KR102662319B1

KR102662319B1 - 페디오코커스 펜토사세우스 cacc616 균주 및 이를 유효성분으로 함유하는 사료 조성물

Info

Publication number: KR102662319B1
Application number: KR1020230118495A
Authority: KR
Inventors: 김대혁; 김양선; 박소연; 박미애; 장현준
Original assignee: 재단법인 농축산용미생물산업육성지원센터
Priority date: 2023-09-06
Filing date: 2023-09-06
Publication date: 2024-04-30
Anticipated expiration: 2043-09-06

Abstract

본 발명은 소의 분변에서 유래한 신균주 페디오코커스 펜토사세우스 CACC616 및 이를 유효성분으로 함유하는 사료 조성물을 제공한다.
본 발명의 페디오코커스 펜토사세우스 CACC616 균주는 내산성, 내담즙성 내열성 및 장세포 부착능이 우수하고, 용혈성, 바이오제닉아민 생성, 및 항생제 내성이 없어 안전하며, 항염증 사이토카인으로 알려진 IL-10 유전자의 발현을 억제하여 우수한 항염증 활성을 나타내며, 가축 급여시 사료요구율(feed conversion ratio)감소를 통해 경제성을 증대시켰고, 악취 원인물질의 생성을 감소시켜 분변 악취 저감에 효과적이며, 세포성 면역반응에 주요 역할을 담당하는 백혈구를 정상범위에서 증가시켜 가축의 면역력을 강화하는 한편, 혈중 BUN(blood urea nitrogen)과 크레아티닌(creatinine)을 감소시켜 소화 효율을 제고하고, 메탄의 생성에 직접 관련된 메타노브레비박터(Methanobrevibac sp.) 속 균주의 장내 증식을 억제하여, 가축 사료의 프로바이오틱스 균주로 사용하기에 적합하다.

Description

페디오코커스 펜토사세우스 CACC616 균주 및 이를 유효성분으로 함유하는 사료 조성물{Novel Strain of Pediococcus pentosaceus CACC616, and Feed Composition Using thereof}

본 발명은 페디오코커스 펜토사세우스 CACC616 균주 및 이를 유효성분으로 함유하는 사료 조성물에 관한 것으로, 보다 상세히는 항염증, 사료요구율 감소, 분변 악취 제거, 및 장내 메탄발생 원인균의 억제 활성을 나타내는 페디오코커스 펜토사세우스 CACC616 균주 및 이를 유효성분으로 함유하는 사료 조성물에 관한 것이다.

축산물의 대량 속성 사육이 보편화되고 있는 현대에는 사육시설이 최대한 가축의 움직임을 축소하여 속성사육 및 비육에만 집중되도록 설치되므로, 가축의 입장에서는 매우 열악한 환경을 가지게 되었다.

열악한 사육시설로 인하여 가축의 스트레스가 증가하면서 면역력이 떨어지게 되므로 최근에는 사료에 항생제를 함께 공급하는 실정이다. 이러한 항생제가 포함된 사료의 급여는, 사료에 항생제를 함께 공급할 경우, 가축의 성장 속도가 향상되고 특히 어린 가축의 성장 촉진 및 사료 섭취량의 증가와 같은 사료효율 개선에 효과가 있음이 밝힌 1946년 무어(Moore)의 연구로부터 비롯되는데, 이러한 결과는 이후에도 여러 연구에서 뒷받침되고 있다.

이와 같이 성장 촉진 목적으로 사료에 첨가되는 항생제는 통상 치료 목적으로 투여되는 양에 비하여 현저히 적은 양이며, 사료 생산원가에서 항생제가 차지하는 부분은 1%를 넘지 않으나, 가축 사육 농가에서 얻을 수 있는 실제 이익은 크다. 사육 농가, 사육 농가가 선호하는 사료를 공급하려는 사료제조업체, 그리고 보다 낮은 값으로 축산물을 구입할 수 있는 소비자 입장에서 본다면 성장 촉진 용도로의 항생제 사용은 결코 평가 절하될 수 없는 위대한 발견이고 쉽게 포기할 수도 없는 현실이기도 하다.

그러나, 상기한 항생제가 축산물에 잔류하면서 항생제 내성균 문제가 최근 사회적인 이슈로 대두되고 있다.

한편, 상기한 항생제 외에도 설파제가 성장 촉진을 위한 사료 첨가제로 광범위하게 사용되고 있고, 질병의 예방과 치료의 목적으로도 널리 사용되고 있어서 식육에 잔류할 위험이 크다.

이에 따라 선진국에서는 항생제, 설파제 등의 사용을 금하는 추세이며, 국내에서도 배합사료 제조용 항생제의 사용을 금지하고 있다.

항생제를 대체하기 위한 용도로 개발된 프로바이오틱스 균주는 사람이나 동물이 섭취했을 때 위장관에 머물러 생존하면서 특정 병리적 상태를 예방하거나 치료하여 유익한 효과를 주는 미생물을 말하는 것으로, 프로바이오틱스 균주는 장내 유익한 미생물의 균 수와 활성을 증가시켜 장내 균총을 정상으로 회복시키기는 역할을 한다.

따라서, 장내 유용한 프로바이오틱스 균주를 선정하기 위해서는 다음의 몇 가지 중요한 성상을 확인하며 선정한다(Fuller, 1989; Garriga et al., 1998; Martin et al., 2006; Mishra and Prasad, 2005). 즉, 프로바이오틱스 균주가 소화관 내에서도 생존해야 하므로, 내산성이나 내담즙성을 가져야 하고, 장에 도달할 때까지 소화관에서 콜로니를 형성해야 한다. 또한, 식품이나 사료 또는 임상적으로 사용 시 안전해야 하며, 동시에 숙주에 유익한 영향을 줄 수 있어야 한다. 최근에는 많은 기능적인 특성이 있는 프로바이오틱스 균주들이 개발되고 있는데, 병원체의 증식을 억제하는 기능을 갖는 프로바이오틱스 균주가 있고, BSH 활성(Begley et al., 2006; Pereira et al., 2003) 또는 전분가수분해 활성(amylolytic activity, Lee et al., 2001; Vizoso Pinto et al., 2006)을 갖는 프로바이오틱스 균주 등이 있다.

그러나, 프로바이오틱스 균주 연구는 사람의 건강이나 가축의 생산성 향상에 주로 초점을 맞추어 진행되고 있는 측면이 있었으며, 아직까지 가축의 면역 관련 질환의 발병 억제, 분변 악취 제거, 및 장내 메탄발생 원인균의 억제에 2 이상의 효과를 나타내는 프로바이오틱스 균주의 개발은 소수인 실정이다.

이에, 본 발명자들은 면역 관련 질환에 효과적인 프로바이오틱스 균주를 찾기 위해 예의 연구노력한 결과, 소의 분변에서 분리된 신균주 페디오코커스 펜토사세우스 CACC616 균주가 내산성, 내담즙성, 내열성 및 장내 부착능이 우수하여 프로바이오틱스 균주로 사용하기에 적합한 동시에, 항염증, 사료요구율 감소, 분변 악취 제거, 및 장내 메탄발생 원인균의 억제에 우수한 효과가 있음을 확인하고, 본 발명을 완성하게 되었다.

(0001) 특허공개 제10-2022-0006863호(2022.01.18), 페디오코커스 펜토사세우스 KI62 및 이의 용도 (0002) 특허공개 제10-2019-0070673호(2019.06.21), 항균 활성을 나타내는 페디오코커스 펜토사세우스 균주 및 이의 용도

따라서, 본 발명의 주된 목적은 내산성, 내담즙성, 내열성 및 장내부착능이 우수하여 프로바이오틱스 균주로 사용하기에 적합한 동시에, 항염증, 사료요구율 감소, 분변 악취 제거, 및 장내 메탄발생 원인균의 억제에 우수한 효과를 나타내는 신균주 페디오코커스 펜토사세우스 CACC616을 제공하는 데 있다.

또한, 본 발명의 다른 목적은 상기 페디오코커스 펜토사세우스 CACC616 균주를 유효성분으로 함유한 사료 또는 식품 조성물을 제공하는 데 있다.

본 발명의 다른 목적 및 이점은 하기의 발명의 상세한 설명, 청구범위 및 도면에 의해 보다 명확하게 된다.

본 발명의 한 양태에 따르면, 본 발명은 프로바이오틱스 신균주인 페디오코커스 펜토사세우스 CACC616(수탁번호: KACC 92546P)을 제공한다.

본 발명의 용어 "페디오코커스 펜토사세우스(Pediococcus pentosaceus) CACC616(수탁번호: KACC 92546P)" 균주는 본 발명자들에 의해 소의 분변에서 새롭게 분리 동정된 신규한 페디오코커스 펜토사세우스 균주로서, "CACC616 균주" 또는 "616 균주"와 혼용하여 사용할 수 있다.

본 발명의 신균주 페디오코커스 펜토사세우스 CACC616(수탁번호: KACC 92546P)은 항염증, 사료요구율 감소, 분변 악취 제거, 및 장내 메탄발생 원인균의 억제 활성을 나타내는 것을 특징으로 한다.

본 발명자들은 인간 또는 가축에 사용할 수 있는 프로바이오틱스의 개발을 위해 인간 또는 가축에 유용한 미생물에 대해 수년간 조사 분석하였고, 그 결과 소의 분변에서 유래한 페디오코커스 펜토사세우스 CACC616 균주가 ⅰ) 내산성, 내담즙성 내열성 및 장세포 부착능이 우수하고, ⅱ) 용혈성, 바이오제닉아민 생성, 및 항생제 내성이 없어 가축에 안전하게 사용할 수 있으며, ⅲ) 항염증 사이토카인으로 알려진 IL-10 유전자의 발현을 억제하여 우수한 항염증 활성을 나타내고, ⅳ) 가축 급여시 사료요구율(feed conversion ratio)을 감소시키며, ⅴ) 악취 원인물질의 생성을 감소시켜 분변 악취 저감에 효과적이고, ⅵ) 세포성 면역반응에 주요 역할을 담당하는 백혈구를 정상범위에서 증가시켜 면역력을 강화하는 한편, 혈중 BUN(blood urea nitrogen)과 크레아티닌(creatinine)을 감소시켜 소화 효율을 제고하고, ⅶ) 메탄의 생성에 직접 관련된 메타노브레비박터(Methanobrevibac sp.) 속 균주의 장내 증식을 억제하여, 사료 조성물 또는 식품 조성물에 프로바이오틱스 균주 원료로 유용하게 사용될 수 있음을 확인하였다.

본 발명의 신균주 페디오코커스 펜토사세우스 CACC616(수탁번호: KACC 92546P)은 서열번호 1의 16s rRNA 서열을 갖는 것을 특징으로 한다.

본 발명자들은 상기 16s rRNA 유전자 서열을 종래 공지된 균주들의 유전자 서열들과 비교 분석한 결과, 본 발명의 균주가 페디오코커스 펜토사세우스에 속하는 새로운 균주임을 확인하여 페디오코커스 펜토사세우스 CACC616으로 명명하였고, 농촌진흥청 국립농업과학원 미생물은행에 2023년 08월 08일자로 기탁하였고, 수탁번호 KACC 92546P를 부여받았다.

본 발명의 다른 양태에 따르면, 본 발명은 신균주 페디오코커스 펜토사세우스 CACC616(수탁번호: KACC 92546P), 또는 그 배양액을 유효성분으로 하는 사료 조성물을 제공한다.

본 발명의 상기 페디오코커스 펜토사세우스 CACC616(수탁번호: KACC 92546P) 균주는 내산성, 내담즙성, 내열성 및 장내부착 활성이 우수하여 사료 조성물 내의 프로바이오틱 균주 원료로 사용되기에 적합하다. 본 발명의 바람직한 실시예에서는 CACC616 균주가 pH 2.5의 강산성 조건에서도 88.4%의 생존율을 나타내고, 담즙 조건에서도 95.7% 이상의 생존율을 나타내며, 70℃의 고온 조건에서도 71.1%의 균주가 생존하여 매우 우수한 내열성 특성을 갖는 것을 확인한 바 있다(표 1 및 도 1 참조). 또한, CACC616 균주는 사람 유래 장상피세포주인 HT-29 세포에서 86.8% 수준으로 부착하고, 돼지 유래 장상피세포주인 IPEC-J2 세포에서 75.1% 수준으로 부착하여 사람과 가축의 장상피세포에 효과적으로 부착하는 특성이 있음을 확인한 바 있다(표 2 및 도 2 참조).

또한, 본 발명의 상기 페디오코커스 펜토사세우스 CACC616(수탁번호: KACC 92546P) 균주는 용혈성, 바이오제닉아민 생성, 및 항생제 내성을 나타내지 않는 안정한 균주로 사료 조성물 내의 프로바이오틱 균주 원료로 사용되기에 안전하다. 본 발명의 바람직한 실시예에서는 CACC616 균주가 용혈성(투명환)을 나타내지 않는 감마용혈(γ-hemolysis) 타입으로 혈액 안정성이 있고(도 3 참조), 바이오제닉 아민 5종(putrescine, cadaverine, histamine, spermidine, spermine) 중 염증유도인자인 히스타민(histamine)을 전혀 생성시키지 않으며, 나머지 4종은 인체에 무해한 극미량 수준으로 생성시킴을 확인한 바 있다. 또한, 앰피실린, 젠타마이신, 에리쓰로마이신, 클린다마이신, 클로람페니콜의 항생제에 감수성을 나타내는 것을 확인한 바 있다.

본 발명의 사료 조성물에서, 상기 페디오코커스 펜토사세우스 CACC616(수탁번호: KACC 92546P) 균주 또는 그 배양액은 염증 억제 유전자인 IL-10 유전자의 발현을 증가시켜 항염증 활성을 나타내는 것을 특징으로 한다. 본 발명의 바람직한 실시예에서는 Raw 264.7 세포와 CACC616 균주의 공배양을 통해 Raw 264.7 세포 내의 IL-10 사이토카인 유전자의 발현이 현저하게 증가하는 것이 분석되었고, 이를 통해 CACC616 균주가 염증반응을 억제하는데 매우 효과적인 것을 확인한 바 있다(도 4 참조).

본 발명의 사료 조성물에서, 상기 페디오코커스 펜토사세우스 CACC616(수탁번호: KACC 92546P) 균주 또는 그 배양액은 가축 분변의 악취 원인물질인 n-뷰틸산(n-Butyric acid), n-발레르산(n-valeric acid), p-크레졸(p-Cresol), 인돌(Indole), 스카톨(skatole, 3-methylindole), 황화수소(H₂S), 및 메틸메르캅탄(methyl mercaptan)의 생성을 억제하여 악취 제거 활성을 나타내는 것을 특징으로 한다. 본 발명의 바람직한 실시예에서는 CACC616 균주 급여를 통해 분변 악취의 원인물질인 n-뷰틸산(n-Butyric acid), n-발레르산(n-valeric acid), p-크레졸(p-Cresol), 인돌(Indole), 스카톨(skatole, 3-methylindole), 황화수소(H₂S), 및 메틸메르캅탄(methyl mercaptan)이 CACC616 균주 무처리 대조군과 비교하여 각각 53.2%, 48.2%, 46.6%, 78.6%, 57.9%, 82.6%, 및 65.2% 감소하는 것을 확인한 바 있으며, CACC616 균주가 악취 원인물질의 저감에 효과적임을 확인한 바 있다(표 8 참조).

본 발명의 사료 조성물에서, 상기 페디오코커스 펜토사세우스 CACC616(수탁번호: KACC 92546P) 균주 또는 그 배양액은 가축 혈액 내의 백혈구 수치를 증가시켜 면역증진 활성을 나타내고, 가축 분변의 메탄 생성 원인균인 메타노브레비박터(Methanobrevibac sp.) 속 균주의 장내 생장을 억제하는 것을 특징으로 한다. 본 발명의 바람직한 실시예에서는 CACC616 균주 급여를 통해 혈액 내 백혈구(WBC) 수치가 CACC616 균주 미급여 대조군에 비해 8.6% 정도 증가하는 것을 확인한 바 있고, 이를 통해 CACC616 균주가 가축의 세포성 면역 증진에 도움을 주는 것을 확인한 바 있다(도 5A 참조). 또한, CACC616 균주 급여를 통해 CACC616 균주 미급여 대조군 대비 혈중 BUN(blood urea nitrogen)과 크레아티닌(creatinine)이 각각 31.4% 및 15.1% 감소한 것으로 분석되어 실험동물의 소화율이 개선된 것을 확인할 수 있었다(도 5B 참조). 또한, CACC616 균주 급여를 통해 CACC616 균주 미급여 대조군 대비 평균 칼프로텍틴 함량이 50.4% 감소하였고, CACC616 균주가 장내 염증 감소에 직접적으로 기여함을 확인한 바 있다(도 6 참조). 또한, 본 발명의 CACC616 균주의 급여를 통해 속(Genus) 수준에서 CACC616 균주 미급여 대조군 대비 유산균인 락토코커스(Lactococcus sp.) 속 균주가 증가하는 경향을 확인하였고, 특히, 메탄의 생성에 직접 관련된 메타노브레비박터(Methanobrevibac sp.) 속 균주를 감소시키는 것을 확인한 바 있다(도 7 참조).

발명의 용어 "사료"는 동물이 먹고, 섭취하며, 소화시키기 위한 또는 이에 적당한 임의의 천연 또는 인공 규정식, 한끼식 등 또는 상기 한끼식의 성분을 의미한다. 일 양태로, 본 발명의 페디오코커스 펜토사세우스 CACC616(수탁번호: KACC 92546P) 균주를 함유하는 사료용 조성물에는 농후사료, 조사료 및/또는 특수사료가 포함될 수 있다.

상기 농후사료에는 밀, 귀리, 옥수수 등의 곡류를 포함하는 종자 열매류, 곡물을 정제하고 얻는 부산물로서 쌀겨, 밀기울, 보릿겨 등을 포함하는 겨류, 콩, 유체, 깨, 아마인, 코코야자 등을 채유하고 얻는 부산물인 깻묵류와 고구마, 감자 등에서 녹말을 뺀 나머지인 녹말 찌꺼기의 주성분인 잔존 녹말질류 등의 찌꺼기류, 어분, 물고기 찌꺼기, 어류에서 얻은 신선한 액상물을 농축시킨 것인 피시 솔루블, 육분, 혈분, 우모분, 탈지분유, 우유에서 치즈, 탈지유에서 카제인을 제조할 때의 잔액인 훼이(whey)를 건조한 건조 훼이 등의 동물질 사료, 효모, 클로렐라, 해조류 등이 있다.

또한, 상기 조사료에는 야초, 목초, 풋베기 등의 생초사료, 사료용 순무, 사료용 비트, 순무의 일종인 루터베어거 등의 뿌리채소류, 생초, 풋베기작물, 곡실 등을 사일로에 채워 놓고 젖산 발효시킨 저장사료인 사일리지(silage), 야초, 목초를 베어 건조시킨 건초, 작물의 짚, 콩과 식물의 잎 등이 있다.

또한, 상기 특수사료에는 굴 껍데기, 암염 등의 미네랄 사료, 요소나 그 유도체인 디우레이드이소부탄 등의 요소사료, 천연사료 원료만을 배합했을 때 부족하기 쉬운 성분을 보충하거나, 사료의 저장성을 높이기 위해서 배합사료에 미량으로 첨가하는 물질인 사료첨가물 등이 있다.

또한, 본 발명에 있어서 상기 사료는 곤충류, 어류, 조류 또는 포유류의 사료일 수 있으며, 바람직하게, 축산법 제2조 제1호 및 동법 시행규칙 제2조 각호에서 정의하고 있는, 야생 습성이 순화되어 사육하기에 적합하며 농가의 소득증대에 기여할 수 있는 곤충 또는 이의 유충, 가축 또는 수산생물의 사료일 수 있다. 상기 가축에는 소, 말, 노새, 당나귀, 염소, 산양, 면양, 사슴, 돼지, 토끼, 가금류 등일 수 있으며, 가금류에는 닭, 칠면조, 오리, 타조, 거위, 메추리 등, 바람직하게는 닭일 수 있으나, 사육하여 축산물을 얻기에 적합한 것이라면 이에 제한되는 것은 아니다. 상기 "축산물"은 축산법 제2조 3호의 정의인, 가축에서 생산된 고기, 젖, 알, 꿀과 이들의 가공품, 원피(원모피를 포함한다), 원모, 기타 가축의 생산물로서 농림부령이 정하는 것을 의미한다. 또한 반려동물을 포함하여 개, 고양이 등일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

다른 일 예로, 상기 사료 조성물은 투여될 가축의 종류, 나이 및 기타 사료 성분의 종류에 따라 적절하게 사용될 수 있다.

본 발명의 사료 조성물은 영양소 보충 및 체중감소 예방, 사료 내 섬유소의 소화 이용성 증진, 유질 개선, 번식 장애 예방 및 수태율 향상, 하절기 고온 스트레스 예방 등 다양한 효과를 나타내는 물질을 추가로 포함할 수 있다. 예를 들어 탄산수소나트륨, 벤토나이트(bentonite), 산화마그네슘, 복합광물질 등의 광물질제제, 아연, 구리, 코발트, 셀레늄 등의 미량 광물질인 미네랄제제, 케로틴, 비타민 E, 비타민 A, D, E, 니코틴산, 비타민 B 복합체 등의 비타민제, 메티오닌, 리이산 등의 보호아미노산제, 지방산 칼슘염 등의 보호지방산제, 효모배양물, 곰팡이 발효물 등의 생균, 효모제 등이 추가로 포함될 수 있다.

또 다른 양태로서, 본 발명은 상기 사료 조성물을 가축에 투여하는 단계를 포함하는, 가축의 염증 억제, 면역증진, 분변 악취 제거, 및 메탄 방출 감소 방법을 제공한다.

상기 투여는 어떠한 적절한 방법으로 가축에 본 발명의 조성물을 도입하는 것을 의미하며, 본 발명의 조성물 투여 경로는 목적 조직에 도달할 수 있는 한 경구 또는 비경구의 다양한 경로를 통하여 투여될 수 있다. 본 발명자들은 본 발명의 사료 조성물을 경구 투여하더라도 급성 독성이 나타나지 않는다.

본 발명의 특징 및 이점을 요약하면 다음과 같다:

(1) 본 발명은 소의 분변에서 유래한 신균주 페디오코커스 펜토사세우스 CACC616 및 이를 유효성분으로 함유하는 사료 조성물을 제공한다.

(2) 본 발명의 페디오코커스 펜토사세우스 CACC616 균주는 ⅰ) 내산성, 내담즙성 내열성 및 장세포 부착능이 우수하고, ⅱ) 용혈성, 바이오제닉아민 생성, 및 항생제 내성이 없어 안전하며, ⅲ) 항염증 사이토카인으로 알려진 IL-10 유전자의 발현을 억제하여 우수한 항염증 활성을 나타내며, ⅳ) 가축 급여시 사료요구율(feed conversion ratio)을 감소시키고, ⅴ) 악취 원인물질의 생성을 감소시켜 분변 악취 저감에 효과적이며, ⅵ) 세포성 면역반응에 주요 역할을 담당하는 백혈구를 정상범위에서 증가시켜 가축의 면역력을 강화하는 한편, 혈중 BUN(blood urea nitrogen)과 크레아티닌(creatinine)을 감소시켜 소화 효율을 제고하고, ⅶ) 메탄의 생성에 직접 관련된 메타노브레비박터(Methanobrevibac sp.) 속 균주의 장내 증식을 억제하여, 가축 사료의 프로바이오틱스 균주로 사용하기에 적합하다.

도 1은 CACC616 균주의 내산성, 내담즙성 및 내열성 시험 결과를 정리한 그래프이다.
도 2는 사람 유래 장상피세포주인 HT-29 세포 및 돼지 유래 장상피세포주인 IPEC-J2 세포에서 CACC616 균주가 갖는 부착 특성을 평가하여 정리한 그래프이다.
도 3은 Sheep blood가 포함된 고체배지에 CACC616 균주를 획선배양 한 후, 콜로니 주변의 용혈성 유무를 확인한 결과 사진이다.
도 4는 CACC616 균주의 처리에 따른 IL-10 유전자의 발현 변화를 측정하여 정리한 그래프이다.
도 5는 CACC616 균주 급여에 따른 혈액 내 성분 변화를 정리한 그래프(5A) 및 소화율 관련 인자의 변화를 정리한 그래프(5B)이다.
도 6은 CACC616 균주 급여에 따른 칼프로텍틴 함량을 측정한 그래프이다.
도 7은 CACC616 균주 급여에 따른 분변 마이크로바이옴 분석 결과를 정리한 그래프이다.
도 8은 신균주 페디오코커스 펜토사세우스 CACC616 균주의 계통도를 도식화한 그림이다.

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하기로 한다. 이들 실시예는 단지 본 발명을 예시하기 위한 것이므로, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지는 않는다.

실시예 1. 소 분변 유래 미생물의 내산성, 내담즙성 및 장내부착 활성 검증

가축 병원균에 대한 면역조절 활성과 생장 촉진 활성을 갖는 동시에, 스트레스 감소 및 분변 악취물질 저감 활성을 갖는 프로바이오틱스(probiotics)의 후보군을 선별하기 위해서 소의 분변 시료에서 혐기적 조건으로 채취된 미생물들의 생균제 특성을 검증하였다.

1-1. 내산성, 내담즙성 및 내열성

소 분변으로부터 분리한 균주의 내산성 및 내담즙 특성 연구를 위해 분리 균주들을 호기 조건에서 MRS(BD Difco™, USA) 배지를 이용하여 37℃에서 24시간 배양하여 실험에 사용하였다.

내산성 시험은 0.05M sodium phosphate 완충용액(pH 7.0)과 HCl을 사용하여 pH 2.5로 조정된 0.05M sodium phosphate에 분리된 균주를 각각 접종한 후, 0시간과 2시간 후의 생균수를 측정하여 분리 균주의 생존율(%)을 나타내었다.

내담즙 시험은 0.3%(w/v) Oxgall(BD Difco™, USA)이 첨가된 MRS 배지에 분리된 균주를 접종하여 8시간 반응한 후, 0시간과 8시간 후의 생균수를 측정하여 생존율(%)을 나타내었다.

내열성 시험은 분리된 균주를 37℃ 조건에서 70℃ 조건의 배양기로 옮긴 후, 0시간과 10분 후의 생균수를 측정하여 생존율(%)을 나타내었다.

[표 1]

실험결과를 정리한 [표 1] 및 [도 1]을 참조하면, 분리된 후보군 중에서 CACC616 균주가 pH 2.5의 강산성 조건에서도 88.4%의 생존율이 측정되어 매우 우수한 내산성을 갖는 것을 확인할 수 있었고, 담즙 조건에서도 95.7% 이상의 생존율을 나타내어 매우 우수한 내담즙 특성을 갖는 것을 확인할 수 있었다. 또한, 70℃의 고온 조건에서도 71.1%의 균주가 생존하여 매우 우수한 내열성 특성을 나타내는 것을 확인할 수 있었다.

1-2. 장세포 부착능 평가

장세포 부착능 시험은 낮은 위액의 pH 및 담즙산 분비 환경에서 생존하여 장까지 도달한 균주가 장내에 오래 머물며 숙주동물의 장내 환경 개선에 도움을 주는 것을 측정하기 위한 시험으로, 사람 유래 장세포주인 HT-29 세포와 돼지 유래 장세포주인 IPEC-J2 세포를 이용하여 후보 균주들의 장세포 부착능을 평가하였다.

사람 유래 장상피세포주인 HT-29 세포와 돼지 유래 장상피세포주인 IPEC-J2 세포는 각각 10% fetal bovine serum(FBS, Gibdo-BRL, USA)과 1% penicillin/streptomycin(10,000 U/ml, Gibdo-BRL, USA)이 첨가된 DMEM(Gibdo-BRL, USA) 배지를 사용하여 37℃, 5% CO₂ 조건에서 배양하였다.

상기 배양된 HT-29 세포 또는 IPEC-J2 세포가 단일층(monolayer)으로 형성되는 것을 확인한 후, 24 well plate에 후보 균주들을 1.0 × 10⁸ CFU/mL 용량으로 접종하여 2시간 배양하였다.

배지를 PBS로 3회 세척한 후, 0.1% triton X-100을 사용하여 장상피세포주에 부착된 후보 균주들을 탈착시켜 10진 희석한 후, LAB petrifilm(3M)에 후보 균주들을 접종 배양하고, 24시간 후 생균수를 측정하였다.

[표 2]

실험결과를 정리한 [표 2] 및 [도 2]를 참조하면, 분리된 후보군 중에서 CACC616 균주는 사람 유래 장상피세포주인 HT-29 세포에서 86.8%의 부착율이 측정되었고, 돼지 유래 장상피세포주인 IPEC-J2 세포에서 75.1%의 부착율이 측정되었다. 상기 실험결과를 통해 CACC616 균주가 사람과 가축의 장상피세포에 효과적으로 부착하는 특성을 나타냄을 확인할 수 있었다.

실시예 2. CACC616 균주의 안정성 분석

실시예 1에서 우수한 프로바이오틱스 활성을 갖는 CACC616 균주의 안정성에 대해 용혈성, 바이오제닉아민 생성, 항생제 내성의 3가지 항목을 대상으로 안정성 분석을 수행하였다.

2-1. 용혈성

미생물에 의한 용혈성은 혈전성 혈소판 감소증이나 용혈성 요독증후군과 같은 질병으로도 이어질 수 있으므로, 용혈성 유무 평가를 통해 CACC616 균주의 안전성을 확인하였다.

CACC616 균주의 용혈성 평가를 위해, 호기 조건에서 MRS broth 배지에 접종한 후, 37℃에서 24시간 배양하였다. 상기 배양된 CACC616 균주를 sheep blood가 포함된 고체배지에 획선배양 한 후, 콜로니 주변의 용혈성 유무를 확인하였다.

실험결과를 정리한 [도 3]을 참조하면, 분리된 후보군 중에서 CACC616 균주는 용혈성(투명환)이 나타나지 않는 유형의 감마용혈(γ-hemolysis) 타입으로 분석되어, 혈액 안정성이 있는 것으로 확인되었다.

2-2. 바이오제닉아민 생성

CACC616 균주의 산업적 활용에 장애가 되는 바이오제닉아민 생성능 확인을 위해, 호기 조건에서 MRS broth(Difco, Becton, Dickinson and Co., USA) 액체배지에 접종한 후, 37℃에서 24시간 배양하였다. 바이오제닉 아민류 위해평가 보고서(2016, 식품의약품안전평가원) 방법을 참고하여 CACC616 균주의 전처리를 진행하였고, HPLC 기기를 이용하여 바이오제닉 아민류의 생성을 분석하였다.

표준물질은 바이오제닉 아민 5종(putrescine, cadaverine, histamine, spermidine, spermine)을 이용하였다.

[표 3]

실험결과를 정리한 [표 3]을 참조하면, CACC616 균주는 인체에 무해한 극미량의 푸트레신(futrescine), 카다베린(Cadaverine), 스퍼미딘(spermidine), 및 스퍼민(spermine)을 생성되는 것이 확인되었고, 염증유도인자인 히스타민(histamine)은 전혀 검출되지 않는 것으로 분석되었다.

2-3. 항생제 내성

본원의 균주인 CACC616의 항생제 내성을 확인을 위해, 호기 조건에서 MRS broth 액체배지에 접종한 후 37℃에서 24시간 배양하였다. 상기 균주를 MRS 고체배지에 평판도말한 후 배지 표면을 5분 동안 건조하였다.

이후 항생제 스트립을 MRS 고체배지 가운데 놓은 후 37℃에서 24시간 배양하였다. 배양 후 육안관찰을 통해 스트립 농도에 따라 형성된 클리어 존(clear zone)의 최소농도를 확인 후 항생제 최소저해농도(MIC) 값으로 결과를 판독하였다.

항생제 스트립은 EFSA(European Food Safety Authority, 유럽 식품 안전처)에서 보고된 기준에 따라 선정하였다.

[표 4]

유럽 식품 안전청 (EFSA)에서 설정한 항생제 cut-off 값에 따른 결과를 정리한 [표 4]를 참조하면, CACC616 균주는 반코마이신(Vancomycin), 카나마이신(Kanamycin), 스트렙토마이신(Streptomycin) 및 테트라사이클린(Tetracycline)을 제외한 항생제 5종에 감수성을 나타내는 것으로 확인되었다.

실시예 3. 염증 억제 활성

대표적인 항염증 사이토카인으로 알려진 IL-10은 대식세포를 비롯한 T-세포 림프구 증식과 염증성 사이토카인의 분비를 강하게 억제하는 사이토카인으로, 보편적으로 IL-10 유전자의 발현이 증가하면 염증반응이 억제된다.

세포에서 CACC616 균주의 염증 반응 억제 활성을 평가하기 위하여 Raw 264.7 세포(mouse macrophage cell line)를 세포 배양 배지(10% FBS, 1% anitibiotics in DMEM)에서 37℃, 5% CO₂ 조건으로 배양하였다. 또한, CACC616 균주를 MRS broth 배지를 이용하여 호기 조건으로 37℃에서 24시간 진탕 배양하였다.

Raw 264.7 세포에 면역유도물질인 LPS 및 5×10⁷ CFU/ml 농도로 준비한 CACC616 균주를 4시간 동안 37℃, 5% CO₂ 조건으로 공배양하였다. 4시간 후 Raw 264.7 세포의 RNA를 추출하고, 하기 [표 5]의 프라이머를 활용하여 염증 조절 관련 사이토카인인 IL-10 유전자 발현 양상을 분석하였다.

[표 5]

유전자 발현량은 하우스키핑 유전자(housekeeping gene)인 GAPDH 유전자로 정규화(normalization)하였다.

IL-10 유전자의 발현 변화를 정리한 [도 4]를 참조하면, CACC616 균주의 공배양을 통해 IL-10 사이토카인 유전자의 발현이 현저하게 증가하는 것이 분석되었고, 이를 통해 CACC616 균주가 염증반응을 억제하는데 매우 효과적인 것으로 확인되었다.

실시예 4. 악취저감평가

본 발명의 CACC616 균주의 악취 저감 효과를 평가하기 위해, 돈사 슬러리를 채취하여 악취저감 실험에 사용하였다. 채취한 돈사 슬러리와 물을 1:4 비율로 희석한 후, CACC616 균주 배양액을 슬러리양의 1.0%(v/v)로 첨가하고 24시간 동안 반응시켰다. 균주 무처리 음성대조군은 물을 1.0%(v/v)로 첨가하였다. 24시간 반응 후, H₂S(4HM), NH₃(3La), 및 NH₂(180) 가스를 각각 측정하였다.

[표 6]

실험 결과를 정리한 [표 6]을 참조하면, CACC616 균주를 처리한 슬러리에서 발생한 H₂S, NH₃, NH₂가스 모두 대조군보다 13.0~14.8% 감소된 것을 확인하였다. 상기 실험을 통해, 본 발명의 CACC616 균주가 분변 악취저감에 직접적인 효과가 있음을 확인할 수 있었다.

실시예 5. 이유자돈 동물모델의 사양실험

상기 실시예를 통해 in vitro 수준에서 프로바이오틱 특성(내산성, 내담즙성, 내열성, 장부착능), 안전성(용혈성, 바이오제닉아민 생성능, 항생제내성) 및 면역조절 활성을 나타내는 것으로 확인된 CACC616 균주가 실제 in vivo 수준에서도 프로바이오틱 활성을 나타내는지 확인하기 위하여, CACC616 균주를 돼지 사료에 혼입한 후, 이유자돈에 급여하여 사료 요구율, 악취 저감, 혈액성상 변화 및 분변마이크로바이옴 항목으로 나누어 프로바이오틱 효능을 평가하였다.

실험동물에 대한 정보 및 시험 스케줄은 하기 [표 7]에 정리하였다.

[표 7]

대조군(control)은 일반사료만 약 4주 동안 급여하였고, 시험군은 일반사료에 CACC616 균주의 함량이 0.5%(w/w) 되도록 CACC616 균주를 자돈 사료에 혼합하여 급여하였다.

5-1. 사료요구율(feed conversion ratio) 감소

사양시험 기간(0~26 days) 동안 매일 이유자돈에 CACC616 균주가 혼합된 사료를 급여하였고, 13일과 26일(실험종료일)에 이유자돈의 체중을 측정하여 사료 섭취량(ADFI, average daily feed intake) 및 사료 잔량을 확인하고, 일당증체량(ADG, average daily gain) 및 사료요구율(feed conversion ratio)을 분석하였다.

[표 8]

사료요구율에 대한 동물시험 분석 결과를 정리한 [표 8]을 참조하면, 이유자돈에게 CACC616 균주가 혼합된 사료를 급여한 후 시험군에서는 일반 사료만을 급여한 대조군에 비해 일별사료섭취율(ADFI) 및 사료요구율(FCR)이 감소하는 것으로 확인되었다. 사료요구율은 가축의 체중 1kg를 증체하는데 필요한 사료 계수로서, 대조군에 비해 사료요구율이 낮을수록 사육 효율이 올라가는 것을 의미한다. 따라서, 본 발명의 CACC616 균주를 생균제로 활용하는 경우 농가 경제성에 기여할 수 있는 것으로 확인되었다.

5-2. 분변 악취물질의 감소

이유자돈에서 CACC616 균주를 사료와 혼합하여 4주간 급여한 후, 실험 종료시 얻은 분변 샘플에서 악취물질 12종을 분석하였다.

[표 9]

시험 결과를 정리한 [표 9]를 참조하면, 본 발명의 CACC616 균주를 급여한 시험군에서는 분변악취의 원인물질인 n-뷰틸산(n-Butyric acid), n-발레르산(n-valeric acid), p-크레졸(p-Cresol), 인돌(Indole), 스카톨(skatole, 3-methylindole), 황화수소(H₂S), 및 메틸메르캅탄(methyl mercaptan)이 CACC616 균주 무처리 대조군과 비교하여 각각 53.2%, 48.2%, 46.6%, 78.6%, 57.9%, 82.6%, 및 65.2% 감소하여, 악취 물질의 저감에 효과적임을 확인할 수 있었다. 즉, 이유자돈의 사양에 지장을 주지 않으면서 분변 악취 저감에 효과적인 것으로 확인되었다.

5-3. 혈액성상 분석

이유자돈에서 CACC616 균주를 사료와 혼합하여 4주간 급여하고, 시험 종료 후 얻은 혈액 샘플을 분석하였다. 혈액분석은 자동혈액분석기(BC-6800Plus, Mindray, China)를 이용하여 WBC(white blood cell) 외 7종을 분석하였으며, 혈청 생화학분석은 자돈 혈액에서 혈청을 분리(3000rpm, 4℃, 15min)하여 혈청분석기(Cobas, Roche, USA)를 이용하여 단백질(Protein), 당(glucose), AST, ALT, BUN, 콜레스테롤(cholesterol), 크레아티닌(creatinine), 및 코티졸(cortisol) 성분을 분석하였다.

혈액 샘플 분석 결과를 정리한 [도 5]를 참조하면, CACC616 균주를 급여한 시험군의 백혈구(WBC)가 CACC616 균주 미급여 대조군에 비해 8.6% 정도 증가하는 것으로 확인되었고(도 5A 참조), 다른 혈액 수치들에서는 유의한 차이가 없는 것으로 분석되었다. 상기와 같은 결과를 통해 CACC616 균주가 세포성 면역반응에 주요 역할을 담당하는 백혈구를 정상범위에서 증가시켜 가축의 면역력을 강화하는데 효과적임을 확인할 수 있었다.

또한, 소화율 관련 인자인 혈중 BUN(blood urea nitrogen)과 크레아티닌(creatinine)이 CACC616 균주 미급여 대조군에 비해 각각 31.4% 및 15.1% 감소한 것으로 분석되어, CACC616 균주의 급여를 통해 실험동물의 소화율이 개선된 것을 확인할 수 있었다(도 5B 참조).

정리하면, 본 발명의 CACC616 균주가 백혈구 수치 개선을 통해 면역 활성을 증진시키고, 혈중 BUN(blood urea nitrogen) 및 크레아티닌(creatinine) 생성억제를 통해 소화율이 개선에 이바지함을 확인할 수 있었다.

5-4. 분변 칼프로텍틴 평가

장내 염증의 표지자인 칼프로텍틴을 평가하기 위해, CACC616 균주를 사료와 혼합하여 4주간 급여한 이유자돈의 분변을 10mg 당 PBS 0.1ml를 첨가하였고, 원심분리하여 상층액을 회수하였다. 상기 방법으로 얻은 분변 상층액에서 Mybiosource ELISA Kit(Cat. No MBS033848, USA)를 사용하여 칼프로텍틴 단백질의 함량을 정량하였다.

[표 10]

시험 결과를 정리한 [표 10] 및 [도 6]을 참조하면, 시험군 시료의 평균 칼프로텍틴 함량은 19.5±2.1 mg/ml로, 균주 무처리 대조군(39.4±6.3 mg/ml) 대비 50.4% 감소된 것으로 확인되었다.

소화 염증 지표인 칼프로텍틴의 농도를 감소시킨 상기 실험 결과는 본 발명의 CACC616 균주가 장내 염증 감소에 직접적으로 기여함을 시사한다.

5-5. 분변마이크로바이옴 분석

이유자돈에서 CACC616 균주를 사료와 혼합하여 4주간 급여하고, 시험 종료 후 얻은 분별 샘플을 채취하여 분변의 마이크로바이옴 분석을 수행하였다. 이유자돈의 분변 라이브러리 준비 및 시퀀싱은 Life is Art of Science (LAS) Laboratory (Korea)을 통해 위탁수행하였고, 시퀀싱 결과를 기반으로 마이크로바이옴의 다양성을 분석하였다.

분변 마이크로바이옴 분석 결과를 정리한 [도 7]을 참조하면, 본 발명의 CACC616 균주를 급여한 시험군이 속(Genus) 수준에서 CACC616 균주 미급여 대조군 대비 유산균인 락토코커스(Lactococcus sp.) 속 균주가 증가하는 경향을 확인하였고, 특히, 메탄의 생성에 직접 관련된 메타노브레비박터(Methanobrevibac sp.) 속 균주가 감소하는 경향이 확인되었다.

실시예 6. 균주 동정 및 기탁

본 발명의 CACC616 균주에 대해 16S rRNA gene sequencing primer 518F/805R을 사용하여 1,479bp 길이의 16S rRNA 서열을 확보하였다.

[표 11]

상기 확보된 염기서열에 대해 Ezbiocloud(https://www.ezbiocloud.net)의 16S-based ID를 통해 16S rRNA 분석한 결과, Pediococcus pentosaceus SRCM102734(CP028254.1) 및 Pediococcus pentosaceus DSM 20336(KX886792.1) 균주와 99.93% 상동성을 보이는 신규한 균주로 동정되었다.

Phylogenetic tree는 Mega 7 program을 사용하여 neighbor joining method를 기반으로 [도 8]에 나타내었다.

본 발명자들은 우수한 생균제 활성을 갖는 본 발명의 균주를 페디오코커스 펜토사세우스 CACC616 균주로 명명하고, 2023년 08월 08일 국립농업과학원 농업유전자원정보센터에 기탁번호 KACC 92546P로 기탁하였다.

상기 실험 결과를 종합해서 정리하면, 소의 분변에서 분리된 페디오코커스 펜토사세우스 CACC618 균주가 ⅰ) 내산성, 내담즙성 내열성 및 장세포 부착능이 우수하고, ⅱ) 용혈성, 바이오제닉아민 생성, 및 항생제 내성이 없어 안전하며, ⅲ) 항염증 사이토카인으로 알려진 IL-10 유전자의 발현을 억제하여 우수한 항염증 활성을 나타내고, ⅳ) 가축 급여시 사료요구율(feed conversion ratio)을 감소시키며, ⅴ) 악취 원인물질의 생성을 감소시켜 분변 악취 저감에 효과적이고, ⅵ) 세포성 면역반응에 주요 역할을 담당하는 백혈구를 정상범위에서 증가시켜 가축의 면역력을 강화하는 한편, 혈중 BUN(blood urea nitrogen)과 크레아티닌(creatinine)을 감소시켜 소화 효율을 제고하며, ⅶ) 메탄의 생성에 직접 관련된 메타노브레비박터(Methanobrevibac sp.) 속 균주의 장내 증식을 억제하여, 프로바이오틱스 균주로 사용하기에 적합함을 확인할 수 있었다.

이상으로 본 발명의 특정한 부분을 상세히 기술하였는 바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 이러한 구체적인 기술은 단지 바람직한 구현예일 뿐이며, 이에 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백하다. 따라서, 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항과 그의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.

농촌진흥청 국립농업과학원 미생물은행(KACC)

KACC92546P

20230808

Claims

신균주 페디오코커스 펜토사세우스 CACC616(수탁번호: KACC 92546P).
제1항에 있어서,
상기 균주는 항염증, 사료요구율 감소, 분변 악취 제거, 및 장내 메탄발생 원인균의 억제 활성을 나타내는 것을 특징으로 하는,
페디오코커스 펜토사세우스 CACC616(수탁번호: KACC 92546P).
제1항에 있어서,
상기 균주는 서열번호 1의 16s rRNA 서열을 갖는 것을 특징으로 하는,
페디오코커스 펜토사세우스 CACC616(수탁번호: KACC 92546P).
제1항의 균주, 또는 그 배양액을 유효성분으로 하는 사료 조성물.
제4항에 있어서,
상기 균주, 또는 그 배양액은 내산성, 내담즙성, 내열성, 및 장내부착 활성이 있는 것을 특징으로 하는, 사료 조성물.
제4항에 있어서,
상기 균주, 또는 그 배양액은 염증 억제 유전자인 IL-10 유전자의 발현을 증가시켜 항염증 활성을 나타내는 것을 특징으로 하는, 사료 조성물.
제4항에 있어서,
상기 균주, 또는 그 배양액은 가축 분변의 악취 원인물질인 n-뷰틸산(n-Butyric acid), n-발레르산(n-valeric acid), p-크레졸(p-Cresol), 인돌(Indole), 스카톨(skatole, 3-methylindole), 황화수소(H₂S), 및 메틸메르캅탄(methyl mercaptan)의 생성을 억제하여 악취 제거 활성을 나타내는 것을 특징으로 하는, 사료 조성물.
제4항에 있어서,
상기 균주, 또는 그 배양액은 가축 혈액 내의 백혈구 수치를 증가시켜 면역증진 활성을 나타내고, 가축 분변의 메탄 생성 원인균인 메타노브레비박터(Methanobrevibac sp.) 속 균주의 장내 생장을 억제하는 것을 특징으로 하는, 사료 조성물.