KR102667836B1 - 뉴클레오티드-활성화된 당으로부터 단당류를 유리형태로 생산하기 위한 발효 공정 - Google Patents

Abstract

본 발명은 미생물 발효 공정을 이용하여 단당류, 예로서 L-푸코오스를 유리형태로 생산하는 방법에 관한 것이다. 사용된 미생물은 뉴클레오티드-활성화된 당에 대해 하이드롤라제 활성을 나타내고, 변형되지 않은 유리형태로 단당류를 방출한다. 상기 유리 단당류는 배양된 미생물의 상등액으로부터 회수된다.

Description

뉴클레오티드-활성화된 당으로부터 단당류를 유리형태로 생산하기 위한 발효 공정

본 발명은 뉴클레오티드-활성화된 당(nucleotide-activated sugar)으로부터 목적하는 단당류를 유리형태(free form)로 생산하기 위한 미생물 발효 방법에 관한 것이다.

탄수화물은 에너지 저장, 구조적 기능, 신호 전달, 정보 저장 등에 필수적인 역할을 함으로써 모든 형태의 생명체에서 역할을 한다. 이 역할을 위해, 자연은 글루코오스, N-아세틸-글루코사민, 만노오스, N-아세틸-만노사민, 프룩토오스, 푸코오스, 리보오스, 시알산, 자일로오스 등 몇몇 주요 단당류 및 보다 전문화된 적용을 위해, 예를 들어 D-알로오스 같은 몇몇 비주요 단당류를 합성한다.

L-푸코오스(6-디옥시-L-갈락토오스) 및 푸코실화된 올리고- 및 다당류는 영양적 및 생체의학적 적용에 있어 높은 잠재성을 가지기 때문에 화학, 화장품 및 제약 산업에서 큰 관심을 모으고 있다(Hauber, H.-P., Schulz, M., Pforte, A., Mack, P., Zabel, P. & Schumacher, U. (2008) Inhalation with fucose and galactose for treatment of Pseudomonas aeroginosa in cyctric fibrosis patients. Int. J. Med. Sci. 5, 371-376.; Isnard, N., Bourles-Dagonet F., Robert, L. & Renard, G. (2005) Studies on corneal wound healing: Effects if fucose on iodine vapor-burnt rabbit corneas. Ophthalmologica 219, 324-333; Robert, L., Fodil-Bourahla, I., Bizbiz, L. & Robert, A.M. (2004) Effect of L-fucose and fucose-rich polysaccharides on elastin biosynthesis, in vivo and in vitro. Biomed. Pharmacother. 58, 123-128; Wild, M. K., Luhn, K., Marquardt, T. & Vestweber, D. (2002) Leukocyte adhesion deficiency II: therapy and genetic defect. Cells Tissues Organs 172, 161-173; Adam, E.C., Mitchell, B.S., Schumacher, D.U., Grant, G. & Schumacher, U. (1997) Pseudomonas aeruginosa II lectin stops human ciliary beating: therapeutic implications of fucose. Am. J. Respir. Care Med. 155, 2102-2104). 그들은 항염증, 항바이러스 및 항-암 특성을 갖고 프리바이오틱스로 작용하는 것으로 알려져 있다. 항-노화 효과로 인해 L-푸코오스는 화장품 산업의 주요 관심사이다(Isnard, N., Fodil-Bourathla, I., Robert A.M. & Robert, L. (2004) Pharmacology of skin aging. Stimulation of glycosaminoglycan biosynthesis by L-fucose and fucose rich polysaccharides, effect of in vitro aging of fibroblasts. Biomed. Pharmacother. 58, 202-204.). 또한 푸코실화된 유도체는 항 알레르기 및 유화 특성으로 알려져 있다.

몇 단당류들이 자연으로부터 많은 양과 합리적인 비용으로 수득될 수 있는 반면(예: 글루코오스, N-아세틸글루코사민 및 프룩토오스), 대부분의 단당류들은 예를 들어 L-푸코오스(6-디옥시-L-갈락토오스)와 같이, 오히려 드물고 자연에서 소량으로만 발견될 수 있다.

단당류의 상업적인 생산을 위해, 거의 오로지 자연으로부터 수득된 올리고당이 공급원으로 사용된다. 이러한 올리고당은 가수분해되고 방출된 단당류로부터 개별 당이 정제된다. 단당류의 높은 화학적 유사성으로 인해(대부분 개별 하이드록실기의 배향에 대해서만 서로 다름), 순수한 형태로 개별 단당류의 분리는 다소 힘들고 비용이 많이 든다.

L-푸코오스는 조류(algae) 또는 박테리아 기원으로부터 복합 올리고당의 가수분해를 통해 현재 수득되는 희귀한 당을 말한다. 복합 가수분해물로부터 개별 단당류를 정제하기 위해, 예를 들어 아세트산 납 및 과량의 유기 용매와 같은 유해 화학물질이 종종 사용되어야 한다(Schweiger, R.G. (1966) Preparation of α-L-fucosides and L-fucose from fucoidan. US Patent 3,240,775). 그러므로, 올리고당의 복합 가수분해물로부터 개별 단당류를 분리하는 것은 (방출된 개별 단당류의 높은 화학적 유사성으로 인해) 도전적이며 (탄산 납과 같은 독성 화학물질의 과도한 사용으로 인해) 환경적으로 유해하다. 또한 특정 당이 풍부한 올리고당의 가용성은 자연에서 다소 제한될 수 있고, 또한 계절적 변화로 인해 매우 가변적이다. L-푸코오스는 통상적으로는 푸코오스-함유 다당류의 산 가수분해에 의해 수득되는 스케어(scare) 단당류를 말한다. 푸코오스는 주로 푸카세에(Fucaceae) 및 라미나리아세에(Laminariaceae)를 포함하는 모든 공통적인 갈색 해조류에 존재하는 푸칸(fucan) 모노설페이트인 다당류 푸코이단(fucoidan)으로부터 유래한다(Black, W.A.P (1954): The seasonal variation in the combined L-fucose content of the common british Laminariaceae and Fucaceae. J. Sci. Food Agric. 5, 445-448). 오늘날, L-푸코오스는 주로 푸카세에(Fucaceae)에 속하는 갈색 해조류를 수집하여 대량으로 수득되고, 이는 세계적으로 발견되지만 대서양의 유럽 해안에서 다량으로 발견된다. 해변으로부터 갈색 해조류의 대규모 수확은 환경 문제를 야기하며 이는 환경 보호법에 의해 제한된다.

예를 들어, JP 2000351790은 푸코이단을 추출하고 추출된 푸코이단으로부터 푸코오스-함유 올리고당을 수득하고 분리하는 방법을 개시한다.

갈색 해조류로부터 푸코이단의 가수분해 외에 최근 특허 공개는 L-푸코오스가 L-푸코오스 함유 박테리아 다당류의 자연 발생적 가수분해를 통해 수득될 수 있음을 보여준다: WO 2012/034996 A1는 L-푸코오스를 함유하는 세포 외 다당류를 생산할 수 있는 엔테로박테리아세에(Enterobacteriaceae) 계통에 속하는 균주를 개시한다. L-푸코오스의 생산을 위해, 상기 균주에 의해 생산된 다당류는 회수되어 가수분해(예: 황산 또는 트리플루오로아세트산을 처리하여)될 수 있다.

WO 2014067696 A1는 유리형태로 L-푸코오스를 합성하기 위해 함께 작용하는 글리코실트렌스퍼라제 및 글리코시다아제를 갖는 재조합 미생물을 사용하여 L-푸코오스를 생산하는 방법을 처음으로 개시한다. 상기 방법은 2개의 효소 및 억셉터(acceptor) 분자를 필요로 한다. 글리코실트랜스퍼라제는 GDP-L-푸코오스로부터 억셉터, 예를 들어, 락툴로오스로의 전이를 촉매하여 푸코실락툴로오스를 합성한다. 푸코실화된 억셉터(예: 푸코실락툴로오스)는 이어서 글리코시다아제에 의해 억셉터 분자 및 L-푸코오스로 가수분해된다. 상기 억셉터는 그 후 사용된 푸코실트랜스퍼라제에 의한 푸코실화를 위해 다시 이용 가능하다. L-푸코오스는 이어서 배지로의 유출로 인해 세포로부터 유리되고 상청액으로부터 회수될 수 있다. 이 방법에 의해 GDP-푸코오스 경로의 피드백 저해는 쉽게 극복될 수 있고 유의한(수 g/l)양의 유리 L-푸코오스가 미생물 발효에 의해 수득될 수 있다.

다당류 또는 올리고당 가수분해로부터 L-푸코오스를 추출하는 것 외에, L-아라비노오스, D-갈락토오스, L-람노오스, D-만노오스 및 D-글루코오스와 같은 다른 단당류로부터 출발하는 몇몇 L-푸코오스 합성 경로가 개발되었다. 가장 효율적인 합성 경로는 희귀한 단당류 L-람노오스로부터 출발하여 Defraye 외(1984)에 의해 개발되었다(Defaye, J., Gadelle, A. & Angyal, S. (1984) An efficient synthesis of L-fucose and L-(4-²H)fucose. Carbohydr. Res. 126, 165-169). 일반적으로 이러한 화학 합성의 수율은 종종 나쁘고 여러 화학적 단계를 수반한다. 여러 합성 단계를 수반하는 것 외에도, L-푸코오스의 화학적 합성에 있어서 광범위한 보호기 화학이 사용되어야 한다. 일반적으로, 단당류의 대규모 화학 합성은 자연으로부터 수집된 다당류로부터 L-푸코오스를 추출하는 것과 비교하여 경제적인 것으로 증명되지 않았다.

따라서, 현재, 순수한 형태로 어떤 단당류를 제조하는 것은 종종 많은 양의 유기 용매 및 다른 유해한 화학 물질을 포함하는, 목적 단당류로부터 다른 단당류를 정제하는 데에 상당한 노력을 요구한다. 결과적으로, 예를 들어 L-푸코오스와 같은 단일의 목적하는 단당류의 배타적인 축적은 막대한 도움이 될 것이다. 그러나, 대부분의 미생물은 이용할 수 있는 단당류의 종류가 제한되어 있다. 또한, 탄소원으로서 여러 단당류가 동시에 이용될 수 있는 경우에 그들은 종종 특정 단당류에 대해 강한 선호도를 나타낸다.

상기의 관점에서, 본 발명의 목적은 단일의 목적하는 단당류를 유리형태로 제조하기 위한 새로운 방법을 제공하는 것으로, 이를 통해 단당류가 신속하고 효율적으로, 즉 대규모 및 비용-효율적이며 부정적인 환경 영향없이, 회수될 수 있다.

이러한 목적 및 다른 목적은 미생물을 사용하여 유리형태로 목적 단당류를 대규모로 생산하는 방법에 의해 달성되며, 상기 방법은

a.) 뉴클레오티드-활성화된 단당류의 가수분해를 촉매하여 뉴클레오티드-활성화된 단당류로부터 목적하는 단당류를 방출할 수 있는 효소를 포함하는, 단당류 합성을 위한 미생물을 제공하는 단계;

b.) 미생물을 이를 성장시키기에 적당한 배지에서 배양하는 단계로서, 상기 미생물은 단당류를 유의한 정도로는 대사할 수 없어 배양 단계 동안 목적하는 단당류가 유리형태로 생산되고 축적되는 단계를 포함한다.

본 발명의 기초가 되는 목적은 이러한 방식으로 완전히 해결된다.

출원인의 상기 방법은 이전에 기재되지 않았고, 뉴클레오티드-활성화된 단당류를 가수분해하여 유리 단당류를 축적시키는 효소를 포함하고 발현하는 미생물을 이용한다. 뉴클레오티드-활성화된 당에 대한 가수분해 활성을 갖는 효소는 예를 들어, 푸코실트랜스퍼라제, 바람직하게는 E. coli: O126 (acc. No. ADN43847)의 wbgL 유전자 또는 헬리코박터 파일로리(Helicobacter pylori) (acc. No. AAD29868) 유래의 1,2-푸코실트랜스퍼라제 futC에 의해 코딩되는 알파-1,2-푸코실트랜스퍼라제의 변이체일 수 있다. 상기-기재된 효소적 특징을 갖는 변형되지 않은 미생물이 본 발명에서 사용될 수 있으나, 본 발명의 일 양태에 따르면, 상기 미생물은 재조합 미생물이며, 재조합 미생물은 미생물에서 자연 발생적이지 않으며 뉴클레오티드-활성화된 단당류의 가수분해를 촉매할 수 있는 효소를 코딩하는 적어도 하나의 핵산 서열을 포함하고 발현하도록 변형된다.

이전의 방법과 달리, 뉴클레오티드-활성화된 당, 즉 단당류의 가수분해를 촉매할 수 있는 단일 효소가 단당류를 방출하는데 사용되는 반면, 당업계에 알려진 이전의 방법은 글리코시다아제에 의해 억셉터로부터 단당류를 방출하는 후속 단계와 함께 도너(donor) 기질로부터 억셉터 기질로 단당류를 전달하는 적어도 하나의 효소를 사용한다. 이 단계는 본 발명에 필수적이지 않아 목적하는 당을 생산하는 방법을 용이하게 한다. 따라서, 본 발명에 따른 방법에서, 뉴클레오티드-활성화된 단당류의 가수분해를 촉매하고 "억셉터의 부재 하에" 유리형태로 단당류를 방출할 수 있는 효소가 사용된다. 또한, 본 발명에 따르면, 본 발명에 따른 방볍은 억셉터-기질로부터 단당류를 방출 할 수 있는 글리코시다아제의 표적화된 사용없이 수행된다.

새로 제공되는 방법 및 새로 제공되는 미생물(재조합 또는 재조합이 아닌)을 사용하면 화학물질을 필요로 하지 않고 정교한 공정 단계 없이 목적하는 단당류를 유리형태로 대량으로 생산하는 것이 가능하다. 본 발명에 따른 방법은 미생물이 배양되는 배지로부터 용이하게 회수될 수 있는 희귀하거나 다른 단당류의 산업적 대량 생산에 사용하기에 적합한, 미생물 발효 방법을 나타낸다.

본원에 사용되고 본 발명의 분야에서 일반적으로 이해되는 "단당류"라는 표현은 탄수화물의 가장 기본적인 단위를 말한다. 단당류는 가장 단순한 형태의 당이며, 일반적으로 무색, 수용성, 결정성 고체이다. 단당류의 예는 글루코오스, 프룩토오스, 갈락토오스, 자일로오스, 만노오스, 푸코오스, 람노오스, 및 리보오스를 포함한다. 단당류는 수크로오스와 같은 이당류 및 셀룰로오스 및 녹말과 같은 다당류의 구성요소이다. 본원에서 사용되고 본 발명의 분야에서 일반적으로 이해되는 용어 "올리고당"은 2 이상의 단당류를 포함하는 당류의 중합체를 말한다.

용어 "…를 코딩하는 핵산 서열"은 일반적으로 변형되지 않은 RNA 또는 DNA 또는 변형된 RNA 또는 DNA일 수 있는 임의의 폴리리보뉴클레오티드 또는 폴리데옥시리포뉴클레오티드를 말하며, 일반적으로 특정 폴리펩티드 또는 단백질을 코딩하는 유전자를 나타낸다. 상기 용어는, 단일- 및 이중-가닥 DNA, 단일- 및 이중-가닥 영역 또는 단일-, 이중- 및 삼중-가닥 영역의 혼합물인 DNA, 단일- 및 이중-가닥 RNA, 및 단일- 및 이중-가닥 영역의 혼합물인 RNA, 단일-가닥 또는, 보다 일반적으로, 이중-가닥, 또는 삼중-가닥 영역, 또는 단일-가닥 및 이중-가닥 영역의 혼합물일 수 있는 DNA 및 RNA를 포함하는 하이브리드 분자를 제한 없이 포함한다. 상기 용어는 또한 코딩 및/또는 비 코딩 서열을 포함할 수 있는 추가적인 영역과 함께 폴리펩티드(예를 들어, 통합된 파지 또는 삽입서열 또는 편집에 의해 중단됨)를 코딩하는 단일의 연속 영역 또는 불연속 영역을 포함하는 폴리뉴클레오티드를 포함한다.

이러한 문맥에서, 용어 "폴리펩티드"는 펩티드 결합 또는 변형된 펩티드 결합에 의해 서로 결합된 2 이상의 아미노산을 포함하는 임의의 펩티드 또는 단백질을 말한다. "폴리펩티드"는 일반적으로 펩티드, 올리고펩티드 및 올리고머로 지칭되는 짧은 사슬 및 단백질로 지칭되는 보다 긴 사슬 모두를 의미한다. 폴리펩티드는 20개의 유전자 코딩된 아미노산 이외의 아미노산을 포함할 수 있다. "폴리펩티드"는 가공 및 다른 번역 후 변형과 같은 자연적인 방법에 의해 변형된 것들뿐 아니라 화학적 변형 기술에 의해 변형된 것들도 포함한다. 동일한 유형의 변형이 본질적으로 폴리펩티드의 활성을 변화시키지 않고 주어진 폴리펩티드의 몇몇 부위에서 동일하거나 상이한 정도로 존재할 수 있음을 이해할 것이다. 또한, 주어진 폴리펩티드는 많은 유형의 변형을 포함할 수 있다. 변형은 펩타이드 주쇄, 아미노산 측쇄 및 아미노 또는 카르복실 말단을 포함하여 폴리펩티드의 임의의 위치에서 일어날 수 있다.

본 발명에 있어서 "뉴클레오티드-활성화된 단당류의 가수분해를 촉매할 수 있는 효소" 또는 "뉴클레오티드-활성화된 단당류를 가수분해할 수 있는 효소"와 함께 사용되는 용어 "뉴클레오티드-활성화된 단당류"는 뉴클레오티드-활성화된 단당류에 대한 촉매 활성을 갖는 효소를 나타내고; 가수분해는 목적하는 단당류의 방출을 유도한다. 이와 관련하여, 용어 "글리코실트랜스퍼라제"는 활성화된 뉴클레오티드 단당류("글리코실 도너")로부터 글리코실 억셉터 분자로의 단당류 잔기의 전달을 촉매하는 효소를 지칭하며 포함한다. 본 발명에서, 본 발명에 따른 방법 및 미생물에 사용된 글리코실트랜스퍼라제는 억셉터 분자의 부재하에 뉴클레오티드-활성화된 단당류의 가수분해를 촉매한다. 본 발명의 일 양태에 다르면, 뉴클레오티드-활성화된 당 하이드롤라제가 박테리아 푸코실트랜스퍼라제, 및 바람직하게는 E. coli: O126 (acc. No. ADN43847)의 wbgL 유전자에 의해 코딩되는 알파-1,2-푸코실트랜스퍼라제 또는 억셉터 분자의 부재하에 GDP-L-푸코오스의 가수분해를 촉매하는 다른 푸코실트랜스퍼라제인 것이 특히 바람직하다.

따라서, 용어 뉴클레오티드-활성화된 당 하이드롤라제 또는 뉴클레오티드-활성화된 당 하이드롤라제를 코딩하는 핵산/폴리뉴클레오티드는 GDP-푸코오스, UDP-갈락토오스, GDP-만노오스, GDP-람노오스, 및 다른 자연적으로 발생하는 뉴클레오티드 당과 같은 뉴클레오티드-활성화된 당의 가수분해적 절단을 촉매하는 효소를 말한다. 바람직하게는 이 뉴클레오티드-활성화된 당 하이드롤라제는 단당류를 억셉터 분자로 전달시키지 않거나 대부분 전달시키지 않는 글리코실트랜스퍼라제이다. GDP-L-푸코오스의 경우, 뉴클레오티드-활성화된 단당류를 가수분해할 수 있는 효소는 푸코실트랜스퍼라제, 예를 들어 알파-1,2-푸코실트랜스퍼라제이나, 이에 제한되지는 않는다.

보다 구체적으로, 아스파라긴 69를 세린, 히스티딘 124를 알라닌, 글루타메이트 215를 글리신, 및 이소류신 268을 프롤린으로 치환시킨 아미노산 잔기를 보유하는 E. coli: 126 유래의 알파-1,2-푸코실트랜스퍼라제 WbgL, 또는 헬리코박터 파일로리 유래의 1,2-푸코실트랜스퍼라제 FutC 또는 억셉터 분자의 부재하에 GDP-L-푸코오스에 대해 가수분해 활성을 보이는 다른 푸코실트랜스퍼라제가 사용되는 것이 바람직하다.

본 발명의 범위 내에서, 또한, 바람직하게는 E. coli: O126 (acc. No. ADN43847)의 wbgL 유전자 또는 H. pylori(acc. No. AAD29868)의 futC에 의해 코딩되는 알파-1,2-푸코실트랜스퍼라제의 아미노산 서열에 대해 적어도 25, 50, 100, 200, 또는 300개 또는 초과의 아미노산 영역에 걸쳐 약 60% 초과의 아미노산 서열 동일성, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 바람직하게는 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 또는 초과의 아미노산 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 갖는 핵산/폴리뉴클레오티드 및 폴리펩타이드 다형성 변이체, 대립 유전자, 돌연변이체, 및 종간 동족체가 이러한 용어에 포함된다.

또한, 가수분해 효소의 폴리펩티드는 그 활성을 변경하기 위해 펩티드 서열의 첨가 또는 결핍에 의해 변형될 수 있다. 예를 들어, 폴리펩티드 서열은 추가적인 효소적 활성을 유발하기 위해 효소 폴리펩티드에 융합될 수 있다.

또한, 뉴클레오티드-활성화된 단당류를 가수분해할 수 있는 효소를 코딩하는 유전자는 유전자 산물이 기능적으로 동등한 유전자 산물을 나타내는 단백질 또는 폴리펩티드를 포함하도록 변형될 수 있다. 그러한 균등한 하이드롤라제 유전자 산물은 상기 하이드롤라제 유전자 서열에 의해 코딩되는 아미노산 서열 내에 아미노산 잔기의 결핍, 첨가 또는 치환을 포함할 수 있으나, 침묵의 변화를 유발하여 뉴클레오티드-활성화된 단당류를 가수분해할 수 있는 효소를 코딩하는 기능적으로 동등한 유전자 산물을 생산한다. 아미노산 치환은 관련 잔기의 극성, 전하, 용해도, 소수성, 친수성, 및/또는 양친매성의 유사성에 기초하여 이루어질 수 있다. 예를 들어, 비극성(소수성) 아미노산은 알라닌, 류신, 이소류신, 발린, 프롤린, 페닐알라닌, 트립토판, 및 메티오닌을 포함하고; 평면의 중성 아미노산은 글리신, 세린, 트레오닌, 시스테인, 타이로신, 아스파라긴, 글루타민을 포함하며; 양전하를 띤(염기성) 아미노산은 아르기닌, 라이신, 및 히스티딘을 포함하며; 음전하를 띤(산성) 아미노산은 아스파르트 산 및 글루탐산을 포함한다.

본 발명의 문맥에서, 본원에서 사용된 "기능적으로 동등한"은 항원성 즉, 항-뉴클레오티드-활성화된 당 하이드롤라제 항체에 결합하는 능력, 면역원성, 즉, 효소 활성뿐만 아니라 뉴클레오티드-활성화된 단당류 하이드롤라제 단백질 또는 폴리펩티드에 결합할 수 있는 항체를 생산하는 능력을 포함하나 이에 제한되지 않는, 다수의 기준에 의해 판단되는 상기 하이드롤라제 유전자 서열에 의해 코딩되는 내생의 하이드롤라제 유전자 산물과 같이 뉴클레오티드-활성화된 당에 대해 실질적으로 유사한 생체 내 하이드롤라제 활성을 나타낼 수 있는 폴리펩티드를 말한다. 따라서, 본 발명은 또한 구체적으로 개시된 것과 기능적으로 동등한 효소를 포함한다.

또한, 당업자는 개시된 효소에 대한 임의의 변형이 본 발명의 방법 및 미생물에 사용될 수 있으며, 상기 변형은 본원에 기재된 효소의 가수분해 활성을 증가시키는 것을 본 발명으로부터 용이하게 도출할 것이다. 따라서, 변형되지 않은 형태에 비해 증가된 가수분해 활성을 나타내는 그러한 변형된 효소가 본 발명에 포함된다.

본 발명의 범위에는 번역 중 또는 후에 다르게 변형된 뉴클레오티드-활성화된 당 하이드롤라제 단백질, 폴리펩티드, 및 유도체(단편 포함)가 포함된다. 나아가, 비-고전 아미노산 또는 화학적 아미노산 유사체는 효소 폴리펩티드 서열로의 치환 또는 첨가로 도입될 수 있다.

본 발명에 따른 방법의 바람직한 구현예에 따르면, 효소는 wbgL 유전자에 의해 코딩되는 1,2-푸코실트랜스퍼라제의 변이체 또는 헬리코박터 파일로리 유래의 futC 유전자에 의해 코딩되는 1,2-푸코실트랜스퍼라제의 변이체로, 상기 변이체는 wbgL 유전자에 의해 코딩되는 야생형 1,2-푸코실트랜스퍼라제 또는 futC 유전자에 의해 코딩되는 야생형 1,2-푸코실트랜스퍼라제와 각각 비교하여 적어도 하나, 바람직하게는 적어도 둘, 보다 바람직하게는 둘 초과의 변형을 갖고, 상기 변형은 효소의 가수분해 활성을 증가시킨다.

뉴클레오티드-활성화된 당을 가수분해 할 수 있는 효소는 당업계에 공지된 기술을 사용하여 재조합 DNA 기술에 의해 제조될 수 있다. 당업자에게 잘 알려진 방법을 사용하여 뉴클레오티드-활성화된 당의 가수분해를 촉매하는 효소의 합성을 가능하게 하는 효소 코딩 서열 및 적절한 전사-번역 조절 신호를 함유하는 발현 벡터를 제조할 수 있다. 이러한 방법은 예를 들어, 시험관 내 재조합 DNA 기술, 합성 기술 및 생체 내 유전자 재조합을 포함한다. 예를 들어, Sambrook, J. and Russell D. W. (1989) Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd Ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y.에 기재된 기술을 참고.

본 발명에 따른 방법의 일 구현예에 따라, 적어도 하나의 변형은 적어도 하나의 아미노산 치환이다. 또 다른 구현예에 따르면, 상기 변형은 적어도 하나, 둘 또는 둘 초과, 특히 셋, 넷, 다섯, 여섯, 일곱, 여덟, 아홉 또는 열 개의 아미노산 치환이거나 치환을 포함하며, 뉴클레오티드-활성화된 단당류를 가수분해 할 수 있는 변형된 효소는 변형되지 않은 야생형 효소와 비교하여 뉴클레오티드-활성화된 단당류에 대해 증가된 가수분해 활성을 갖는다.

일 구현예에 따르면, 아스파라긴 69를 세린, 히스티딘 124를 알라닌, 글루타메이트 215를 글리신, 및 이소류신 268을 프롤린으로 치환시킨 아미노산 잔기를 보유하는 E. coli:126 유래의 알파-1,2-푸코실트랜스퍼라제 WbgL, 또는 헬리코박터 파일로리 유래의 1,2-푸코실트랜스퍼라제 FutC 또는 억셉터 분자의 부재하에 GDP-L-푸코오스에 대해 가수분해 활성을 보이는 다른 푸코실트랜스퍼라제가 사용되는 것이 바람직하다.

변형되지 않은 야생형 효소와 비교하여 변형된 효소가 뉴클레오티드-활성화된 단당류에 대해 증가된 가수분해 활성을 갖는 한, 당업자는 본 발명의 개시로부터 위에 명시된 특정한 치환뿐만 아니라 구체적으로 기재된 효소의 다른 변형, 특히, 다른 치환이 본 발명에 포함되는 것을 인식할 것이다. 적절할 수 있는 대체적인 치환은 또한 위에서 보다 일반적으로 논의되었지만 여기에도 또한 적용되어야 한다.

현재, 그리고 본 발명 전반을 걸쳐, "재조합체"는 한 종으로부터의 유전자를 다른 종의 숙주 미생물로 이식 또는 접합시킴으로써 제조된 유전적으로 조작된 DNA를 의미한다. 이러한 DNA는 숙주의 유전자 구성의 일부가 되어 복제된다.

"미생물"은 현재 본 발명에 따른 방법에 사용하기에 적합한 단세포, 세포 클러스터, 또는 다세포의 비교적 복잡한 유기체를 포함하는 임의의 미생물을 포함하고, 특히 박테리아 및 효모를 포함한다. 본 발명에 따라 사용되는 미생물은 액체 배지에서 배양될 수 있고, 일반적으로 배지에서 성장하고 복제하기 위해 탄소원을 필요로 한다.

결과적으로, "재조합 숙주 미생물"은 글리코실트랜스퍼라제 또는 뉴클레오티드-활성화된 당 하이드롤라제를 코딩하는 핵산 서열, 또는 푸코실트랜스퍼라제 또는 GDP-L-푸코오스 하이드롤라제를 코딩하는 핵산 서열을 포함하는 임의의 미생물을 의미하도록 지칭되며, 이러한 효소를 코딩하는 상기 핵산 서열은 재조합 (숙주) 세포에 대해 외래이거나 재조합 (숙주) 세포에서 자연적으로 발생하지 않는 핵산 서열이고, 상기 미생물에서 외래/자연 발생적이지 않은 서열은 숙주 미생물 세포의 게놈에 통합된다. 따라서, "자연 발생적이지 않은"것은 핵산 서열이 상기 숙주 미생물 세포에 대해 외래인 것을 의미하며, 즉, 핵산 서열은 미생물 숙주 세포에 대해 이종이다. 이종 서열은 예를 들어, 형질 감염, 형질 전환, 또는 형질 도입에 의해 숙주 미생물 세포의 게놈으로 도입될 수 있으며, 상기 기술은 서열이 도입되는 숙주 세포에 따라 적용될 수 있다. 다양한 기술이 당업자에게 공지되어 있으며, 예를 들어, Sambrook et al., 1989에 개시되어 있다. 따라서, 이종 서열이 도입된 숙주 세포는 본 발명에 따른 핵산 서열이 코딩하는 이종 단백질을 생산할 것이다.

재조합체 생산을 위해, 숙주 세포는 발현 시스템 또는 그의 부분 및 본 발명의 핵산 서열을 도입하도록 유전적으로 조작될 수 있다. 숙주 미생물 세포 내로의 핵산 서열의 도입은 Davis et al., Basic Methods in Molecular Biology, (1986), and Sambrook et al., 1989과 같은 표준 실험실 메뉴얼에 기재된 방법에 의해 영향을 받을 수 있다.

따라서, 본 발명에 따른 핵산 서열은, 예를 들어 숙주 미생물 세포로 안정하게 형질 전환/형질 감염되어야 하는 벡터에 포함될 수 있다.

매우 다양한 발현 시스템이 본 발명의 폴리펩티드를 생산하는데 사용될 수 있다. 그러한 벡터로는, 그 중에서도, 코스미드 및 파스미드와 같은 플라스미드 및 박테리오파지 유전 인자로부터 유래된 것들과 같은, 염색체, 에피솜 및 바이러스 유래 벡터, 예를 들어 박테리아 플라스미드, 박테리오파지, 트랜스포슨, 효모 에피솜, 삽입인자, 효모 염색체 인자, 바이러스로부터 유래된 벡터 및 그의 조합으로부터 유래된 벡터를 포함한다. 발현 시스템 구조는 발현을 발생시킬 뿐 아니라 발현을 통제하는 조절 영역을 포함할 수 있다. 일반적으로, 폴리뉴클레오티드를 유지, 전파 또는 발현시키고 숙주에서 폴리펩티드를 합성하기에 적합한 임의의 시스템 또는 벡터는 이와 관련하여 발현에 사용될 수 있다. 적절한 DNA 서열은 예를 들어, Sambrook et al. 등의 상기 문헌에 기재된 것과 같은 임의의 다양한 잘 알려지고 일상적인 기술에 의해 발현 시스템에 삽입될 수 있다.

본원에 사용된 용어 "회수"는 분리, 수확, 수집 또는 본 발명에 따른 미생물에 의해 생산된 단당류를 미생물 배양물로부터 분리하는 것을 의미한다.

본 발명에 따른 바람직한 구현예에 따르면, 미생물은 추가로 변형되어 이화 경로를 불활성화시키거나 심각하게 감소시키거나 결핍시켜 생성된 단당류의 분해를 유도한다.

또 다른 구현예에 따르면, 미생물은 추가로 변형되어 L-푸코오스의 이화작용에 관여하는 유전자를 불활성화 또는 심각하게 감소시키거나 결핍시킨다.

또 다른 구현예에 따르면, 미생물은 추가로 변형되어 뉴클레오티드-활성화된 단당류의 생합성에 관여하는 적어도 하나의 유전자를 과발현시켜 단당류의 뉴클레오티드-활성화된 단당류의 공급을 향상시킨다. 이와 관련하여, 적어도 하나의 유전자가 이종 또는 동종인 것이 바람직하다.

본 발명에 따른 방법의 또 다른 구현예에 따르면, GDP-푸코오스, GDP-만노오스 또는 GDP-람노오스의 생합성에 관여하는 적어도 하나의 유전자는 과발현되어 GDP-푸코오스, GDP-만노오스 또는 GDP-람노오스의 공급을 각각 향상시킨다. 이와 관련하여, 적어도 하나의 유전자가 이종 또는 동종인 것이 바람직하다.

본 발명에 따른 방법의 또 다른 구현예에 따르면, 미생물은 추가로 변형되어 뉴클레오티드-활성화된 단당류에 대한 경쟁 경로(competing pathway)를 불활성화시키거나 감소시킨다.

본 발명에 따른 방법의 또 다른 구현예에 따르면, 단당류가 효소에 의해 인산화된 형태로 방출되는 경우, 미생물은 추가로 변형되어 포스파타아제를 발현한다.

본 발명 전반에 걸쳐, 생성되는 유리 단당류가 L-푸코오스, L-람노오스 또는 L- 만노오스로부터 선택되는 것이 특히 바람직하다.

바람직한 구현예에서, 미생물은 글리세롤, 수크로오스, 아세테이트, 글루코오스, 프룩토오스, 당밀, 락토오스, 자일로오스, 셀룰로오스, 합성가스(syngas), 이산화탄소 또는 일산화탄소로부터 선택되는 탄소원을 포함하는 배지에서 배양된다. 이러한 문맥에서, 임의의 다른 - 바람직하게는 저비용 - 발효 기질이 탄소원으로 사용될 수 있고, 당업자는 목적하는 단당류를 대량으로 생산하는 미생물을 성장시키기 위해 본 발명에 적합한 탄소원을 용이하게 이용할 수 있음을 이해할 것이다.

본 발명의 일 양태에 따르면, 탄소원은 미생물, 예를 들어 재조합 미생물의 배양 단계 동안 배지에 지속적으로 첨가된다.

배양 단계 동안 탄소원을 지속적으로 첨가함으로써, 단당류의 일정하고 효과적인 생산이 이루어진다.

본 발명의 또 다른 양태에 따르면, 단당류는 배양된 재조합 숙주 미생물의 상청액으로부터 회수되고, 상청액은 상청액 및 숙주 미생물 펠렛을 얻기 위해 배양된 숙주 미생물을 원심분리함으로써 수득된다.

새로 제공되는 방법을 이용하여 숙주 미생물이 배양된 배지로부터 생산된 단당류를 회수할 수 있고, 미생물에서 생산된 단당류가 배지로 옮겨지기 때문에, 일단 미생물의 세포가 배양 배지로부터 분리되면 상청액으로부터 미생물을 회수하는 것을 쉽게 가능하게 한다.

목적하는 단당류의 합성 동안 미생물에서 생성될 수 있고 목적하는 단당류의 회수/정제 단계를 손상/저해하는 모노- 또는 올리고당은 미생물에 의해 대사될 수 있으므로, 목적하는 단당류를 회수하는 단계는 더욱 향상되고 촉진된다. 따라서, 당 대사 효소(들)는 본 발명에 따른 방법의 종결 시에 외부에서 첨가/공급될 수 있다. 그렇게 함에 있어서, 바람직하지 않은 당은 축적될 수 없고 목적하는 단당류의 회수를 저해하지 않는다. 대사경로 또는 효소를 코딩하는 유전자는 다른 저해하는 바람직하지 않은 단당류를 대사시키기 위해 미생물에서 발현될 수 있고, 당업자는 본 발명을 읽고 생산될 단당류에 의존하는 탈조절/활성화 또는 공급을 위한 다른 적합한 경로 또는 효소를 쉽게 인식할 것이다.

본 발명의 또 다른 양태에 따르면, 본 발명에 다른 방법은 하기 단계를 포함한다:

a) 미생물이 성장하기에 적합한 배지에서, 자연적으로 발생하지 않는 뉴클레오티드-활성화된 단당류의 가수분해를 촉매하는 효소를 코딩하는 핵산 서열을 포함하도록 형질전환된 재조합 숙주 미생물을 제공하는 단계로서, 상기 미생물은 단당류가 유의한 양으로 생성되도록 대사할 수 없는 것인, 단계

b) 상기 배지에서 재조합 숙주 미생물을 배양하는 단계로서, 단당류는 유리형태로 생산되는 것인, 단계

c) 배지로부터 유리 단당류를 회수하는 단계

따라서, 상기 단락에 기재된 바와 같은 방법은 배지로부터 유리 단당류를 회수하는 추가적인 단계를 포함한다.

본 발명의 또 다른 양태에 따르면, 미생물이 개시되고 청구된다.

상기 방법과 관련하여 특정 용어에 대해 위에서 사용된 정의는 본원에 제시된 재조합 미생물에도 적용된다.

바람직한 구현예에 따르면, 본 발명에 따른 방법에 사용되며 본원에 청구된 미생물은 목적하는 단당류가 뉴클레오티드-활성화된 단당류의 가수분해 절단에 의해 수득될 수 있는 뉴클레오티드-활성화된 당을 합성할 수 있는 박테리아 또는 효모 균주로부터 선택된다. 박테리아 에스케리치아 콜라이( Escherichia coli), 코리네박테리움 글루타미컴(Corynebacterium glutamicum) 및 효모 사카로미세스(yeast Saccharomyces) 종은 실험실 환경에서 쉽고 경제적으로 성장하는 장점이 있으며, 박테리아 및 효모는 수년 동안 집중적으로 연구되어 왔다.

따라서, 바람직한 구현예에서, 본 발명에 따른 방법에서 사용되거나 청구된 숙주 미생물은 박테리아 및 효모를 포함하는 군으로부터 선택되고, 바람직하게는 에스케리치아 콜라이 균주이다.

본 발명의 구현예에서, 재조합 숙주 미생물은 목적하는 단당류의 대사에 관여하는 효소를 코딩하는 유전자, L-푸코오스의 경우, L-푸쿨로소세 키나아제(L- fuculosose kinase), L-푸코오스 아이소머라제, 푸쿠로스-1-포스페이트 알돌라아제, 및 UDP-글루코오스: 언데카프레닐-포스페이트 글루코오스 포스포트랜스퍼라제를 코딩하는 유전자가 결핍되도록 추가로 변형되는 경우, 보다 바람직하다. 또한, 바람직한 구현예에 따라, 다당류의 합성을 위한 기질로서 뉴클레오티드-활성화된 단당류를 사용하는 글리코실트랜스퍼라제 유전자(예를 들어, 푸코실트랜스퍼라제, 또는 콜론산(colonic acid)과 같은 푸코실화된 올리고당의 합성에 관여하는 효소)가 결핍된다.

또한, 뉴클레오티드-활성화된 당의 합성을 향상시키는 유전자의 과발현이 바람직하다. E.coli 유래의 포스포만노뮤타아제(manB), 만노오스-1-포스페이트 구아노실트랜스퍼라제 (manC), GDP-만노오스-4,6-디하이드라타제(gmd), 및 GDP-L-푸코오스 신타아제(wcaG) 또는 다른 유기체로부터의 적절한 유전자를 코딩하는 GDP-L-푸코오스 유전자가 각각의 미생물에서 과발현된다.

본 구현예는 생산된 단당류 L-푸코오스의 분해 및 콜론산(colonic acid)의 생산이 방지되고 GDP-L-푸코오스의 합성이 향상되는 장점을 갖는다.

또 다른 바람직한 구현예에서, 재조합 숙주 미생물은 단독 탄소원으로서 수크로오스 또는 글리세롤 상에서 재조합 숙주 미생물이 성장할 수 있도록 하는 유전자를 함유하도록 추가로 형질전환되고, 에스케리치아 콜라이 W(acc. No. CP0021851)의 csc-유전자 클러스터가 숙주 미생물의 게놈에 통합될 경우 특히 바람직하다. 유전자 클러스터는 형질전환된 미생물이 단독 탄소원으로서 수크로오스 상에서 성장할 수 있도록 하는 수크로오스 퍼미아제(permase), 프룩토키나아제, 수크로오스 하이드롤라제, 및 전사 억제자(유전자 cscB, cscK, cscA, 및 cscR, 각각)를 포함한다.

이와 관련하여, 본 발명에 따른 방법에 대해 바람직한 것으로 열거된 구현예들은 적용 가능한 경우 청구된 미생물에 대해 모두 적용됨에 주목한다.

따라서, 본 발명은 또한 단당류를 대사할 수 없는 뉴클레오티드-활성화된 단당류의 가수분해를 촉매하는 효소를 갖는 미생물의 사용에 관한 것이며, 본 발명은 또한 단당류, 특히 L-푸코오스의 생산을 위한 본 발명에 따른 재조합 미생물의 사용에 관한 것이다.

본 발명에 따른 방법의 특정 용어를 설명하기 위한 상기 정의는 본원에서 청구되고 기재된바와 같이, 재조합 또는 변형되지 않은 미생물에 적용됨에 주목한다.

달리, 단당류를 생산하는 방법은 세포가 없는 시스템 상에 적용될 수 있으며, 이로써 본 발명에 따른 효소 및 적합한 기질은 수성 반응 배지에서 혼합된다. 효소는 용액 중에서 자유롭게 이용될 수 있거나, 중합체와 같은 지지체에 결합되거나 고정될 수 있으며, 기질은 지지체에 첨가될 수 있다. 지지체는 예를 들어, 컬럼으로 포장될 수 있다.

특히, 본 발명은 재조합 숙주 미생물로서 재조합 에스케리치아 콜라이 균주가 사용되는 방법에 관한 것으로, 상기 재조합 에스케리치아 콜라이 균주는 L-푸코오스 아이소머라제 유전자, L-푸쿨로소세 키나아제(L-fuculosose kinase) 유전자, 및 UDP-글루코오스: 언데카프레닐-포스페이트 글루코오스 포스포트랜스퍼라제가 결핍되고, 상기 재조합 에스케리치아 콜라이 균주는 a) E.coli 균주가 수크로오스 또는 글리세롤을 단독 탄소원으로하여 성장할 수 있게 하는 유전자, 수크로오스 퍼미아제, 프룩토키나아제, 수크로오스 하이드롤라제, 및 전사 억제자, b) E.Coli 또는 다른 유기체로부터의 포스포만노뮤타아제, 만노오스-1-포스페이트 구아노실트랜스퍼라제, GDP-만노오스-4,6-디하이드라타제, 및 GDP-L-푸코오스신타아제를 코딩하는 유전자, c) 뉴클레오티드-활성화된 단당류의 가수분해를 촉매하는 효소, 예를 들어 억셉터 분자의 부재 하에 GDP-L-푸코오스를 가수분해하는 푸코실트랜스퍼라제를 코딩하는 유전자를 포함하도록 형질 전환된다.

상술한 특징 및 아래에서 설명하는 특징은 본 발명의 범위를 벗어나지 않는 한, 각각의 특정 조합뿐만 아니라, 그 밖의 조합 또는 그 자체로 사용할 수 있음은 물론이다. 또한, 종속항에 있는 특정한 특징들은 본 발명이 또한 구체적으로 종속항의 특징의 임의의 다른 가능한 조합을 갖는 다른 구현예에 관한 것으로 인식되도록 본 발명의 범위 내에서 다른 방식으로 서로 결합될 수 있음에 주목한다.

본 발명의 몇몇의 구현예가 도면에 도시되어 있으며, 다음의 기재에서 보다 상세하게 설명된다.
도 1
pDEST: 실수 유발 PCR에 의한 wbgL의 무작위 돌연변이 유발 후 pDEST: wbgL 라이브러리를 포함하는 E. coli BL21(DE3) 생산 균주의 상청액에서 유리 L-푸코오스의 검출. pDEST: wbgL(실수-유발)를 보유하는 E. coli BL21(DE3) 생산 균주의 배양물의 상청액을 비색 L-푸코오스 디하이드로지나아제 분석(분석의 설명은 아래 단락 [0089] 참조)에 적용하였다. "WT"로 표시된 웰은 변형되지 않은 wbgL 유전자를 발현하는, E. coli BL21(DE3) 생산 균주 pDEST:wbgL 배양물의 상청액을 포함한다. "D1" 및 "H2"로 표시된 웰은 WbgL 변이체 (H124A E215G) (클론 D1) and WbgL (N69S I268P) (클론 H2)을 합성하는 클론으로부터의 배양 상청액을 포함한다.
도 2
pDEST: wbgL (H124A E215G) (클론 D1), 및 pDEST: wbgL (N69S I268P) (클론 H2)를 보유하는 E. coli BL21(DE3) 생산 균주의 배양물 상청액의 LC-MS / MS 분석. 4.3 g/L, and 2.5 g/L의 L-푸코오스가 각각, 클론 D1 및 클론 H2에 의해 생산되었다.
도 3
GDP-L-푸코오스 하이드롤라제 활성에 의한 GDP-L-푸코오스로부터 방출된 L-푸코코스의 검출. E. coli BL21(DE3) pDEST:futC 및 E. coli BL21(DE3) pDEST:wbgL (H124A E215G)의 세포 용해물을 5mM GDP-L-푸코오스를 포함하는 시험관 내 GDP-L-푸코오스 하이드롤라제 분석에 적용하였다. 유리 L-푸코오스를 비색 L-푸코오스 디하이드로지나아제 분석에서 검출하였다(분석의 설명은 아래 단락 [0089] 참조). 웰 1에서 0.27 유닛의 FutC, 웰 2에서는 0.32 유닛의 WbgL (H124A E215G)를 포함하는 분석이 적용되었다. GDP-L-푸코오스의 안정성을 확인하기 위해 분석은 소 혈청 알부민(웰 3)으로 수행되었다.
도 4
<P_tet-manCB-P_T5-gmd> (서열번호 1), wcaG - dhfr (A), <cscB - cscK -cscA- cscR> (서열번호 2) (B), <wbgL> (서열번호 3) (C), 및 <futC> (서열번호 4)의 서열.

실시예

푸코오스 생산 E. coli 균주의 제작

에스케리치아 콜라이 BL21 (DE3) (Novagen, Darmstadt, Germany)이 푸코오스 생산 균주를 제작하기 위한 유전자 조작에 사용되었다. 푸코오스는 GDP-L-푸코오스의 가수분해에 의해 생산되기 대문에, GDP-L-푸코오스의 합성은 E.coli K12 DH5α 유래의 포스포만노뮤타아제 (manB), 만노오스-1-포스페이트 구아노실트랜스퍼라제 (manC), GDP-만노오스-4,6-디하이드라타제 (gmd), 및 GDP-L-푸코오스 신타아제 (wcaG)를 코딩하는 유전자의 삽입 및 과발현에 의해 향상된다. 오페론 manC-manB는 P_tet 프로모터의 전사 조절 하에 있고 오페론 gmd - wcaG는 PT5 프로모터로부터 발현된다. 유전자 클러스터 <P_tet-manCB-P_T5-gmd, wcaG - dhfr > (서열번호 1; 도 4a)는 인테그란트(integrant)에 트리메소프림 저항성을 부여하는 디하이드로폴레이트 리덕타제를 코딩하는 dhfr 유전자를 또한 포함한다. 전위에 의한 E. coli BL21(DE3) 게놈으로의 클러스터의 통합을 위해, 클러스터는 마리너-계(mariner-family) 전이성 인자 Himar1에 의해 특이적으로 인식되는 역전된 말단 반복에 의해 측면에 위치한다. 또한, E.coli W의 csc-유전자 클러스터를 숙주 유기체의 게놈에 도입하였다. 유전자 클러스터는 수크로오스 퍼미아제(cscB), 프룩토키나아제(cscK), 수크로오스 하이드롤라제(cscA), 및 전사 억제자(cscR) 유전자를 포함한다. Himar1 특이적인 역전된 말단 반복물이 측면에 놓인 클러스터<cscB - cscK -cscA-cscR> (서열번호 2; 도. 4b)의 통합은 Himar1 전위에 의해 수행되고 숙주 유기체에 대해 수크로오스를 단독 탄소원으로 하여 성장하는 능력을 매개하였다(Choi, K.-H. and Kim, K.-J. (2009) Applications of transposon-based gene delivery system in bacteria. J. Microbiol. Biotechnol. 19, 217-228).

콜론산(colonic acid)의 형성에 의한 GDP-L-푸코오스의 감소를 막기 위해, UDP-글루코오스: 언데카프레닐 포스페이트 글루코오스-1-포스페이트 트런스퍼라제를 코딩하는 것으로 예측되는 유전자 wcaJ를 Datsenko and Warner 방법 (Datsenko, K.A. and Warner B.L. (2000) One-step inactivation of chromosomal genes in Escherichia coli K-12 using PCR products. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 97, 6640-6645)에 따라 E.coli BL21(DE3) 게놈으로부터 제거하였다. UDP-글루코오스: 언데카프레닐 포스페이트 글루코오스-1-포스페이트 트런스퍼라제는 콜론산(colonic acid) 합성의 첫 번째 단계를 촉매한다(Stevenson, G., Andrianopoulos, K., Hobbs, M. and Reeves, P. R. (1996) Organization of the Escherichia coli K-12 gene cluster responsible for the production of the extracellular polysaccharide colonic acid. J. Bacteriol. 178, 4885-4893). 추가적으로, 푸코오스 아이소머라제 및 푸쿠로스 키나아제를 코딩하는, 푸코오스 이화 경로의 유전자 fucl 및 fucK는 각각 게놈 넉-아웃에 의해 불활성화되어 L-푸코오스의 분해를 저해하였다.

1,2-푸코실트랜스퍼라제 유전자 wbgL 및 futC의 클로닝, 및 wbgL의 돌연변이 유발

E.coli:O126 (acc. No. AND43847) 유래의 1,2-푸코실트랜스퍼라제 유전자 wbgL (서열번호 3; 도 4c)을 코돈-최적화하고 GenScript Cooperation(Piscataway, USA)에 의해 합성적으로 제조하였다. 또한 헬리코박터 파일로리(acc. No. AAD29868) 유래의 1,2-푸코실트랜스퍼라제를 코딩하는 futC (서열번호 4, 도 4d) 유전자를 합성적으로 합성하고, E.coli에서의 발현을 위해 코돈 최적화하였다. 벡터 pDEST14로의 클로닝을 위해, 유전자를 wbgL에 대한 프라이머 6128(서열번호 5) 및 6129 (서열번호 6) 및 futC에 대해 프라이머 6195(서열번호 7) 및 6196(서열번호 8)를 각각 사용하여 증폭하였다. 프라이머 서열에 대해서는 아래의 표 1을 참고.

[표 1] 폴리머라제 연쇄 반응에 사용된 올리고뉴클레오티드의 목록

wbgL 유전자의 돌연변이는 제조사의 지시 및 프라이머 6128과 6129에 따라 Diversify® PCR Random Mutagenesis Kit (Clonetech, Mountain View, USA)를 사용한 여러 차례의 실수-유발 PCR에 의해 도입되었다. 정제된 실수-유발 PCR 산물을 벡터 pDEST14에 클로닝하여 pDEST:wbgL(실수-유발)을 얻었다. 벡터 pDEST14로의 클로닝은 일반적으로 Gateway technology (Gateway® Technology manual (Life Technologies, Carlsbad, USA))를 사용하여 수행되었다. 플라스미드의 시퀀싱은 LGC Genomics (Berlin, Germany)에 의해 수행되었다. 재조합 플라스미드를 전기천공법에 의해 적합한 E.coli 숙주에 형질전환시켰다.

성장 배지 및 세포 배양

pDEST:wbgL(실수-유발) 플라스미드 라이브러리를 갖는 E.coli BL21(DE3) 생산 균주를 1% (v/v)의 글리세롤 및 1% (v/v)의 수크로오스를 탄소원으로 갖는 미네랄 염 배지에서 성장시켰다. 배지는 2 g/L NH₄H₂PO₄, 7 g/L K₂HPO₄, 2 g/L KOH, 0.3 g/L 시트르산, 0.98 g/L MgSO₄ × 7 H₂O, 및 0.02 g/L CaCl₂ × 6 H₂O로 구성된다. 리터 당 1 밀리리터의 미량 원소 용액(54.4 g/L 암모늄 철 시트레이트, 9.8 g/L MnCl₂ × 4 H₂O, 1.6 g/L CoCl₂ × 6 H₂O, 1 g/L CuCl₂ × 2 H₂O, 1.9 g/L H₃BO₃, 9 g/L ZnSO₄ × 7 H₂O, 1.1 g/L Na₂MoO₄ × 2 H₂O, 1.5 g/L Na₂SeO₃, 1.5 g/L NiSO₄ × 6 H₂O)이 보충된다. 선택을 위해 10 μg/mL의 트리메소프림 및 100 μg/mL의 암피실린을 첨가하였다. 세포를 96-웰 미량정량판에서 24시간 동안 30℃에서 진탕하면서 성장시켰다. 50 ㎕의 준비 배양액을 pDEST에서 wbgL 유전자의 발현을 유도하기 위한 0.3mM IPTG를 함유하는 400 ㎕ 신선한 HEPES (100 mM) 완충 배지가 있는 96-웰 플레이트로 옮겼다. 유도된 배양물을 30℃에서 2일 동안 진탕하면서 배양하였다. 세포를 원심분리에 의해 침강시키고, 상청액을 유리 L-푸코오스의 검출에 사용하였다.

pDEST: wbgL (H124A E215G) 및 pDEST: futC를 각각 함유하는 E.coli BL21 (DE3)을 100 μg/mL 암피실린 존재 하에 0.3의 OD600nm까지 30 ℃에서 2YT 브로스(Sambrook, J. and Russell D. W. (1989) Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd Ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y.)에서 성장시켰다. 0.3mM IPTG를 첨가하여 wbgL (H124A E215G) 및 futC의 전사를 유도하였다. 유도 20시간 후 세포를 원심분리하여 수확하였다. 세포를 시험관 내 GDP-L-푸코오스 하이드롤라제 활성의 분석에 사용하였다.

유리 L- 푸코오스 및 시험관 내 GDP-L- 푸코오스 하이드롤라제 활성을 검출하기 위한 효소 분석

유리 L-푸코오스를 L-푸코오스의 L-푸코노-1,5-락톤으로의 NADP-의존적 형질전환을 촉매하는 슈도모나스 속 No. 1143 (acc. no. D32042) 유래의 L-푸코오스 디하이드로지나아제(FuDH)를 사용하여 비색 분석에 의해 측정하였다. 비색 분석에서 페나진 메토설페이트의 존재 하에 나이트로블루 테트라졸륨은 NADPH에 의해 청자색 포르마잔으로 감소된다. 포르마잔의 형성은 571nm에서 관찰된다. (Mayer, K. M. and Arnold, F. H. (2002) A Colorimetric Assay to Quantify Dehydrogenase Activity in Crude Cell Lysates. J. Biomol. Screen. 7, 135-140).

슈도모나스 속 No. 1143 유래의 fuDH 유전자는 E.coli BL21(DE3)에서 과발현되었다. N-말단 His6-태그를 함유하는 재조합 FuDH 단백질은 Ni Sepharose^TM 6 Fast Flow column (GE Healthcare, Pollards Wood, UK)을 사용하여 고정된-금속 친화성 크래마토그래피에 의해 조 추출물로부터 농축되었다.

pDEST:wbgL(실수-유발)를 보유하는 푸코오스 E. coli BL21(DE3) 생산 균주의 배양물에서 유리 L-푸코오스를 검출하기 위해, 각각의 200㎕ L-푸코오스 디하이드로지나아제 분석 반응은 50㎕ 세포 배양 상청액 및 0.13%(w/v) 젤라틴과 함께 0.8mM NADPH, 0.3mM 나이트로블루 테트라졸륨, 0.03mM 페나진 메토설페이트 및 50mM 트리스(pH 8.0) 중 4.7 단위 His6-FuDH로 이루어진 150㎕ 시약 용액을 함유하였다(모든 화학 물질은 Sigma Aldrich, St. Louis, USA에서 구입하였다). 청자색의 포르마잔 형성은 실온에서 10분 배양 후 571nm에서 측정되었다.

E.coli BL21 (DE3) pDEST : wbgL (H124A E215G) 및 E.coli BL21 (DE3) pDEST : futC의 세포 용해물에서의 GDP-L-푸코코스 하이드롤라제 활성을 검출하기 위해 세포를 5mM MnCl₂가 있는 50mM HEPES 완충액 (pH 7.5)에 재현탁하고 glasbeats 및 Mini-Beatbeater(BioSpec Producs, Bartlesville, USA)를 사용하여 분쇄하였다. L-푸코오스는 GDP-L-푸코오스 하이드롤라제 분석에서 GDP-L-푸코오스로부터 절단되었다. 200㎕의 하이드롤라제 분석은 50mM HEPES 완충액(pH 7.5), 5mM MnCl₂ 및 50㎕ 무세포 추출액에 100mM 중 12.5㎕의 GDP-L-푸코오스 (Sigma Aldrich, St. Louis, USA)를 함유한다.

GDP-L-푸코오스의 안정성을 확인하기 위해, 하이드롤라제 분석은 또한 조 추출물 대신 50㎕ 소 혈청 알부민(30 mg/mL)을 사용하여 수행되었다. 단백질 농도는 시판되는 염료 용액(Roti-Quant®, Carl Roth, Karlsruhe, Germany)을 사용하여 브래드퍼드법에 따라 평가되었다. 30℃에서 1시간 항온처리한 후, GDP-L-푸코코스 분석에서 효소를 95℃에서 10분 동안 가열함으로써 비활성화시켰다. L-푸코오스 디하이드로지나아제 분석을 사용하여 유리 L-푸코코스를 검출하기 위해 50㎕의 GDP-L-푸코오스 하이드롤라제 분석 반응 혼합물을 사용하였다. 이 분석을 상기 기재된 바와 같이 설정하고, 실온에서 24 시간 동안 항온처리하였다.

LC-MS / MS 분석

LC Triple-Quadrupole MS 검출 시스템(Shimadzu LC-MS 8050) (Shimadzu Corporation, Kyoto, Japan)을 사용하여 MRM(multiple reaction monitoring)으로 질량 분석을 수행하였다. 전구체 이온은 사중극자 1에서 선택되고 분석되며, 단편화는 CID 가스로서 아르곤을 사용하는 충돌 셀(collision cell)에서 일어나고, 조각 이온의 선택은 사중극자 3에서 수행된다.

배양 상청액 및 시험관 내 분석으로부터 반응 혼합물의 희석 후 푸코오스 및 말토트리오스의 크래마토그래피 분리는 XBridge Amide 가드 카트리지(3.5 μm, 2.1 × 10 mm) (Waters, USA)가 있는 XBridge Amide HPLC 컬럼(3.5 μm, 2.1 × 50 mm) (Waters, USA) 에서 수행되었다. HPLC 시스템은 8℃에서 작동하는 Shimadzu Nexera X2 SIL-30ACMP 자동 시료 주입기, Shimadzu LC-20AD 펌프 및 30℃에서 작동하는 Shimadzu CTO-20AC 컬럼 오븐으로 구성된다(Shimadzu Corporation, Kyoto, Japan). 이동상은 아세토니트릴: H₂O (62:38 % (v/v)) 및 10mM 암모늄 아세테이트로 구성된다. 1㎕ 시료를 기기에 주입하고, 작동은 300 ㎕/분의 유속으로 3분 동안 수행되었다. L-푸코오스 및 말토트리오스(정규화를 위한 내부표준으로 첨가)를 ESI 음 이온화 모드에서 MRM으로 분석하였다. 질량 분광기는 단위 분해능으로 작동되었다. 푸코오스는 m/z 163.2 [M-H]의 이온을 형성하고, 말토트리오스는 m/z 503.2 [M-H]의 이온을 형성하였다. L-푸코오스의 전구 이온은 충돌 셀에서 단편 이온 m/z 88.9, m/z 70.8 및 m/z 58.9로 더 단편화되었다. 말토트리오스(m/z 503.2)의 분자 이온은 m/z 341.1, m/z 161.05 및 m/z 100.9로 단편화되었다. 충돌 에너지, Q1 및 Q3 Pre Bias는 각 분석물에 대해 개별적으로 최적화되었다.

결과

푸코실트랜스퍼라제 유전자를 발현하는 E. coli BL21(DE3) 생산 균주에 의한 유리 L- 푸코오스의 합성

E.coli BL21(DE3)에서 GDP-L-푸코오스 합성을 향상시키기 위해 포스포만노뮤타아제, 만노오스-1-포스페이트 구아노실트랜스퍼라제, GDP-만노오스-4,6-디하이드라타제 및 GDP-L-푸코오스 신타아제를 코딩하는 이종 유전자를 유전체 수준에서 통합하고 과발현시켰다. 또한, BL21(DE3) 균주에 수크로오스에서 성장하는 능력을 부여하기 위해, E.coli W 유래의, 수크로오스 퍼미아제, 프룩토키나아제, 수크로오스 하이드롤라제 및 전사 억제자를 코딩하는 csc-유전자 클러스터를 게놈에 통합하였다.

1,2-푸코실트랜스퍼라제 WbgL은 도너 분자 GDP-L-푸코오스로부터 억셉터 올리고당으로 L-푸코오스를 전달하는 것을 촉매한다. 그러나, 억셉터 분자의 부재 하에 적절한 배지에서 pDEST:wbgL를 보유하는 E. coli BL21(DE3) 생산 균주를 성장시킬 때, 유리 L-푸코오스가 박테리아 배양물의 상청액에서 검출될 수 있다. 유리-L-푸코오스는 WbgL의 GDP-L-푸코오스 하이드롤라제 활성에 의해 GDP-푸코오스로부터 방출된다.

WbgL의 GDP-L-푸코오스 하이드롤라제 활성을 추가로 향상시키기 위해 wbgL 유전자는 실수-유발 PCR을 사용하여 무작위의 돌연변이를 유발시켰다. pDEST:wbgL(실수-유발)를 보유하는 약 5000개의 E. coli BL21(DE3) 생산 균주의 라이브러리를 향상된 GDP-L-푸코오스 하이드롤라제 활성에 대해 시험하였다. 두 개의 클론(클론 D1 및 H2로 지칭)은 L-푸코오스 디하이드로지나아제 분석을 사용하여 배양 상청액을 분석함으로써 결정된 바와 같이 유리 L-푸코오스스의 생산 증가를 나타냈다(도 1). 두 개의 클론 각각의 WbgL 서열에서 2개의 아미노산 치환체가 발견되었다. 클론 D1의 WbgL 변이체는 히스티딘 124에서 알라닌 및 글루타메이트 215에서 글리신으로의 아미노산 치환을 포함하고, 클론 H2의 WbgL 변이체에서 잔기 아스파라긴 69는 세린으로 이소류신 268은 프롤린으로 치환되었다.

플라스미드 pDEST : wbgL, pDEST : wbgL (H124A E215G) D1 및 pDEST : wbgL (N69S I268P) H2를 보유하는 E. coli BL21(DE3) 생산 균주의 상청액을 또한 LC-MS/MS 분석하였다. L-푸코오스는 각 시료에서 MRM 분석에 의해 동정되었다. 유리 L-푸코오스의 양은 정규화를 위한 내부 표준으로서 말토트리오스를 사용하여 결정하였다. wbgL 야생형 유전자를 발현하는 균주에 대해 0.12 g/L L- 푸코오스를 배양 상청액에서 결정하였다. WbgL 변이체(H124A, E215G) 및 (N69S, I268P)의 가수 분해 활성이 명확히 증가했다. 클론 D1 및 H2는 각각 0.43 g/L 및 0.25 g/L의 L-푸코오스를 생산하였다(도 2).

푸코실트랜스퍼라제 유전자를 발현하는 미생물의 세포 용해물에서 GDP-L- 푸코오스 하이드롤라제 활성의 검출

GDP-L-fucose 하이드롤라제 활성을 전사 유도자 IPTG의 존재 하에 성장한, E.coli BL21 (DE3) pDEST: wbgL (H124A E215G) 및 E.coli BL21 (DE3) pDEST: futC의 무세포 추출물에서 분석하였다. 2-푸코실트랜스퍼라제 FutC는 올리고당 기질의 부재 하에 GDP-L-푸코오스를 가수분해하는 것으로 기재되어있다 (Stein, D.B., Lin Y.-N., Lin, C.-H. (2008) Characterization of Helicobacter pylori α 1,2-fucosyltransferase for enzymatic synthesis of tumor-associated antigens. Adv. Synth. Catal. 350, 2313-2321). GDP-L푸코오스는 5mM GDP-L-푸코오스 및 각각의 균주의 세포 용해물을 함유하는 하이드롤라제 분석에서 절단되었다. L-푸코오스 디하이드로지나아제 분석을 이용하여 유리 L-푸코오스를 검출하였다. 조 추출물 대신에 소 혈청 알부민을 함유하는 분석에서 유리 L-푸코오스가 검출되지 않아 GDP-L-푸코오스의 안정성을 입증하였다(도 3).

GDP-L-푸코오스의 시험관 내 가수분해에 의해 방출된 L-푸코오스의 정량화를 위해, 이온 교환 카트리지(Strata ABW, Phenomenex, Aschaffenburg, Germany)를 사용하는 고체상 추출에 의해 하이드롤라제 분석물을 클리어링하고 LC-MS/MS로 분석하였다. futC 및 wbgL(H124A E215G) 발현 균주의 세포 용해물을 함유하는 분석에서, 1시간 배양 후 각각 0.38 g/L 및 0.32 g/L의 L-푸코오스가 측정되었으며, 이는 FutC에 대해 0.18U/mg 및 WbgL (H124A E215G)에 대해 0.21U/mg의 특정 GDP-L-푸코오스 하이드롤라제 활성과 상응한다.

SEQUENCE LISTING <110> Jennewein Biotechnologie GmbH <120> Fermentation process for producing monosaccharides in free form from nucleotide-activated sugars <130> IPA170565-DE <140> EP15153383.3 <141> 2015-01-30 <160> 8 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 6741 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> <Ptet-manCB-PT5-gmd, wcaG-dhfr> <400> 1 ggccagatga ttaattccta atttttgttg acactctatc attgatagag ttattttacc 60 actccctatc agtgatagag aaaagtgaaa tgaatagttc gacaaaaatc tagaaataat 120 tttgtttaac tttaagaagg agatatacaa tttcgtcgac acacaggaaa catattaaaa 180 attaaaacct gcaggagttt gaaggagata gaaccatggc gcagtcgaaa ctctatccag 240 ttgtgatggc aggtggctcc ggtagccgct tatggccgct ttcccgcgta ctttatccca 300 agcagttttt atgcctgaaa ggcgatctca ccatgctgca aaccaccatc tgccgcctga 360 acggcgtgga gtgcgaaagc ccggtggtga tttgcaatga gcagcaccgc tttattgtcg 420 cggaacagct gcgtcaactg aacaaactta ccgagaacat tattctcgaa ccggcagggc 480 gaaacacggc acctgccatt gcgctggcgg cgctggcggc aaaacgtcat agcccggaga 540 gcgacccgtt 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aaagagaaat 1320 gagtaactgg atgcaaaacg atagtacgca tttctgaatg gaatattcag tgccataatt 1380 acctgcctgt cgttaaaaaa ttcacgtcct atttagagat aagagcgact tcgccgttta 1440 cttctcacta ttccagttct tgtcgacatg gcagcgctgt cattgcccct ttcgccgtta 1500 ctgcaagcgc tccgcaacgt tgagcgagat cgataattcg tcgcatttct ctctcatctg 1560 tagataatcc cgtagaggac agacctgtga gtaacccggc aacgaacgca tctcccgccc 1620 ccgtgctatc gacacaattc acagacattc cagcaaaatg gtgaacttgt cctcgataac 1680 agaccaccac cccttctgca cctttagtca ccaacagcat ggcgatctca tactcttttg 1740 ccagggcgca tatatcctga tcgttctgtg tttttccact gataagtcgc cattcttctt 1800 ccgagagctt gacgacatcc gccagttgta gcgcctgccg caaacacaag cggagcaaat 1860 gctcgtcttg ccatagatct tcacgaatat taggatcgaa gctgacaaaa cctccggcat 1920 gccggatcgc cgtcatcgca gtaaatgcgc tggtacgcga aggctcggca gacaacgcaa 1980 ttgaacagag atgtaaccat tcgccatgtc gccagcaggg caagtctgtc gtctctaaaa 2040 aaagatcggc actggggcgg accataaacg taaatgaacg ttccccttga tcgttcagat 2100 cgacaagcac cgtggatgtc cggtgccatt catcttgctt cagatacgtg atatcgactc 2160 cctcagttag cagcgttctt tgcattaacg caccaaaagg atcatccccc acccgaccta 2220 taaacccact tgttccgcct aatctggcga ttcccaccgc aacgttagct ggcgcgccgc 2280 caggacaagg cagtaggcgc ccgtctgatt ctggcaagag atctacgacc gcatccccta 2340 aaacccatac tttggctgac atttttttcc cttaaattca tctgagttac gcatagtgat 2400 aaacctcttt ttcgcaaaat cgtcatggat ttactaaaac atgcatattc gatcacaaaa 2460 cgtcatagtt aacgttaaca tttgtgatat tcatcgcatt tatgaaagta agggacttta 2520 tttttataaa agttaacgtt aacaattcac caaatttgct taaccaggat gattaaaatg 2580 acgcaatctc gattgcatgc ggcgcaaaac gccctagcaa aacttcatga gcaccggggt 2640 aacactttct atccccattt tcacctcgcg cctcctgccg ggtggatgaa cgatccaaac 2700 ggcctgatct ggtttaacga tcgttatcac gcgttttatc aacatcatcc gatgagcgaa 2760 cactgggggc caatgcactg gggacatgcc accagcgacg atatgatcca ctggcagcat 2820 gagcctattg cgctagcgcc aggagacgat aatgacaaag acgggtgttt ttcaggtagt 2880 gctgtcgatg acaatggtgt cctctcactt atctacaccg gacacgtctg gctcgatggt 2940 gcaggtaatg acgatgcaat tcgcgaagta caatgtctgg ctaccagtcg ggatggtatt 3000 catttcgaga aacagggtgt gatcctcact ccaccagaag gaatcatgca cttccgcgat 3060 cctaaagtgt ggcgtgaagc cgacacatgg tggatggtag tcggggcgaa agatccaggc 3120 aacacggggc agatcctgct ttatcgcggc agttcgttgc gtgaatggac cttcgatcgc 3180 gtactggccc acgctgatgc gggtgaaagc tatatgtggg aatgtccgga ctttttcagc 3240 cttggcgatc agcattatct gatgttttcc ccgcagggaa tgaatgccga gggatacagt 3300 taccgaaatc gctttcaaag tggcgtaata cccggaatgt ggtcgccagg acgacttttt 3360 gcacaatccg ggcattttac tgaacttgat aacgggcatg acttttatgc accacaaagc 3420 tttttagcga aggatggtcg gcgtattgtt atcggctgga tggatatgtg ggaatcgcca 3480 atgccctcaa aacgtgaagg atgggcaggc tgcatgacgc tggcgcgcga gctatcagag 3540 agcaatggca aacttctaca acgcccggta cacgaagctg agtcgttacg ccagcagcat 3600 caatctgtct ctccccgcac aatcagcaat aaatatgttt tgcaggaaaa cgcgcaagca 3660 gttgagattc agttgcagtg ggcgctgaag aacagtgatg ccgaacatta cggattacag 3720 ctcggcactg gaatgcggct gtatattgat aaccaatctg agcgacttgt tttgtggcgg 3780 tattacccac acgagaattt agacggctac cgtagtattc ccctcccgca gcgtgacacg 3840 ctcgccctaa ggatatttat cgatacatca tccgtggaag tatttattaa cgacggggaa 3900 gcggtgatga gtagtcgaat ctatccgcag ccagaagaac gggaactgtc gctttatgcc 3960 tcccacggag tggctgtgct gcaacatgga gcactctggc tactgggtta acataatatc 4020 aggtggaaca acggatcaac agcgggcaag ggatccgcgt cactcttccc ccttcacgac 4080 cttcaataat atgcaatgca gcttcccgcc cgataatgtc atgtggaagc tgaattgtgg 4140 tcagcggcgg taaaaacaga tgcccgacgc caaccagatt atcaaagccc attacggcga 4200 catcctgcgg gattcgtacc cccttcgcca gaagaacctg ataagccaca aaggctgcgc 4260 gatcgttacc acatatcaga acatcaaaat ctggtttgcc cggtttgaag tgggcattga 4320 gtaaacttgc gagatcggtg tagtgatcat cacctgttgc catgtgaaat tgtttcacct 4380 cagccagatc tcgtccagca tcacgccagg cctgctcaaa tccctgccga cgataccctg 4440 ttgccaacgc actttccggt agccagaagc ataacggttg acgatagccc gccgcgagca 4500 aatgctgtgt tgattcatat tgtgcagtgt aatcatcagg gatataactg ggtaacgctg 4560 ggtcatccgc cacacagttc gccaatacaa tattttcacc atacagagac tcaggcagcg 4620 tgatatgtcg cagccccatt gtagtataga taatgccatc cggacggtgg gcaagcagct 4680 gacgtgccgc gcgggcagcg tcatcttcag aaaaaatatt gattaaaaaa ctattccagc 4740 cgaactcgct ggcggtttgc tcaatggcaa gcagaatatc aacagagaaa ggagtggtag 4800 ccgtgtcctg cgccagcacg gcgagagtcg acggcttacg tccttgagcg cgcatcttac 4860 gggcggaaag atcaggaaca taattcaggg tctggattgc ctgcaatacg cggtcacgcg 4920 ttgcaggacg cacagattct gcattatgca tcacccggga gactgtcatc atcgacactc 4980 ccgccaggcg tgcgacatcc tttaatgaag ccatacccaa gccgtttgcc gtaaaacggg 5040 cactgtagca gaaacagacg tcactggcga gatccaacgc cctatcacct gacacagcaa 5100 tacaataaaa aataacaata attcccggac aattgtcccc aattccgcct ctgttctcgc 5160 <210> 3 <211> 897 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> wbgL gene codon optimized <400> 3 atgggcagca ttattcgtct gcagggtggt ctgggtaatc agctgtttca gtttagcttt 60 ggttatgccc tgagcaaaat taatggtaca ccgctgtatt tcgacattag ccattatgcc 120 gaaaacgatg atcatggtgg ttatcgtctg aataatctgc agattccgga agaatatctg 180 cagtattata ccccgaaaat taataatatt tataaactgc tggtgcgtgg cagccgtctg 240 tatccggata tttttctgtt tctgggcttt tgcaacgaat ttcatgccta tggctacgat 300 tttgaatata ttgcccagaa atggaaaagc aaaaaataca ttggctactg gcagagcgaa 360 cacttttttc ataaacatat tctggacctg aaagaatttt ttattccgaa aaatgtgagc 420 gaacaggcaa atctgctggc agcaaaaatt ctggaaagcc agagcagcct gagcattcat 480 attcgtcgtg gcgattatat taaaaacaaa accgcaaccc tgacacatgg tgtttgtagc 540 ctggaatatt ataaaaaagc cctgaacaaa atccgcgatc tggcaatgat tcgtgatgtg 600 tttatcttta gcgacgatat cttctggtgc aaagaaaata ttgaaaccct gctgagcaaa 660 aaatataata tttattatag cgaagatctg agccaagaag aggatctgtg gctgatgagc 720 ctggcaaatc atcatattat tgccaatagc agctttagtt ggtggggtgc atatctgggt 780 agcagcgcaa gccagattgt tatttatccg accccgtggt atgatattac cccgaaaaac 840 acctatatcc cgattgtgaa ccattggatc aacgttgata aacatagcag ctgctaa 897 <210> 4 <211> 903 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> futC codon optimized <400> 4 atggccttta aagtggttca gatctgcggc ggtctgggca atcagatgtt tcaatatgcg 60 ttcgccaaat cactgcaaaa acattcgaac accccggttc tgctggatat cacgagtttt 120 gattggtccg accgtaaaat gcagctggaa ctgttcccga ttgatctgcc gtacgcaagc 180 gctaaagaaa tcgcgattgc caaaatgcag cacctgccga aactggtccg tgatgcactg 240 aaatgtatgg gctttgaccg cgtttcacaa gaaattgtct tcgaatatga accgaaactg 300 ctgaaaccgt cgcgtctgac ctatttcttt ggttactttc aggatccgcg ctacttcgac 360 gctatctctc cgctgattaa acaaaccttt acgctgccgc cgccgccgga aaacaacaaa 420 aacaacaaca aaaaagaaga agaatatcag tgcaaactga gtctgatcct ggcggccaaa 480 aattccgtct ttgtgcatat tcgtcgcggc gattacgtgg gcatcggttg tcagctgggt 540 attgactatc agaaaaaagc actggaatac atggctaaac gtgtgccgaa tatggaactg 600 tttgttttct gcgaagatct ggaatttacc cagaacctgg acctgggcta tccgttcatg 660 gatatgacca cgcgcgacaa agaagaagaa gcgtactggg atatgctgct gatgcagtca 720 tgtcaacatg gtattatcgc caatagcacg tattcttggt gggcagctta cctgattgaa 780 aacccggaaa aaattatcat tggcccgaaa cattggctgt ttggtcacga aaatatcctg 840 tgcaaagaat gggtcaaaat tgaaagccac ttcgaagtga aatctcagaa atataacgcg 900 taa 903 <210> 5 <211> 74 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer 6128 <400> 5 ggggacaagt ttgtacaaaa aagcaggctt cgaaggagat acaacatggg cagcattatt 60 cgtctgcagg gtgg 74 <210> 6 <211> 60 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer 6129 <400> 6 ggggaccact ttgtacaaga aagctgggtt tagcagctgc tatgtttatc aacgttgatc 60 <210> 7 <211> 75 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer 6195 <400> 7 ggggacaagt ttgtacaaaa aagcaggctt cgaaggaggt agaacatggc ctttaaagtg 60 gttcagatct gcggc 75 <210> 8 <211> 64 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer 6196 <400> 8 ggggaccact ttgtacaaga aagctgggtc ctattacgcg ttatatttct gagatttcac 60 ttcg 64

Claims (18)

1. 미생물을 사용하여 L-푸코오스를 유리형태로 생산하는 방법으로서,
   a) GDP-푸코오스의 가수분해를 촉매하여 GDP-푸코오스로부터 L-푸코오스를 방출할 수 있는 이종(heterologous) 효소를 포함하는, L-푸코오스 합성을 위한 재조합 미생물을 제공하는 단계로서, 상기 효소가 억셉터(acceptor) 분자의 부재 하에 GDP-푸코오스의 가수분해를 촉매할 수 있는 글리코실트랜스퍼라제이고, 상기 효소가 서열번호 3으로 나타낸 에스케리치아 콜라이(Escherichia coli) 유래의 wbgL 유전자에 의해 코딩되는 1,2-푸코실트랜스퍼라제의 변이체이되 상기 변이체가 wbgL 유전자에 의해 코딩되는 야생형 1,2-푸코실트랜스퍼라제와 비교하여 아스파라긴 69의 세린으로의 치환 및 이소류신 268의 프롤린으로의 치환; 또는 히스티딘 124의 알라닌으로의 치환 및 글루타메이트 215의 글리신으로의 치환의 아미노산 잔기 치환을 갖는 단계;
   b) 상기 미생물을 성장시키기에 적당한 배지에서 상기 미생물을 배양하는 단계로서, L-푸코오스가 배양 동안 축적되는 정도로 상기 미생물이 L-푸코오스를 대사할 수 없는 단계; 및
   c) 배지로부터 L-푸코오스를 회수하는 단계를 포함하는, 방법.
   
2. 제1항에 있어서, 1,2-푸코실트랜스퍼라제를 코딩하는 이종 핵산을 포함하는 재조합 미생물이 사용되는 것을 특징으로 하는, 방법.
   
3. 제1항에 있어서, 미생물이, 생성된 L-푸코오스의 분해를 유도하는 이화 경로가 불활성화되거나 심각하게 감소되도록, 또는 상기 이화 경로가 결핍되도록 추가로 변형되는 것을 특징으로 하는, 방법.
   
4. 제1항에 있어서, 미생물이, L-푸코오스의 이화작용에 관여하는 유전자가 불활성화되거나 심각하게 감소되도록, 또는 상기 유전자가 결핍되도록 추가로 변형되는 것을 특징으로 하는, 방법.
   
5. 제1항에 있어서, GDP-푸코오스의 생합성에 관여하는 적어도 하나의 유전자가 과발현되어 GDP-푸코오스의 공급을 향상시키는 것을 특징으로 하는, 방법.
   
6. 제5항에 있어서, 적어도 하나의 유전자가 이종 또는 동종(homologous)인 것을 특징으로 하는, 방법.
   
7. 제1항에 있어서, 미생물이, GDP-L-푸코오스에 대한 경쟁 경로(competing pathway)가 불활성화되거나 감소되도록 추가로 변형되는 것을 특징으로 하는, 방법.
   
8. 제1항에 있어서, 미생물이, 제한없이 글리세롤, 수크로오스, 글루코오스, 프룩토오스, 당밀, 자일로오스, 셀룰로오스, 합성가스(syngas), 옥수수-시럽 또는 락토오스로부터 선택되는, 저가의 탄소원을 함유하는 배지에서 배양되는 것을 특징으로 하는, 방법.
   
9. 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, 미생물이 에스케리치아 콜라이(Escherichia coli) 균주, 코리네박테리움 종(Corynebacterium spp.), 클로스트리디움 종(Clostridium spp.), 바실러스 종(Bacillus spp.), 슈도모나스 종(Pseudomonas spp.), 락토바실러스 종(Lactobacillus spp.) 또는 사카로미세스 종(Saccharomyces sp.) 균주인 것을 특징으로 하는, 방법.
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