KR102681006B1

KR102681006B1 - 뇌의 레닌-안지오텐신 시스템 인자를 이용한 알츠하이머병의 진단 방법

Info

Publication number: KR102681006B1
Application number: KR1020220013989A
Authority: KR
Inventors: 석경호; 김종헌
Original assignee: 경북대학교 산학협력단
Priority date: 2021-02-03
Filing date: 2022-02-03
Publication date: 2024-07-04
Anticipated expiration: 2042-02-03
Also published as: KR20220112204A

Abstract

본 발명은 뇌의 레닌-안지오텐신 시스템(renin-angiotensin system; RAS) 인자를 이용한 알츠하이머병의 진단 방법에 관한 것으로서, 보다 상세하게는 수용성 ANPEP 및 PRCP 발현수준을 측정하는 제제를 포함하는 알츠하이머병의 진단용 조성물, 진단용 키트 및 알츠하이머병의 진단에 필요한 정보를 제공하기 위하여 수용성 ANPEP 및 PRCP를 정성 또는 정량 분석하는 방법에 대한 것이다. 본 발명의 수용성 ANPEP 및 PRCP는 알츠하이머병 환자에서 정상군 대비 유의적으로 증가된 수준을 보일 뿐만 아니라, 특히 혈장과 같은 체액 시료를 통해서 측정 가능하므로 측정의 용이성이 크기 때문에 알츠하이머병 진단의 바이오마커로서 효용성이 우수하다.

Description

뇌의 레닌-안지오텐신 시스템 인자를 이용한 알츠하이머병의 진단 방법{Method for diagnosing Alzheimer’s disease using brain renin-angiotensin system (RAS) factors}

본 발명은 뇌의 레닌-안지오텐신 시스템(renin-angiotensin system; RAS) 인자를 이용한 알츠하이머병의 진단 방법에 관한 것이다.

인간의 평균 수명이 늘어나고 전 세계적으로 고령화 사회가 되어가면서 퇴행성 뇌질환의 치료법 및 진단 기술의 수요가 증가하고 있는 추세이다. 그러나 퇴행성 뇌질환에 있어서 현재까지 성공적인 치료제 개발은 희박한 상황이다. 특히, 퇴행성 뇌질환은 이의 조기진단이 이루어져 시기적절한 치료가 수행될 때 뇌질환 극복을 기대할 수 있기 때문에, 이의 조기 진단이 중요하다고 할 수 있다.

한편, 알츠하이머성 치매는 주로 65세 이상 노년층에서 점진적인 기억력 감소와 인지기능 손상으로 특징되는 병이다. 병리수준에서는 베타-아밀로이드 단백질 침전물과 신경섬유 타우 단백질의 엉킴현상이 대표적인 병인으로 인정받고있다. 세계 치매 유병률은 2010년 3,560만명에서 2050년 1억 1,540만명으로 매우 가파른 증가세를 나타내어 공공보건의 가장 치명적인 위협이 될 것으로 전망되며, 이러한 치매 중 알츠하이머성 치매가 가장 큰 비중을 차지한다. 현재까지 많은 연구를 통하여 발병기전의 연구와 치료제 개발에 많은 투자가 이루어졌음에도 불구하고, 아직까지도 알츠하이머병은 조기진단이 어려운 질환으로 확실한 조기 진단 바이오마커가 없는 실정이다. 바이오마커는 조기에 정확한 진단을 용이하게 하기 위하여 쉽게 측정되는 것이 좋으며, 특히 뇌 질환에 있어서 뇌 조직이나 신경조직을 침습적으로 채취하는데에는 상당한 위험성과 2차 합병증을 유발하는 등의 많은 어려움이 있는 것이 고려되어야한다. 또한 현재 뇌척수액에서 베타-아밀로이드 단백질의 농도 정량분석 및 뇌 영상의학검사가 치매(알츠하이머) 확진검사법으로 사용되고 있으나, 뇌척수액 검사 또한 침습적 검사법으로서 조기진단에는 부적절하며, 베타-아밀로이드 및 타우-단백질의 검출을 위한 양전자 단층촬영(PET) 검사도 고비용, 시·공간 제약의 한계가 존재한다.

미국등록특허 US 8257922 B2 (2012.09.04 등록)

본 발명의 목적은 수용성 아미노펩티데이즈 N/CD13(Soluble aminopeptidase N/CD13; ANPEP) 또는 프롤릴카르복시펩티데이즈(Prolylcarboxypeptidase; PRCP)의 발현수준을 측정할 수 있는 제제를 유효성분으로 포함하는 알츠하이머병 진단용 조성물 또는 이를 포함하는 알츠하이머병 진단용 키트를 제공하는데 있다.

또한, 본 발명의 다른 목적은 환자에서 분리된 시료로부터 ANPEP 또는 PRCP의 발현 수준을 측정하는 단계를 포함하는 알츠하이머병 진단에 필요한 정보를 제공하는 방법를 제공하는데 있다.

또한, 본 발명의 또 다른 목적은 ANPEP 또는 PRCP의 발현 수준 측정을 통한 알츠하이머병 치료제 스크리닝 방법을 제공하는데 있다.

상기 과제의 해결을 위하여, 본 발명은 수용성 아미노펩티데이즈 N/CD13(Soluble aminopeptidase N/CD13; ANPEP) 또는 프롤릴카르복시펩티데이즈(Prolylcarboxypeptidase; PRCP)의 발현수준을 측정할 수 있는 제제를 유효성분으로 포함하는 알츠하이머병 진단용 조성물을 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 조성물을 포함하는 알츠하이머병 진단용 키트를 제공한다.

또한, 본 발명은 (1) 환자에서 분리된 시료로부터 ANPEP 유전자의 mRNA 발현 수준 또는 ANPEP 단백질의 발현 수준을 측정하는 단계; (2) 상기 ANPEP 유전자의 mRNA 발현 수준 또는 ANPEP 단백질의 발현 수준을 대조군 시료와 비교하는 단계; 및 (3) 상기 ANPEP 유전자의 mRNA 발현 수준 또는 ANPEP 단백질의 발현 수준이 대조군 시료보다 높을 경우 알츠하이머병이라고 판단하는 단계를 포함하는 알츠하이머병 진단에 필요한 정보를 제공하는 방법을 제공한다.

또한, 본 발명은 (1) 환자에서 분리된 뇌척수액 시료로부터 PRCP 유전자의 mRNA 발현 수준 또는 PRCP 단백질의 발현 수준을 측정하는 단계; (2) 상기 PRCP 유전자의 mRNA 발현 수준 또는 PRCP 단백질의 발현 수준을 대조군 시료와 비교하는 단계; 및 (3) 상기 PRCP 유전자의 mRNA 발현 수준 또는 PRCP 단백질의 발현 수준이 대조군 시료보다 높을 경우 알츠하이머병이라고 판단하는 단계를 포함하는 알츠하이머병 진단에 필요한 정보를 제공하는 방법을 제공한다.

또한, 본 발명은 (1) 환자에서 분리된 혈액 시료로부터 PRCP 유전자의 mRNA 발현 수준 또는 PRCP 단백질의 발현 수준을 측정하는 단계; (2) 상기 PRCP 유전자의 mRNA 발현 수준 또는 PRCP 단백질의 발현 수준을 대조군 시료와 비교하는 단계; 및 (3) 상기 PRCP 유전자의 mRNA 발현 수준 또는 PRCP 단백질의 발현 수준이 대조군 시료보다 낮을 경우 알츠하이머병이라고 판단하는 단계를 포함하는 알츠하이머병 진단에 필요한 정보를 제공하는 방법을 제공한다.

또한, 본 발명은 (1) 염증 활성화된 인간성상교세포에 시험물질을 접촉시키는 단계; (2) 상기 시험물질을 접촉한 염증 활성화된 인간성상교세포에서 ANPEP 또는 PRCP의 발현 또는 활성 정도를 측정하는 단계; 및 (3) 대조군 시료와 비교하여 상기 ANPEP 또는 PRCP의 발현 또는 활성 정도가 감소한 시험물질을 선별하는 단계를 포함하는 알츠하이머병 치료제 스크리닝 방법을 제공한다.

도 1은 성상교세포에 뇌염증 자극을 준 뒤 분비 단백질에 대한 LC-MS/MS 분석 과정을 나타낸다. 성상교세포 염증 활성은 염증 촉진 사이토카인 (TNF-a, IL-1b, IFN-r)을 10ng/ml로 처리하여 유도하였고 24시간 후 배양을 수집하여 LC-MS/MS 분석을 진행하였다.
도 2는 성상교세포에 뇌염증 자극을 준 뒤 변화된 분비 단백질 분류 및 Gene ontology (GO) 데이터베이스를 이용한 기능 분석한 결과이다. (A)는 염증자극에 의해 증가 또는 감소된 단백질에 대한 벤다이어그램을 나타내고, (B)는 통계적으로 유의한 발현 차이를 나타내는 volcano plot 분석 결과이다. (C)는 GO 데이터베이스를 이용한 생물학적 기능 분석한 결과이다. 염증활성화된 인간성상교세포에서 증가된 분비단백질군 중 뇌 레닌-안지오텐신 시스템 인자의 증가를 확인할 수 있었다.
도 3은 정상 및 염증활성화된 인간성상교세포의 배양액에서 레닌-안지오텐신 시스템 인자 수용성 ANPEP 및 PRCP의 수준을 Sandwich enzyme-linked immunosorbent assay kit을 이용하여 측정한 결과이다. p-value는 unpaired two-tailed Student’s t test 에 기반하여 비교 평가한 결과이다. 각 실험군에서의 가로 막대는 수용성 ANPEP 및 PRCP 수준의 평균값을 나타낸다.
도 4는 정상 대조군(NOR)과 AD 환자군에서 뇌척수액 및 혈장 내의 수용성 ANPEP (Soluble anminopeptidase N/CD13) 수준을 unpaired two-tailed Student’s t test 에 기반하여 비교평가한 결과를 나타낸다. 각 실험군에서의 가로 막대는 수용성 ANPEP 수준의 평균값을 나타낸다.
도 5는 바이오마커로서 AD 환자군의 뇌척수액 및 혈장 내 수용성 ANPEP 수준에 대한 ROC 곡선(Receiver operating charateristic curve)을 나타낸다(AUC: area under curve).
도 6은 정상 대조군(NOR)과 AD 환자군에서 뇌척수액 및 혈장 내의 PRCP (Prolyl carboxypeptidase) 수준을 unpaired two-tailed Student’s t test 에 기반하여 비교평가한 결과를 나타낸다. 각 실험군에서의 가로 막대는 PRCP 수준의 평균값을 나타낸다.
도 7은 바이오마커로서 AD 환자군의 뇌척수액 및 혈장 내 PRCP 수준에 대한 ROC 곡선(Receiver operating charateristic curve)을 나타낸다(AUC: area under curve).

본 발명은 수용성 아미노펩티데이즈 N/CD13(Soluble aminopeptidase N/CD13; ANPEP) 또는 프롤릴카르복시펩티데이즈(Prolylcarboxypeptidase; PRCP)의 발현수준을 측정할 수 있는 제제를 유효성분으로 포함하는 알츠하이머병 진단용 조성물을 제공한다.

상세하게는, 상기 ANPEP 또는 PRCP의 발현 수준을 측정할 수 있는 제제는 상기 ANPEP 유전자 또는 PRCP 유전자에 특이적으로 결합하는 프라이머 또는 프로브, 상기 ANPEP 단백질 또는 PRCP 단백질에 특이적으로 결합하는 항체, 펩타이드, 앱타머 또는 화합물일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.

본 발명의 "ANPEP(aminopeptidase N/CD13)"은 2형 막단백질에 해당하는 150kDa 크기의 matalloprotease로 세포 바깥쪽으로 효소 활성 도메인을 가진다. ANPEP은 다양한 기능을 가지고 있으며, 병적 환경에서 면역반응과 밀접한 관련성이 있다는 보고가 증가하고 있다. 최근 ANPEP의 N-말단부가 제거된 수용성 ANPEP이 호르몬, 사이토카인 및 케모카인등의 활성을 조절한다고 알려졌다. 특히, ANPEP의 효소 활성과 상관없이 독립적으로 수용성 ANPEP이 G-단백질 결합 수용체와 결합할 수 있다고 알려졌다. 하지만 G-단백 결합 수용체와 결합하여 Src, ERK1/2, 인산화를 유도한다는 것이 보고되었으나 아직 정확한 기능은 발혀져 있지 않다. NF-kB를 활성화 시킨다는 점에서 세포 활성, 세포 이동, 혈관신생, 면역세포의 화학주성 또는 모세혈관 생성등의 기능을 수행할 것으로 예상되고 있다. 한편, ANPEP은 레닌 안지오텐신 시스템에서 효소 활성을 나타내는데, 안지오텐신 3의 N-말단에 아르기닌을 분해하여 안지오텐신 4로 전환하는 역할을 수행한다.

본 발명에서 수용성 ANPEP 폴리펩타이드는 바람직하게 인간 유래의 것으로 알려진 것이라면 그 구체적 서열이 특별히 제한되지 않으나, 일례로 GenBank(NCBI) accession number: NP_001368852.1 등으로 공지된 것을 사용할 수 있다. 상기 수용성 ANPEP 폴리펩타이드는 일례로 GenBank(NCBI) accession number: NM_001381923.1(mRNA)등의 폴리뉴클레오타이드 서열에 의해서 코딩되는 것으로 알려져 있으며, NC_000015.10 (RefSeqGene on chromosome 15) 등의 유전자 서열을 참조로 할 수 있다.

본 발명의 "PRCP (Prolylcarboxypeptidase)"는 단백질 분해효소로 예를 들어 안지오텐신 2, 3, 그리고 des-Arg9-bradykinin과 같은 펩타이드상의 프롤린에 연결된 C-말단을 분해할 수 있다고 알려져 있다. PRCP의 기능이상은 염증 및 고혈압과 같은 심혈관계 질환에 관련이 있다고 알려져 있으나, 정확한 생리학적 기능 기전은 아직 잘 알려지지 않았다. 신경계에서의 기능은 시상하부를 통해 식욕조절 및 비만 또는 당뇨병과 관련이 있는 것으로 알려져 있다. 하지만 알츠하이머병과 직접적인 관련성은 아직 보고된 바가 없다.

본 발명에서 PRCP 폴리펩타이드는 바람직하게 인간 유래의 것으로 알려진 것이라면 그 구체적 서열이 특별히 제한되지 않으나, 일례로 GenBank(NCBI) accession number: NP_005031.1 등으로 공지된 것을 사용할 수 있다. 상기 PRCP 폴리펩타이드는 일례로 GenBank (NCBI) accession number : NM_005040.4(mRNA)등의 폴리뉴클레오타이드 서열에 의해서 코딩되는 것으로 알려져 있으며, NC_000011.10 (RefSeqGene on chromosome 11) 등의 유전자 서열을 참조로 할 수 있다.

본 발명에서 "알츠하이머병"은 알츠하이머성 치매로도 불리며, 노화에 따라 수반되는 뇌 질환으로서 뇌 전체에 걸쳐 세포외 베타아밀로이드 침착과 세포내 과인산화 타우단백질에 의해 신경세포가 사멸하는 것으로 알려져 있으며 이는 점진적인 기억력 장애, 인지력 결손, 개인 성격의 변화 등을 초래하는 질병이다. 본원발명에서 용어 ‘알츠하이머병’은 특히 경도인지장애(mild cognitive impairment, MCI)와는 구분되는 것을 특징으로 한다. 바람직하게는, 본 발명에서 상기 "알츠하이머병"은 NINCDS-ADRDA 진단기준에 따라 알츠하이머병으로 판정된 것을 의미한다.

본 명세서에서 용어 “진단”은 특정 질병 또는 질환에 대한 한 객체의 감수성(susceptibility)을 판정하는 것, 한 객체가 특정 질병 또는 질환을 현재 가지고 있는지 여부를 판정하는 것, 특정 질병 또는 질환에 걸린 한 객체의 예후(prognosis)를 판정하는 것, 또는 테라메트릭스(therametrics)(예컨대, 치료 효능에 대한 정보를 제공하기 위하여 객체의 상태를 모니터링하는 것)을 포함한다.

본 명세서에서 용어 "프라이머"는 짧은 자유 3-말단 수산화기(free 3' hydroxyl group)를 가지는 핵산 서열로 상보적인 템플레이트(template)와 염기쌍을 형성할 수 있고 템플레이트 가닥 복사를 위한 시작 지점으로서 작용하는 짧은 핵산 서열을 말한다. 프라이머는 적절한 완충용액 및 온도에서 중합반응을 위한 시약(즉, DNA 폴리머라제 또는 역전사효소) 및 상이한 4 가지의 뉴클레오사이드 트리포스페이트의 존재하에서 DNA 합성을 개시할 수 있다. PCR 조건, 센스 및 안티센스 프라이머의 길이는 당업계에 공지된 기술에 따라 적절히 선택될 수 있다.

본 명세서에서 용어 "프로브"는 mRNA외 특이적으로 결합을 이룰 수 있는 짧게는 수 염기 내지 길게는 수백 염기에 해당하는 RNA 또는 DNA 등의 핵산 단편을 의미하며 라벨링되어 있어서 특정 mRNA의 존재 유무, 발현양을 확인할 수 있다. 프로브는 올리고뉴클레오타이드(oligonucleotide) 프로브, 단쇄 DNA(single strand DNA) 프로브, 이중쇄DNA(double strand DNA) 프로브, RNA 프로브 등의 형태로 제작될 수 있다. 적절한 프로브의 선택 및 혼성화 조건은 당해 기술 분야에 공지된 기술에 따라 적절히 선택할 수 있다.

본 명세서에서 용어 "항체"는 당해 기술분야에 공지된 용어로서 항원성 부위에 대하여 지시되는 특이적인 면역 글로불린을 의미한다. 본 발명에서의 항체는 본 발명의 LRP-1에 대해 특이적으로 결합하는 항체를 의미하며, 당해 기술분야의 통상적인 방법에 따라 항체를 제조할 수 있다. 상기 항체의 형태는 폴리클로날 항체 또는 모노클로날 항체를 포함하며, 모든 면역글로불린 항체가 포함된다. 상기 항체는 2개의 전체 길이의 경쇄 및 2 개의 전체 길이의 중쇄를 갖는 완전한 형태를 의미한다. 또한, 상기 항체는 인간화 항체 등의 특수 항체도 포함된다.

또한, 본 발명의 키트는 마커 성분에 특이적으로 결합하는 항체, 기질과의 반응에 의해서 발색하는 표지체가 접합된 2차 항체 접합체(conjugate), 상기 표지체와 발색 반응할 발색 기질 용액, 세척액 및 효소반응 정지용액 등을 포함할 수 있으며, 사용되는 시약 성분을 포함하는 다수의 별도 패키징 또는 컴파트먼트로 제작될 수 있다.

본 명세서에서 용어 "펩타이드"는 표적 물질에 대한 결합력 높은 장점이 있으며, 열/화학 처리시에도 변성이 일어나지 않는다. 또한 분자 크기가 작기 때문에 다른 단백질에 붙여서 융합 단백질로의 이용이 가능하다. 구체적으로 고분자 단백질 체인에 붙여서 이용이 가능하므로 진단 키트 및 약물전달 물질로 이용될 수 있다.

본 명세서에서 용어 "앱타머(aptamer)"란, 그 자체로 안정된 삼차 구조를 가지면서 표적 분자에 높은 친화성과 특이성으로 결합할 수 있는 특징을 가진 특별한 종류의 단일가닥 핵산(DNA, RNA 또는 변형핵산)으로 구성된 폴리뉴클레오티드의 일종을 의미한다. 상술한 바와 같이, 앱타머는 항체와 동일하게 항원성 물질에 특이적으로 결합할 수 있으면서도, 단백질보다 안정성이 높고, 구조가 간단하며, 합성이 용이한 폴리뉴클레오티드로 구성되어 있으므로, 항체를 대체하여 사용될 수 있다.

본 발명의 진단용 키트에는 수용성 ANPEP 또는 PRCP의 발현 수준을 측정하기 위하여 선택적으로 수용성 ANPEP 또는 PRCP 폴리펩타이드를 마커로 인식하는 항체, 앱타머 또는 수용성 ANPEP 또는 PRCP mRNA를 마커로 인식하는 프라이머, 프로브 뿐만 아니라 분석 방법에 적합한 한 종류 또는 그 이상의 다른 구성 성분 조성물, 용액 또는 장치가 포함될 수 있다.

구체적인 양태로서 상기 키트는 웨스턴 블랏, ELISA(enzyme-linked immunospecific assay), 방사선면역분석, 방사선 면역 확산법, 오우크테로니 면역 확산법, 로케트 면역전기영동, 면역염색법, 면역침전 분석법, 보체 고정 분석법, FACS(Fluorescence activated cell sorter) 또는 단백질 칩 방법을 수행하기 위해 필요한 공지의 필수요소 및 부수 요소를 포함하는 것을 특징으로 하는 진단 키트일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

일례로, 상기 키트는 수용성 ANPEP 또는 PRCP 폴리펩타이드에 대한 특이적인 항체를 포함한다. 상기 항체는 목적 마커 단백질(본 발명에서, 수용성 ANPEP 또는 PRCP 폴리펩타이드)에 대한 특이성 및 친화성이 높고 다른 단백질에 대한 교차반응성이 거의 없는 항체로, 단클론 항체, 다클론 항체 또는 재조합 항체이다. 또한 상기 키트는 추가적으로 대조군 단백질에 특이적인 항체를 포함할 수 있다. 그 외 상기 키트는 결합된 항체를 검출할 수 있는 시약, 예를 들면, 표지된 2차 항체, 발색단(chromophores), 효소(항체와 컨주게이트된 형태로서) 및 그의 기질 또는 항체와 결합할 수 있는 다른 물질 등을 포함할 수 있다. 또한, 본 발명의 키트는 잉여의 발색 기질 및 결합되지 않은 단백질 등은 제거하고 항체와 결합된 단백질 마커만을 보유할 수 있는 세척액 또는 용리액을 포함할 수 있다.

또한 상기 키트는 당업계에 프라이머(프라이머쌍) 또는 프로브를 구성품으로 제공하는 분석 키트로서 알려진 것이라면 그 종류가 특별히 제한되지 않으나, 예를 들어 PCR(polymerase chain reaction, 중합효소연쇄반응), RNase 보호 분석법, 노던 블랏팅, 서던 블랏팅 또는 DNA 마이크로어레이 칩용 키트 등을 포함한다.

일례로, 상기 진단 키트는 중합효소반응을 수행하기 위해 필요한 필수 요소를 포함하는 것을 특징으로 하는 진단용 키트일 수 있다. 중합효소반응 키트는 마커 유전자(mRNA)에 대한 특이적인 각각의 프라이머 쌍을 포함한다. 프라이머는 각 마커 유전자(mRNA)의 핵산서열에 특이적인 서열을 가지는 뉴클레오타이드로서, 약 7bp 내지 50bp의 길이, 보다 바람직하게는 약 10bp 내지 30bp의 길이이다. 또한 대조군 유전자의 핵산 서열에 특이적인 프라이머를 포함할 수 있다. 그 외 중합효소반응 키트는 테스트 튜브 또는 다른 적절한 컨테이너, 반응 완충액(pH 및 마그네슘 농도는 다양), 데옥시뉴클레오타이드(dNTPs), DNA 폴리머라아제(예를 들어 Taq-폴리머라아제) 및 역전사효소, DNAse, RNAse 억제제 DEPC-수(DEPC-water), 멸균수 등을 포함할 수 있다.

본 명세서에서 용어 "환자에서 분리된 시료"란 알츠하이머병의 발병 여부를 진단하고자 하는 피검체에서 채취된 것이면 제한없이 사용할 수 있으며, 예를 들어 생검 등으로 얻어진 세포나 조직, 혈액, 전혈, 혈청, 혈장, 타액, 뇌척수액, 각종 분비물, 소변, 대변 등일 수 있다. 바람직하게는 생물학적 액체 시료(체액 시료)를 사용하는 것일 수 있으며, 일례로 혈액, 혈장, 혈청, 타액, 비액, 객담, 관절낭액, 양수, 복수, 자궁경부 또는 질 분비물, 소변 및 뇌척수액을 사용하는 것일 수 있다. 본 발명은 알츠하이머병이 발생된 직접적 뇌 병변조직 외의 체액시료(일례로, 혈장)를 통해 진단이 가능하여, 진단의 효용성, 신속성, 편이성 및 안전성 등이 증가된다는 점에서 기술적 의의가 크다. 본 발명에서 상기 시료는 가장 바람직하게는 뇌척수액, 혈액, 혈장 또는 혈청일 수 있다.

상세하게는, 상기 mRNA 발현 수준을 측정하는 방법은 RT-PCR, 경쟁적 RT-PCR(Competitive RT-PCR), 실시간 RT-PCR (Real-time RT-PCR), RNase 보호 분석법(RPA; RNase protection assay), 노던 블랏팅 (Northern blotting) 및 DNA 칩을 이용하지만, 이에 한정되는 것은 아니다.

상세하게는, 상기 단백질 발현 수준을 측정하는 방법은 웨스턴 블랏, ELISA(enzyme linked immunosorbent asay), 방사선면역분석(Radioimmunoassay; RIA), 방사면역확산법(radioimmunodiffusion), 오우크테로니(Ouchterlony) 면역 확산법, 로케이트(rocket) 면역전기영동, 조직면역염색, 면역침전 분석법(Immunoprecipitation assay), 보체고정분석법 (Complement Fixation Assay), FACS 및 단백질 칩을 이용하지만, 이에 한정되는 것은 아니다.

본 발명의 스크리닝 방법을 언급하면서 사용되는 용어 "시험물질"은 유전자의 발현량에 영향을 미치거나, 단백질의 발현 또는 활성에 영향을 미치는지 여부를 검사하기 위하여 스크리닝에서 이용되는 미지의 후보 물질을 의미한다. 상기 시료는 화학물질, 뉴클레오타이드, 안티센스-RNA, siRNA(small interference RNA) 및 천연물 추출물을 포함하나, 이에 제한되는 것은 아니다.

이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 실시예를 들어 상세하게 설명하기로 한다. 다만 하기의 실시예는 본 발명의 내용을 예시하는 것일 뿐 본 발명의 범위가 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다. 본 발명의 실시예는 당업계에서 평균적인 지식을 가진 자에게 본 발명을 보다 완전하게 설명하기 위해 제공되는 것이다.

< 실시예 1> 알츠하이머병 진단을 위한 혈장 내 수용성 ANPEP 및 PRCP의 바이오마커로서의 효용성 확인

1. 실험방법

(1) 세포 배양

인간 성상교세포 (ScienCell, San Diego, CA)는 10%(v/v) 열-불활성 소 태아 혈청 (FBS, heat-inactivated fetal bovine serum)(ScienCell), 100 U/mL 페니실린(penicillin), 100 μg/mL 스트렙토마이신(streptomycin)(ScienCell) 및 astrocyte growth factor (ScienCell)를 포함하는 human astrocyte media (ScienCell)에서 배양되었다. 세포는 배양기에서 37℃, 5% CO₂ 조건으로 배양되었다. 인간 성상교세포를 염증 활성화하기 위해 염증 촉진 사이토카인 (TNF-a, IL-1b, IFN-r)을 10ng/ml로 처리하였고 24시간 후 배양을 수집하여 amicon Ultra-4 Centrifugal Filter Units을 이용하여 순수 단백질을 PBS에 분리 및 농축하였다.

(2) Secretome 분석

용액 내 단백질을 분해하기 위해, 침전된 단백질을 40 mM NH₄HCO₃에 재현탁 하였다. 5 mM dithiothreitol를 처리하고 56℃에서 20분 동안 배양한 후, 단백질 침전물을 10 mM iodoacetamide로 10분 동안 상온에서 처리하였다. 그 후, 단백질 침전물을 1 : 100 trypsin-Lys C 혼합물 (Promega, Madison, WI)로 37℃에서 12 시간 동안 처리하였다. 트립신으로 분해된 펩타이드는 제조사의 지침에 따라 탈염 컬럼 (# 89873, Thermo Fisher Scientific, San Jose, CA)을 사용하여 탈염되었다.

트립신이 분해된 펩타이드는 EASY-Spray 소스와 인터페이스 되는 Q-Exactive 플러스 하이브리드 사중극 orbit-trap 질량 분석기 (Thermo Fisher Scientific)를 사용하여 분석되었다. 펩타이드의 크로마토그래피 분리는 로딩 컬럼으로 Acclaim PepMapTM 100 (75mm × 2cm, 3μm, nanoViper, Thermo Fisher Scientific), 분리 컬럼으로 EASY-Spray 컬럼 PepMapTM RSLC C18 (75 μm x 50 cm, 2 μm, Thermo Fisher Scientific) 장착한 Ultimate 3000 RSLCnano 시스템 (Thermo Fisher Scientific)에서 진행되었다. 펩타이드는 RS 자동 시료 주입기로 로딩되고, 0.1 % 포름산 함유 ACN/물의 선형 구배로 300 nL/min의 유속에서 분리되었다. LC 용리액을 분석 컬럼에서 전기 분무하고, 2.0 kV의 전압을 나노 스프레이 소스의 액체 접합을 통해 적용하였다. 펩타이드 혼합물을 40분 동안 5%에서 40%로 증가하는 CAN의 구배로 분리되었다. 분석 방법에는 350 ~ 2000 m/z 범위로 전체 질량 분석기(MS) 스캔 및 전체 MS 스캔에서 가장 강렬한 10 개의 이온에 대한 데이터 의존적 MS/MS (MS2)가 포함되었다. 질량 분석기는 데이터 종속 모드에서 데이터를 수집하도록 프로그래밍 되었다. 질량분석기의 교정은 제조사의 지침에 따라 제안된 교정 솔루션으로 수행되었다. 데이터 베이스 검색을 수행하기 위해, Proteome Discoverer software version 2.3 (Thermo Fisher Scientific)을 사용하여 직렬 질량 스펙트럼을 처리하였다. 스펙트럼 데이터는 human Uniprot database (release version 2019_07)로 검색하였다. 사용된 분석 워크플로워는 Spectrum Files (데이터 입력), Spectrum Selector (스펙트럼 및 기능 검색), Sequest HT (시퀀스 데이터베이스 검색), Percolator (펩티드 스펙트럼 일치 또는 PSM 검증 및 FDR 분석)의 4 개 노드가 포함되었다. 확인된 모든 단백질은 펩타이드 수준에서 계산된 FDR이 ≤ 1%로 나타났다. 검증은 q-값을 기반으로 하였다. 검색 매개 변수는 고정된 변형인 시스테인의 메틸티오 변형 및 동적 변형인 메티오닌의 산화와 같은 최대 2개의 누락된 분열의 트립신 특이성을 허용하였다. +1, +2 및 +3 이온에 대한 질량 검색 매개 변수에는 전구체 이온의 경우 20ppm, 조각 이온의 경우 0.6 Da의 질량 오차 허용 오차가 포함되었다.

(3) 데이터 분석

Secretome 분석 후 유의적으로 변화된 분비 단백질들은 DAVID v.6.8 (the database for annotation, visualization and integrated discovery; http://david.abcc.ncifcrf.gov/)과 Cytoscape (https://cytoscape.org/)의 ClueGO v2.5.1/CluePedia v1.5.1를 이용하여 세포내 위치 및 기능적으로 분류하였다.

(4) 인간성상교세포 배양액 내의 ANPEP 및 PRCP 측정

염증 활성화된 인간성상교세포의 배양액내의 ANPEP 및 PRCP의 농도는 Sandwich enzyme-linked immunosorbent assay kit for ANPEP (MyBiosource, San Diego, CA) 및 Sandwich enzyme-linked immunosorbent assay kit for PRCP (Cloud clone, Katy, TX)를 사용하여 제조사의 프로토콜에 따라 ELISA assay가 수행되었다. 상기 kit의 96 well plate에 각 well당 100μl의 배양액을 넣어 수용성 ANPEP 및 PRCP농도를 측정하였다. 사용된 human recombinant ANPEP protein의 standard 농도는 1.56 ~ 100 ng/ml이며 human recombinant PRCP protein의 standard 농도는 78 ~ 5000 pg/ml이다. 모든 측정은 이중으로 수행되었다.

(5) 환자

경북대학교 병원 치매 클리닉(대구, 한국) 환자들을 대상으로 하였으며, 구체적인 환자들의 정보는 하기 표 1과 같다. 신경심리학검사, 정신의학적인 평가와 인터뷰, 아포리포단백질E를 포함하는 혈액 분석, 뇌 자기공명영상을 포함한 검사를 시행하였고, NINCDS-ADRDA 진단기준에 따라 알츠하이머 치매로 진단된 환자를 포함하였다 (Neurology, 1984;34(7);939). 진단의 정확성을 높이기 위해 1년 이상 추적 관찰하여 알츠하이머 치매에 합당한 경과의 환자를 대상으로 포함하였다. 신경심리학 검사는 mini-mental state examination (MMSE)을 포함한 서울신경심리검사 2판 (SNSB II, Seoul Neuropasychological Screening Batter)을 수행하였다.

	정상(13명)	알츠하이머성 치매(20명)
성별(남/여)	5/8	4/16
나이	65.14±6.94	68.42±9.36
MMSE score	28.75±1.89	16.9±6**
교육(년도)	10.75±2.50	4.86±4.4
체질량지수(BMI)	24.77±4.19	24.49±3.2

(mean ± SD, * p<0.05, ** p<0.001, *** p<0.0001)

(6) 환자 뇌척수액 및 혈장 샘플

하루 전날 8시간 이상 금식한 환자들로부터 대정맥에서 채혈 한 혈액을 EDTA 튜브에 넣은 후, 프로테아제 저해제 칵테일(Roche Diagnostics)을 넣고 부드럽게 섞어준다. 상기 EDTA 처리 혈액을 3000 rpm의 속도로 10분간 원심분리하여, 혈장을 분리하였다. 수집 된 혈장 샘플을 드라이 아이스상에서 즉시 냉동시킨 다음 -80℃ 냉동고에 보관 하였다.

(7) 환자 뇌척수액 및 혈장 내 수용성 ANPEP 측정

뇌척수액 및 혈장을 PBS를 이용하여 각각 10배 및 10,000배 희석한 다음 수용성 ANPEP에 대한 Sandwich enzyme-linked immunosorbent assay kit (MyBiosource, San Diego, CA)를 사용하여 제조사의 프로토콜에 따라 ELISA assay가 수행되었다. 상기 kit의 96 well plate에 각 well당 100μl의 희석된 뇌척수액 및 혈장을 넣어 각 환자의 수용성 ANPEP 농도를 측정하였다. 사용된 human recombinant ANPEP protein의 standard 농도는 1.56 ~ 100 ng/ml이다. 모든 측정은 이중으로 수행되었다.

(8) 환자 뇌척수액 및 혈장 내 PRCP 측정

뇌척수액 및 혈장을 PBS를 이용하여 각각 10배 및 10,000배 희석한 다음 PRCP에 대한 Sandwich enzyme-linked immunosorbent assay kit(Cloud clone, Katy, TX)를 사용하여 제조사의 프로토콜에 따라 ELISA assay가 수행되었다. 상기 kit의 96 well plate에 각 well당 100μl의 희석된 뇌척수액 및 혈장을 넣어 각 환자의 PRCP 농도를 측정하였다. 사용된 human recombinant PRCP protein의 standard 농도는 78 ~ 5000 pg/ml이다. 모든 측정은 이중으로 수행되었다.

(9) 통계적 분석

통계 분석은 unpaired two-tailed Student’s t-test, Tukey multiple comparison test를 이용한 one-way ANOVA 또는 two-way ANOVA를 사용하여 다른 그룹의 평균을 비교함으로써 수행되었다. SPSS version 14.0K 소프트웨어(SPSS Inc., Chicago, IL)를 사용하여 데이터 세트를 분석 하였다. 통계적 유의성은 p <0.05에서 확립되었다.

2. 실험결과

도 1과 도2와 같이 염증 활성화된 인간성상교세포에서 정상 인간성상교세포에 비해 증가된 분비 단백질 중 레닌 안지오텐신과 관련된 인자를 확인할 수 있었다. 이중 ANPEP와 PRCP의 수준을 세포배양액에서 확인한 결과 도3과 같이 현저히 증가(ANPEP: p<0.00001, PRCP: p=0.0383) 되는 것을 확인 할 수 있었다.

도 4에서 보는 바와 같이, 정상군(13 명)과 AD 환자(11 명)에서 뇌척수액 (CSF) 내 수용성 ANPEP 농도 차이는 p=0.0196의 차이를 나타내었으며, AD 환자군에서 현격하게 증가된 상태를 나타내었다. 정상군(8 명)과 AD 환자(20 명)에서 혈장 내 수용성 ANPEP 농도 차이는 p=0.0327의 차이를 나타내었으며, AD 환자군에서 유의하게 증가된 상태를 나타내었다. 이러한 결과는 수용성 ANPEP의 혈중 농도 증가와 알츠하이머 치매 발병과의 밀접한 관련성을 나타낸다.

또한, ROC 곡선으로 AD 환자의 뇌척수액 및 혈장 내 수용성 ANPEP 수준의 예측 중요성(predictive significance)을 평가하였다. 도 5에서 보는 바와 같이, AD 환자에서 ROC 곡선 아래 면적(AUC, 즉 정확도)은 (CSF AUC=0.7273, Plasma AUC=0.8625) 이었다.

도 6에서 보는 바와 같이, 정상군(13 명)과 AD 환자(11 명)에서 뇌척수액 내 PRCP 농도 차이는 p=0.0218의 차이를 나타내었으며, AD 환자군에서 현격하게 증가된 상태를 나타내었으며 정상군(8 명)과 AD 환자(20 명)에서 혈장 내 PRCP 농도 차이는 Plasma p=0.026의 차이를 나타내었으며, AD 환자군에서 유의하게 감소된 상태를 나타내었다. 이러한 결과는 PRCP의 뇌척수액 증가와 혈중 농도 감소가 알츠하이머 치매 발병과의 밀접한 관련성을 나타낸다.

또한, ROC 곡선으로 AD 환자의 뇌척수액 및 혈장 내 PRCP 수준의 예측 중요성(predictive significance)을 평가하였다. 도 7에서 보는 바와 같이, AD 환자에서 ROC 곡선 아래 면적(AUC, 즉 정확도)은 (CSF AUC=0.7762, Plasma AUC=0.7906) 이었다.

이상으로 본 발명의 특정한 부분을 상세히 기술하였는 바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서, 이러한 구체적 기술은 단지 바람직한 실시예일 뿐이며, 이에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백할 것이다. 따라서, 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항들과 그것들의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.

Claims

수용성 아미노펩티데이즈 N/CD13(Soluble aminopeptidase N/CD13; ANPEP) 단백질 또는 이를 코딩하는 유전자; 및 프롤릴카르복시펩티데이즈(Prolylcarboxypeptidase; PRCP) 단백질 또는 이를 코딩하는 유전자의 발현수준을 측정할 수 있는 제제를 유효성분으로 포함하는 알츠하이머병 진단용 조성물.
제1항에 있어서, 상기 발현 수준을 측정할 수 있는 제제는 상기 ANPEP 유전자 또는 PRCP 유전자에 특이적으로 결합하는 프라이머 또는 프로브이거나, 상기 ANPEP 단백질 또는 PRCP 단백질에 특이적으로 결합하는 항체, 펩타이드, 앱타머 또는 화합물인 것을 특징으로 알츠하이머병 진단용 조성물.
제1항 또는 제2항의 조성물을 포함하는 알츠하이머병 진단용 키트.
(1) 환자에서 분리된 시료로부터 ANPEP 유전자의 mRNA 발현 수준 또는 ANPEP 단백질의 발현 수준을 측정하는 단계;
(2) 상기 ANPEP 유전자의 mRNA 발현 수준 또는 ANPEP 단백질의 발현 수준을 대조군 시료와 비교하는 단계; 및
(3) 상기 ANPEP 유전자의 mRNA 발현 수준 또는 ANPEP 단백질의 발현 수준이 대조군 시료보다 높을 경우 알츠하이머병이라고 판단하는 단계를 포함하는 알츠하이머병 진단에 필요한 정보를 제공하는 방법.
제4항에 있어서, 상기 환자에서 분리된 시료는 혈액 또는 뇌척수액인 것을 특징으로 하는 알츠하이머병 진단에 필요한 정보를 제공하는 방법.
(1) 환자에서 분리된 뇌척수액 시료로부터 PRCP 유전자의 mRNA 발현 수준 또는 PRCP 단백질의 발현 수준을 측정하는 단계;
(2) 상기 PRCP 유전자의 mRNA 발현 수준 또는 PRCP 단백질의 발현 수준을 대조군 시료와 비교하는 단계; 및
(3) 상기 PRCP 유전자의 mRNA 발현 수준 또는 PRCP 단백질의 발현 수준이 대조군 시료보다 높을 경우 알츠하이머병이라고 판단하는 단계를 포함하는 알츠하이머병 진단에 필요한 정보를 제공하는 방법.
(1) 환자에서 분리된 혈액 시료로부터 PRCP 유전자의 mRNA 발현 수준 또는 PRCP 단백질의 발현 수준을 측정하는 단계;
(2) 상기 PRCP 유전자의 mRNA 발현 수준 또는 PRCP 단백질의 발현 수준을 대조군 시료와 비교하는 단계; 및
(3) 상기 PRCP 유전자의 mRNA 발현 수준 또는 PRCP 단백질의 발현 수준이 대조군 시료보다 낮을 경우 알츠하이머병이라고 판단하는 단계를 포함하는 알츠하이머병 진단에 필요한 정보를 제공하는 방법.
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