KR102681997B1 - 형광 접합체 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 표적 모이어티 T에 결합된 형광 색소 모이어티 F를 갖는 접합체를 제공한다. 모이어티 F는 화학식(I)로 기술되고, 표적 모이어티 T는 항체 또는 항체 단편 등의 종양 결절의 광검출을 포함하는 종양 진단을 위해 사용할 수 있다.
Description
본 발명은 생물의학 연구 분야의 것으로, 특히, 진단, 예를 들어 종양의 시험관내 또는 생체내 진단에 유용한 방법 및 화합물에 관한 것이다.
암은 현재 전세계 사망의 약 13 %를 차지한다. 수십 년에 걸친 집중적인 연구에도 불구하고, 암은 최선진국에서, 사망의 대략 25%를 차지하는, 두 번째 주요 사망 원인으로 남아있다. 많은 종류의 암의 경우, 종종 화학요법, 방사선 치료 또는 고열치료과 조합하는, 수술이 치료 중재의 주류이다.
암은 또한 악성 신생물, 또는 악성 종양으로서 지칭된다. 신생물은 조직의 비정상적인 성장이다. 신생물은 양성 신생물, 전암성 또는 제위치 신생물, 및 악성 신생물로 분화된다. 신생물 전체는 아니지만 다수의 신생물은 또한, 영향을 받지 않은 조직과 해부학적으로 구별될 수 있는 고형 또는 유체가 채워진 병변인, 종양을 형성한다. 신생물처럼, 종양은 양성, 전암성, 또는 악성일 수 있다. 그러나, 본 발명의 상세한 설명에서뿐만 아니라 공통 언어에서, 용어 "종양"은 "악성 종양"과 동의어로서 사용될 수 있다.
암 환자의 활력 예후는 처음 진단되었을 때 질환의 병기에 따라 달라진다. 위장암을 앓고있는 환자의 20-30%는 고유의 재발로서 국소영역 재발이 발달할 것이다. 상피성 난소 종양은 또한 단계 III에 이르는 경우 국소 영역 발전을 보여준다. 몇년 전 완전한 수술적 절제가 환자의 예후 개선에 있어서 아주 중요한 요인이다는 것이 증명되었다. 이 최대 세포수감소 전략은 고열치료와 관련될 가능성이 있는 전신성 또는 복막내 화학요법을 포함하는 치료 프로토콜의 일부이다.
치료적 수술의 구성은 환자의 미래를 위한 주요한 매개변수이다. 종양 결절 및 이들의 전파(dissemination)의 전체 검출은 수술 후 예후에 영향을 주는 주요 사항이다. 종양과 정상 조직을 구별하는 것은, 특히 환자가 선행-보조 치료를 받은 경우, 항상 쉽지는 않다. 외과의는 그후 자신의 시각 및 촉각 감각, 또는 자신의 경험만을 지침으로 한다. 종양의 확대를 가시화하도록 도울 수 있는 수술 중에 이용가능한 기술은 없다.
제위치 광검출의 사용에 의해 암 절제 수술이 개선될 수 있을 것으로 제안되어 왔다. 광검출은 종양에 친화력을 가지며 선택된 파장의 광에서 광학적으로 가시화될 수 있는 화합물에 의해 잠재적으로 영향받은 조직의 노출에 의존한다.
종양의 광검출은 본래 포토프린과 같은 헤마토포르피린 유도체를 사용하여 1980년도에 개발되었다. 이들 분자를 사용하는 광진단의 주요 제한은 암성 조직에 대한 이의 낮은 선택성 및 화학적으로 반응하여 높은 광민감성 및 괴사를 유도하는 이들의 성능이다. 후자의 제한은, 사실상, 이들 화합물이 또한 제안되는, 광역학 요법에 있어서는 장점이다.
Folli등은 대장암을 가진 환자에서 종양을 가시화하기 위해 플루오레세인을 포함하는 암종 태아성 (CEA) 항원에 대한 항체의 접합체를 사용하였다 (Proc. Natl. Acad. Sci. USA, vol. 89, pp. 7973-7977, 1992). 항-CEA MAb 35A7과 인도시아닌(Cy5)의 접합체를 사용하는 결장암 LS174T 병변의 면역광검출은 Gutowsky등에 의한 마우스 모델에서 증명되었다 (Clin. Cancer Res., vol. 7, pp. 1142-1148, 2001).
그러나, 이들 접합체의 임상적 유용성은 다소 제한적이다. 플루오레세인과 항체의 접합체는 다소 낮은 여기 및 방출 파장을 가져, 낮은 조직 투과를 초래하고 염료 성분을 여기시키기 위해 사용되는 레이저 광에 의해 유도된 비-암성 조직의 상당한 정도의 비특이적 자가형광을 초래한다. Cy5 접합체의 독성은 알려져 있지 않고 문헌에서 여전히 잘 확립되어 있지 않다.
본 발명은 종양 광검출의 이들 및 다른 관련된 문제점 및 단점을 다룬다. 본 발명의 목적 중 하나는 선행 기술의 하나 이상의 단점을 극복하고, 다음 특성 중 하나 이상을 갖는 임상적으로 실행가능한 악성 또는 전암성 종양의 광검출에 유용한 개선된 접합체를 제공하는 것이다: 높은 수준의 종양 특이성, 매우 작은 종양 병변의 검출을 가능하도록 하는 높은 민감성, 우수한 임상 용인성, 높은 안정성, 다른 염료와의 낮은 간섭, 및 우수한 제조가능성.
본 발명의 추가적인 목적은 이러한 접합체를 이용하여, 시험관내 및 생체내 모두에서 종양에 대한 개선된 진단 방법을 제공하는 것이다. 생체내에서 사용되는 이러한 진단 방법은 개선된 종양 절제 방법과 같은 신규 치료의 일부일 수 있다.
본 발명의 추가적인 목적은 이러한 접합체를 제조하기 위한 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 추가적인 목적은 다음의 본 발명의 상세한 설명 및 청구항을 기초로 하여 명확해질 것이다.
요약하면, 본 발명은 표적 모이어티 T에 결합된 형광 색소 모이어티 F를 포함하는 형광 접합체로서, 모이어티 F는 하기 본 명세서에 정의된 바와 같은 화학식 (I)을 가지고, Y는 각각 독립적으로 SO3H, SO3- 및 SO3M로부터 선택되고; M은 1가 양이온이고; x, z 및 y는 1내지 8의 정수 중 독립적으로 선택되고; 여기서 모이어티 T는 종양 마커에 친화력을 가지는 형광 접합체를 제공한다. 일 실시형태에서, 형광 색소 모이어티 F는 하기 정의된 바와 같은 화학식 (II)를 가질 수 있다.
표적 모이어티 T는 종양 항원, 특정 종양 세포에 의해 발현되거나 또는 과발현된 항원일 수 있는 종양 마커에 친화력을 가진다. 이러한 항원의 예는 암종 태아성 항원 (CEA)이다. 표적화 모이어티 T 자체는 비-펩티드성 리간드, 항체, 항체 단편, 또는 항체의 적어도 하나의 가변 영역을 포함하는 융합 단백질일 수 있다. 일 실시형태에서, 표적 모이어티 T는 항체, 특히, 키메라형, 인간화된 또는 인간 모노클로날 항체이다.
추가의 양태에서, 본 발명은 이러한 접합체를, 경우에 따라 추가적인 활성 또는 불활성 성분과 함께, 포함하는 조성물을 제공한다. 예를 들어, 조성물은 무균일 수 있고, 불활성 성분 예를 들어, 주사를 위한 물, 완충액 성분, 아미노산과 같은 하나 이상의 안정화제, 모노-, 디-, 또는 올리고사카라이드와 같은 동결건조 보조제, 등장화제 등을 포함한다. 조성물은 비접합된 형태인 소량의 표적 모이어티 T를 또한 포함할 수 있다.
다른 추가적인 양태에서, 본 발명은 접합체를 제조하기 위한 방법을 제공한다. 방법은 (a) 하기 정의된 바와 같은 화학식 (III)을 갖는 형광 색소를 제공하는 단계로서, 여기에서 Y는 각각 독립적으로 SO3H, SO3- 및 SO3M로부터 선택되고; 여기서 M은 1가 양이온이고, x, z 및 y는 1 내지 8의 정수 중에서 독립적으로 선택되고, z는 반대이온, 수소, 숙신이미딜, 술포숙신이미딜, 및 니트로페닐로부터 선택되는 것인 단계; (b) 종양 마커에 친화력을 갖는 표적화제를 제공하는 단계; 및 (c) 형광 색소를 표적화제와 결합시키는 단계를 포함한다. 일 실시형태에서, 형광 색소는 하기 정의된 바와 같은 화학식 (IV)을 가진다.
더욱이, 본 발명은 접합체 및 상기 접합체를 포함하는 조성물의 임상 및 비-임상 사용을 제공한다. 시험관내 사용은 종양 세포 또는 시료 중의 종양 세포를 검출, 또는 시험관내 종양의 진단 및/또는 모니터링을 위한 사용을 포함한다. 임상적으로, 접합체 및/또는 상기 접합체를 포함하는 조성물은 종양 마커를 발현하는 병소를 검출하거나 또는 환자에서 종양 마커를 발현하는 종양의 위치를 결정하기 위해 사용될 수 있다. 예를 들어, 이들은 절제 수술을 시행중인 환자 또는 절제 수술을 받은 환자의 절제 마진에서 종양 세포 또는 종양 조직을 검출하기 위해 사용될 수 있다. 일 실시형태에서, 상기 접합체를 포함하는 조성물은 표적 모이어티 T가 친화력을 갖는 종양 마커를 발현하는 종양을 갖는 환자에게, 예를 들어 정맥내, 복막내, 피하, 또는 근육내 주사 또는 관류에 의해 또는 흡입에 의해 또는 국소 투여, 예를 들어, 분무로서 투여되고; 약 72 시간 이하 내에 종양 절제 수술을 환자에서 개시한 이후, 약 660 내지 700 nm의 파장을 갖는 광으로 절제 수술이 시행중인 환자의 절제 부위의 조직을 조명한다. 이런 방식에서, 사람의 육안으로 달리는 보이지 않는 매우 작은 결절 또는 병변의 위치표시(localisation)을 포함하는, 종양의 국소결정은 외과의가 절제의 완전성을 검증하고/하거나 종양 조직을 완전히 절제하도록 안내하기 위해 가시화될 수 있다.
도 1은 20μg의 실시예 3의 형광 접합체의 투여 후 700 nm에서 가시화된, LS-174T 복막 암종증 마우스 모델에서 제위치 (컬럼 A) 및 절제된 (컬럼 B) 종양 미세결절의 형광을 나타낸다.
도 2A는 30μg의 형광 접합체 (A - 실시예 3 형광 접합체; B - 대조군 접합체)의 투여 48시간 후 촬영된, CEA를 과발현하는 인간 대장암 (HT-29)의 피하 종양 마우스 모델에서 종양의 이미지를 나타낸다. 왼쪽부터 오른쪽으로의 컬럼은 백색광, 형광 (700nm에서 가시화) 및 중첩 하에 촬영된 이미지를 나타낸다.
도 2B는 30μg의 실시예 3의 형광 접합체 투여 48 시간 후 촬영된, CEA를 과발현하는 인간 대장암 (HT-29)의 동소이식 종양 마우스 모델에서 종양의 이미지를 나타낸다 (A - 절개 전, B - 절개 후, C - 종양의 노출 후). 왼쪽부터 오른쪽으로의 컬럼은 백색광, 형광 (700 nm에서 가시화) 및 중첩 하에 촬영된 이미지를 나타낸다.
도 3은 5mg의 실시예 3의 형광 접합체의 투여 48시간 후, 환자에서 일차 췌장암의 수술 동안 촬영된 이미지를 나타낸다 (A는 백색광 하, B는 형광과의 이미지 중첩임). 파선은 가시화 및 촉진(palpation) 만을 기초로하여 제안된 절제 마진을 표시하는 반면, 실선은 형광 가시화를 기반으로 하여 제안된 절제 마진을 표시한다. 점선은 형광에 의해 나타난 바의 종양의 대략적인 윤곽을 나타낸다.
도 4는 5 mg의 실시예 3의 형광 접합체의 투여 48 시간 후, 췌장암 환자의 복막 전이의 이미지를 나타낸다. A 열의 이미지는 생체내에서 수술 중 얻었고, B열의 이미지는 절제 후 생체외에서 얻었다 (좌측 컬럼은 백색광 하이고, 오른쪽 컬럼은 형광과의 중첩 이미지임).
도 2A는 30μg의 형광 접합체 (A - 실시예 3 형광 접합체; B - 대조군 접합체)의 투여 48시간 후 촬영된, CEA를 과발현하는 인간 대장암 (HT-29)의 피하 종양 마우스 모델에서 종양의 이미지를 나타낸다. 왼쪽부터 오른쪽으로의 컬럼은 백색광, 형광 (700nm에서 가시화) 및 중첩 하에 촬영된 이미지를 나타낸다.
도 2B는 30μg의 실시예 3의 형광 접합체 투여 48 시간 후 촬영된, CEA를 과발현하는 인간 대장암 (HT-29)의 동소이식 종양 마우스 모델에서 종양의 이미지를 나타낸다 (A - 절개 전, B - 절개 후, C - 종양의 노출 후). 왼쪽부터 오른쪽으로의 컬럼은 백색광, 형광 (700 nm에서 가시화) 및 중첩 하에 촬영된 이미지를 나타낸다.
도 3은 5mg의 실시예 3의 형광 접합체의 투여 48시간 후, 환자에서 일차 췌장암의 수술 동안 촬영된 이미지를 나타낸다 (A는 백색광 하, B는 형광과의 이미지 중첩임). 파선은 가시화 및 촉진(palpation) 만을 기초로하여 제안된 절제 마진을 표시하는 반면, 실선은 형광 가시화를 기반으로 하여 제안된 절제 마진을 표시한다. 점선은 형광에 의해 나타난 바의 종양의 대략적인 윤곽을 나타낸다.
도 4는 5 mg의 실시예 3의 형광 접합체의 투여 48 시간 후, 췌장암 환자의 복막 전이의 이미지를 나타낸다. A 열의 이미지는 생체내에서 수술 중 얻었고, B열의 이미지는 절제 후 생체외에서 얻었다 (좌측 컬럼은 백색광 하이고, 오른쪽 컬럼은 형광과의 중첩 이미지임).
일 양태에서, 본 발명은 표적 모이어티 T에 결합된 형광 색소 모이어티 F를 포함하고, 모이어티 F가 화학식 (I)를 가지며, 또한 모이어티 T가 종양 마커에 친화력을 갖는, 형광 접합체를 제공한다:
상기 식에서 Y는 각각 독립적으로 SO3H, SO3- 및 SO3M으로부터 선택되고; M은 1가 양이온이고; x, z 및 y는 1 내지 8의 정수 중에서 독립적으로 선택된다.
1가 양이온의 예는, 제한없이, Na, K, 또는 암모늄을 포함한다. 바람직한 일 실시형태에서, Y는 SO3- 및 SO3Na로부터 선택된다.
본 발명의 형광 접합체의 형광 색소 모이어티 F는 형광 염료 또는 표지, 또는 형광단 부분으로서도 지칭될 수 있으며, 바람직하게는 자외선, 가시 스펙트럼 또는 적외선의 파장 범위에서 전자기식 에너지를 흡수하고 일반적으로 더 긴 파장 범위, 바람직하게는 가시 또는 근적외선 범위에서 방출된다. 본 명세서에서 이해되는 바와 같이, 용어 여기 파장 (nm로 표현됨)은 피크(peak), 즉 형광 색소의 최대 또는 특정 흡수 파장을 의미하거나, 또는 표적 모이어티 T에 결합된 형광 색소 부분을 포함하는 형광 접합체의 피크를 의미한다. 용어 방출 파장 (nm로 표현됨)은 형광 색소의 피크, 즉 최대 또는 특정 방출 파장을 의미하거나, 또는 본 발명의 표적 모이어티에 결합된 형광 색소를 포함하는 형광 접합체의 피크를 의미한다.
형광 색소 모이어티 F는 상기 기술된 바와 같은 화학식 (I)의 시아닌 유도체이고, 바람직하게는 650와 750 nm 사이의 피크 방출 파장 범위를 갖는 원 가시(far visible) 또는 근-적외선 (NIR) 스펙트럼에서 방출된다. 표적 모이어티 T와 결합되는 경우, 생성되는 접합체는 또한 바람직하게는 650 내지 750 nm 사이의 피크 방출 범위에서 방출된다.
본 발명자들은 이들 형광 색소 부분이 퀀칭(quenching), 양자 수율과 같은 형광 특성에 특히 유리하고, 특히, 광퇴색에 대해 강건하여, 항원에 대하여 활성인 표적 모이어티과 접합에 있어서 이들이 신뢰성 있게 사용될 수 있음을 밝혀냈다.
Y에 대하여, 당업자는 접합체의 화학적 환경에 따라, SO3H, SO3 -, SO3M 및/또는 SO3Na 기가 또한 서로 역학적으로 전환될 수 있음을 이해할 것이다. 예를 들어, 수성 배지에 용해되는 경우, 및 pH 및 다른 양이온의 이용가능성에 따라, Y로서 표현되고 SO3 -, SO3M 및/또는 SO3Na로부터 선택되는 기는 또한 SO3H으로 양자화될 수 있거나, 또는 SO3Na 내지 SO3K 또는 그 반대와 같은 다른 염 형태로 전환될 수 있다. 따라서, 본 발명은 화학식 (I)의 화합물의 이러한 대안적 형태를 포함한다.
특히 바람직한 접합체는 화학식 (II)의 형광 색소 모이어티 F를 포함하는 것이다:
형광 접합체에서, 형광 색소 모이어티 F는 표적 모이어티 T에 결합된다; 바람직하게는 이는 공유 결합, 즉 아미드 또는 에스테르 결합과 같은 공유 결합의 방식에 의해 표적 모이어티 T에 결합된다.
화학식 (I)의 내용에서 언급된 바와 같이, 화학식 (II)는 또한, Y로 표현되는 작용기들과 관련하여, 예를 들어, 접합체가 용해될 수 있는 수성 배지의 조성 및/또는 pH 값에 따라, 화학적 평형 하에 제위치에서 생성된 SO3H 또는 SO3K와 같은 대안적인 술폰산 형태를 포함하도록 해석되어야 한다. 게다가, 화학식 (II)에서 각각의 4개의 술폰산 기가 Na 염 또는 내부 염의 형태일 수 있고 나타낸 바와 같은 화학식 (II)는 화합물을 대표하는 다양한 가능성 중 단지 하나를 대표하는 것임이 이해되어야 한다.
형광 접합체의 표적화 모이어티 T는 종양 마커에 대해 친화력을 가지며 종양 마커와 결합 또는 연관될 수 있다. 종양 마커는 종양에 의해 생성되거나 또는 종양에 존재하거나, 또는 종양의 존재에 대한 반응으로 환자의 정상 세포 기전에 의해 생성되는 산물 또는 분자로서 이해된다. 본 명세서에서 사용된 바와 같이, 특정 문맥으로부터 상이한 의미가 명백하지 않는 한, 종양은 비정상 또는 비통제된 세포 성장으로부터 발생하는 세포 또는 조직의 그룹 또는 덩어리인 신생물을 의미한다. 특히, 종양 마커는 암성 또는 악성인 종양에 의해 생성된다.
종양 마커는 예를 들어, 단백질, 당단백질, 수용체, 호르몬, 효소, 항원, 또는 암유전자 또는 이들의 산물의 형태일 수 있다. 종양 마커는 정상 세포와 비교해 종양 세포에 의해 과발현될 수 있거나, 또는 종양 세포에 의해 독특하게 생성되는 종양-특이적 성분일 수 있다. 표적 모이어티 T에 대하여 표적되거나 또는 지향될 수 있는 특히 바람직한 종양 마커는 종양 세포 표면에 존재하는 세포-표면 단백질 또는 수용체 및/또는 특히 상피 세포 또는 암종 또는 육종과 같은 고형 종양에서 발현되는 것이다.
본 발명의 바람직한 실시형태에서, 종양 마커는 종양 항원이다. 종양 항원은 항체 T 세포 및/또는 B-세포 반응의 생성과 같은 면역계 반응을 유도 또는 자극할수 있는, 종양 세포에 특이적이거나, 또는 이과 연관된 (예를 들어, 종양 세포에서 과발현된) 분자 또는 산물이다. 종양 항원은 단백질 또는 지질을 나타내거나 또는 포함할 수 있다. 종양 항원은 당화될 수 있고 (예컨대, 당단백질), 하나 이상의 에피토프, 즉, 항체, B 세포 또는 T-세포가 바람직하게 결합할수 있거나 또는 특정 친화력을 가질 수 있는 영역 또는 도메인을 함유할 수 있다.
예시적인 종양 항원은 종양바이러스성 단백질로부터 유래되거나 또는 생성된 종양 항원, 오로지 태아 발달 동안에만 더 높은 수준으로 정상적으로 생성되는 종양태아 항원, 정상 세포에 비해 종양 세포에 의해 과발현되거나 또는 축적되는 항원, 또는 돌연변이체 또는 번역 후 변형된 항원을 포함한다. 바람직하게는 종양 마커는 암종 태아성 항원 (CEA), 상피 성장 인자 수용체 (EGFR) 및 인간 상피 성장 인자 수용체 -2 (HER2)로부터 선택되는 종양 항원이다.
본 발명의 바람직한 실시형태에서, 종양 항원은 암종 태아성 항원 (CEA)이다. CEA는 상피 세포에서 발현되는180-200 kDa의 분자량을 갖는 암종 태아성 당단백질이다. CEA는 위, 소장, 췌장, 간, 유방, 난소, 자궁경부, 방광, 쓸개, 및 폐의 악성 종양뿐만 아니라, 특히 결장 및 직장의 악성 종양 에서 세포 표면 상에 높은 수준으로 발현된다(95%의 대장암에서 과발현됨). CEA는 전형적으로 국소화되지 않고, 전체 세포 표면뿐만 아니라 선내 내강 및 세포내 내강에 걸쳐 발현될 수 있다. CEA 항원은 Hammarstrom 등 (Cancer Res 1989 (49) 4852-4858)에서 정의된 바와 같이, 항-CEA 항체 또는 항체 단편 또는 융합 단백질에 결합 특이성을 가질 수 있는, GOLD-1 내지 GOLD-5로서 분류되는 5가지 주요 에피토프를 포함한다.
바람직한 실시형태중의 하나에서, 본 발명의 형광 접합체의 표적 모이어티 T는 결장, 직장, 위, 소장, 췌장, 간, 유방, 난소, 자궁경부, 방광, 쓸개, 폐 및 식도로부터 선택되는 환자의 하나 이상의 기관 또는 조직에 위치될 수 있는 CEA 항원-발현성 종양을 표적하고 이에 결합한다.
다른 바람직한 실시형태에서, 형광 접합체의 표적 모이어티 T는 수용체인 종양 마커에 결합할 수 있다. 수용체는 종양 세포 특이적일 수 있거나 또는 종양 세포에서 과발현되고 더 높은 수준으로 존재할 수 있다. 표적 모이어티 T는 이러한 수용체에 대하여 리간드로서 작용할 수 있고, 작은 비-펩티드성 분자, 즉 임의의 아미노산 서열을 혼입하거나 또는 포함하지 않는 화학적 실재물 또는 화합물일 수 있다.
바람직한 실시형태에서, 본 발명의 형광 접합체는 화학식 (I) 또는 (II)의 형광 색소 및 비-펩티드성 리간드, 항체, 항체 단편, 및 항체의 적어도 하나의 가변 영역을 포함하는 융합 단백질로부터 선택되는 표적화 모이어티 T를 포함한다. 바람직하게는, 이러한 표적화 부분 중 어느 하나는 CEA, HER2, 또는 EGFR와 같은 종양 항원에 특이적으로 결합할 수 있다. 특정한 일 실시형태에서, 형광 접합체는 화학식 (I) 또는 (II)의 형광 색소 및 표적 모이어티이 CEA에 특이적으로 결합하는, 비-펩티드성 리간드, 항체, 항체 단편, 및 항체의 적어도 하나의 가변 영역을 포함하는 융합 단백질로부터 선택되는 표적 모이어티 T를 포함한다.
특정한 일 실시형태에서, 표적 모이어티 T는 항체 또는 항체 단편, 또는 항체의 적어도 하나의 가변 영역을 포함하는 융합 단백질이다. 이 경우, 항체, 항체 단편, 또는 융합 단백질의 항체의 적어도 하나의 가변 영역은 임의의 IgG, IgA, IgD, 또는 IgM 면역글로블린 이소타입 또는 클래스에 속하거나, 또는 이로부터 유래될 수 있다. 전장 항체는 Fc (결정화가능 단편) 도메인 및 Fab (항원 결합 단편) 도메인을 포함하는 전형적으로 Y-형태인 당단백질이다. 이들은 이황화 결합을 통해 연결된 한 쌍의 중쇄 (H) 및 경쇄 (L) 폴리펩티드 구조로부터 작제되어 Y-형태 구조를 형성한다. 각각의 쇄는 가변 영역 (V) 및 불변 영역 (C)을 포함한다. 중쇄는 가변 쇄 영역 (VH) 및 다양한 불변 영역 (CH1, CH2 등으로 약기됨)을 포함한다; 반면 경쇄는 단지 가변 쇄 영역 (VL) 및 불변 영역 (CL)을 포함한다. 가변 영역은 항원의 특정 에피토프에 대한 항체의 결합 특이성 및 인식과 연관되고, 항체-결합성 Fab 도메인을 형성한다.
항체 단편은 항원에 특이적으로 결합하고 상호작용할 수 있는 항체, 또는 이의 임의의 작제물, 안정화된 형태 또는 접합체의 임의의 영역, 쇄, 또는 도메인을 의미한다. 예시적인 항체 단편은 항원-결합 도메인 단편 (Fab, 또는 Fab), Fab 작제물, 단일쇄 가변 단편 (scFv), VHH, 미니바디, 디아바디와 같은 단일 도메인 항체 등을 포함한다. 융합 단백질은 다른 생물활성 단백질 또는 폴리펩티드에 융합된 항체 단편을 포함하는 작제물을 의미한다.
바람직한 실시형태에서, 본 발명의 형광 접합체의 표적 모이어티 T는 모노클로날 항체 (mAb)이다. 이는 당해 분야에 알려진 방법을 통해 만들어질 수 있다. 화학적 모노클로날 항체가 특히 바람직하다. 이들은 하나 이상의 종, 예를 들어 인간 및 쥐 항체로부터 유래된 중쇄 또는 경쇄의 도메인 및 영역을 포함하는 하이브리드 모노클로날 항체이다. 경우에 따라, 형광 접합체의 표적 모이어티 T는 인간화된 항체 (일반적으로 대부분 적어도 85-95% 인간-유래된 서열로 이루어짐) 또는 인간 생식계열 항체 서열로부터 단독으로 유래된 인간 항체일 수 있다.
바람직하게는, 이러한 표적 모이어티 T 중 임의의 어떤 것도 종양 항원 CEA에 특이적으로 결합이 가능하다.
일 실시형태에서, 화학식 (I)의 형광 색소 모이어티 F를 포함하는 형광 접합체의 표적 모이어티 T는 CEA 항원의 하나 이상의 에피토프, 예를 들어 GOLD-1, GOLD-2, GOLD-3, GOLD-4, 또는 GOLD-5 에피토프에 결합 특이성을 갖는 키메라형 모노클로날 항체이다. 특정한 일 실시형태에서, 표적 모이어티 T는 GOLD-2 에피토프에 대해 친화력을 가지고/가지거나 이에 특이적이다. 추가적인 실시형태에서, 이러한 접합체의 형광 색소 모이어티 F는 상기 기술된 바와 같은 화학식 (II)의 것이다.
특히 바람직한 실시형태에서, 본 발명은 표적 모이어티 T에 결합된 형광 색소 모이어티 F를 포함하는 형광 접합체로서, 모이어티 F이 화학식 (II)를 가지며, 모이어티 T가 G1m3 알로타입의 중쇄 및 km3 알로타입의 경쇄를 포함하는, CEA의 GOLD-2 에피토프에 대항하는 키메라형 mAb이고, 각각의 중쇄 및 각각의 경쇄가 적어도 하나의 마우스 IgG1 가변 도메인 및 적어도 하나의 인간 불변 도메인을 포함하는, 형광 접합체를 제공한다. 이 키메라형 모노클로날 항체는 당업계에 알려진 경쟁적인 결합/억제 시험에 의해 측정된 바와 같이, CEA의 GOLD-2 에피토프에 대해 반응 특이성을 가진다.
특히, 형광 접합체는 하기 뉴클레오티드 서열로부터 제조되고 발현된 CEA에 대항하는 키메라형 mAb에 결합될 수 있다:
(A) 중쇄 (서열번호: 1):
GGTACCGCCGCCACCATGGACTCCAGACTGAACCTGGTGTTCCTGGTGCTGATCCTGAAG
GGCGTGCAGTGCGACGTGCAGCTGGTGGAATCTGGCGGAGGACTGGTGCAGCCTGGCGGC
TCCAGAAAGCTGTCTTGTGCCGCCTCCGGCTTCACCTTCTCCAACTTCGGCATGCACTGG
ATCCGGCAGGCCCCTGAGAAGGGCCTGGAATGGGTGGCCTATATCTCCGGCGGCTCCTCC
ACCATCTACTTCGCCGACACCCTGAAGGGACGGTTCACCATCTCCCGGGACAACCCCAAG
AACACCCTGTTTCTGCAGATGACCTCCCTGCGGAGCGAGGACACCGCCATCTACTACTGC
GCCAGAGACTACTACATCAACAACTACTGGTACTTCGACGTGTGGGGCGCTGGCACCACC
GTGACAGTGTCATCTGCTAGC
(B) 경쇄 (서열번호: 2):
GTCGACGCCGCCACCATGGAATTTCAGACCCAGGTGTTCGTGTTCGTGCTGCTGTGGCTG
TCTGGCGTGGACGGCGACATCGTGATGACCCAGTCCCAGAAATTCATGTCCACCTCCGTG
GGCGACCGGGTGTCCATCACATGCAAGGCCTCTCAGAACGTGCGGAGCGCCGTGGCCTGG
TATCAGCAGACACCTGGCCAGAGCCCCAAGGCCCTGATCTACCTGGCCTCCAACAGATAC
ACCGGCGTGCCCGATCGGTTCACCGGCTCTGGCTCTGGCACCGACTTCACCCTGACCATC
TCCAACGTGCAGTCCGAGGACCTGGCCGACTACTTCTGTCTGCAACACTGGAACTACCCC
CTGACCTTCGGCGGAGGCACCAAGCTGGAACTGAAGCGTACG
상기 가변 중쇄 뉴클레오티드 서열 (A)는 KpnI 및 NheI 제한 부위에 대한 서열을 각각 5’및 3’말단에 포함한다. 가변 경쇄 뉴클레오티드 서열 (B)는 SaII 및 BSiWI 제한 부위 서열을 각각 5’및 3’말단에 포함한다.
이 mAb의 가변 영역의 아미노산 서열은 하기 서열에 상응한다:
(A) 중쇄 (서열번호: 3):
Asp Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
Ser Arg Lys Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asn Phe Gly Met His Trp
Ile Arg Gln Ala Pro Glu Lys Gly Leu Glu Trp Val Ala Tyr Ile Ser Gly Gly Ser Ser
Thr Ile Tyr Phe Ala Asp Thr Leu Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Pro Lys
Asn Thr Leu Phe Leu Gln Met Thr Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Ile Tyr Tyr Cys
Ala Arg Asp Tyr Tyr Ile Asn Asn Tyr Trp Tyr Phe Asp Val Trp Gly Ala Gly Thr Thr
Val Thr Val Ser Ser
(B) 경쇄 (서열번호: 4):
Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Gln Lys Phe Met Ser Thr Ser Val
Gly Asp Arg Val Ser Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gln Asn Val Arg Ser Ala Val Ala Trp
Tyr Gln Gln Thr Pro Gly Gln Ser Pro Lys Ala Leu Ile Tyr Leu Ala Ser Asn Arg Tyr
Thr Gly Val Pro Asp Arg Phe Thr Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile
Ser Asn Val Gln Ser Glu Asp Leu Ala Asp Tyr Phe Cys Leu Gln His Trp Asn Tyr Pro
Leu Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Leu Lys
본 발명의 바람직한 실시형태에서, 형광 접합체는 표적화 모이어티 T에 결합된 화학식 (II)를 갖는 모이어티 F를 포함할 수 있고, T는 서열번호: 4의 가변 경쇄 영역 및 서열번호: 3의 가변 중쇄를 포함하는 CEA에 대항하는 키메라형 mAb이다.
본 발명의 형광 접합체는 하나의 표적화 모이어티 T에 결합된 하나 이상의 형광 모이어티 F, 예를 들어 표적화 모이어티 T 당 1개 내지 약 10개의 모이어티 F를 포함할 수 있다. 바람직하게는, 하나의 표적화 모이어티 T에 결합된 형광 색소 모이어티 F의 개수는 1 내지 4 중 선택된다. 다시 말하면, 이러한 바람직한 접합체의 분자 내에, n개 모이어티 F가 하나의 모이어티 T에 결합되고, n은 1 내지 4 중에서 선택된 정수이다.
개별 접합체 분자는, n이 정수인 것을 특징으로 하지만, 복수개의 접합체 분자를 포함하는 화합물은 접합도, 또는 모이어티 T 당 모이어티 F의 평균 개수를 가질 수 있으며, 이는 정수이어야 하는 것은 아니지만, 바람직하게는 약 1 내지 4 범위의 임의의 값이다.
이 문맥에서, 표적화 모이어티 T는 바람직하게는 항체, 항체 단편, 및 적어도 하나의 항체의 가변 영역을 포함하는 융합 단백질, 및 이에 접합된 화학식 (I)의 1 내지 4개의 형광 색소 모이어티 F로부터 선택된다. 본 발명의 일 실시형태에서, 표적화 모이어티 T는 화학식 (II)의 형광 색소 모이어티 F에 결합된 항-CEA 키메라형 모노클로날 항체이고, 여기에서, n은 1 내지 4의 범위이다.
본 발명의 추가적인 양태는 상기 기술된 바와 같은 형광 접합체를 포함하는 조성물을 포함한다.
일 실시형태에서, 조성물은 단독 또는 기본적으로 접합도가 다른 상이한 형광 접합체의 혼합물을 포함한다. 다른 특정한 실시형태에서, 조성물은 적어도 3개 또는 4개 접합체의 혼합물을 포함하며, 이들 모두는 CEA의 GOLD-2 에피토프에 친화력을 갖는 키메라형 mAb에 결합된 화학식 (II)를 갖는 형광 색소 모이어티 F를 포함하고, 여기에서 적어도 3개 또는 4개 접합체는 하나의 표적 모이어티 T에 결합된 형광 색소 모이어티 F의 개수가 각각 1개, 2개, 및 3개; 또는 각각 1개, 2개, 3개, 및 4개인 점에서 서로 상이하다.
조성물은 비접합된 형태 (또는 이론적으로, 치환도가0인 접합체)로 표적화 모이어티 T를 나타내는 화합물을 더 포함할 수 있다. 예를 들어, 이전 기술된 실시형태와 조합하여, 이러한 조성물은 각각 화학식 (II)에 따른 1개, 2개, 3개, 또는 경우에 따라 4개 이상의 형광 색소 부분에 결합된 동일한 mAb의 적어도 3개 또는 4개 접합체와 함께, CEA의 GOLD-2 에피토프에 대하여 친화력을 갖는 비접합된 키메라형 mAb를 포함한다. 이 혼합물의 접합체 집단은 당해 분야에 알려진 방법, 예를 들어 질량 분석법 (예컨대, MALDI-TOF)에 의해 측정될 수 있다.
조성물 내에 접합체의 평균 접합도는 바람직하게는 약 0.5 내지 약 3이다. 접합도는 분광광도법으로 측정될 수 있는 항체에 대한 형광 색소 몰비이다. 따라서, 숫자(figure)는 조성물 내에 존재하는 임의의 비접합된 항체 및 접합체의 접합도를 반영하도록 이해되어야 한다. 다른 실시형태에서, 평균 치환도는 약 1 내지 약 2이다. 발명자들은 더 높은 정도의 치환이 개선된 가시화를 제공할 수 있는 반면, 표적 모이어티의 종양 마커에 대한 친화력은 이에 결합된 형광 색소 부분의 개수가 증가함에 따라 감소한다는 것을 밝혀냈다. 치환도가 약 0.5 내지 약 3인, 특히 CEA의 GOLD-2 에피토프에 대해 친화력을 갖는 키메라형 mAb와 화학식 (II)에 따른 형광 색소의 접합체를 포함하는 조성물의 경우 가장 잘 작용하고, 이는 수술 동안 CEA를 발현하는 종양의 매우 작은 결절의 우수한 가시화를 가능하게 하는 것으로 결정되었다.
본 발명의 조성물은 부형제, 예를 들어 완충액, 안정화제, 동결보호제, 및 등장화제, pH 조절제를 더 포함할 수 있다. 특히 바람직한 부형제는 L-아르기닌 및 이의 염과 같은 염기성 아미노산, 시트르산염, 인산 나트륨 또는 인산 칼륨 염과 같은 염, 염화 나트륨, 염화 칼륨, 트레할로스, 만니톨, 말토오스, 수크로스, 또는 덱스트란과 같은 사카라이드, 또는 폴리소르베이트 또는 폴리옥사머와 같은 비이온성 표면활성제이다. 조성물의pH는 바람직하게는 5.2 내지 7.2이다. 바람직하게는, 조성물은 당해 분야에 알려진 무균 조건 하에서 제조되고, 무균이다.
특정한 실시형태에서, 임의의 상기 정의된 형광 접합체를 포함하는 조성물은 무균이고 수성 완충액 및 L-아르기닌 및/또는 모이어티 F에 결합하지 않은 모이어티 T를 포함하는 화합물을 더 포함한다. 추가적인 실시형태에서, 임의의 상기 정의된 형광 접합체를 포함하는 조성물은 무균이고, 약 6.0으로 조정된 pH의 수성 완충액, L-아르기닌 하이드로클로라이드, 및 폴리소르베이트, 바람직하게는 폴리소르베이트 20을 포함한다. 경우에 따라 트레할로스, 만니톨, 말토스 또는 수크로스와 같은 사카라이드가 이들 조성물 중 포함될 수 있다.
다른 특정한 실시형태에서, 표적 모이어티, 예를 들어 항-CEA mAb의 함량 (당해 분야에서 알려진 분광광도법 또는 HPLC 방법에 의해 측정됨)을 기반으로 한, 조성물 중 형광 접합체의 농도는 1 mg/mL 내지 10 mg/mL이다.
본 발명의 더 추가적인 양태는 형광 접합체의 제조 방법으로서,
(a) 화학식 (III)을 갖는 형광 색소를 제공하는 단계:
상기 화학식에서, Y는 각각 독립적으로 SO3H,SO3 - 및 SO3M로부터 선택되고, M은 1가 양이온이고; x, z 및 y는 1 내지 8의 정수 중에서 독립적으로 선택되고, Z는 반대이온, 수소, 숙신이미딜, 술포숙신이미딜 및 니트로페닐로부터 선택되고; (b) 종양 마커에 친화력을 갖는 표적화제를 제공하는 단계; 및 (c) 형광 색소를 표적화제와 결합시키는 단계를 포함하는 방법을 제공한다.
1가 양이온의 예는, 제한 없이, Na, K, 또는 암모늄을 포함한다. 바람직한 일 실시형태에서, Y는 SO3-및 SO3Na로부터 선택된다.
표적 모이어티 T에 결합된 형광 색소 모이어티 F를 포함하는 본 발명의 형광 접합체는 이러한 제조 방법에 의해 얻어질 수 있으며, 여기에서 모이어티 F는 화학식 (I)을 갖고 여기에서 표적 모이어티 T는 종양 마커에 친화력을 가진다.
임의의 선행하는 단락에서 접합체 자체의 문맥에서 기술된 바와 같이 표적화 모이어티 T 및 형광 색소 모이어티 F에 대한 동일한 옵션 및 선호도는 또한 상기 방법에서 사용될 표적화제 및 형광 색소에 적용된다. 따라서, 표적화제는 바람직하게는 접합체의 표적 모이어티 T를 포함하는 화합물이고, 본 방법에서 사용되는 형광 색소는 바람직하게는 접합체의 형광 색소 모이어티 F를 포함하거나 이를 산출하는 화합물이다. 표적화제는 바람직하게는 암종 태아성 항원(CEA)과 같은, 종양 항원에 친화력을 가진다. CEA의 친화력은 GOLD-2 에피토프와 같은 이의 알려진 에피토프 중 임의의 하나에 대해서 일 수 있다. 특히 바람직한 실시형태에서, 표적화제는 CEA에 대해 친화력을 갖는 키메라형 모노클로날 항체이다.
CEA에 대해 친화력을 갖는 키메라형 모노클로날 항체(mAb)는 키메라형 mAb을 코딩하는 발현 벡터로 형질감염된 CHO 세포로부터 발현하는 방식으로 만들어질 수 있다. 바람직하게는, 발현 벡터는 항체 인간 불변 도메인 및 항-CEA 항체 쥐 가변 도메인, 바람직하게는 상기 기술한 서열을 갖는 가변 도메인을 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함한다.
접합체를 제조하는데 유용한 형광 색소는 미국특허 제8,034,626호에 기술된 다이아그램 Ia의 반응식 및 방법과 유사하게 제조될 수 있다. 예를 들어, 형광 색소는 필수 술폰산염 및 알킬(옥시) 치환체를 포함하는 2개의 인돌레닌 유도체의 축합으로부터 합성될 수 있으며, 여기에서 인돌레닌 유도체 중 하나는 아세트아닐리드 유도체의 형태이다. 일 실시형태에서, 인돌레닌 중간체는 아미노-방향족 전구체로부터 디아조화/환원의 단계 후 술폰화, 수산화, 인돌레닌에 대한 케톤에 의한 피셔 (Fischer) 고리화, 하이드록시 치환체의 카르복시알킬화 및 술톤과의 4차화 반응의 단계를 거쳐 제조될 수 있다.
다른 실시형태에서, 형광 색소는 하기의 화학식 (IV)의 화합물이다:
본 발명의 형광 색소는 활성화, 바람직하게는 표적화 모이어티 T와 접합을 위한 활성 에스테르 (예컨대, 숙신이미딜 에스테르)로서 활성화될 수 있다. 일 실시형태에서, 화학식 (I) 또는 (II)의 형광 색소는 당해 분야에 알려진 공유 결합 방법을 사용하여, 아미드, 에스테르, 티오에스테르, 이황화 또는 카바메이트 결합의 방식에 의해 표적화 모이어티 T에 결합된다. 본 발명의 다른 실시형태에서, 표적화 모이어티 T가 항체, 항체 단편, 또는 펩티드성 서열인 곳에서 형광 색소는 바람직하게는 아미드 결합을 통해 표적화 모이어티 T의 유리 아미드 기를 통해 접합된다.
본 발명의 다른 양태는 종양 마커에 대해 친화력을 갖는 표적 모이어티 T에 결합된 형광 색소 모이어티 T를 포함하는 형광 접합체의 시험관내 사용을 위해 제공되고, 여기에서, 모이어티 F가 화학식 (I) 또는 (II)를 가지며, 또는 상기 형광 접합체를 포함하는 조성물의 시험관내 사용을 위해, 시료 중의 종양 세포의 검출을 위해, 또는 종양의 진단 및/또는 모니터링을 위해 제공된다.
특히, 형광 접합체는 CEA와 같은 종양 항원을 발현하는 종양 세포 및 종양의 검출을 위해 사용될 수 있다. 이러한 경우, 표적 모이어티 T는 임의의 상기 옵션 및 선호도에서 정의된 바와 같이, 바람직하게는 비-펩티드성 리간드, 항체, 항체 단편, 및 항체의 적어도 하나의 가변 영역을 포함하는 융합 단백질로부터 선택된다. 형광 접합체는 종양 세포의 검출을 위해 사용될 수 있거나 또는 혈청과 같은 체액, 또는 조직 생검으로부터 환자에게서 얻어진 시료의 시험관내 시험에 의한 암의 상태의 진단을 보조하거나 또는 이를 진단하기 위해 사용될 수 있다. 바람직하게는, 종양은 결장, 직장, 위, 장, 담관, 췌장, 식도, 난소, 유방, 전립선, 간 또는 폐로부터 얻어지거나 또는 이로부터 유래된 것과 같은 고형 조직 종양이다. 또한, 형광 접합체는 종양의 존재 또는 진행을 모니터링하기 위해, 예를 들어 절제 수술 및/또는 화학요법 치료 이후 임의의 잔여 종양 세포 또는 종양 조직을 평가하기 위해 유용할 수 있다.
추가적인 양태에서, 본 발명은 본 명세서에 기술된 바와 같은 접합체 및/또는 접합체를 포함하는 조성물의 약제로서의 용도를 제공한다. 본 명세서에 사용된 바와 같이, 약제는 인간 개체 또는 동물의 질환 또는 상태의 예방적 치료를 포함하는, 치료 또는 진단을 위한 것과 같은 임의의 의료 목적을 위해 투여되는 물질 또는 산물을 의미한다. 특히, 본 발명은 진단 약제 또는 제제로서 본 명세서에 기술된 바와 같은 접합체 및/또는 접합체를 포함하는 조성물의 용도를 제공한다. 상기 용도는 접합체, 또는 조성물을 이를 필요로 하는 개체에게 단일 또는 반복 투여하는 것을 포함한다. 일 실시형태에서, 접합체 또는 조성물을 필요로 하는 개체는 암이 발병하거나, 또는 암을 발병할 위험이 있는 개체이다.
본 발명은 또한 종양 마커를 발현하는 종양의 병소을 검출을 위한 또는 환자에서 종양 마커를 발현하는 종양의 위치를 결정하기 위한 형광 접합체 및/또는 이의 조성물의 사용을 제공한다. 상기 사용은 재발, 전이 또는 씨딩처리(seeding)와 같은 질병 진행을 특징으로 하는 암에 의해 영향을 받은 환자에서 특히 이로울 수 있다. 이러한 암 진행은 종양 세포 또는 종양 덩어리의 더 넓은 분포를 초래할 수 있다. 특히, 형광 접합체 또는 조성물은 병소의 검출을 위해 또는 바람직하게는, 세포의 표면에서, 종양 마커, 즉 모이어티 T가 친화력을 가지는 종양 마커 또는 종양 항원을 발현하는 종양의 위치를 결정하기 위해 사용될 수 있다. 본 명세서에 이해되는 바와 같이, 용어 병소는 종양으로 발달할 수 있는 종양 또는 병변을 의미하고 주위의 정상 조직과 구분되는 세포 또는 조직의 그룹 또는 군집을 의미한다.
바람직한 실시형태에서, 종양은 CEA를 발현한다. 다른 바람직한 실시형태에서, 환자는 대장암 또는 위장암을 가진다. 이러한 암의 진행된 징후에서, 환자는 암성 종양의 널리퍼진 전이가 복강(peritoneal cavity)의 선 상에 발생하는 복막 암종증을 가질 수 있다. 본 발명의 특정한 실시형태에서, 화학식 (I) 또는 (II)의 형광 색소 부분 및 키메라형 모노클로날 항체인 표적화 모이어티 T 를 포함하는 형광 접합체는 종양의 병소를 검출하거나 또는 환자에서 CEA 를 발현하는 종양의 위치를 결정하는데 사용된다.
종양 조직의 수술적 절제 동안, 외과의는 종양 조직과 정상 조직을 구분하기 위해 시각적 외형 및 촉진에 의존한다. 수술적 절제는 환자의 조직, 구조 또는 기관에 존재하는 종양 조직을 완전히 또는 부분적으로 수술적으로 절제하는 것이다. 암성 및 악성 종양 조직은 종종 육안으로 가시적이지 않는 작은 (예를 들어, 밀리리터 이하 사이즈임) 결절 또는 병변에 존재할 수 있다. 완전한 종양 절제는 종종 환자의 예후에 중요하며, 그 자체로, 외과의가 건강한 조직으로부터 악성 종양 조직의 경계 및 마진을 정확히 확인하고, 구분할 수 있도록 하고 상기 종양 조직을 절제하도록 할 뿐만 아니라, 환자의 종양의 수술적 절제 및/또는 세포감소 수술 치료 동안 건강한 조직 또는 구조의 불필요한 제거 또는 손상을 방지하는데 있어서 중요하다.
상기 기술된 바와 같은 형광 접합체 및/또는 이러한 접합체를 포함하는 조성물은 종양 마커를 발현하는 종양의 절제 수술을 시행중이거나 또는 수술을 받은 환자의 절제 마진에서 종양 세포 또는 종양 조직의 검출하는데 특히 유용한 것으로 밝혀졌다. 본 명세서에 이해되는 바와 같이, 용어 절제 마진은 종양 조직을 둘러싸는 조직의 마진 또는 테두리를 의미한다. 절제된 종양을 둘러싸는 조직의 마진은 보통 모든 악성 종양 조직의 충분한 제거를 보장하기 위해 종양과 함께 절제되는 비-암성 조직이어야 하지만, 상기 기술된 바와 같이 종양 대 정상 조직의 정도 및/또는 마진의 정도를 결정하는 것은 어려울 수 있다. 경우에 따라, 절제 마진은 또한 의도된 절제 마진으로서 이해될 수 있는데, 이는 본 발명의 방법의 사용을 기초로 결정되거나 변형될 수 있다.
바람직하게는 종양 마커가 종양 항원인, 종양 마커를 발현하는 종양의 절제 수술이 시행중인 또는 수술을 받은 환자에서, 본 발명의 형광 접합체 또는 이의 조성물을 사용하여, 절제 마진에서 또는 절제 마진에 근접한 종양 세포 또는 종양 조직을 검출하는 방법은 수술, 예를 들어 세포 감소 수술 동안 및 이후에 모든 종양 조직이 제거되고 깔끔한 (또는 음성적) 마진, 즉 어떠한 종양 세포도 검출되지 않는 마진이 얻어지도록 보장하기 위해 외과의를 보조하는데 유용하다. 바람직한 실시형태에서, 절제 수술은 CEA를 발현하거나 과발현하는 종양의 수술이다.
본 발명 및 임의의 선행한 문단에서 기술된 바와 같은 형광 접합체 또는 조성물은 환자의 수술적 절제 동안 또는 이후 환자로부터 종양의 절제 마진에서뿐만 아니라 종양 세포 또는 종양 조직의 검출, 예를 들어 종양의 병소의 검출 및/또는 이의 위치(들)의 검출에 사용될 수 있고, 여기에서 환자는 대장암, 위암, 담도암, 췌장암, 식도암, 난소암, 유방암, 전립선암, 간암, 또는 폐암을 가진다. 검출되거나 또는 위치되는 종양 세포 또는 조직은 CEA를 발현하는 암종 또는 육종의 형태일 수 있다. 바람직하게는, 형광 접합체는 예를 들어, 복막 암종증을 앓고 있는 환자에서 밀리미터 이하 크기 범위인 종양 결절 또는 병변의 검출을 위해 사용된다.
절제 수술 동안 또는 이후의 종양의 절제 마진을 검출하거나 또는 종양 세포 또는 종양 조직을 위치시키거나 또는 검출하기 위한 본 발명의 형광 접합체 또는 조성물의 사용의 특정한 실시양태에서, 종양은 악성 위장 종양이고 형광 접합체는 화학식 (I), 또는 바람직하게는 G1m3 알로타입의 중쇄 및 km3 알로타입의 경쇄를 포함하는, CEA의 GOLD-2 에피토프에 대항하는 키메라형 모노클로날 항체인 표적 모이어티 T에 결합된 화학식 (II) 의 형광 색소 모이어티 F를 포함하고, 각각의 중쇄 및 각각의 경쇄는 적어도 하나의 마우스 IgG1 가변 도메인 및 적어도 하나의 인간 불변 영역을 포함한다. 위장관 종양은 임의의 위장 기관, 예를 들어 식도, 위, 소장, 대장, 직장뿐만 아니라 소화와 관련된 기관, 예를 들어 췌장, 간 및 담낭에 위치하는 종양을 의미할 수 있고, 밀리미터 이하 크기 범위일 수 있다. 이러한 사용을 위해 특히 바람직한 것은 상기 키메라형 모노클로날 항체가 서열번호: 4의 가변 경쇄 영역 및 서열번호: 3의 가변 중쇄를 포함하는 접합체이다.
절제 수술 동안 또는 이후의 종양의 절제 마진을 검출하거나 종양 세포 또는 종양 조직을 위치시키거나 또는 검출하기 위한 본 발명의 형광 접합체 또는 조성물의 사용의 다른 특정한 실시양태에서, 종양은 (악성) 유방 종양이고 형광 접합체는 화학식 (I), 또는 바람직하게는 G1m3 알로타입의 중쇄 및 km3 알로타입의 경쇄를 포함하는, CEA의 GOLD-2 에피토프에 대항하는 키메라형 모노클로날 항체인 표적 모이어티 T에 결합된 화학식 (II) 의 형광 색소 모이어티 F를 포함하고, 각각의 중쇄 및 각각의 경쇄는 적어도 하나의 마우스 IgG1 가변 도메인 및 적어도 하나의 인간 불변 영역을 포함한다. 이러한 사용을 위해 특히 바람직한 것은 상기 키메라형 모노클로날 항체가 서열번호: 4의 가변 경쇄 영역 및 서열번호: 3의 가변 중쇄를 포함하는 접합체이다. 본 명세서에서 사용된 바와 같은 유방 종양은 선 또는 관 조직을 포함하는, 유방 또는 유선 조직과 관련된 임의의 조직에 위치한 종양을 의미할 수 있고, 또한 겨드랑이에서 발견되는 것과 같은, 지역적 림프 결절을 포함한다. 이러한 종양은 밀리미터 이하 크기 범위일 수 있다.
추가적인 양태에서, 종양의 절제 수술이 시행중이거나 이를 받은 환자의 절제 마진에서 종양 세포 또는 종양 조직의 검출을 위해 또는 종양의 병소의 검출 및 이 위치의 결정과 같은 본 발명의 형광 접합체 또는 조성물의 사용은 다음의 단계를 포함한다:
(a) 종양을 앓고있는 환자에게 접합체 또는 조성물을 투여하는 단계;
(b) 상기 환자에 대해 종양 절제 수술을 개시하는 단계;
(c) 절제 수술을 받는 환자의 절제 부위의 조직을 약 660 내지 700 nm의 파장을 갖는 광으로 조명하는 단계,
여기에서, 상기 단계 (b)는 단계 (a) 이후 약 96시간 또는 72 시간 이하의 기간 내에 수행된다.
본 명세서에 기술된 접합체 또는 조성물의 모든 용도는 또한 대안적으로 방법, 특히 환자를 진단 또는 치료하기 위한 방법으로서 표현될 수 있다. 예를 들어, 종양 마커를 발현하는 종양의 병소를 검출하기 위한 또는 환자에서 종양 마커를 발현하는 종양의 위치를 결정하기 위한 사용은 또한 종양 마커를 발현하는 종양의 병소의 검출 또는 환자에서 종양 마커를 발현하는 종양의 위치를 결정하는 방법으로서 이해되어질 수 있다.
추가적인 대안으로서, 본 명세서에 기술된 접합체 또는 조성물의 모든 진단 및/또는 치료적 사용은 또한 특정한 진단 및/또는 치료적 사용을 위해 (유용한) 약제 또는 진단제의 제조에 있어서 접합체 또는 조성물의 사용으로서 표현될 수 있다.
종양을 앓고 있는 환자의 치료의 방법의 단계 (a)에서, 형광 접합체 또는 이의 조성물은 당해 분야에 알려진 주사 또는 관류에 의해 투여될 수 있다. 특히, 형광 접합체 또는 이의 조성물은 정맥내, 복막내, 피하 또는 근육내 주사 또는 관류에 의해 투여될 수 있다. 대안적으로, 형광 접합체 또는 이의 조성물은 흡입에 의해 또는 국소적으로 투여될 수 있다. 이 문맥에서, 국소 투여는 피부에 직접 투여 또는 외부 또는 내부 점막에 직접 투여를 포함한다. 흡입은 호흡계, 예를 들어 폐에 종양을 앓고 있는 환자의 치료를 위해 유용할 수 있다. 국소적으로 투여되는 경우, 형광 접합체 또는 이의 조성물은 바람직하게는 분무의 형태로 투여된다.
접합체는 바람직하게는 0.1 내지 50 mg의 용량, 또는 5 mg 내지 100 mg의 용랑으로 환자에게 투여된다. 이 문맥에서, 용량은, 접합체 및 존재하는 경우, 예를 들어 수술 또는 진단 절차 이전에 투여되는 비접합된 항체의 양을 의미한다. 용량은 경우에 따라 배분되고 간격을 둘 수 있다. 대장암, 위암, 담도암, 췌장암, 식도암, 난소암, 유방암, 전립선암, 간암 또는 폐암을 앓고 절제 수술이 진행중인 환자에게 주사에 의해 투여되는 경우, 용량은 0.5 내지 10 mg, 또는 5 내지 15 mg과 같이 바람직하게는 약 0.2 내지 15 mg이다. 바람직하게는, 투여되는 용량은 적어도 5 mg이다. 이 용량 범위는 특히 상기 기술된 바와 같은 바람직한 치환도를 갖는 접합체 및 조성물에 적용된다.
바람직하게는, 단계 (b)는 단계 (a) 이후 약 96 시간 이하의 기간 내에 수행된다. 다른 실시형태에서, 단계 (b)는 단계 (a)의 완료 후 72 시간 이하, 또는 48 시간 이하, 또는 36 시간 이하, 또는 24 시간 이하, 또는 12 시간 이하의 기간 이내에 수행된다.
방법의 단계 (c)에서, 절제 수술을 시행중인 환자는 근적외선 영역 내 파장에서 조명된다. 단계 (c)에서 사용된 조명을 위한 광학 장치는 바람직하게는 형광 접합체의 여기 파장, 바람직하게는 약 660 내지 700nm의 파장을 표적한다. 방법의 실시형태에서, 단계 (c)는 680 nm의 여기 파장에서 절제 수술을 시행중인 환자의 절제 부위에서 조직을 조명함으로써 수행된다.
종양을 앓고 있는 환자를 치료하는데 있어서 방법의 특히 바람직한 실시형태에서, 종양은 악성 위장 종양이고, 형광 접합체는 화학식 (I), 또는 바람직하게는 G1m3 알로타입의 중쇄 및 km3 알로타입의 경쇄를 포함하는, CEA의 GOLD-2 에피토프에 대항하는 키메라형 모노클로날 항체인 표적 모이어티 T에 결합된 화학식 (II)의 형광 색소 모이어티 F를 포함하고, 각각의 중쇄 및 각각의 경쇄는 적어도 하나의 마우스 IgG1 가변 도메인 및 적어도 하나의 인간 불변 영역을 포함한다.
본 발명의 더 추가적인 양태에서, 임의의 상기 실시형태 중 나타난 바와 같은 형광 접합체는 또한 방사성 이소토프, 방사성 표지 또는 방사성 추적자를 포함할 수 있다. 방사성표지된 형광 접합체는 예를 들어, 접합체의 직접 방사성표지에 의해, 또는 접합 전에 표적 모이어티 T에 방사성표지의 적용에 의해 얻어질 수 있다. 방사성표지된 형광 접합체, 및 이의 조성물은 치료 및/또는 진단적 적용에 있어서 약제로서 사용될 수 있다. 일 실시형태에서, 방사성표지된 접합체 또는 이의 조성물이 투여되는 개체는 암이 발병했거나, 또는 암을 발병할 위험이 있는 개체이다.
실시예
실시예 1 - 항-CEA 키메라형 모노클로날 항체의 제조
유전자 설계 및 합성
각각 천연 쥐 VH및 VL가변 도메인을 코딩하는, 하기 뉴클레오티드 서열 (A) 및 (B)는 쥐 항-CEA 항체 하이브리도마로부터 얻었고, 새로이(de novo) 합성하고, 숙주 pVVS Tandem 발현 벡터 내로 클로닝시켰다. 이들 서열은 (천연 단백질 서열을 변화시키지 않으면서) 다수의 뉴클레오티드 변형을 포함하여 CHO 세포에서 최적화된 클로닝 및 최적화된 발현을 보장한다. KpnI 및 NheI 제한 부위를 VH도메인에 대해 코딩하는 서열의 5’및 3’말단에 각각 삽입시킨다. 유사하게, 2개의 제한 부위 서열인, SalI 및 BSiWI를 VL도메인에 대해 코딩하는 서열의 5’및 3’말단에 각각 삽입시켰다.
(A) 중쇄 (서열번호: 1):
GGTACCGCCGCCACCATGGACTCCAGACTGAACCTGGTGTTCCTGGTGCTGATCCTGAAGG
GCGTGCAGTGCGACGTGCAGCTGGTGGAATCTGGCGGAGGACTGGTGCAGCCTGGCGGCTC
CAGAAAGCTGTCTTGTGCCGCCTCCGGCTTCACCTTCTCCAACTTCGGCATGCACTGGATCC
GGCAGGCCCCTGAGAAGGGCCTGGAATGGGTGGCCTATATCTCCGGCGGCTCCTCC
ACCATCTACTTCGCCGACACCCTGAAGGGACGGTTCACCATCTCCCGGGACAACCCCAAG
AACACCCTGTTTCTGCAGATGACCTCCCTGCGGAGCGAGGACACCGCCATCTACTACTGC
GCCAGAGACTACTACATCAACAACTACTGGTACTTCGACGTGTGGGGCGCTGGCACCACC
GTGACAGTGTCATCTGCTAGC
(B) 경쇄 (서열번호 2):
GTCGACGCCGCCACCATGGAATTTCAGACCCAGGTGTTCGTGTTCGTGCTGCTGTGGCTG
TCTGGCGTGGACGGCGACATCGTGATGACCCAGTCCCAGAAATTCATGTCCACCTCCGTG
GGCGACCGGGTGTCCATCACATGCAAGGCCTCTCAGAACGTGCGGAGCGCCGTGGCCTGG
TATCAGCAGACACCTGGCCAGAGCCCCAAGGCCCTGATCTACCTGGCCTCCAACAGATAC
ACCGGCGTGCCCGATCGGTTCACCGGCTCTGGCTCTGGCACCGACTTCACCCTGACCATC
TCCAACGTGCAGTCCGAGGACCTGGCCGACTACTTCTGTCTGCAACACTGGAACTACCCC
CTGACCTTCGGCGGAGGCACCAAGCTGGAACTGAAGCGTACG
벡터 합성
VH및 VL유전자에 대한 숙주 벡터로서 작용하도록 선택된 pVVS Tandem벡터를 Sa1I/BsiWI 및 KpnI/NheI를 이용하는 순차적 이중 소화에 의해 제조하였다. 이 발현 벡터는 중쇄에 대한 인간 IgG1 알로타입 G1m3의 불변 영역 및 인간 IgG1 알로타입 Km3의 서열을 코딩한다. 이 벡터는 다음의 기능적인 요소를 포함한다: pCMV 프로모터 (중쇄 및 경쇄 둘 모두에 대해), 번역을 위한 프로모터와 개시 코돈 사이에 키메라형 인트론, pUC 복제 근원, BGH 폴리아데닐화 부위, HS4 TK 폴리A 절연체, SV40 프로모터 및 벡터 증폭 동안 및 형질주입 후 세포 선별을 위한 카나마이신/네오마이신 저항 유전자. 소화 후, 생성된 벡터 백본 (backbone) 단편은 겔 정제를 이용해 회수하였다.
상기 기술된 바와 같은 천연 쥐 VH 및 VL 도메인을 코딩하는 합성 VH및 VL유전자 삽입체를 포함하는 삽입 단편은 각각 KpnI/NheI 및 SalI/BsiWI를 이용하여 그의 각각의 PVVS 탠덤(tandem) 발현 벡터로부터 추출하고 겔 정제를 통해 회수하였다.
모든 회수한 절편은 함께 모으고, 결찰시켜 형질주입을 위한 최종 벡터를 생성하였다.
형질주입/선별
CHO 세포는 European Collection of Cell Cultures (ECACC)로부터 얻은 CHO (단백질 불함유) 세포주 (참조 # 00102307, 롯트 02K/008)로부터 유래된 상기 기술된 벡터에 의해 형질주입시켰다. 본래 1985년에 ECACC에 의해 획득된 이 세포주는 햄스터 난소 조직으로부터 유래된 부모계 CHO 세포주의 아클론이고, Puck 등에 의해 최초로 확립되었다 (1958).
ECACC 바이알로부터 유래된 세포은행(bank)은 Bk1998로 명명하였다. 세포는 소 태아 혈청 없이 성장하도록 적응시킨 후, 제한 희석에 의해 클로닝시켰다. 아클론 PF 3B9는 성장 특성 및 형질주입 능력을 기반으로 하여 선별하고 저장하였다 (세포 은행 Bk4164). 항체의 항체 생산을 위한 세포 기질을 생성하기 위해 사용되는, 세포 은행 BK4164은 Bk21146의 바이알로부터 제조하였다.
본래 아클론 3B9으로부터 얻은 CHO 세포는 4 mM L-글루타민으로 충전된 EX-CELL ®ACF CHO 배지에서 해동시키고, 선회 진탕 (orbital shaking) 하에 5% CO2습윤 대기 중 37℃에서 성장시켰다. 5번째 계대 후 2일째에 형질도입을 수행하였다. 상기 제조된 바와 같은 발현 벡터는 SWaI 제한 효소에 의한 소화에 의해 선형화시켰다. 형질도입은 10 μg DNA를 이용하여 Nucleofection™ (Amaxa)에 의해 3회 반복 수행하고, 3일 동안 진탕없이 5 % CO2,37℃에서 인큐베이션시켰다. 3일 회복 기간 후, 제네티신(0.5 g/L)을 추가하여 선별을 개시하였다. DNA 없는 Nucleofection™ 조건으로 주입된 세포는 항체 선별의 대조군으로서 사용하였다.
제네티신 선별 압력 하에 세포 생존력이 적어도 80%에 도달한 후 제한된 희석 클로닝을 수행하였다. 3개의 형질감염 풀 (pool) 각각에 대해, 0.5 세포/웰의 표적 세포 밀도로 40개의 96-웰 플레이트를 씨딩처리하였다. 이들 풀로부터, 단일 세포로부터 유래된 475개 클론을 생성하였다. 대략 18일의 배양 후, 항체 농도를 ELISA로 평가하여 24-웰 플레이트에서 스케일 업 (scale up)을 위한 150개의 최상-생산성 클론을 선별하였다. 세포가 충분한 밀도에 도달한 후, 세포를 6 웰 플레이트로 옮겼다. 추가적인 선별은 진탕 플라스크 스케일 업에 대해 FastELISA 에 의해 평가한 바와 같이 mAb 생산 및 10-일 배치 카이네틱 (batch kinetic)을 기반으로 하여 수행하였다. 단백질 A HPLC (최대 2L 생물반응기 규모)에 의해 평가된 바와 같이 mAb 생산 및 유가-배치 (fed-batch) 카이네틱을 기반으로 한 추가적인 선별을 수행한 결과 항체 생산을 위한 리드 (lead) 클론을 선별하였다.
항체 생산
리드 클론으로부터의 세포를 해동시키고, 재활성화 배지 (EX-CELL ®ACF CHO 배지, 4 mM L-글루타민)로 옮겼다. 생존 세포 밀도를 측정하고, 원심분리 시킨 후, 세포 펠렛을 75 cm2플라스크에서 씨딩 후 2 x 106세포/mL의 밀도로 배지에서 재현탁시켰다. 세포를 선회 진탕 하에 37℃±1℃, 8%±2% CO2에서 성장시켰다. 2일째부터,진탕 플라스크의 용량을 증가시키면서 배양물을 선회 진탕 하에 37℃±1℃, 8%±2% CO2에서 EX-CELL ®ACF CHO 배지, 4 mM L-글루타민에서 스케일업 한다. 세포 생존력, 밀도 및 성장을 각각의 계대에서 평가하고, 오염물질이 없는 것을 현미경 검사를 통해 확인하였다. 7번째 계대 후, 17일째에, 진탕 플라스크의 내용물을 모았다. 세포를 계수하고, 이를 7 L 부피 중 0.5 x106생존 세포/mL의 밀도로 2개의 15-L 생물반응기에 씨딩처리하기 위해 사용하였다. 세포를 20일 동안 pH와 산소를 조절하면서 37℃에서 EX-CELL ®ACF CHO 배지, 5 mM L-글루타민, 0.2% 플루로닉에서의 유가-배치 배양으로 성장시켰다. BalanCD™ CHO Feed 3, 글루코스 및 L-글루타민을 필요에 따라 첨가하였다. 세포 밀도, 생존력, pH는 매일 평가한다; 6일째부터 시료를 매일 취해 글루코스 농도를 측정하고, 10일째부터 항체 농도를 평가한다(단백질 A HPLC).
20일째에 각각의 생물반응기로부터 삼중 깊이(three depth) 필터를 통해 동시에 세포 현탁액을 통과시킨 후, 0.2 μm 필터를 통해 직접 통과시켜 정제(clarification)를 수행하였다. 정제된 벌크 수확물을 수집하고, 단백질 A HPLC에 의해 항체 함량을, 웨스턴 블랏 분석에 의해 재조합 단백질 확인 (identity), 바이오버든 (bioburden), 마이코플라스마, 스피로플라스마 (spiroplasma) 오염을 시험하였다. 벌크 수확물을 2L PET 병에 분배시키고 -70℃ 내지 -90℃에서 저장하였다.
벌크 수확물의 추가적인 처리는 다음과 같이 수행하였다: 청징된 벌크 수확물을 15-25℃에서 24시간 동안 해동시키고, 다양한 병의 내용물을 모으고 자기적 교반에 의해 균질화시켰다. 모아진 벌크 수확물을 일단 50 mM 인산 나트륨, 300 mM NaCl, pH 7.0 완충액으로 평형화된 단백질 A 친화성 크로마토그래피 컬럼 상에서 정제한다. 평형 완충액, 이어서 25 mM 인산 나트륨, pH 7.0 완충액으로 세척한 후, 항체를 25 mM 아세트산 나트륨 pH 3.5 완충액을 이용해 용출시킨다. 항체 피크 (280 nm에서 용출 흡광도를 기반으로 함)를 수집하고 항체 용출물은 pH 조정 단계 이전에 15-25℃에서 유지시켰다.
항체 용출물의 pH는 0.2M 시트르산을 이용해 pH 3.8로 조정하고, 15-25℃에서 60-65분 동안 교반시키면서 인큐베이션시켰다. 0.5 M Na2HPO4로 pH 6.5까지 중화시킨 후, 용액을 0.2 μm 필터 상에 여과시키고, 수집하고 2-8℃에서 저장하였다.
pH-불활성화된 항체 용액은 술폰산염 리간드 레진을 이용하는 양이온 교환 크로마토그래피에 의해 더 정제된다. 용액의 pH를 0.2 M 시트르산을 이용해 5.0으로 조정하고, 25 mM 아세트산 나트륨, pH 5.0 완충액으로 이전에 평형화된 컬럼 상에 로딩시킨다. 평형 완충액으로 세척한 후, 항체를 25 mM 아세트산 나트륨, 195.2 mM NaCl, pH 5.0 완충액으로 용출시킨다. 수집은 280 nm에서 흡광도를 기반으로 한다.
생성된 항체 용액을 24 mM 인산 나트륨, 53.4 mM NaCl, pH 7.0 완충액으로 평형화된 사차 암모늄 이온 교환 막을 이용하는 음이온 교환 크로마토그래피에 의해 더 정제한다. 양이온 교환 크로마토그래피 용출물의 pH를 0.5 M Na2HPO4로 pH 7.0로 조정하고, 25 mM 인산 나트륨, pH 7.0 완충액으로 희석시켜 11mS/cm의 최종 전도율에 도달시킨다. 용액을 막 상에 로딩시키고, 항체를 280 nm에서의 흡광도를 기반으로 한 플로우-트루(flow-through) 방식으로 수집한다. 수집된 용액을 0.2 μm 필터를 통해, 무균의 일회용 PET 용기로 여과시키고, 2-8℃에서 저장한다.
항체 용액을 그후 30 kDA 컷-오프 (cut-off) 막을 이용해 10 mM Tris-HCl, pH 7.2 완충액에 대해 한외여과 및 투석여과에 의해 농축시킨다. 여과의 투석물 (retentate)을 수집하고 15-25℃에서 저장한다.
그후 투석물을 10 mM Tris-HCl pH 7.2 완충액을 이용해 1 mg/mL로 희석시키고, 0.2 μm 필터, 이어서 동일한 완충액으로 이전에 평형화된 나노여과 (Planova 15 N 막)를 통해 통과시킨다. 여과물은 15-25°에서 저장한다. 최종 단계에서, 생성된 정제된 벌크 항체 용액을 0.2 μm 필터를 통해 여과시키고, 무균 PET 병으로 분배시키고, -70 내지 90℃에서 저장한다.
시료는 각각의 정제 단계 동안 단백질 A HPLC에 의한 항체 농도 측정을 위해 취한다.
생성된 항체 산물은 UPLC-UV-MS와 같은 당해 분야에 알려진 방법에 의해 특성화시켰다. 항체의 분자량은 MALDI-TOF 질량분석법에 의해 측정된 바와 같이 148.6 kDA이다.
실시예
2 - 화학식 (IV)의 형광 색소의 제조
아세트아닐리드 중간체 (B):
설폰화된 인돌레닌 A는 1,4-부탄 설톤과 반응된다. 생성된 중간체는 베타-아닐리노아크롤레인과 반응시켜 아세트아닐리드 중간체 B를 제공한다.
중간체 화합물 (D):
중간체 D는 인돌레닌 전구체 C의 카르복시알킬옥시 유도체를 형성하기 위한 윌리암슨 (Williamson) 축합반응 후, 1,4-부탄 설톤과의 4차화 반응을 통해서 제조된다. 인돌레닌 C는 아미노화된 방향족 전구체의 디아조화/환원 후, 술폰산염 형성, 수산화 및 케톤과의 피셔 고리화에 의해 수득된다.
화학식 (IV)의 형광 색소:
화합물 B는 인돌 화합물 D로 축합된다. 생성된 디카르보시아닌 화합물을 N-하이드록시숙신이미드 (NHS)로 활성시켜 화학식 (IV)의 형광 색소를 제공하였다.
실시예
3 - 항-
CEA
키메라형
mAb에
대한 형광 색소의 접합
실시예 1의 정제된 항체는 15-25℃에서 대략 24시간 동안 해동시킨다. 30 kDa 컷-오프 막을 이용해 한외여과/투석여과로 완충액 교환(0.1 M 인산/탄산 나트륨, pH 9.3)을 수행한다. 형광 색소 (실시예 2의 화학식 (IV))는 15-25℃에서 밤새 교반시키면서 2.25 mg/mL의 농도로 DMF 중 용해시킨다. DMF는 10% v/v의 최종 농도까지 항체의 용액(0.1 M 인산/탄산 나트륨 완충액, pH 9.3를 이용해1 mg/mL의 최종 농도로 희석됨)에 첨가한다. 형광 색소의 용액을 그후 4.5의 몰 과량으로 20 mL/분의 유속으로 항체 용액에 첨가한다. 생성된 반응 혼합물은 약 45분 동안 주위 온도에서 선회 진탕 하에 인큐베이션시킨다.
제2 한외여과/투석여과 단계 (30 kDa 컷-오프 막)는 일단 10% (v/v) DMF로 보충된 PBS-135mM L-아르기닌, 이어서 배합 완충액 PBS-135mM- L-아르기닌으로 수행하여 DMF를 제거한다. 그후 투석물을 배합 완충액을 이용해 1.0-1.1 mg/mL의 최종 농도 (분광광도 분석에 의해 측정됨)로 희석시키고 여과시킨다 (0.2 μm).
얻어진 형광 접합체를 고 밀도 폴리에틸렌 캡으로 밀봉되는, 0.5 L PET 병 내로 채우고, 황색 플라스틱 가방에 넣어서, -20℃±5℃에서 저장한다.
형광 색소/항체 몰비는 분광광도법에 의해 측정한다. 1.5-1.6의 평균 접합도가 관찰된다.
항체에의 형광 색소의 접합은 접합 용매로서 DMSO를 이용해 대안적으로 수행될 수 있다. 10 % v/v 의 DMSO의 최종 반응 농도와 함께, 항체에 대한, 4 몰 과량 (1 mg/mL의 용액 농도)의 형광 색소의 첨가, 및 5 내지 120분의 반응 시간은, 분광광도법에 의해 측정된 바와 같이, 1.5-1.6 사이의 평균 접합도를 갖는 접합체를 제공하였다. 형광 방출 강도, 광퇴색, 및 양자 수율 측정에 있어서 어떠한 현저한 차이도 관찰되지 않았다. DMF 중 유사한 농도 및 조건 하에서 제조된 접합체와 비교하여 DMSO 중 제조된 이들 형광 접합체에 대해 얻어진 형광 방출 강도, 광퇴색, 및 양자 수율 측정에 있어서 어떠한 현저한 차이도 관찰되지 않았다.
실시예
4 배합
실시예 3에 따라 제조된 바와 같은 형광 접합체의 배합을 위해 사용되는 완충액은 본 발명의 내용에 속하는 용도 및 방법을 위해 필요에 따라 조정될 수 있다. 예를 들어, 형광 접합체는 바람직하게는 10 mM KH2PO4(VWRProlabo)10mMNa3시트르산염/시트르산 (Fluka), 300 mM Arginine HCl (Sigma), 0.02 % (w/v) Tween 20 (Merck)을 포함하는 완충액에서 배합될 수 있고, 여기에서 pH는 6.0로 조정된다.
실시예
5 접합체
특성화
형광 연구
실시예 3에 따라 제조된 바와 같은 형광 접합체 및 화학식 (IV)의 형광 색소의 퀀칭, 광퇴색 및 형광 양자 산출은 임상 사용에 적절한 파장인, 680 nm의 방출 파장 (광학 장치 Fluobeam700을 사용해 제공됨)에서 측정하였다.
DMF 중 화학식 (IV)의 형광 색소의 시료 및 PBS 135 mM-아르기닌 중 실시예 3의 형광 접합체의 시료를 0.05-500 μM범위의 다양한 농도로 제조하였다.
퀀칭의 검출 이전에 형광 색소의 최대 형광 강도 및 농도 (즉, 특정 농도에서 형광 색소 자체에 의해 방출된 형광의 자동-억제)를 형광강도계를 사용해 측정하였다.
형광 값은 완충제의 배경 형광 값을 감산한 후에 얻었다. 형광 접합체에 대하여, 최대 형광 강도는 70 AU (임의 단위)인 것으로 측정되었으며, 퀀칭 전에 5μM의 최대 농도가 관찰된다. 형광 색소에 대하여는, 최대 형광 강도는 120 AU이고 최대농도는 10 μL로 측정되었다.
흡수된 광에서 방출된 광으로의 전환의 효율에 대한 측정으로서 양자 수율은 680 nm 임상 파장에서 5 μM 농도의 시료에 대하여 계산하였다. 화학식 (IV)의 비접합된 형광 색소의 경우, 0.26의 양자 수율이 측정된 반면, 접합된 형광 색소의 경우 0.15의 양자 수율이 측정되어, 단지 43%의 감소에 해당되었다.
임상 사용에 있어서, 특히 종양 절제 수술 동안, 형광 접합체의 형광 색소는 가능한 긴 기간 동안 안정하고 충분한 수준의 형광 강도를 유지해야만 한다.
광퇴색, 또는 형광 활성의 손실을 또한 형광 색소 및 접합체뿐만 아니라, 화학식 (IV)의 형광 색소와 비슷한 최대 흡수 및 방출 파장 (679 nm 의 최대 흡수 및 702 nm에서 최대 방출)을 갖는 근적외선 방출 염료인, 상업적으로 입수 가능한 카보시아닌 형광 색소, Alexa Fluor®680의 시료에 대해 680 nm의 임상 방출 파장에서 측정하였다. 광퇴색은 또한 실시예 1의 항-CEA 키메라형 mAB의 실시예 3에서 기술된 접합 방법과 유사하게 제조된 접합체 및 Alexa Fluor®680에 대해 평가하였다 (약 1.46의 항체에 대한 평균 형광 색소의 비가 얻어짐). 이들 접합체의 시료를 PBS 1x 에서 제조하였다.
시료를 5μM의 농도로 제조하고, 680 nm에서 광에 노출시켰다. 방출된 형광 강도는 0 시간, 30 분 및 1시간, 1.5시간 및 2시간의 광 노출 간격으로 측정하였다.
| 노출 시간 (시간) | 0 | 0.5 | 1 | 1.5 | 2 |
| 형광 색소 (화학식 IV) |
100.00 | 79.73 | 83.29 | 73.74 | 66.3 |
| 실시예 3의 접합체 | 100.00 | 69.59 | 35.75 | 25.43 | 15.14 |
| Alexa-Fluor 680 | 100.00 | 52.13 | 16.22 | 5.74 | 2.01 |
| Alexa-Fluor 680 접합체 |
100.00 | 9.04 | 2.27 | 0.98 | 0.62 |
680 nm의 임상 파장에서 30분의 계속적인 노출 후, 형광 접합체의 형광은 대략 70%인 반면, 동일한 항체에 접합된 상업 염료의 방출된 형광은 단지 약 9%이다. 1시간 후, 상업 염료뿐만 아니라 이의 접합체의 형광 강도는 거의 0이 된 반면, 형광 접합체 및 비접합된 형광 색소의 형광은 여전히 유지된다.
조직 교차 반응성
비오틴 표지된 접합체를 이용하여 실시예 3에서와 같이 제조된 형광 접합체의 조직 교차 반응성 연구를 표준 면역조직화학염색 기술을 이용해 3인의 연관없는 개인으로부터의 혈액 도말 및 42개 인간 냉동 조직의 패널 상에서 수행하였다. 항체 접합체의 특이적 염색은 소화관 및 CEA를 발현하기 위해 문헌에서 기술되었던, 주로 정단 세포 경계 또는 내강 측 상에, 상피 성분 내, 일부 다른 조직에 제한적인 것으로 밝혀져, 항체가 정확히 표적에만 결합하는 것을 확인하였다.
항체 친화도
표적 암종 태아성 항원에 대한 실시예 3에서 제조된 바와 같은 형광 접합체의 친화력은, BIACORE 3000 장치 상에 표면 플라스몬 공명 (SPR)을 이용해, 측정하였다. 암종 태아성 항원은 티올 기(Surface Thiol Coupling GE healthcare; Instruction 22-0618-10AB)를 통해 CM5 칩에 결합되었다. 연계 및 분리 속도는 실시예 1의 키메라형 모노클로날 항체, 모노클로날 항체 m511 (실시예 1의 키메라형 모노클로날 항체의 가변 영역이 기반으로 한 본래 쥐 항체) 및 형광 접합체의 6가지 상이한 농도 (50 nM 내지 1.5 nM)의 흐름을 이용해 측정하였다. 데이터 습득 및 매개변수 계산은 소프트웨어 및 Bia 평가 프로그램을 이용해 수행하였다. CEA에 대한 실시예 1의 키메라형 모노클로날 항체의 친화력 (3.27x10-11 nM)은 모계 쥐 511 항체 (3.82x10-11 nM)의 것과 아주 유사하게 남아있었고, 근적외선 형광 색소로 표지화 한 후 변형되지 않았다 (실시예 3의 형광 접합체의 KD는 3.21x10-11 nM로서 측정되었다).
실시예
6 -
생체내
연구
실시예 3의 형광 접합체의 효능은 인간 CEA를 발현하는 4개의 상이한 마우스 모델에서 생체내 평가하였다.
형광 접합체의 조직 분포는 확립된 프로토콜에 따라 설정된 LS-174T 복막 암종증 마우스 모델에서 단일-광자 방출 컴퓨터 단층 촬영(SPECT)을 이용하여 방사능을 측정하여 평가하였다. 면역억제된 NMRI 누드 마우스에게 CEA-과발현 LS-174T 세포로 복막내 주사를 통해 LS-174T 세포를 이식하였다. 30 및 50 μg 의 125I-방사성표지된 형광 접합체 (형광 접합체와 방사성표지 요오드화 시약을 함께 인큐베이션시켜 제조됨)를 마우스에게 10일 후 정맥내 주사하였다. 50 μg의 접합체로 처리 48시간 후 마우스의 가시화 (Nano-SPECT-CT (Bioscan®카메라를 이용해 수행함)는 방사능이 마우스의 복강(perioneal cavity) 내 존재하는 종양 결절에 필수적으로 제한되었음을 나타냈다. 이 결과는 동물을 희생시킨 후 수득한 다른 기관에서의 방사능의 생물분포 측정과 상응하였다.
생체내 형광 가시화 연구는 CEA를 과발현하는 LS-174T 인간 종양 세포를 복막 주사한 후 복막 암종증이 발병한 면역억제된 NMRI 누드 마우스 내로 비-방사성표지 형광 접합체를 주사하여 수행하였다. 암종증의 발병 12일 후, 동물은 20 또는 30 μg 의 형광 접합체를 정맥내 투여 받았다. 48시간 후, 동물을 희생시키고, 각각 680 nm 및 700 nm의 여기 및 방출 파장에서 최적 프로브를 이용해 가시화시켰다. 용량 둘 모두에서, 형광 분포는 명확하게 복막 종양에 제한되었으며, 췌장 부위를 포함하여, 복강 내 미세-결절의 명확한 가시화가 가능하였다 (도 1, 컬럼 A, 제위치 종양은 700 nm에서 가시화됨). 1 mm 보다 작고, 무게가 1 mg 미만(0.2-1.7 mg)인 결절을 확인가능하였고 형광성이었다 (도 1, 컬럼 B는 컬럼 A에 나타난 것과 동일한 동물의 개별 절제된 종양을 나타냄, 700 nm에서 가시화됨). 건강한 동물 내로 형광 접합체 및 대조군으로서 관련 없는 형광 접합체 (PX 항체, 즉 마우스 골수종 MOPC21로부터 정제된 IgG1 모노클로날 항체를 포함 (참조: Koholer 등, Eur J Immunol 1976 (6) 292))의 주사는 어떠한 특이적 염색도 유도하지 않았다.
놀랍게도, 형광 접합체는 종양 결절의 위치에 상관없이, CEA를 과발현하는 종양 결절의 가시화를 가능하게 하고, 따라서 임상 상태를 모사한다.
인간 CEA를 발현하는 인간 대장암의 동소이식 마우스 모델(Tseng 등, Vis. Exp. 2007 (10) 484)에 기초한 모델을 사용하였다. CEA를 과발현하는 HT29 세포를 6주령 CD1-FOxn1nu면역억제 암컷 마우스의 등 4개 부위에 피하 주사하여 피하형 인간 결장 종양 발달을 유도하였다. 그후 작은 종양 단편 (대략 직경 3 mm)을 제거하고, 동물의 맹장벽 내로 이식시켜 동소이식 종양의 발달을 유도하였다. 맹장벽을 약하게 손상시켜 면역반응을 유도하고, 종양 세포 침윤을 촉진시켰다. 이들 종양의 발달 후, 본 발명에 따른 30 μg의 형광 접합체 (또는 대조군으로서, 관련 없는 PX 항체를 포함하는 형광 접합체)를 동물 내로 정맥내 주사하였다. 근적외선 (700 nm)에서 형광 신호를 피하 종양의 경우 PEARL 촬영 시스템 (Li-Cor Biosciences)을 이용하거나 또는 동소이식 종양의 경우 FLARE 수술중 촬영 시스템 (Curadel)을 이용해 주사 후 0, 4, 24 및 48 시간에 측정하였다.
그 결과, 피하 및 동소이식 둘 모두의 위치에서 종양의 700nm에서 수술중 면역광검출(immunophotodetection)가 명확하게 관찰되었다 (각각 도 2A 및 도 2B). 피하 종양의 형광은 아주 높은 수준이어서 항체 주사 48시간 후 동물의 피부를 통해 가시화되었다 (도 2A, A열).
CEA를 과발현하는 인간 종양의 간 전이를 또한 본 발명의 형광 접합체를 이용해 관찰하였다. LS-174T 세포 또는 LoVo 인간 결장 선암 세포를 공개된 프로토콜 (참조: Tibbetts et al, Cancer 1993, (71), 315-21)에 기술된 바와 같이 면역억제된 Balb/c 누드 마우스의 비장에 주사하였다. 세포 유형 둘 모두 CEA를 과발현하고, 간 전이의 발달을 유도하였지만, 상이한 패턴을 따랐다. LoVo 세포는 간 표면에 걸친 많은 소규모 전이의 파종을 유도하는 반면, LS-174T 세포는 단지 일부의 더 넓은 전이의 형성을 유도한다. 마우스 개체는 700 nm에서 형광 가시화 48시간 전에 30 μg의 형광 접합체를 받았다. 대조군으로서, 마우스에게 PX 항체를 기반으로 하는 관련 없는 접합체를 주사하였다. 검출이 불가능하였던, 즉, 육안으로 확인가능한, 아주 작은 크기의 종양 결절, 예를 들어 간 표면 상에 미세-전이는 형광 접합체로 주사된 마우스에서 형광 하에 검출될 수 있었고, 이는 이들 종양의 윤곽을 정의하였다. 또한, 간 전이의 가시화는 종양 결절의 세포주에 관련없이 가능한 것으로 확립되었다. 대조군에 의한 어떠한 종양의 검출도 확인되지 않았다.
유사한 연구를 췌장 종양을 위한 모델을 이용해 수행하였다. 6주령 무흉선 CD1-Foxn1nu면역억제된 엄컷 마우스를 연구에서 사용하였고, 종양 접종 및 촬영 절차 동안 이소플루란을 이용해 마취시켰다. 동소이식 췌장 종양을 Kim 등, Nat. Protoc., 2009, 4, 1670-80에서 기술된 바와 같이 얻었다. 동물의 비장 및 췌장을 둘다 췌장의 전체 길이를 노출시키기 위해 측면 절제를 통해 측면으로 노출시켰다. 미세 바늘을 혈관구조와 평행하게 췌장으로 통과시키고, 이를 통해 500000 BXPC-3-luc2세포 (루시퍼라제 형질감염된 세포주)를 주사하였다. 동소이식 종양의 성장은 IVIS 스펙트럼 촬영 시스템 (Perkin Elmer Life Sciences)을 이용하는 촬영 10분 전에, 50 μL의 총 부피인 PBS 중 150 mg/kg의 D-루시펜렌 용액 (SynChem, Inc)을 복막내로 주사하여 수행되는 생체발광 촬영 (BLI)에 의해 매주 모니터링하였다. 일단 동소이식 종양이 BLI를 통해 검출되면, 30 μg의 형광 접합체를 동물의 꼬리 정맥을 통해 정맥내 주사하였다. 동물을 주사 48 시간 후 희생시키고, 700 nm에 근적외선 하에서 검사하였다. 동소이식 췌장 종양의 명백한 가시화가 관찰되었다. 비-특이적 접합체 또는 형광 색소 염료 단독으로 주사된 대조군 마우스에서는 어떠한 가시화도 관찰되지 않았다.
신호-대-배경 비율을 Pearl Impulse 작은 동물 촬영 시스템 (LI-COR)을 이용하여 측정된 NIR형광 신호를 이용해 측정하였다. 이미지는 정규화시키고 관심 영역을 분석을 위해 선택하였다. 종양 특이적 신호 평균을 주변 조직으로부터의 신호 평균으로 나누어 신호-대-노이즈 평균 비율을 제공하였다. Bonferroni 보정법을 이용하는 투-웨이 반복 측정 ANOVA를 이용해 모든 시점에서 상이한 그룹들로부터 유의 신호-대-배경 비율을 평가하였다. 유리 (free) 형광 색소 염료, 또는 신호-대-배경 비율 값이 1에 가까웠던 관련 없는 대조군 접합체와 대조적으로, 형광 접합체에 대한 신호-대 배경 비율은 3을 초과했다.
헤마토실린-에오신 염색을 이용한 BXPC-3 피하 종양의 절개면의 면역 조직 화학적 분석으로부터, 종양 세포 주위에 비-특이적 염색으로서만 나타났던 대조군과 대조적으로, 형광 접합체가 종양에 결합되었음이 확인되었다.
요약하면, 실시예 3에 따라 제조된 바와 같은 형광 접합체가 종양의 위치, 및 종양의 근원 (즉, 대장 대 췌장)에 상관없이, CEA를 과발현하는 종양 결절의 생체내 확인을 가능하게 함이 밝혀졌으며, 이는 형광 접합체의 표적화 능력을 확인시켜 주는 것이다. 높은 수준의 노이즈 신호 비율이 관찰되었고, 이는 육안으로 보이지 않는 매우 작은 결절의 검출을 가능하게 한다.
형광 접합체의 정맥내 투여의 안전성 및 독성을 평가하기 위한 약학적 연구는 Wistar 랫트에서 중추 및 말초 신경계에서 어떠한 현저한 부작용도 없었고, Beagle 개의 심혈관 및 호흡 기능에서도 어떠한 현저한 부작용도 없었으며, 접합체가 랫트에서 하루에 40 mg/kg 이하 (의도된 임상 용량의 85배) 및 개에서 5 mg/kg (의도된 임상 용량의 10배)이하의 시험된 최대 용량 수준까지 내약성이 우수함 (well tolerated)을 또한 증명하였다.
실시예
7 - 임상 연구
(a) 복막 암종증 - 소화 기관의 복막 암종증 (전이성 종양)을 가진 15명의 환자에서 실시예 3의 접합체의 안전성 및 성능을 평가하기 위한 임상 연구.
5 내지 15 mg 범위의 실시예 3의 형광 접합체 용량을 정맥내 주사로 투여하였다. 초기 결과는 이들 용량 중 어는 것에서도 이상 반응이 관찰되지 않았음을 보여준다.
(b) 대장 및 췌장 암 - 직장 또는 췌장 암을 가진 30명의 환자에서 실시예 3의 형광 항체 접합체의 안전성 및 성능을 평가하기 위한 임상 연구.
수술 48시간 전에 정맥내 주사된 5 mg 용량의 형광 접합체를 이용하는 연구를 수행하였다. 현재까지 연구된 환자 중, 투약 동안 또는 투약 직후에 어떠한 부작용도 보고되지 않았다. 일반적으로, 활력 징후에 있어 기저값으로부터의 어떠한 임상적으로 유의미한 변화도 관찰되지 않았다.
초기 결과는 의심이 가는 종양 위치에서 아주 명확한 형광의 위치표시를 증명한다. 수술중 가시화는 형광 접합체에 대해 적절한 설정으로 구성된 Artemis Open Imaging System (Quest Medical Imaging)을 이용해 수행하였다.
한명의 췌장암 환자에서, 형광 접합체의 사용은, 일반적으로 시각적 검사 및 촉진 만을 기초로 하여, 췌장 본체에 위치확인된 일차 종양 주위에서 종양이 없는 (tumour-free) 절제 마진인 것으로 고려되었던 부위에 위치한 종양 세포가 위치함을 확인시켜 주었다 (즉, 종양 조직의 잔류를 야기함) (도 3 시각적 검사 및 촉진 만으로 결정되어 제안된 절제 마진은 파선으로서 표시하고, 이는 그 덩어리 (bulk)가 점선으로서 표시되는 종양 조직과 너무 가까울 수도 있다. 형광에 의해 측정되어 제안된 절제 마진은 실선으로서 표시됨). 많은 복막 전이의 존재로 인해, 조사 및 병기결정만이 수행되었다, 즉, 전이만을 생검을 위해 절제하여, 수술실의 뒷쪽 책상에서 추가로 분석하였다. 형광 접합체는 절제 후 절단된 종양에서 생체내 및 생체외 모두에서 전이의 마진뿐만 아니라 병소의 명백한 구분을 제공하였다 (도 3, A열: 백색광 하 및 형광 하 생체내 전이의 이미지 (중첩 이미지); 도 3, B열: 백색광 하 및 형광 하 생체외 절제된 전이의 이미지 (중첩 이미지)).
유사한 결과가 형광 접합체 투여 후 다른 췌장암 환자에서 관찰되었다. 췌장의 윗부분(hear) 가까이 위치했던 의심되는 종양을 명확하게 표시하는 형광을 관찰하였다.
대장 전이로 진단된 환자에서, 절제 48시간 전에 5mg 용량의 형광 접합체를 투여하였다. 상기 용량은 어떠한 부작용 없이 내약성이 우수하였다. 전이를 나타내는, 전이에 대해 의심되는 왼쪽 림프절 장골 주변에서(para-iliacal) 명확한 형광 시그널이 검출되었다. 성공적인 절제가 수행되었다.
국소적으로 진행된 직장암을 가진 환자에게 또한 5mg 용량의 형광 접합체를 투여하였다. 상기 용량은 어떠한 부작용 없이 잘 용인되었다. 절제된 직장 조직을 수술실 뒷쪽 책상에서 가시화하였다. 절제된 조직에서 종양 조직의 명확한 묘사가 관찰되었다.
SEQUENCE LISTING
<110> SurgiMab S.A.S
<120> Fluorescent Conjugates
<130> SRG15P01PC
<150> EP15170617.3
<151> 2015-06-03
<160> 4
<170> BiSSAP 1.3.6
<210> 1
<211> 441
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Mus musculus with KpnI and NheI restriction sites
<400> 1
ggtaccgccg ccaccatgga ctccagactg aacctggtgt tcctggtgct gatcctgaag 60
ggcgtgcagt gcgacgtgca gctggtggaa tctggcggag gactggtgca gcctggcggc 120
tccagaaagc tgtcttgtgc cgcctccggc ttcaccttct ccaacttcgg catgcactgg 180
atccggcagg cccctgagaa gggcctggaa tgggtggcct atatctccgg cggctcctcc 240
accatctact tcgccgacac cctgaaggga cggttcacca tctcccggga caaccccaag 300
aacaccctgt ttctgcagat gacctccctg cggagcgagg acaccgccat ctactactgc 360
gccagagact actacatcaa caactactgg tacttcgacg tgtggggcgc tggcaccacc 420
gtgacagtgt catctgctag c 441
<210> 2
<211> 402
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Mus musculus with SalI and BsiWI restriction sites
<400> 2
gtcgacgccg ccaccatgga atttcagacc caggtgttcg tgttcgtgct gctgtggctg 60
tctggcgtgg acggcgacat cgtgatgacc cagtcccaga aattcatgtc cacctccgtg 120
ggcgaccggg tgtccatcac atgcaaggcc tctcagaacg tgcggagcgc cgtggcctgg 180
tatcagcaga cacctggcca gagccccaag gccctgatct acctggcctc caacagatac 240
accggcgtgc ccgatcggtt caccggctct ggctctggca ccgacttcac cctgaccatc 300
tccaacgtgc agtccgagga cctggccgac tacttctgtc tgcaacactg gaactacccc 360
ctgaccttcg gcggaggcac caagctggaa ctgaagcgta cg 402
<210> 3
<211> 121
<212> PRT
<213> Mus musculus
<400> 3
Asp Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Arg Lys Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asn Phe
20 25 30
Gly Met His Trp Ile Arg Gln Ala Pro Glu Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Tyr Ile Ser Gly Gly Ser Ser Thr Ile Tyr Phe Ala Asp Thr Leu
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Pro Lys Asn Thr Leu Phe
65 70 75 80
Leu Gln Met Thr Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Ile Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Asp Tyr Tyr Ile Asn Asn Tyr Trp Tyr Phe Asp Val Trp Gly
100 105 110
Ala Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 4
<211> 107
<212> PRT
<213> Mus musculus
<400> 4
Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Gln Lys Phe Met Ser Thr Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Ser Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gln Asn Val Arg Ser Ala
20 25 30
Val Ala Trp Tyr Gln Gln Thr Pro Gly Gln Ser Pro Lys Ala Leu Ile
35 40 45
Tyr Leu Ala Ser Asn Arg Tyr Thr Gly Val Pro Asp Arg Phe Thr Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Asn Val Gln Ser
65 70 75 80
Glu Asp Leu Ala Asp Tyr Phe Cys Leu Gln His Trp Asn Tyr Pro Leu
85 90 95
Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Leu Lys
100 105
Claims (27)
- 표적화 모이어티 T에 결합된 형광 색소 모이어티 F를 포함하고, 형광 색소 모이어티 F가 하기 화학식 (I)을 가지며;
(I)
상기 식에서,
Y는 각각 독립적으로 S03H, S03- 및 S03M으로부터 선택되고;
M은 1가 양이온이고;
x, z 및 y는 1 내지 8의 정수 중에서 독립적으로 선택되고;
상기 표적화 모이어티 T가 종양 항원과 결합 또는 결부될 수 있고, 항체, 항체 단편 및 항체의 적어도 하나의 가변 영역을 포함하는 융합 단백질로부터 선택되는, 접합체. - 제 1 항에 있어서, Y가 S03- 및 S03Na로부터 선택되는, 접합체.
- 제 1 항에 있어서, 모이어티 F가 하기 화학식 (II)를 갖는, 접합체.
(II) - 제 1 항에 있어서, 상기 종양 항원이 암종 태아성 항원(CEA)인, 접합체.
- 제 1 항에 있어서, 상기 모이어티 T는 키메라형 모노클로날 항체(mAb)인, 접합체.
- 제 1 항에 있어서, 상기 모이어티 T가 CEA 항원의 하나 이상의 에피토프에 결합하는 키메라형 모노클로날 항체인, 접합체.
- 제 6 항에 있어서, 모이어티 F가 화학식(II)를 가지며,
(II)
키메라형 모노클로날 항체가 CEA의 GOLD-2 에피토프에 대항되고, G1m3 알로 타입의 중쇄 및 km3 알로 타입의 경쇄를 포함하고, 각각의 중쇄 및 각각의 경쇄는 적어도 하나의 마우스 IgG1 가변 도메인 및 적어도 하나의 인간 불변 도메인을 포함하는, 접합체. - 제 7 항에 있어서, 상기 키메라형 모노클로날 항체가 서열번호: 4의 가변 경쇄 영역 및 서열번호: 3의 가변 중쇄를 포함하는 접합체.
- 제 1 항에 있어서, n개 모이어티 F가 하나의 모이어티 T에 결합되고, n은 1 내지 4 중에서 선택된 정수인, 접합체.
- 제 1 항 내지 9 항 중 어느 한 항의 접합체를 포함하는, 종양 항원을 발현하는 종양의 병소를 검출하거나 또는 종양의 위치를 결정하기 위한, 조성물.
- 제 10 항에 있어서, 상기 조성물은
(a) 무균이며, 수성 완충액 및 L-아르기닌을 포함하고, 또는
(b) 모이어티 F에 결합하지 않은 모이어티 T를 포함하는 화합물을 포함하고, 또는
(c) 무균이며, 수성 완충액 및 L-아르기닌을 포함하고, 그리고 모이어티 F에 결합하지 않은 모이어티 T를 포함하는 화합물을 추가로 포함하는, 조성물. - 제 11 항에 있어서, 상기 조성물 내의 접합체의 평균 접합도가 0.5 내지 3 인, 조성물.
- (a) 화학식(III)을 갖는 형광 색소를 제공하는 단계,
(III)
상기 식에서,
Y는 각각 독립적으로 S03H, S03- 및 S03M으로부터 선택되고,
M은 1가 양이온이고,
x, z 및 y는 1 내지 8의 정수 중에서 독립적으로 선택되고, 그리고
Z는 반대이온, 수소, 숙신이미딜, 술포숙신이미딜 및 니트로페닐로부터 선택되고;
(b) 종양 항원과 결합 또는 결부될 수 있는 표적화제를 제공하는 단계, 여기서 상기 표적화제는 항체, 항체 단편 및 항체의 적어도 하나의 가변 영역을 포함하는 융합 단백질로부터 선택되며; 및
(c) 형광 색소를 표적화제와 결합시키는 단계를 포함하는, 형광 접합체의 제조 방법. - 제 13 항에 있어서, Y는 S03- 및 S03Na로부터 선택되는, 방법.
- 제 14 항에 있어서, 상기 표적화제가 CEA에 대해 친화성을 갖는 키메라형 모노클로날 항체이고, 상기 형광 색소가 하기 화학식 IV의 화합물인 방법.
(IV) - 제 1 항 내지 제 9 항 중 어느 한 항에 있어서, 시료 중의 종양 세포의 검출, 또는 종양의 진단 또는 모니터링을 위해 시험관내 사용되는, 접합체.
- 제 1 항 내지 제 9 항 중 어느 한 항에 있어서, 약제 또는 진단제로서 사용하기 위한, 접합체.
- 제 1 항 내지 제 9 항 중 어느 한 항에 있어서,
(a) 종양 항원을 발현하는 종양의 병소를 검출하거나 또는 환자에서 종양 항원을 발현하는 종양의 위치를 결정하는 단계, 또는
(b) 종양 항원을 발현하는 종양의 절제 수술을 시행중인 환자 또는 절제 수술을 받은 환자의 절제 마진(resection margin)에서 종양 세포 또는 종양 조직을 검출하는 단계에서 사용하기 위한, 접합체. - 제 18항에 있어서, 접합체는
(a) 종양을 앓고있는 환자에게 상기 접합체 또는 상기 접합체를 포함하는 조성물을 투여하는 단계;
(b) 상기 환자에 대해 종양 절제 수술을 개시하는 단계; 및
(c) 절제 수술을 받는 환자의 절제 부위의 조직을 660 내지 700 nm의 파장을 갖는 광으로 조명하는 단계들에서 사용되는, 접합체. - 제 19 항에 있어서, 상기 단계 (b)는 단계 (a) 이후, 96 시간 이하의 기간 내에 수행되는, 접합체.
- 제 18 항에 있어서, 상기 종양은 대장암, 위암, 담도 암, 췌장암, 식도암, 난소 암, 유방암, 전립선 암, 간암 또는 폐암인, 접합체.
- 제 7 항 또는 제 8 항에 있어서, 상기 접합체는 시료 중의 종양 세포의 검출, 또는 종양의 진단 또는 모니터링을 위해 사용되고, 종양은 악성 위장 종양인, 접합체.
- 제 17 항에 있어서, 상기 접합체는 국소적으로, 흡입에 의해, 또는 정맥내, 복강내, 피하, 또는 근육내 주사 또는 관류로 투여되는, 접합체.
- 제 19 항에 있어서, 환자는 대장암, 위암, 담도 암, 췌장암, 식도암, 난소 암, 유방암, 전립선 암, 간암 또는 폐암을 가지며, 접합체는 5 내지 15 mg 범위의 용량으로 주사로 환자에게 투여되는, 접합체.
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