기초한 최적화된 Vero 세포 배양을 특징화하는 것이었다. E2 단백질의 바이러스 생산성 및 서열 이질성에 대한 여러 업스트림 방법 파라미터(MOI, 플레이팅 및 배양 온도에 따른 Vero 세포 감염일)의 영향을 GMP 제조용 바이러스 시드 뱅크(GMP WVSB B3005044; 계대 2, 또한 본원에서 "P2 CHIKV-Δ5nsP3"으로도 지칭됨) 및 약물 물질을 생산하기 위한 R&D Vero 제조용 세포 뱅크(DS; 계대 3, 즉 또한 본원에서 "P3 CHIKV-Δ5nsP3"으로도 지칭됨)를 사용하여 시험하였다.
GMP WVSB B3005044의 제조
특징화된 프리-마스터 바이러스 시드 뱅크(PMVSB, Vero 세포에서 바이러스 구제로부터의 프리-마스터 바이러스 시드 뱅크 AFR886/197579)을 R&D 조건 하에 확립하였고, 프리-마스터 바이러스 시드 뱅크를 사용하여 GMP 조건 하에 CHIKV-Δ5nsP3의 마스터 시드 뱅크를 생성하였다. GMP 제조용 바이러스 시드 뱅크, VLA78-1553-WVSB-2016, 배치 B3005044를 VLA78-1553-MVSB-2016, 배치 #B3005567에 대해 기재된 바와 동일한 생산 방법 및 GMP 조건 하에 Halix B.V.에서 생산하였다. 간단히 말해서, VERO 제조용 세포 뱅크(내부 명칭: ICB 2014/002)를 도 12에 도시된 바와 같이 T75cm2 플라스크(1X), 이어서 T175cm2 플라스크(3X)를 사용한 시드 흐름의 4 단계 및 마지막 단계 6x850cm2 롤러 병으로 확장하였다. 6개 롤러 병 중 4개를 CHIKV-Δ5nsP3 시드 뱅크의 생산을 위해 사용하였다. 4개 롤러 병에서 세포의 총 양을 결정하였다. 프리-마스터 바이러스 시드 뱅크를 사용하여 CHIKV-Δ5nsP3 마스터 바이러스 시드 뱅크를 생성하였다. 이후에, CHIKV-Δ5nsP3 마스터 바이러스 시드 뱅크를 사용하여 CHIKV-Δ5nsP3 제조용 바이러스 시드 뱅크를 생성하였다. 감염은 모든 단계에서 0.01의 MOI에서 수행하였다. 감염 24 시간 후(35℃; 5% CO2; 0.5 RPM), CHIKV-Δ5nsP3을 수확하였다. Tris 및 수크로스 원액을 수확물 풀 중에서 5% 수크로스 및 25 mM Tris의 최종 농도로 첨가하였다. 제형화 후, 풀을 증기 멸균된 0.22 μm 여과를 통해 멸균된 500 mL 바이오 방법 용기로 연동 펌프를 사용하여 여과하였다. 바이알을 연동 충전 펌프를 사용하여 0.7 mL 제형화되고 여과된 수확물로 하나씩 충전하였다. ThermoFisher 캡퍼 / 디캡퍼 장치를 사용하여 2 D Matrix Cryo 바이알을 열고 닫았다. GMP 시드 뱅크의 충전된 바이알을 <-65℃에서 보관하였다.
Vero 세포의 배양
Vero 세포의 배양을 T75 cm2(T75), T175 cm2(T175) T-플라스크 및 850cm2 롤러 병(850RB)에서 35℃ 및 5% CO2에서 수행하였다. 상이한 실험에 사용된 Vero 세포는 GMP 마스터 세포 뱅크 MCB ICB/2014/001로부터 유래되었다. 이 연구 제조용 세포 뱅크의 내부 명칭은 Bk5685였다. GMP 마스터 세포 뱅크는 Institut Merieux(Aventis Pasteur) P129 뱅크로부터 및 궁극적으로 원래 ATCC CCL 81 P113 뱅크로부터 비롯된 WHO Vero 세포 뱅크 10-87 P134로부터 유래되었다. 세포 배양 흐름에 관한 보다 상세한 사항은 도 12에 도시되어 있다. 세포를 10% FBS 및 2 mM L-글루타민으로 보충된 MEM 배지에서 유지하였다.
850cm 2 롤러 병에서 바이러스 생산
850RB에서 35℃에서 세포 확장 2, 4 또는 5일 후, 세포를 PBS로 세척하고 0.1, 0.01 또는 0.001 TCID50/세포의 MOI에서 CHIKV-Δ5nsP3(WVSB B3005044)으로 감염시켰다. 바이러스 생산을 위해, 감염된 세포를 2 mM 글루타민으로 보충된 100 mL의 MEM 배지에서 37℃, 35℃ 또는 28℃에서 배양하였다.
바이러스 적정
TCID50 검정을 사용하여 Vero 세포에서 바이러스 역가를 결정하였다. 세포를 마이크로플레이트에 시딩하고 0.5% FBS 및 2 mM 글루타민으로 보충된 EMEM 중에서 10배 연속적으로 희석된 바이러스 샘플로 감염시켰다. 35℃ / 5% CO2에서 1주 배양 후, 바이러스-유도된 세포변성 효과를 모니터링하였고, 리드 앤드 뮌헨 방법(Reed, L.J.; Muench, H. A simple method of estimating fifty percent endpoints(1938) The American Journal of Hygiene 27:493-497)에 따라 바이러스 역가를 계산하였다.
바이러스 게놈 추출 및 서열분석
바이러스 핵산을 QIAamp MinElute Virus Spin Kit(Qiagen)를 사용하여 나타낸 시점에서 Vero 세포 배양 상청액으로부터 추출 및 정제하고, 랜덤 헥사머를 사용하는 SuperScript III First-Strand Synthesis System(ThermoFischer)을 사용하여 cDNA 합성을 수행하였다. E2 유전자 영역의 서열분석을 위해, 먼저, 프라이머 16F, 16R, 17F, 17R, 18F 및 18R(프라이머 서열에 대해 표 1 참조)을 사용하여 Phusion High Fidelity Polymerase(ThermoFischer)로의 PCR을 수행하여 CHIKV E2 유전자의 중첩 영역을 증폭시켰다. PCR 앰플리콘의 정제 후, 독일 소재 MWG Eurofins에서 Sanger 서열분석을 수행하였다. 자동화 염기 호출(>20%)에 의해 검출된 서열 이질성의 분석 이외에도, 모든 서열분석 크로마토그램을 수동으로 판독하여 검출 한계(<20%) 미만의 이질성을 또한 검출하였다.
면역원성 P3 CHIKV-Δ5nsP3 약물 물질을 생산하는 방법의 최적화
Vero 세포에서 계대 3 CHIKV-Δ5nsP3을 생성하는 방법을 최적화하기 위해, 상이한 MOI, 시딩후 Vero 세포 감염 시간 및 배양 온도를 표 5에 나타낸 바와 같이 모든 조합으로 시험하였다. 추가적으로, 감염 후 다른 날에 수율을 분석하였다. 수확된 바이러스의 3가지 양태를 모니터링하였다: E2 구조 단백질의 바이러스 생산성, 역가의 안정성 뿐만 아니라 서열 이질성 수준.
표 5. 850 cm2 롤러 병에서 Vero 세포에서 CHIKV-Δ5nsP3의 생산에 대해 시험된 파라미터 및 확인된 최적화된 방법의 파라미터.
바이러스 생산
모든 조건에 대해 달성된 CHIKV-Δ5nsP3 생산 동역학은 도 13에 도시되어 있다. CHIKV-Δ5nsP3을 생산하기 위해 현재 사용되는 최적의 방법(35℃, MOI 0.01, Vero 세포 시딩 후 제4일에 감염)이 또한 실험에 포함되었으며, 이는 감염 24h 후 108.0-8.5/mL의 예상된 수준에서 바이러스 생산성을 나타낸다(도 13b).
MOI 및 감염 시간을 비교하면, 온도는 바이러스 생산 동역학에 가장 영향을 미쳤다. 37℃ 및 35℃에서(각각 도 13a 및 13b), 최대 생산성은 감염후 제1일에 달성되었다. CHIKV-Δ5nsP3 감염성은 이후 24 시간 동안 실질적으로 하락하였으며, 35℃에서 약간 덜 뚜렷한 바이러스 역가 손실이 있었다. 28℃로의 온도 감소는 바이러스 동역학의 현저한 변화를 초래하였다. 최대 바이러스 생산성은 사용된 MOI에 따라 1 내지 4일 지연되었고; 유의하게 개선된 바이러스 역가 안정성을 관찰하였다(도 13c). 모든 수확물로부터 생산된 총 바이러스 수율은 도 14에 도시되어 있다. 도 13a에 도시된 바와 같은 28℃ 조건의 경우, 2개 수확물의 수율을 조합하였고(감염후 제1일 및 제2일); 35℃ 조건의 경우(도 13b), 모든 3개 수확물의 수율을 조합하였고(제1일-제3일), 37℃ 조건의 경우(도 13c), 5개 수확물(제1일-제5일)의 수율을 조합하였다.
초기 관찰을 완료하기 위해, 반응 표면 2차 모형을 사용하여 바이러스 생산성 및 역가 안정성 데이터를 분석하였다(도 15 및 16). 바이러스 생산성을 위해, 최대 바이러스 역가 값을 사용하였다. 바이러스 역가 안정성을 위해, 생산 방법에서 하루 후에 측정된 역가에서 최대 역가를 빼서 나온 델타 값을 계산하고 사용하였다. 총 바이러스 생산성을 위해, 각각의 시점에서의 개별 역가를 더하였다.
두 모형의 ANOVA 분석으로, 통계적으로 유의한 영향 요인을 나타내는 것이 가능하였다(도 15a 및 16a). 이전 관찰을 확인하면, 온도는 바이러스 생산성 및 안정성에 영향을 미치는 가장 강력한 요인이었다. 특히, 저온(28℃)은 높은 바이러스 역가를 가능하게 하면서 바이러스 역가를 시간 경과에 따라 합리적으로 안정하게 유지하였다. 그러나, 35℃와 비교하면 이 온도에서의 전반적인 총 바이러스 생산성은 유의하게 더 높지 않았다(특히 도 14 참조).
Vero 세포 시딩 후 감염 시간은 또한 반응에 영향을 미쳤지만, 더 낮은 정도로 영향을 미쳤다. MOI는 유의하게 영향을 미치지 않았다. 두 모형에 대해, 세포 시딩후 72h에서의 감염은 세포 감염에 적절한 시간이었다. 반대로, 가장 높은 바이러스 수율이 35℃에서 발견되었고 가장 안정화된 역가가 28℃에서 관찰되었으므로 단일 온도는 최적의 바이러스 생산 및 역가 안정성을 조합하는 것을 허용하지 않았다(도 15b 및 16b). 감염후 최단 시간 내에 최대 총 바이러스 생산성은 35℃에서 달성되었다(도 14 참조).
E2 단백질 유전자 서열의 분석
Vero 세포의 감염(시딩후 제4일에 감염됨) 후 제2일 또는 제5일에 수집된 바이러스 샘플을 선택하여 바이러스 E2 구조 단백질의 게놈 RNA 서열의 분석을 수행하였다. 이들 샘플은 롤러 병에서 Vero 세포 밀집에 대해 가장 대표적이다. 하기 표 6 및 7은 Sanger 서열분석에 의해 결정된 핵산 서열에 기초한 4개 아미노산(AA) 위치에 대해 추정된 이질성의 백분율을 요약한다. 표 6은 3개의 상이한 온도에서 성장시키고 감염후 2일에 수확된 CHIKV-Δ5nsP3에 대한 데이터를 나타내고, 표 7은 28℃에서 성장시키고 감염후 5일에 수확된 CHIKV-Δ5nsP3에 대한 데이터를 나타낸다.
표 6. 감염후 D2 샘플 수확물로부터 E2 바이러스 단백질에 대한 RNA 게놈 서열의 분석. Sanger 서열분석에 의해 결정된 바와 같이, 4개 AA 위치(괄호로 표시됨)에 상응하는 핵산 이질성의 추정된 백분율이 제시된다. 핵산 위치 9649에서의 이질성은 침묵 돌연변이이다.
표 7. 감염후 D5 샘플 수확물로부터 E2 바이러스 단백질에 대한 RNA 게놈 서열의 분석. Sanger 서열분석에 의해 결정된 바와 같이, 4개 AA 위치(괄호로 표시됨)에 상응하는 핵산 이질성의 추정된 백분율이 제시된다. 핵산 위치 9649에서의 이질성은 침묵 돌연변이이다.
MOI, 온도, 감염후-Vero 세포 시딩일 및 샘플 수확일은 모두 Vero 세포에서 생산될 때 CHIKV-Δ5nsP3의 생산성 및 품질에 영향을 미쳤다. 그러나 각각의 파라미터의 강도는 상이한 중요성을 가졌다. 예를 들어, 결과는 MOI와 이질성 수준 사이의 상관관계를 시사하는데; 즉, 감염시 바이러스 유입이 낮을수록, 수확시 관찰된 이질성 수준이 높아진다. 배양 온도는 37℃에서 더 높은 수준의 이질성이 관찰된 Pos. 9119(E247K)를 제외하고는, 뉴클레오티드 서열의 안정성에 영향을 미치는 것으로 나타나지 않았다(표 6). 또한, 바이러스 동역학에서 나중에 수집된 샘플 수확물은 동일한 AA 위치에 대해 약간 더 높은 수준의 이질성을 촉발시켰다.
이러한 첫번째 분석을 완료하기 위해, 원시 데이터의 수학적 모형을 또한 수행하였다(도 17 및 18). 위치 8543에 대해 유의한 모형이 계산되지 않았으므로 단지 3개 핵산 위치(Pos. 8882, 9119, 9649)만이 분석될 수 있다. 도 17에 나타낸 바와 같이, 온도 및 MOI는 고려되는 핵산 위치에 따라 상이한 영향을 미쳤다. MOI는 핵산 위치 8882 및 9649에 대해 관찰된 이질성에 유의하게 영향을 미쳤지만, 9112에 대해서는 영향을 미치지 않았다. 온도는 위치 9112 및 9649에 영향을 미쳤지만, 8882에는 영향을 미치지 않았다(도 17). MOI는 28℃에서 생산된 바이러스로부터 감염후 D2 및 D5 수확물 샘플을 비교할 때 이질성 수준에 지속적으로 영향을 미치는 것으로 나타났으며, 세포를 높은 품질의 바이러스(MOI 0.1 TCID50/세포)로 접종하였을 때 AA 이질성의 최소화된 수준이 관찰되었다. 이 관찰은 E2 단백질 내에서 낮은 수준의 이질성을 보장하면서 최대 바이러스 생산/역가 안정성을 달성하기 위한 수단으로 더 높은 MOI를 갖는 새로운 방법 파라미터 설정의 확립을 촉구할 수 있다. 그러나, 0.1의 MOI는 GMP 제조용 바이러스 시드 뱅크의 유의하게 더 놓은 소비를 초래하며, 이에 따라 실제 산업 적용가능성을 제한한다.
감염후 수확일은 단지 핵산 위치 9119의 변이에만 영향을 미쳤다(도 18).
서열
서열 번호: 1
CHIKV-Δ5nsP3의 뉴클레오티드 서열
서열 번호: 2
LR2006_OPY1 치쿤구니야 바이러스 균주로부터의 E2 단백질의 아미노산 서열―구조 다단백질 진뱅크 수탁번호: ABD95938.1(1-1248 aa)로부터의 아미노산 339-742
본원에서 확인된 일부 E2 변이체
서열 번호: 3
치쿤구니야 바이러스로부터의 E2 단백질의 E168K 변이체
서열 번호: 4
치쿤구니야 바이러스로부터의 E2 단백질의 G55R 변이체
서열 번호: 5
치쿤구니야 바이러스로부터의 E2 단백질의 E247K 변이체
서열 번호: 6
치쿤구니야 바이러스로부터의 E2 단백질의 G82R 변이체
서열 번호: 7
치쿤구니야 바이러스로부터의 E2 단백질의 H232Y 변이체
서열 번호: 8
CHIKV-Δ5nsP3 서열분석용 프라이머 1F
서열 번호: 9
CHIKV-Δ5nsP3 서열분석용 프라이머 1R
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<110> Valneva SE <120> Immunogenic Chikungunya Virus <130> PAT028/PCT <150> EP17192374.1 <151> 2017-09-21 <160> 49 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 11674 <212> DNA <213> Chikungunya virus <400> 1 gatggctgcg tgagacacac gtagcctacc agtttcttac tgctctactc tgcaaagcaa 60 gagattaata acccatcatg gatcctgtgt acgtggacat agacgctgac agcgcctttt 120 tgaaggccct gcaacgtgcg taccccatgt ttgaggtgga accaaggcag gtcacaccga 180 atgaccatgc taatgctaga gcgttctcgc atctagctat aaaactaata gagcaggaaa 240 ttgaccccga ctcaaccatc ctggatatcg gcagtgcgcc agcaaggagg atgatgtcgg 300 acaggaagta ccactgcgtc tgcccgatgc gcagtgcgga agatcccgag agactcgcca 360 attatgcgag aaagctagca tctgccgcag gaaaagtcct ggacagaaac atctctggaa 420 agatcgggga cttacaagca gtaatggccg tgccagacac ggagacgcca acattctgct 480 tacacacaga cgtctcatgt agacagagag cagacgtcgc tatataccaa gacgtctatg 540 ctgtacacgc acccacgtcg ctataccacc aggcgattaa aggggtccga gtggcgtact 600 gggttgggtt cgacacaacc ccgttcatgt acaatgccat ggcgggtgcc tacccctcat 660 actcgacaaa ctgggcagat 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<220> <223> primer <400> 35 taactcgagg accgcttaaa ggccag 26 <210> 36 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 36 ttaggatccg tgcatgaaaa tcgaaaatg 29 <210> 37 <211> 31 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 37 taactcgagt ggtcttgtgg ctttatagac a 31 <210> 38 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 38 ttaggatcca accggaggaa accctac 27 <210> 39 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 39 taactcgagg taccgcaccg tctgg 25 <210> 40 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 40 ttaggatcca gctaccttgc agcacgt 27 <210> 41 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 41 taactcgagc ccaccatcga cagg 24 <210> 42 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 42 ttaggatccc gagccgtata agtattggc 29 <210> 43 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 43 taactcgagc gccggtgaag accttac 27 <210> 44 <211> 32 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 44 ttaggatcca ctactgtcag tcactttgga gc 32 <210> 45 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 45 taactcgagt accgggtttg ttgctattt 29 <210> 46 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 46 ttaggatccc acaactggta ctgcagagac 30 <210> 47 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 47 taactcgagg cgtagccctt tgatctatag 30 <210> 48 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 48 ttaggatccg gtgctatgcg tgtcgt 26 <210> 49 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 49 taactcgaga tctcctacgt ccctgtggg 29

Claims (35)

  1. 치쿤구니야 바이러스 감염을 예방하기 위한 백신으로 사용되는, CHIKV-Δ5nsP3 입자를 포함하는 약제학적 조성물로서, 여기서 상기 조성물에 존재하는 CHIKV-Δ5nsP3 입자의 적어도 30%가 서열 번호: 2의 아미노산 서열에 의해 정의된 바와 같은 E2 구조 단백질을 발현시키고; 여기서 상기 조성물에 존재하는 CHIKV-Δ5nsP3 입자의 1-50%가 서열 번호: 2의 아미노산 서열에 대해 면역원성 감소 돌연변이 E168K 또는 G55R 중 적어도 하나를 갖는 E2 구조 단백질을 발현시키는, 약제학적 조성물.
  2. 제1항에 있어서, 상기 조성물에 존재하는 CHIKV-Δ5nsP3 입자의 적어도 50%가 서열 번호: 2의 아미노산 서열에 의해 정의된 바와 같은 E2 구조 단백질을 발현시키는, 약제학적 조성물.
  3. 제1항에 있어서, 상기 조성물에 존재하는 CHIKV-Δ5nsP3 입자의 1 내지 50%가 서열 번호: 2의 아미노산 서열에 대해 적어도 하나의 면역원성 감소 돌연변이 E168K 또는 G55R 돌연변이를 갖는 E2 구조 단백질을 발현시키는, 약제학적 조성물.
  4. 제1항에 있어서, 상기 조성물에 존재하는 CHIKV-Δ5nsP3 입자의 1 내지 25%가 서열 번호: 2의 아미노산 서열에 대해 면역원성 감소 돌연변이 E168K를 갖는 E2 구조 단백질을 발현시키는, 약제학적 조성물.
  5. 제1항에 있어서, 상기 조성물에 존재하는 CHIKV-Δ5nsP3 입자의 5-30%가 서열 번호: 2의 아미노산 서열에 대해 E168K 또는 G55R 돌연변이를 갖는 E2 구조 단백질을 발현시키는, 약제학적 조성물.
  6. 제1항에 있어서, 상기 조성물이 상기 약제학적 조성물로 면역화된 마우스에서 CHIKV-Δ5nsP3에 대한 중화 항체를 유도하여 상기 중화 항체를 포함하는 혈청을 초래하고, 상기 혈청이 세포의 CHIKV 감염을, 시험관내 중화 검정에서 1:80 혈청 희석으로 적어도 50% 중화시키고, 여기서 시험관내 검정은 LR-CHIKV 바이러스 레플리콘 입자 (VRP)의 중화를 평가하는 BHK-21 세포 기반 루시퍼라제 검정인, 약제학적 조성물.
  7. 제1항에 있어서, 서열 번호: 2의 아미노산 서열에 의해 정의된 E2 구조 단백질을 발현하는 상기 CHIKV-Δ5nsP3가 서열 번호: 1의 폴리뉴클레오티드 서열에 의해 정의되는, 약제학적 조성물.
  8. 제1항에 있어서, 상기 약제학적 조성물이 서열 번호: 2의 아미노산 서열에 의해 정의된 바와 같은 E2 구조 단백질을 발현시키는 유효량의 CHIKV-Δ5nsP3 입자를 포함하며, 상기 유효량이 서열 번호: 2의 아미노산 서열에 의해 정의된 바와 같은 E2 구조 단백질을 발현시키는 적어도 102 개 CHIKV-Δ5nsP3 입자로 정의되는, 약제학적 조성물.
  9. 제1항에 있어서, 상기 약제학적 조성물이 서열 번호: 2의 아미노산 서열에 의해 정의된 바와 같은 E2 구조 단백질을 발현시키는 유효량의 CHIKV-Δ5nsP3 입자를 포함하며, 상기 유효량이 서열 번호: 2의 아미노산 서열에 의해 정의된 바와 같은 E2 구조 단백질을 발현시키는 적어도 103 개 CHIKV-Δ5nsP3 입자로 정의되는, 약제학적 조성물.
  10. 제1항에 있어서, 상기 약제학적 조성물이 서열 번호: 2의 아미노산 서열에 의해 정의된 바와 같은 E2 구조 단백질을 발현시키는 유효량의 CHIKV-Δ5nsP3 입자를 포함하며, 상기 유효량이 백신 접종된 대상체에서 치쿤구니야 바이러스 바이러스혈증(viremia)을 예방하기에 충분한 양으로 정의되는, 약제학적 조성물.
  11. 제1항에 있어서, 상기 약제학적 조성물이 1회성 약제학적 조성물인, 약제학적 조성물.
  12. 서열 번호: 2의 아미노산 서열에 의해 정의된 바와 같은 E2 구조 단백질을 발현시키는 CHIKV-Δ5nsP3 입자를 포함하는 약제학적 조성물을 생산하는 방법으로서, 상기 방법은 CHIKV-Δ5nsP3을 Vero 세포에서 서열 번호: 1에 의해 정의된 바와 같은 폴리뉴클레오티드 서열로, 바이러스 구제(rescue) 후 5회 미만의 배양으로 계대시키는 단계를 포함하는, 방법.
  13. 제12항에 있어서, 상기 서열 번호: 2의 아미노산 서열을 갖는 CHIKV-Δ5nsP3의 E2 구조 단백질에서 면역원성-감소 돌연변이의 빈도가, CHIKV-Δ5nsP3을 Vero 세포에서 서열 번호: 1에 의해 정의된 바와 같은 폴리뉴클레오티드 서열로 5회 이상의 배양으로 계대시킴으로써 수득된 CHIKV-Δ5nsP3의 E2 구조 단백질에서의 면역원성-감소 돌연변이의 빈도와 비교하여 감소되는, 방법.
  14. 제13항에 있어서, 상기 면역원성-감소 돌연변이의 빈도가 5회 이상 계대와 비교하여 적어도 10% 만큼 감소되는, 방법.
  15. 제13항에 있어서, 상기 E2 구조 단백질에 위치하는 상기 면역원성-감소 돌연변이가 G55R 및 E168K로부터 선택되는, 방법.
  16. 제13항에 있어서, 상기 E2 구조 단백질에 위치하는 면역원성-감소 돌연변이(들)가 E168K인, 방법.
  17. 제16항에 있어서, 상기 E2 구조 단백질의 상기 E168K 돌연변이의 빈도가 수확된 CHIKV-Δ5nsP3의 전체 풀에서 90% 미만인, 방법.
  18. 제12항에 있어서, 서열 번호: 1에 의해 정의된 바와 같은 폴리뉴클레오티드 서열을 갖는 CHIKV-Δ5nsP3가 Vero 세포에서 바이러스 구제 후 최대 3회 배양으로 계대되는, 방법.
  19. 제12항에 있어서, 상기 Vero 세포가 28℃ 내지 37℃의 온도에서 성장하는, 방법.
  20. 제12항에 있어서, 상기 Vero 세포가 시딩 후 제2일 내지 제5일에 감염되는, 방법.
  21. 제12항에 있어서, 상기 CHIKV-Δ5nsP3 입자가 Vero 세포 감염 후 제1일, 또는 제2일, 또는 둘 모두에 수확되는, 방법.
  22. 제12항에 있어서, 상기 CHIKV-Δ5nsP3 입자 또는 CHIKV-Δ5nsP3 입자를 포함하는 상기 약제학적 조성물을 생산하는데 사용되는 감염 다중도(MOI)가 0.1 미만인, 방법.
  23. 제1항에 있어서, 상기 약제학적 조성물이 동결건조된 형태로 제공되는, 약제학적 조성물.
  24. 제1항에 있어서, 약제학적으로 허용가능한 부형제를 추가로 포함하는 약제학적 조성물.
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