KR102711436B1

KR102711436B1 - 대장암의 치료 및 전이 억제용 조성물 및 이의 용도

Info

Publication number: KR102711436B1
Application number: KR1020210144021A
Authority: KR
Inventors: 조용범; 김현호; 김태원
Original assignee: 사회복지법인 삼성생명공익재단
Priority date: 2021-10-26
Filing date: 2021-10-26
Publication date: 2024-09-26
Anticipated expiration: 2041-10-26
Also published as: KR20230059641A; WO2023075122A1

Abstract

본 발명은 대장암(colorectal cancer)의 치료 및 전이 억제 표적으로서 AFAP1-AS1(AFAP1 Antisense RNA1) 및 MLK7-AS1(MLK7 Antisense RNA1)의 새로운 용도에 관한 것으로서, 보다 구체적으로 상기 AFAP1-AS1 및 MLK7-AS1의 발현 수준을 측정하는 것을 포함하는 대장암 진단용 키트 및 대장암의 진단방법에 관한 것이다. 또한 본 발명은 상기 AFAP1-AS1 억제제 및 MLK7-AS1 억제제를 포함하는 대장암의 치료 또는 전이 억제용 조성물에 관한 것이다.

Description

대장암의 치료 및 전이 억제용 조성물 및 이의 용도{Composition for treatment and metastasis inhibition of colorectal cancer and use thereof}

대장암은 병리학적으로는 대부분이 선암(adenocarcinoma)이며, 부위별로는 크게 결장암과 직장암으로 구분된다. 부위별 발생 빈도는 하부 대장, 즉 직장에서 발생하는 경우가 약 50%로 가장 높다. 최근의 연구 결과에 의하면, 식이습관의 변화로 한국에서도 대장암의 발생률과 그에 따른 사망률이 현저하게 증가하고 있으며, 최근 WHO에 따르면, 지난 20년간 암 진단을 받은 전체 인구수는 2000년 1,000만 명에서 2020년 1,930만 명으로 거의 2배 가량 증가했으며, 이와 같은 숫자는 추후 더 늘어날 것으로 예상하고 있다. 2020년 발간된 국립암센터 보고서(국립암센터, DATA로 보는 암 동향 보고서 2020년)에 따르면, 대장암은 위암 다음으로 많이 발생하는 암(12.1%)이며, 대장암 사망률은 전체 암종 중 세번째로 높은 것으로 보고되고 있다.

대장암을 포함하는 대부분의 암환자는 현존하는 여러 치료방법(수술, 항암제, 방사선처리)을 이용하여도 암전이(metastasis)의 발생결과로서 주로 사망하게 된다. 암 전이가 일어나기 전에 1차 종양이 관찰된 환자의 대부분은 치료 가능성이 상당히 높지만 이런 환자는 쉽게 발견하기 어려우며, 대부분의 환자에서는 1차 종양이 관찰된 시점에서 이미 암의 전이가 발견된다. 대부분의 암의 전이는 다발성, 전신성이며, 그 존재 여부의 판정도 어렵기 때문에 현재의 암 치료방법으로는 치료효능이 만족스럽지 못하다. 따라서 암의 발생 및 전이 등의 치료 및 진단을 위한 지표가 될 수 있는 바이오마커의 발굴이 절실한 실정이다.

상기와 같은 배경하에, 본 발명자들은 대장암의 성장 및 전이를 조절하는 바이오마커를 개발하고자 연구 노력한 결과, 본 발명의 AFAP1-AS1 및 MLK7-AS1을 동시에 억제하는 경우, 대장암의 성장 및 전이를 조절할 수 있음을 확인함으로써 본 발명을 완성하였다.

이에, 본 발명은 AFAP1-AS1(AFAP1 Antisense RNA1) 억제제 및 MLK7-AS1(MLK7 Antisense RNA1) 억제제를 유효성분으로 포함하는, 대장암 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공하는 것을 목적으로 한다.

또한, 본 발명은 AFAP1-AS1 및 MLK7-AS1을 포함하는, 대장암 진단용 또는 진행 진단용 마커 조성물을 제공하는 것을 다른 목적으로 한다.

또한, 본 발명은 상기 조성물을 포함하는, 대장암 진단용 또는 진행 진단용 키트를 제공하는 것을 또 다른 목적으로 한다.

또한, 본 발명은 (a) 대상체 유래의 시료에서 AFAP1-AS1 및 MLK7-AS1의 발현 수준을 측정하는 단계; 및

(b) AFAP1-AS1 및 MLK7-AS1의 발현 수준을 측정한 결과, 정상 대조군 보다 증가한 경우, 대장암의 판정 또는 대장암이 진행 중이라고 판정하는 단계를 포함하는, 대장암 또는 대장암 진행 정도의 진단을 위한 정보제공방법을 제공하는 것을 또 다른 목적으로 한다.

그러나 본 발명이 이루고자 하는 기술적 과제는 이상에서 언급한 과제에 제한되지 않으며, 언급되지 않은 또 다른 과제들은 아래의 기재로부터 당업자에게 명확하게 이해될 수 있을 것이다.

상기와 같은 본 발명의 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은, AFAP1-AS1(AFAP1 Antisense RNA1) 억제제 및 MLK7-AS1(MLK7 Antisense RNA1) 억제제를 유효성분으로 포함하는, 대장암 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.

본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 억제제는 siRNA(small interfering RNA), shRNA(short hairpin RNA), miRNA (micro RNA), 리보자임(ribozyme), DNAzyme, PNA(peptide nucleic acids), 안티센스 올리고뉴클레오티드 (Antisense oligonucleotide, ASO) 및 화합물(chemical compound)로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나일 수 있다.

본 발명의 다른 실시예 있어서, 상기 조성물은 p-AKT 및 p-ERK으로 이루어진 그룹에서 선택되는 하나 이상의 단백질 수준을 억제하는 것일 수 있다.

본 발명의 또 다른 실시예에 있어서, 상기 AFAP1-AS1(AFAP1 Antisense RNA1) 억제제는 서열번호 1, 서열번호 2 또는 서열번호 3으로 표시되는 염기서열로 이루어진 것일 수 있다.

본 발명의 또 다른 실시예에 있어서, MLK7-AS1(MLK7 Antisense RNA1) 억제제 서열번호 4, 서열번호 5 또는 서열번호 6으로 표시되는 염기서열로 이루어진 것일 수 있다.

또한, 본 발명은 AFAP1-AS1 억제제 및 MLK7-AS1 억제제를 유효성분으로 포함하는, 대장암 전이 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.

본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 조성물은 E-cadherin 단백질의 수준을 증진하는 것일 수 있다.

본 발명의 다른 실시예에 있어서, 상기 조성물은 Vimentin 단백질의 수준을 억제하는 것일 수 있다.

본 발명의 또 다른 실시예에 있어서, 상기 AFAP1-AS1 억제제 및 MLK7-AS1 억제제는 대장암의 세포 이동 및 침윤을 억제하는 것일 수 있다.

또한, 본 발명은 AFAP1-AS1 및 MLK7-AS1을 포함하는, 대장암 진단용 또는 진행 진단용 마커 조성물을 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 조성물을 포함하는, 대장암 진단용 또는 진행 진단용 키트를 제공한다.

(b) AFAP1-AS1 및 MLK7-AS1의 발현 수준을 측정한 결과, 정상 대조군 보다 증가한 경우, 대장암의 판정 또는 대장암이 진행 중이라고 판정하는 단계를 포함하는, 대장암 또는 대장암 진행 정도의 진단을 위한 정보제공방법을 제공한다.

본 발명자들은 대장암 환자에서 특이적으로 높게 발현되고 있는 asRNA인 AFAP1-AS1 및 MLK7-AS1을 발굴하였으며, 상기 AFAP1-AS1 및 MLK7-AS1를 동시에 억제하는 억제제를 처리하는 경우, 대장암의 성장 및 전이를 효과적으로 억제할 수 있음을 확인하였다. 이를 통해, 본 발명의 바이오마커는 대장암의 진단, 진행 수준 진단, 치료 및 전이 억제 등의 분야에 폭넓게 활용될 수 있을 것으로 기대된다.

단, 본 발명의 효과는 상기 효과로 한정되는 것은 아니며, 본 발명의 상세한 설명 또는 청구범위에 기재된 발명의 구성으로부터 추론 가능한 모든 효과를 포함하는 것으로 이해되어야 한다.

도 1은 본 발명의 asRNA를 발굴하기 위해 진행한 실험방법을 나타낸 모식도이다.
도 2는 RNA 시퀀싱 데이터 분석을 통해 확인한, 대장암 환자 샘플에서 상이하게 발현하는 9개의 asRNA를 나타낸 결과이다.
도 3은 asRNA의 발현 수준에 따른 전체 생존율(total survival rate)를 나타낸 결과로서, 도 3a는 AFAP1-AS1 및 MLK7-AS1의 발현수준에 따른 생존율을 나타낸 결과이고, 도 3b는 AFAP1-AS1 및 MLK7-AS1을 동시에 억제했을때의 생존율을 나타낸 결과이다.
도 4는 정상 세포군과 원발 대장암 세포에서 AFAP1-AS1 및 MLK7-AS1의 발현을 확인한 것으로서, 도 4a는 43명의 대장암 환자 샘플에서 상대적인 AFAP1-AS1 및 MLK7-AS1의 발현수준을 확인한 결과이고, 도 4b는 원발성 대장암 환자 샘플에서 상대적인 AFAP1-AS1 및 MLK7-AS1의 발현수준을 확인한 결과이며, 도 4c는 정상세포주 및 대장암 세포주(DLD-1 및 HT29)에서 상대적인 AFAP1-AS1 및 MLK7-AS1의 발현 수준을 확인한 결과이다.
도 5는 AFAP1-AS1 및 MLK7-AS1 억제제를 처리했을 때, 대장암의 생장, 전이 등에 미치는 효과를 확인한 결과로서, 도 5a는 AFAP1-AS1 및 MLK7-AS1 억제제인 siRNA의 AFAP1-AS1 및 MLK7-AS1 녹다운 효과를 확인한 결과이고, 도 5b 내지 도 5g는 AFAP1-AS1 및 MLK7-AS1 억제제를 동시 처리했을 때 대장암 세포에 미치는 영향을 구체적으로 확인한 결과로서, 도 5b는 대장암 세포 생장 억제 효과, 도 5c는 콜로니 형성능 억제 효과, 도 5d는 증식관련 인자인 p-AKT 및 p-ERK 발현 억제 효과, 도 5e는 침윤능 억제효과, 도 5f는 이동능 억제효과, 도 5g는 EMT 관련 인자의 발현 수준 조절 효과를 확인한 결과이다.
도 6은 생체(in vivo)에서 AFAP1-AS1 및 MLK7-AS1 억제제를 처리했을 때, 대장암의 생장, 전이 등에 미치는 효과를 확인한 결과로서, DLD-1 세포를 주입하여 전이성 대장암 마우스 모델을 제작한 다음, AFAP1-AS1 및 MLK7-AS1 억제제 처리한 다음, 종양의 부피(도 6a), 종양의 중량(도 6b) 및 종양 세포의 전이능(도 6c)을 확인한 결과이다.

본 발명자들은 본 발명의 AFAP1-AS1 및 MLK7-AS1을 동시에 억제하는 경우, 대장암의 성장 및 전이를 조절할 수 있음을 확인하였는바, 이로써 본 발명을 완성하게 되었다.

이에, 본 발명은 AFAP1-AS1(AFAP1 Antisense RNA1) 억제제 및 MLK7-AS1(MLK7 Antisense RNA1) 억제제를 유효성분으로 포함하는, 대장암 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.

본 발명에 있어서, AFAP1-AS1(AFAP1 Antisense RNA1)은 asRNA로서, 서열번호 7로 이루어지는 것일 수 있으며, MLK7-AS1은 asRNA로서, 서열번호 8로 이루어지는 것일 수 있다.

본 발명에서 대상으로 하는 질환인 "대장암 (colorectal cancer; CRC)"은 직장암, 결장암 및 항문암을 통칭하는 것을 의미하며, 본 발명의 바이오마커는 대장암의 발생, 발전 및/또는 전이에 대한 지표가 될 수 있으며, 대장암의 발생, 발전 및/또는 전이의 진단에 이용될 수 있다.

본 발명에 있어서, 상기 억제제는 siRNA(small interfering RNA), shRNA(short hairpin RNA), miRNA(micro RNA), 리보자임(ribozyme), DNAzyme, PNA(peptide nucleic acids), 안티센스 올리고뉴클레오티드(Antisense oligonucleotide, ASO) 및 화합물(chemical compound)로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나일 수 있다.

안티센스 올리고뉴클레오티드는 특정 mRNA의 서열에 상보적인 핵산 서열을 함유하고 있는 DNA 또는 RNA 또는 이들의 유도체를 의미하고, mRNA 내의 상보적인 서열에 결합하여 mRNA의 단백질로의 번역, 세포질 내로의 전위(translocation), 성숙(maturation) 또는 다른 모든 전체적인 생물학적 기능에 대한 필수적인 활성을 저해할 수 있다.

siRNA(small interfering RNA)는 특정 mRNA의 절단을 통하여 RNAi(RNA 간섭) 현상을 유도할 수 있는 짧은 이중사슬 RNA를 의미한다. 표적 유전자의 mRNA와 상동인 서열을 가지는 센스 RNA 가닥과 이와 상보적인 서열을 가지는 안티센스 RNA 가닥으로 구성된다. siRNA는 표적 유전자의 발현을 억제할 수 있기 때문에 효율적인 유전자 녹다운 방법으로서 또는 유전자 치료의 방법으로 제공될 수 있다. 본 발명의 siRNA는 AFAP1-AS1을 타겟으로 하는, 서열번호 1, 서열번호 2 또는 서열번호 3으로 표시되는 염기서열로 이루어지는 것이거나, MLK7-AS1을 타겟으로 하는, 서열번호 4, 서열번호 5 또는 서열번호 6으로 표시되는 염기서열로 이루어지는 것일 수 있다.

상기 AFAP1-AS1을 타겟으로 하는 siRNA는 서열번호 1, 서열번호 2 또는 서열번호 3과 70% 이상, 80% 이상, 90% 이상 바람직하게는 95% 이상, 96% 이상, 97% 이상, 98% 이상, 99% 이상 또는 100%의 서열 상보성을 갖는 것일 수 있으며, 상기 MLK7-AS1을 타겟으로 하는 siRNA는 서열번호 4, 서열번호 5 또는 서열번호 6과 70% 이상, 80% 이상, 90% 이상 바람직하게는 95% 이상, 96% 이상, 97% 이상, 98% 이상, 99% 이상 또는 100%의 서열 상보성을 갖는 것일 수 있다.

본 발명에서 사용되는 용어 "예방"은, 본 발명에 따른 약학적 조성물의 투여에 의해 대장암에 의한 증상을 억제시키거나 발병을 지연시키는 모든 행위를 의미한다.

본 발명에서 사용되는 용어 "치료"는, 본 발명에 따른 약학적 조성물의 투여에 의해 대장암에 대한 증세가 호전되거나 이롭게 변경되는 모든 행위를 의미한다.

본 발명의 약학적 조성물은 대장암 세포의 생장을 억제할 수 있다. 구체적으로 p-AKT 및 p-ERK으로 이루어진 그룹에서 선택되는 하나 이상의 단백질 수준을 억제하는 것일 수 있다.

본 발명의 다른 양태로서, 본 발명은 AFAP1-AS1 억제제 및 MLK7-AS1 억제제를 유효성분으로 포함하는, 대장암 전이 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.

본 발명의 약학적 조성물은 대장암 세포의 상피간엽이행(epithelial to mesenchymal transition, EMT)을 억제할 수 있다. 구체적으로, 상기 상피간엽이행의 억제는 비멘틴(Vimentin, VIM)의 발현을 증진시키거나, N-cad(N-cadherin) 단백질의 발현을 억제하는 것일 수 있다.

본 발명에 있어서, "상피간엽이행(epithelial mesenchymal transition)"은 상피세포가 세포의 극성 및 세포 간 부착성을 잃고, 이동상 및 침습성을 얻음으로써 간엽 줄기세포가 되는 과정을 의미하며, 이들은 다양한 세포 유형으로 분화할 수 있는 다능성 기질세포(stromal cell)이다. 상피 간엽 이행은 중배엽 형성과 신경관 형성을 포함한 수많은 발달 과정에 필수적이며, 상처 치유, 장기 섬유화증 및 암 전이 과정에서 관찰된다.

또한, 본 발명은 상기 약학적 조성물을 개체에 투여하는 단계를 포함하는 대장암의 예방 또는 치료 방법을 제공한다.

본 발명에서 사용되는 용어 "투여"는 임의의 적절한 방법으로 개체에게 소정의 본 발명의 조성물을 제공하는 것을 의미한다.

본 발명에서 사용되는 용어 "개체"란 질병의 치료를 필요로 하는 대상을 의미하고, 보다 구체적으로는, 인간 또는 비-인간인 영장류, 생쥐(mouse), 개, 고양이, 말, 및 소 등의 포유류를 의미한다.

또한, 본 발명은 상기 약학적 조성물의 대장암의 예방 또는 치료 용도를 제공한다.

본 발명자들은 구체적인 실시예를 통하여, 본 발명의 AFAP1-AS1 및 MLK7-AS1을 억제하는 경우, 대장암의 발병 및 전이 등을 치료할 수 있음을 확인하였다.

본 발명의 일실시예에 있어서, 본 발명자들은 대장암 환자 샘플에서 대장암 환자 특이적으로 AFAP1-AS1 및 MLK7-AS1의 발현이 높게 나타남을 확인하였다(실시예 2 참조)

본 발명의 다른 실시예에 있어서, 본 발명자들은 대장암 세포인 DLD-1 및 HT29세포에 AFAP1-AS1 및 MLK7-AS1를 동시에 억제했을 때 대장암의 증식과 관련된 인자인 p-AKT 및 p-ERK의 발현 수준을 유의하게 감소시키고, 이를 통해 대장암의 생장을 유의하게 억제할 수 있음을 확인하였으며(실시예 3-1 참조), 상기 asRNA를 동시에 억제하는 경우, 대장암 세포의 EMT를 억제하여, 대장암의 전이를 유의하게 억제할 수 있음을 확인하였다(실시예 3-2 참조).

상기와 같은 결과를 통하여, 본 발명자들은 AFAP1-AS1 및 MLK7-AS1를 동시에 억제하는 경우, 대장암의 발병, 성장, 전이 등을 유의하게 억제할 수 있음을 구체적인 실험을 통해 확인하였다.

한편, 본 발명에서 "약학적 조성물"은 질병의 예방 또는 치료를 목적으로 제조된 것을 의미하며, 각각 통상의 방법에 따라 다양한 형태로 제형화하여 사용될 수 있다. 예컨대, 산제, 과립제, 정제, 캡슐제, 현탁액, 에멀젼, 시럽 등의 경구형 제형으로 제형화할 수 있고, 외용제, 좌제 및 멸균 주사용액의 형태로 제형화하여 사용할 수 있다.

본 발명에 따른 약제학적 조성물은 약학적으로 허용되는 담체를 추가로 포함할 수 있다. 상기 약학적으로 허용되는 담체는 제제 시에 통상적으로 이용되는 것으로서, 식염수, 멸균수, 링거액, 완충 식염수, 사이클로덱스트린, 덱스트로즈 용액, 말토덱스트린 용액, 글리세롤, 에탄올, 리포좀 등을 포함하지만 이에 한정되지 않으며, 필요에 따라 항산화제, 완충액 등 다른 통상의 첨가제를 더 포함할 수 있다. 또한 희석제, 분산제, 계면활성제, 결합제, 윤활제 등을 부가적으로 첨가하여 수용액, 현탁액, 유탁액 등과 같은 주사용 제형, 환약, 캡슐, 과립, 또는 정제로 제제화할 수 있다. 적합한 약학적으로 허용되는 담체 및 제제화에 관해서는 Remington's Pharmaceutical Sciences (19th edition, 1995)에 개시되어 있는 방법을 이용하여 각 성분에 따라 바람직하게 제제화할 수 있다. 본 발명의 약제학적 조성물은 제형에 특별한 제한은 없으나 주사제, 흡입제, 피부 외용제, 또는 경구 섭취제 등으로 제제화할 수 있다.

본 발명의 약학적 조성물은 목적하는 방법에 따라 경구 투여하거나 비경구투여(예를 들어, 정맥 내, 피하, 복강내 또는 국소에 적용)할 수 있으며, 투여량은 환자의 상태 및 체중, 질병의 정도, 약물형태, 투여경로 및 시간에 따라 다르지만, 당업자에 의해 적절하게 선택될 수 있다.

본 발명의 약학적 조성물은 약학적으로 유효한 양으로 투여한다. 본 발명에 있어서 "약학적으로 유효한 양"은 의학적 치료에 적용 가능한 합리적인 수혜/위험 비율로 질환을 치료하기에 충분한 양을 의미하며, 유효용량 수준은 환자의 질환의 종류, 중증도, 약물의 활성, 약물에 대한 민감도, 투여 시간, 투여 경로 및 배출비율, 치료기간, 동시 사용되는 약물을 포함한 요소 및 기타 의학 분야에 잘 알려진 요소에 따라 결정될 수 있다.

본 발명에 따른 약학적 조성물은 개별 치료제로 투여하거나 다른 치료제와 병용하여 투여될 수 있고 종래의 치료제와는 순차적 또는 동시에 투여될 수 있으며, 단일 또는 다중 투여될 수 있다. 상기 요소들을 모두 고려하여 부작용 없이 최소한의 양으로 최대 효과를 얻을 수 있는 양을 투여하는 것이 중요하며, 이는 당업자에 의해 용이하게 결정될 수 있다.

본 발명의 또 다른 양태에 있어서, 본 발명은 AFAP1-AS1 및 MLK7-AS1을 포함하는, 대장암 진단용 또는 진행 진단용 마커 조성물을 제공한다.

본 발명의 또 다른 양태에 있어서, 본 발명은 상기 마커 조성물을 포함하는, 대장암 진단용 또는 진행 진단용 키트를 제공한다.

본 발명의 또 다른 양태에 있어서, (a) 대상체 유래의 시료에서 AFAP1-AS1 및 MLK7-AS1의 발현 수준을 측정하는 단계; 및

이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 바람직한 실시예를 제시한다. 그러나 하기의 실시예는 본 발명을 보다 쉽게 이해하기 위하여 제공되는 것일 뿐, 하기 실시예에 의해 본 발명의 내용이 한정되는 것은 아니다.

[실시예]

실시예 1. 실험 방법 및 준비

1-1. 환자 및 데이터 수집

삼성서울병원에서 수술받은 대장암환자의 정상조직, 암조직을 이용해서 small RNA 및 RNA 시퀀싱을 진행하였으며, 삼성서울병원에 기록되어있는 임상데이터를 활용하여 분석하였다.

1-2. 세포배양

American Type Culture Collection(ATCC, Manassas, VA)에서 DLD-1 및 HT29 대장암 세포를 구매하고 RPMI 1640 (Gibco, Grand Island, NY, USA)에 10% FBS (Gibco, Grand Island, NY, USA)와 1% 페니실린-스트렙토마이신 (Gibco, Grand Island, NY, USA)을 넣고 37 ℃ 5% CO2 배양기에서 배양하였다.

1-3. 세포 증식 분석

세포 증식은 water-soluble tetrazolium salt인 WST-1(Roche, Indianapolis, IN)의 대사 전환을 평가함으로써 세포 생존력을 결정하는 형광파장 분석을 사용하여 3회 측정되었다. 생존력은 대장암 세포에서 다양한 시간에 평가되었고, 분석은 WST-1을 세포배양배지에 직접 첨가하여 37 ℃에서 60분 동안 배양하였다. 흡광도는 파장 450nm에서 측정하였다. 세 가지 실험이 각 실험 조건에 대해 수행되었다.

1-4. siRNA 형질주입

siRNA는 bioneer(한국)로부터 구입하였다. Lipofectamine RNAiMAX (Invitrogen)를 사용하여 형질주입 실험을 진행하였고, 60 dish 1개당 1x10⁵ 세포를 사용하였으며, 형질주입 실험 방법은 Lipofectamine 제조사의 지시에 따라 진행하였다.

1-5. 세포이동 및 침윤 분석

세포 이동을 확인하고자 세포 단층에 상처를 입힌 후 0시간과 48시간에 상처를 낸 세포 단층의 폭을 촬영하여 세포 이동률을 확인하였다. 또한 세포 침윤을 확인하고자 transwell 분석을 진행하였다.

1-6. 세포용해 및 Western blot 분석

전체 세포 추출물을 얻기 위해 Pro-prep buffer (Intron Biotechnology, Seoul, Korea)에 protease inhibitor와 phosphatase inhibitor를 포함하여 세포를 용해시켰다. 10-60μg의 단백질 추출물을 SDS-PAGE로 분석하고 PVDF membrane으로 옮긴 후 BSA와 skim milk를 사용하여서 blocking 및 antibody를 반응시켰다. phospho ERK (# 612358 BD), phospho AKT (#4060, Cell Signaling), Ecadherin(#3195, Cell Signaling), Vimentin(#MA5-11883, Thermo Fisher Scientific) 그리고 β-actin (#3700, Cell Signaling)을 1차 항체로 사용하였고, 1차 항체 반응 후에 horseradish peroxidase (Santa-Cruz)에 접합된 2차 항체를 반응시켰다. β-actin은 western blot 분석에서 대조군으로 사용되었다.

1-7. 마우스 암 성장 및 전이모델

암 성장모델은 BALB/c Nude mouse의 옆구리쪽 피하에 암세포를 이식하는 방법으로 구축한다. 크기의 측정은 측정용 자를 이용하여서 암조직의 가로와 세로를 측정하여 (단축 x 단축 x 장축 / 2) 공식을 이용하여 부피를 기록한다. 실험 종료후에는 암조직의 무게를 측정한다. 암 전이 모델은 암세포를 비장에 주입한 후 간전이 여부를 확인하는 방법으로 진행한다.

실시예 2. 대장암 환자 샘플에서 신규한 asRNA의 발현 확인

대장암(colorectal cancer, CRC)환자에서 변화한 발현수준을 보여주는 asRNA를 탐색하기 위하여, 대조를 위한 정상 샘플 및 43명의 대장암 환자 샘플에 대한 RNA 및 small RNA 시퀀싱 및 추가적인 실험을 수행하였고, 구체적인 실험 진행방식은 도 1에 나타내었다. 시퀀싱을 수행하여, 원발성 대장암(primary colorectal cancer) 환자에서 도 2에 나타낸 바와 같이, 9개의 DE(differentially expressed) asRNA(fold change >2, p<0.05)를 선발해 내었으며, 이렇게 선발해낸 asRNA가 임상에 미치는 영향을 구체적으로 파악하기 위해, 시퀀싱 데이터에서 생존 분석을 수행하였다.

그 결과, asRNA 중, AFAP1-AS1과 MLK7-AS1은 전체 생존 분석(overall survival analysis)에서 변화된 경향성을 보여주었으며, 보다 구체적으로 상기 2개의 asRNA에 대해 생존분석을 별도로 수행했을 때, 도 3a에 나타낸 바와 같이, AFAP1-AS1 또는 MLK7-AS1 asRNA를 높게 발현하는 그룹은 낮은 asRNA의 발현을 보여주는 그룹보다 나쁜 예후를 보여주었으며, 이와 같은 현상은 AFAP1-AS1 또는 MLK7-AS1 각각 높게 발현하는 경우보다, 도 3b에 나타낸 바와 같이, 상기 2가지 asRNA를 동시에 높게 발현하는 경우에 더 나쁜 생존예후를 보여줌을 구체적으로 확인할 수 있었다. 이와 같은 결과를 종합하여 본 발명자들은 모든 asRNA 중에서, 대장암의 예후와 관련된 asRNA는 AFAP1-AS1 및 MLK7-AS1임을 확인하였고, 본 발명자들은 상기와 같은 결과를 통해, 상기 asRNA를 단독으로 억제하는 경우 보다, 둘 모두를 타겟으로 하여 동시에 억제하는 경우, 현저한 대장암 증상 개선효과가 있음을 확인하였고, 상기 asRNA를 동시에 억제한 다음, 이에 대한 구체적인 기능 연구(functional study)를 수행하였다.

환자 조직에 대한 RNA 시퀀싱 데이터 분석을 수행했을 때, 도 4a에 나타낸 바와 같이, AFAP1-AS1 및 MLK7-AS1의 발현 수준이 정상조직보다 원발성 대장암에서 더 높게 나타났다(도 4a, 왼쪽 패널: p=0.019, 오른쪽 패널: p=0.0002). 상기와 같은 결과를 확인하기 위하여 다른 환자샘플 및 이와 일치하는 정상 샘플(n=14)에 대한 q-RT PCR을 수행하였다. 그 결과, 도 4b에 나타낸 바와 같이, AFAP1-AS1 및 MLK7-AS1의 RNA 발현은 각각 정상 조직 샘플보다, 원발성 대장암 환자에서 더 높게 나타남을 확인하였다 (그림 4b, 왼쪽 패널: p=0.0493, 오른쪽 패널: p<0.0001).

상기 AFAP1-AS1 및 MLK7-AS1의 생물학적 효과를 평가하기 위하여, 2개의 대장암 세포주(현미부수체 불안정성(Microsatellite instability, MSI) 양성 DLD-1 세포주; 및 현미부수체 안정성(microsatellite stability, MSS) 양성 HT29 세포주)와 정상 상피 세포주(CCD841 세포주)를 활용한 기능평가를 수행하였다. 그 결과, 도 4c에 나타낸 바와 같이, AFAP1-AS1 asRNA의 발현이 정상 상피세포주보다 대장암 세포주인 DLD-1(p=0.0010) 및 HT29(p<0.0001)에서 더 높게 나타났으며(도 4c 왼쪽 패널), MLK7-AS1 발현 또한, 정상 상피 세포주에서보다 대장암 세포주인 DLD-1(p=0.0011) 및 HT29(p<0.0001)에서 더 높게 나타났다(도 4c 오른쪽 패널).

실시예 3. 대장암 세포에서 asRNA 억제에 따른 효과 확인

상기 실시예 2에서 대장암 환자 및 세포주에서 높은 발현 수준을 보여준 asRNA인 AFAP1-AS1 및 MLK7-AS1의 대장암에서의 역할을 구체적으로 확인하기 위하여, AFAP1-AS1 siRNA(si-AFAP1-AS1 # 1 [5’-3': GUCUCAGCCGAAUGACUGA, 서열번호 1], si-AFAP1-AS1 # 2 [5’-3': GGGCUUCAAUUUACAAGCA, 서열번호 2] 및 si-AFAP1-AS1 # 3 [5’-3': CCUAUCUGGUCAACACGUA, 서열번호 3]) MLK7-AS1 siRNA(si-MLK7-AS1 # 1 [5’-3': UGAGAAACUAGUACAGUA, 서열번호 4], si-MLK7-AS1 # 2 [5’-3': GAAACUUGGGCAAAACAAU, 서열번호 5] 및 si-MLK7-AS1 # 3 [5’-3': CACAAGUCUCAGAAGAGUA, 서열번호 6])를 사용하여 실험을 진행하였다. 상기 siRNA 들은 도 5a에 나타낸 바와 같이, 타겟 asRNA의 발현수준을 유의적으로 억제할 수 있음을 확인하였다.

3-1. AFAP1-AS1 및 MLK7-AS1의 동시 억제에 따른 대장암 세포 증식 억제 효과 확인

AFAP1-AS1 및 MLK7-AS1 asRNA와 대장암 세포의 증식과의 상관성을 분석하기 위하여, 대장암 세포주인 DLD-1 및 HT29 세포주에 상기 asRNA에 대한 siRNA를 각각 처리하고, WST-1 세포 증식 분석(WST-1 cell proliferation assay)를 수행했을 때, 도 5b에 나타낸 바와 같이, AFAP-AS1 및 MLK7-AS1을 동시에 녹다운 했을 때, 대장암 세포주인 DLD-1 및 HT29 세포주의 생존력이 감소됨을 확인하였고, 이와 동시에, 대장암 세포주의 콜로니 형성능(도 5c)도 감소하는 것을 확인하였다. 상기와 같은 결과가 본 발명의 siRNA 처리에 의해 발생하는지를 구체적으로 확인하기 위하여, siRNA를 처리하여 AFAP1-AS1 및 MLK7-AS1를 녹다운 시킨 다음, 증식 관련 유전자로 알려진 p-AKT 및 p-ERK의 발현 수준을 웨스턴 블롯팅(western blotting)을 통해 확인한 결과, 도 5d에 나타낸 바와 같이, p-AKT 및 p-ERK의 발현 수준이 감소함을 확인하였고, 이를 통해 본 발명자들은 본원발명의 asRNA 억제제가 증식 관련 유전자의 발현을 억제함을 통해, 대장암 세포의 증식을 유의적으로 억제할 수 있음을 구체적으로 확인하였다.

3-2. AFAP1-AS1 및 MLK7-AS1 동시 억제에 따른 대장암 세포 전이 억제 효과 확인

AFAP1-AS1 및 MLK7-AS1 asRNA가 대장암의 전이와 관련이 있는지 여부를 추가로 확인하기 위하여, 본 발명자는 대장암 세포주인 DLD-1 및 HT29에서 상기 asRNA를 녹다운 하고, 대장암 세포주의 침입 및 이동능을 확인하였다. 트랜스웰 분석(transwell analysis)를 수행했을 때, 도 5e에 나타낸 바와 같이, 세포의 침습 능력이 상기 AFAP1-AS1 및 MLK7-AS1 asRNA를 동시에 억제했을 때, 유의한 수준으로 감소하는 것을 확인하였고, 상처 치유 분석(wound healing assay)를 수행하여 세포의 이동성을 확인했을 때에도, 도 5f에 나타낸 바와 같이, AFAP1-AS1 및 MLK-AS1 asRNA를 동시에 억제했을 때, 세포의 이동성이 유의적으로 억제되는 것을 확인하였다. 상기와 같은 결과가 본 발명의 siRNA 처리에 의해 발생하는지를 구체적으로 확인하기 위하여, siRNA를 처리하여 AFAP1-AS1 및 MLK7-AS1를 녹다운 시킨 다음, EMT 경로와 관련된 유전자인 E-cadherin 및 Vimentin의 발현 수준을 웨스턴 블롯팅을 통해 확인하였다. 그 결과, 도 5g에 나타낸 바와 같이, E-Cadherin의 발현 수준은 증가하고, Vimentin의 발현 수준은 감소하는 것을 확인하였다.

상기와 같은 결과를 통해 본 발명자들은 대장암 세포주에서 AFAP1-AS1 및 MLK-AS1 asRNA를 동시에 억제했을 때, 세포의 이동 및 침입을 억제할 수 있다는 사실을 구체적으로 확인하였다.

실시예 4. 대장암 마우스 모델에서 asRNA 억제에 따른 효과 확인

상기 실시예 2 및 실시예 3의 결과를 통해, 본 발명자들은 AFAP1-AS1 및 MLK7-AS1 asRNA를 억제하는 경우, 시험관 내(in vitro)에서 대장암의 성장 및 전이를 억제하는 것을 확인하였고, 이와 같은 AFAP1-AS1 및 MLK7-AS1 asRNA 억제제의 효과가 생체 내(in vivo)에서도 동일한 효과를 나타내는지 여부를 확인하기 위하여, 대장암 세포인 DLD-1을 세포에 피하 주입하는 방식을 통해, 전이성 대장암 마우스 모델(대조군)을 제작하였고, siRNA에 의해 AFAP1-AS1 및 MLK7-AS1 asRNA이 녹다운된 DLD-1 세포를 피하 주입하여 상기 asRNA이 녹다운된 전이성 대장암 마우스 모델(실험군)을 제작하였다.

상기 마우스 모델의 종양 부피 및 중량을 확인한 결과, 도 6a에 나타낸 바와 같이, 상기 AFAP1-AS1 및 MLK7-AS1 asRNA이 동시에 녹다운된 마우스 모델의 경우, 대조군에 비해 현저하게 작은 종양 부피를 관찰할 수 있었고, 종양 중량의 경우에도, 도 6b에 나타낸 바와 같이, AFAP1-AS1 및 MLK7-AS1 asRNA를 동시에 억제하는 경우, 그 중량이 대조군에 비해 현저하게 감소되는 것을 확인할 수 있었다.

또한, 도 6c에 나타낸 바와 같이, 상기 AFAP1-AS1 및 MLK7-AS1 asRNA가 동시에 억제된 마우스 모델에서 대장암 조직을 관찰했을 때, 전이성이 감소됨을 확인할 수 있었다.

상기 진술한 본 발명의 설명은 예시를 위한 것이며, 본 발명이 속하는 기술분야의 통상의 지식을 가진 자는 본 발명의 기술적 사상이나 필수적인 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 쉽게 변형이 가능하다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 이상에서 기술한 실시예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적이 아닌 것으로 이해해야만 한다.

<110> SAMSUNG LIFE PUBLIC WELFARE FOUNDATION <120> Composition for treatment and metastasis inhibition of colorectal cancer and use thereof <130> PD21-018 <160> 6 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 19 <212> RNA <213> si-AFAP1-AS1 # 1 <400> 1 gucucagccg aaugacuga 19 <210> 2 <211> 19 <212> RNA <213> si-AFAP1-AS1 # 2 <400> 2 gggcuucaau uuacaagca 19 <210> 3 <211> 19 <212> RNA <213> si-AFAP1-AS1 # 3 <400> 3 ccuaucuggu caacacgua 19 <210> 4 <211> 18 <212> RNA <213> si-MLK7-AS1 # 1 <400> 4 ugagaaacua guacagua 18 <210> 5 <211> 19 <212> RNA <213> si-MLK7-AS1 # 2 <400> 5 gaaacuuggg caaaacaau 19 <210> 6 <211> 19 <212> RNA <213> si-MLK7-AS1 # 3 <400> 6 cacaagucuc agaagagua 19

Claims

AFAP1-AS1(AFAP1 Antisense RNA1) siRNA 및 MLK7-AS1(MLK7 Antisense RNA1) siRNA를 유효성분으로 포함하는, 대장암 예방 또는 치료용 약학적 조성물로서, 상기 AFAP1-AS1 siRNA는 서열번호 1로 표시되는 염기서열로 이루어진 것이고, 상기 MLK7-AS1 siRNA는 서열번호 4, 서열번호 5 또는 서열번호 6으로 표시되는 염기서열로 이루어진 것인, 대장암 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
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제1항에 있어서,
상기 조성물은 p-AKT 및 p-ERK으로 이루어진 그룹에서 선택되는 하나 이상의 단백질 수준을 억제하는 것인, 대장암 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
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AFAP1-AS1 siRNA 및 MLK7-AS1 siRNA를 유효성분으로 포함하는, 대장암 전이 예방 또는 치료용 약학적 조성물로서, 상기 AFAP1-AS1 siRNA는 서열번호 1로 표시되는 염기서열로 이루어진 것이고, 상기 MLK7-AS1 siRNA는 서열번호 4, 서열번호 5 또는 서열번호 6으로 표시되는 염기서열로 이루어진 것인, 대장암 전이 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
제6항에 있어서,
상기 조성물은 E-cadherin 단백질의 수준을 증진하는 것인, 대장암 전이 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
제6항에 있어서,
상기 조성물은 Vimentin 단백질의 수준을 억제하는 것인, 대장암 전이 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
제6항에 있어서,
상기 AFAP1-AS1 siRNA 및 MLK7-AS1 siRNA는 대장암의 세포 이동 및 침윤을 억제하는 것을 특징으로 하는, 대장암 전이 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
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