KR102703242B1 - 캘빈회로 유전자가 도입된 대장균의 이산화탄소 고정 능력 향상을 위한 배양 방법 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 캘빈회로 유전자가 도입된 재조합 미생물에 의한 효율적인 이산화탄소 고정 방법 및 유용한 화학물질의 생산 방법을 제공한다.
Description
본 발명은 캘빈회로 유전자가 도입된 재조합 미생물을 사용하여 환경의 이산화탄소를 고정함으로써 이산화탄소를 감소시키는 대사 공학 기술, 특히 상기 재조합 미생물의 이산화탄소의 저감 능력을 최적화할 수 있도록 하는 배양방법에 관한 것이다.
수세기 동안 인간은 화석 연료를 개발하고 사용해 왔으며, 무의식적으로 이산화탄소를 대기로 방출하여 왔다. 대기 중 이산화탄소의 증가는 지구온난화를 포함한 심각한 기후변화를 일으키고 있다. 그럼에도 불구하고, 저렴하고 풍부한 석탄의 이점으로 인해서 화석 연료에 대한 의존도는 줄어들지 못하고 있으며, 그에 따라 이산화탄소 배출량도 증가되고 있다.
현재 이산화탄소에 의한 기후 변화를 해결하기 위해 주목받고 있는 유망한 솔루션 중의 하나는 생물학적 메커니즘을 활용한 탄소 고정 및 격리의 대사공학적 기술의 개발이다. 미생물을 사용한 생물학적 이산화탄소 격리는 환경 친화적이고 경제적으로 효율적이고 지속 가능한 동시에 부가가치 화학물질을 생산할 수 있다. 특히 캘빈회로 경로를 통해 이산화탄소가 당 및 화학소재로 형성되므로, 캘빈회로 경로에서 작용하는 루비스코(Rubisco) 유전자의 과발현을 통해서 이산화탄소 고정 효율을 증가시키는 연구가 수행되고 있다. 대기 또는 수중의 이산화탄소는 식물 또는 미생물의 광합성 작용에 의해 유기물질로 고정된다. 몇몇 광합성 세균들은 이산화탄소가 유일한 탄소원일 때, 세포의 탄소원을 공급하기 위하여 캘빈-벤슨-배스햄 (Calvin-Benson-Bassham: CBB)의 환원성 펜타오스 포스페이트 경로를 작동시킨다.
이산화탄소 고정을 위해 캘빈밴슨 회로를 사용하는 박테리아는 이산화탄소를 ATP 뿐만 아니라 바이오 연료 및 바이오매스 형태의 에너지로 전환할 수 있다. 대사공학적인 전략에 의한 미생물의 개선된 이산화탄소 격리 능력은 더 높은 화학적인 생합성, 생산성으로 이어진다. 이러한 이산화탄소 고정 경로의 효율성은 이산화탄소 고정 경로의 촉매 특성을 개선함으로써 향상될 수 있다.
본 발명자들의 연구실에서는 광합성 박테리아인 로도박터 스페로이드로부터 분리된 캘빈회로 유전자를 캘빈회로를 가지고 있지 않은 대장균에 도입하여 비광합성 조건에서 이산화탄소의 고정이 가능하도록 재조합 미생물을 제조하였다 (특허 제1639031호 참조). 이러한 재조합 미생물에 의한 이산화탄소 고정 효율을 최대화시킬 수 있는 방법의 개발이 필요하다.
따라서, 본 발명의 일 목적은 캘빈회로 유전자가 도입된 재조합 미생물에 의한 효율적인 이산화탄소 고정 방법을 제공하는 것이다.
또한, 본 발명의 일 목적은 캘빈회로 유전자가 도입된 재조합 미생물에 의한 유용한 화학물질을 효율적으로 생산하는 방법을 제공하는 것이다.
그러나 본 발명이 해결하고자 하는 과제는 이상에서 언급한 과제로 제한되지 않으며, 언급되지 않은 또 다른 과제들은 아래의 기재로부터 당업자에게 명확하게 이해될 수 있을 것이다.
상기와 같은 과제를 해결하기 위하여 본 발명은 일 측면에서, 캘빈-벤슨-배스햄 회로(Calvin-Benson-Bassham cycle)를 코딩하는 유전자를 포함하는 재조합 미생물을 16~30 ℃에서 배양하는 단계를 포함하는, 상기 재조합 미생물에 의한 이산화탄소 고정 방법을 제공한다.
또한 본 발명은 일 측면에서, 캘빈-벤슨-배스햄 회로(Calvin-Benson-Bassham cycle)를 코딩하는 유전자를 포함하는 재조합 미생물을 16~30 ℃에서 배양하는 단계를 포함하는, 상기 재조합 미생물에 의한 유용물질의 생산 방법을 제공한다.
본 발명에서 제공하는 방법에 따르면, 캘빈-벤슨-배스햄 회로를 코딩하는 유전자를 포함하는 재조합 미생물에 의한 이산화탄소 고정 효율이 증가하고, 나아가 재조합 미생물의 개선된 이산화탄소 격리 능력을 통해 고부가가치 유용화합물의 환경친화적인 화학적 생합성 및 생산성으로 이어진다.
본 발명의 효과는 이런 문언적 기재에만 한정되지 않고, 통상의 기술자가 본 발명을 통해 유추할 수 있는 것까지 모두 포함한다.
도 1은 가스크로마토그래피를 사용하여 배양 온도에 따라 재조합 미생물에서 방출되는 이산화탄소의 양을 비교한 결과이다.
도 2는 TEM을 사용하여 배양 온도에 따라 재조합 미생물에서 형성되는 봉입체의 양을 비교한 결과이다. 검은 화살표는 봉입체를 나타낸다. (a) 30 ℃ MOCK, (b) 30 ℃ CBB, (c) 37 ℃ MOCK, (d) 37 ℃ CBB
도 3은 LC/MS/MS를 통해 배양 온도에 따라 재조합 미생물에서 형성된 캘빈밴슨 경로의 대사 물질의 함량을 비교한 결과이다. (a) 리불로오스 1,5-비스포스페이트, (b) 글리세르알데히드-3-포스페이트, (c) 피루베이트
도 4는 액체크로마토그래피로 배양 온도에 따른 재조합 미생물에 의한 발효 산물의 함량을 비교한 결과이다.
도 5는 ATP assay 및 NAD/NADH assay로 배양 온도에 따른 재조합 미생물의 산화환원 보조인자의 양을 비교한 결과이다. (a) NAD+/NADH 비, (b) ATP
도 6은 순환 전압전류법을 활용해 배양 온도에 따른 재조합 미생물의 전자 소모를 비교한 결과이다. (a) 30 ℃ MOCK, (b) 30 ℃ CBB, (c) 37 ℃ MOCK, (d) 37 ℃ CBB
도 2는 TEM을 사용하여 배양 온도에 따라 재조합 미생물에서 형성되는 봉입체의 양을 비교한 결과이다. 검은 화살표는 봉입체를 나타낸다. (a) 30 ℃ MOCK, (b) 30 ℃ CBB, (c) 37 ℃ MOCK, (d) 37 ℃ CBB
도 3은 LC/MS/MS를 통해 배양 온도에 따라 재조합 미생물에서 형성된 캘빈밴슨 경로의 대사 물질의 함량을 비교한 결과이다. (a) 리불로오스 1,5-비스포스페이트, (b) 글리세르알데히드-3-포스페이트, (c) 피루베이트
도 4는 액체크로마토그래피로 배양 온도에 따른 재조합 미생물에 의한 발효 산물의 함량을 비교한 결과이다.
도 5는 ATP assay 및 NAD/NADH assay로 배양 온도에 따른 재조합 미생물의 산화환원 보조인자의 양을 비교한 결과이다. (a) NAD+/NADH 비, (b) ATP
도 6은 순환 전압전류법을 활용해 배양 온도에 따른 재조합 미생물의 전자 소모를 비교한 결과이다. (a) 30 ℃ MOCK, (b) 30 ℃ CBB, (c) 37 ℃ MOCK, (d) 37 ℃ CBB
이하에서는 본 발명을 실시하기 위한 내용을 구체적인 실시예 및 첨부한 도면을 참조하여 자세히 설명한다. 종래기술과 다르지 않은 부분으로서 본 발명의 기술적 사상을 이해하는데 필요하지 않은 사항은 설명에서 제외한다.
본 발명자들의 실험실에서는 캘빈-벤슨-배스햄 회로의 유전자가 도입된 재조합 대장균을 제조하여 등록 특허 제1639031호를 획득하였으며, 그의 내용은 본 특허 발명에 도입된다.
본 발명에서는 상기 재조합 대장균에 의한 이산화탄소 고정 효율을 높이기 위하여 캘빈-벤슨-배스햄 회로 내의 Rubisco 및 ATPase의 활성을 높이는 동시에, 봉입체의 형성을 낮추는 방안을 강구하였다. Rubisco 및 ATPase의 활성은 온도가 증가함에 따라 증가되지만 5~30 ℃ 범위에서만 동일한 활성으로 증가한다.
본 발명의 발명자들은 캘빈-벤슨-배스햄 회로를 코딩하는 유전자가 도입된 재조합 대장균을 통상 사용되는 온도인 37 ℃에서 배양할 때 보다 30 ℃에서 배양할 때, 이산화탄소의 배출량이 10배 이상 줄어들었으며(도 1 참조), 캘빈-벤슨-배스햄 회로의 대사산물인 글리세르알데히드-3-포스페이트(G3P) 및 피루베이트(pyruvate)의 생산량이 더 높다는 것을 밝혔다(도 3 참조). 배양된 대장균을 TEM로 관찰한 결과, CBB에서 기본적으로 모든 조건에서 재조합 단백질의 이종 발현으로 인해 더 많은 봉입체가 관찰되었으나, 30 ℃에서 봉입체가 눈에 띄게 감소하였음을 밝혔다(도 2 참조). 또한, 이산화탄소의 고정을 위해 소모되는 산화환원 보조인자인 NADH 및 ATP의 감소가 37 ℃에서 배양할 때 보다 30 ℃에서 배양할 때 두드러졌으며(도 5 참조), 바이오전기화학적 분석 결과, 37 ℃에서 배양할 때 보다 30 ℃에서 배양할 때 이산화탄소 고정활성 및 그의 대사를 유지하는데 더 많은 전자가 필요하다는 것을 알아냈다(도 6 참조).
이와 같은 발명자들의 연구결과를 바탕으로 본 발명은 다음을 제공한다.
본 발명은 일 측면에서, 캘빈-벤슨-배스햄 회로(Calvin-Benson-Bassham cycle)를 코딩하는 유전자를 포함하는 재조합 미생물을 16~30 ℃에서 배양하는 단계를 포함하는, 상기 재조합 미생물에 의한 이산화탄소 고정 방법을 제공한다.
배양온도가 16 ℃보다 낮으면 미생물의 적정 성장 범위를 벗어나 미생물이 배양되지 못하고, 30 ℃보다 높으면 배양 온도 조절을 통한 봉입체 형성 억제 효과가 나타나지 못하게 된다.
본 발명에 있어서의 '이산화탄소(CO2) 고정'이란, 당대사에 있어서 발생하는 CO2나 외부로부터 공급된 CO2를 유기 화합물로 변환하는 것을 가리킨다. CO2는 HCO3 - 이어도 된다.
또한 본 발명은 일 측면에서, 캘빈-벤슨-배스햄 회로(Calvin-Benson-Bassham cycle)를 코딩하는 유전자를 포함하는 재조합 미생물을 16~30 ℃에서 배양하는 단계를 포함하는, 상기 재조합 미생물에 의한 유용물질의 생산 방법을 제공한다.
본 발명은 일 구현예로, 상기 캘빈-벤슨-배스햄 회로(Calvin-Benson-Bassham cycle)를 코딩하는 유전자는 (ⅰ) D-프럭토스-1,6-비스포스파타아제(D-fructose-1,6-bisphosphatase)를 코딩하는 유전자(cbbF), 포스포리불로오스 인산화효소(phosphoribulokinase)를 코딩하는 유전자 (prkA), 프럭토스-1,6-비스포스파테이트 알돌라아제(fructose-1,6-bisphosphate aldolase)를 코딩하는 유전자(cfxA), 리불로오스 비스포스파테이트 카르복실라아제/옥시게나아제 라지 서브유닛 (ribulose bisphosphate carboxylase/oxygenase large subunit)을 코딩하는 유전자 (cbbL) 및 리불로오스-1,5-비스포스파테이트 카르복실레이즈 스몰 서브유닛(ribulose-1,5-bisphosphate carboxylase small subunit)을 코딩하는 유전자(cbbS); 및/또는 (ⅱ) D-프럭토스-1,6-비스포스파타아제(D-fructose-1,6-bisphosphatase)를 코딩하는 유전자(fbpB), 포스포리불로오스 인산화효소(phosphoribulokinase)를 코딩하는 유전자 (prkB), 트랜스케톨라제(transketolase)를 코딩하는 유전자(tklB), 글리세르알데하이드-3-포스파테이트 디하이드로게나아제(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase)를 코딩하는 유전자(gapB), 프럭토스-1,6-비스포스파테이트 알돌라아제(fructose-1,6-bisphosphate aldolase)를 코딩하는 (cfxB) 및 리불로오스 비스포스파테이트 카르복실라아제/옥시게나아제 라지 서브유닛(ribulose bisphosphate carboxylase/oxygenase large subunit)를 코딩하는 유전자(rbpL)일 수 있다.
본 발명의 일 구현예로서, 상기 (ⅰ) cbbF, prkA, cfxA, cbbL 및 cbbS 유전자는 로도박터 스페로이드(Rhodobacter sphaeroides)의 캘빈-벤슨-배스햄(Calvin- Benson-Bassham; cbb) I 오페론 유래인 것을 특징으로 하며, 상기 (ⅱ) fbpB, prkB, tklB, gapB, cfxB 및 rbpL 유전자는 로도박터 스페로이드(Rhodobacter sphaeroides)의 캘빈-벤슨-배스햄(Calvin- Benson-Bassham; cbb) Ⅱ 오페론 유래일 수 있다.
상기 '오페론(operon)'은 염색체상에서 하나의 리프레서와 오퍼레이터에 의해 조절을 받고 있는 전사 단위로서, 이에 의해 하나의 대사계 중에서 효소군의 합성이 동시에 조절되며, 리프레서의 오퍼레이터에 대한 결합의 유무로 전사가 억제된다. 이러한 조절기능이 있는 유전자군을 오페론이라고 하며, 단순히 전사 단위를 오페론이라 하는 경우도 있다.
'캘빈-벤슨-배스햄(Calvin-Benson-Bassham; CBB) 회로'는 캘빈 회로(Calvin cycle)에 일종으로, 몇몇 광합성 세균들은 CO2가 유일한 탄소원일 때, 세포의 탄소원을 공급하기 위하여 캘빈-벤슨-배스햄(CalvinBenson-Bassham; CBB)의 환원성 펜타오스 포스페이트(pentose phosphate) 경로를 작동시킨다. 이 경로의 탄소 고정 역할을 담당하는 단백질은 루비스코(RubisCO)로 알려져 있으며, 로도박터(Rhodobacter)에 속하는 세균들은 form I과 form Ⅱ의 두 종류 루비스코(RubisCO)를 함유하고 있다. form I과 form Ⅱ의 RubisCO는 각각 별도의 염색체(chromosome)에 존재하며 form I의 RubisCO를 코딩하는 유전자는 cbbI 오페론(operon)에, form Ⅱ의 RubisCO를 코딩하는 유전자는 cbb Ⅱ 오페론에 존재하는 것으로 알려져 있다. cbbI 오페론(operon)과 cbb Ⅱ 오페론에 의해 코딩되는 효소들은 CO2 고정 경로뿐만 아니라, 다른 탄수화물 대사과정에도 관여한다.
본 발명의 일 구현예로서, 상기 캘빈-벤슨-배스햄 회로(Calvin-Benson-Bassham cycle)를 코딩하는 유전자는 (ⅰ) 서열번호 1로 표시되는 cbbF 유전자, 서열번호 2로 표시되는 prkA 유전자, 서열번호 3으로 표시되는 cfxA 유전자, 서열번호 4로 표시되는 cbbL 유전자 및 서열번호 5로 표시되는 cbbS 유전자; 및/또는 (ⅱ) 서열번호 6으로 표시되는 fbpB 유전자, 서열번호 7로 표시되는 prkB 유전자, 서열번호 8로 표시되는 tklB 유전자, 서열번호 9로 표시되는 gapB 유전자, 서열번호 10으로 표시되는 cfxB 유전자 및 서열번호 11로 표시되는 rbpL 유전자일 수 있다.
본 발명의 일 구현예로서, 상기 재조합 미생물은 캘빈회로를 가지고 있지 않은 미생물일 수 있다.
본 발명에 있어서, 캘빈회로 유전자를 도입하기 위한 선호되는 숙주세포는 원핵세포이다. 적합한 원핵 숙주세포는 E. coli XL-1Blue(Stratagene), E. coli DH5α, E. coli JM101, E. coli K12, E. coli W3110, E. coli X1776, E. coli BL21 등을 포함한다. 그러나 FMB101, NM522, NM538 및 NM539와 같은 E. coli 균주 및 다른 원핵생물의 종(speices) 및 속(genera) 등이 또한 사용될 수 있다. 상기 E. coli에 덧붙여, 아그로박테리움 A4와 같은 아그로박테리움 속 균주, 바실루스 섭틸리스(Bacillus subtilis)와 같은 바실 리(bacilli), 살모넬라 타이피뮤리움(Salmonella typhimurium) 또는 세라티아 마르게센스(Serratia marcescens)와 같은 또 다른 장내세균 및 다양한 슈도모나스(Pseudomonas) 속 균주가 숙주세포로서 이용될 수 있으며, 바람직하게는 캘빈회로롤 포함하지 않은 미생물, 더 바람직하게는 대장균(Escherichia coli)을 사용할 수 있다.
본 발명에 따른 상기 재조합 미생물은 통상의 방법에 따라 상기 유전자를 미생물의 염색체(chromosome) 상에 삽입시키거나, 상기 재조합 벡터를 미생물의 플라스미드(plasmid) 상에 도입시킴으로써 제조할 수 있다.
본 발명에서 캘빈회로 유전자를 숙주세포의 염색체상에 삽입하는 방법으로는 통상적으로 알려진 유전자조작방법을 사용할 수 있다. 예를 들어, 물리적인 방법으로서, microinjection, liposome, directed DNA uptake, receptor-mediated DNA transfer 또는 칼슘이온을 이용한 DNA 운반 방법 등이 있으며, 최근에는 바이러스(virus)를 이용한 유전자 운반 방법이 많이 사용되고 있다. 일례로는 레트로바이러스 벡터, 아데노 바이러스 벡터, 아데노-연관 바이러스 벡터, 헤르페스 심플렉스 바이러스 벡터, 폭스바이러스 벡터 또는 렌티바이러스 벡터를 이용하는 방법 등이 있으며, 특히, 레트로바이러스는 유전자 전달 효율이 높고 gross deletion이나 숙주 DNA와 재정렬(rearrangement: 숙주 DNA 중 자기 DNA와 유사한 부위를 바꾸는 것으로 숙주 DNA 기능의 변화를 초래함)에 의한 결합 없이 넓은 범위의 세포들에서 사용할 수 있다.
본 발명의 일 측면에서, 본 발명에 따른 캘빈-벤슨-배스햄 회로(Calvin-Benson-Bassham cycle)를 코딩하는 유전자를 포함하는 재조합 미생물에 의한 이산화탄소 고정 방법 또는 유용물질의 생산 방법은 추가로 IPTG(isopropyl-1-thio-β-D-galactopyranoside), RuBP(ribulose-1, 5-bisphosphate) 및 ZnPc(Zinc phthalocyanine)로 이루어지는 군에서 선택되는 어느 하나 이상의 화합물을 재조합 미생물 배양 배지에 처리하는 단계를 포함할 수 있다.
본 발명의 일 구현예에서, 본 발명에 따른 캘빈-벤슨-배스햄 회로(Calvin-Benson-Bassham cycle)를 코딩하는 유전자를 포함하는 재조합 미생물에 의한 유용물질의 생산 방법에 의하여 생산되는 유용물질은 캘빈회로에 의해 생성되는 글루코스(glucose), 슈크로스(sucrose), 프럭토스 (fructose)로 구성된 군에서 선택되는 어느 하나 이상의 당, 유기산 및 ATP로 구성된 군에서 선택된 어느 하나 이상일 수 있다.
본 발명의 캘빈회로 유전자가 도입된 재조합 미생물은 탄소고정능을 가지고 있으므로, 광합성 효율을 증가시킬 수 있으며, 광합성 과정을 통해 생성되는 각종 유용한 유기물을 생산할 수 있다.
본 발명의 바람직한 일실시예에 따르면, 상기 재조합 미생물을 이용한 유용물질 생산방법은 상기 재조합 미생물을 이산화탄소를 탄소원으로 배양하여 유용물질을 생성시킨 다음, 생성된 유용물질을 회수하는 단계를 포함할 수 있다.
본 발명의 캘빈회로 유전자가 도입된 재조합 미생물은 상기 캘빈회로 유전자 도입으로 인해 생성된 이산화탄소 고정능에 의해 이산화탄소 저감 기능이 있을 뿐만 아니라, 광합성 효율 증가로 인한 유용 유기물의 생성을 증가시키는 방법을 제공할 수 있으므로, 종래의 미세조류보다 배양 속도가 빠르고, 이산화탄소 저감 효과 보다 현저히 우수한 재조합 미생물을 이용하여 생물학적 환경문제 해결이 가능할 뿐만 아니라, 이산화탄소 고정을 통한 고부가가치 물질의 생산을 향상시킬 수 있다.
아래에서는 실시예를 통하여 본 발명을 보다 상세히 설명하기로 한다. 다만, 이는 발명의 하나의 예시로서 제시되는 것으로, 이에 의해 발명의 권리범위가 한정되는 것은 아니며, 발명의 권리범위 내에서 구현예에 대한 다양한 변형이 가능함은 당업자에게 자명하다.
<실시예 1> 캘빈회로 유전자가 도입된 재조합 대장균의 제조
캘빈회로 유전자가 도입된 재조합 대장균을 등록 특허 제1639031호에 기재된 바와 같이 제조하였다.
통성혐기성 광합성 균주인 로도박터 스페로이드 KCTC 1434 (Rhodobacter sphaeroides KCTC 1434) 균주를 사용하였다. 먼저, 로도박터스페로이드 유래의 캘빈회로인 캘빈-벤슨-배스햄(CalvinBensonBassham; cbb) 회로를 코딩하는 유전자를 수득하기 위해, 로도박터 스페로이드의 유전체 데이터로부터 CBB 사이클의 cbbI 오페론을 구성하고 있는 유전자인 D-프럭토스-1,6-비스포스파타아제(D-fructose-1,6-bisphosphatase)를 코팅하는 유전자(cbbF; 서열 번호 1), 포스포리불로오스인산화효소(phosphoribulokinase) 유전자(prkA; 서열번호 2), 프럭토스-1,6-비스포스파테이트 알돌라아제(fructose-1,6-bisphosphate aldolase)를 코딩하는 유전자(cfxA; 서열번호 3), 리불로오스 비스포스파테이트 카르복실라아제/옥시게나아제 라지 서브유닛(ribulose bisphosphate carboxylase/oxygenase large subunit)을 코딩하는 유전자(cbbL; 서열번호 4) 및 리불로오스-1,5-비스포스파테이트 카르복실레이즈 스몰 서브유닛(ribulose-1,5-bisphosphate carboxylase small subunit)을 코딩하는 유전자(cbbS; 서열번호 5)와 cbbⅡ 오페론을 구성하고 있는 유전자인 D-프럭토스-1,6-비스포스파타아제(D-fructose-1,6-bisphosphatase)를 코딩하는 유전자(fbpB; 서열번호 6), 포스포리불로오스인산화효소(phosphoribulokinase)를 코딩하는 유전자 (prkB; 서열번호 7), 트랜스케톨라제(transketolase)를 코딩하는 유전자(tklB; 서열번호 8), 글리세르알데하이 드-3-포스파테이트 디하이드로게나아제(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase)를 코딩하는 유전자(gapB; 서열번호 9), 프럭토스-1,6-비스포스파테이트 알돌라아제(fructose-1,6-bisphosphate aldolase)를 코딩하는 유 전자(cfxB; 서열번호 10) 및 리불로오스 비스포스파테이트 카르복실라아제/옥시게나아제 라지 서브유닛 (ribulose bisphosphate carboxylase/oxygenase large subunit; 서열번호 11)을 코딩하는 유전자(rbpL)의 DNA 서열을 NCBI의 genebank (www.ncbi.nlm.nih.gov)로부터 확보하여 각각의 유전자를 특이적으로 증폭할 수 있는 프라이머(primer)를 제작하였으며, 증폭된 유전자를 벡터에 삽입할 수 있도록 제한효소 사이트가 포함되도록 제작하였다 (바이오니아, 한국). 상기 cbbI 오페론 및 cbbⅡ 오페론을 구성하고 있는 각각의 유전자는 하기 표 1의 프라이머를 이용하여 증폭하였다.
[표 1]
*표 1의 밑줄친 부분은 제한효소에 의해 절단되는 위치를 표기한 것임.
cbbI 오페론을 구성하고 있는 cbbF, prkA, cfxA, cbbL 및 cbbS 유전자를 증폭시키기 위해, 로도박터 스페로이드 균주로부터 게놈 DNA를 추출하고, 이를 주형으로 하여 상기 표 1의 각각의 프라이머쌍을 사용하여 PCR (Polymerase chain reaction)을 수행하였다. PCR증폭 산물을 아가로즈 겔(agarose gel)에서 전기영동한 결과, cbbF는 1 kb, prkA-cfxA은 1.95 kb, cbbL-cbbS는 1.85 kb의 크기를 가지는 cbbI(form I) DNA 단편이 증폭된 것을 확인하였다. 상기 증폭 산물의 서열을 확인한 결과, cbbF 유전자는 서열번호 1로, prkA-cfxA 유전자는 서열번호 12, cbbL-cbbS 유전자는 서열번호 13으로 표시되는 것을 확인하였다.
또한, cbbⅡ오페론을 구성하고 있는 fbpB, prkB, tklB, gapB, cfxB 및 rbpL 유전자를 증폭시키기 위해, 로도 박터 스페로이드 균주로부터 게놈 DNA를 추출하고, 이를 주형으로 하여 상기 표 1의 각각의 프라이머쌍을 사용하여 PCR을 수행하였다. PCR증폭 산물을 아가로즈 겔에서 전기영동한 결과, fbpB-prkB는 1.87 kb, tklB-gapB은 2.97 kb, cfxB-rbpL는 2.44 kb의 크기를 가지는 cbbⅡ(from Ⅱ) DNA 단편이 증폭된 것을 확인하였다. 상기 증폭 산물의 서열을 확인한 결과, fbpB-prkB 유전자는 서열번호 14, tklB-gapB 유전자는 서열번호 15, cfxB-rbpL 유전자는 서열번호 16으로 표시되는 것을 확인하였다.
증폭한 캘빈-벤슨-배스햄(CalvinBensonBassham; cbb) 회로 유전자가 포함된 재조합 벡터를 제조하기 위해 대장균-단백질 발현벡터인 pET-28b(Novagen, 미국)를 기본 벡터로 사용하여 캘빈회로 form I(cbb I) 발현용 벡터인 MBTLY I-3을 제작하였으며, 제작과정은 다음과 같다; 증폭한 cbbF DNA절편을 XbaI과 NdeI으로 절단하여 동일한 제한 부위를 절단한 pET-28b 벡터에 도입하였으며, 이를 MBTLY I-1 로 명명하였다. 여기에 prkA-cfxA 유전자를 NdeI과 NheI으로 절단한 후 동일한 제한부위를 절단한 벡터에 도입하여 이를 MBTLY I-2로 명명하였다. 또한 여기에 cbbL-cbbS 유전자를 NheI과 Hind²로 절단한 후 동일한 제한부 위를 절단한 벡터에 도입하여 이를 MBTLY I-3으로 명명하였다.
또한, 대장균-단백질 발현벡터인 pET-21a (Novagen, 미국)를 기본 벡터로 사용하여 캘빈-벤슨-배스햄 form Ⅱ(cbbⅡ) 발현용 벡터인 MBTLY Ⅱ-3을 제작하였으며, 제작과정은 다음과 같다; 증폭한 fbpB-prkB DNA 절편을 XbaI과 NdeI으로 절단하여 동일한 제한 부위를 절단한 pET-21a벡터에 도입하였으며, 이를 MBTLY Ⅱ-1로 명명하였다. 여기에 tklB-gapB 유전자를 NdeI과 NheI으로 절단한 후 동일한 제한부위를 절단한 벡터에 도입하여 이를 MBTLY Ⅱ-2로 명명하였다. 또한 여기에 cfxB-rbpL유전자를 NheI과 Hind²로 절단한 후 동일한 제한부위를 절단한 벡터에 도입하여 이를 MBTLY Ⅱ-3으로 명명하였다.
두 벡터의 동시발현 시스템으로 캘빈회로 효율을 더욱 증가시키기 위해, 재조합 벡터 MBTLY I-3 및 MBTLY Ⅱ-3을 동시에 대장균인 Escherichia coli BL21 (DE3)에 전기천공법 (Electroporation)으로 형질전환하여 재조합 미생물을 제조하였다. 제조된 재조합 미생물은 카나마이신과 암피실린이 각각 함유된 LB 고체평판배지에서 배양하여 콜로니를 수득한 다음, 새로운 배지에 옮겨 단일 콜로니를 수득하였으며, 이 균주를 MBTL-YS1이라 명명하였다. 상기 균주에 캘빈-벤슨-배스햄 회로 유전자가 제대로 도입되었는지 확인하기 위해, DNA 시퀀싱(Sequancing)을 수행하였으며, MBTLY I-3에 삽입된 cbbF, cfxA, prkA, cbbL, cbbS의 DNA 염기서열 및 MBTLY Ⅱ-3에 삽입된 fbpB, prkB, tklB, gapB, cfxB, rbpL의 DNA 염기서열이 포함되어 있는 것을 확인하였다.
또한, 대조군으로는 유전자가 삽입되지 않은 pET-21a 벡터와 pET-28b 벡터를 함께 형 질전환한 재조합 미생물(MBTL-YS0)를 사용하였으며, MBTLY I-3 와 pET-21a 벡터가 함께 들어간 재조합 미생물(MBTL-YS2), MBTLY Ⅱ-3와 pET-28b 벡터가 함께 들어간 재조합 미생물(MBTL-YS3) 및 MBTLY I-3 벡터와 MBTLY Ⅱ-3 벡터가 함께 들어간 재조합 미생물(MBTL-YS1)을 상기와 동일한 방법으로 제조하였다.
<실시예 2> 캘빈회로 유전자가 도입된 재조합 대장균의 배양
재조합 대장균 (MBTL-YSO, MBTL-YS2)을 암피실린 50 ㎍/ml, 카나마이신 50 ㎍/ml 이 함유된 LB (pH7) 액체 배지 10 ml에 접종하여 30 ℃에서 16시간 진탕 배양하였다. 진탕 배양 후 얻어진 배양액을 M9 최소배지로 씻은 후, 이 배양액 400 ㎕를 암피실린 50 ㎍/ml, 카나마이신 50 ㎍/ml 이 함유된 M9 (per L; 12.8g Na2HPO4·7H2O, 3g KH2PO4, 0.5g NaCl, 1g NH4Cl, 2mM, MgSO4, 0.1mM CaCl2, 0.5g NaOH, 4g 글루코스) 최소배지(pH7) 40 ml에 접종하여 본 배양을 하였다. 본 배양은 100 ml 혈청병에 넣고 밀봉하여 30℃, 180rpm, 빛이 없는 조건에서 24시간 동안 실시되었으며, 본 배양 중 3시간 후 1mM의 IPTG를 통해 재조합 대장균의 이종 발현이 유도되었다.
<실시예 3> 가스크로마토그래피를 활용한 배양 온도에 따른 이산화탄소 배출량 비교
이산화탄소 배출량을 반-혐기성 조건 내, 각 온도 조건에서 24시간 배양 후 Gas chromatography YL6500 (YOUNGIN Chromass co., ltd)를 통해 측정되었다. CBB (재조합 대장균 MBTL-YS2)에서의 이산화탄소 방출 결과는 30 ℃ 및 37 ℃의 두 온도 조건 모두에서 MOCK(재조합 대장균 MBTL-YSO)에 비해 감소된 것으로 나타났다(도 1).
또한, CBB에서 온도에 따른 이산화탄소 방출량은 37 ℃에서 약 129.733 mV*s/cell, 30 ℃에서 약 12.336 mV*s/cell로, 30 ℃에서 10배 이상 이산화탄소 방출량이 줄어든 것이 확인되었다.
이러한 결과는 30 ℃에서의 배양으로 캘빈밴슨 회로와 관련된 유전자의 과발현이 유도되었으며, 해당 반응에서 방출된 이산화탄소의 재활용을 통해 바이오매스를 증가시킨다는 결과를 나타낸다.
<실시예 4> TEM을 활용한 배양 온도에 따른 봉입체 형성 비교
투과전자현미경(Transmission Electron Microscope; TEM)을 통하여 배양된 재조합미생물을 관찰하였다.
반-혐기성 조건 내, 각 온도 조건에서 24시간 배양된 재조합 대장균을 2% 파라포름알데히드(paraformaldehyde), 2% 글루타르알데히드(glutaraldehyde)를 포함하는 0.05M sodium cacodylate 완충액 내 4 ℃에서 16시간 동안 1차 고정하였다. 이후 1% 오스뮴 테트록사이드(Osmium tetroxide)를 포함하는 0.05M sodium cacodylate 완충액 내 4 ℃에서 90분 동안 2차 고정하였다. 고정된 샘플을 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 100, 100%의 에탄올 용액에서 순서에 따라 탈수하였다. 탈수된 샘플을 실온에서 100% 프로필렌 옥사이드(propylene oxide)로 치환하였다. 치환된 샘플은 1:1의 resin:propylene oxide에서 2시간, 3:1의 resin:propylene oxide에서 16시간, 100% resin에서 2시간 침투시켰다. 각 단계에서 샘플을 1분 동안 10,000 rpm에서 원심분리하였으며, 침투된 샘플은 몰드로 옮겨서 60 ℃에서 48시간 중합시켰다. 중합된 샘플은 ultramicrotome (Leica EM UC7/FC7)을 통해 초박형 섹션으로 절단하였으며, 샘플은 200 mesh grid에서 각 7분 동안 2% uranyl acetate 및 Reynold's lead citrate로 이중 염색하였다.
염색된 샘플은 가속 전압 100kV의 조건에서 TEM (Hitachi H-7650)으로 관찰하였다.
도 2는 온도에 따른 MOCK 및 CBB의 TEM 이미지를 나타낸다. 형태학적으로 표면이 매끄럽거나 불규칙한 굴정성 입자로 봉입체가 관찰되었다.
봉입체는 주로 외래 단백질로 구성된다. CBB에서 기본적으로 모든 조건에서 재조합 단백질의 이종 발현으로 인해 더 많은 봉입체가 관찰되었으나, 30 ℃에서 봉입체가 눈에 띄게 감소하였다. 상기 결과는 37 ℃에서 30 ℃로의 온도 조절이 봉입체 형성과 이산화탄소 방출을 감소시키고, CBB가 제한적인 탄소원을 통해 내인성 이산화탄소를 재활용하는 특성이 두드러짐을 나타낸다.
<실시예 5> LC/MS/MS를 통한 캘빈 밴슨 경로의 대사산물 비교
LC/MS/MS의 샘플을 준비하기 위해 Crusher (JFC-2000; Japan analytical Industry, Co., Ltd., Tokyo)를 사용하여 재조합 균주를 분쇄하였다. 샘플은 액체 질소에서 10분간 냉각된 후 50 Hz의 주파수로 설정된 파쇄봉의 상하 왕복운동으로 10분간 분쇄되었다. 분쇄된 시료는 90:10의 에탄올:시료로 희석하고 -20 ℃에서 10분 동안 현탁하여 단백질을 용해시켰다. 13,000 rpm, 4 ℃의 조건에서 10분 간 원심분리 후 상층액 5 ㎕를 LC/MS/MS에 주입하였다.
리불로오스-1,5-비스포스파테이트 (Ribulose-1,5-bisphosphate (RuBP), 피루베이트(pyruvate)의 표준물질은 시그마-알드리치(St, Louis, MO, USA)에서, 글리세르알데히드-3-포스페이트 (glyceraldehyde-3-phosphate; G3P)의 표준물질은 Cayman chemical company (Ann Arbor, USA)에서 구입하였다. 최적화된 multiple reaction monitoring (MRM) 방법은 MS/MS가 결합된 ultra-performance liquid chromatography (UPLC)를 통해 실시되었다.
UPLC 시스템(Acquity system, Waters, Milford)을 Xevo TQ-S triple quadrupole mass spectrometer (Waters, Milford)에 연결하였고, AQUITY UPLC BEH C18 Column (1.7 ㎛; Waters)을 사용하여 분리되었다. 이동상 용매 B는 0.1%의 포름산(formic acid)을 포함하는 아세토니트릴(acetonitrile)로, 용매 A는 0.1%의 포름산을 포함하는 물로 구성되었다. Desolvation, Cone 및 Nebulizer는 각각 650 L/hour, 150 L/hour 및 7 bar로 설정되었다.
도 3의 a는 RuBP의 함량을, b는 G3P의 함량을, c는 피루베이트(pyruvate)의 함량을 나타낸다. RuBP의 함량에는 유의미한 차이가 없었으나 G3P 및 피루베이트의 함량은 두 온도 조건에서 모두 MOCK 보다 CBB에서 더 높았다. 또한, 온도에 따른 CBB에서의 대사산물을 비교했을 때, 37 ℃에서 보다 30 ℃에서 더 많은 G3P와 피루베이트의 양을 확인할 수 있었다.
<실시예 6> HPLC를 통한 발효산물의 비교
대장균은 발효를 통해서도 대사될 수 있는 통성 혐기성 세균이다. 대장균의 대표적인 발효산물인 젖산, 에탄올, 초산의 발효 수율을 비교하였다. HPLC 샘플은 각 온도 조건에서 배양된 재조합 균주를 멤브레인 필터를 통해 여과하였다. 발효 산물의 함량은 Rspak KC-811 (8 mm x 300 mm) 컬럼 (Showa Denko, Tokyo)가 장착된 HPLC (Waters)로 정량화하였다. 이동상은 1 ㎖/min의 유속에서 4 mmol/L 황산이 사용되었다. 컬럼의 온도는 60 ℃이며, 발효 수율은 각 발효 산물의 증가량을 포도당 감소량으로 나누어 계산하였다.
도 4는 대장균의 대표적인 발효 산물인 젖산, 에탄올, 초산의 발효 수율을 나타낸 것이다. 에탄올 수율에는 온도에 따라 큰 차이가 없었으나 30 ℃ 조건에서는 초산의 수율이, 37 ℃ 조건에서는 젖산의 수율이 MOCK에 비해 CBB에서 감소함을 확인하였다. 이러한 결과는 CBB가 두 온도 조건 모두에서 캘빈밴슨 경로를 통해 대사되기 때문에, 발효로의 전환을 감소시킨다는 것을 보여준다.
<실시예 7> 캘빈밴슨 회로에 의한 NAD
+
/NADH 및 ATP 비교
일반적으로 캘빈밴슨 경로는 이산화탄소의 고정을 위해 NADH 및 ATP와 같은 산화환원 보조인자를 필요로 한다. 따라서 이산화탄소 고정이 진행될수록 NADH 및 ATP가 소모된다.
NADH 및 NAD+를 NAD/NADH-Glo assay kit (Promega Co., Ltd, USA0를 사용하여 검출하였다. 샘플을 추출용액 (0.4 N HCl, 0.2 N NaOH/20% DTAB, 0.2 N HCl/0.25 M Trizma, 0.5M Trizma)을 사용하여 추출하였다. GloMax Explorer 시스템 (Promega Co., Ltd)를 사용하여 100 ㎕의 NAD/NADH 검출시약과 100 ㎕의 샘플을 혼합하여 혼합물의 발광을 검출하였다.
도 5는 온도에 따른 MOCK 및 CBB 에서의 NAD+/NADH 비율 (도 5a) 및 ATP의 농도 (도 5b)를 나타낸다. 그 결과 MOCK에서는 온도 의존적인 변화량이 관찰되지 않았다. 반면 CBB에서는 37 ℃에서보다 30 ℃에서 감소된 ATP 및 NADH를 확인할 수 있었으며, 두 온도 조건에서 모두 MOCK 보다 감소된 결과를 확인할 수 있었다. 즉, ATP와 NADH의 감소가 37 ℃보다 30 ℃에서 두드러졌다. 이러한 NAD+/NADH 비율과 ATP의 농도 변화는 도 1의 이산화탄소 방출 결과와 일치하는 경향성을 보였다. 결과적으로 산화환원 보조인자의 향상된 전자 활용을 통해 이산화탄소의 고정이 증가되는 CBB의 특성이 37 ℃보다 30 ℃에서 두드러짐이 확인되었다.
<실시예 8> 바이오전기화학적 분석
바이오전기화학 분석 기술을 통해 재조합 균주에서의 전자 소모를 비교하였다. 바이오전기화학 분석 기술은 산화환원 보조인자에 환원력을 공급하기 위해 음극을 통해 전자를 제공함으로써 환원된 생성물의 생물 변환 및 생합성을 가능하게 하는 기술이다.
3개의 전극으로 구성된 단일 챔버 반응기에서 전압의 함수로서 전류의 변화를 모니터링하였다. 미생물에 대한 독성과 성장 억제를 최소화하기 위해 전자 전달은 메틸렌블루 (methylene blue; MB 0.5 mM)에 의해 매개되었다. 20 ㎖의 반응기 내 Ag/AgCl 기준 전극(reference electrode (NaCl saturated)), Platinum wire 카운터 전극(counter electrode), 3 mm 직경의 glassy carbon 워킹 전극(working electrode)가 사용되었다.
바이오전기화학 챔버는 Piranha 용액 (과산화수소:황산=1:3)으로 세척되었고, 워킹 전극은 직경 0.3 및 1 ㎛의 알루미늄-물 슬러리로 연마되었다. 사이클릭 볼타메트리(Cyclic voltammetry (CV))는 potentiostat (SP-200; Bio-Lohics SAS, France)를 활용하여 수행되었다. 전기화학적 측정은 배지에서 산소를 제거하기 위해 아르곤으로 15분간 퍼지 후 수행되었다.
바이오전기화학적 분석은 IPTG 유도 후 (도 6의 T(i, 0)) Chronoamperometry 및 CV 측정이 시작되었다. 0.5 mM의 메틸렌블루(MB) 및 1mM IPTG가 보충된 M9 배지에서 피크 감소 전류는 -0.2 V 부근에서 관찰되었다. 스캔속도는 10 mVs-1이었다. T(i)는 0.5 mM의 MB, 1mM IPTG 및 크로노암페로미터를 넣었을 때 시작점을 나타낸다.
도 6a 및 도 6b는 각각 30 ℃에서 MOCK 및 CBB의 CV를 보여주며, 도 6c 및 도 6d는 각각 37 ℃에서 MOCK 및 CBB의 CV를 보여준다. 이러한 산화환원 전류의 값이 클수록 CBB의 향상된 전기 영양을 나타내며, 미생물과 전극 표면 사이의 전자 수송과 같은 향상된 전기화학적 상호작용을 나타낸다. 또한, 이산화탄소 고정의 활성화 및 대사 유지에 더 많은 전자가 필요함을 나타낸다.
이상에서 본 발명을 설명하였으나, 본 발명은 개시된 실시예 및 첨부된 도면에 의하여 한정되지 않으며 본 발명의 기술적 사상을 벗어나지 않는 범위 이내에서 통상의 기술자에 의하여 다양하게 변형될 수 있다. 또한 본 발명의 실시예에서 설명한 기술적 사상은, 각각 독립적으로 실시될 수도 있고, 둘 이상이 서로 조합되어 실시될 수도 있다.
<110> CHONBUK NATIONAL UNIVERSITY INDUSTRY-UNIVERSITY COOPERATION FOUNDATION
<120> Culture method for improving carbon dioxide fixation ability of
E. coli harboring Calvin-Benson Bassham cycle genes
<130> JB21057
<160> 28
<170> KoPatentIn 3.0
<210> 1
<211> 1002
<212> DNA
<213> Rhodobacter sphaeroides
<400> 1
tcagctccgg aacaggccgc gattgccgaa gagggccgac gtctcctgct cgggcaggtc 60
gtgatacgcg gtgatgcggg ccaccttctc ggcggacccg aagacgaagg gcgtgcgggc 120
atgaagccgc gagggcgtct gtccgaggat cggattctcg ccgtcggtgg ccccgccgcc 180
cgcctgggtg atgacgaagg cgatgggcgc gcattcgtag agatagcgca ggcgaccctg 240
ctcgtagccc ttgcggctgt cgcgcggata gaggaacacg ccgccccgcg cgaggatgcg 300
gtgggtctcg gccaccagcg aggccagcca gcgcatgttg aagttgcgtc cccgcggccc 360
ctcggtaccc gccacgcaat cgtcgatata ggcgcggatc ggcttcggcc agtggcggta 420
gttcgaggcg ttgatcgcga attcggtcga gctgggcggc accttcacgg cacggtcgac 480
cagcacgaag ctgcggctgc cgggatcgag cacatatttc tgcgtcccct tcccgaagct 540
caccatcatg cagacttgcg ggccgtagat gacatagccc gccgcgatga gctcggagcc 600
caggcgcagg aagctcgcct cggccgtggc cgcggcaggc cagatggcga agatcgtgcc 660
gaccgagagg ttggtgtcga tgttggacga gccgtccagc ggatcgatgg cgagggccag 720
cgtcccggcc tcgttcagcg tcaccgccgt gtcctgctcc tcggaggcgt agaagcggac 780
cgccgagcct tccagtgcca cgcggaaggc gtcgtcggcg attacgtcga gcgccttctg 840
cccgtccccg tcggtgttgg ttccgcagag accggcgaga tcctcgtcga tacccccgcg 900
ggcgatccgg ttcgcgactt cgatcgcgac cgagcccaga cggtccatca cgtcctgcaa 960
ctcggccggt atggcatcgg ggtgggtggg aaagggcttc ac 1002
<210> 2
<211> 873
<212> DNA
<213> Rhodobacter sphaeroides
<400> 2
tcaggccacc ttgctctctc ggacgaggcg gtcgatcagc ggtgtcagga tcagctgcat 60
cgcgaggtcc agcttgttgc cgggcaccac gatggaattg gcgcggctca tccacgagcc 120
gtggatcatc gaggtgagat aggggaagtc gatcccgcgc ggattgcgga aacggatcac 180
caccacgctc tcgtcggcgg tggggatcca gcgcgcgatg aaggggttcg aggtatccac 240
caccggcacg cgctggaagt tgatgtcggt ctgcgagaat tgcggcacga tgcagtgaac 300
gtaggcatgc atccggcgca ggatcacgtc ggtgaccgcc tcggtcgtgt aaccgcgggt 360
cgcgcggtcg cggtggatct tctggatcca ttcgaggttg atgaccggaa ccacgccgat 420
cttgaggtcg gccagccccg cgatattgac ctcgctgttc accaccgccc cgtgcaaccc 480
ctcgtagaac agcaggtggc tgtcgctgtc gaagtcgcgc cagtcggtga agttgccggg 540
cgccacgccg gtgcgcgccg cttcggcatc gtcatggacg taggtccgcg tccgcccctg 600
cccggtctcg ccgtactcgc ggaagacgcg ctccagctcc ttcagctcgt tcgcctcgta 660
ggagaagtgc gagaaggtgg cgtcgcccgc cgcatagcgc cggtccagct cggccttcat 720
gtcggcgcgg ttgaagcggt ggaaggcgtc gccctcgatc gagaccgcct tgaccccctc 780
gcgccggaag atctggtcga acgtgtgctt caccgtcgag gtgcccgcgc cggacgagcc 840
cgtgaccgag atgatgggat gcttcttgct cat 873
<210> 3
<211> 1080
<212> DNA
<213> Rhodobacter sphaeroides
<400> 3
tcaggcggct ttggcggtcg cgaccgcagg atcgagcgct ccgctcgcgt agcgcttggc 60
catgtcatcc atcgggatga cggtgatctt cgaagcattg cccgcagtgc cgaaccgctc 120
gaaccggtcg cggacgaggg cctccatctc cttcatcgcg gggatcatga acttccgcgg 180
gtcgaactcc ttcgggctct ccatggcgac cttgcggaac tggccggtca gggccatccg 240
gcagtcggtg tcgatattga ccttgcggac cccgtgacgg atgccgcgct cgatctcctc 300
gaccgggact ccgtaggtct gaggcatatc gccgccatgg gcgttgatga gatcctgcag 360
cgcctgcggc accgaggacg agccgtgcat caccagatgc gtcgcgggca gccgggcgtg 420
gatctcctcg atcacgcgca tggcgaggat ctcgccgtcc ggcttgcggc tgaacttgta 480
ggcgccgtgg ctcgtgccca tggcgatggc cagcgcgtcg acgcgggtcg cctgcacgaa 540
ctccaccgcc tgatccgggt cggtcagcat ctggctgtgg tcgagctttc cttccgcacc 600
cgagccgtcc tcggcctccg cctcgccctt ctcgaggctg cccagcaccc ccagctcgcc 660
ctcgaccgag gctccgaccc agtgggccgc gtcggtcacg cggcgggtga tgtccacgtt 720
gtaatcgtag gaggccaccg tcttcatgtc ggcctgaagc gatccgtcca tcatcaccga 780
ggtgaagccg tgccggatcg ccgagaggca ggtggcctcg ttgttgccgt ggtcctgatg 840
caggcagatc gggatctgcg gatacatttc ggccagcgcc tcgacgatgt ggcgcagcat 900
gatgtcgccg gcatagctgc gcgccccgcg gctggcctgc aggatcaccg gcgcgtcgca 960
ggcgcgggcg gcggcgagga tggcgagccc ctgctccatg ttgttgatgt tgaaggcggg 1020
cacgccatag ccgcgctctg cggcatggtc gagcaattgt ctgagcgtga tcagggccat 1080
1080
<210> 4
<211> 1461
<212> DNA
<213> Rhodobacter sphaeroides
<400> 4
ttacatcgcg accgaggcgg tcggcacgaa gtccgacgtg tcggtggagg tgtagttgaa 60
ggtgatgttg ccccaggtat cgagggcggc ctccagcggc ttgcaccatt tggccgcggc 120
gcggaggatc tccgggccct ccacatcgat gttgcggccc tcgttgcgcg ccagcaccat 180
cgcttccagc gccacgcggt tcgcggtcgc cccggcctgg atccccatcg ggtggccgat 240
ggtgccgccg ccgaactgca gcaccacatc gtcgccgaag aggctcagaa gctggtgcat 300
ctgcccggca tggatcccgc ccgaggccac cggcatgacc ttcctcaggt ccgcccagtc 360
ctgctcgaag aagatcccgc gcggcaggtc gaccgtgttg aagggctcgc ggcagacatt 420
gtaatagccc tgcaccgtca gcgggtcgcc ctcgagcttg cccacggccg tgccgcaatg 480
cagatggtcc acccccgcca gccgcagcca cttggcgatc acgcggaagc tgatgccgtg 540
gttcttctgc cgcgtgtagg tgccgtggcc cgcgcggtgc atgtgcagga tcatgtcgtt 600
ctgccggcac cattccgaga tcgactggat cgccgtatag ccgatgatga gatcgaccat 660
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caccgcctcc atcacataga ggaaccggtc gcgccagtgc atgaagggct gcgagttgat 840
gttctcgtcg tccttcatga agtcgaggcc gcccttcagc ccctcataga ccacgcggcc 900
gtagttcttg cccgacaggc cgagcttggg cttcgtggtg gcgccgagaa ggggcttgcc 960
gaacttgtcc agccgctcgc gctcgcccac gatgccggtg ggcgggccct tgtaggtctt 1020
cacataggcc acggggaagc gcatgtcctc gagccgggcg gccttcagcg gcttgaagct 1080
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caggtcatag gccacatagc agaaatactg ccccggcgtg cccggcaccg gctccacccg 1200
gtaggccttg gcgcggtagc tgtcgcaggc ggtcagccgg tcggtccaga ccacggtcca 1260
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ctgcggtgtg atgcggaaca gcgccagcac gtcggtgtcc ttggggacgt aatcgccgtc 1380
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ctcggtggtc ttggtatcca t 1461
<210> 5
<211> 390
<212> DNA
<213> Rhodobacter sphaeroides
<400> 5
tcagcggacg atgctgtgcg tgtagcggat cgaccggccg tcgacctcgg tgcgctccat 60
gcggaggctg ggctcgacct cggggcggtt gacgatgaag ctcatcgtga ccgtctcgaa 120
gccgcgggtg gaatcgaagg cattgatgcg gatgtagcgg ccgggccagg ccttgcggca 180
ctcgtccagc tcgatcatca cgcccttggg gtcgcgcagg tcgaacatcg gcatgcccca 240
catttcccag taggtgttcc ggggatgcgg gtcgtcggta tgttcgaggc tcacggccca 300
gccgcggccg aggcaatagt ccacctgcgc cgagatctgc gcgtcggtca ggtcgggcag 360
gaacgagaag cagccttggg tgatgcgcat 390
<210> 6
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<212> DNA
<213> Rhodobacter sphaeroides
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atggccatcg agctggagga cctggggctg agccccgatg tggcggacgt gatgcagcgt 60
ctggcgcgcg tgggggcagg catcgcccgc atcatctcgc gcaacgggct cgagcgcgat 120
ctgggcgcgg gcgtcggcac caatgccgga ggagacgggc agaaggcgct cgacgtgatc 180
gcggacgacg cgttccgcgc ggcgctcgaa ggctctgcgg tggcttatta cgcctccgag 240
gagcaggacg aagtggtgac gctgggcgag ggaagcctcg cgctcgccat cgacccgctg 300
gacggctcgt ccaacatcga tgtgaacgtg tcgatcggga cgatcttctc gatcttcccg 360
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tacatcatct acgggccgca atgcgcgctg gtctgcagct tcgggcaggg cgtgcagcac 480
tgggtgctcg acctcgatgc gggcatcttc cggcggatgc ccgacatccg cccgctgccg 540
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<212> DNA
<213> Rhodobacter sphaeroides
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gtgtcgaaga aatatcccat catttccgtg gtcggctcgt ccggcgcggg cacctcgacg 60
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<211> 1974
<212> DNA
<213> Rhodobacter sphaeroides
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cgcggcgccg acgcccgcgc ggcctgggaa acacgccttc aggcgagccc cctccgcgcc 960
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cgggatccgg gcgagcgaca ggtgacgctg atcgcgaccg gctcggagct ggagctggcg 1680
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catttcaaca tcaccgctga agccattgtc aaatcggcaa aagaacggat ctga 1974
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<211> 1002
<212> DNA
<213> Rhodobacter sphaeroides
<400> 9
atgacaatca gggttgccat caacggcttc ggccgtatcg gccgcaacgt gctgcgggcc 60
atcgtggagt cggggcgcac cgatatcgag gtggtcgcga tcaacgatct gggtcaggtc 120
gagaccaacg cgcatcttct gcgcttcgac agcgtgcacg gccgcttccc ggccaaggtc 180
accagcggag acgactggat cgatgtgggc cgcggcccga tcaaggtgac ggcgatccgc 240
aatccggcgg agctgccctg ggcgggtgtc gacatggcga tggaatgcac gggcatcttc 300
accaccaagg agaaggccgc ggcccatctg cagaacgggg cgaagcgggt gctcgtctcg 360
gcgccctgcg acggggccga ccggaccatc gtctatgggg tgaaccatgc gacgctcacc 420
gcggacgacc tcgtggtctc gaatgcctcc tgcaccacca actgcctctc gccggtggcc 480
aaggtgcttc acgatgcgat cggcatcgcc aagggcttca tgaccacgat ccacagctat 540
acgggcgacc agcccacgct cgacacgatg cacaaggatc tctaccgcgc ccgcgccgcg 600
gcgctgagca tgatccccac ctcgacggga gcggcgaagg cggtgggcct cgtgctgccc 660
gagctcaagg gccggctcga cggcgtgtcg atccgggtgc ccacgcccaa tgtctcggtg 720
gtggatctgg tgttcgaggc cgcccgcgac acgacggtgg aggaggtgaa tgcggccatc 780
gaggccgccg cctgcggacc gttgaagggc gtgctgggct tcacgaccga gcccaacgtc 840
tcgtccgact tcaaccacga cccgcattcg tcggtgttcc acatggacca gaccaaggtg 900
atggagggcc gcatggtccg catcctcagc tggtacgaca acgaatgggg cttctcgaac 960
cggatggccg acaccgccgt ggcgatgggc cggcttctct ga 1002
<210> 10
<211> 1065
<212> DNA
<213> Rhodobacter sphaeroides
<400> 10
atggcactca tcacgcttcg ccagcttctc gatcacgcgg ccgaacaggg ctacggcgtt 60
cccgccttca acatcaacaa catggagcag ggtctcgcga tcatggaggc ggcgcgggcc 120
tgcgatgcgc ccgtcatcat ccaggccagc cgcggcgcgc gcagctacgc caacgacatc 180
atgctggcca agatgatcga ggcgctggcc gcgatctatc ccgagatccc gctctgcatg 240
catcaggacc acggcaacaa cgaggccacc tgcatgaccg cgatccggca cggcttcacc 300
tcggtgatga tggacggctc actgaaggcc gatgccaaga cgcctgccga ttatgactac 360
aatgtcgata tcaccgcccg cgtgagccac atggcgcatt gggtgggcgc ctcggtcgag 420
ggtgagctgg gcgttctggg cagcctcgag accggcgaga gcgaggccga ggacgggcat 480
ggcgcggaag gcaagctcga tcacagccag ctgctgaccg accccgatca ggcggtggat 540
ttcgtgaaga agacccaggt cgatgcgctg gccatcgcct gcggcacctc gcacggcgcc 600
tacaagttca gccgcaagcc cgacggcgag atcctcgcca tgtcggtgat cgaggcgatc 660
cacaagaagc tgcccgacac ccatctcgtg atgcacggat cctcgtcggt gccgcaggag 720
ctgcaggaca tcatcaacgc gttcggcggc gccatgccgc agaccttcgg cgtgccggtc 780
gaggagatcg tgcgcggcat caagatgggc gtgcgcaagg tcaatatcga caccgactgc 840
cgcatggcga tgaccgggca gttccgccgc atcgcgcagc agacgccttc cgaattcgac 900
ccgcgcaagt tcctcaagcc cgcgatggat gcgatgcgcg acctctgcaa gcagcggctc 960
gaagccttcg gcaccgcagg ccaggccggg aagatcagga tcatcccgat ggacgatatg 1020
gccaaacgct atgccagcgg cgcgcttgcg cccaagaccg cctga 1065
<210> 11
<211> 1380
<212> DNA
<213> Rhodobacter sphaeroides
<400> 11
atggaccagt ccaaccgcta cgcccggctt gatctgcagg aagccgatct gatcgccggc 60
ggccgtcacg ttctctgcgc ctatgtcatg aagcccaagg cgggctacgg ctatctggag 120
acggcggcgc atttcgcggc cgaaagctcc accggcacca acgtcgaggt ctcgaccacc 180
gacgatttca cccgcggcgt cgatgcgctc gtctatgaga tcgacccgga gaaggagatc 240
atgaagatcg cctatccggt cgagctcttc gaccgcaaca tcatcgacgg gcgggcgatg 300
ctctgctcgt tcctgacgct gacgatcggc aacaaccagg gcatgggcga cgtcgaatat 360
gccaagatgc acgatttcta tgtgccgccc tgctatctgc gcctgttcga cggcccctcg 420
atgaacatcg ccgacatgtg gcgcgtgctg gggcgcgatg tgcgcaacgg cggcatggtg 480
gtgggcacga tcatcaagcc gaagctcggg ctgcggccga aacccttcgc ggatgcctgc 540
cacgagttct ggctgggcgg cgacttcatc aagaacgacg agccgcaggg caaccagacc 600
ttcgcgccgc tgaaggagac catccgcctc gtggccgatg cgatgaagcg cgcgcaggac 660
gagaccggcg aggccaagct cttctcggcc aacatcaccg cggacgacca ttacgagatg 720
gtggcgcgcg gggaatacat cctcgagacc ttcggcgaga atgccgacca tgtggccttc 780
ctcgtcgacg gctatgtgac gggccccgcg gccatcacca ccgcgcggcg ccagttcccg 840
cgccagttcc tgcattatca ccgggcgggg cacggcgccg tcacctcgcc gcagtcgatg 900
cggggctata cggccttcgt gctctcgaag atggcgcgcc tgcagggggc ctcgggcatc 960
cacaccggca ccatgggcta tggcaagatg gagggcgagg cggccgacaa gatcatggcc 1020
tacatgctga ccgacgaggc ggccgagggg cccttctacc gtcaggactg gctggggctg 1080
aaggccacga cgcccatcat ctcgggcggc atgaacgcgc tgcggctgcc gggcttcttc 1140
gacaatctcg gccattccaa cgtgatccag acctcgggcg gcggcgcctt cggccatctc 1200
gacggcggca cggcgggggc gaagtcgctg cgccagtcgc acgaagcctg gatggcgggg 1260
gtggatctcg tgacctatgc ccgcgagcat cgcgagctcg cccgtgcctt cgagagcttc 1320
ccggcggatg ccgacaagtt ctatccgggc tggcgcgacc ggctgcatcg cgcggcctga 1380
1380
<210> 12
<211> 2076
<212> DNA
<213> Rhodobacter sphaeroides
<400> 12
tcaggcggct ttggcggtcg cgaccgcagg atcgagcgct ccgctcgcgt agcgcttggc 60
catgtcatcc atcgggatga cggtgatctt cgaagcattg cccgcagtgc cgaaccgctc 120
gaaccggtcg cggacgaggg cctccatctc cttcatcgcg gggatcatga acttccgcgg 180
gtcgaactcc ttcgggctct ccatggcgac cttgcggaac tggccggtca gggccatccg 240
gcagtcggtg tcgatattga ccttgcggac cccgtgacgg atgccgcgct cgatctcctc 300
gaccgggact ccgtaggtct gaggcatatc gccgccatgg gcgttgatga gatcctgcag 360
cgcctgcggc accgaggacg agccgtgcat caccagatgc gtcgcgggca gccgggcgtg 420
gatctcctcg atcacgcgca tggcgaggat ctcgccgtcc ggcttgcggc tgaacttgta 480
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ctccaccgcc tgatccgggt cggtcagcat ctggctgtgg tcgagctttc cttccgcacc 600
cgagccgtcc tcggcctccg cctcgccctt ctcgaggctg cccagcaccc ccagctcgcc 660
ctcgaccgag gctccgaccc agtgggccgc gtcggtcacg cggcgggtga tgtccacgtt 720
gtaatcgtag gaggccaccg tcttcatgtc ggcctgaagc gatccgtcca tcatcaccga 780
ggtgaagccg tgccggatcg ccgagaggca ggtggcctcg ttgttgccgt ggtcctgatg 840
caggcagatc gggatctgcg gatacatttc ggccagcgcc tcgacgatgt ggcgcagcat 900
gatgtcgccg gcatagctgc gcgccccgcg gctggcctgc aggatcaccg gcgcgtcgca 960
ggcgcgggcg gcggcgagga tggcgagccc ctgctccatg ttgttgatgt tgaaggcggg 1020
cacgccatag ccgcgctctg cggcatggtc gagcaattgt ctgagcgtga tcagggccat 1080
gggtctcctc ccgggtcgtc atgtcagtcg gatgggtgcg ggatatcggc cggccgggcg 1140
ggtgccggcc gggacggtcg agccgagggt ccgaggcggc tctgcgcccg ccccgggtcc 1200
ggatcaggcc accttgctct ctcggacgag gcggtcgatc agcggtgtca ggatcagctg 1260
catcgcgagg tccagcttgt tgccgggcac cacgatggaa ttggcgcggc tcatccacga 1320
gccgtggatc atcgaggtga gataggggaa gtcgatcccg cgcggattgc ggaaacggat 1380
caccaccacg ctctcgtcgg cggtggggat ccagcgcgcg atgaaggggt tcgaggtatc 1440
caccaccggc acgcgctgga agttgatgtc ggtctgcgag aattgcggca cgatgcagtg 1500
aacgtaggca tgcatccggc gcaggatcac gtcggtgacc gcctcggtcg tgtaaccgcg 1560
ggtcgcgcgg tcgcggtgga tcttctggat ccattcgagg ttgatgaccg gaaccacgcc 1620
gatcttgagg tcggccagcc ccgcgatatt gacctcgctg ttcaccaccg ccccgtgcaa 1680
cccctcgtag aacagcaggt ggctgtcgct gtcgaagtcg cgccagtcgg tgaagttgcc 1740
gggcgccacg ccggtgcgcg ccgcttcggc atcgtcatgg acgtaggtcc gcgtccgccc 1800
ctgcccggtc tcgccgtact cgcggaagac gcgctccagc tccttcagct cgttcgcctc 1860
gtaggagaag tgcgagaagg tggcgtcgcc cgccgcatag cgccggtcca gctcggcctt 1920
catgtcggcg cggttgaagc ggtggaaggc gtcgccctcg atcgagaccg ccttgacccc 1980
ctcgcgccgg aagatctggt cgaacgtgtg cttcaccgtc gaggtgcccg cgccggacga 2040
gcccgtgacc gagatgatgg gatgcttctt gctcat 2076
<210> 13
<211> 1862
<212> DNA
<213> Rhodobacter sphaeroides
<400> 13
tcagcggacg atgctgtgcg tgtagcggat cgaccggccg tcgacctcgg tgcgctccat 60
gcggaggctg ggctcgacct cggggcggtt gacgatgaag ctcatcgtga ccgtctcgaa 120
gccgcgggtg gaatcgaagg cattgatgcg gatgtagcgg ccgggccagg ccttgcggca 180
ctcgtccagc tcgatcatca cgcccttggg gtcgcgcagg tcgaacatcg gcatgcccca 240
catttcccag taggtgttcc ggggatgcgg gtcgtcggta tgttcgaggc tcacggccca 300
gccgcggccg aggcaatagt ccacctgcgc cgagatctgc gcgtcggtca ggtcgggcag 360
gaacgagaag cagccttggg tgatgcgcat gtccggtctc cttacatcgc gaccgaggcg 420
gtcggcacga agtccgacgt gtcggtggag gtgtagttga aggtgatgtt gccccaggta 480
tcgagggcgg cctccagcgg cttgcaccat ttggccgcgg cgcggaggat ctccgggccc 540
tccacatcga tgttgcggcc ctcgttgcgc gccagcacca tcgcttccag cgccacgcgg 600
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agcaccacat cgtcgccgaa gaggctcaga agctggtgca tctgcccggc atggatcccg 720
cccgaggcca ccggcatgac cttcctcagg tccgcccagt cctgctcgaa gaagatcccg 780
cgcggcaggt cgaccgtgtt gaagggctcg cggcagacat tgtaatagcc ctgcaccgtc 840
agcgggtcgc cctcgagctt gcccacggcc gtgccgcaat gcagatggtc cacccccgcc 900
agccgcagcc acttggcgat cacgcggaag ctgatgccgt ggttcttctg ccgcgtgtag 960
gtgccgtggc ccgcgcggtg catgtgcagg atcatgtcgt tctgccggca ccattccgag 1020
atcgactgga tcgccgtata gccgatgatg agatcgacca tcacgatgac cgagccaagc 1080
gacttggcga attccgcccg ccggtacatc tcctccatcg tgccggcggt gatgttgagg 1140
tagtggccct tcacctcgcc ggtctgggcc gaggcgaggt tcaccgcctc catcacatag 1200
aggaaccggt cgcgccagtg catgaagggc tgcgagttga tgttctcgtc gtccttcatg 1260
aagtcgaggc cgcccttcag cccctcatag accacgcggc cgtagttctt gcccgacagg 1320
ccgagcttgg gcttcgtggt ggcgccgaga aggggcttgc cgaacttgtc cagccgctcg 1380
cgctcgccca cgatgccggt gggcgggccc ttgtaggtct tcacataggc cacggggaag 1440
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gaggcggtga ggttggcgat cgagccttcc tcgaacagga tcaggtcata ggccacatag 1560
cagaaatact gccccggcgt gcccggcacc ggctccaccc ggtaggcctt ggcgcggtag 1620
ctgtcgcagg cggtcagccg gtcggtccag accacggtcc aggtcgcagt cgagctttcg 1680
ccggccacgg cggcggccgc ctcgaccgga tccaccccct cctgcggtgt gatgcggaac 1740
agcgccagca cgtcggtgtc cttggggacg taatcgccgt cccagtaacc catctgggca 1800
tatttcagga cgccggcctt gtagcgttcc ttgcccttga tctcggtggt cttggtatcc 1860
at 1862
<210> 14
<211> 1878
<212> DNA
<213> Rhodobacter sphaeroides
<400> 14
atggccatcg agctggagga cctggggctg agccccgatg tggcggacgt gatgcagcgt 60
ctggcgcgcg tgggggcagg catcgcccgc atcatctcgc gcaacgggct cgagcgcgat 120
ctgggcgcgg gcgtcggcac caatgccgga ggagacgggc agaaggcgct cgacgtgatc 180
gcggacgacg cgttccgcgc ggcgctcgaa ggctctgcgg tggcttatta cgcctccgag 240
gagcaggacg aagtggtgac gctgggcgag ggaagcctcg cgctcgccat cgacccgctg 300
gacggctcgt ccaacatcga tgtgaacgtg tcgatcggga cgatcttctc gatcttcccg 360
gcggcggctg gccccgaggc cagcttcctg cgcccgggca ccgagcagat tgccggcggc 420
tacatcatct acgggccgca atgcgcgctg gtctgcagct tcgggcaggg cgtgcagcac 480
tgggtgctcg acctcgatgc gggcatcttc cggcggatgc ccgacatccg cccgctgccg 540
gccgagacgt ccgagtttgc gatcaacgcc tcgaactacc gccactggcc gcagccgatc 600
cgcgccttcg tcgacgatct ggtcgccggg gccgaggggc cgcgcggcaa gaacttcaac 660
atgcgctgga tcgcctcgct ggtggccgag acgcaccgca tcctgatgcg gggcggggtg 720
tttctctatc ccggcgacga gcgcaagggc tacgagcggg gccggctgcg ccatgtctac 780
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tgcgcgagca aggtcgcccg cgtcgccgcc tatcacgatc tggcctgcga agagacgtcc 960
gctctcttcg gcagccgggg cctgttccgg agttaaagag tgtcgaagaa atatcccatc 1020
atttccgtgg tcggctcgtc cggcgcgggc acctcgacgg tcaagaacac gttcgagcag 1080
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tcgcatttct cctacgaggc gaacgaactg aaggagctgg agcgcgtctt ccgcgaatat 1260
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tcgatgatcg cgggctcgtg gatgagccgg gcgaattcca tcgtggtgcc gggcaacaag 1800
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cgccgcgcgc gggcctga 1878
<210> 15
<211> 2986
<212> DNA
<213> Rhodobacter sphaeroides
<400> 15
atgaaggaca ttggagccgc gcaggagacg cggatggcga acgccatccg ggccctcgcg 60
atggatgcgg tggagaaggc caagtcgggc catcccggga tgccgatggg gatggcggac 120
gtggcgaccg tcctcttcaa ccgctttctc acggtcgatc cttcggcgcc caaatggccc 180
gaccgcgacc ggttcgtgct gtcggcgggg catggctcga tgctgctcta tgccatccat 240
catctgctgg gctatgccga tatggacatg gatcagatcc ggtccttccg ccagctcggc 300
gcgcggacgg cgggccaccc ggaatacggc catgccgagg ggatcgaggt cacgaccggg 360
ccgctcggtc aggggatcgc gaccgcggtg ggcatggcgc tggccgagcg catgaagaac 420
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ctgatggagg gcatctcgca cgaggccatc gacatggcgg gtcatctggg cctcggccgg 540
ctgatcgtgc tgtgggacga caaccgcatc accatcgacg gcgacacggg catctcgacc 600
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gtccatggcg cgccgctggg cgcggccgag atcgcggcgg cgcgcgagcg gctcggctgg 840
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catggcggcc tgcgccccta cggcggcacc ttcatggcct tcgccgacta ttgccggccc 1320
tcgatccggc tctcggcgct gatgggcgtg ccggtgacct atgtcatgac gcacgattcc 1380
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cgggatccgg gcgagcgaca ggtgacgctg atcgcgaccg gctcggagct ggagctggcg 1680
ctggccgcgg cggatcttct ggccgcggaa ggcatcgccg ccgccgtggt ctcggcgccc 1740
tgcttcgagc tcttcgccgc gcagccggcg gactaccggg cgacggttct gggacgggcc 1800
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ggccatcgtg gagtcggggc gcaccgatat cgaggtggtc gcgatcaacg atctgggtca 2100
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ccgcaatccg gcggagctgc cctgggcggg tgtcgacatg gcgatggaat gcacgggcat 2280
cttcaccacc aaggagaagg ccgcggccca tctgcagaac ggggcgaagc gggtgctcgt 2340
ctcggcgccc tgcgacgggg ccgaccggac catcgtctat ggggtgaacc atgcgacgct 2400
caccgcggac gacctcgtgg tctcgaatgc ctcctgcacc accaactgcc tctcgccggt 2460
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ggtggtggat ctggtgttcg aggccgcccg cgacacgacg gtggaggagg tgaatgcggc 2760
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ggtgatggag ggccgcatgg tccgcatcct cagctggtac gacaacgaat ggggcttctc 2940
gaaccggatg gccgacaccg ccgtggcgat gggccggctt ctctga 2986
<210> 16
<211> 2471
<212> DNA
<213> Rhodobacter sphaeroides
<400> 16
atggcactca tcacgcttcg ccagcttctc gatcacgcgg ccgaacaggg ctacggcgtt 60
cccgccttca acatcaacaa catggagcag ggtctcgcga tcatggaggc ggcgcgggcc 120
tgcgatgcgc ccgtcatcat ccaggccagc cgcggcgcgc gcagctacgc caacgacatc 180
atgctggcca agatgatcga ggcgctggcc gcgatctatc ccgagatccc gctctgcatg 240
catcaggacc acggcaacaa cgaggccacc tgcatgaccg cgatccggca cggcttcacc 300
tcggtgatga tggacggctc actgaaggcc gatgccaaga cgcctgccga ttatgactac 360
aatgtcgata tcaccgcccg cgtgagccac atggcgcatt gggtgggcgc ctcggtcgag 420
ggtgagctgg gcgttctggg cagcctcgag accggcgaga gcgaggccga ggacgggcat 480
ggcgcggaag gcaagctcga tcacagccag ctgctgaccg accccgatca ggcggtggat 540
ttcgtgaaga agacccaggt cgatgcgctg gccatcgcct gcggcacctc gcacggcgcc 600
tacaagttca gccgcaagcc cgacggcgag atcctcgcca tgtcggtgat cgaggcgatc 660
cacaagaagc tgcccgacac ccatctcgtg atgcacggat cctcgtcggt gccgcaggag 720
ctgcaggaca tcatcaacgc gttcggcggc gccatgccgc agaccttcgg cgtgccggtc 780
gaggagatcg tgcgcggcat caagatgggc gtgcgcaagg tcaatatcga caccgactgc 840
cgcatggcga tgaccgggca gttccgccgc atcgcgcagc agacgccttc cgaattcgac 900
ccgcgcaagt tcctcaagcc cgcgatggat gcgatgcgcg acctctgcaa gcagcggctc 960
gaagccttcg gcaccgcagg ccaggccggg aagatcagga tcatcccgat ggacgatatg 1020
gccaaacgct atgccagcgg cgcgcttgcg cccaagaccg cctgaaaagc ctcgtgtgaa 1080
aggatacgat catggaccag tccaaccgct acgcccggct tgatctgcag gaagccgatc 1140
tgatcgccgg cggccgtcac gttctctgcg cctatgtcat gaagcccaag gcgggctacg 1200
gctatctgga gacggcggcg catttcgcgg ccgaaagctc caccggcacc aacgtcgagg 1260
tctcgaccac cgacgatttc acccgcggcg tcgatgcgct cgtctatgag atcgacccgg 1320
agaaggagat catgaagatc gcctatccgg tcgagctctt cgaccgcaac atcatcgacg 1380
ggcgggcgat gctctgctcg ttcctgacgc tgacgatcgg caacaaccag ggcatgggcg 1440
acgtcgaata tgccaagatg cacgatttct atgtgccgcc ctgctatctg cgcctgttcg 1500
acggcccctc gatgaacatc gccgacatgt ggcgcgtgct ggggcgcgat gtgcgcaacg 1560
gcggcatggt ggtgggcacg atcatcaagc cgaagctcgg gctgcggccg aaacccttcg 1620
cggatgcctg ccacgagttc tggctgggcg gcgacttcat caagaacgac gagccgcagg 1680
gcaaccagac cttcgcgccg ctgaaggaga ccatccgcct cgtggccgat gcgatgaagc 1740
gcgcgcagga cgagaccggc gaggccaagc tcttctcggc caacatcacc gcggacgacc 1800
attacgagat ggtggcgcgc ggggaataca tcctcgagac cttcggcgag aatgccgacc 1860
atgtggcctt cctcgtcgac ggctatgtga cgggccccgc ggccatcacc accgcgcggc 1920
gccagttccc gcgccagttc ctgcattatc accgggcggg gcacggcgcc gtcacctcgc 1980
cgcagtcgat gcggggctat acggccttcg tgctctcgaa gatggcgcgc ctgcaggggg 2040
cctcgggcat ccacaccggc accatgggct atggcaagat ggagggcgag gcggccgaca 2100
agatcatggc ctacatgctg accgacgagg cggccgaggg gcccttctac cgtcaggact 2160
ggctggggct gaaggccacg acgcccatca tctcgggcgg catgaacgcg ctgcggctgc 2220
cgggcttctt cgacaatctc ggccattcca acgtgatcca gacctcgggc ggcggcgcct 2280
tcggccatct cgacggcggc acggcggggg cgaagtcgct gcgccagtcg cacgaagcct 2340
ggatggcggg ggtggatctc gtgacctatg cccgcgagca tcgcgagctc gcccgtgcct 2400
tcgagagctt cccggcggat gccgacaagt tctatccggg ctggcgcgac cggctgcatc 2460
gcgcggcctg a 2471
<210> 17
<211> 27
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
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<223> cbbF forward primer
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<223> prkA-cfxA reverse primer
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
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<223> cbbL-cbbS reverse primer
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<212> DNA
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<223> cfxB-rbpL reverse primer
<400> 28
aataagcttt caggccgcgc gatgcag 27
Claims (11)
- 캘빈-벤슨-배스햄 회로(Calvin-Benson-Bassham cycle)를 코딩하는 유전자를 포함하는 재조합 미생물을 16~30 ℃에서 배양하는 단계를 포함하는, 상기 재조합 미생물에 의한 이산화탄소 고정 방법.
- 제1항에 있어서,
상기 캘빈-벤슨-배스햄 회로(Calvin-Benson-Bassham cycle)를 코딩하는 유전자는 (ⅰ) D-프럭토스-1,6-비스포스파타아제(D-fructose-1,6-bisphosphatase)를 코딩하는 유전자(cbbF), 포스포리불로오스 인산화효소(phosphoribulokinase)를 코딩하는 유전자 (prkA), 프럭토스-1,6-비스포스파테이트 알돌라아제(fructose-1,6-bisphosphate aldolase)를 코딩하는 유전자(cfxA), 리불로오스 비스포스파테이트 카르복실라아제/옥시게나아제 라지 서브유닛 (ribulose bisphosphate carboxylase/oxygenase large subunit)을 코딩하는 유전자 (cbbL) 및 리불로오스-1,5-비스포스파테이트 카르복실레이즈 스몰 서브유닛(ribulose-1,5-bisphosphate carboxylase small subunit)을 코딩하는 유전자(cbbS); 또는 (ⅱ)D-프럭토스-1,6-비스포스파타아제(D-fructose-1,6-bisphosphatase)를 코딩하는 유전자(fbpB), 포스포리불로오스 인산화효소(phosphoribulokinase)를 코딩하는 유전자 (prkB), 트랜스케톨라제(transketolase)를 코딩하는 유전자(tklB), 글리세르알데하이드-3-포스파테이트 디하이드로게나아제(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase)를 코딩하는 유전자(gapB), 프럭토스-1,6-비스포스파테이트 알돌라아제(fructose-1,6-bisphosphate aldolase)를 코딩하는 (cfxB) 및 리불로오스 비스포스파테이트 카르복실라아제/옥시게나아제 라지 서브유닛(ribulose bisphosphate carboxylase/oxygenase large subunit)를 코딩하는 유전자(rbpL)인 것인, 상기 재조합 미생물에 의한 이산화탄소 고정 방법.
- 제2항에 있어서,
상기 (ⅰ) cbbF, prkA, cfxA, cbbL 및 cbbS 유전자는 로도박터 스페로이드(Rhodobacter sphaeroides)의 캘빈-벤슨-배스햄(Calvin- Benson-Bassham; cbb) I 오페론 유래인 것을 특징으로 하며, 상기 (ⅱ) fbpB, prkB, tklB, gapB, cfxB 및 rbpL 유전자는 로도박터 스페로이드(Rhodobacter sphaeroides)의 캘빈-벤슨-배스햄(Calvin- Benson-Bassham; cbb) Ⅱ 오페론 유래인 것을 특징으로 하는 것인, 상기 재조합 미생물에 의한 이산화탄소 고정 방법.
- 제1항에 있어서,
상기 캘빈-벤슨-배스햄 회로(Calvin-Benson-Bassham cycle)를 코딩하는 유전자는 (ⅰ) 서열번호 1로 표시되는 cbbF 유전자, 서열번호 2로 표시되는 prkA 유전자, 서열번호 3으로 표시되는 cfxA 유전자, 서열번호 4로 표시되는 cbbL 유전자 및 서열번호 5로 표시되는 cbbS 유전자; 또는 (ⅱ) 서열번호 6으로 표시되는 fbpB 유전자, 서열번호 7로 표시되는 prkB 유전자, 서열번호 8로 표시되는 tklB 유전자, 서열번호 9로 표시되는 gapB 유전자, 서열번호 10으로 표시되는 cfxB 유전자 및 서열번호 11로 표시되는 rbpL 유전자인 것을 특징으로 하는 것인, 상기 재조합 미생물에 의한 이산화탄소 고정 방법.
- 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서,
IPTG(isopropyl-1-thio-β-D-galactopyranoside), RuBP(ribulose-1, 5-bisphosphate) 및 ZnPc(Zinc phthalocyanine)로 이루어지는 군에서 선택되는 어느 하나 이상의 화합물을 재조합 미생물 배양 배지에 처리하는 단계를 추가적으로 포함하는 것을 특징으로 하는, 상기 재조합 미생물에 의한 이산화탄소 고정 방법.
- 캘빈-벤슨-배스햄 회로(Calvin-Benson-Bassham cycle)를 코딩하는 유전자를 포함하는 재조합 미생물을 16~30 ℃에서 배양하는 단계를 포함하는, 상기 재조합 미생물에 의한 유용물질의 생산 방법.
- 제6항에 있어서,
상기 캘빈-벤슨-배스햄 회로(Calvin-Benson-Bassham cycle)를 코딩하는 유전자는 (ⅰ) D-프럭토스-1,6-비스포스파타아제(D-fructose-1,6-bisphosphatase)를 코딩하는 유전자(cbbF), 포스포리불로오스 인산화효소(phosphoribulokinase)를 코딩하는 유전자 (prkA), 프럭토스-1,6-비스포스파테이트 알돌라아제(fructose-1,6-bisphosphate aldolase)를 코딩하는 유전자(cfxA), 리불로오스 비스포스파테이트 카르복실라아제/옥시게나아제 라지 서브유닛 (ribulose bisphosphate carboxylase/oxygenase large subunit)을 코딩하는 유전자 (cbbL) 및 리불로오스-1,5-비스포스파테이트 카르복실레이즈 스몰 서브유닛(ribulose-1,5-bisphosphate carboxylase small subunit)을 코딩하는 유전자(cbbS); 또는 (ⅱ) D-프럭토스-1,6-비스포스파타아제(D-fructose-1,6-bisphosphatase)를 코딩하는 유전자(fbpB), 포스포리불로오스 인산화효소(phosphoribulokinase)를 코딩하는 유전자 (prkB), 트랜스케톨라제(transketolase)를 코딩하는 유전자(tklB), 글리세르알데하이드-3-포스파테이트 디하이드로게나아제(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase)를 코딩하는 유전자(gapB), 프럭토스-1,6-비스포스파테이트 알돌라아제(fructose-1,6-bisphosphate aldolase)를 코딩하는 (cfxB) 및 리불로오스 비스포스파테이트 카르복실라아제/옥시게나아제 라지 서브유닛(ribulose bisphosphate carboxylase/oxygenase large subunit)를 코딩하는 유전자(rbpL)인 것인, 상기 재조합 미생물에 의한 유용물질의 생산 방법.
- 제6항에 있어서,
상기 (ⅰ) cbbF, prkA, cfxA, cbbL 및 cbbS 유전자는 로도박터 스페로이드(Rhodobacter sphaeroides)의 캘빈-벤슨-배스햄(Calvin- Benson-Bassham; cbb) I 오페론 유래인 것을 특징으로 하며, 상기 (ⅱ) fbpB, prkB, tklB, gapB, cfxB 및 rbpL 유전자는 로도박터 스페로이드(Rhodobacter sphaeroides)의 캘빈-벤슨-배스햄(Calvin- Benson-Bassham; cbb) Ⅱ 오페론 유래인 것을 특징으로 하는 것인, 상기 재조합 미생물에 의한 유용물질의 생산 방법.
- 제6항에 있어서,
상기 캘빈-벤슨-배스햄 회로(Calvin-Benson-Bassham cycle)를 코딩하는 유전자는 (ⅰ) 서열번호 1로 표시되는 cbbF 유전자, 서열번호 2로 표시되는 prkA 유 전자, 서열번호 3으로 표시되는 cfxA 유전자, 서열번호 4로 표시되는 cbbL 유전자 및 서열번호 5로 표시되는 cbbS 유전자; 또는 (ⅱ) 서열번호 6으로 표시되는 fbpB 유전자, 서열번호 7로 표시되는 prkB 유전자, 서열번호 8로 표시되는 tklB 유전자, 서열번호 9로 표시되는 gapB 유전자, 서열번호 10으로 표시되는 cfxB 유전자 및 서열번호 11로 표시되는 rbpL 유전자인 것을 특징으로 하는 것인, 상기 재조합 미생물에 의한 유용물질의 생산 방법.
- 제6항에 있어서,
상기 유용물질은 캘빈 회로에 의해 생성되는 글루코스(glucose), 슈크로스(sucrose), 프럭토스 (fructose)로 구성된 군에서 선택되는 어느 하나 이상의 당, 유기산 및 ATP로 구성된 군에서 선택된 어느 하나 이상인, 상기 재조합 미생물에 의한 유용물질의 생산 방법.
- 제6항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서,
IPTG(isopropyl-1-thio-β-D-galactopyranoside), RuBP(ribulose-1, 5-bisphosphate) 및 ZnPc(Zinc phthalocyanine)로 이루어지는 군에서 선택되는 어느 하나 이상의 화합물을 재조합 미생물 배양 배지에 처리하는 단계를 추가적으로 포함하는 것을 특징으로 하는, 상기 재조합 미생물에 의한 유용물질의 생산 방법.
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