KR102676799B1 - 천연 복합 추출물 함유 피부 개선용 외용제 조성물 - Google Patents

Abstract

본 발명은 무화과, 망고, 포도, 및 가지의 복합 추출물을 유효성분으로 포함하는 피부 외용제 조성물에 관한 것이다.
본 발명에 따른 무화과, 망고, 포도, 및 가지의 복합 추출물은 피부 주름 개선, 항산화, 피부 장벽 강화, 항노화, 항염, 피부 재생 또는 창상 치유 등의 피부 개선 효과를 가지는 바, 이러한 무화과, 망고, 포도, 및 가지의 복합 추출물은 화장료, 의약 등의 피부 개선용 소재로 유용하게 사용될 수 있다.

Description

천연 복합 추출물 함유 피부 개선용 외용제 조성물 {External Composition Comprising Natural Complex Extract for Improving Skin}

본 발명은 천연 복합 추출물을 유효성분으로 포함하는 피부 주름개선, 항염, 피부 보습, 피부 장벽 개선, 항노화, 항산화, 피지 억제, 가려움증 완화 등의 피부 개선용 외용제 조성물에 관한 것이다.

피부는 무게를 기준으로 몸에서 가장 큰 기관이며 각질화된 바깥쪽 표피와 혈관이 풍부하게 발단된 내부 결합조직인 진피, 그리고 가장 안쪽의 피하조직의 3 층으로 되어 있으며, 피부와 연관된 여러 부속기구 (털, 손발톱, 감각수용기, 분비샘)와 함께 피부계 (integumentary　system)를 이룬다. 피부는 몸 안의 여러 기관의 주요한 기능 수행을 위해 몸의 안과 밖의 경계를 이룬다.

피부는 항상성 (homeostasis) 유지에 필수적이며 보호기능 외에도 체온조절, 수분손실 억제, 감각수용기 함유, 다양한 생화학물질 합성 및 소량의 노폐물 배출 등 다양한 기능을 수행하는 중요한 기관이다.

그러나 다른 기관과 비교하여 피부는 외부로부터의 자극이나 여러 병원체와 직접 접촉하는 기회가 많으며, 특히 피부에 자외선이 흡수될 경우 광화학 반응을 일으킴으로써 피부 병변을 야기하게 된다. 뿐만 아니라 정신적인 스트레스, 비만, 술, 담배 등 현대사회에서 일반적으로 발생하는 요소들에 의한 피부질환 환자가 급격히 늘고 있는 추세이다.

이에 따라 피부 손상을 억제하고 피부세포를 보호하기 위한 다양한 피부 보호제에 대한 개발이 활발히 이루어지고 있으나, 개발된 피부 보호제는 주로 합성 화합물을 유효성분으로 하고 있어,　피부에 손상을 유발시키거나 가려움 및 반점 등 부작용이 발생한다는 단점이 있다. 따라서,　피부에　부작용이 없으면서도 피부 손상 억제 및 피부 강화 기능이 우수한 새로운 천연물 소재의 개발이 필요한 실정이다.

대한민국 공개특허 제10-2022-0141467호

본 발명은 전술한 문제 및 이와 연관된 다른 문제를 해결하는 것을 목적으로 한다.

본 발명의 일 예시적 목적은 천연 복합 추출물을 유효성분으로 포함하는 피부 개선용 외용제 조성물, 일 예로, 무화과, 망고, 포도, 및 가지의 복합 추출물을 유효성분으로 포함하는 피부 개선용 외용제 조성물을 제공하는 것이다.

본 명세서에 개시된 발명의 기술적 사상에 따라 이루고자 하는 기술적 과제는 이상에서 언급한 문제점을 해결하기 위한 과제로 제한되지 않으며, 언급되지 않은 또 다른 과제는 아래의 기재로부터 통상의 기술자에게 명확하게 이해될 수 있을 것이다.

이를 구체적으로 설명하면 다음과 같다. 한편, 본 출원에서 개시된 각각의 설명 및 실시형태는 각각의 다른 설명 및 실시 형태에도 적용될 수 있다. 즉, 본 출원에서 개시된 다양한 요소들의 모든 조합이 본 출원의 범주에 속한다. 또한, 하기 기술된 구체적인 서술에 의하여 본 출원의 범주가 제한된다고 볼 수 없다.

상기 목적을 달성하기 위한 일 양태로서, 본 발명은 무화과, 망고, 포도, 및 가지의 복합 추출물을 유효성분으로 포함하는 피부 개선용 외용제 조성물을 제공한다.

본 발명에 있어서, 무화과, 망고, 포도 및 가지의 복합 추출물은 무화과, 망고, 포도 및 가지를 용매에서 함께 추출하여 복합 추출물을 얻거나, 또는 무화과 추출물, 망고 추출물, 포도 추출물 및 가지 추출물을 함께 혼합하여 복합 추출물을 얻을 수 있다.

본 발명에 있어서, "추출물"은 무화과, 망고, 포도 및 가지의 추출처리에 의해 얻어지는 추출액, 상기 추출액의 희석액이나 농축액, 상기 추출물을 건조하여 얻어지는 건조물, 상기 추출액의 조정제물이나 정제물, 또는 이들의 혼합물 등, 추출액 자체 및 추출액을 이용하여 형성 가능한 모든 제형의 추출물을 포함한다.

본 발명에 있어서 상기 추출은 특별히 제한되지 아니하며, 당해 기술 분야에서 통상적으로 사용하는 방법에 따라 추출할 수 있다. 상기 추출 방법의 비제한적인 예로는, 열수 추출법, 냉침 추출법, 용매 추출법, 수증기 증류법, 용출법, 압착법, 초음파 추출법, 여과법, 환류 추출법 등이 있으며, 이들은 단독으로 수행되거나 2종 이상의 방법을 병용하여 수행될 수 있다.

일 실시예로, 본 발명의 추출 단계는 열수추출에 의한 것일 수 있다. 바람직하게는 70 ℃ 내지 140 ℃에서 36시간 내지 52시간 열수추출하는 것일 수 있으며, 더욱 바람직하게는 90 ℃ 내지 120 ℃에서 48시간 열수추출하는 것일 수 있다.

본 발명의 상기 추출물은 적절한 용매를 이용하여 추출한 것이며, 예를 들어 조추출물, 극성용매 가용 추출물 또는 비극성 용매 가용 추출물을 모두 포함할 수 있다. 상기 추출물을 제조하기 위해 사용되는 추출 용매의 종류는 특별히 제한되지 아니하며, 당해 기술 분야에서 공지된 임의의 용매를 사용할 수 있다. 상기 추출 용매의 비제한적인 예로는 물; 메탄올, 에탄올, 프로판올, 이소프로판올, 부탄올, 프로필알콜, 부틸알콜 등의　탄소수 1 내지 4 저급 알콜; 글리세린, 부틸렌글리콜, 프로필렌글리콜 등의 다가 알코올; 메틸아세테이트, 에틸아세테이트, 아세톤, 벤젠, 헥산, 디에틸에테르, 디클로로메탄 등의 탄화수소계 용매;　또는 이들의 혼합물을 사용할 수 있다. 또한, 상기 용매를 사용하여 1회 이상 추출하여 용매 추출물을 제조할 수 있다.

본 발명의 상기 추출물은 부유하는 고체 입자를 제거하기 위해 여과, 예를 들어 mesh로 여과하여 고형분을 제거하고 사용하거나, 이를 동결건조, 열풍건조, 분무건조 등을 이용해 건조시켜 사용될 수 있다. 또한, 상기 추출물은 추가로 통상의 분획 공정을 거칠 수도 있으며, 통상의 정제 방법을 이용하여 정제될 수도 있다.

본 발명에 있어서, "피부 개선"이란 본 발명의 조성물을 사용하여 피부가 호전되도록 하거나 이롭게 되도록 하는 모든 행위를 의미한다.

본 발명의 상기 피부 개선은 일 예시로, 자외선 조사에 대한 피부 보호, 피부 보습, 항노화, 피부 장벽 강화, 가려움증 완화, 항스트레스에 의한 피부(세포 손상) 보호, 항주름, 피부재생, 창상치유에 의한 항노화, 모공 축소, 피지 억제, 또는 여드름 개선을 포함할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

본 발명의 용어 "피부 보습"은 피부에 수분감을 증가시켜주고 촉촉한 상태를 유지시키는 것을 의미한다. 피부 보습 효과를 높일 경우 피부의 주름 개선, 탄력도 증가에도 이로운 영향을 미칠 수 있다.

본 발명의 용어 "자외선 조사, 블루라이트에 대한(로부터) 피부 보호"은 피부가 자외선, 블루라이트에 노출됨에 따라 발생하는 손상 또는 증상, 예를 들어 자외선에 의한 주름 생성, 피부 탄력 저하, 광노화 또는 피부 각화에 대한 방지 또는 개선을 말한다.

본 발명의 용어 "피부 장벽 강화"는 각질세포로 이루어진 피부 장벽에서 각질형성세포의 분화를 촉진하여 표피층의 두께를 두껍게 개선시키는 것을 말한다.

본 발명의 용어 "가려움(증) 개선"이란 피부를 긁거나 문지르고 싶은 충동을 일으키는 피부 증상의 완화를 의미하는 것으로, 가려움증을 유발하는 유전자의 발현을 감소함으로써 가려움증이 완화되는 것을 포함하는 개념이다.

본 발명의 용어 "모공 축소"는 피부 표면에 존재하는 털이 자라나는 구멍의 크기를 감소시키는 것을 의미한다. 모공이 커지면 노폐물과 세균이 신체 안으로 쉽게 침투하여 세균감염 및 여드름 생성이 쉽게 일어날 수 있으므로, 모공을 축소함으로써 깨끗한 피부 상태의 유지 및 세균 감염으로부터 보호 효과를 얻을 수 있다.

본 발명의 용어 "피부 노화"는 내인성/외인성 노화를 모두 포함하는 개념이다. 이러한 피부 노화는 주름 개선, 주름 예방, 탄력 개선 등은 각종 피부노화로부터 발생하는 현상에 대한 개선, 예방, 방지를 또한 포함한다.

본 발명의 용어 "피지 억제"는 피부에서 스며나오는 기름의 분비량을 감소시키는 것을 말한다. 피지가 지나치게 분비될 경우 피부 표면에 염증 및 여드름이 발생하므로, 피지 분비를 억제함으로써 피부의 건강 상태를 향상시키고 산뜻한 피부 상태를 유지할 수 있다.

본 발명의 용어 "여드름 억제 또는 개선"은 피지 분비 과다와 모공 폐쇄로 인해 발생하는 여드름의 발생을 감소시키거나, 발생한 여드름이 가라앉는 것을 의미한다.

본 발명의 용어 "피부 보호 (피부 세포 손상 보호)"란 피부 세포가 손상될 수 있는 원인을 차단함으로써 세포 손상으로부터 보호하는 것을 의미하며, 예를 들어 피부 세포를 손상시키는 원인 중 하나인 스트레스에 대한 내성이 증가하는 유전자의 발현이 증가하는 것을 들 수 있으나, 이로 제한되지 않는다. 예컨대, 각종 환경 스트레스로부터 피부 노화를 억제하거나, 피부를 보호하는 것을 의미하며, 이러한 환경 스트레스로는 자외선, 공해, 바람, 또는 온도 등을 포함할 수 있다.

본 발명의 용어 "항염(증)"은 염증 반응의 개선이나 경감, 억제 또는 지연을 포함하는 의미로 사용된다. 이러한 염증 반응은 각종 염증 매개 인자와 면역세포와 관련된 효소(예컨대 iNOS, COX-2 등) 활성화, 염증 매개 물질의 분비(예컨대, NO, TNF-α, IL-6 등의 분비), 체액 침윤, 세포 이동, 조직 파괴 등 일련의 복합적인 생리적 반응을 수반하며, 홍반, 통증, 부종, 발열 등의 증상에 의해 외적으로 나타난다.

본 발명의 용어 "유효성분으로 포함하는"의 의미는, 피부 외용제 조성물로써 상기와 같은 다양한 피부 개선 효과를 나타낼 수 있는 정도의 유효량을 포함하는 것을 말한다.

구체적으로, 본 발명의 실험예에서는 무화과, 망고, 포도 및 가지의 복합 추출물 함유 조성물은 프로콜라겐 생합성 증가에 따른 피부 주름 개선, 예방효과를 확인하였고, AQP3, 필라그린 발현의 증가를 통해 피부 보습, 피부장벽개선 효과를 확인하였고, COX-2, iNOS 발현 감소에 따른 항염 효과를 확인하였고, SOD1, SOD2, CAT 발현 감소에 따른 항산화 효과를 확인하였고, H2O2 산화 독성으로부터 항산화 효과를 확인하였으며, 자외선 자극, 블루라이트로부터의 피부 보호(피부세포보호) 확인하였으며, 창상 치유, 항노화효능을 확인하였다. 또한, 멜라닌 함량을 감소시켜 미백 효능을 확인하였으며, 우수한 모공 수축, 피지 억제, 여드름 개선, 가려움증 완화 효능, HMOX1, NQO1, FTL, TXNRD1 유전자 발현 증가를 통한 스트레스 억제 효능 또한 있음을 확인하였다. 이러한 우수한 효능을 통해, 본 발명의 조성물은 피부 개선 용도로 유용하게 사용될 수 있음을 확인하였다.

본 발명에 있어서, 상기 무화과, 망고, 포도 및 가지의 복합 추출물은 조성물의 총 중량에 대하여 0.1 내지 10 중량%로 함유할 수 있다.

본 발명에 있어서, 상기 피부 외용제 조성물은 화장료 조성물 또는 약제학적 조성물일 수 있다.

상기 화장료 조성물에 있어서는, 화장품 제제에 있어서 수용가능한 담체를 포함할 수 있다. 여기서, "화장품 제제에 있어서 수용가능한 담체"란 화장품 제제에 포함될 수 있는 이미 공지되어 사용되고 있는 화합물 또는 조성 물이거나 앞으로 개발될 화합물 또는 조성물로서 피부와의 접촉시 인체가 적응 가능한 이상의 독성, 불안정성 또는 자극성이 없는 것을 말한다. 상기 담체는 본 발명의 피부 외용제 조성물에 그것의 전체 중량에 대하여 약 1 중량% 내지 약 99.99 중량%, 바람직하게는 조성물의 중량의 약 90 중량% 내지 약 99.99 중량%로 포함될 수 있다. 그러나 상기 비율은 본 발명의 피부 외용제 조성물이 제조되는 제형에 따라 또 그것의 구체적인 적용 부위 (얼굴, 목 등)나 그것의 바람직한 적용량 등에 따라 달라지는 것이기 때문에, 상기 비율은 어떠한 측면으로든 본 발명의 범위를 제한하는 것으로 이해되어서는 안 된다.

상기 담체로서는 알코올, 오일, 계면활성제, 지방산, 실리콘 오일, 습윤제, 보습제, 점성 변형제, 유제, 안정제, 자외선산란제, 자외선흡수제, 발색제, 향료 등이 예시될 수 있다. 상기 알코올, 오일, 계면활성제, 지방산, 실리콘 오일, 습윤제, 보습제, 점성 변형제, 유제, 안정제, 자외선산란제, 자외선흡수제, 발색제, 향료로 사용될 수 있는 화합물 또는 조성물 등은 이미 당업계에 공지되어 있기 때문에 당업자라면 적절한 해당 물질 또는 조성물을 선택하여 사용할 수 있다.

본 발명에 따른 피부 외용제 조성물은 다양한 형태로 제조될 수 있는데, 예컨대, 화장수, 에센스, 젤, 에멀젼, 로션, 크림 (수중유적형, 유중수적형, 다중상), 용액, 현탁액 (무수 및 수계), 무수 생성물 (오일 및 글리콜계), 젤, 마스크, 팩, 분말, 또는 젤라틴 등의 피막이 있는 캅셀 (소프트 캅셀, 하드 캅셀) 제형 등의 형태로 제조될 수 있다.

또한, 적합한 화장품의 제형으로는, 예를 들면 용액, 겔, 고체 또는 반죽 무수 생성물, 수상에 유상을 분산시켜 얻은 에멀젼, 현탁액, 마이크로에멀젼, 마이크로캡슐, 미세과립구 또는 이온형 (리포좀), 비이온형의 소낭 분산 제의 형태, 크림, 스킨, 로션, 파우더, 연고, 스프레이 또는 콘실스틱의 형태로 제공될 수 있다. 또한, 포말 (foam)의 형태 또는 압축된 추진제를 더 함유한 에어로졸 조성물의 형태로도 제조될 수 있다.

또한, 본 발명의 피부 외용제 조성물은 추가로 지방 물질, 유기 용매, 용해제, 농축제 및 겔화제, 연화제, 항산 화제, 현탁화제, 안정화제, 발포제 (foaming agent), 방향제, 계면활성제, 물, 이온형 또는 비이온형 유화제, 충 전제, 금속이온봉쇄제 및 킬레이트화제, 보존제, 비타민, 차단제, 습윤화제, 필수 오일, 염료, 안료, 친수성 또는 친유성 활성제, 지질 소낭 또는 화장품에 통상적으로 사용되는 임의의 다른 성분과 같은 화장품학 또는 피부 과학 분야에서 통상적으로 사용되는 보조제를 함유할 수 있다. 그리고, 상기의 성분들은 피부과학 분야에서 일반적으로 사용되는 양으로 도입될 수 있다.

본 발명에 있어서의 피부는 얼굴 뿐만 아니라, 두피, 전신도 포함되는 개념으로, 이러한 두피에 적용될 수 있는 피부 외용제 조성물로써, 샴푸, 린스, 트리트먼트, 발모제 등이 있고, 전신에 적용될 수 있는 바디클렌져 등의 용도로써 다양한 형태로 제조될 수 있다.

따라서, 본 발명에 따른 피부 외용제 조성물은 피부 재생, 창상 치유, 주름 개선, 항노화, 피부 장벽 강화, 항산화 등의 기능성 화장품의 형태를 포함한다.

본 발명에 있어서, 상기 피부 외용제 조성물은 피부 상태 개선을 위한 약제학적 조성물로써 기능할 수 있다.

본 발명의 약학적 조성물은 통상의 방법에 따른 약학적으로 허용되는 담체, 부형제 또는 희석제를 더 포함할 수 있다. 약학적으로 허용되는 담체는 투여 경로나 제형에 따라 당업계에 주지되어 있으며, 구체적으로는 '대한민국약전'을 포함한 각국의 약전을 참조할 수 있다. 본 발명의 조성물에 포함될 수 있는 담체, 부형제 및 희석제로는 락토오스, 덱스트로오스, 수크로오스, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말티톨, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로오스, 메틸 셀룰로오스, 미정질 셀룰로오스, 폴리비닐 피롤리돈, 물, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트 및 광물유를 들 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 또한, 본 발명의 조성물에 포함될 수 있는 담체, 부형제 및 희석제는 비자연적 담체일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

본 발명의 약학적 조성물은 통상의 방법에 따라 산제, 과립제, 정제, 캡슐제, 현탁액, 에멀젼, 시럽, 에어로졸 등의 경구형 제형, 외용제, 좌제 또는 멸균 주사용액의 형태로 제형화하여 사용될 수 있다. 상세하게는, 제형화할 경우 보통 사용하는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 조제될 수 있다. 경구투여를 위한 고형제제에는 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제 등이 포함되며, 이러한 고형제제는 상기 화합물에 적어도 하나 이상의 부형제, 예를 들면, 전분, 칼슘카보네이트, 수크로오스, 락토오스, 젤라틴 등을 섞어 조제될 수 있다. 또한, 단순한 부형제 이외에 마그네슘 스테아레이트, 탈크 같은 윤활제들도 사용될 수 있다. 경구투여를 위한 액상 제제로는 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제 등이 해당되는데, 흔히 사용되는 단순 희석제인 물, 액체 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등이 포함될 수 있다. 비경구 투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결건조 제제 및 좌제가 포함된다. 비수성용제, 현탁제로는 프로필렌글리콜, 폴리에틸렌 글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 오일, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다. 좌제의 기제로는 위텝솔, 마크로골, 트윈 61, 카카오지, 라우린지, 글리세로젤라틴 등이 사용될 수 있다. 약학적 조성물의 구체적인 제제화와 관련하여서는 당업계에 공지되어 있으며, 예컨대 문헌[Remington's Pharmaceutical Sciences(19th ed., 1995)] 등을 참조할 수 있다. 상기 문헌은 본 명세서의 일부로서 간주 된다.

본 발명의 약학적 조성물은 약학적으로 유효한 양으로 투여한다. 상기 약학적으로 유효한 양은 의학적 치료에 적용 가능한 합리적인 수혜/위험 비율로 질환을 치료하기에 충분하며 부작용을 일으키지 않을 정도의 양을 의미하며, 유효 용량 수준은 환자의 건강상태, 질환의 종류, 중증도, 약물의 활성, 약물에 대한 민감도, 투여 방법, 투여 시간, 투여 경로 및 배출 비율, 치료기간, 배합 또는 동시 사용되는 약물을 포함한 요소 및 기타 의학 분야에 잘 알려진 요소에 따라 결정될 수 있다. 투여량 및 횟수는 어떠한 면에서든 본 발명의 범위를 제한하는 것은 아니다.

본 발명의 약학적 조성물은 쥐, 개, 고양이, 소, 말, 돼지, 인간 등의 포유동물에 다양한 경로를 통해 투여될 수 있으며, 인간인 경우가 바람직할 수 있다. 투여의 모든 방식은 예상될 수 있으며, 예를 들어 경구, 정맥, 근육 또는 피하 주사에 의해 투여될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

본 발명의 피부 외용제 조성물은, 의약외품 조성물일 수 있다.

본 발명의 의약외품 조성물에는 상기 성분 외에 필요에 따라 약학적으로 허용가능한 담체, 부형제 또는 희석제를 더욱 포함할 수 있다. 상기 약학적으로 허용가능한 담체, 부형제 또는 희석제는 본 발명의 효과를 해하지 않는한 특히 제한되지 않으며, 예를 들어 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제, 윤활제, 감미제, 방향제, 보존제 등을 포함할 수 있다.

의약외품 조성물은 소독 청결제, 샤워폼, 연고액, 물티슈, 코팅제 등을 예시할 수 있으나 이에 제한되는 것이 아니며, 의약외품의 제제화 방법, 용량, 이용방법, 구성성분 등은 기술분야에 공지된 통상의 기술로부터 적절히 선택될 수 있다.

본 발명에 따른 천연 복합 추출물은 주름 개선, 항노화, 피부 장벽 강화, 항산화, 피부재생, 창상 치유등의 피부 개선 효과를 가지는 바, 피부 개선용 화장료, 의약 등의 소재로써 유용하게 사용될 수 있다.

이하, 실시예를 통하여 본 발명의 구성 및 효과를 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 예시하기 위한 것일 뿐, 본 발명의 범위가 이에 의해 한정되는 것은 아니다.

실시예 1: 본 발명에 따른 조성물 제조

본 발명에 따른 조성물을 수득하기 위하여 깨끗하게 수세한 80 g 무화과, 200 g 망고, 200 g 포도, 200 g 가지를 정제수 20 L에 104 ℃에서 4시간동안 가열하여 열수추출을 진행하였다. 추출 후 mesh로 여과하여 고형분을 제거하고, 복합 추출물을 얻었다.

실험예 1: 피부세포 무자극 효과 확인 시험

본 발명의 조성물이 피부 세포에서 독성을 일으켜 피부자극에 유발되는지 알아보기 위해, 세포생존률을 측정하는 MTT assay를 진행하였다.

HaCaT 세포(keratinocyte, 각질형성세포), Detroit 세포(fibroblast, 섬유아세포)를 각각 10% FBS(Fetal Bovine Serum), 1% Antibiotic-Antimycotic이 함유된 DMEM(Dubelcco's Modified Eagle's Medium)과 함께 96-well plate에 분주하고, 5% CO₂, 37℃의 조건인 항온기에서 24시간 배양하였다. 이 후 정제수를 첨가한 대조군과 시험물질인 조성물을 최종 1, 5, 10%인 농도가 되도록 세포에 처리하고, 24시간 동안 추가 배양하였다. 이어 5 mg/mL MTT(3-(4, 5-dimethyl-2-thiazolyl)-2,5-diphenyl-2H-tetrazolium bromide) 용액을 각 well에 4 μL씩 첨가하고, 4시간 동안 배양하여 반응시켰다. 배양액을 제거한 다음 DMSO(Dimethyl sulfoxide) 용액 100 μL씩 첨가하여 세포를 용해시킨 후, 540 nm에서 흡광도를 측정하였다.

시료	처리 농도 (%)	HaCaT 세포 생존률(%)	Detroit 세포 생존률(%)
대조군	-	100.00	100.00
시험군	0.5	101.02	105.6
	1	103.80	110.2
	2	108.26	109.8

그 결과, 본 발명의 조성물은 1 ~ 10% 처리 농도에서 피부세포 내 독성을 보이지 않아 자극이 없음을 확인하였다. 따라서 상기 조성물은 피부 자극 유발 가능성이 낮고 안전한 물질임을 의미한다.

실험예 2: PIP 생성 증가에 따른 주름 개선 효과 확인 시험

본 발명에 따른 조성물의 주름 개선 효과를 살펴보기 위하여, 콜라겐의 합성의 전구체인 프로콜라겐(Procollagen Type I C-Peptide, PIP)의 생합성양을 측정하였다.

이를 위하여 Detroit551 세포를 48-well plate에 분주한 후, 세포 배양 조건에서 24시간 배양하였다. 이 후 대조군과 시험물질인 조성물을 세포에 처리하고, 48시간 동안 추가 배양하였다. 이때, 양성대조군으로 TGF-beta 5 ng/mL 사용하였다. 이어 배양한 배지의 상층액을 희석한 일부 20 μL를 취해 PIP EIA Kit(Takara, Cat. MK101) 내 PIP 표준물질 20 μL와 함께 각각 antibody coated microtiter plate에 넣고 100 μL의 peroxidase 표식 antibody solution을 또한 각 well에 첨가하여, 37 ℃에서 3시간 동안 반응시켰다. 배지를 제거하여 200 μL의 PBS로 4회 세척한 후, 각 well에 100 μL의 substrate solution을 첨가하고 차광한 상태에서 15분간 실온에서 반응시켰다. 이 후 100 μL stop solution (1 N H₂SO₄)을 첨가하고, 450 nm에서의 흡광도를 측정하였다.

시료	처리 농도 (%)	PIP 합성능(%)
대조군	-	100.00
양성 대조군	-	130.20
시험군	0.5	110.09
	1	129.20
	2	118.81

그 결과, 본 발명의 조성물을 농도별 처리한 세포에서 대조군 대비 PIP 양이 증가하여 상기 조성물은 주름 개선에 효과가 있을 것으로 확인하였다.

실험예 3: AQP3과 FLG 발현 증가에 따른 보습 및 피부장벽 개선 효과 확인 시험

본 발명에 따른 조성물의 보습 및 피부장벽 개선 효능을 살펴보기 위하여, 수분/glycerol 수송체인 AQP3(Aquaporin)와 자연보습인자로 알려진 FLG(Filaggrin)의 발현양 변화를 알아보았다.

HaCaT 세포를 96-well plate에 분주한 후, 세포 배양 조건에서 24시간 배양하였다. 이후 대조군과 시험물질인 조성물을 세포에 처리하고, 24시간 동안 추가 배양하였다. 이때, 양성대조군으로 Glyceryl glucoside 1% 사용하였다. AQP3와 FLG의 유전자 수준에서 확인하기 위해 Real-time PCR 법을 수행하였으며, 그 시험 순서는 다음과 같다.

RNA isolation과 cDNA합성을 위해 SuperPrep^TMcell lysis & RT Kit for qPCR(TOYOBO, Cat.SCQ-101)을 사용하였다. 배지를 제거한 세포를 PBS로 한 번 세척하고, 50 μL cell lysis mixture 를 넣고 5분간 반응시킨 후, stop solution을 첨가하였다. RT reaction mixture 32 μL에 앞서 추출한 lysate 8 μL를 첨가하고 PCR을 이용하여 37 ℃ 15분, 50 ℃ 5분, 95 ℃ 5분 조건에서 cDNA를 합성하였다. 유전자의 발현을 비교분석하기 위하여 상기에서 합성한 cDNA를 template로 하고, Thunderbird^TM SYBR qPCR Mix(TOYOBO,Cat.QPS-201)를 이용하여 Real-time PCR 분석을 진행하였다. 실험에 사용한 primer는 Qiagen사의 QuantiTect　primer assays (GAPDH; Cat. QT01192646, AQP3; Cat. QT00212996, FLG; Cat. QT02448138)이며 시료의 AQP3, FLG mRNA 발현량은 GADPH로 정량하였다. Real-time qPCR 조건은 먼저 95 ℃ 1분 반응 후, 1 사이클 당 94 ℃ 15초, 60 ℃ 30초, 72 ℃ 30초로 하여 총 40 사이클로 진행하였다.

시료	처리 농도 (%)	AQP3	FLG
대조군	-	1.00	1.00
양성대조군	-	1.59	3.12
시험군	0.5	1.12	1.93
	1	1.50	2.31
	2	1.72	2.80

그 결과, 본 발명의 조성물을 농도별 처리한 세포에서 대조군 대비 AQP3와 FLG의 mRNA 발현양이 증가하여 상기 조성물은 보습과 피부장벽 개선에 효과가 있을 것으로 확인하였다.

실험예 4: COX-2, iNOS 발현 감소에 따른 항염증 효과 확인 시험

본 발명에 따른 조성물의 항염증 효과를 살펴보기 위하여, 염증 반응에 관여하는 COX-2(Cyclooxygenase-2), iNOS(inducible Nitric Oxygen Synthase)의 발현양 변화를 알아보았다.

이를 위하여 HaCaT 세포를 96-well plate에 분주한 후, 세포 배양 조건에서 24시간 배양하였다. 이후 UVB 조사를 통해 염증반응을 유도하고, 대조군과 시험물질인 조성물을 세포에 처리하고, 4시간 동안 추가 배양하였다. 이때, 양성대조군으로 Dexamethasone 5 μM을 사용하였다. COX-2의 유전자 수준에서 확인하기 위해 Real-time PCR 법을 수행하였으며, 그 시험 순서는 다음과 같다.

RNA isolation과 cDNA합성을 위해 RNA isolation과 cDNA합성을 위해 SuperPrep^TMcell lysis & RT Kit for qPCR(TOYOBO, Cat.SCQ-101)을 사용하였다. 배지를 제거한 세포를 PBS로 한 번 세척하고, 50 μL cell lysis mixture 를 넣고 5분간 반응시킨 후, stop solution을 첨가하였다. RT reaction mixture 32 μL에 앞서 추출한 lysate 8 μL를 첨가하고 PCR을 이용하여 37 ℃ 15분, 50 ℃ 5분, 95 ℃ 5분 조건에서 cDNA를 합성하였다. 유전자의 발현을 비교분석하기 위하여 상기에서 합성한 cDNA를 template로 하고, Thunderbird^TM SYBR qPCR Mix(TOYOBO,Cat.QPS-201)를 이용하여 Real-time PCR 분석을 진행하였다. 실험에 사용한 primer는 Qiagen사의 QuantiTect　primer assays (GAPDH; Cat. QT01192646, COX-2; Cat. QT00040586, iNOS; Cat. QT01323189)이며 시료의 COX-2, iNOS mRNA 발현량은 GADPH로 정량하였다. Real-time qPCR 조건은 먼저 95 ℃ 1분 반응 후, 1 사이클 당 94 ℃ 15초, 60 ℃ 30초, 72 ℃ 30초로 하여 총 40 사이클로 진행하였다.

시료	처리 농도 (%)	UVB	COX-2	iNOS
대조군(-)	-	-	0.23	0.75
대조군	-	+	1.00	1.00
양성대조군	-	+	0.72	0.85
시험군	0.5	+	0.72	0.83
	1	+	0.92	0.87
	2	+	0.72	0.71

그 결과, 본 발명의 조성물을 농도별 처리한 세포에서 대조군(UVB 처리) 대비 COX-2, iNOS의 mRNA 발현양이 감소하여 상기 조성물은 항염증 효과가 있을 것으로 확인하였다.

실험예 5: 항산화 효과 확인실험

실험예 5-1: SOD1, SOD2, CAT 발현 감소에 따른 항산화 효과 확인 시험

본 발명에 따른 조성물의 보습 및 피부장벽 개선 효능을 살펴보기 위하여, 호기성 물질대사에서 생성되는 독성물질인 H₂O₂나 활성산소종(ROS)의 분해 작용에 관여하는 것으로 알려져 있는 SOD1(Superoxide Dismutase 1), SOD2(Superoxide Dismutase 2), CAT(Catalase)의 발현양 변화를 알아보았다.

HaCaT 세포를 96-well plate에 분주한 후, 세포 배양 조건에서 24시간 배양하였다. 이후 대조군과 시험물질인 조성물을 세포에 처리하고, 24시간 동안 추가 배양하였다. 이때 양성대조군으로 N-acetyl-L-cysteine(NAC) 2 mM을 사용하였다. SOD1, SOD2, CAT의 유전자 수준에서 확인하기 위해 Real-time PCR 법을 수행하였으며, 그 시험 순서는 다음과 같다.

RNA isolation과 cDNA 합성을 위해 SuperPrep^TMcell lysis & RT Kit for qPCR(TOYOBO, Cat.SCQ-101)을 사용하였다. 배지를 제거한 세포를 PBS로 한 번 세척하고, 50 μL cell lysis mixture 를 넣고 5분간 반응시킨 후, stop solution을 첨가하였다. RT reaction mixture 32 μL에 앞서 추출한 lysate 8 μL를 첨가하고 PCR을 이용하여 37 ℃ 15분, 50 ℃ 5분, 95 ℃ 5분 조건에서 cDNA를 합성하였다. 유전자의 발현을 비교분석하기 위하여 상기에서 합성한 cDNA를 template로 하고, Thunderbird^TM SYBR qPCR Mix(TOYOBO,Cat.QPS-201)를 이용하여 Real-time PCR 분석을 진행하였다. 실험에 사용한 primer는 Qiagen사의 QuantiTect　primer assays (GAPDH; Cat. QT01192646, SOD1; Cat. QT01008651, SOD2; Cat. QT01008693, CAT; Cat. QT00079674)이며 시료의 SOD1, SOD2, CAT mRNA 발현량은 GADPH로 정량하였다. Real-time qPCR 조건은 먼저 95 ℃ 1분 반응 후, 1 사이클 당 94 ℃ 15초, 60 ℃ 30초, 72 ℃ 30초로 하여 총 40 사이클로 진행하였다.

시료	처리 농도 (%)	SOD1	SOD2	CAT
대조군(-)	-	1.00	1.00	1.00
양성대조군	-	1.49	1.52	1.62
시험군	0.5	1.92	1.26	1.23
	1	2.10	2.30	1.89
	2	1.98	1.46	2.10

그 결과, 본 발명의 조성물을 농도별 처리한 세포에서 대조군 대비 SOD1, SOD2, CAT의 mRNA 발현양이 증가하여 상기 조성물은 항산화 효능에 효과가 있을 것으로 확인하였다.

실험예 5-2: H ₂ O ₂ 산화 독성으로부터 항산화 효과 확인 시험

본 발명에 따른 조성물의 H₂O₂산화 독성으로부터 항산화효과를 살펴보기 위하여, H₂O₂에 의한 세포생존률의 변화를 알아보았다.

이를 위하여 HaCaT 세포를 48-well plate에 분주한 후, 세포 배양 조건에서 24시간 배양하였다. 이후 1 mM H₂O₂를 조사하고, 대조군과 시험물질인 조성물을 세포에 처리하여 12~16시간 동안 추가 배양하였다. 이때 양성대조군으로 N-acetyl-L-cysteine(NAC) 2 mM을 사용하였다. 이후 H₂O₂산화 독성 유도에 의한 피부세포의 손상을 보호하는지 확인하고자 MTT assay를 이용하여 세포 생존율을 측정하였다.

시료	처리 농도 (%)	HaCaT 세포 생존률 (%)
대조군(-)	-	100.00
대조군(+)	-	60.33
양성대조군	-	88.8
시험군	0.5	66.56
	1	76.73
	2	79.46

그 결과, 본 발명의 조성물을 농도별 처리한 세포에서 대조군(+H₂O₂) 대비 H₂O₂처리에 의한 세포 사멸이 저해되어 상기 조성물은 H₂O₂산화 독성으로부터 항산화 효과가 있을 것으로 확인하였다.

실험예 6: 자외선 자극으로부터 피부세포 보호 효과 확인 시험

본 발명에 따른 조성물의 자외선 자극으로부터 피부세포 보호 효과를 살펴보기 위하여, 세포생존률의 변화를 알아보았다.

이를 위하여 HaCaT 세포를 96-well plate에 분주한 후, 세포 배양 조건에서 24시간 배양하였다. 이후 UVB를 조사하고, 대조군과 시험물질인 조성물을 세포에 처리하여 24시간 동안 추가 배양하였다. 이어 자외선 유도에 의한 피부세포의 손상을 보호하는지 확인하고자 MTT assay를 이용하여 세포 생존율을 측정하였다.

시료	처리 농도 (%)	UVB	HaCaT 세포 생존률 (%)
대조군	-	-	100.00
대조군	-	+	45.63
시험군	0.5	+	45.69
	1	+	50.23
	2	+	49.85

그 결과, 본 발명의 조성물을 농도별 처리한 세포에서 대조군(+UVB) 대비 UVB 처리에 의한 세포 사멸이 저해되어 상기 조성물은 자외선으로부터 세포 보호 효과가 있음을 확인하였다.

실험예 7: 블루라이트 유도로부터 피부세포 보호 효과 확인 시험

본 발명에 따른 조성물의 블루라이트 자극으로부터 피부세포 보호 효과를 살펴보기 위하여, 세포생존률의 변화를 알아보았다.

이를 위하여 HaCaT 세포를 96-well plate에 분주한 후, 세포 배양 조건에서 24시간 배양하였다. 이후 대조군과 시험물질인 조성물을 세포에 처리하고, 2시간 후 Topview 5450 VRI SMD LED (ITSWELL, Cat. IWS-L5056-VRI-K3)를 이용하여 블루라이트를 6시간 조사한 후, 24시간 동안 세포를 추가 배양하였다. 이어 블루라이트 유도에 의한 피부세포의 손상을 보호하는지 확인하고자 MTT assay를 이용하여 세포 생존율을 측정하였다.

시료	처리 농도 (%)	블루라이트	HaCaT 세포 생존률 (%)
대조군	-	-	100.00
대조군	-	+	75.23
시험군	0.5	+	75.90
	1	+	82.10
	2	+	83.42

그 결과, 본 발명의 조성물을 농도별 처리한 세포에서 대조군(+블루라이트) 대비 블루라이트 처리에 의한 세포 사멸이 저해되어 상기 조성물은 블루라이트로부터 세포 보호 효과가 있음을 확인하였다.

실험예 8: Wound healing를 이용한 창상치유, 항노화 효능 시험

본 발명에 따른 조성물의 피부세포 재생 효과를 살펴보기 위하여, Wound healing assay를 이용하여 시험물질에 의한 세포 proliferation 및 migration을 촉진하는지의 유무를 관찰하여 항노화 효능을 평가하고자 하였다.

이를 위하여 HaCaT 세포를 24-well plate에 분주한 후, insert와 함께 세포 배양 조건에서 24시간 배양하였다. 이 후 대조군과 시험물질인 조성물을 세포에 처리하고, 24시간 동안 추가 배양하였다. 이 때 양성대조군으로 200 ng/ml EGF를 사용하였다. 물질처리 후 0시간대에 cell image를 현미경 사진으로 찍고 37 ℃, 5% CO2의 조건으로 배양하였다. 물질처리 후 18-20 시간동안 추가배양 후 배지를 제거하고 fixing solution(4% paraformaldehyde)으로 넣고 15분간 상온에서 incubation하고 PBS로 3번 washing하였다. Fixed cells은 4 ℃에서 한달 동안 보관이 가능하였다. Wound healing이 된 정도는 현미경으로 사진을 찍어 Image J라는 프로그램을 이용하여 계산하였다.

시료	처리 농도 (%)	Healing area (%)
대조군	-	23.50
양성대조군	-	45.23
시험군	0.5	28.61
	1	33.69
	2	35.20

그 결과, 본 발명의 조성물은 농도별 처리한 세포에서 healing area가 증가함을 확인하여, 상기 조성물은 피부세포 재생 효과가 있을 것으로 확인하였다.

실험예 9: melanin 함량 측정에 의한 미백효과 확인 시험

본 발명에 따른 조성물의 미백효과를 확인하기 위해 멜라닌 형성에 중요한 역할을 하는 melanin 함량에 미치는 영향을 시험하였다.

이를 위하여 B16F1 세포를 6-well plate에 70% confluence 씩 분주한 후, 세포 배양 조건에서 24시간 배양한다. 이후 시료를 세포에 처리하고, 72시간 동안 추가 배양한다. 이때 양성대조군 Kojic acid 100 ppm도 함께 처리한다. 또한 100 nM α-MSH를 시료와 함께 넣어 멜라닌 생성을 촉진시킨다. 배양이 끝난 후, 배지의 상층액을 제거하고, 1X Trypsin-EDTA를 넣어 세포를 수확한다. (72시간 처리 후, 세포가 일부 부유하고 있을 경우 scraper로 바닥에 있는 세포를 모두 떨어트려 수확한다.) 세포 pellet에 1 N NaOH 용액을 200~300 μL 첨가하고, 100 ℃에서 30분 동안 끓여 멜라닌을 용해시킨다. 용해된 멜라닌 용액은 96-well plate에 일부를 취하여 405 nm에서 흡광도를 측정한다. 각 시료의 흡광도 값을 단백질 양으로 정량하고, 멜라닌 합성능을 백분율로 표시하였다.

시료	처리 농도 (%)	melanin 억제능 (%)
대조군	-	0
양성대조군	-	36.24
시험군	0.5	5.80
	1	7.96
	2	13.26

그 결과, 본 발명의 조성물을 농도별 처리한 세포에서 대조군 대비 멜라닌 양이 감소하여 상기 조성물은 미백에 효과가 있을 것으로 확인하였다.

실험예 10: 모공수축효과 시험 (In vitro Test)

본 발명에 따른 조성물의 모공 수축 효과를 측정하기 위해 상기 실시예에서 제조된 조성물을 대상으로 피부를 대신할 단백질로 헤모글로빈을 사용하여 모공수축효과를 시험하였다.

0.9% Phosphate Buffer Saline (0.1 mM, pH 7.4)으로 헤모글로빈 용액(0.05g/50ml)을 제조하여 헤모글로빈 용액 2 ml에 에델바이스 식물세포 및 부정근 세포배양추출물 2 ml을 가한 후, 30초 동안 진탕 혼합한 다음 3,500 rpm에서 10분 동안 원심분리하고, 그 상등액 1 ml에 정제수 2 ml을 가하여 407 nm에서 UV-Visible spectrum으로 측정하였다.

대조군으로는 PBS(Phosphate Buffer Saline) 2 ml을 가하였다.

시료	처리 농도 (%)	헤모글라빈의 침전 (%)
대조군 (PBS)	-	0.5
양성대조군(탄닌산)	1	30
시험군	0.5	1
	1	5
	2	9

그 결과, 본 발명의 조성물의 헤모글로빈의 침전량을 측정하여 수축효과를 평가하였고, 헤모글로빈의 침전(%)가 높을수록 모공수축 효과가 우수한 것으로 판별하여, 상기 조성물은 모공수축 효과가 있을 것으로 확인하였다.

실험예 11: 피지 억제효과 실험

본 발명에 따른 조성물의 피지억제효과를 확인하기 위하여, 피시험자 10명의 4주 후에 피부 유분 측정기(Sebum meter SM810)를 이용하여 피부의 피지분비량을 측정하였다. 실험은 22±2 ℃, 40±5％ humidity에서 이루어졌다. 지성 피부인 경우 측정값이 220 ㎍/cm²이상이고, 정상 피부인 경우 100∼220 ㎍/cm²이다. 대조군으로 정제수를 사용하였고, 실험결과는 표와 같다

시료	처리 농도 (%)	피지 억제효과
		0 일 (사용 전)	28 일 (사용 전)
대조군	-	230	221
시험군	0.5	231	190
	1	229	175
	2	232	171

그 결과, 본 발명의 조성물을 농도별 처리한 피부에서 대조군 대비 피지가 감소하여 상기 조성물은 피지 억제에 효과가 있을 것으로 확인하였다.

실험예 12 : 여드름 개선 효과

여드름이 발생한 남녀 10명으로 대상으로 화장수를 아침, 저녁으로 4주간 얼굴 전체에 실시예 1에서 제조한 조성물을 고루 바르도록 하였다. 여드름 개선 효과의 판정은 실험에 참가한 본인이 느끼는 정도에 따라 하기 판정기준을 참고로 1-3점으로 시험 전 상태를 평가한 뒤 여드름 치유 효과를 평가하도록 하여 그 결과를 표에 나타내었다.

<시험전 상태의 평가>

1 = 여드름 조금 있음 2 = 여드름 약간 있음 3 = 여드름 심함

<여드름 효과 판정>

- : 효과 거의 없음, + : 약간의 효과 있음, ++ : 많이 완화,

+++: 완전히 치유됨

피험자	시험 전 상태	2주 경과후 효과	4주 경과후 효과
피험자1	2		+
피험자2	1	+	++
피험자3	1	-	+
피험자4	2	+	-
피험자5	2	+	++
피험자6	2	+	+
피험자7	3	++	+++
피험자8	2	-	++
피험자9	3	++	+++
피험자10	2	+	++

그 결과, 본 발명의 조성물이 함유된 유연 화장수를 4주간 사용한 후 대다수 피험자들에서 여드름의 개선 효과를 확인할 수 있다.

실험예 13 : 사이토카인 유전자 발현 분석에 의한 가려움증 완화 효과

본 발명에 의한 조성물이 가려움증 억제 및 완화효과를 확인하기 위하여, IL-4, IL-33, TSLP mRNA 발현 수준을 분석하였다.

HaCaT 세포를 96-well plate에 분주한 후, 세포 배양 조건에서 24시간 배양하였다. 이후 대조군과 시험물질인 조성물을 세포에 처리하고, 24시간 동안 추가 배양하였다. IL-4, IL-33, TSLP의 유전자 수준에서 확인하기 위해 Real-time PCR 법을 수행하였으며, 그 시험 순서는 다음과 같다.

RNA isolation과 cDNA 합성을 위해 SuperPrep^TMcell lysis & RT Kit for qPCR(TOYOBO, Cat.SCQ-101)을 사용하였다. 배지를 제거한 세포를 PBS로 한 번 세척하고, 50 μL cell lysis mixture 를 넣고 5분간 반응시킨 후, stop solution을 첨가하였다. RT reaction mixture 32 μL에 앞서 추출한 lysate 8 μL를 첨가하고 PCR을 이용하여 37 ℃ 15분, 50 ℃ 5분, 95 ℃ 5분 조건에서 cDNA를 합성하였다. 유전자의 발현을 비교분석하기 위하여 상기에서 합성한 cDNA를 template로 하고, Thunderbird^TM SYBR qPCR Mix(TOYOBO,Cat.QPS-201)를 이용하여 Real-time PCR 분석을 진행하였다. 실험에 사용한 primer는 Qiagen사의 QuantiTect　primer assays (GAPDH; Cat. QT01192646, Interleukin 4 (IL-4); Cat. #QT00012565, Thymic Stromal Lymphopoietin (TSLP); Cat. #QT00051464, Interleukin 33 (IL-33); Cat. #QT00041559)이며 시료의 IL-4, IL-33, TSLP mRNA 발현량은 GADPH로 정량하였다. Real-time qPCR 조건은 먼저 95 ℃ 1분 반응 후, 1 사이클 당 94 ℃ 15초, 60 ℃ 30초, 72 ℃ 30초로 하여 총 40 사이클로 진행하였다.

시료	처리 농도 (%)	IL-4	TSLP	IL-33
대조군(-)	-	1.00	1.00	1.00
시험군	0.5	1.10	0.98	1.05
	1	0.76	0.92	0.91
	2	0.67	0.88	0.82

그 결과, 본 발명의 조성물을 농도별 처리한 세포에서 대조군 대비 IL-1, TSLP, IL-33의 mRNA 발현양이 감소하여 상기 조성물은 가려움증 완화 효능에 효과가 있을 것으로 확인하였다.

실험예 14 : HMOX1, NQO1, FTL, TXNRD1 유전자 발현에 의한 스트레스 억제 효과

본 발명에 의한 조성물이 스트레스 억제 효과를 확인하기 위하여, HMOX1, NQO1, FTL, TXNRD1 mRNA 발현 수준을 분석하였다.

HaCaT 세포를 96-well plate에 분주한 후, 세포 배양 조건에서 24시간 배양하였다. 이후 대조군과 시험물질인 조성물을 세포에 처리하고, 24시간 동안 추가 배양하였다. HMOX1, NQO1, FTL, TXNRD1의 유전자 수준에서 확인하기 위해 Real-time PCR 법을 수행하였으며, 그 시험 순서는 다음과 같다.

RNA isolation과 cDNA 합성을 위해 SuperPrep^TMcell lysis & RT Kit for qPCR(TOYOBO, Cat.SCQ-101)을 사용하였다. 배지를 제거한 세포를 PBS로 한 번 세척하고, 50 μL cell lysis mixture 를 넣고 5분간 반응시킨 후, stop solution을 첨가하였다. RT reaction mixture 32 μL에 앞서 추출한 lysate 8 μL를 첨가하고 PCR을 이용하여 37 ℃ 15분, 50 ℃ 5분, 95 ℃ 5분 조건에서 cDNA를 합성하였다. 유전자의 발현을 비교분석하기 위하여 상기에서 합성한 cDNA를 template로 하고, Thunderbird^TM SYBR qPCR Mix(TOYOBO,Cat.QPS-201)를 이용하여 Real-time PCR 분석을 진행하였다. 실험에 사용한 primer는 Qiagen사의 QuantiTect　primer assays (GAPDH; Cat. QT01192646, HMOX1; Cat. #QT00092645, NQO1; Cat. #QT00050281, FTL; Cat. #QT00055860, TXNRD1; Cat. #QT00055902)이며 시료의 HMOX1, NQO1, FTL, TXNRD1 mRNA 발현량은 GADPH로 정량하였다. Real-time qPCR 조건은 먼저 95 ℃ 1분 반응 후, 1 사이클 당 94 ℃ 15초, 60 ℃ 30초, 72 ℃ 30초로 하여 총 40 사이클로 진행하였다.

시료	처리 농도 (%)	HMOX1	NQO1	FTL	TXNRD1
대조군(-)	-	1.00	1.00	1.00	1.00
시험군	0.5	1.45	1.40	1.48	1.39
	1	1.68	1.57	1.52	1.49
	2	2.43	1.83	1.61	1.68

그 결과, 본 발명의 조성물을 농도별 처리한 세포에서 대조군 대비 HMOX1, NQO1, FTL, TXNRD1의 mRNA 발현양이 증가하여 상기 조성물은 스트레스 억제 효능에 효과가 있을 것으로 확인하였다.

실시예 2: 피부 외용제 조성물 제조

본 발명에 따른 무화과, 망고, 포도, 및 가지의 복합 추출물을 유효 성분으로 포함하는 피부 외용제 조성물을 제조하기 위하여, 화장수, 에센스, 로션, 크림 및 젤을 각각 제조하였다.

제조예 2-1: 화장수

다음 처방에 따라 통상의 화장수 제조 방법에 따라 제조하였다.

원 료 명	중량 %(w/w)
글리세린	5.0
디프로필렌글리콜	3.0
히아루론산	0.5
폴리옥시에틸렌 경화피마자유	0.1
폴리에틸렌 올레일에틸	0.1
에탄올	5.0
방부제	0.15
항료	적량
착색료	적량
무화과, 망고, 포도, 및 가지의 복합 추출물	1.0
정제수	to 100

제조예 2-2: 에센스

다음 처방에 따라 통상의 에센스 제조 방법에 따라 제조하였다.

원 료 명	중량 %(w/w)
세토스테아릴알코올	1.0
자기유화형모노스테아린산	1.0
밀납	0.5
스쿠알란	5.0
이소세틸옥타노에이트	3.0
디메틸실록산	0.3
모노스테아린산소르비탄	0.5
모노스테아린산폴리에틸렌글리콜	8.0
글리세린	4.0
프로필렌글리콜	0.2
카르복시폴리머	0.22
트리에탄올아민	0.25
방부제	적량
향료	적량
착색료	적량
무화과, 망고, 포도, 및 가지의 복합 추출물	1.0
정제수	to 100

제조예 2-3: 로션

다음 처방에 따라 통상의 로션 제조 방법에 따라 제조하였다.

원료명	중량 %(w/w)
세토스테아릴알코올	0.8
자기유화형모노스테아린산	1.0
밀납	0.5
스테아린산	0.5
유동파라핀	7.0
스쿠알란	5.0
마카데미아오일	3.0
이소세틸옥타노에이트	2.0
디메틸실록산	0.3
모노스테아린산소르비탄	0.5
모노스테아린산폴리에틸렌글리콜	1.2
글리세린	4.0
프로필렌글리콜	4.0
베타인	4.0
카르복시폴리머	0.12
트리에탄올아민	0.15
방부제	0.25
향료	적량
착색료	적량
무화과, 망고, 포도, 및 가지의 복합 추출물	1.0
정제수	to 100

제조예 2-4: 크림

다음 처방에 따라 통상의 크림 제조 방법에 따라 제조하였다.

원 료 명	중량 %(w/w)
세토스테아릴알코올	3.0
자기유화형모노스테아린산	1.5
친유형모노스테아린산	1.5
밀납	0.5
유동파라핀	8.0
스쿠알란	7.0
이소세틸옥타노에이트	4.0
정제호호바유	4.0
디메틸실록산	0.3
모노스테아린산소르비탄	1.0
모노스테아린산폴리에틸렌글리콜	1.2
글리세린	6.0
프로필렌글리콜	4.0
베타인	4.0
산탄검	0.06
트리에탄올아민	0.10
방부제	0.25
향료	적량
착색료	적량
무화과, 망고, 포도, 및 가지의 복합 추출물	1.0
정제수	to 100

제조예 2-5: 젤

다음 처방에 따라 통상의 젤 제조 방법에 따라 제조하였다.

원료명	중량 %(w/w)
글리세린	4.0
프로필렌글리콜	4.0
에탄올	10
폴리옥시에틸렌경화피마자유	0.1
카르복시폴리머	0.30
트리에탄올아민	0.30
방부제	적량
향료	적량
착색료	적량
무화과, 망고, 포도, 및 가지의 복합 추출물	1.0
정제수	to 100

이상의 설명으로부터, 본 발명이 속하는 기술분야의 당업자는 본 발명이 그 기술적 사상이나 필수적 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 실시될 수 있다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 이와 관련하여, 이상에서 기술한 실시예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적인 것이 아닌 것으로 이해해야만 한다. 본 발명의 범위는 상기 상세한 설명보다는 후술하는 특허 청구범위의 의미 및 범위 그리고 그 등가 개념으로부터 도출되는 모든 변경 또는 변형된 형태가 본 발명의 범위에 포함되는 것으로 해석되어야 한다.

Claims (14)

1. 무화과, 망고, 포도, 및 가지의 복합 추출물을 유효성분으로 포함하는 피부 개선용 화장료 조성물로, 상기 피부 개선은 피지 억제인 것인 화장료 조성물.
   
2. 제1항에 있어서,
   상기 피부 개선은 주름 개선 또는 예방인 것인, 화장료 조성물.
   
3. 제1항에 있어서,
   상기 피부 개선은 피부 보습 또는 피부 장벽 개선인, 화장료 조성물.
   
4. 제1항에 있어서,
   상기 피부 개선은 항염인, 화장료 조성물.
   
5. 제1항에 있어서,
   상기 피부 개선은 피부 항산화용인, 화장료 조성물.
   
6. 제1항에 있어서,
   상기 피부 개선은 자외선 또는 블루라이트로부터 피부 보호인 것인, 화장료 조성물.
   
7. 삭제
8. 제1항에 있어서,
   상기 피부 개선은 피부 재생인, 화장료 조성물.
   
9. 제1항에 있어서,
   상기 피부 개선은 피부 미백인, 화장료 조성물.
   
10. 제1항에 있어서,
    상기 피부 개선은 모공수축인, 화장료 조성물.
    
11. 삭제
12. 제1항에 있어서,
    상기 피부 개선은 여드름 개선 또는 예방인, 화장료 조성물.
    
13. 제1항에 있어서,
    상기 피부 개선은 피부 가려움증 완화인, 화장료 조성물.
    
14. 제1항에 있어서,
    상기 피부 개선은 피부 스트레스 억제인, 화장료 조성물.