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KR102676067B1 - 시퀀싱 및 고 해상도 이미징 - Google Patents

시퀀싱 및 고 해상도 이미징 Download PDF

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KR102676067B1
KR102676067B1 KR1020197030228A KR20197030228A KR102676067B1 KR 102676067 B1 KR102676067 B1 KR 102676067B1 KR 1020197030228 A KR1020197030228 A KR 1020197030228A KR 20197030228 A KR20197030228 A KR 20197030228A KR 102676067 B1 KR102676067 B1 KR 102676067B1
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니안동 류
마노하르 알. 퍼타도
리선 팡
노르만 번즈
윈저 오웬즈
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퍼시픽 바이오사이언스 오브 캘리포니아, 인크.
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Abstract

밀집 패킹된 기판으로부터 광학 신호의 검출 식별을 위한 방법 및 시스템이 여기에 개시된다. 이들은 폴리 뉴클레오티드 서열 분석 응용의 효율 및 정확도 개선을 포함하여 광학 시스템의 회절 한계 근처 또는 그 미만의 생체 분자 검출을 위한 광범위한 응용을 갖는다.

Description

시퀀싱 및 고 해상도 이미징
본 출원은 2017년 3월 17일자로 출원된 미국 가출원 제62/473,163호의 이익을 주장하며, 그 전체 내용은 모든 목적을 위해 전체적으로 참고로 포함된다.
기판의 표면에 고정된 단일 분자 분석물의 서브-회절 제한 이미징을 위한 방법 및 시스템이 개시된다.
건강 관리를 개선하기 위해 시퀀싱(sequencing, 서열 분석) 비용을 줄이는 것이 중요하다. 시퀀싱 비용을 책정하기 위한 표준은 90 기가베이스로 정의된, 30X 인간 게놈(genome)의 가격이다.
게놈의 가격은 2007년에서 2011년 사이에 크게 떨어졌으며, 이는 게놈 당 10,000달러 이하로 안정화되었다. 최근에 달성된 중요한 이정표는 1,000달러의 게놈이다. 다음 주요 이정표는 100달러의 게놈으로, 이는 몇 년이 걸릴 것으로 예상된다. 본 발명은 실질적으로 계약된 기간에서 10달러의 게놈을 달성하는 방법을 논의한다. 이 가격대라면, 모든 신생아를 시퀀싱하는 것이 경제적일 것이고, 특히 종약학 분야에서 질병 진단과 검사의 비용 장벽을 훨씬 더 경제적으로 만들 것이다.
시퀀싱 시스템의 주요 비용 구성 요소는 주로 바이오 칩과 시약을 포함하는 소모품이며, 이차적으로 기기 비용이다.
10달러 30X 게놈에 도달하려면, 단위 면적당 데이터량은 100배, 데이터 포인트당 시약량은 100배 정도 감소해야 한다.
제곱 센티미터 당 천만 분자의 클러스터 밀도를 갖는 1,000달러의 게놈 플랫폼의 예에서, 각 분자는 칩 면적의 평균 10um2를 차지한다. 따라서, 평균 유효 피치는 3,160nm이다. 100배 더 적은 복제로 100배 더 높은 밀도를 얻을 수 있다면, 동일한 칩 영역과 시약에 대해 100배 더 많은 정보가 얻어 져 비용이 100배 감소한다. 100배 더 높은 밀도에서, 신규 피치는 320nm로 요구된다. 시약 사용을 균등화 하기 위한 복제의 수는 분자 당 10개의 복제로, 클러스터 당 1,000 개의 복제보다 100배 적다.
따라서, 약 320nm만큼 이격된 단일 분자로부터의 광학 신호를 분석할 수 있는 광학 이미징 시스템이 필요하다. 그러나 이러한 해상도는 로 정의된 빛의 회절 한계로 인해 달성하기가 어렵다. 여기서 는 광의 파장이고, 는 광학 이미징 시스템의 개구 수(numerical aperture)이며, 이는 시퀀싱 및 분석물 검출에 유용한 수성 시스템에서 거의 1에 가깝다. 따라서, 650nm 부근에서 방출된 광학 신호의 검출을 위해, 320nm 간격은 회절 한계에 가깝거나 그 미만이며, 이는 그러한 어레이 상의 개별 특징을 해결하는 것을 막을 수 있다.
Ion Torrent(Thermo Fisher에 의해 구입된)와 옥스포드 나노포어(Oxford Nanopore)와 같은 회사에서 개발한 전기 기반 시스템과 같은, 광학 신호의 회절 한계에 의해 제한되지 않는 다른 방법이 존재하지만, 이미지 기반 시퀀싱 시스템은 현재 모든 기존 시퀀싱 기술 중에서 가장 낮은 시퀀싱 비용을 가진다. 이미지 기반 시스템은 높은 처리량의 이미징 광학 장치와 저렴한 소모품을 결합하여 저렴한 비용을 달성한다.
그러므로, 회전 한계 미만의 해상도가 높은 정확도로 수행될 수 있는, 인접하게 패킹된(closely-packed) 기판 상의 개별 피처의 해상도를 증가시키기 위해 회절 한계를 극복하는 광학 이미징 방법 및 시스템이 요구된다. 이들 방법 및 시스템은 고해상도 특징 검출에 특정한 응용, 폴리 뉴클레오티드 서열 검출(sequence detection)을 위한 광학 이미징에 사용하기 위한 것을 포함하는 응용을 가질 수 있다.
기판의 표면에 고정된 단일 분자 분석물의 서브-회절 제한 이미징을 위한 방법 및 시스템을 제공한다.
기판은 분석물과의 결합 반응을 수행하기 위한 플로우 셀 등을 포함한다. 분석물은 개별 폴리 뉴클레오티드 또는 단백질과 같은 단일 분자 분해 능을 위해 분리된 위치에서 표면 상에 이산된 생체 분자를 포함한다. 이들은 합성에 의한 단일 분자 시퀀싱과 같은 응용을 위한 고해상도 단일 분자 검출에 사용될 수 있다.
일부 실시예에서, 기판의 표면 상에 높은 밀도로 고정된 복수의 폴리 뉴클레오티드를 시퀀싱하기 위한 방법이 제공된다. 상기 방법은: 표면을 포함하는 기판을 제공하는 단계로서, 상기 표면은 이산된 위치에서 상기 표면 상에 고정된 복수의 폴리 뉴클레오티드를 포함하고, 상기 표면은 합성에 의한 시퀀싱을 위한 시약을 포함하는, 단계; 복수의 단일 분자 시퀀싱의 사이클을 합성에 의해 수행하는 단계로서, 각 사이클은: 검출 가능한 표지를 포함하는 가역적 종결인자 뉴클레오티드 세트와 상기 폴리 뉴클레오티드를 접촉시키는 단계; 상기 폴리 뉴클레오티드 내로 혼입된 각각의 뉴클레오티드로부터의 광학 신호를 검출하기 위해 광학 시스템으로 상기 표면의 필드를 이미징함으로써, 상기 사이클 동안 상기 필드에서 복수의 광학 신호를 검출하는 단계를 포함하는, 단계; 상기 복수의 사이클 중 적어도 2 개로부터 상기 필드의 이미지로부터의 상기 복수의 광학 신호 각각으로부터 피크 위치를 결정하는 단계; 각각의 광학 신호에 대한 상기 피크 위치를 오버레이하고, 개선된 정확도로 상기 표면 상의 각각 검출된 혼입 뉴클레오티드의 상대 위치를 결정하기 위해 각각의 광학 신호 클러스터에 광학 분포 모델을 적용하는 단계; 상기 결정된 상대 위치 및 디콘볼루션 함수를 사용하여 각 사이클로부터 각 필드 이미지에서 상기 광학 신호를 디콘볼루션하는 단계; 상기 디콘볼루션된 광학 신호로부터 각각의 필드 및 각각의 사이클에 대해 상기 폴리 뉴클레오티드에 포함된 상기 검출 가능한 표지를 식별하는 단계; 및 각각의 폴리 뉴클레오티드 위치에서 상기 복수의 사이클에 걸쳐 상기 식별된 검출 가능한 표지로부터 상기 기판의 표면에 고정된 상기 복수의 폴리 뉴클레오티드를 시퀀싱하는 단계를 포함한다.
일부 실시예에서, 상기 기판은 동일한 서열을 포함하는 폴리 뉴클레오티드의 1,000 개 이하, 500 개 이하, 100 개 이하, 50 개 이하 25 개 이하, 20 개 이하, 15 개 이하 또는 10 개 이하의 클론 복제를 포함한다. 일부 실시예에서, 상기 폴리 뉴클레오티드는 DNA 연쇄동일서열이다.
일부 실시예에서, 각 사이클은 상기 표면을 상기 복수의 가역적 종결인자 뉴클레오티드와 접촉시킨 이후 및 상기 필드를 이미징하기 이전에 결합되지 않은 뉴클레오티드를 제거하기 위해 상기 표면을 세척하는 단계를 더 포함한다. 일부 실시예에서, 상기 사이클은 다른 사이클이 수행되는 경우 상기 가역적 종결인자를 절단하는 단계를 더 포함한다. 일부 실시예에서, 상기 사이클은 다른 사이클이 수행되는 경우 상기 검출 가능한 표지를 절단하는 단계를 더 포함한다.
일부 실시예에서, 상기 가역적 종결인자 뉴클레오티드 세트는 각각 개별적인 검출 가능한 표지를 갖는 적어도 2개의 개별적인 뉴클레오티드를 포함한다. 일부 실시예에서, 상기 가역적 종결인자 뉴클레오티드 세트는 각각 개별적인 검출 가능한 표지를 갖는 적어도 4개의 개별적인 뉴클레오티드를 포함한다. 일부 실시예에서, 상기 가역적 종결인자 뉴클레오티드 세트는 아데닌, 시토신, 티민 및 구아닌을 포함한다. 일부 실시예에서, 상기 가역적 종결인자 뉴클레오티드 세트는 아데닌, 시토신, 우라실 및 구아닌을 포함한다.
일부 실시예에서, 상기 폴리 뉴클레오티드는 데옥시리보핵산 또는 리보핵산이다. 일부 실시예에서, 상기 복수의 표적 폴리 뉴클레오티드의 길이는 약 1 kb 내지 약 100 kb이다. 상기 복수의 표적 폴리 뉴클레오티드의 길이는 약 10 kb 내지 약 500 kb이다. 상기 표면에 결합된 상기 폴리 뉴클레오티드는 적어도 10 nm의 거리로 분리된다.
일부 실시예에서, 상기 검출 가능한 표지는 상기 가역적 종결인자 뉴클레오티드의 3'-OH 기에 결합된다. 일부 실시예에서, 검출 가능한 표지가 아닌 블록킹 기는 상기 가역적 종결인자 뉴클레오티드의 3'-OH 기에 결합된다.
일부 실시예에서, 상기 복수의 표적 폴리 뉴클레오티드는 이산된 위치에서 상기 표면에 결합되는 프로브를 포획하기 위해 결합함으로써 고정된다. 일부 실시예에서, 상기 복수의 표적 폴리 뉴클레오티드는 상기 포획 프로브의 서열에 상보적인 포획 서열, 및 상기 시퀀싱 프라이머의 서열에 상보적인 프라이밍 서열을 포함하는 어댑터에 연결된다. 일부 실시예에서, 상기 포획 서열은 20 내지 50 mer이다. 일부 실시예에서, 상기 프라이밍 서열은 20 내지 50 mer이다.
일부 실시예에서, 동일한 서열을 갖는 폴리 뉴클레오티드 세트 또는 데이터 자체를 기반으로 비교함으로써 페이징 에러를 정정하기 위해 이전 사이클 회귀를 수행하는 단계를 더 포함한다.
일부 실시예에서, 상기 디콘볼루션하는 단계는 상기 결정된 상대 위치로부터 상기 이웃하는 폴리 뉴클레오티드 사이의 중심 간 거리를 사용하여 이웃하는 폴리 뉴클레오티드로부터의 간섭 광학 신호를 제거하는 단계를 포함한다. 일부 실시예에서, 상기 디콘볼루션 함수는 최근접 이웃 변수 회귀를 포함한다. 일부 실시예에서, 상기 디콘볼루션하는 단계는 각각의 사이클에 사용된 각각의 고유한 검출 가능한 표지로부터 중첩 파장을 분리하는 단계를 포함한다. 일부 실시예에서, 상기 디콘볼루션 함수는 크로스 토크 회귀를 포함한다. 상기 디콘볼루션 함수는 최근접 이웃 변수 회귀, 평활화, 또는 크로스 토크 보정을 포함한다.
폴리 뉴클레오티드
일부 실시예에서, 상기 폴리 뉴클레오티드는 합성에 의한 단일 분자 시퀀싱을 위해 상기 기판 상에 이격되어 있다. 일부 실시예에서, 상기 폴리 뉴클레오티드는 상기 기판 상에 밀집 패킹되어, 서열 분석될 별개의 폴리 뉴클레오티드 서열을 포함하는 인접한 폴리 뉴클레오티드에 결합된 프로브로부터 상기 검출 가능한 표지에 의해 방출된 광학 신호 사이에 중첩이 존재하도록 한다. 일부 실시예에서, 상기 표면에 고정된 상기 폴리 뉴클레오티드는 상기 검출 가능한 표지에 의해 방출되고 상기 광학 시스템에 의해 이미지화되는 광의 회절 한계보다 평균적으로 이격되어 있다. 일부 실시예에서, 상기 표면에 고정된 상기 폴리 뉴클레오티드 중 적어도 2개는 상기 검출 가능한 표지에 의해 방출되고 상기 광학 시스템에 의해 이미지화되는 광의 회절 한계 미만으로 이격되어 있다. 일부 실시예에서, 상기 표면에 고정된 상기 폴리 뉴클레오티드의 적어도 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80% 또는 90%는 검출 가능한 표지에 의해 방출되고 광학 시스템에 의해 이미지화 된 광의 회절 한계 미만으로 다른 고정된 폴리 뉴클레오티드와 이격되어 있다.
일부 실시예에서, 상기 광학 시스템은 0.2 내지 2.0의 개구 수를 포함한다. 일부 실시예에서, 상기 광학 시스템은 1 내지 1.1의 개구 수를 포함한다. 일부 실시예에서, 상기 방출된 광의 상기 파장은 약 400 내지 450nm, 약 450 내지 500nm, 약 500 내지 550nm, 약 550 내지 600nm, 약 600 내지 650nm 또는 약 650 내지 700nm이다.
일부 실시예에서, 상기 고정된 폴리 뉴클레오티드는 600nm 미만, 500nm 미만, 400nm 미만, 300nm 미만, 또는 200nm 미만의 인접한 폴리 뉴클레오티드 사이의 최소 중심 간 거리를 포함한다. 일부 실시예에서, 상기 폴리 뉴클레오티드는 제곱 미크론 당 약 4 내지 25 분자의 평균 밀도로 상기 표면 상에 고정된다. 일부 실시예에서, 상기 폴리 뉴클레오티드는 제곱 미크론 당 4개 이상, 6개 이상, 8개 이상, 10개 이상, 15개 이상, 또는 20개 이상의 분자의 평균 밀도로 상기 표면 상에 고정된다.
일부 실시예에서, 상기 표면의 상기 이미징은 상기 광학 시스템의 나이퀴스트 한계에 의해 결정되는 임계 샘플링 속도보다 큰 해상도에서 수행된다. 일부 실시예에서, 상기 표면의 상기 이미징은 나이퀴스트 샘플링 주파수의 적어도 2배의 해상도에서 수행된다. 일부 실시예에서, 상기 표면의 상기 이미징은 이미지 필드의 축을 따라 300nm 이상의 하나의 픽셀의 해상도에서 수행된다. 일부 실시예에서, 상기 표면의 상기 이미징은 이미지 필드의 축을 따라 픽셀 당 약 162.5nm의 해상도에서 수행된다.
일부 실시예에서, 각 사이클로부터의 상기 필드 이미지 각각으로부터 더 높은 픽셀 밀도를 가지는 오버 샘플링된 이미지를 생성하는 단계를 더 포함한다. 일부 실시예에서, 상기 오버 샘플링된 이미지는 상기 광학 신호에 대한 예상된 포인트 확산 함수에 기초하여 각 필드 이미지에 평활화를 적용함으로써 생성된다. 일부 실시예에서, 상기 필드 이미지 또는 상기 오버 샘플링된 이미지로부터의 광학 신호 피크의 위치를 포함하는 데이터 세트를 생성하는 단계를 더 포함한다.
일부 실시예에서, 상기 피크 위치를 오버레이하는 단계는 복수의 사이클에서 각각의 필드에서 검출된 상기 광학 신호 피크의 위치를 정렬하여 상기 복수의 사이클로부터 각각의 폴리 뉴클레오티드에 대한 광학 피크 위치의 클러스터를 생성하는 단계를 포함한다. 일부 실시예에서, 상기 광학 분포 모델은 가우시안 분포이다. 일부 실시예에서, 상기 광학 분포 모델은 포인트 확산 함수이다.
일부 실시예에서, 상기 상대 위치는 상기 필드에서 상기 폴리 뉴클레오티드에 대해 결정되는 방법. 일부 실시예에서, 상기 상대 위치는 10nm RMS 이내의 정확도로 결정된다.
일부 실시예에서, 상기 필드의 참조 이미지에 대한 상대 오프셋을 결정하기 위해 상이한 주기로부터 상기 필드의 복수의 이미지를 오버레이하는 단계를 더 포함한다. 일부 실시예에서, 상기 참조 필드와 정렬된 상기 필드 각각에 대한 오프셋 값을 생성하는 단계를 포함한다. 일부 실시예에서, 각 필드 내의 폴리 뉴클레오티드의 상기 상대 위치는 상기 오프셋 값으로부터 결정된다. 일부 실시예에서, 정렬이 정렬 임계 값 밖에 있는 필드 이미지를 폐기하는 단계를 더 포함한다. 일부 실시예에서, 상기 필드의 참조 이미지에 대한 상대 오프셋을 결정하기 위해 상기 필드로부터 복수의 이미지를 오버레이하는 단계를 더 포함하고, 상기 상대 위치는 5nm RMS 이내의 정확도로 결정된다.
일부 실시예에서, 상기 방법은 표면으로부터 광 신호를 제곱 미크론 당 ~4 내지 25의 밀도로 분해할 수 있다.
일부 실시예에서, 상기 검출 가능한 표지는 광을 방출하고, 상기 폴리 뉴클레오티드는 상기 검출 가능한 표지로부터 방출된 광의 회절 한계 미만의 평균 피치로 상기 기판의 표면 상에 고정된다.
일부 실시예에 따르면, 밀집 패킹된 기판의 표면 상에 고정된 분석물의 상대 위치를 정확하게 결정하는 방법이 더 제공된다. 상기 방법은: 표면을 포함하는 기판을 제공하는 단계로서, 상기 표면은 이산된 위치에서 상기 표면 상에 고정된 복수의 분석물을 포함하는, 단계; 상기 표면에 대해 프로브 결합 및 신호 검출의 복수의 사이클을 수행하는 단계(각 사이클은: 프로브 세트로부터 상기 분석물을 복수의 프로브와 접촉시키는 단계로서, 상기 프로브는 검출 가능한 표지를 포함하고, 상기 프로브 각각은 표적 분석물에 특이적으로 결합하는, 단계; 및 상기 표면 상의 이산된 위치에서 상기 분석물에 결합된 개별 프로브로부터의 복수의 광학 신호를 검출하기 위해 광학 시스템으로 상기 표면의 필드를 이미징하는 단계를 포함한다); 상기 복수의 사이클 중 적어도 2 개로부터 상기 필드의 이미지로부터의 상기 복수의 광학 신호 각각으로부터 피크 위치를 결정하는 단계; 및 각각의 광학 신호에 대한 상기 피크 위치를 오버레이하고, 개선된 정확도로 상기 표면 상의 각각 검출된 분석물의 상대 위치를 결정하기 위해 각각의 광학 신호 클러스터에 광학 분포 모델을 적용하는 단계를 포함한다.
일부 실시예에서, 상기 결정된 상대 위치 및 디콘볼루션 함수를 사용하여 각 사이클로부터 각 필드 이미지에서 상기 광학 신호를 디콘볼루션하는 단계; 및 상기 디콘볼루션된 광학 신호로부터 각각의 필드 및 각각의 사이클에 대해 상기 고정된 분석물에 결합된 상기 검출 가능한 표지를 식별하는 단계를 더 포함한다.
일부 실시예에서, 상기 기판상의 복수의 상기 분석물을 식별하기 위해 각 사이클에서 검출된 각각의 분석물에 대해 상기 검출 가능한 표지 아이덴티티를 사용하는 단계를 더 포함한다.
일부 실시예에서, 상기 디콘볼루션하는 단계는 상기 이웃 분석물의 상기 결정된 상대 위치로부터 상기 이웃 분석물 사이의 중심 간 거리를 사용하여 이웃 분석물로부터의 간섭 광 신호를 제거하는 단계를 포함한다.
일부 실시예에서, 상기 디콘볼루션 함수는 최근접 이웃 변수 회귀를 포함한다. 일부 실시예에서, 상기 디콘볼루션하는 단계는 각각의 사이클에 사용된 각각의 고유한 검출 가능한 표지로부터 중첩 파장을 분리하는 단계를 포함한다. 일부 실시예에서, 상기 디콘볼루션 함수는 크로스 토크 회귀를 포함한다. 일부 실시예에서, 상기 디콘볼루션 함수는 최근접 이웃 변수 회귀, 평활화, 또는 크로스 토크 보정을 포함한다.
일부 실시예에서, 상기 분석물은 단일 분자이다. 일부 실시예에서, 상기 단일 분자는 단일 생체 분자이다. 일부 실시예에서, 상기 단일 분자는 폴리 뉴클레오티드이다.
일부 실시예에서, 상기 분석물은 인접한 분석물에 결합된 프로브로부터 상기 검출 가능한 표지에 의해 방출된 광학 신호 사이에 중첩이 존재하도록 상기 기판 상에 밀집 패킹된다. 일부 실시예에서, 상기 표면에 고정된 상기 분석물은 상기 검출 가능한 표지에 의해 방출되고 상기 광학 시스템에 의해 이미지화되는 광의 회절 한계보다 평균적으로 이격된다. 일부 실시예에서, 상기 표면에 고정된 상기 분석물 중 적어도 2개는 상기 검출 가능한 표지에 의해 방출되고 상기 광학 시스템에 의해 이미지화되는 광의 회절 한계 미만으로 이격된다. 상기 표면에 고정된 상기 분석물의 적어도 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80% 또는 90%는 검출 가능한 표지에 의해 방출되고 광학 시스템에 의해 이미지화된 광의 회절 한계 미만으로 다른 고정된 분석물과 이격된다.
일부 실시예에서, 상기 광학 시스템은 0.2 내지 2.0의 개구 수를 포함한다. 일부 실시예에서, 상기 광학 시스템은 1 내지 1.1의 개구 수를 포함한다. 일부 실시예에서, 상기 광의 상기 파장은 약 400 내지 450nm, 약 450 내지 500nm, 약 500 내지 550nm, 약 550 내지 600nm, 약 600 내지 650nm 또는 약 650 내지 700nm이다.
일부 실시예에서, 상기 고정된 분석물은 600nm 미만, 500nm 미만, 400nm 미만, 300nm 미만, 또는 200nm 미만의 인접한 분석물 사이의 최소 중심 간 거리를 포함한다. 일부 실시예에서, 상기 분석물은 제곱 미크론 당 약 4 내지 25 분자의 평균 밀도로 상기 표면 상에 고정된다. 일부 실시예에서, 상기 분석물은 제곱 미크론 당 4개 이상, 6개 이상, 8개 이상, 10개 이상, 15개 이상, 또는 20개 이상의 분자의 평균 밀도로 상기 표면 상에 고정된다.
일부 실시예에서, 각 사이클은 상기 프로브 세트로부터의 추가 프로브를 사용하여 i 단계 및 ii 단계를 반복하는 단계를 더 포함한다. 일부 실시예에서, 각 사이클은 상기 표면을 상기 복수의 프로브와 접촉시킨 이후 및 상기 필드를 이미징하기 이전에 결합되지 않은 프로브를 제거하는 단계를 더 포함한다. 일부 실시예에서, 각 사이클은 다른 사이클이 수행되는 경우 상기 표면으로부터 결합된 프로브를 제거하는 단계를 더 포함한다.
일부 실시예에서, 적어도 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 50, 60, 70, 80, 90 또는 100회의 사이클이 수행된다. 일부 실시예에서, 각 사이클은 상기 광학 시스템으로 상기 표면의 복수의 필드를 이미징하는 단계를 포함한다.
일부 실시예에서, 상기 표면의 상기 이미징은 상기 광학 시스템의 나이퀴스트 한계에 의해 결정되는 임계 샘플링 속도보다 큰 해상도에서 수행된다. 상기 표면의 상기 이미징은 나이퀴스트 샘플링 주파수의 적어도 2배의 해상도에서 수행된다. 일부 실시예에서, 상기 표면의 상기 이미징은 이미지 필드의 축을 따라 300nm 이상의 하나의 픽셀의 해상도에서 수행된다. 일부 실시예에서, 상기 표면의 상기 이미징은 이미지 필드의 축을 따라 픽셀 당 약 162.5nm의 해상도에서 수행된다.
일부 실시예에서, 각 사이클로부터의 상기 필드 이미지 각각으로부터 더 높은 픽셀 밀도를 가지는 오버 샘플링된 이미지를 생성하는 단계를 더 포함한다. 일부 실시예에서, 상기 오버 샘플링된 이미지는 상기 광학 신호에 대한 예상된 포인트 확산 함수에 기초하여 각 필드 이미지에 평활화를 적용함으로써 생성된다. 상기 필드 이미지 또는 상기 오버 샘플링된 이미지로부터의 광학 신호 피크의 위치를 포함하는 데이터 세트를 생성하는 단계를 더 포함한다.
일부 실시예에서, 상기 피크 위치를 오버레이하는 단계는 복수의 사이클에서 각각의 필드에서 검출된 상기 광학 신호 피크의 위치를 정렬하여 상기 복수의 사이클로부터 각각의 분석물에 대한 광학 피크 위치의 클러스터를 생성하는 단계를 포함한다. 일부 실시예에서, 상기 광학 분포 모델은 가우시안 분포이다. 일부 실시예에서, 상기 광학 분포 모델은 포인트 확산 함수이다.
일부 실시예에서, 상기 상대 위치는 상기 필드에서 상기 분석물에 대해 결정된다. 일부 실시예에서, 상기 상대 위치는 10nm RMS 이내의 정확도로 결정된다.
일부 실시예에서, 상기 필드의 참조 이미지에 대한 상대 오프셋을 결정하기 위해 상이한 주기로부터 상기 필드의 복수의 이미지를 오버레이하는 단계를 더 포함한다. 일부 실시예에서, 상기 참조 필드와 정렬된 상기 필드 각각에 대한 오프셋 값을 생성하는 단계를 포함한다. 일부 실시예에서, 각 필드 내의 분석물의 상기 상대 위치는 상기 오프셋 값으로부터 결정된다. 일부 실시예에서, 정렬이 정렬 임계 값 밖에 있는 필드 이미지를 폐기하는 단계를 더 포함한다. 일부 실시예에서, 상기 필드의 참조 이미지에 대한 상대 오프셋을 결정하기 위해 상기 필드로부터 복수의 이미지를 오버레이하는 단계를 더 포함하고, 상기 상대 위치는 5nm RMS 이내의 정확도로 결정된다.
일부 실시예에서, 상기 방법은 표면으로부터 광 신호를 제곱 미크론 당 ~4 내지 25의 밀도로 분해할 수 있다.
일부 실시예에서, 상기 검출 가능한 표지는 광을 방출하고, 상기 어레이가 결합된 표적 분석물은 상기 검출 가능한 표지로부터 방출된 광의 회절 한계 미만의 평균 피치를 포함한다.
일부 실시예에 따르면, 기판의 표면에 고정된 복수의 밀집 패킹된 분석물을 식별하는 방법이 더 제공된다. 상기 방법은: 표면을 포함하는 기판을 제공하는 단계로서, 상기 표면은 이산된 위치에서 상기 표면 상에 고정된 복수의 분석물을 포함하는, 단계; 상기 표면에 대해 프로브 결합 및 신호 검출의 복수의 사이클을 수행하는 단계(각 사이클은: i. 프로브 세트로부터 상기 분석물을 복수의 프로브와 접촉시키는 단계로서, 상기 프로브는 검출 가능한 표지를 포함하고, 상기 프로브 각각은 표적 분석물에 특이적으로 결합하는, 단계; 및 ii. 상기 분석물에 결합된 개별 프로브로부터의 복수의 광학 신호를 검출하기 위해 광학 시스템으로 상기 표면의 필드를 이미징하는 단계를 포함한다); 상기 복수의 사이클 중 적어도 2 개로부터 상기 필드의 이미지로부터의 상기 복수의 광학 신호 각각으로부터 피크 위치를 결정하는 단계; 및 각각의 광학 신호에 대한 상기 피크 위치를 오버레이하고, 개선된 정확도로 상기 표면 상의 각각 검출된 분석물의 상대 위치를 결정하기 위해 각각의 광학 신호 클러스터에 광학 분포 모델을 적용하는 단계; 상기 결정된 상대 위치 및 디콘볼루션 함수를 사용하여 각 사이클로부터 각 필드 이미지에서 상기 광학 신호를 디콘볼루션하는 단계; 상기 디콘볼루션된 광학 신호로부터 각각의 필드 및 각각의 사이클에 대해 상기 고정된 분석물에 결합된 상기 검출 가능한 표지를 식별하는 단계; 및 각 사이클에서 검출된 각각의 분석물에 대해 상기 검출 가능한 표지 아이덴티티를 사용하여 상기 기판상의 복수의 상기 분석물의 아이덴티티를 결정하는 단계를 포함한다.
일부 실시예에 따르면, 복수의 분석물의 아이덴티티를 결정하기 위한 시스템이 더 제공된다. 상기 시스템은 기판의 표면 상에 고정된 분석물에 대한 프로브 결합의 복수의 사이클에 걸쳐 기판의 필드로부터 복수의 광학 신호를 이미징하도록 구성된 광학 이미징 장치; 및 이미지 처리 모듈로서, i. 상기 복수의 사이클 중 적어도 2 개로부터 상기 필드의 이미지로부터의 상기 복수의 광학 신호 각각으로부터 피크 위치를 결정하고; ii. 상기 복수의 사이클로부터 각각의 광학 신호 클러스터에 광학 분포 모델을 적용함으로써 개선된 정확도로 상기 표면 상의 각각 검출된 분석물의 상대 위치를 결정하며; 및 iii. 상기 결정된 상대 위치 및 디콘볼루션 함수를 사용하여 각 사이클로부터 각 필드 이미지에서 상기 광학 신호를 디콘볼루션하도록 구성되는 이미지 처리 모듈을 포함한다.
일부 실시예에서, 상기 이미지 처리 모듈은 상기 디콘볼루션된 광 신호를 사용하여 상기 표면 상에 고정된 상기 분석물의 아이덴티티를 결정하도록 더 구성된다.
일부 실시예에서, 상기 분석물은 각각 폴리 뉴클레오티드 분자이고, 상기 아이덴티티는 상기 폴리 뉴클레오티드 분자의 서열을 포함한다.
일부 실시예에서, 상기 광학 이미지 장치는 스캔 가능한 영역을 정의하는 이동 가능한 스테이지를 포함한다.
일부 실시예에서, 상기 광학 이미지 장치는 센서 및 상기 스캔 가능한 영역에서 회절 한계 아래에서 기판의 표면을 샘플링하도록 구성된 광학 배율을 포함한다.
일부 실시예에서, 분석물을 포함하는 기판을 더 포함하되, 상기 분석물은 회절 한계 미만의 중심 간격으로 상기 기판의 표면에 고정된다.
일부 실시예에서, 상기 디콘볼루션은 상기 이웃 분석물의 상기 결정된 상대 위치로부터 상기 이웃하는 분석물 사이의 중심 간 거리를 사용하여 이웃 분석물로부터의 간섭 광학 신호를 제거하는 것을 포함한다. 상기 디콘볼루션 함수는 최근접 이웃 변수 회귀를 포함한다. 상기 디콘볼루션은 각각의 사이클에 사용된 각각의 고유한 검출 가능한 표지로부터 중첩 파장을 분리하는 것을 포함한다. 상기 디콘볼루션 함수는 크로스 토크 회귀를 포함한다. 상기 디콘볼루션 함수는 최근접 이웃 변수 회귀, 평활화, 또는 크로스 토크 보정을 포함한다.
일부 실시예에서, 상기 분석물은 단일 분자이다. 일부 실시예에서, 상기 단일 분자는 단일 생체 분자이다. 일부 실시예에서, 상기 단일 분자는 폴리 뉴클레오티드이다.
일부 실시예에서, 상기 분석물은 인접한 분석물에 결합된 프로브로부터 상기 검출 가능한 표지에 의해 방출된 광학 신호 사이에 중첩이 존재하도록 상기 기판 상에 밀집 패킹된다. 일부 실시예에서, 상기 표면에 고정된 상기 분석물은 상기 검출 가능한 표지에 의해 방출되고 상기 광학 시스템에 의해 이미지화되는 광의 회절 한계보다 평균적으로 이격된다. 일부 실시예에서, 상기 표면에 고정된 상기 분석물 중 적어도 2개는 상기 검출 가능한 표지에 의해 방출되고 상기 광학 시스템에 의해 이미지화되는 광의 회절 한계 미만으로 이격되어 있다. 상기 표면에 고정된 상기 분석물의 적어도 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80% 또는 90%는 검출 가능한 표지에 의해 방출되고 광학 시스템에 의해 이미지화 된 광의 회절 한계 미만으로 다른 고정된 분석물과 이격되어 있다.
일부 실시예에서, 상기 광학 시스템은 0.2 내지 2.0의 개구 수를 포함한다. 일부 실시예에서, 상기 광학 시스템은 1 내지 1.1의 개구 수를 포함한다. 일부 실시예에서, 상기 광의 상기 파장은 약 400 내지 450nm, 약 450 내지 500nm, 약 500 내지 550nm, 약 550 내지 600nm, 약 600 내지 650nm 또는 약 650 내지 700nm이다.
일부 실시예에서, 상기 고정된 분석물은 600nm 미만, 500nm 미만, 400nm 미만, 300nm 미만, 또는 200nm 미만의 인접한 분석물 사이의 최소 중심 간 거리를 포함한다. 일부 실시예에서, 상기 분석물은 제곱 미크론 당 약 4 내지 25 분자의 평균 밀도로 상기 표면 상에 고정된다. 일부 실시예에서, 상기 분석물은 제곱 미크론 당 4개 이상, 6개 이상, 8개 이상, 10개 이상, 15개 이상, 또는 20개 이상의 분자의 평균 밀도로 상기 표면 상에 고정된다.
일부 실시예에서, 상기 광학 이미징 장치는 상기 광학 시스템의 나이퀴스트 한계에 의해 결정되는 임계 샘플링 속도보다 큰 해상도로 상기 기판을 이미징하도록 구성된다. 상기 광학 이미징 장치는 나이퀴스트 샘플링 주파수의 적어도 2배의 해상도로 상기 기판을 이미징하도록 구성된다. 상기 광학 이미징 장치는 상기 이미지 필드의 축을 따라 픽셀 당 300nm 이하의 해상도로 상기 기판을 이미징하도록 구성된다. 상기 광학 이미징 장치는 상기 이미지 필드의 축을 따라 픽셀 당 약 162.5nm의 해상도로 상기 기판을 이미징하도록 구성된다.
일부 실시예에서, 상기 이미지 처리 모듈은 각 사이클로부터의 상기 필드 이미지 각각으로부터 더 높은 픽셀 밀도를 가지는 오버 샘플링된 이미지를 생성하도록 구성된다. 상기 이미지 처리 모듈은 상기 오버 샘플링된 이미지를 생성하기 위해 상기 광학 신호에 대한 예상된 포인트 확산 함수에 기초하여 각 필드 이미지에 평활화를 적용하도록 구성된다. 일부 실시예에서, 상기 이미지 처리 모듈은 상기 이미징된 필드로부터 광학 신호 피크의 위치를 포함하는 데이터 세트를 생성하도록 구성된다.
일부 실시예에서, 상기 시스템은 표면으로부터 광학 신호를 제곱 미크론 당 ~4 내지 25의 밀도로 분해할 수 있다.
일부 실시예에서, 상기 표적 분석 물질은 상기 광학 이미징 장치에 의해 검출된 광의 회절 한계 미만의 평균 중심 간 거리에서 상기 기판 상에 고정된다.
기판의 표면에 결합되고 밀집 패킹된 분석물에 결합된 프로브의 광학적 검출 및 식별을 용이하게 하는 시스템 및 방법이 본 명세서에서 제공된다. 부분적으로, 본 명세서에 기술된 방법 및 시스템은 기판 표면상의 복수의 표적 분석물의 반복 검출에 의존하여 기판상의 각 분석 물의 상대 위치의 식별 정확도를 향상시킨다. 이어서, 이러한 정보는 각각의 사이클에 대해 기판의 필드의 각 이미지에 대해 신호 디콘볼루션을 수행하여 표적 분석물에 결합된 프로브로부터의 신호를 신뢰성 있게 식별하는데 사용될 수 있다. 일부 실시예에서, 이러한 유형의 디콘볼루션 처리는 활성화 광에 의해 활성화 될 때 중첩 방출 스펙트럼을 갖는 표적 분석물에 결합된 상이한 프로브를 구별하기 위해 사용될 수 있다. 일부 실시예에서, 디콘볼루션 처리는 인접 분석물로부터 광학 신호를 분리하는데 사용될 수 있다. 이는 광학 시스템의 회절 한계로 인해 광학 검출이 어려운 밀도를 갖는 분석물을 가지는 기판에 특히 유용하다.
유사한 도면 부호가 상이한 도면에 걸쳐 동일한 부분을 나타내는 첨부 도면에 도시된 바와 같이, 전술 한 그리고 다른 목적, 특징 및 장점은 본 발명의 특정 실시 예에 대한 다음의 설명으로부터 명백해질 것이다. 도면은 반드시 축척대로 도시된 것은 아니며, 대신 본 발명의 다양한 실시예의 원리를 설명하기 위해 강조된다.
도 1은 시퀀서 처리량 대 어레이 피치를 도시하며, 10달러의 게놈에 필요한 기준을 충족시키는 시스템 설계를 개략적으로 도시한다.
도 2a는 저비용 시퀀싱을 위한 240nm 피치에서 80nm 직경 결합 영역(스팟)의 고밀도 영역의 제안된 실시예를 도시한다.
도 2b는 제안된 기판 밀도와 1,000달러 게놈에 사용된 샘플 유효 밀도를 비교한 것이다.
도 3은 2X 필터로 처리된 600nm 피치에서 시뮬레이션된 단일 분자에 대한 크로스토크 계산을 도시한다.
도 4는 600nm, 400nm 및 300nm의 중심 간 거리에서 기판상의 단일 분자 분석물의 검출 이미지에 대한 오버 샘플링된 2X(왼쪽) 대 오버 샘플링된 4X 및 디콘볼루션된(오른쪽) 시뮬레이션을 도시한다.
도 5는 오버 샘플링된 2X 대 오버 샘플링된 4X 및 디콘볼루션된 시뮬레이션을 사용하여 처리된 단일 분석 물질(어레이 피치(nm)) 사이의 상이한 중심 간 거리에서 인접한 스팟들 사이의 크로스토크의 플롯을 도시한다.
도 6은 본 발명의 일 실시예에 따른 기판의 분석물의 상대 위치를 고정밀도로 결정하는 방법에 대한 흐름도를 도시한다.
도 7은 본 발명의 일 실시예에 따른 기판으로부터 검출된 디콘볼루션된 광학 신호로부터 개별 분석물을 식별하는 방법에 대한 흐름도를 도시한다.
도 8은 본 발명의 일 실시예에 따른 기판 상에 고정된 폴리 뉴클레오티드를 시퀀싱하는 방법에 대한 흐름도를 도시한다.
도 9는 본 발명의 일 실시예에 따른 사이클 검출로부터 광학 신호 검출 프로세스의 단계들의 개요를 도시한다.
도 10a는 본 발명의 일 실시예에 따른 로우 이미지 분석을 위한 단계들의 흐름도를 도시한다.
도 10b는 본 발명의 일 실시예에 따른 복수의 사이클로부터의 광학 신호 피크 정보로부터 위치 결정을 위한 단계들의 흐름도를 도시한다.
도 10c는 본 발명의 일 실시예에 따른 정확한 상대 위치 정보 및 이미지 디콘볼루션 알고리즘을 사용하여 이미지로부터 겹치는 광학 신호를 식별하기 위한 단계의 흐름도를 도시한다.
도 11은 본 발명의 일 실시예에 따른 밀집 패킹된 기판의 사이클 검출로부터의 이미지에 대한 광학 신호 검출 및 디콘볼루션 프로세스를 위한 단계의 상세한 흐름도를 도시한다.
도 12a는 로우 이미지로부터 검출된 광학 신호로부터 4개의 형광단 사이의 형광단 세기의 크로스토크 플롯을 도시한다.
도 12b는 4X 오버 샘플링된 이미지로부터 4개의 형광단 사이의 형광단 강도의 크로스토크 플롯을 도시한다.
도 13a는 4X 오버 샘플링된 이미지로부터 4 개의 형광단 사이의 형광단 강도의 크로스토크 플롯을 도시한다.
도 13b는 본 발명의 일 실시예에 따른 정확한 분석물 위치 정보를 갖는 디콘볼루션 알고리즘을 사용하여 4X 오버 샘플링되고 디콘볼루션된 이미지로부터 4개의 형광단 사이의 형광단 강도의 크로스토크 플롯을 도시한다.
도 13b는 도 11에 도시되고 본 명세서에 기술된 바와 같이 디콘볼루션 및 최근접 이웃 회귀를 갖는 동일한 이미징 영역에 대한 크로스토크 플롯을 도시한다.
도 14a는 약 315nm의 분석물들 사이의 중심 간 간격에서 필드의 로우 이미지의 시뮬레이션된 4색 합성을 도시한다.
도 14b는 약 315nm의 분석물 사이의 중심 간 간격에서 디콘볼루션된 이미지의 시뮬레이션된 4 색 합성을 도시한다.
도 15a는 동일한 양의 돌연변이 및 야생형(WT) 표적을 함유하는 EGFR 유전자에서 코돈 790 주변 영역에 상응하는 합성 올리고 뉴클레오티드 주형의 1 : 1 혼합물의 서열 분석 결과를 도시한다.
도 15b는 교대 염기 혼입 및 절단 주기로부터의 이미지를 도시한다.
도 16은 기질 상에 고정되고 형광단을 포함하는 프로브에 의해 결합된 단일 분자의 이미지이다.
도 17의 우측 패널은 기판상의 여러 분석물로부터 중첩된 각각의 사이클로부터 필드의 오버 샘플링된 이미지로부터의 피크를 도시한다(피크 클러스터). 왼쪽 패널은 오른쪽 패널의 평활화된 버전으로, 상대적 위치 정보를 나타내는 매우 정확한 피크로 복수의 사이클에 걸쳐 분석 물로부터 피크의 가우시안 분포를 요약한다.
도 18은 필드에서 발견된 복수의 분자 각각에 대한 국소화 변화를 도시한다. 중앙값 국소화 분산은 5nm이고 3 시그마 국소화 분산은 10nm 미만이다.
본 발명의 다양한 실시예의 세부 사항은 아래의 설명에서 설명된다. 본 발명의 다른 특징, 목적 및 이점은 상세한 설명 및 도면 및 청구 범위로부터 명백 할 것이다.
정의(Definitions)
본 명세서에서, 사용된 용어 중심 간 거리(center-to-center distance)는 기판 상의 각 분자의 평균 위치의 차이에 의해 측정된 인접한 2개의 분자 사이의 거리를 의미한다. 중심 간 거리라는 용어는 또한 기판상의 분석물의 밀도에 대응하는 제한의 맥락에서 최소 중심 간 거리를 지칭하며, 용어 평균 최소 중심 간 거리는 구체적으로 기판 상에 배치된 각각의 분석물의 중심과 가장 가까운 인접 분석물의 중심 사이의 평균 거리를 지칭한다. 본 명세서에서, 용어 "피치" 또는 "평균 유효 피치"는 일반적으로 평균 최소 중심 간 거리를 지칭하기 위해 사용된다. 규칙적인 분석물의배열과 관련하여, 피치는 또한 정의된 축을 따라 인접한 분자 사이의 중심 간 거리를 결정하는데 사용될 수 있다.
본 명세서에서 사용되는 용어 "오버레잉(overlaying, 예를 들어, 이미지 오버레이)"은 복수의 사이클에 걸쳐 각각의 분석 물로부터 검출된 광학 신호의 분포(예를 들어, 위치 및 강도 또는 피크의 위치)를 생성하기 위해 상이한 사이클로부터 이미지를 오버레이하는 것을 의미한다. 검출된 광학 신호의 이러한 분포는 이미지 오버레이, 인공 처리된 이미지 오버레이 또는 위치 정보를 포함하는 데이터 세트를 오버레이함으로써 생성될 수 있다. 따라서, 본원에 사용된 용어 "오버레이 이미지(overlaying images)"는 복수의 사이클 각각에 대해 단일 분석물에 결합된 단일 프로브로부터 광학 신호에 대한 위치 정보의 분포를 생성하기 위한 이러한 메커니즘 중 임의의 것을 포함한다.
"사이클"은 하나 이상의 패스의 완료 및 검출 가능한 표지를 기판으로부터 스트리핑함으로써 정의된다. 사이클 당 하나 이상의 패스의 후속 사이클이 수행될 수 있다. 본 명세서에 기술된 방법 및 시스템에 대해, 다중 사이클이 단일 사이클 또는 샘플상에서 수행된다. DNA 시퀀싱을 위해, 다중 사이클은 가역적인 종결인자 및 통합된 뉴클레오티드로부터의 제거 가능하고 검출 가능한 표지의 사용을 필요로 한다. 단백질의 경우, 다중 사이클은 프로브 제거(스트라이핑) 조건이 단백질을 적절한 형태로 접은 상태로 유지하거나 사용된 프로브가 펩타이드 서열에 결합하도록 선택되어, 결합 효율이 단백질 폴드 구성과 무관하도록 요구한다.
검출 분석의 “패스”란 검출 가능한 표지를 포함하는 복수의 프로브가 결합된 분석물에 도입되고, 프로브와 별개의 표적 분석물 사이에 선택적 결합이 발생하고, 검출 가능한 표지로부터 복수의 신호가 검출되는 과정을 지칭한다. 패스는 표적 분석물에 특이적으로 결합하는 항체 세트의 도입을 포함한다. 패스는 또한 합성에 의한 시퀀싱 동안 성장 가닥(growing strand)에 혼입하기 위한 표지된 뉴클레오티드 세트의 도입을 포함할 수 있다. 기판이 모든 검출 가능한 표지로부터 제거되기 전에, 또는 검출 가능한 표지 또는 가역적 종결인자가 시퀀싱 동안 혼입 된 뉴클레오티드로부터 제거되기 전에, 상이한 세트의 프로브의 다수의 패스가 존재할 수 있다. 일반적으로, 패스 동안 4개의 뉴클레오티드가 사용되는 경우, 사이클은 합성에 의한 표준 4개의 뉴클레오티드 시퀀싱을 위한 단일 경로로만 구성될 것이다.
본 명세서에서 사용되는 바와 같이, 이미지는 사이클 동안 또는 필드 내의 패스 중 촬영된 필드의 이미지를 지칭한다. 일부 실시예에서, 단일 이미지는 검출 가능한 표지의 단일 색상의 검출로 제한된다.
본 명세서에서 사용된 용어 "필드"는 이미지화되는 기판의 단일 영역을 지칭한다. 전형적인 분석 동안, 단일 필드는 적어도 사이클 당 1회 이미지화된다. 예를 들어, 4가지 색상의 20사이클 분석의 경우, 동일한 필드 모두에서 20 * 4 = 80개의 이미지가 있을 수 있다.
"표적 분석물"또는 "분석물"은 확인, 정량화 및 달리 특성화 될 단일 분자, 화합물, 복합체, 물질 또는 성분을 지칭한다. 표적 분석물은 예를 들어 단일 분자(임의의 분자 크기), 단일 생체 분자, 폴리펩티드, 단백질(접힘 또는 펼침), 폴리 뉴클레오티드 분자(RNA, cDNA 또는 DNA), 이의 단편, 이의 변형된 분자, 예컨대 변형된 핵산, 또는 이들의 조합을 포함할 수 있지만, 이에 제한되지는 않는다. 일 실시예에서, 표적 폴리 뉴클레오티드는 합성에 의한 시퀀싱을 용이하게 하기 위해 혼성화된 프라이머를 포함한다. 표적 분석물은 프로브에 의해 인식되며, 프로브는 본 명세서에 기술된 광학적 검출 방법을 사용하여 표적 분석물의 시퀀싱, 식별 및 정량화하는데 사용될 수 있다.
본 명세서에서 사용된 "프로브"는 분자, 세포 성분 또는 구조, 또는 세포의 특성을 검출 또는 평가하기 위해, 다른 분자(예를 들어, 합성, 폴리 뉴클레오티드, 폴리펩티드 또는 전장 단백질 등에 의한 시퀀싱 동안 상보적으로 표지된 뉴클레오티드), 세포 성분 또는 구조(예를 들어, 지질, 세포벽) 또는 세포에 결합할 수 있는 분자를 지칭한다. 프로브는 표적 분석물에 결합하는 구조 또는 성분을 포함한다. 일부 실시예에서, 다수의 프로브는 동일한 표적 분석물의 상이한 부분을 인식할 수 있다. 프로브의 예는 표지된 가역적 종결인자 뉴클레오티드, 앱타머, 항체, 폴리펩티드, 올리고 뉴클레오티드(DNA, RNA) 또는 이들의 임의의 조합을 포함하지만, 이에 제한되지는 않는다. 프로브로서의 항체, 앱타머, 올리고 뉴클레오티드 서열 및 이들의 조합이 또한 아래에 상세히 기재되어있다.
프로브는 표적 분석물에 대한 프로브의 결합을 검출하는데 사용되는 검출 가능한 표지를 포함할 수 있다. 프로브는 표적 분석물에 직접 또는 간접적으로 결합, 혼성화, 접합 또는 공유 결합될 수 있다.
본 명세서에 사용된 용어 검출 가능한 표지는 프로브가 표적 분석물에 결합되고 광학 이미징 시스템을 사용하여 이미지화 될 때 검출 가능한 광학 신호를 생성할 수 있는 프로브에 결합된 분자를 지칭한다. 검출 가능한 표지는 프로브에 직접 또는 간접적으로 결합, 혼성화, 접합 또는 공유 결합될 수 있다. 일부 실시예에서, 검출 가능한 표지는 형광 분자 또는 화학 발광 분자이다. 프로브는 감지 가능한 표지를 통해 광학적으로 감지할 수 있다.
본 명세서에서 사용되는 용어 광 분포 모델은 포인트 소스로부터의 광 검출을 위한 통계의 분포를 의미한다. 여기에는 가우시안 분포가 포함된다. 가우시안 분포는 광학 분포 모델로서 포인트 확산 함수를 생성하기 위해 검출에 예상 수차를 포함하도록 수정될 수 있다.
개요(Overview)
기판의 표면에 결합되고 밀집 패킹된 분석물에 결합된 프로브의 광학적 검출 및 식별을 용이하게 하는 시스템 및 방법이 본 명세서에서 제공된다. 부분적으로, 본 명세서에 기술된 방법 및 시스템은 기판 표면상의 복수의 표적 분석물의 반복 검출에 의존하여 기판상의 각 분석 물의 상대 위치의 식별 정확도를 향상시킨다. 이어서, 이러한 정보는 각각의 사이클에 대해 기판의 필드의 각 이미지에 대해 신호 디콘볼루션을 수행하여 표적 분석물에 결합된 프로브로부터의 신호를 신뢰성 있게 식별하는데 사용될 수 있다. 일부 실시예에서, 이러한 유형의 디콘볼루션 처리는 활성화 광에 의해 활성화 될 때 중첩 방출 스펙트럼을 갖는 표적 분석물에 결합된 상이한 프로브를 구별하기 위해 사용될 수 있다. 일부 실시예에서, 디콘볼루션 처리는 인접 분석물로부터 광학 신호를 분리하는데 사용될 수 있다. 이는 광학 시스템의 회절 한계로 인해 광학 검출이 어려운 밀도를 갖는 분석물을 가지는 기판에 특히 유용하다.
일부 실시예에서, 본 명세서에 기재된 방법 및 시스템은 시퀀싱(서열 분석)에 특히 유용하다. 밀집 패킹된(densely packed) 기판에서 신뢰할 수 있는 광학 검출을 용이하게 하는 방법 및 시스템을 제공함으로써, 시약, 클론 분자의 수, 처리 및 판독 시간과 같은 시퀀싱과 관련된 비용을 모두 줄일 수 있으며, 시퀀싱 기술, 특히 광학적으로 검출 된 뉴클레오티드를 사용한 합성에 의한 단일 분자 시퀀싱을 크게 발전시킬 수 있다.
본 명세서에 기술된 시스템 및 방법은 시퀀싱 기술을 발전시키는 데 중요한 의미를 가지며, 본 명세서에 기술된 방법 및 시스템은, 특히 단일 분자 수준에서 기판 표면에 결합된 분석물의 광학적 검출에 일반적으로 적용 가능하다.
시퀀싱 비용 절감
시퀀싱 기술에는 Illumina 및 Complete Genomics와 같은 회사에서 개발한 이미지 기반 시스템과 Ion Torrent 및 Oxford Nanopore와 같은 회사에서 개발 한 전기 기반 시스템이 포함된다. 이미지 기반 시퀀싱 시스템은 현재 모든 기존 시퀀싱 기술 중에서 가장 낮은 시퀀싱 비용을 가진다. 이미지 기반 시스템은 높은 처리량의 이미징 광학 장치와 저렴한 소모품을 결합하여 저렴한 비용을 달성한다. 그러나, 종래의 광학 검출 시스템은 부분적으로 광학 시스템의 회절 한계로 인해 약 1 미크론에서 인접한 분해 가능한 분자 사이의 최소 중심 간 간격을 갖는다. 일부 실시예에서, 사이클 검출(cycled detection), 분석물의 정확한 위치 결정 및 회절 한계 아래에서 작동하는 증가된 패킹 밀도를 수용하기 위해 이미지 신호의 매우 정확한 디콘볼루션을 위한 위치 정보 사용을 사용하여 기존 생화학을 사용하는 이미지 기반 시퀀싱 시스템의 비용을 크게 낮추는 방법이 여기에 설명된다.
회절 한계 미만의 중심 간 간격으로 표면에 고정된 분석물로부터의 신호의 영상화를 용이하게 하는 시스템 및 방법이 본 명세서에 제공된다. 이러한 시스템 및 방법은 고급 이미징 시스템을 사용하여 고해상도 이미지를 생성하고, 사이클 검출을 통해 이미지의 정확도 및 디콘볼루션(deconvolution)으로 기판상의 분자의 위치 결정을 용이하게 하여 고밀도로 채워진 표면의 각 분자에 대한 신호 아이덴티티(identity)를 획득한다. 이러한 방법 및 시스템은 고밀도로 패킹된 기판상에서 합성함으로써 단일 분자 시퀀싱을 가능하게 하여 매우 효율적이고 매우 높은 처리량의 폴리 뉴클레오티드 서열 결정을 높은 정확도로 제공한다.
시퀀싱 시스템의 주요 비용 구성 요소는 주로 바이오 칩과 시약을 포함하는 소모품이며 이차적으로 기기 비용이다. 100배 비용이 절감되는, 10달러 30X 게놈에 도달하려면, 단위 면적당 데이터 양이 100배 증가해야 하고, 데이터 포인트 당 시약 양이 100배 감소해야 한다.
도 1은 시퀀서 처리량(throughput 대 어레이 피치를 보여주며, 10달러 게놈에 필요한 기준을 충족시키는 시스템 설계를 개략적으로 보여준다. 기본 아이디어는 100배의 비용 절감을 달성하는 것으로, 단위 면적당 데이터 양은 100배 증가해야 하고 데이터 포인트 당 시약 양은 100배 감소해야 한다. 이러한 비용 절감을 달성하기 위한, 회절 한계 미만의 밀도로 기판 표면에 고정된 폴리 뉴클레오티드의 신뢰성 있는 시퀀싱을 용이하게 하는 방법 및 시스템이 본 명세서에서 제공된다. 이러한 고밀도 어레이는 시약을 보다 효율적으로 사용하게 하고 단위 면적당 데이터 양을 증가시킨다. 또한, 검출 신뢰성의 증가는 시퀀싱 및 검출에서의 오류를 식별하고 정정하기 위해 합성되어야 하는 클론 복제 수를 감소시켜 시약 비용 및 데이터 처리 비용을 추가적으로 감소시킨다.
기판 표면의 분석 물질의 고밀도 분포
도 2a는 240nm 피치에 80nm 직경 결합 영역(스팟)의 고밀도 영역의 제안된 실시예를 도시한다. 이 실시예에서, 단일 가닥 DNA 분자가 칩 상의 특정 영역에 독점적으로 결합하는 정렬된 어레이가 사용될 수 있다. 일부 실시 예에서, 스팟을 과도하게 채우지 않도록 40kB보다 작은 연쇄동일서열(concatemers)(즉, 직렬로 연결된 동일한 DNA 서열의 다중 복제를 함유하는 긴 연속 DNA 분자)이 사용된다. 연쇄동일서열의 크기는 면적과 대략적으로 비례하며, 동일한 증폭 공정이 사용되는 경우 더 작은 연쇄동일서열의 예상 길이는 대략 4kB ~ 5kB가 되어 약 10복제가 된다. 4kB 길이의 DNA 및 서열 단일 분자를 직접 사용하는 것도 가능하다. 다른 옵션은 배제 분자(exclusionary molecule)를 생성하는 데 필요한 크기까지 총 길이를 확보하기 위해 DNA의 짧은 세그먼트를 서열이 지정되지 않은 필러 DNA와 결합시키는 것이다.
도 2b는 1,000달러 게놈에 사용된 샘플 유효 피치와 제안된 피치를 비교한 것이다. 신규 어레이의 밀도는 170배 더 높아서 100배 더 높은 밀도를 달성하는 기준을 충족한다. 단위 면적당 이미징 스팟 당 복제 수는 기존 플랫폼보다 최소 100배 낮은 기준을 충족한다. 이를 통해 시약 비용이 기준보다 100배 더 경제적이게 된다.
밀집 패킹된 단일 생체 분자 및 회절 한계 이미징
이미징 플랫폼의 증가된 분자 밀도에 대한 주요 제약은 회절 한계이다. 광학 시스템의 회절 한계는 하기 수학식 1과 같다.
[수학식 1]
여기서, 는 회절 한계, 는 광의 파장, 는 광학 시스템의 개구 수(numerical aperture)이다. 전형적인 공기 이미지 시스템은 가 0.6 내지 0.8이다. = 600nm를 사용하면, 회전 한계는 375nm 내지 500nm 이다. 수침 시스템(water immersion system)에서, 는 ~1.0이며, 회절 한계는 300nm 이다.
생체 분자를 포함하는 어레이 또는 다른 기판 표면상의 특징이 너무 가까운 경우, 두 개의 광학 신호가 겹치게 되며, 이미지만으로는 확실하게 구분할 수 없는 단일 얼룩만을 볼 수 있게 된다. 이는 움직이는 기판의 부정확한 추적으로 인한 블러(blur), 또는 센서와 기판 표면 사이의 광 경로의 광학적 변화와 같은 광학 이미징 시스템에 의해 야기된 에러에 의해 악화될 수 있다.
현미경의 표본 평면의 한 지점에서 나오는 투과 광 또는 형광 방출 파면은 대물 조리개(objective aperture)의 가장자리에서 회절되고, 파면을 효과적으로 확산시켜서, 유한한 중심 디스크를 가지나, 원래 점보다 큰 회절 패턴으로 확장되는 포인트 소스의 이미지를 생성한다. 따라서, 빛의 회절로 인해, 현미경 광학 시스템이 구조적 세부 사항을 해결할 수 없는 한계치가 있기 때문에, 표본의 이미지는 표본에 존재하는 실제 세부 사항을 완벽하게 나타내지 못한다.
현미경으로 서브 파장 구조를 관찰하는 것은 회절 한계로 인해 어렵다. 형광 단백질 또는 뉴클레오티드 단일 분자와 같은 현미경의 점 오브젝트는 간섭의 작용에 의해 생성 된 회절 패턴으로 구성된 중간 평면(intermediate plane)에서 이미지를 생성한다. 고배율인 경우, 포인트 대상의 회절 패턴은 일련의 회절 링으로 둘러싸인 중심점(회절 디스크)으로 구성되는 것으로 관찰된다. 결합된, 이러한 포인트 소스 회절 패턴을 에어리 디스크(Airy disk)라고 지칭한다.
에어리 패턴(Airy pattern)에서 중심점의 크기는 빛의 파장과 대물 렌즈의 조리개 각도와 관련이 있다. 현미경 대물 렌즈의 경우, 조리개 각도는 여기에는 대물 렌즈가 표본에서 빛을 모을 수 있는 반각인 sinθ라는 용어가 포함되는 개구 수(NA)로 설명된다. 해상도 측면에서, 횡방향(lateral)(x, y) 이미지 평면에서 회절 에어리 디스크의 반경은 다음 공식, 로 정의된다. 여기서, 는 투과광에서의 평균 조명 파장 또는 형광에서의 여기 파장 대역, 개구 수()는 이미징 매체의 굴절률(n; 일반적으로, 공기, 물, 글리세린 또는 오일)에 조리개 각도의 사인(sinθ)을 곱한 값으로 정의된다. 이 관계의 결과로, 포인트 소스에 의해 생성된 스팟의 크기는 파장이 감소하고 개구 수가 증가함에 따라 감소하지만 항상 유한한 직경의 디스크로 남아 있다. Abbe 해상도(즉, Abbe 한계)는 본 명세서에서 회절 한계라고도 하며 광학 시스템의 해상도 한계를 정의한다.
두 개의 에어리 디스크 또는 포인트-확산 기능 사이의 거리가 이 값보다 크면 두 포인트 소스가 해결된 것(쉽게 구별될 수 있는 것)으로 간주된다. 그렇지 않으면 에어리 디스크가 함께 병합되어 해결되지 않은 것으로 간주된다.
따라서, 파장 를 갖는 단일 분자 검출 가능한 표지 포인트 소스로부터 방출되고, 굴절률 을 갖는 매체에서 이동하고, 반각 를 갖는 스팟으로 수렴되는 광은 직경을 갖는 회절 제한 스팟: 을 만들 것이다. 약 500nm의 녹색광과 1의 NA(개구 수)를 고려하면, 회절 한계는 대략 이며, 이는 종래의 이미징 기술에 의해 이미지화될 수 있는 표면상의 단일 분자 단백질 및 뉴클레오티드와 같은 분석물의 밀도를 제한한다. 광학 현미경에 사용 가능한 최고 품질의 렌즈 요소가 장착되어 있고 완벽하게 정렬되어 있으며 개구 수가 가장 높은 경우에도 최상의 시나리오에서 해상도는 빛의 파장의 약 절반으로 제한된다. 해상도를 높이기 위해, UV 및 X-ray 현미경과 같은 더 짧은 파장을 사용할 수 있다. 이러한 기술은 더 나은 해상도를 제공하지만 비싸고, 생물학적 샘플의 대비(contrast) 부족으로 인해 샘플을 손상시킬 수 있다.
디콘볼루션
디콘볼루션은 기록된 데이터에 대한 컨볼루션의 영향을 되돌리는 데 사용되는 알고리즘 기반 프로세스이다. 디콘볼루션의 개념은 신호 처리 및 이미지 처리 기술에 널리 사용된다. 이러한 기술은 많은 과학 및 공학 분야에서 널리 사용되기 때문에 디콘볼루션은 많은 응용 분야를 찾는다.
광학 및 이미징에서, "디콘볼루션(deconvolution)"이라는 용어는 광학 현미경, 전자 현미경, 망원경 또는 다른 이미징 기기에서 발생하는 광학 왜곡을 역전시켜 보다 선명한 이미지를 생성하는 프로세스를 구체적으로 지칭한다. 일반적으로 현미경 이미지 처리 기술의 일부로 소프트웨어 알고리즘에 의해 디지털 영역에서 수행된다.
일반적인 방법은 기기를 통과하는 광학 경로가 광학적으로 완벽하고 포인트 확산 함수(PSF), 즉, 이론적인 빛(또는 다른 파)의 포인트 소스가 기기를 통과하는 경로에 대한 왜곡을 설명하는 수학적 함수와 관련이 있다고 가정하는 것이다. 일반적으로 이러한 점 소스는 최종 이미지에 약간의 퍼지 영역을 제공한다. 이러한 기능이 결정될 수 있다면, 그것은 역 또는 상보 기능을 계산하고, 획득된 이미지를 그것과 관련시키는 문제이다. 디콘볼루션은 푸리에 코-도메인(Fourier co-domain)의 디비전으로 매핑된다. 이를 통해 푸리에 변환의 대상이 되는 실험 데이터로 디콘볼루션을 쉽게 적용할 수 있다. 데이터가 시간 영역에 기록되지만 주파수 영역에서 분석되는 nmR 분광법이 그 예시이다. 지수 함수로 시간 영역 데이터를 나누면 주파수 영역에서 로렌지안 선(Lorenzian line)의 폭을 줄이는 효과가 있다. 결과는 원본으로, 왜곡되지 않은 이미지이다.
그러나, 회절 제한 이미징의 경우, 포인트 확산 함수가 완벽하게 알려져 있더라도 신호를 더 세분화하기 위해, 회절 한계를 넘어서 분해능을 향상시키기 위한 디콘볼루션(deconvolution)이 필요하다. 나이퀴스트 거리(Nyquist distance)보다 작은 거리에서 두 물체를 확실하게 분리하는 것은 매우 어려운 일이다. 그러나, 나이퀴스트 거리 보다 훨씬 작은 거리로 분리된 물체를 신뢰성 있게 검출하기 위해 사이클 검출, 분석물 위치 결정, 정렬 및 디콘볼루션을 이용하는 방법 및 시스템이 본 명세서에서 설명된다.
시퀀싱
광학 검출 이미징 시스템은 회절-제한적이고, 따라서 시퀀싱에 전형적으로 사용되는 형광단(fluorophores)을 갖는 ~ 300nm의 이론상 최대 해상도를 갖는다. 현재까지, 최상의 시퀀싱 시스템은 어레이에서 ~ 600nm의 인접한 폴리 뉴클레오티드 사이의 중심 간 간격 또는 ~ 2 X의 회절 한계를 가졌다. 이러한 2X 계수는 위치 오차를 유발할 수 있는 강도, 배열 및 생물학 변형을 설명하는 데 필요하다. 10달러의 게놈을 달성하기 위해서는 대략 200nm의 중심 간 간격이 필요하며, 이는 서브-회절-제한 이미징 능력이 필요하다.
시퀀싱을 위해, 본 명세서에 기술된 시스템 및 방법의 목적은 광학 시스템의 회절 한계 미만의 중심 간 간격을 갖는 기판 상에 시퀀싱된 폴리 뉴클레오티드를 해결하는 것이다.
본 명세서에 기술된 바와 같이, 본 발명자들은 각각의 분석물의 위치를 높은 정확도(예를 들어, 10nm RMS 이하)로 식별함으로써 서브-회절-제한 이미징을 달성하기 위한 방법 및 시스템을 제공한다. 이에 비해, 최첨단 초 고해상도 시스템(Harvard/STORM)은 이 시스템보다 2배 더 나쁜, 20nm RMS의 정확도로 위치를 식별할 수 있다. 따라서, 본 명세서에 개시된 방법 및 시스템은 서브-회절 제한-이미징이 기판상의 밀집 패킹된 분자를 식별하여 효소 단위당 높은 데이터 속도, 단위 시간당 데이터 속도를 및 10달러 게놈을 달성하기 위한 높은 데이터 정확도를 달성할 수 있게 한다. 이러한 서브-회절-제한 이미징 기술은 본 명세서에 기술된 바와 같은 사이클 검출(cycled detection)을 사용하는 기술에 광범위하게 적용 가능하다.
이미징 및 사이클 검출
본 명세서에 기술된 바와 같이, 각각의 검출 방법 및 시스템은 서브-회절-제한 이미징을 달성하기 위해 사이클 검출(cycled detection)을 필요로 한다. 사이클 검출은 결합 및 영상화 또는 가시광 광학 신호를 방출할 수 있는 검출 가능한 표지에 결합된 항체 또는 뉴클레오티드와 같은 프로브를 포함한다. 서로 다른 사이클의 일련의 필드 이미지에서 위치 정보를 사용함으로써, 밀집 패킹된 기판으로부터의 신호를 해결하기 위한 디콘볼루션(deconvolution)은 광학 이미징의 회절 한계로 인해 가려진 신호로부터 개별적인 광학 신호를 식별하는데 효과적으로 사용될 수 있다. 분자의 정확한 위치는 다중 사이클 이후 점점 더 정확해질 것이다. 픽셀 이산화 효과(discretization effects)로 인해 발생하는 크로스토크 매트릭스에서의 알려진 비대칭에 관한 크로스토크 보정을 돕기 위해 이 정보를 사용하여, 추가 계산이 수행될 수 있다.
사이클 프로브 결합 및 광학 검출을 사용하는 방법 및 시스템은 미국 공개 번호 제2015/0330974호, 단일 분자 검출을 이용한 분자 분석물의 디지털 분석(2015년 11월 19일 공개)에 기재되어 있으며, 그 전문이 본원에 참조로 포함된다.
일부 실시예에서, 로우 이미지(raw image)는 오버 샘플링된 이미지의 보다 정확한 결정을 용이하게 하기 위해 적어도 나이퀴스트 한계에 있는 샘플링을 사용하여 획득된다. 나이퀴스트 한계를 초과하는 샘플링에 의해 이미지를 나타내는 데 사용되는 픽셀 수를 늘리면(오버 샘플링) 이미지 처리 및 표시에 사용할 수 있는 픽셀 데이터가 증가한다.
이론적으로 대역폭-제한 신호는 나이퀴스트 속도 이상으로 샘플링하면 완벽하게 재구성될 수 있다. 나이퀴스트 속도는 신호에서 가장 높은 주파수 성분의 두 배로 정의된다. 오버 샘플링은 안티-앨리어싱 필터 성능 요구 사항을 완화하여 해상도를 개선하고 노이즈를 줄이며 앨리어싱 및 위상 왜곡을 방지한다. 나이퀴스트 속도의 N배로 샘플링된 신호는 N의 인자만큼 오버 샘플링된다.
따라서, 일부 실시예에서, 각각의 이미지는 관찰되는 광 파장의 절반 이하의 픽셀 크기로 촬영된다. 일부 실시예들에서, 162.5nm x 162.5nm의 픽셀 크기는 나이퀴스트 한계 또는 그 이상에서의 샘플링을 달성하기 위한 검출에 사용된다. 본 명세서에 기술된 시스템 또는 방법의 해상도를 최적화하기 위해 기판의 로우 이미징 동안 적어도 나이퀴스트 한계의 주파수에서의 샘플링이 바람직하다. 이것은 회절 한계 미만의 기판상의 피처를 높은 정확성으로 분해하기 위해 본 명세서에 설명된 디콘볼루션 방법 및 광학 시스템과 함께 수행될 수 있다.
상이한 사이클로부터 이미지 처리
서브-회절 제한 이미징을 달성하기 위해 본 발명에 의해 극복된 몇 가지 장벽이 있다.
픽셀화 오류(Pixelation error)는 로우 이미지에 존재하며 픽셀화로 인한 광학 신호에서 존재하는 정보의 식별을 방해한다. 본 명세서에 기술된 바와 같이 적어도 나이퀴스트 주파수에서 샘플링하고 오버 샘플링된 이미지의 생성은 각각 픽셀화 에러를 극복하는 것을 돕는다.
PSF 크기가 픽셀 크기(나이퀴스트 이하)보다 크고, 중앙 간 간격이 너무 작아 공간 중첩으로 인한 크로스토크가 발생하기 때문에 다양한 분자의 점-분포(PSF)는 중첩될 수 있다. 최근접 이웃 변수 회귀(중심 대 중심 크로스토크)는 여러 개의 중첩되는 광학 신호의 디콘볼루션을 돕기 위해 사용될 수 있다. 그러나 이것은 기판에서 각 분석물의 상대 위치를 알고 필드의 이미지를 잘 정렬하면 개선될 수 있다.
다중 사이클 후 분자의 정확한 위치는 점점 더 정확해질 것이다. 이러한 정보를 사용하여, 픽셀 이산화 효과 및 회절 한계로 인해 발생하는 광학 신호의 공간적 중첩에서 공지된 비대칭을 보정함으로써 디콘볼루션을 돕기 위한 추가적인 계산이 수행될 수 있다. 또한 이들은 서로 다른 방출 스펙트럼으로부터 방출 스펙트럼의 중첩을 보정하는 데 사용될 수 있다.
각 분석물에 대한 고정밀 상대 위치 정보는 각 분석물에 바인딩된 서로 다른 프로브의 광학 신호에서 측정된 피크 분포를 생성하기 위해 서로 다른 사이클에서 동일한 필드의 이미지를 오버레이 하여 획득될 수 있다. 이 분포는 분석물의 단일 상대 위치에 해당하는 피크 신호를 생성하는 데 사용될 수 있다. 사이클의 서브 세트로부터의 이미지는 각각의 분석물에 대한 상대 위치 정보를 생성하는데 사용될 수 있다. 일부 실시예에서, 이 상대 위치 정보는 국소화 파일(localization file)에 제공된다.
각 사이클마다 필드에 대해 이미징된 특정 영역은 사이클마다 상이할 수 있다. 따라서, 각각의 이미지에 대한 분석물 위치의 식별 정확도를 향상시키기 위해, 여러 사이클에 걸쳐 필드의 이미지 사이의 정렬이 수행될 수 있다. 이 정렬로부터, 참조 파일과 비교된 오프셋 정보가 식별되고 디콘볼루션 알고리즘에 통합되어 회절 한계로 인해 가려진 광학 신호에 대한 디콘볼루션 및 신호 식별의 정확도를 더 증가시킬 수 있다. 일부 실시 예에서, 이 정보는 필드 정렬 파일(Field Alignment File)에 제공된다.
신호 검출(크로스-토크/최근접 이웃)
기판상의 분석물에 대한 상대 위치 정보가 정확하게 결정되고 각 사이클의 필드 이미지가 이 위치 정보와 정렬되면, 크로스토크 및 최근접 이웃 회귀를 사용하는 각 오버 샘플링된 이미지의 분석을 사용하여 각 이미지의 각 분석물로부터의 광학 신호를 정확하게 식별할 수 있다.
일부 실시예에서, 광학 시스템의 회절 한계에 의해 가려진 복수의 광학 신호는 기판 상에 고정되고 검출 가능한 표지를 포함하는 프로브에 결합된 복수의 생체 분자 각각에 대해 식별된다. 일부 실시예에서, 프로브는 뉴클레오티드가 혼입되고 일련의 사이클은 합성에 의한 단일 분자 시퀀싱을 사용하여 어레이 상에 고정된 폴리 뉴클레오티드의 서열을 결정하는데 사용된다.
이미지에 적용된 디콘볼루션 시뮬레이션
분자 밀도는 이웃 분자의 크로스토크(crosstalk)에 의해 제한된다. 도 3은 단일 분자의 시뮬레이션 이미지를 도시한다. 이러한 특정 이미지는 2X 오버 샘플링된 필터로 처리된 600nm 피치에서 단일 분자배열의 시뮬레이션이다. 8개의 인접 스팟으로의 크로스토크는 배열 피치 및 알고리즘 유형의 함수로 평균화된다.
도 4는 본 명세서에 기술된 바와 같이, 복수의 피치 및 2개의 변형된 이미지 처리 알고리즘으로 처리된 일련의 이미지이고, 첫 번째는 2X 오버 샘플링된 이미지이고, 두 번째는 디콘볼루션을 갖는 4X 오버 샘플링된 이미지이다. 도 5 는 200nm까지 피치에서 이러한 두 가지 유형의 이미지 처리에 대한 크로스토크 분석이다. 2X 오버 샘플로 25% 이하에서 허용되는 크로스토크 레벨은 275nm 이상의 피치에서 발생한다. 광학 시스템의 포인트 확산 함수를 사용하여 4X 디콘볼루션으로 25% 이하에서 허용되는 크로스토크 레벨은 210nm 이상의 피치에서 발생한다.
분자의 물리적 크기는 결합 영역의 대략 절반 크기의 스팟을 넓힐 것이다. 예를 들어, 80nm 스팟의 경우 피치가 약 40nm 증가한다. 더 작은 스팟 크기가 사용될 수 있지만, 이는 더 적은 복제가 허용되고 더 큰 조도(illumination intensity)가 필요하다는 단점이 있다. 단일 복제는 가장 간단한 시료 준비를 제공하지만 가장 큰 조도를 요구한다.
이 시점에서 논의된 서브-회절 한계 이미징을 위한 방법은 오버 샘플링, 디콘볼루션 및 크로스토크 보정의 이미지 프로세싱 기술을 포함한다. 분석 물질에 대한 프로브 광학 신호 이미징의 여러 사이클로부터의 정보를 사용하여 기판상의 정확한 상대 위치 분석물의 결정을 포함하는 방법 및 시스템이 본 명세서에 설명된다. 이 정보를 사용하여, 픽셀 이산화 효과로 인해 발생하는 크로스토크 매트릭스에서의 알려진 비대칭에 관한 크로스토크 보정을 돕기 위한 추가 계산이 수행될 수 있다.
방법들
일부 실시예에서, 도 6에 도시된 바와 같이, 밀집 패킹된 기판의 표면 상에 고정된 분석 물의 상대 위치를 정확하게 결정하는 방법이 본 명세서에서 제공된다. 상기 방법은 먼저 표면을 포함하는 기판을 제공하는 단계를 포함하며, 상기 표면은 이산된 위치에서 표면에 고정된 복수의 분석물을 포함한다. 그 후, 상기 표면에 대한 프로브 바인딩 및 신호 검출의 복수의 사이클이 수행된다. 각 검출 사이클은 표면에 고정된 표적 분석물에 결합할 수 있는 프로브 세트와 분석물을 접촉시키는 단계; 상기 표면 상의 이산된 위치에서 상기 분석물에 결합된 개별 프로브로부터 복수의 광학 신호를 검출하기 위해 광학 시스템으로 상기 표면의 필드를 이미징하는 단계; 및 다른 검출 사이클이 수행될 경우 결합된 프로브를 제거하는 단계를 포함한다. 각각의 이미지로부터, 상기 복수의 사이클 중 적어도 2개에서 상기 필드의 이미지로부터 상기 복수의 광학 신호 각각의 피크 위치가 검출된다. 각각의 분석물에 대한 피크의 위치는 중첩되고, 기판 상의 각 분석물의 정확한 상대 위치가 결정되는 피크 클러스터를 생성한다.
일부 실시예에서, 도 7에 도시된 바와 같이, 이어서 기판 상의 분석물에 대한 정확한 위치 정보는 이미지에 적용되는 위치 정보를 포함하는 디콘볼루션 알고리즘에 사용되어 (예: 기판의 인접 분석물 사이의 중심에서 중심 사이의 간격을 식별하기 위해), 상기 이미지 각각으로부터 중첩되는 광학 신호를 디콘볼루션할 수 있다. 일부 실시예에서, 디콘볼루션 알고리즘은 중첩되는 광학 신호를 갖는 인접 분석물 사이의 공간 식별을 위한 최근접 이웃 변수 회귀를 포함한다.
일부 실시예에서, 도 8에 도시된 바와 같이, 분석물 검출 방법은 기판에 고정된 개별 폴리 뉴클레오티드의 서열 분석을 위해 적용된다.
일부 실시예에서, 광학 신호는 도 11에 도시된 바와 같이 밀집 패킹된 기판으로부터 디콘볼루션된다. 상기 단계는 도 9와 같이 4가지 섹션으로 구분될 수 있다: 1) 이미지 분석 단계, 이미지 분석 단계는 각 사이클에 대한 필드의 각 이미지로부터 오버 샘플링된 이미지를 생성, 및 이미지에서 검출된 각각의 광학 신호에 대한 피크 위치 및 강도를 포함하는 피크 파일(예를 들어, 데이터 세트)의 생성을 포함한다. 2) 국소화 파일(Localization File) 생성 단계, 국소화 파일 생성 단계는 기판상의 분석물의 정확한 상대 위치를 결정하기 위해 각각의 분석물에 대한 다수의 광학 신호 검출 사이클로부터 생성된 다수의 피크의 정렬을 포함한다. 3) 필드 정렬 파일(Field Alignment file) 생성 단계, 필드 정렬 파일 생성 단계는 상이한 검출 사이클로부터 필드의 이미지를 선택된 참조 이미지에 대해 정렬하기 위한 각 이미지에 대한 오프셋 정보를 포함한다. 4) 강도 추출(Extract Intensities) 단계, 강도 추출 단계는 디콘볼루션 모델링과 함께 오프셋 정보 및 위치 정보를 사용하여 각 오버 샘플링된 이미지에서 감지된 신호의 정확한 아이덴티티(identity)를 결정한다. “강도 추출” 단계는 또한 합성 처리 및 검출에 의한 시퀀싱의 에러를 정정하기 위해 사용된 이전 사이클 회귀와 같은 다른 에러 정정을 포함할 수 있다. 각 섹션에서 수행되는 단계는 아래에 자세히 설명되어 있다.
도 10a 및 도 11에 표시된 이미지 분석 단계에서, 각 사이클로부터의 각 필드의 이미지는 각각의 검출된 신호에 대한 픽셀 수를 증가시키고, 각 신호에 대한 피크를 선명하게 하고, 각 신호로부터 피크 강도를 식별하도록 처리된다. 이 정보는 (측정된 광학 신호의 피크로부터) 각 분석 물질의 위치 측정 및 각 신호의 피크 강도로부터의 강도의 측정 값을 포함하는 각 사이클에 대한 각 필드에 대한 피크 파일을 생성하는 데 사용된다. 일부 실시예에서, 각각의 필드로부터의 이미지는 먼저배경 분리(background subtraction)을 거쳐 이미지에서 노이즈를 초기에 제거한다. 그 후, 이미지는 평활화 및 디콘볼루션을 사용하여 처리되어 오버 샘플링된 이미지를 생성하는데, 여기에는 각 이미지에서 관찰된 신호의 모델링에 기초하여 인공적으로 생성된 픽셀을 포함한다. 일부 실시예에서, 오버 샘플링된 이미지는 로우 이미지로부터 각 픽셀로부터 4픽셀, 9픽셀 또는 16픽셀을 생성할 수 있다.
각각의 로우 이미지(raw image)에서 검출되거나 오버 샘플링된 이미지에 존재하는 광학 신호로부터의 피크가 식별되고, 각각의 검출된 분석물에 대한 강도 및 위치 정보가 추가적인 처리를 위해 피크 파일에 배치된다.
일부 실시예에서, 모든 이미지에 대응하는 N 로우 이미지는 기판의 각 사이클 및 각 필드로부터 검출되거나 각각의 이미지화된 필드에 대해 N 오버 샘플링된 이미지 및 N 피크 파일로 출력한다. 피크 파일은 각각의 이미지에 대한 각각의 검출된 분석물의 상대 위치를 포함한다. 일부 실시예에서, 피크 파일은 또한 각각의 검출된 분석물에 대한 강도 정보를 포함한다. 일부 실시예에서, 하나의 피크 파일은 각각의 사이클에서 각 색상 및 각 필드마다 생성된다. 일부 실시 예에서, 각각의 사이클은 다수의 패스를 더 포함하여, 하나의 피크 파일이 각각의 컬러에 대해 그리고 각각의 사이클에서 각각의 패스에 대한 각 필드에 대해 생성될 수 있다. 일부 실시예에서, 피크 파일은 단일 필드 내의 광학 신호로부터 피크 위치를 지정한다.
바람직한 실시예에서, 피크 파일은 각 사이클에 대해 처리된 각 오버 샘플링된 필드 이미지에서의 XY 위치 정보를 포함한다. XY 위치 정보는 오버 샘플링된 이미지로부터의 프로브(형광단과 같은)로부터 검출된 각각의 검출 가능한 표지의 위치의 추정된 좌표를 포함한다. 피크 파일은 또한 각각의 개별 검출 가능한 표지로부터의 신호로부터의 강도 정보를 포함할 수 있다.
오버 샘플링된 이미지의 생성은 픽셀화로 인해 추출될 수 없는 정보를 식별하기 위해 픽셀화 오류를 극복하는 데 사용된다. 평활화 및 디콘볼루션으로 로우 이미지를 초기 처리하면 피크 파일에 보다 정확한 정보를 제공하여 각 분석물의 위치를 보다 정확하게 결정할 수 있으며, 그리고 이러한 정보는 이후 회절 제한 이미징에서 가려진 신호의 보다 정확한 결정을 제공하기 위해 사용될 수 있다.
일부 실시예에서, 로우 이미지는 오버 샘플링된 이미지의 보다 정확한 결정을 용이하게 하기 위해 적어도 나이퀴스트 한계에 있는 샘플링을 사용하여 획득된다. 나이퀴스트 한계를 초과하여 샘플링하여 이미지를 나타내는 데 사용되는 픽셀 수를 늘리면(오버 샘플링) 이미지 처리 및 표시에 사용할 수 있는 픽셀 데이터가 증가한다.
이론적으로 대역폭-제한 신호는 나이퀴스트 속도 이상으로 샘플링하면 완벽하게 재구성될 수 있다. 나이퀴스트 속도는 신호에서 가장 높은 주파수 성분의 두 배로 정의된다. 오버 샘플링은 안티 앨리어싱 필터 성능 요구 사항을 완화하여 해상도를 개선하고 노이즈를 줄이며 앨리어싱 및 위상 왜곡을 방지한다. 나이퀴스트 속도의 N배로 샘플링된 신호는 N의 인자만큼 오버샘플링 된다.
따라서, 일부 실시예에서, 각각의 이미지는 관찰되는 광 파장의 절반 이하의 픽셀 크기로 촬영된다. 일부 실시예에서, 나이퀴스트 한계 또는 그 이상에서 샘플링을 달성하기 위해 162.5nm x 162.5nm의 픽셀 크기가 검출에 사용된다.
평활화는 근사화 기능을 사용하여 데이터에서 중요한 패턴을 캡처하는 동시에 노이즈 또는 기타 미세한 구조/급속한 현상을 제거한다. 평활화에서는 신호의 데이터 점이 수정되어 개별 점이 줄어들고, 인접한 점보다 낮은 점이 증가하여 신호가 더 평활화된다. 본 명세서에서 평활화는 신호로부터 피크 및 강도를 더 잘 식별하기 위해 각 이미지에서 검출된 회절 제한 광학 신호를 평활화하기 위해 사용된다.
각각의 로우 이미지는 회절 제한되지만, 상이한 사이클로부터 동일한 분석물로부터 다수의 신호를 수집하는 방법이 본 명세서에 기재되어있다. 이 방법의 실시예는 도 10b의 흐름도에 도시되어 있다. 각각의 분석물로부터의 이들 다중 신호는 각각의 개별 이미지로부터의 회절 제한 신호보다 훨씬 더 정확한 위치를 결정하는데 사용된다. 이들은 5nm 미만의 해상도에서 필드 내의 분자를 식별하는 데 사용될 수 있다. 이 정보는 도 11에 도시된 바와 같이 국소화 파일로 저장된다. 그런 다음 크로스토크 회귀 및 최근접 변수 회귀와 같은, 디콘볼루션 알고리즘과 함께 고도의 정확한 위치 정보를 사용하여 각 개별 필드 이미지의 신호 식별을 크게 개선할 수 있다.
도 11에 도시된 바와 같이, 국소화 파일을 생성하는 단계는 피크 파일에 제공된 위치 정보를 사용하여 기판상의 분석물 세트의 상대 위치를 결정한다. 일부 구체 예에서, 각각의 국소화 파일은 기판의 단일 이미지 필드로부터의 분석물 세트로부터 상대 위치를 포함한다. 국소화 파일은 여러 사이클의 위치 정보를 결합하여 회절 한계 미만에서 검출된 분석물에 대해 매우 정확한 위치 정보를 생성한다.
일부 실시예에서, 각각의 분석물에 대한 상대 위치 정보는 평균적으로 10nm 미만의 표준 편차(즉, RMS 또는 제곱 평균 제곱)로 결정된다. 일부 실시예에서, 각각의 분석물에 대한 상대 위치 정보는 평균적으로 10nm 2X 표준 편차 미만으로 결정된다. 일부 실시예에서, 각각의 분석 물에 대한 상대 위치 정보는 평균적으로 10nm 3X 표준 편차 미만으로 결정된다. 일부 실시예에서, 각각의 분석물에 대한 상대 위치 정보는 10nm 중앙 표준 편차 미만으로 결정된다. 일부 실시예에서, 각각의 분석물에 대한 상대 위치 정보는 10nm 중앙값 2X 표준 편차 미만으로 결정된다. 일부 실시예에서, 각각의 분석물에 대한 상대 위치 정보는 10nm 중앙값 3X 표준 편차 미만으로 결정된다.
상이한 사이클의 필드에 대한 피크 파일의 하위 집합에서 국소화 파일이 생성되어 어레이에서 분석물의 위치를 결정한다. 도 11에 도시된 바와 같이, 일부 실시예에서, 피크 파일은 먼저 광학 시스템에서의 수차를 설명하기 위해 포인트 확산 함수를 사용하여 정규화된다. 정규화된 피크 파일은 피크 파일에 제공된 위치 및 강도 정보에 기초하여 인공 정규화된 이미지를 생성하는데 사용될 수 있다. 그런 다음 각 이미지가 정렬된다. 일부 실시예에서, 정렬은 각각의 이미지 쌍을 상관시키고 미세 조정을 수행함으로써 수행될 수 있다. 일단 정렬되면, 각 사이클로부터 각각의 분석물에 대한 위치 정보가 오버레이되어 기판상의 위치 측정의 분포를 제공할 수 있다. 이 분포는 기판에서 분석물의 매우 정확한 상대 위치를 제공하는 단일 피크 위치를 결정하는 데 사용된다. 일부 실시예에서, 단일 피크를 결정하기 위해 포아송 분포(Poisson distribution)가 각각의 분석물에 대한 오버레이 위치에 적용된다.
사이클로부터 위치 정보의 적어도 서브 세트로부터 결정된 피크는 위치 결정 파일에 기록되며, 이는 회절 한계 미만의 정확도를 갖는 각각의 검출된 분석 물의 상대 위치의 측정치를 포함한다. 기술된 바와 같이, 이 정보를 결정하기 위해서는 서브 세트의 사이클로부터의 이미지가 필요하다.
도 11에 도시된 바와 같이, 각 사이클 및 컬러에 대한 각 필드로부터의 정규화된 피크 파일 및 정규화된 국소화 파일은 필드의 참조 이미지에 대한 필드로부터 각 이미지에 대한 오프셋 정보를 생성하는데 사용될 수 있다. 이 오프셋 정보는 밀집 패킹된 기판 및 회절 제한 이미지로부터의 신호 식별의 추가적인 개선을 위한 각각의 로우 이미지에서 분석물의 상대 위치 결정의 정확도를 향상시키기 위해 사용될 수 있다. 일부 실시예에서, 이러한 오프셋 정보는 필드 정렬 파일로서 저장된다. 일부 실시예에서, 조합된 국소화 파일 및 필드 정렬 파일로부터의 필드에서의 각각의 분석물의 위치 정보는 10nm RMS 미만, 5nm RMS 미만, 또는 2nm RMS 미만이다.
일부 실시예에서, 필드 정렬 파일은 필드로부터 마스터 파일에 대한 오프셋 정보를 결정함으로써 단일 필드로부터의 이미지들의 정렬에 의해 생성된다. 각 필드마다 하나의 필드 정렬 파일이 생성된다. 이러한 파일은 모든 사이클에서 필드의 모든 이미지에서 생성되며 필드의 참조 이미지에 대한 필드의 모든 이미지에 대한 오프셋 정보를 포함한다.
일부 실시예에서, 정렬 전에, 각각의 피크 파일은 포인트 확산 함수로 정규화되고, 이어서 정규화된 피크 파일로부터 인공 이미지가 생성되고 인공 이미지의 푸리에 변환이 이어진다. 정규화된 피크 파일의 인공 이미지의 푸리에 변환은 대응하는 필드에 대한 정규화된 국부화 파일로부터 인공 이미지의 푸리에 변환의 콤플렉스 컨쥬게이트(complex conjugate)와 관련된다. 이는 각 사이클에 대해 피크 파일마다 수행된다. 결과 파일은 이미지 파일을 재 생성하기 위해 역 푸리에 변환을 거치며, 이미지 파일은 필드에서 참조 파일을 기준으로 정렬되어 각 이미지 파일에 대한 오프셋 정보를 생성한다. 일부 실시예에서, 이러한 정렬은 참조 파일에 대한 미세 조정을 포함한다.
필드 정렬 파일은 따라서 오버 샘플링된 각각의 이미지에 대한 오프셋 정보를 포함하고, 대응하는 필드에 대한 국소화 파일과 함께 사용되어 후속 "강도 추출 "단계에서 사용하기 위해 각 분석물에 대해 매우 정확한 상대 위치를 생성할 수 있다.
예를 들어, 한 필드에서 20사이클이 수행되고, 4개의 컬러 각각에 대해 하나의 이미지가 생성되어 80개의 필드 이미지가 생성되는 경우, 필드를 촬영한 모든 80개 이미지 (20사이클 * 4컬러)에 대해 하나의 필드 정렬 파일이 생성된다. 일부 실시예에서, 필드 정렬 파일 내용은 필드, 각각의 이미지에 대해 관찰된 색상, 사이클 검출(예를 들어, 바인딩 또는 스트리핑)의 단계 유형, 및 참조 이미지에 대한 이미지 오프셋 좌표를 포함한다.
일부 실시예에서, 정렬 프로세스 동안, 2개의 이미지들을 정렬하는데 필요한 XY "시프트" 또는 "잔차(residual) "이 계산되고, 나머지 이미지들에 대해 프로세스는 반복되고, 모든 것에 적용하기 위해 최적 적합 잔차가 계산된다.
일부 실시예에서, 임계 값을 초과하는 잔차가 폐기되고, 최적 적합이 다시 계산된다. 이러한 과정은 모든 개별 잔차가 임계 값 내에 올 때까지 반복된다.
그런 다음 각 오버 샘플링된 이미지는 국소화 파일로부터의 정확한 위치 정보와 필드 정렬 파일로부터 오프셋 정보를 사용하여 디콘볼루션된다. 강도 추출 단계의 실시예가 도 10c 및 도 11에 도시되어있다. 중심 간 간격이 너무 작아 인접 분석물로부터의 신호의 포인트 확산 함수가 중첩되므로 다양한 분자의 포인트 확산 함수(PSF)이 중첩된다. 정확한 분석물 위치 정보 및/또는 오프셋 정보와 조합된 최근접 이웃 변수 회귀는 회절 한계로 인한 분해능을 억제하는 중심 간 거리를 갖는 인접 분석 물질로부터 신호를 분리하기 위해 사용될 수 있다. 각각의 분석 물에 대한 정확한 상대 위치 정보의 사용은 회절 한계 아래의 이웃 분석물로부터의 광학 신호의 공간적 디콘볼루션을 용이하게 한다. 일부 실시예에서, 인접 분석물의 상대 위치는 인접 분석물의 정확한 중심 간 거리를 결정하는데 사용되며, 이는 각각의 개별 이미지로부터의 신호의 디콘볼루션(deconvolution)에 사용하기 위해 인접 분석물 사이의 공간적 크로스토크를 추정하기 위해 광학 시스템의 포인트 확산 함수와 조합하여 사용될 수 있다. 이는 폴리 뉴클레오티드 시퀀싱과 같은 광학적 검출 기술을 위한 회절 한계 미만의 분석물 밀도를 갖는 기판의 사용을 가능하게 한다.
특정 실시예에서, 방출 스펙트럼은 상이한 신호들 사이에서 중첩된다(즉, "크로스토크"). 예를 들어, 합성에 의한 시퀀싱 동안, 시퀀싱 공정에 사용된 4가지 염료는 전형적으로 방출 스펙트럼에서 약간 중첩된다.
특정 실시예에서, 서로 다른 컬러 채널간에 크로스토크가 발생하고 서로 다른 이미지 세트에 대해 크로스토크가 다른 경우 사이클 동안 획득 한 이미지 세트에서 서로 다른 피처에 색상(예: 염기 콜, base call)을 할당하는 문제는 사용된 각각의 상이한 검출 가능한 표지로부터의 광학 신호로부터 겹치는 방출 스펙트럼을 제거하기 위해 각각의 오버 샘플링된 이미지에 대한 국소화 및 필드 정렬 파일과 함께 크로스토크 회귀에 의해 해결될 수 있다. 이는 기판상의 각각의 분석 물에 결합 된 각각의 프로브에 대한 검출 가능한 표지 아이덴티티(label identity)의 식별 정확도를 추가로 증가시킨다.
따라서, 일부 실시예에서, 본 명세서에 개시된 바와 같은 사이클로부터 필드의 단일 이미지로부터 신호의 강도 및/또는 신호의 식별은 다음 특징을 사용한다: 1) 오버 샘플링된 이미지 - 정의된 위치에서 강도와 신호를 제공함. 2) 정확한 상대 위치 - 현지화 파일(사이클의 적어도 일부 서브 세트의 정보에서 위치 정보를 제공함) 및 필드 정렬 파일(필드의 모든 이미지에 대한 오프셋/정렬 정보를 제공함). 3) 이미지 처리 - 필드에서 각 분석물에 대한 정확한 상대 위치 정보를 사용하는 최근접 이웃 변수 회귀(공간 디콘볼루션) 및 크로스토크 회귀(방출 스펙트럼 디콘볼루션). 각 분석물에 대한 프로브(예: 검출용 항체 또는 서열 분석용 상보적 뉴클레오티드)의 정확한 식별.
이미지 처리 시뮬레이션
본 명세서에 개시된 방법 및 시스템의 효과는 도 12a, 도 12b, 도 13a 및 도 13b에 도시된 시뮬레이션된 크로스토크 플롯으로 도시되어 있다. 이들 각각의 도면에, 10um X 10um 영역에서 각각의 검출된 분석물에서 4개의 형광단 중 하나와 상관된 방출 스펙트럼의 세기를 나타내는 크로스토크 플롯이 도시되어 있다. 4개의 형광단 중 하나에 대응하는 각각의 축은 플롯의 각 코너로 연장된다. 따라서, 플롯의 중앙에 위치한 스팟은 4개의 모든 형광단에서 동일한 강도의 기여를 한다. 이미징 사이클 동안 개별 형광단으로부터 검출된 방출 강도는 스팟을 X, Y; X, -Y; -X, Y; 또는 -X, -Y 방향으로 이동 시키도록 할당된다. 따라서, 이들 4개의 축을 따라 스팟 집단의 분리는 분석물 위치에서 형광단으로부터 명확한 디콘볼루션된 신호를 나타낸다. 각각의 시뮬레이션은 10.075 um x 10.075 um 영역에서 1024 분자의 검출에 기초하여, 마이크론 제곱 당 10.088 분자의 밀도, 또는 약 315nm의 분자 사이의 평균 중심간 거리를 나타낸다. 이것은 162.5nm x 162.5nm의 픽셀 크기에서 약 62 x 62 픽셀의 이미징 영역과 관련이 있다.
도 12a는 로우 이미지에서 검출된 광학 신호로부터 4개의 형광단 사이의 형광단 세기의 크로스토크 플롯을 도시한다. 도 12b 및 도 13a는 각각 4X 오버 샘플링된 이미지를 생성함으로써 달성된 4개의 형광단 사이의 분리를 도시하며, 이는 각각의 분석물에서 크로스토크의 일부 제거의 달성을 나타낸다. 도 13b는 동일한 이미징 영역에 대한 디콘볼루션 및 최근접 이웃 회귀를 갖는 크로스토크 플롯을 도시하며, 도 11에 도시되고 본 명세서에 기술된 바와 같이 수행된다. 도 13a 및 도 12a를 비교하면, 검출된 각각의 분석물은 다른 형광단으로부터 광학 신호의 명확한 분리를 보여, 각각의 분석물에 대해 매우 정확한 형광단 식별을 나타낸다.
도 14a 및 도 14b는 위에서 시뮬레이션한 각 검출된 10.075 μm x 10.075 μm 영역의 시뮬레이션된 4색 합성(4-color composite)을 도시한다. 이는 로우 이미지(도 14a) 및 본원에 기술된 바와 같이 처리된 이미지(도 14b)로부터의 분석물 사이의 선명도를 시각적으로 나타낸다.
시퀀싱
상기 내용 및 도 11에 서술된 방법은 또한 밀집 패킹된 폴리 뉴클레오티드를 포함하는 기판상의 성장하는 상보성 가닥에 포함된 상보적 가역적 종결인자의 광학적 검출을 사용하는 합성에 의한 시퀀싱을 용이하게 한다. 따라서, 회절 한계 미만의 중심 간 거리에서 이웃하는 폴리 뉴클레오티드의 서열과 상관되는 신호는 본 명세서에 기재된 방법 및 광학적 검출 시스템을 사용하여 확실하게 검출될 수 있다. 시퀀싱 동안의 이미지 프로세싱은 또한 시퀀싱 반응 또는 검출에서의 에러를 보정하기 위해 기판상에서 반복된 클론 서열 또는 데이터 자체에 기초한 이전 사이클 회귀를 포함할 수 있다. 일부 실시예에서, 시퀀싱을 위해 기판에 고정된 폴리 뉴클레오티드는 연쇄동일서열(concatemers)이다. 연쇄동일서열은 서열 분석될 폴리 뉴클레오티드의 다수의 동일한 복제를 포함할 수 있다. 따라서, 본 명세서에 기술된 방법 및 시스템에 의해 식별 된 각각의 광학 신호는 혼입된 뉴클레오티드로부터 단일 검출 가능한 표지(예를 들어, 형광단)을 지칭할 수 있거나, 또는 단일 연쇄동일서열의 다수의 위치에 결합된 다수의 검출 가능한 표지를 지칭할 수 있으며, 신호는 여러 위치의 평균이다. 발생해야 하는 해상도는 개별 감지 가능한 표지 사이가 아니라 기판에 고정된 다른 연쇄동일서열 사이이다.
일부 구체예에서, 시퀀싱될 단일 또는 다중 복제 분자는 표면상의 올리고 뉴클레오티드를 포획하기 위해 하이브리드화함으로써 공유 결합에 의해, 또는 다른 비공유 결합에 의해 표면에 결합될 것이다. 결합된 분자는 수백 사이클 동안 표면에 남아있을 것이며, 초기 시퀀싱 프라이머를 스트리핑한 후, 상이한 변이체의 존재를 확인하기 위해 다른 프라이머 세트로 다시 조사될 수 있다.
일 실시예에서, 형광단 및 블록킹 기는 화학 반응을 사용하여 제거될 수 있다.
다른 실시예에서, 형광단 및 블록킹 기는 UV 광을 사용하여 제거될 수 있다.
일 실시예에서, 시퀀싱 될 분자는 직경이 50-100nm인 반응성 표면에 고정될 수 있고, 이러한 영역은 150-300nM의 피치로 이격될 것이다. 이들 분자는 표적 디콘볼루션을 위해 그 위에 부착된 바코드 및 시퀀싱을 개시하기 위한 시퀀싱 프라이머 결합 영역을 가질 수 있다. 버퍼는 신장 반응(extension reaction)을 가능하게 하기 위해 적절한 양의 DNA 폴리머라제를 함유할 것이다. 이들 부위는 이용 가능한 임의의 유전자 증폭 방법(PCR, 전체 게놈 증폭 등)에 의해 생성될 시퀀싱될 표적의 10-100 복제 수를 포함할 수 있다.
다른 실시예에서, 바코드 및 프라이머 어닐링 부위로 태그된 단일 표적 분자는 60-150nM의 피치로 이격된 20-50nM 직경의 반응성 표면에 고정될 것이다. 분자는 개별적으로 서열 분석될 것이다.
일 실시예에서, 프라이머는 표적에 결합할 것이고 단일 또는 다중 형광단(들)과 함께 한 번에 하나의 dNTP를 사용하여 연장될 것이고; 표면은 이미지화될 것이고, 형광단은 제거되고 세척될 것이며 프로세스는 반복되어 제2 연장부를 생성할 것이다. 동일한 dNTP에 다수의 형광단이 존재하면 게놈의 일부 영역(2-5 이상)에 존재하는 반복 뉴클레오티드의 수를 정의할 수 있다.
다른 실시예에서, 프라이머 어닐링 후, 형광단 및 차단된 3 '하이드록실기를 갖는 4개의 dNTP가 모두 폴리머라제 연장 반응에 사용될 것이며, 표면이 이미지화되고 형광단 및 블록킹 기가 제거되고, 공정이 복수 사이클 동안 반복된다.
다른 실시예에서, 서열은 주어진 위치에서 특정 뉴클레오티드의 존재에 기초하여 연결되는 특정 프로브를 어닐링하는 결찰 반응(ligation reactions)에 기초하여 추론될 수 있다.
전술한 기술을 사용하여 종래 기술의 랜덤 어레이에 비해 개선된 밀도를 갖는 랜덤 어레이가 사용될 수 있지만, 랜덤 어레이는 일반적으로 정렬된 어레이의 면적 밀도가 4배 내지 10배 감소된다. 랜덤 어레이의 장점은 칩을 위한 균일하고 패턴화되지 않은 표면과 더 긴 가닥의 배제 특성에 의존할 필요가 없기 때문에 더 짧은 핵산 가닥의 사용을 포함한다.
등가물 및 범위
당업자는 본 명세서에 기재된 본 발명에 따른 특정 실시 양태와 많은 등가물을 일상적인 실험을 사용하여 인식하거나 확인할 수 있을 것이다. 본 발명의 범위는 상기 설명으로 제한되는 것이 아니라 첨부된 청구 범위에 설명된 바와 같다.
청구 범위에서, "a", "an"및 "the"와 같은 관사는 달리 지시되거나 문맥상 명백하지 않는 한 하나 이상을 의미할 수 있다. 하나 이상의 그룹 구성원 사이에 "또는"을 포함하는 청구 또는 설명은 문맥에서 반대로 또는 명백하게 표시되지 않는 한 하나 이상의 그룹 구성원 중 하나 이상이 모든 제품 또는 공정에 존재하거나, 채용되거나, 또는 관련이 있는 경우 충족된 것으로 간주된다. 본 발명은 그룹의 정확히 하나의 구성원이 주어진 제품 또는 공정에 존재하거나, 채용되거나, 또는 이와 관련이 있는 구체 예를 포함한다. 본 발명은 하나 이상의 또는 모든 그룹 구성원이 주어진 제품 또는 공정에 존재하거나, 채용되거나, 또는 이와 관련이 있는 구체 예를 포함한다.
"포함하는"이라는 용어는 개방적인 것으로 의도되며 추가 요소 또는 단계의 포함을 허용하지만 요구하지는 않는다. 용어 "포함하는"이 본 명세서에서 사용될 때, "구성되는"이라는 용어도 포함되고 개시된다.
범위가 주어지면 끝 점이 포함된다. 또한, 당업자에게 문맥 및 이해로부터 달리 지시되거나 달리 명백하지 않는 한, 범위로 표현 된 값은 언급된 범위 내의 임의의 특정 값 또는 하위 범위를 상이한 실시 양태에서 가정할 수 있음을 이해해야 한다. 문맥 상 명백하게 다르게 지시되지 않는 한, 본 발명은 범위의 하한의 단위의 10분의 1에 해당한다.
본 명세서에 인용된 모든 인용된 출처, 예를 들어, 참고 문헌, 간행물, 데이터베이스, 데이터베이스 항목 및 기술은 인용에 명시적으로 언급되지 않더라도 본 출원에 참고로 포함된다. 인용된 출처와 본 출원의 진술이 상충하는 경우, 본 출원의 진술이 우선한다.
섹션과 테이블 제목은 제한적이지 않다.
실시예
하기는 본 발명을 수행하기 위한 특정 실시예의 예시이다. 실시예는 단지 예시의 목적으로 제공되며, 본 발명의 범위를 어떠한 방식으로도 제한하려는 것은 아니다. 사용된 수(예를 들어, 양, 온도 등)와 관련하여 정확성을 보장하기 위해 노력했지만, 물론 일부 실험 오차 및 편차가 허용되어야 한다.
달리 지시되지 않는 한, 본 발명의 실시는 당업자에게 통상적인 단백질 화학, 생화학, 재조합 DNA 기술 및 약리학적 방법을 이용할 것이다. 이러한 기술은 문헌에 충분히 설명되어있다. 예를 들어, T.E. Creighton, Proteins: Structures and Molecular Properties(W.H. Freeman and Company, 1993); A.L. Lehninger, Biochemistry(Worth Publishers, Inc., current addition); Sambrook, et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual(2nd Edition, 1989); Methods In Enzymology(S. Colowick and N. Kaplan eds., Academic Press, Inc.); Remington's Pharmaceutical Sciences, 18th Edition(Easton, Pennsylvania: Mack Publishing Company, 1990); Carey and Sundberg Advanced Organic Chemistry 3rd Ed.(Plenum Press) Vols A and B(1992).
실시예 1: 밀집 어레이
이하의 방법은 피치가 200nm에서 333nm 사이인 정사각형배열을 사용하는 방법을 설명한다. 더 작은 피치를 허용하는 추가 방법이 설명될 것이다. 이미징 시스템은 2018년 3월 2일자로 출원된 국제 출원 PCT/US2018/020737에 기재되어 있고, 본 명세서에 참고로 포함되며, 이는 서브 회절 한계 이미징을 가능하게 하는 참조 시스템으로서 사용될 것이다. 광학 시스템은 필드 크기가 332.8 um x 332.8 um인 초당 최대 100Hz 프레임(fps)으로 작동하는 복수의 2,048 x 2,048 픽셀 카메라를 포함할 수 있다. 이 시스템은 90fps 이상에서 단일 플루오르를 측정할 수 있다. 85fps에서 분자당 1-10개 복제(또는 1-10 개의 형광단)와 함께 이 시스템을 사용하면 15분 이내에 63mm x 63mm 슬라이드를 이미징하는 데 필요한 처리량이 달성된다. 생화학 사이클 및 영상화는 2개의 칩을 사용하거나 단일 칩을 2개 이상의 영역으로 나누어 연속적이고 동시에 수행된다.
실시예 2 : 합성에 의한 시퀀싱을 이용한 단일 분자 시퀀싱
합성에 의한 시퀀싱 접근법을 이용한 단일 분자 시퀀싱은 Apton 시스템에서 평가되었다. 방법론을 테스트하기 위해, 5 '포스페이트 그룹을 갖는 단일 가닥 DNA 템플릿을 먼저 EDC(1-Ethyl-3-(3-mplate dimethylaminopropyl) carbodiimide) 화학을 통해 플로우 셀의 테카보하이드라지드(tecarbohydrazide) 활성화 실리콘 표면을 갖는 칩에 부착시켰다. 시퀀싱 프라이머는 표면에 고정화된 표적에 어닐링되었다. 우리의 초기 연구에 사용된 시퀀싱 템플릿은 EGFR L858R, EGFR T790M 및 BRAF V600E 돌연변이를 포함하는 합성 올리고 뉴클레오티드 및 ERCC 00013 및 ERCC 00171 대조 RNA 전 사체로부터 역 전사된 2개의 cDNA 샘플을 포함하였다. DNA 주형 고정화 및 프라이머 어닐링 후, 플로우 셀은 시퀀싱 반응을 위해 Apton 기기에 로딩되는데, 여기에는 여러 사이클의 효소 단일 뉴클레오티드 혼입 반응, 형광 염료 검출을 검출하기 위한 이미징, 이어서 화학적 절단이 포함된다. NEB로부터의 테르미네이터 IX DNA 폴리머라제(Therminator IX DNA Polymerase)는 단일 염기 연장 반응에 사용되었고, 이는 변형된 디데옥시 뉴클레오티드를 도입하는 능력이 향상된 9 ° NTM DNA 폴리머라제(9°NTM DNA Polymerase) 변이체이다. 반응에 사용된 4개의 dNTP는 4개의 상이한 절단 가능한 형광 염료로 표지되고 3 '-OH기에서 절단 가능한 모이어티(cleavable moiety)(dCTP-AF488, dATP-AFCy3, dTTP-TexRed 및 dGTP-Cy5)로 차단된다. 각각의 시퀀싱 반응 사이클 동안, 단일 표지된 dNTP가 혼입되고 dNTP상의 3'- 블록킹 기 때문에 반응이 종결된다. dNTP 혼입 후, 혼입되지 않은 뉴클레오티드를 세척에 의해 플로우 셀로부터 제거하고 혼입된 형광 염료 표지된 뉴클레오티드를 영상화하여 염기를 확인한다. 이미지가 포착된 후, 형광 염료 및 차단 모이어티는 100 mM TCEP (tris(2-carboxyethyl)phosphine), pH9.0)를 사용하여 혼입된 뉴클레오티드로부터 절단되어, 다음 사이클에서 다음 상보적 뉴클레오티드의 후속 첨가를 허용한다. 이 연장, 검출 및 절단 사이클(cleavage cycle)은 판독 길이를 증가시키기 위해 반복된다.
도 15a는 동일한 양의 돌연변이 및 야생형(WT) 표적을 함유하는 EGFR 유전자에서 코돈 790 주변 영역에 상응하는 합성 올리고 뉴클레오티드 주형의 1 : 1 혼합물의 서열 분석 결과를 보여준다. 프라이머 후 첫 번째 염기(WT의 C-포괄 및 돌연변이의 T-포괄)에서 돌연변이로 코돈 790 근처의 EGFR 유전자의 영역에 상응하는 합성 주형을 시퀀싱하는데 사용되는 염료 표지된 뉴클레오티드의 도입으로부터의 이미지. 도 15a의 몽타주는 교대 염기 혼입 및 절단 사이클로부터의 이미지를 도시한다. 이 데이터는 시스템이 10사이클의 기본 통합을 감지하는 능력을 보여주며, 화살표는 관찰된 기본 변화를 나타낸다.
사용된 합성 올리고 뉴클레오티드는 약 60개의 뉴클레오티드 길이였다. 코돈 790에서의 돌연변이 이전에 하나의 염기로 끝나는 서열을 갖는 프라이머를 사용하여 연장 n 반응을 가능하게 하였다. DNA 폴리머라제에 의해 뉴클레오티드의 혼입 후 및 TCEP와의 절단 반응 후 표면을 이미지화 하였다. 황색 원은 염료 혼입의 10회 연속 사이클로부터의 데이터를 사용하여 정렬된 주형 분자의 위치를 나타낸다. 실제 염기 혼입이 노동 집약적인 육안 검사에 의해 확인된 후, 공지된 색 혼입 서열로 분자를 동정하였다.
염료 표지된 뉴클레오티드를 사용하여 RNA 주형으로부터 생성 된 cDNA를 서열 분석 하였다. 사용된 RNA는 클로닝된 ERCC 대조군 플라스미드로부터의 T7 전사에 의해 생성되었다. 도 15b는 교대 염기 혼입 및 절단 사이클로부터의 이미지를 도시한다. 데이터는 시스템이 10사이클의 염기 혼입을 검출하는 능력을 나타낸다. 관찰된 서열은 정확했다. 노란색 화살표는 절단 사이클을 나타낸다.
구체적으로, T7 전사에 의해 ERCC(외부 RNA 대조군 컨소시엄) 대조군 플라스미드로부터 생성된 전사체에 상응하는 cDNA 주형을 시퀀싱하였다. 생성 된 cDNA 분자는> 350 뉴클레오티드 길이였다. DNA 폴리머라제에 의해 뉴클레오티드의 혼입 후 및 TCEP와의 절단 반응 후 표면을 이미지화하였다. 도 15b의 황색 원은 염료 혼입의 10회 연속 사이클로부터의 데이터를 사용하여 정렬된 주형 분자의 위치를 나타낸다. 데이터는 이미지를 수동으로 관찰함으로써 10사이클의 뉴클레오티드 혼입을 수동으로 검출하는 능력을 나타냈다.
실시예 3: 단일 분자 변이체에 대한 상대 위치 결정
도 16은 기판 상에 고정되고 형광단을 포함하는 프로브에 의해 결합된 단일 분자의 이미지이다. 분자는 고체 지지체에 공유 결합된 세포 용해물로부터의 ERK 단백질에 결합된 anti-ERK 항체이다. 항체는 분자 당 3-5 개의 형광단으로 표지된다. 예를 들어, 합성에 의한 시퀀싱 동안, 단일 플루오르 핵산 표적으로 유사한 이미지를 획득할 얻을 수 있다.
검출 정확도를 향상시키기 위해, 분자는 연속적인 프로브 결합 및 스트리핑의 사이클(이 경우 30 사이클)을 겪는다. 각 라운드에서 이미지는 분자의 위치를 결정하기 위해 처리된다. 이미지는 배경 분리, 2X로 오버 샘플링되며, 이후 피크가 식별된다. 여러 층의 사이클이 20nm 그리드에 겹쳐진다. 위치 편차는 표준 편차 또는 반지름을 측정 수의 제곱근으로 나눈 값이다. 도 17, 오른쪽 패널은 중첩된 각 사이클의 각 피크를 도시한다. 왼쪽 패널은 오른쪽 패널이 평활화된 버전이다. 각 밝은 점은 분자를 나타낸다. 분자 위치는 200nm 미만의 분자 대 분자 거리로 분해할 수 있다. 도 18은 필드에서 발견된 복수의 분자 각각에 대한 국소화 변화를 보여준다. 중앙값 국소화 분산은 5nm이고 3 시그마 국소화 분산은 10nm 미만이다.
다른 실시예
사용된 단어는 제한이 아니라 설명의 단어이며, 본 발명의 진정한 범위 및 사상을 벗어나지 않고 첨부 된 청구 범위의 범위 내에서 변경이 이루어질 수 있음을 이해해야 한다.
본 발명은 몇 가지 설명된 실시예들과 관련하여 어느 정도의 길이 및 특정도로 설명되었지만, 그러한 특정 또는 실시예 또는 임의의 특정 실시예로 제한되도록 의도된 것은 아니며, 그러나 종래 기술의 관점에서 그러한 청구 범위의 가능한 가장 넓은 해석을 제공하기 위해 첨부된 청구 범위에 대한 참조로 해석되어야 하고, 따라서, 본 발명의 의도된 범위를 효과적으로 포함한다.
본 명세서에 언급된 모든 간행물, 특허 출원, 특허 및 기타 참고 문헌은 그 전문이 참고로 포함된다. 충돌이 있을 경우, 정의를 포함한 본 명세서가 우선 할 것이다. 또한, 섹션 제목, 재료, 방법 및 예는 단지 예시적인 것이며 제한하려는 것이 아니다.

Claims (135)

  1. 복수의 분석물의 처리 또는 분석을 위한 방법으로, 상기 방법은:
    제곱 마이크로미터 당 적어도 1 분자의 밀도로 인접하게 고정된 상기 복수의 분석물을 지지하는 기판을 제공하는 (a) 단계;
    상기 기판에 인접하게 고정된 상기 복수의 분석물의 하나 이상의 분석물에 결합하는 프로브의 복수의 사이클들에 걸쳐 상기 기판으로부터 중첩하는 복수의 광학 신호들을 획득하는 (b) 단계; 및
    상기 중첩하는 복수의 광학 신호들 중 적어도 2개의 광학 신호들을 처리하여 상기 복수의 분석물의 상기 하나 이상의 분석물을 식별하는 (c) 단계를 포함하고,
    상기 복수의 분석물의 적어도 10%는 상기 적어도 2개의 광학 신호들 중 어느 하나의 광학 신호의 미만만큼 서로 분리되고, 상기 λ는 상기 하나의 광학 신호의 광의 파장을 포함하고, 상기 NA는 상기 중첩하는 복수의 광학 신호들을 획득하도록 구성되는 광학 이미징 시스템의 개구 수를 포함하는, 방법.
  2. 제1 항에 있어서,
    상기 (b) 단계는 이미지 처리 모듈을 구성하여 상기 복수의 분석물의 상기 하나 이상의 분석물에 결합하는 상기 프로브의 복수의 사이클들로부터의 상기 적어도 2개의 광학 신호들을 오버레이하는 단계를 더 포함하고, 및
    상기 (c) 단계는 상기 적어도 2개의 광학 신호들의 상기 오버레이에 광학 분포 모델을 적용하여 상기 복수의 분석물의 상기 하나 이상의 분석물을 식별하는 단계를 더 포함하는, 방법.
  3. 제2 항에 있어서,
    상기 이미지 처리 모듈을 사용하여 상기 복수의 분석물의 상기 하나 이상의 분석물에 결합하는 상기 프로브의 상기 복수의 사이클들에 대한 필드 이미지로부터 더 높은 픽셀 밀도를 가지는 상기 적어도 2개의 광학 신호들로부터 오버 샘플링된 이미지를 생성하는 단계를 더 포함하는, 방법.
  4. 제1 항에 있어서,
    상기 복수의 분석물은 제곱 마이크로미터 당 적어도 2 분자의 밀도로 상기 기판에 인접하게 고정되는, 방법.
  5. 제1 항에 있어서,
    상기 복수의 분석물은 제곱 마이크로미터 당 적어도 4 분자의 밀도로 상기 기판에 인접하게 고정되는, 방법.
  6. 제1 항에 있어서,
    상기 적어도 2개의 광학 신호들은 250 나노미터당 1 픽셀 이하의 해상도에서 광학 이미징 모듈에 의해 획득되는, 방법.
  7. 제1 항에 있어서,
    상기 복수의 분석물의 적어도 하나의 분석물은 핵산 분자인, 방법.
  8. 제1 항에 있어서,
    상기 복수의 분석물의 적어도 하나의 분석물은 단백질 또는 폴리펩티드인, 방법.
  9. 제1 항에 있어서,
    상기 적어도 2개의 광학 신호들은 형광 신호인, 방법.
  10. 복수의 분석물의 처리 또는 분석을 위한 시스템으로, 상기 시스템은:
    제곱 마이크로미터 당 적어도 1 분자의 밀도로 인접하게 고정된 상기 복수의 분석물을 지지하도록 구성된 기판;
    상기 기판에 인접하게 고정된 상기 복수의 분석물의 하나 이상의 분석물에 결합하는 프로브의 복수의 사이클들에 걸쳐 상기 기판으로부터 중첩하는 복수의 광학 신호들을 획득하도록 구성된 광학 이미징 모듈; 및
    상기 중첩하는 복수의 광학 신호들 중 적어도 2개의 광학 신호들을 처리하여 상기 복수의 분석물의 상기 하나 이상의 분석물을 식별하도록 구성된 이미지 처리 모듈을 포함하고,
    상기 복수의 분석물의 적어도 10%는 상기 적어도 2개의 광학 신호들 중 어느 하나의 광학 신호의 미만만큼 서로 분리되고, 상기 λ는 상기 하나의 광학 신호의 빛의 파장을 포함하고, 상기 NA는 상기 중첩하는 복수의 광학 신호들을 획득하도록 구성되는 광학 이미징 시스템의 개구 수를 포함하는, 시스템.
  11. 제10 항에 있어서,
    상기 이미지 처리 모듈은 상기 복수의 분석물의 상기 하나 이상의 분석물에 결합하는 상기 프로브의 복수의 사이클들에 걸쳐 상기 기판으로부터의 상기 적어도 2개의 광학 신호들을 오버레이하고, 상기 적어도 2개의 광학 신호들의 상기 오버레이에 광학 분포 모델을 적용하여 상기 복수의 분석물의 상기 하나 이상의 분석물을 식별하도록 구성되는, 시스템.
  12. 제11 항에 있어서,
    상기 이미지 처리 모듈은 상기 복수의 분석물의 상기 하나 이상의 분석물에 결합하는 상기 프로브의 상기 복수의 사이클들에 대한 필드 이미지로부터 더 높은 픽셀 밀도를 가지는 상기 적어도 2개의 광학 신호들로부터 오버 샘플링된 이미지를 생성하도록 더 구성되는, 시스템.
  13. 제10 항에 있어서,
    상기 복수의 분석물은 제곱 마이크로미터 당 적어도 2 분자의 밀도로 상기 기판에 인접하게 고정되는, 시스템.
  14. 제10 항에 있어서,
    상기 복수의 분석물은 제곱 마이크로미터 당 적어도 4 분자의 밀도로 상기 기판에 인접하게 고정되는, 시스템.
  15. 제10 항에 있어서,
    상기 복수의 분석물의 적어도 하나의 분석물은 핵산 분자인, 시스템.
  16. 제10 항에 있어서,
    상기 복수의 분석물의 적어도 하나의 분석물은 단백질 또는 폴리펩티드인, 시스템.
  17. 제10 항에 있어서,
    상기 적어도 2개의 광학 신호들은 형광 신호인, 시스템.
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