KR102681811B1

KR102681811B1 - Her2에 결합하는 단일 가닥 가변 영역 항체 절편 플랫폼

Info

Publication number: KR102681811B1
Application number: KR1020210084786A
Authority: KR
Inventors: 원형식; 심대원; 현재원; 이기빈; 김찬길; 변규태
Original assignee: 건국대학교 글로컬산학협력단
Priority date: 2021-02-18
Filing date: 2021-06-29
Publication date: 2024-07-05
Anticipated expiration: 2041-06-29
Also published as: KR20220118280A

Abstract

본 발명은 불용성의 단일 가닥 가변 단편 (single chain variable fragment, scFV)을 대장균에서 세포외 방출시켜 빠르고 손쉽게 생산할 수 있는 핵산분자 플랫폼에 관한 것으로, 상기 플랫폼을 사용하면 가용 형태의 scFv를 고순도 및 대량으로 생산할 수 있다.

Description

HER2에 결합하는 단일 가닥 가변 영역 항체 절편 플랫폼{Novel anti-HER2 single chain variable fragment platform}

본 발명은 일반적인 방법으로 대장균에서 발현시키면 불용성으로 발현되는 단일 가닥 가변 단편 (single chain variable fragment, scFv)을 대장균에서 세포외 방출 가용성 형태로 빠르고 손쉽게 생산할 수 있는 플랫폼에 관한 것이다.

1. 항체 치료제의 개요

전 세계 의약품 시장에서 바이오 의약품이 차지하는 비율은 2018년에 25%까지 늘어날 것으로 예상되며, 특히 세계 100대 의약품에서 바이오 의약품이 차지하는 비율은 2004년 17%에서 2012년 39%, 2018년에는 51%로 가파르게 증가할 것으로 예상되고 있다. 특히 항체의약품이 바이오 의약품 매출에서 차지하는 비율은 약 52%로 총 646억 달러의 매출을 기록하는 등, 항체 의약품은 의약품 중에서 가장 빠른 성장을 보인다.

1994년 첫 항체 치료제가 출시된 이래 현재까지 30여 종의 치료용 항체가 암, 자가질환, 이식 거부반응, 감염증, 심장병 등의 치료에 FDA의 승인을 받았다.

특히, Rituxan (rituximab), Herceptin (trastuzumab), Campath (alemtuzumab), Erbitux (cetuximab), Avastin (bevacizumab), Vectibix (panitumumab), Prolia/Xgeva (denosumab), 그리고 Arzerra (ofatumumab) 등의 단일클론 항체(monoclonal antibody, mAb)가 항암제로서 FDA 승인을 획득하였으며 다수의 그 매출액이 폭발적으로 증가하고 있다.

암 치료를 위한 화학요법은 임상 치료에서 큰 효과를 얻기 위하여 최대 허용량에 가깝게 사용되고 있으며, 종양 세포뿐만 아니라 정상 세포의 증식 억제 및 세포 사멸을 야기하고, 비-종양 특이적(non-tumor specific) 전신 독성과 세포 독성, 약물의 장기 사용으로 인한 내성을 야기할 수 있다.

이에 반해, 항체 치료제의 경우 종양 세포의 표면에 있는 특정 항원에 결합함으로써 정상세포의 손상 없이 종양세포의 증식을 억제하고 세포의 사멸을 야기하는 장점이 있고, 또한 일반 저분자 약물에 비해 반감기가 매우 길기 때문에 투여 횟수를 줄일 수 있다.

즉, 암세포 선택적이고 효능이 높으며 부작용이 적고 투여 횟수를 줄일 수 있는 항체 의약품이 차세대 항암제로 자리매김하고 있어 그 개발 가치가 높다.

2. 차세대 항체기술 개요

차세대 항체기반 의약품으로는 항체와 약물이 결합된 항체-약물 융합체(antibody-drug conjugate, ADC), 이중특이항체(bispecific antibody)와 바이오베터가 있으며, 이중 항체-약물 융합체(ADC)는 신개념의 항암 항체 의약품 기술로서 가장 성공적인 치료용 항체기반 의약품으로 각광받고 있다. 항체-약물 융합체(ADC)는 약물, 단클론 항체, 그리고 항체와 약물을 연결하는 링커(linker)를 포함한 세 가지 구성 요소로 구성되어 있으며, 이때, 단일클론 항체의 표적 특이성과 약물의 세포독성(cytotoxicity) 두 구성 요소의 장점을 조합하여 약물이 암 세포만 표적화하는데 초점을 맞춘 기술이다.

즉, 항체-약물 융합체(ADC) 테크놀로지는 암 세포의 표면에 발현된 특정 항원에 특이적으로 결합하는 항체를 사용하여 약물을 종양세포에 전달하는 방법이며, 이 때 항체는 선택적인 약물 전달 시스템(drug delivery system)으로서 사용되는 것이다.

항체가 암세포를 인식하여 표적한 뒤 세포 내에서 약물이 유리되어 암세포 내에서 약물에 의해 암세포가 사멸되는 작용기전을 가진다. 따라서 이러한 표적 특이적 전달은 유리되는 독성 약물의 노출에 의해 유발되는 전신 독성을 피할 수 있는 장점이 있다.

따라서, 항체-약물 융합체(ADC)는 immunoconjugates라고도 불리며 "targeted chemotherapeutics"의 항암 약물에도 속한다.

다수의 글로벌 제약사들이 벤처기업으로부터 항체-약물 컨주게이트(ADC) 기술을 도입하고 있으며, 그 규모는 2000~5000억원에 이르고 있다.

항체-약물 컨주게이트(ADC) 기술이 적용된 제품의 시장은 폭발적으로 성장하여 항암 항체 바이오베터의 선도적 역할을 담당하고 있으며, 일례로 비호지킨 림프종 치료제인 Adcetris와 유방암 치료제인 Kadcyla의 2014년 매출은 약 8600억원으로 단 2종의 제품만으로도 1조원 돌파를 앞두고 있다.

3. EGFR 표적 의약품 개요

EGFR (HER1)은 세포표면에 존재하는 receptor HER family의 하나로 EGF, TGF-α, Epiregulin 등의 ligand들과 결합하여 세포의 성장과 사멸에 중요한 역할을 담당한다.

면역염색을 통해 조사한 결과 많은 종류의 암세포에서 EGFR 발현이 증가되며 EGFR의 증가는 암의 예후와도 밀접한 관련성이 있다고 보고되어지고 있다.

따라서, EGFR signal을 억제하여 암을 치료하는 항암제 약물들이 개발되었다.

EGFR blocking antibody인 cetuximab (Erbitux^®)과 small molecule의 EGFR tyrosine kinase inhibitor (EGFR-TK1)인 gefitinib (iressa^®), erlotinib (tarceva^®) 등이 임상에 사용된다.

그 외에도 해외에서는 EGFR에 대한 다양한 치료용 항체가 개발되어 승인되었거나 임상 진행 중으로, EGFR을 표적으로 한 항암치료제 개발이 활발하게 이뤄지고 있다.

이러한 현황은 EGFR 표적 의약품이 여러 종양에 대한 우수한 치료제가 될 수 있음을 방증하는 결과이며, 커다란 시장성과 더불어 연구개발의 중요성을 제시한다.

4. EGFR family Her2(Human epidermal growth factor receptor-2)

세포 내 Human EGFR2(HER2)는 HER2/neu 혹은 ErbB2로 알려져 있으며, 인간 표피 성장인자 수용체 (HER/EGFR/ERBB) family에 속하는 티로신인산화효소수용체(tyrosine kinase receptor)이며 정상적으로 신호 전달 경로에 관여하여 세포 성장 및 분화를 유도한다. HER2는 다른 3종의 EGFR family (HER1, HER3, HER4)와 매우 높은 구조적 유사성을 보인다.

그러나, 다른 항암 타겟과 달리 Her2(Human epidermal growth factor 2)의 경우 이와 결합하는 리간드는 아직 알려진 것이 없으며 리간드와 결합을 하는 다른 HER receptor들과 파트너를 이루며 heterodimer를 이루어 다양한 신호경로(signal pathway)를 통해 세포 주기증가, 세포증식조절 그리고 분화 및 생존에 관여한다. Her2를 타겟으로 하는 항체의 경우 IgG2 type으로 항체 치료제가 개발되어 시판 중에 있다.

5. Her2 과발현 유방암의 작용기전

유방암 환자의 약 30%에서 암세포 증식에 따라 HER2 유전자가 증식 및 과발현되는 현상에 따라 주목을 받게 되었고 이는 HER2-positive cancer로 분류를 하며 HER2-negative cancer의 형태보다 재발이나 사망의 위험이 현저히 높다는 보고가 되고 있다.

트라스투주맙(trastuzumab)은 Her2에 결합함으로써 Her2의 세포내 부위인 신호전달의 티로신 인산화효소 활성과 하위 신호인 RAS-RAF-MEK-MAPK와 PTEN-PIK3CA-AKT 경로들을 차단하는 단일 항체로 이로 인해 세포성장을 억제하고, 세포 사멸을 유도하여 Her2 과발현 유방암의 치료적 효과를 나타내게 된다.

그 결과 종양세포의 정상조직 침투 및 새로운 부위로의 종양확산이 감소하고, 더불어 종양세포가 화학요법 및 방사선 요법으로 인한 손상을 복구하는 능력을 억제하여 종양증식을 전반적으로 억제한다. 이러한 치료 기작에서 알 수 있듯이 Her2 과발현 유방암의 경우는 Her2의 하위 메커니즘을 차단하는 작용으로, 이는 항체의 Fc부분의 작용이 상쇄되더라도 가능한 치료기작으로 항원결합부위인 Fab부분으로도 치료효율을 얻을 수 있다.

6. 항체 단편 유도체 (Engineered antibody fragments) 활용

단편화하여 개량된 항체는 온전한 항체에 비해 크기가 작기 때문에 조직이나 종양으로의 침투율이 좋고, 박테리아 시스템을 이용한 저비용 생산이 가능하다는 장점이 있다.

다만, 항체 단편은 온전 항체에 비해 Fc가 없고 적은 분자량을 가지므로, 항체 recycling의 저해, 신장 배출 증가 등의 이유로 혈액 내 반감기가 짧아질 수 있는 단점이 있지만, 페길화(PEGylation) 등을 비롯한 다양한 바이오의약품 안정화 기술들이 개발 되고 있고, FDA에 승인된 Cimzia의 경우가 이에 해당한다.

또한, 방사성동위원소를 부착하여 진단제로 응용될 경우, 항체단편의 짧은 반감기로 인한 신속한 약효물질 해소의 특징은 오히려 온전 항체에 비해 장점으로 작용한다.

이에 따라 현재 개발 중이거나 사용 중인 항체단편은 생체 진단용으로 적합하게 사용할 뿐 아니라, 반감기를 늘려 치료제로도 개발하며, 박테리아의 독소를 접합하여 약물 전달(drug delivery)용으로 개발하거나, cytotoxic T 세포에 결합하는 항체단편과의 이중특이적(bispecific) 항체를 제조하여 암치료제로 개발하는 등 다양한 형태의 항체단편들이 치료용 개량항체로서 개발되고 있다.

특히, 세포독성 약물을 항체에 부착함으로써 항체를 표적으로의 전달 (delivery) 목적으로 사용하는 항체-약물 융합체(antibody-drug conjugate, ADC) 약물 개발의 경우, 항체단편을 사용하면 다른 면역 세포들과의 상호작용 없이 표적 세포로의 신속한 타겟팅과 더불어, 온전 항체에 비해 종양 조직 및 세포 침투율을 높여 약물의 효과를 신속하게 극대화할 수 있으며, 항체 recycling에 의한 독성 약물의 종양 외 유출을 감소시킬 수 있는 장점이 있다.

항체 또는 항체 절편의 생산에는 주로 동물세포를 이용한 단백질 발현시스템이 사용된다. 동물세포를 이용한 단백질 발현시스템은 번역 후 수정(post-translational modification)이 필요한 항체를 비롯한 복잡한 단백질 생산에 적합하나, 생산에 긴 시간이 소요되고 생산비용이 비싼 단점이 있다. 일부 항체 절편의 생산에는 번역 후 수정과정이 불필요하여 대장균 발현시스템을 이용한 빠르고 값싼 단백질 생산이 가능하나, 침전이 형성되고 자가조립이 이루어지지 않는 문제가 있어 수율이 매우 나쁘다.

7. 세포 외 방출(extracellular secretion) 생산법의 유용성

세포를 이용한 재조합단백질 생산에서 세포 외 방출 생산법은 효율적인 생산공정을 개발하기 위한 여러 잇점을 갖는다.

특히 항체 기반의 단백질의 경우 이황화결합(disulfide bond) 형성을 필요로 하기 때문에 세포 외 방출이 될 경우 올바른 구조 형성의 가능성을 높을 수 있다.

또한, 세포가 방출하는 단백질 분해효소 및 기타 단백질은 매우 적기 때문에 세포 외 방출로 표적 단백질을 생산할 경우 단백질 분해효소에 의한 예기치 않은 분해를 방지하여 안정성과 생산 수율을 높일 수 있다. 세포 내 발현에 비해 불순 단백질 함유가 적어 이후의 정제 과정도 용이해진다. 더욱이 세포 외 방출 생산은 이후 공정에 있어 세포를 파쇄하는 작업을 필요로 하지 않기 때문에 더욱 수월한 downstream 생산 공정을 최적화할 수 있다.

이러한 세포 외 방출을 위해서는 일반적으로 세포 외 방출 시그널 서열을 사용하는데, 이러한 방법도 대장균의 경우는 그램음성균에 해당하기 때문에 세포 외 방출 효율이 떨어지는 것으로 알려져 있다.

대한민국 공개특허공보 제10-2015-0128560호

단일 가닥 가변 단편(Single Chain Variable Fragment, scFv)은 항체 고유의 특이적 항원-결합능력은 유지하는 한편, 항체(150kDa)에 비해 작은 크기(30kDa)로 커다란 종양이나 침투가 어려운 조직에도 효과적으로 작용할 수 있을 것으로 기대되어 기존 항체를 대체할 치료제로 유망하다.

본 발명의 목적은 일반적인 방법으로 대장균에서 발현시키면 불용성으로 발현되는 scFv(single chain variable fragment)를 가용성 형태 (soluble form)로 대장균에서 세포 외 방출로 생산하는 방법을 제공하는 것이다.

본 발명은 상기와 같은 목적을 달성하기 위한 제1 구현 예로, HER2에 특이적으로 결합하는 단일 가닥 가변 단편(scFv)을 코딩하는 염기서열; 담배 식각 바이러스 부위(TEV site)를 코딩하는 염기서열; 공간자(spacer)를 코딩하는 염기서열; 및 말토오스 결합 단백질(MBP)을 코딩하는 염기서열;이 작동가능하게 연결된 핵산분자 플랫폼을 제공한다.

상기 핵산분자 플랫폼이 코딩하는 단백질에서, 상기 HER2에 특이적으로 결합하는 단일 가닥 가변 단편(scFv)은 경쇄가변영역(V_L)-연결자(linker)-중쇄가변영역(V_H)으로 연결되도록 각각 서열번호 1, 서열번호 2 및 서열번호 3으로 이루어질 수 있다.

상기 핵산분자 플랫폼이 코딩하는 단백질에서, 상기 담배 식각 바이러스 부위(TEV site)는 서열번호 4의 아미노산 서열로 이루어질 수 있다.

상기 핵산분자 플랫폼이 코딩하는 단백질에서, 상기 공간자는 서열번호 5의 아미노산 서열로 이루어질 수 있다.

상기 핵산분자 플랫폼이 코딩하는 단백질은 말토오스 결합 단백질(MBP)-공간자-담배 식각 바이러스 부위(TEV site)-단일 가닥 가변 단편(scFv)으로 작동가능하게 연결되고, 서열번호 6의 아미노산서열로 이루어질 수 있다.

본 발명은 상기와 같은 목적을 달성하기 위한 제2 구현예로, 상기의 핵산분자 플랫폼을 포함하는 재조합 발현 벡터를 제공한다.

상기 재조합 발현 벡터는 서열번호 16의 염기서열로 이루어질 수 있다.

본 발명은 상기와 같은 목적을 달성하기 위한 제3 구현예로, 상기 재조합 발현 벡터를 숙주세포에 형질전환시키는 단계와 발현 단백질의 세포외 방출을 포함하는, 핵산분자 플랫폼의 생산방법을 제공한다.

상기 핵산분자 플랫폼의 생산방법은 (a) 상기 재조합 발현 벡터를 숙주세포에 형질전환시키는 단계; (b) 상기 형질전환된 숙주세포를 배양한 후, 단일 콜로니를 암피실린이 포함된 배지에서 종자배양하는 단계; (c) 상기 종자 배양물을 성장시킨 후 암피실린이 첨가된 배지에 옮겨 배양하는 단계; (d) IPTG, Triton X-100 및 Tween 20을 첨가하여 과발현 및 세포외 방출을 유도하는 단계; 및 (e) 배양 종료후, 원심분리하여 얻은 상등액을 여과한 다음, 크로마토그래피하여 정제하는 단계를 포함할 수 있다.

상기 핵산분자 플랫폼의 생산방법에서, 상기 숙주세포는 대장균, 바람직하게는 대장균 BL21(DE3)일 수 있 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.

본 발명은 상기와 같은 목적을 달성하기 위한 제4 구현예로, (a) 상기 핵산분자 플랫폼의 생산방법에 의해 생산된 핵산분자 플랫폼을 담배 식각 바이러스 부위(TEV site) 단백질분해효소와 혼합하고, 반응시키는 단계; 및 (b) 상기 반응 종료후 정치시키는 단계를 포함하는, HER2에 특이적으로 결합하는 단일 가닥 가변 단편(scFv)의 정제방법을 제공한다.

상기 HER2에 특이적으로 결합하는 단일 가닥 가변 단편(scFv)의 정제방법에서, 상기 혼합은 상기 핵산분자 플랫폼을 상기 담배 식각 바이러스 부위(TEV site) 단백질분해효소와 0.1~10 : 0.1~10의 분자 비율, 바람직하게는 0.5~2 : 0.5~2의 분자 비율, 보다 바람직하게는 1:1의 분자 비율로 혼합할 수 있다.

상기 HER2에 특이적으로 결합하는 단일 가닥 가변 단편(scFv)의 정제방법에서, 상기 반응은 20~25℃, 바람직하게는 21~23℃에서 15~25시간, 바람직하게는 18~22시간 동안 수행할 수 있다.

상기 HER2에 특이적으로 결합하는 단일 가닥 가변 단편(scFv)의 정제방법에서, 상기 정치는 15~25시간, 바람직하게는 20~25시간 동안 수행할 수 있다.

본 발명은 상기와 같은 목적을 달성하기 위한 제5 구현 예로, 상기 제4 구현예의 방법에 의해 정제된 HER2에 특이적으로 결합하는 단일 가닥 가변 단편(scFv)을 포함하는 암 예방 또는 치료용 약학 조성물을 제공한다.

본 발명의 상기 약학 조성물에서, 상기 암은 유방암, 난소암, 위암, 직장암, 췌장암 및 자궁내막암으로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.

본 발명의 일 예에 따른 방법을 이용하면 가용성 단일 가닥 가변 단편(scFv)을 대장균에서 손쉽게 대량으로 생산할 수 있으며, 생산된 단일 가닥 가변 단편은 항체의 고유한 능력을 유지하므로 항암제 등 치료제로 유용하게 사용될 수 있다.

도 1은 본 발명의 일 예에 따른 MBP-spacer-TEVsite-scFv 재조합체의 모식도를 나타낸 것이다.
도 2는 본 발명의 일 예에 따른 MBP-spacer-TEVsite-scFv 재조합체발현 벡터의 구조를 개략적으로 나타낸 것이다.
도 3은 대장균에서 시간 의존적으로 세포외 방출되는 MBP-spacer-TEVsite-scFv 재조합체를 SDS-PAGE로 확인한 결과이다.
도 4a 및 도 4b는 대장균에서 최적의 조건으로 72시간 발현 후 MBP Column과 크기 배제 크로마토그래피를 이용하여 정제한 MBP-spacer-TEVsite-scFv 재조합체를 SDS-PAGE로 확인한 결과이다.
도 5는 MBP-spacer-TEVsite-scFv 재조합체와 TEV 단백질분해효소를 반응시킨 후 SDS-PAGE로 확인한 결과이다.
도 6a 및 도 6b는 정제한 scFV를 SDS-PAGE와 웨스턴 블랏을 통하여 확인한 결과이다.
도 7은 최종 정제된 scFv의 크기를 크기 배제 크로마토그래피를 통하여 확인한 결과이다.
도 8a는 HER2 단백질을 정제한 scFv 또는 허셉틴과 반응시킨 후 결합 정도를 ELISA로 확인한 결과이고, 도 8b는 SPR 분석으로 확인한 결과이다.

본 발명자들은 불용성으로 발현되는 scFv를 대장균을 이용하여 가용성(Soluble) 형태로 세포 외 방출로 제조하고자 노력하였다. 그 결과, 생물학적 활성이 높은 가용성 scFv를 대장균에서 값싸고 빠르게 생산할 수 있는 신규한 단일 가닥 가변 단편 플랫폼을 개발하였다. 그에 대한 실시예로 해당 플랫폼을 이용하여 HER2와 결합 친화도가 우수한 트라스트주맙 scFv를 생산하였다.

구체적으로 본 발명의 플랫폼은 MBP-spacer-TEVsite-V_L-Linker-V_H 형태를 가진다. 말토오스-결합 단백질(Maltose-binding protein, MBP)은 대장균에서 malE gene에 의해 코딩되는 단백질로서, 대장균 내 말토덱스트린(maltodextrin)의 이화작용(catabolism) 및 흡수에 관계된 단백질 중 하나이다. 대략 40 kDa의 단량체(monomer) 단백질인 MBP는 대장균을 이용한 재조합 단백질의 생산에 있어 융합 파트너(Fusion partner)로 사용되고 있다.

TEV site(Glu-Asn-Leu-Tyr-Phe-Gln-Gly)는 담배 식각 바이러스 단백질분해효소(Tobacco Etch Virus Protease, TEV Protease)에 의해 인식되는 서열로 TEV 단백질분해효소는 상기 아미노산 서열을 인식하여 절단한다.

따라서, 본 발명의 플랫폼으로 scFv를 융합 단백질 형태로 생산한 후 TEV단백질분해효소와 반응시키면 scFV만을 분리 및 정제할 수 있다.

이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 바람직한 실시예를 제시한다. 그러나 하기의 실시예는 본 발명을 보다 쉽게 이해하기 위하여 제공되는 것일 뿐, 하기 실시예에 의해 본 발명의 내용이 한정되는 것은 아니다.

제조예 1: Mv(MBP-spacer-TEVsite-scFv) 재조합 벡터 제작

항체의 일종인 단일 가닥 가변 단편(scFv)을 생산하기 위해 먼저 다음과 같이 재조합 벡터를 제작하였다.

먼저, 트라스트주맙(Trastuzumab) 아미노산 서열(서열번호 7 및 8)을 이용하여 scFv (VL-Linker-VH) 아미노산 서열을 코딩하는 핵산 서열 (서열번호 9 및 10)을 대장균 발현에 적합한 코돈으로 최적하고, VL과 VH를 연결하기 위한 연결자(Linker) 서열을 새롭게 설계하였다.

이후 클로닝을 위해 [TEVsite-VL-Linker-VH-Stop Codon(TAA)] 서열 (서열번호 11)을 부가하고, 바이노니아에 의뢰하여 전체 핵산 서열 (서열번호 12)을 합성하여 TEVsite 앞과 stop codon 뒤에 각각 제한효소 XhoI(CTCGAG)과 BamHI(GGATCC) 자리가 포함되도록 프라이머를 합성하여 PCR 증폭하였다.

다음으로 MBP (maltose-binding protein, MBP) 유전자가 삽입되어 있는 발현용 벡터인 pRK793(Addgene; Plasmid #8827)를 주형으로 바이오니아에서 합성한 프라이머를 이용하여 NdeI (CATATG)-MBP-spacer-XhoI (CTCGAG) 서열의 핵산 서열(서열번호 13 및 14)을 PCR 하였다.

발현용 벡터인 pColdI(Takara; Plasmid #3361)의 제한효소 자리 NdeI 및 XhoI에 [(XhoI (CTCGAG)-TEVsite-VL-Linker-VH-Stop Codon(TAA)-BamHI (GGATCC))] 서열의 핵산 서열을 서브클로닝하고 제한효소자리 XhoI 및 BamHI에 NdeI (CATATG)-MBP-spacer-XhoI (CTCGAG) 서열의 핵산 서열을 서브클로닝하여 pColdI 기반의 TEE-6His-FactorXasite-MBP-spacer-TEVsite-scFv 재조합체(서열번호 13 및 14)발현용 벡터를 제작하였다. 이하에서, TEE-6His-FactorXasite-MBP-spacer-TEVsite-scFv 재조합체를 Mv 재조합체로 기재한다.

도 1 및 도 2에 본 발명의 일 예에 따른 MBP-spacer-TEVsite-scFv 재조합체의 모식도를 나타내었다.

실험예 1:Mv 재조합체 발현

제조예 1에서 제작한 Mv 재조합체 발현용 벡터의 발현 여부를 확인하기 위해 다음과 같이 실험하였다.

대장균 BL21(DE3) 세포에 42℃ 열충격을 가하여 Mv 재조합체를 형질전환 시키고, LB 고체 배지 (암피실린 100 ug/ml 포함)에 도말하여 14시간 동안 배양하였다. 1개 콜로니(single colony)를 암피실린이 들어 있는 LB 배지에 접종하여 37 ℃에서 진탕 배양기를 이용하여 150 rpm에서 밤새 배양하였다.

이후 새로운 암피실린이 들어있는 1L TB 배지(Gellix)에 대략 0.5 ~ 2 %의 세포 배양 배지를 접종하여 150 rpm, 5시간 진탕 배양 후 OD₆₀₀ 값이 0.7~1 사이에 도달했을 때 0.2 mM IPTG, 0.5 % Triton X-100 그리고 0.05 % Tween20를 처리하여 15 ℃, 150 rpm에서 72시간 추가 배양하였다. 시간에 따라 Mv가 세포 외 분비되는 것을 SDS-PAGE로 확인하였다.

도 3에 상기 SDS-PAGE 결과를 도시하였다. 발현 유도 시 시간에 따라 배지에서 Mv의 양이 증가하는 것을 확인할 수 있다.

배양이 종료된 후 배양액은 4 ℃, 10000 rpm으로 1시간 원심 분리하여 상등액(supernatant)을 얻었다. 회수한 상등액을 0.2 um 필터로 필터링한 후 MBP affinity chromatography, Size exclusion chromatography로 정제하였다. MBP affinity chromatography을 이용하여 정제 할 때에 A buffer는 0.01% Tween20이 혼합된 PBS가 사용되었고 B buffer는 0.01% Tween20, 10mM Maltose가 혼합된 PBS가 사용되었다. Size exclusion chromatography를 이용하여 정제 할 때에 buffer는 0.01% Tween20이 혼합된 PBS가 사용 되었다.

도 4a 및 도 4b에 상기 SDS-PAGE 결과를 도시하였다. MBP affinity chromatography, Size exclusion chromatography를 이용하여 두차례 정제를 진행하면 순도 높은 Mv를 얻을 수 있었다.

실험예 2: scFv 정제

실험예 1에서 생산한 Mv(MBP-spacer-TEVsite-scFv) 재조합체를 TEV 단백질분해효소와 1:1 분자 비율로 혼합하고, 22 ℃ 항온수조에서 20시간 동안 반응시켰다. 2시간, 16시간 그리고 20시간이 지났을 때 샘플의 일부를 회수하여 SDS-PAGE로 확인하였다.

그 결과, 도 5에 나타난 바와 같이 Mv 재조합체와 TEV 단백질분해효소를 반응시킨지 20시간이 경과 하였을 때 Mv 재조합체가 모두 MBP와 scFv로 절단되었다.

Mv 재조합체와 TEV 단백질분해효소를 반응시킨 샘플의 반응 결과물을 Ni²⁺ affinity chromatography를 이용하여 정제하였다. Nickel이 충진된 Ni²⁺ affinity chromatography에 A완충액(PBS, 0.01% Tween20)으로 컬럼을 씻어준 후 Mv 재조합체와 TEV 단백질분해효소를 반응시킨 샘플의 반응 결과물을 흘려 레진에 흡착시켰다. A완충액(PBS, 0.01% Tween20)으로 비특이적 결합물을 제거하고, B완충액(PBS, 0.01% Tween20, 500mM Imidazol)을 이용하여 이미다졸 농도 별로 용출시켜 주었다. 이 때 FPLC는 (Target B: 100 %, Flow rate: 3 ml, Elution volume: 150 ml, Fraction size: 3ml)조건으로 진행되었다. 용출액은 SDS-PAGE로 확인하였다.

확인 결과, 도 6a에서 나타난 바와 같이 용출액에서 scFv 밴드를 확인할 수 있었으며, 다른 단백질과 분리해 낼 수 있었다.

정제한 scFv에 대해 HRP-ProteinL(genescript, M00098)을 항체로 사용하여 웨스턴 블랏을 수행하였다. 그 결과, 도 6b에 나타낸 바와 같이 scFv를 확인하였다. (lane M: 분자 크기 마커, lane 1: 발현 전, lane 2: 발현 후 대장균 펠렛, lane 3: 발현 후 배지, lane 4: 정제 후 Mv, lane 5: TEV 단백질분해효소 반응 후 Mv, lane 6: scFv, lane 7: MBP, lane 8: TEV 단백질분해효소)

scFv의 순도를 높이고, 크기를 확인하기 위하여 Superdex75과 Superdex200 column을 이용하여 Size exclusion chromatography를 진행하였다. 이 때 FPLC는 완충액(PBS, 0.01% Tween20)으로 (Flow rate: 1ml, Elution volume: 120ml, Fraction size: 3ml)조건 하에 진행되었다. 용출액은 SDS-PAGE로 확인하였으며, 분자 크기 마커로 사용되는 단백질을 이용하여 만들어진 표준곡선을 이용하여 측정되었다.

그 결과, 도 7에 나타난 바와 같이 Superdex75(파랑선), Superdex200(빨간선) column에서 각각 66분, 85분에 최대 용출되는 것을 확인할 수 있으며, 표준곡선을 이용하여 크기를 측정하였을 때 약 30 kDa으로 측정되었다.

실험예 3: 정제한 scFv의 결합 친화도 분석

3-1. ELISA

HER2 단백질 (Human Epidermal growth factor receptor2; Acro biosystem, HE2-H5225)을 코팅 완충액(15 mM Na₂CO₃, 35 mM NaHCO₃, pH 9.6)에 50 ng/ml 농도로 희석하고, 96 웰(well) ELISA 플레이트의 각 웰에 100 ul씩 분주하여 4℃에서 밤새 흡착시켰다. 다음날 TBS-T(TBS, 0.05% Tween20) 완충액으로 각 웰을 4회씩 세척하여 흡착되지 않은 HER2 단백질을 제거하였다.

각 웰에 2% BSA(TBS-T, 2% Bovine Serum Albumin)를 300 ul씩 분주하여 실온에서 1시간 동안 블록킹한 후 블로킹 용액을 제거하였다. 이 후 TBS-T(TBS, 0.05% Tween20) 완충액으로 4회 세척하였다.

허셉틴(Herceptin)과 scFv를 최소 0 nM부터 최대 60 nM의 농도로 각각의 웰에 100 ul씩 추가하여 실온에서 1시간 동안 반응시키고, TBS-T(TBS, 0.05% Tween20) 완충액으로 4회 세척하였다. TBS-T에 1:10000으로 희석된 HRP-ProteinL(genescript, M00098)를 각각의 웰에 100 ul씩 추가하여 실온에서 1시간 동안 반응시키고, TBS-T(TBS, 0.05% Tween20) 완충액으로 4회 세척하였다.

TMB 기질을 각각의 웰에 200 ul씩 추가하고, 상온에서 20분동안 반응시켜 발색 반응을 유도하였다. 1M H₂SO₄를 각 웰에 50 ul씩 첨가하여 반응을 정지시키고, 450 nm에서 흡광도를 측정하였다. 각 실험은 3배수로 실험하고, 각 농도에서의 측정값과 표준편차를 Prism8 프로그램을 이용하여 도표화하였다.

실험 결과, 도 8a에 나타낸 바와 같이 정제된 scFv가 항원 HER2에 대하여 허셉틴의 결합 친화도보다는 약하지만, 우수한 결합 친화도를 보이는 것을 확인하였다. 허셉틴, 정제된 scFv와 MV의 Kd 값은 각각 0.08 nM, 0.4 nM 그리고 8.9 nM로 나타났다.

3-2. 표면 플라즈몬 공명 분석(Surface plasmon resonance analysis)

Reichert SR7500DC instrument system(Reichert)를 이용하여 양성 대조군으로 허셉틴, 음성 대조군으로 MBP 그리고 최종 정제된 scFv의 결합력을 측정하였다. HBS-EP(0.01 M HEPES pH 7.4, 0.15 M NaCl, 3 mM EDTA, 0.005% v/v Surfactant P20)완충액을 Running flow 완충액으로써 30 ul/min의 유속으로 흘려주었다.

0.04 M N-ethyl-N’-(3-dimethylaminopropyl) carbodiimide(EDC) 그리고 0.001 M sulfo-N-hydroxysuccinimide를 20 ul/min의 유속으로 흘려 PEG chip을 활성화 시켰다. 이 후 20 mM Acetate 완충액(pH 6.0)으로 희석된 HER2를 흘려 코팅하였다.

HER2의 고정화 수준이 264 response unit(RU)일 때, 1 M ethanolamine-HCL(pH 8.5)용액으로 PEG chip을 비활성화시킨다. 50 nM에서 연속적으로 2 배 희석된 단백질 샘플을 칩에 주입하고 Regeneration 용액으로 20 mM NaOH를 사용하였다. Association과 subsequent dissociation 시간은 각각 3분과 20분이었다. 해리상수 Kd를 산출하기 위해 Scrubber 2 프로그램을 사용하여 SPR 데이터를 1대 1 결합 모델로 분석하였다.

실험 결과, 도 8b에 나타낸 바와 같이 정제된 scFv가 항원 HER2에 대하여 우수한 결합 친화도를 보이는 것을 확인하였다. 허셉틴, 정제된 scFv의 Kd 값은 약 0.2 nM로 나타났다.

이상에서 언급된 서열목록은 하기 표 1 내지 표 5와 같다.

Mv	서열	서열번호
scFv-V_L (아미노산)	DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQDVNTAVAWYQQKPGKAPKLLIYSASFLYSGVPSRFSGSRSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQHYTTPPTFGQGTKVEIKR	1
scFv-linker (아미노산)	SGGGSGGGSGGGS	2
scFv-V_H (아미노산)	EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFNIKDTYIHWVRQAPGKGLEWVARIYPTNGYTRYADSVKGRFTISADTSKNTAYLQMNSLRAEDTAVYYCSRWGGDGFYAMDYWGQGTLVTVSSAS	3
TEV site (아미노산)	ENLYFQG	4
Spacer (아미노산)	NSSSNNNNNNNNNNLG	5
MBP-spacer-TEV site-scFv (V_L-linker-V_H) (아미노산)	MKTEEGKLVIWINGDKGYNGLAEVGKKFEKDTGIKVTVEHPDKLEEKFPQVAATGDGPDIIFWAHDRFGGYAQSGLLAEITPDKAFQDKLYPFTWDAVRYNGKLIAYPIAVEALSLIYNKDLLPNPPKTWEEIPALDKELKAKGKSALMFNLQEPYFTWPLIAADGGYAFKYENGKYDIKDVGVDNAGAKAGLTFLVDLIKNKHMNADTDYSIAEAAFNKGETAMTINGPWAWSNIDTSKVNYGVTVLPTFKGQPSKPFVGVLSAGINAASPNKELAKEFLENYLLTDEGLEAVNKDKPLGAVALKSYEEELAKDPRIAATMENAQKGEIMPNIPQMSAFWYAVRTAVINAASGRQTVDEALKDAQTNSSSNNNNNNNNNNLGLEENLYFQGDIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQDVNTAVAWYQQKPGKAPKLLIYSASFLYSGVPSRFSGSRSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQHYTTPPTFGQGTKVEIKRSGGGSGGGSGGGSEVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFNIKDTYIHWVRQAPGKGLEWVARIYPTNGYTRYADSVKGRFTISADTSKNTAYLQMNSLRAEDTAVYYCSRWGGDGFYAMDYWGQGTLVTVSSAS	6

Transtuzumab	서열	서열번호
Anti-HER2 Light chain (아미노산)	DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQDVNTAVAWYQQKPGKAPKLLIYSASFLYSGVPSRFSGSRSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQHYTTPPTFGQGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC	7
Anti-HER2 Heavy chain (아미노산)	EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFNIKDTYIHWVRQAPGKGLEWVARIYPTNGYTRYADSVKGRFTISADTSKNTAYLQMNSLRAEDTAVYYCSRWGGDGFYAMDYWGQGTLVTVSS ASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK	8
Anti-HER2 Light chain (염기)	GATATTCAGATGACCCAGAGCCCGAGCAGCCTGAGCGCGAGCGTGGGCGATCGCGTGACCATTACCTGCCGCGCGAGCCAGGATGTGAACACCGCGGTGGCGTGGTATCAGCAGAAACCGGGCAAAGCGCCGAAACTGCTGATTTATAGCGCGAGCTTTCTGTATAGCGGCGTGCCGAGCCGCTTTAGCGGCAGCCGCAGCGGCACCGATTTTACCCTGACCATTAGCAGCCTGCAGCCGGAAGATTTTGCGACCTATTATTGCCAGCAGCATTATACCACCCCGCCGACCCTTGGCCAGGGCACCAAAGTGGAAATTAAACGCACCGTGGCGGCGCCGAGCGTGTTTATTTTTCCGCCGAGCGATGAACAGCTGAAAAGCGGCACCGCGAGCGTGGTGTGCCTGCTGAACAACTTTTATCCGCGCGAAGCGAAAGTGCAGTGGAAAGTGGATAACGCGCTGCAGAGCGGCAACAGCCAGGAAAGCGTGACCGAACAGGATAGCAAAGATAGCACCTATAGCCTGAGCAGCACCCTGACCCTGAGCAAAGCGGATTATGAAAAACATAAAGTGTATGCGTGCGAAGTGACCCATCAGGGCCTGAGCAGCCCGGTGACCAAAAGCTTTAACCGCGGCGAATGC	9
Anti-HER2 Heavy chain (염기)	GAAGTTCAGCTGGTTGAATCTGGCGGCGGTCTGGTTCAACCGGGCGGTTCCCTGCGCCTGTCTTGCGCAGCGTCAGGCTTTAACATCAAAGATACCTACATCCACTGGGTTCGCCAGGCGCCGGGTAAAGGTCTGGAATGGGTGGCTCGCATCTACCCGACCAACGGCTATACCCGTTATGCTGACAGCGTTAAAGGCCGCTTCACCATTAGCGCGGATACCAGTAAAAATACGGCATACCTGCAAATGAACTCGTTACGCGCGGAAGACACCGCGGTGTACTACTGCTCCCGCTGGGGCGGGGATGGCTTCTACGCAATGGATTACTGGGGTCAGGGCACGCTGGTCACAGTCTCCAGCGCCTCGACAAAAGGCCCGAGCGTGTTCCCGCTGGCGCCTTCCAGCAAAAGCACCTCAGGGGGCACAGCTGCGCTGGGTTGCCTGGTGAAAGACTACTTCCCGGAACCGGTTACCGTTTCCTGGAACAGCGGTGCTCTGACCAGCGGCGTTCACACCTTCCCGGCTGTTCTGCAAAGTTCCGGCCTGTACTCTCTGAGCTCTGTGGTGACCGTGCCGTCTTCTTCTCTGGGGACCCAGACTTACATTTGCAACGTGAACCACAAACCGTCAAACACCAAAGTTGATAAAAAAGTGGAGCCGCCGAAAAGCTGCGATAAAACCCATACCTGCCCGCCGTGCCCGGGCCGGAACTGCTGGGCGGCCCGAGCGTGTTTCTGTTTCCGCCGAAACCGAAAGATACCCTGATGATTAGCCGCACCCCGGAAGTGACCTGCGTGGTGGTGGATGTGAGCCATGAAGATCCGGAAGTGAAATTTAACTGGTATGTGGATGGCGTGGAAGTGCATAACGCGAAAACCAAACCGCGCGAAGAACAGTATAACAGCACCTATCGCGTGGTGAGCGTGCTGACCGTGCTGCATCAGGATTGGCTGAACGGCAAAGAATATAAATGCAAAGTGAGCAACAAAGCGCTGCCGGCGCCGATTGAAAAAACCATTAGCAAAGCGAAAGGCCAGCCGCGCGAACCGCAGGTGTATACCCTGCCGCCGAGCCGCGATGAACTGACCAAAAACCAGGTGAGCCTGACCTGCCTGGTGAAAGGCTTTTATCCGAGCGATATTGCGGTGGAATGGGAAAGCAACGGCCAGCCGGAAAACAACTATAAAACCACCCCGCCGGTGCTGGATAGCGATGGCAGCTTTTTTCTGTATAGCAAACTGACCGTGGATAAAAGCCGCTGGCAGCAGGGCAACGTGTTTAGCTGCAGCGTGATGCATGAAGCGCTGCATAACCATTATACCCAGAAAAGCCTGAGCCTGAGCCCGGGCAAA	10

t-scFv	서열	서열번호
t-scFv (아미노산)	ENLYFQGDIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQDVNTAVAWYQQKPGKAPKLLIYSASFLYSGVPSRFSGSRSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQHYTTPPTFGQGTKVEIKRSGGGSGGGSGGGSEVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFNIKDTYIHWVRQAPGKGLEWVARIYPTNGYTRYADSVKGRFTISADTSKNTAYLQMNSLRAEDTAVYYCSRWGGDGFYAMDYWGQGTLVTVSSAS	11
t-scFv (염기)	GAAAATCTTTATTTCCAGGGTGATATTCAGATGACGCAGAGCCCGTCGAGCCTCAGTGCATCAGTTGGTGATAGGGTTACCATAACCTGTCGTGCAAGTCAAGACGTTAATACAGCAGTAGCTTGGTATCAGCAGAAACCTGGTAAAGCACCGAAATTACTGATCTACTCCGCTTCTTTTTTGTATAGCGGCGTTCCCAGCCGTTTTTCAGGTTCAAGATCAGGTACAGATTTTACCCTGACAATCTCGTCATTACAGCCAGAAGACTTTGCAACGTACTACTGCCAGCAGCATTATACAACCCCACCTACGTTTGGTCAGGGAACTAAAGTTGAAATAAAACGGAGCGGTGGTGGTAGTGGAGGGGGTTCTGGCGGTGGAAGCGAGGTTCAATTGGTTGAGAGCGGTGGAGGTCTGGTTCAACCGGGTGGTTCTCTGCGGCTGAGCTGCGCAGCATCTGGATTCAATATTAAGGACACGTACATTCATTGGGTTAGACAGGCACCGGGTAAAGGTCTTGAATGGGTTGCTCGTATTTACCCGACTAACGGTTATACCCGTTATGCAGATAGTGTAAAGGGTCGTTTCACAATTAGCGCAGATACAAGCAAAAATACGGCATATCTGCAAATGAATAGCCTGCGTGCCGAGGATACCGCTGTTTATTATTGTTCTCGCTGGGGTGGCGACGGCTTCTATGCAATGGATTACTGGGGTCAAGGAACCTTAGTTACAGTTTCTAGCGCCTCC	12

	서열	서열번호
NdeI-MBP-spacer-XhoI (아미노산)	HMKTEEGKLVIWINGDKGYNGLAEVGKKFEKDTGIKVTVEHPDKLEEKFPQVAATGDGPDIIFWAHDRFGGYAQSGLLAEITPDKAFQDKLYPFTWDAVRYNGKLIAYPIAVEALSLIYNKDLLPNPPKTWEEIPALDKELKAKGKSALMFNLQEPYFTWPLIAADGGYAFKYENGKYDIKDVGVDNAGAKAGLTFLVDLIKNKHMNADTDYSIAEAAFNKGETAMTINGPWAWSNIDTSKVNYGVTVLPTFKGQPSKPFVGVLSAGINAASPNKELAKEFLENYLLTDEGLEAVNKDKPLGAVALKSYEEELAKDPRIAATMENAQKGEIMPNIPQMSAFWYAVRTAVINAASGRQTVDEALKDAQTNSSSNNNNNNNNNNLGLE	13
NdeI-MBP-spacer-XhoI (염기)	CATATGAAAACTGAAGAAGGTAAACTGGTAATCTGGATTAACGGCGATAAAGGCTATAACGGTCTCGCTGAAGTCGGTAAGAAATTCGAGAAAGATACCGGAATTAAAGTCACCGTTGAGCATCCGGATAAACTGGAAGAGAAATTCCCACAGGTTGCGGCAACTGGCGATGGCCCTGACATTATCTTCTGGGCACACGACCGCTTTGGTGGCTACGCTCAATCTGGCCTGTTGGCTGAAATCACCCCGGACAAAGCGTTCCAGGACAAGCTGTATCCGTTTACCTGGGATGCCGTACGTTACAACGGCAAGCTGATTGCTTACCCGATCGCTGTTGAAGCGTTATCGCTGATTTATAACAAAGATCTGCTGCCGAACCCGCCAAAAACCTGGGAAGAGATCCCGGCGCTGGATAAAGAACTGAAAGCGAAAGGTAAGAGCGCGCTGATGTTCAACCTGCAAGAACCGTACTTCACCTGGCCGCTGATTGCTGCTGACGGGGGTTATGCGTTCAAGTATGAAAACGGCAAGTACGACATTAAAGACGTGGGCGTGGATAACGCTGGCGCGAAAGCGGGTCTGACCTTCCTGGTTGACCTGATTAAAAACAAACACATGAATGCAGACACCGATTACTCCATCGCAGAAGCTGCCTTTAATAAAGGCGAAACAGCGATGACCATCAACGGCCCGTGGGCATGGTCCAACATCGACACCAGCAAAGTGAATTATGGTGTAACGGTACTGCCGACCTTCAAGGGTCAACCATCCAAACCGTTCGTTGGCGTGCTGAGCGCAGGTATTAACGCCGCCAGTCCGAACAAAGAGCTGGCAAAAGAGTTCCTCGAAAACTATCTGCTGACTGATGAAGGTCTGGAAGCGGTTAATAAAGACAAACCGCTGGGTGCCGTAGCGCTGAAGTCTTACGAGGAAGAGTTGGCGAAAGATCCACGTATTGCCGCCACCATGGAAAACGCCCAGAAAGGTGAAATCATGCCGAACATCCCGCAGATGTCCGCTTTCTGGTATGCCGTGCGTACTGCGGTGATCAACGCCGCCAGCGGTCGTCAGACTGTCGATGAAGCCCTGAAAGACGCGCAGACTAATTCGAGCTCGAACAACAACAACAATAACAATAACAACAACCTCGGGCTCGAG	14

	서열	서열번호
TEE-6His-factorXa site-MBP-spacer-TEVsite -scFv (아미노산)	MNHKVHHHHHHIEGRHMKTEEGKLVIWINGDKGYNGLAEVGKKFEKDTGIKVTVEHPDKLEEKFPQVAATGDGPDIIFWAHDRFGGYAQSGLLAEITPDKAFQDKLYPFTWDAVRYNGKLIAYPIAVEALSLIYNKDLLPNPPKTWEEIPALDKELKAKGKSALMFNLQEPYFTWPLIAADGGYAFKYENGKYDIKDVGVDNAGAKAGLTFLVDLIKNKHMNADTDYSIAEAAFNKGETAMTINGPWAWSNIDTSKVNYGVTVLPTFKGQPSKPFVGVLSAGINAASPNKELAKEFLENYLLTDEGLEAVNKDKPLGAVALKSYEEELAKDPRIAATMENAQKGEIMPNIPQMSAFWYAVRTAVINAASGRQTVDEALKDAQTNSSSNNNNNNNNNNLGLEENLYFQGDIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQDVNTAVAWYQQKPGKAPKLLIYSASFLYSGVPSRFSGSRSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQHYTTPPTFGQGTKVEIKRSGGGSGGGSGGGSEVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFNIKDTYIHWVRQAPGKGLEWVARIYPTNGYTRYADSVKGRFTISADTSKNTAYLQMNSLRAEDTAVYYCSRWGGDGFYAMDYWGQGTLVTVSSAS	15
TEE-6His-factorXa site-MBP-spacer-TEVsite -scFv (염기)	ATGAATCACAAAGTGCATCATCATCATCATCATATCGAAGGTAGGCATATGAAAACTGAAGAAGGTAAACTGGTAATCTGGATTAACGGCGATAAAGGCTATAACGGTCTCGCTGAAGTCGGTAAGAAATTCGAGAAAGATACCGGAATTAAAGTCACCGTTGAGCATCCGGATAAACTGGAAGAGAAATTCCCACAGGTTGCGGCAACTGGCGATGGCCCTGACATTATCTTCTGGGCACACGACCGCTTTGGTGGCTACGCTCAATCTGGCCTGTTGGCTGAAATCACCCCGGACAAAGCGTTCCAGGACAAGCTGTATCCGTTTACCTGGGATGCCGTACGTTACAACGGCAAGCTGATTGCTTACCCGATCGCTGTTGAAGCGTTATCGCTGATTTATAACAAAGATCTGCTGCCGAACCCGCCAAAAACCTGGGAAGAGATCCCGGCGCTGGATAAAGAACTGAAAGCGAAAGGTAAGAGCGCGCTGATGTTCAACCTGCAAGAACCGTACTTCACCTGGCCGCTGATTGCTGCTGACGGGGGTTATGCGTTCAAGTATGAAAACGGCAAGTACGACATTAAAGACGTGGGCGTGGATAACGCTGGCGCGAAAGCGGGTCTGACCTTCCTGGTTGACCTGATTAAAAACAAACACATGAATGCAGACACCGATTACTCCATCGCAGAAGCTGCCTTTAATAAAGGCGAAACAGCGATGACCATCAACGGCCCGTGGGCATGGTCCAACATCGACACCAGCAAAGTGAATTATGGTGTAACGGTACTGCCGACCTTCAAGGGTCAACCATCCAAACCGTTCGTTGGCGTGCTGAGCGCAGGTATTAACGCCGCCAGTCCGAACAAAGAGCTGGCAAAAGAGTTCCTCGAAAACTATCTGCTGACTGATGAAGGTCTGGAAGCGGTTAATAAAGACAAACCGCTGGGTGCCGTAGCGCTGAAGTCTTACGAGGAAGAGTTGGCGAAAGATCCACGTATTGCCGCCACCATGGAAAACGCCCAGAAAGGTGAAATCATGCCGAACATCCCGCAGATGTCCGCTTTCTGGTATGCCGTGCGTACTGCGGTGATCAACGCCGCCAGCGGTCGTCAGACTGTCGATGAAGCCCTGAAAGACGCGCAGACTAATTCGAGCTCGAACAACAACAACAATAACAATAACAACAACCTCGGGCTCGAGGAAAATCTTTATTTCCAGGGTGATATTCAGATGACGCAGAGCCCGTCGAGCCTCAGTGCATCAGTTGGTGATAGGGTTACCATAACCTGTCGTGCAAGTCAAGACGTTAATACAGC AGTAGCTTGGTATCAGCAGAAACCTGGTAAAGCACCGAAATTACTGATCTACTCCGCTTCTTTTTTGTATAGCGGCGTTCCCAGCCGTTTTTCAGGTTCAAGATCAGGTACAGATTTTACCCTGACAATCTCGTCATTACAGCCAGAAGACTTTGCAACGTACTACTGCCAGCAGCATTATACAACCCCACCTACGTTTGGTCAGGGAACTAAAGTTGAAATAAAACGGAGCGGTGGTGGTAGTGGAGGGGGTTCTGGCGGTGGAAGCGAGGTTCAATTGGTTGAGAGCGGTGGAGGTCTGGTTCAACCGGGTGGTTCTCTGCGGCTGAGCTGCGCAGCATCTGGATTCAATATTAAGGACACGTACATTCATTGGGTTAGACAGGCACCGGGTAAAGGTCTTGAATGGGTTGCTCGTATTTACCCGACTAACGGTTATACCCGTTATGCAGATAGTGTAAAGGGTCGTTTCACAATTAGCGCAGATACAAGCAAAAATACGGCATATCTGCAAATGAATAGCCTGCGTGCCGAGGATACCGCTGTTTATTATTGTTCTCGCTGGGGTGGCGACGGCTTCTATGCAATGGATTACTGGGGTCAAGGAACCTTAGTTACAGTTTCTAGCGCCTCCTAA	16

<110> Konkuk University Glocal Industry-Academic Collaboration Foundation <120> Novel anti-HER2 single chain variable fragment platform <130> P210508P <150> KR 10-2021-0022011 <151> 2021-02-18 <160> 16 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 108 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> scFv-VL <400> 1 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asp Val Asn Thr Ala 20 25 30 Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Ser Ala Ser Phe Leu Tyr Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Arg Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80 Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln His Tyr Thr Thr Pro Pro 85 90 95 Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg 100 105 <210> 2 <211> 13 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> scFv-linker <400> 2 Ser Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser 1 5 10 <210> 3 <211> 122 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> scFv-VH <400> 3 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Asn Ile Lys Asp Thr 20 25 30 Tyr Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ala Arg Ile Tyr Pro Thr Asn Gly Tyr Thr Arg Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Ala Asp Thr Ser Lys Asn Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ser Arg Trp Gly Gly Asp Gly Phe Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln 100 105 110 Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser 115 120 <210> 4 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> TEV site <400> 4 Glu Asn Leu Tyr Phe Gln Gly 1 5 <210> 5 <211> 16 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Spacer <400> 5 Asn Ser Ser Ser Asn Asn Asn Asn Asn Asn Asn Asn Asn Asn Leu Gly 1 5 10 15 <210> 6 <211> 635 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> MBP-spacer-TEV site-scFv (VL-linker-VH) <400> 6 Met Lys Thr Glu Glu Gly 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Lys Gly Glu Thr Ala 210 215 220 Met Thr Ile Asn Gly Pro Trp Ala Trp Ser Asn Ile Asp Thr Ser Lys 225 230 235 240 Val Asn Tyr Gly Val Thr Val Leu Pro Thr Phe Lys Gly Gln Pro Ser 245 250 255 Lys Pro Phe Val Gly Val Leu Ser Ala Gly Ile Asn Ala Ala Ser Pro 260 265 270 Asn Lys Glu Leu Ala Lys Glu Phe Leu Glu Asn Tyr Leu Leu Thr Asp 275 280 285 Glu Gly Leu Glu Ala Val Asn Lys Asp Lys Pro Leu Gly Ala Val Ala 290 295 300 Leu Lys Ser Tyr Glu Glu Glu Leu Ala Lys Asp Pro Arg Ile Ala Ala 305 310 315 320 Thr Met Glu Asn Ala Gln Lys Gly Glu Ile Met Pro Asn Ile Pro Gln 325 330 335 Met Ser Ala Phe Trp Tyr Ala Val Arg Thr Ala Val Ile Asn Ala Ala 340 345 350 Ser Gly Arg Gln Thr Val Asp Glu Ala Leu Lys Asp Ala Gln Thr Asn 355 360 365 Ser Ser Ser Asn Asn Asn Asn Asn Asn Asn Asn Asn Asn Leu Gly Leu 370 375 380 Glu Glu Asn Leu Tyr Phe Gln Gly Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro 385 390 395 400 Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg 405 410 415 Ala Ser Gln Asp Val Asn Thr Ala Val Ala Trp 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gatagtgtaa agggtcgttt cacaattagc 1800 gcagatacaa gcaaaaatac ggcatatctg caaatgaata gcctgcgtgc cgaggatacc 1860 gctgtttatt attgttctcg ctggggtggc gacggcttct atgcaatgga ttactggggt 1920 caaggaacct tagttacagt ttctagcgcc tcctaa 1956

Claims

5'에서 3' 방향으로 말토오스 결합 단백질(MBP), 공간자(spacer) 및 담배 식각 바이러스 부위(TEV site)를 코딩하는 서열번호 16의 염기서열; 및
HER2에 특이적으로 결합하는 단일 가닥 가변 단편(scFv)을 코딩하는 서열번호 12의 염기서열이 작동가능하게 연결된, 대장균에서 제조된 HER2에 특이적으로 결합하는 단일 가닥 가변 단편을 세포외로 방출시킬 수 있는 핵산분자 플랫폼.
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제1항의 핵산분자 플랫폼을 포함하는 재조합 발현 벡터.
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제6항의 재조합 발현 벡터를 대장균에 형질전환시키는 단계를 포함하는, 핵산분자 플랫폼의 생산방법.
제8항에 있어서,
(a) 상기 재조합 발현 벡터를 대장균에 형질전환시키는 단계;
(b) 상기 형질전환된 대장균을 배양한 후, 단일 콜로니를 암피실린이 포함된 배지에서 종자배양하는 단계;
(c) 상기 종자 배양물을 성장시킨 후 암피실린이 첨가된 배지에 옮겨 배양하는 단계;
(d) IPTG, Triton X-100 및 Tween 20을 첨가하여 과발현과 세포외 방출을 유도하는 단계; 및
(e) 배양 종료후, 원심분리하여 얻은 상등액을 여과한 다음, 크로마토그래피하여 정제하는 단계를 포함하는, 핵산분자 플랫폼의 생산방법.
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(a) 제8항의 방법에 의해 생산된 핵산분자 플랫폼을 담배 식각 바이러스 부위(TEV site) 단백질분해효소와 혼합하고, 반응시키는 단계; 및
(b) 상기 반응 종료후 정치시키는 단계를 포함하는, HER2에 특이적으로 결합하는 단일 가닥 가변 단편(scFv)의 정제방법.
제12항에 있어서,
상기 혼합은 상기 핵산분자 플랫폼을 상기 담배 식각 바이러스 부위(TEV site) 단백질분해효소와 0.1~10 : 0.1~10의 분자 비율로 혼합하는 것을 특징으로 하는, HER2에 특이적으로 결합하는 단일 가닥 가변 단편(scFv)의 정제방법.
제12항에 있어서,
상기 반응은 20~25℃에서 15~25시간 동안 수행하는 것을 특징으로 하는, HER2에 특이적으로 결합하는 단일 가닥 가변 단편(scFv)의 정제방법.
제12항에 있어서,
상기 정치는 15~25시간 동안 수행하는 것을 특징으로 하는, HER2에 특이적으로 결합하는 단일 가닥 가변 단편(scFv)의 정제방법.
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