KR102655286B1 - 복합 하이드로겔-스캐폴드 지지체 제조방법 및 이에 따라 제조된 복합 하이드로겔-스캐폴드 지지체 - Google Patents
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Abstract
복합 하이드로겔-스캐폴드 지지체 제조방법 및 이에 따라 제조된 복합 하이드로겔-스캐폴드 지지체에 관한 것으로써, 복합 하이드로겔-스캐폴드 지지체 제조방법에 따라 제조된 복합 하이드로겔-스캐폴드 지지체는 동결건조시킨 결과물로써 형태 변경없이 보관과 유통이 용이한 장점이 있다. 또한, 동결건조시킨 결과물에 최종 수요자가 세포 혼합용액을 투입시킬 때 젤의 팽윤시 생기는 흡수동력에 의해, 종래 세포 및 하이드로겔을 동시 충진할 때보다도, 간이하게 투입시킬 수 있는 장점이 있을 뿐만 아니라, 복합 하이드로겔-스캐폴드 지지체에 포함된 세포가 균일하게 배치되는 장점이 있다. 또한, 세포 혼합용액 투입에 따라 복합 하이드로겔-스캐폴드 지지체가 동결건조 전상태로 복원이 용이한 장점이 있다.
Description
복합 하이드로겔-스캐폴드 지지체 제조방법 및 이에 따라 제조된 복합 하이드로겔-스캐폴드 지지체에 관한 것이다.
기존의 하이드로겔이 충진되고 세포가 포함된 스캐폴드 지지체를 제조할 때 충진 도구 등으로 스캐폴드 지지체에 하이드로겔과 세포를 동시에 주입해야 하는 바 섬세하고 세밀한 작업이 요구되는 어려움이 있었다.
또한, 기존의 하이드로겔이 포함된 스캐폴드 지지체는 수분을 기본적으로 포함하고 있고 가교가 되기 전 상태에서 유통 시 온도, 습도, pH 변화, 등 환경에 의해 변형이나 수축이 발생하여 형태 변형이 쉽게 발생하는 문제점이 있었다.
스캐폴드 지지체에 하이드로겔을 충진한 후 가교제로 화학적 가교시킨 다음 동결건조시키는 단계를 포함하고, 추가적으로 세포 혼합용액을 투입하는 단계를 더 포함하는 복합 하이드로겔-스캐폴드 지지체 제조방법을 제공하는 것을 목적으로 한다.
또한, 복합 하이드로겔-스캐폴드 지지체 제조방법에 따라 제조되어, 3차원적 공간을 포함하는 스캐폴드 지지체; 및 복수의 기공을 포함하는 하이드로겔;을 포함하고, 추가적으로 복합 하이드로겔-스캐폴드 지지체를 제공하는 것을 목적으로 한다.
일 양태에 따른 복합 하이드로겔-스캐폴드 지지체 제조방법은 스캐폴드 지지체를 준비하는 단계; 하이드로겔의 외부 형태가 상기 스캐폴드 지지체의 내부 형태에 의해 결정되도록 상기 스캐폴드 지지체에 하이드로겔을 충진하는 단계; 상기 충진된 결과물을, 가교제가 포함된 가교용액에 침지하는 단계; 상기 충진된 결과물을 가교시키는 단계; 및 상기 가교시킨 결과물을 동결건조시키는 단계;를 포함한다.
상기 복합 하이드로겔-스캐폴드 지지체 제조방법은 상기 동결건조된 결과물에 세포 혼합용액을 투입하는 단계를 더 포함할 수 있다.
상기 하이드로겔은 콜라겐(Collagen), 탈세포화된 세포외기질(Decellularized Extracellular Matri, dECM), 젤라틴(Gelatin), 마트리젤(Matrigel), 메타크릴레이트화된 젤라틴(Methacrylated Gelatin, GelMA), 히알루론산(Hyaluronic acid), 알지네이트(Alginate), 피브린(Fibrin), 키토산(Chitosan), 및 아가로스(Agarose)으로 이루어진 군으로부터 선택된 1종 이상일 수 있다.
상기 가교제는 글루타르알데하이드(Glutaraldehyde), Ethyl(dimethylaminopropyl) carbodiimide/N-hydroxysuccinimide(EDC/NHS), 트롬빈(thrombin), 염화 칼슘 용액 (CaCl2), Genipin 으로 이루어진 군으로부터 선택된 1종 이상일 수 있다.
상기 충진된 결과물을 가교시키는 단계에서, 상기 가교조건은 5분 내지 48시간 동안 4℃ 내지 60℃의 온도에서 수행될 수 있다.
상기 가교시킨 결과물을 동결건조시키는 단계에서, 상기 동결건조 조건은 -200 ℃ 내지 -10℃의 온도에서 수행될 수 있다.
상기 하이드로겔의 농도는, 하이드로겔 전체100중량% 기준, 0.05중량% 내지 5중량%일 수 있다.
상기 가교제의 농도는, 가교용액 전체 100중량% 기준, 0.01중량% 내지 10중량%일 수 있다.
상기 세포 혼합용액을 투입하는 단계에서, 상기 세포 혼합용액의 투입조건은 4 ℃에서 37 ℃의 온도에서 수행될 수 있다.
상기 세포 혼합용액에 포함된 세포는 104 내지 108 cells/ml 농도일 수 있다.
다른 일 양태에 따른 복합 하이드로겔-스캐폴드 지지체는 본 발명의 일 양태에 의해 제조되는 복합 하이드로겔-스캐폴드 지지체로서, 3차원적 공간을 포함하는 스캐폴드 지지체; 및 복수의 기공을 포함하는 하이드로겔;을 포함하고, 상기 기공의 최대직경은 1 μm 내지 500 μm인 것을 특징으로 한다.
상기 복합 하이드로겔-스캐폴드 지지체는 상기 스캐폴드 지지체 내에 충진된 상기 하이드로겔의 기공 내에 포함되어, 스캐폴드 지지체에 균일하게 배치된 세포를 더 포함할 수 있다.
복합 하이드로겔-스캐폴드 지지체 제조방법에 따라 제조된 복합 하이드로겔-스캐폴드 지지체는 동결건조시킨 결과물로써 형태 변형없이 보관과 유통이 용이한 장점이 있다. 또한, 동결건조시킨 결과물에 최종 수요자가 세포 혼합용액을 투입시킬 때 젤의 팽윤 시 생기는 흡수동력에 의해, 종래 세포 및 하이드로겔을 동시 충진할 때보다도, 간이하게 투입시킬 수 있는 장점이 있을 뿐만 아니라, 복합 하이드로겔-스캐폴드 지지체에 포함된 세포가 균일하게 배치되는 장점이 있다. 또한, 세포 혼합용액 투입에 따라 복합 하이드로겔-스캐폴드 지지체가 동결건조 전상태로 복원이 용이한 장점이 있다.
도 1a는 복합 하이드로겔-스캐폴드 지지체 제조방법을 간략하게 나타낸흐름도이다.
도 1b은 하이드로겔 (콜라겐, col) 및 가교제 (글루타르알데하이드, GTA)의 함량을 달리한 제조단계에 따른 복합 하이드로겔-스캐폴드 지지체의 탄성계수(Elastic modulus) 결과를 나타낸 그래프이다.
도 2는 가교조건 및 건조조건을 달리하여 제조한 복합 하이드로겔-스캐폴드 지지체의 이미지이다.
도 3은 복합 하이드로겔-스캐폴드 지지체의 팽윤도 (Swelling weight) 실험 결과를 나타낸 그래프이다.
도 4a 및 도 4b는 복합 하이드로겔-스캐폴드 지지체의 동결건조된 결과물(도 4a) 및 재수화된 결과물(도 4b)의 투명도(O.D.:optical density) 실험 결과 그래프이다.
도 5는 동결 온도 조건 변화한 제조단계에 따른 복합 하이드로겔-스캐폴드 지지체의 이미지이다.
도 6 및 도 7은 동결건조 후 보관온도 조건에 따른 재수화시 복합 하이드로겔-스캐폴드 지지체의 팽윤도 실험 결과(도 6) 및 투명도 분석 결과(도 7)를 나타낸 그래프이다.
도 8 및 도 9은 동결건조 후 보관시간 조건에 따른 재수화시 복합 하이드로겔-스캐폴드 지지체의 팽윤도 실험 결과(도 8) 및 투명도 분석 결과(도 9)를 나타낸 그래프이다.
도 10은 복합 하이드로겔-스캐폴드 지지체의 세포 생존 실험 결과를 종래 세포 및 하이드로겔을 충진할 때 사용되어지는 열가교 조건 (대조군)과 비교한 이미지이다.
도 11은 복합 하이드로겔-스캐폴드 지지체의 세포 증식 결과를 종래 세포 및 하이드로겔을 충진할 때 사용되어지는 열가교조건 (대조군)과 비교한 그래프이다.
도 12는 장기유래 탈세포화된 세포외기질 (Decellularized Extracellular Matrix; dECM)을 하이드로겔로 사용하여 복합 하이드로겔-스캐폴드를 제작하고 이의 재 수화 전 후의 이미지이다.
도 13 및 14는 콜라젠을 하이드로겔로 사용하여 제작한 복합 하이드로겔-스캐폴드(Col F-D)와 장기유래 탈세포화된 세포외기질을 하이드로겔로 사용하여 제작한 복합 하이드로겔-스캐폴드(dECM F-D)의 팽윤도 실험 결과(도 13) 및 투명도 분석 결과(도 14)를 비교해주는 그래프이다.
도 1b은 하이드로겔 (콜라겐, col) 및 가교제 (글루타르알데하이드, GTA)의 함량을 달리한 제조단계에 따른 복합 하이드로겔-스캐폴드 지지체의 탄성계수(Elastic modulus) 결과를 나타낸 그래프이다.
도 2는 가교조건 및 건조조건을 달리하여 제조한 복합 하이드로겔-스캐폴드 지지체의 이미지이다.
도 3은 복합 하이드로겔-스캐폴드 지지체의 팽윤도 (Swelling weight) 실험 결과를 나타낸 그래프이다.
도 4a 및 도 4b는 복합 하이드로겔-스캐폴드 지지체의 동결건조된 결과물(도 4a) 및 재수화된 결과물(도 4b)의 투명도(O.D.:optical density) 실험 결과 그래프이다.
도 5는 동결 온도 조건 변화한 제조단계에 따른 복합 하이드로겔-스캐폴드 지지체의 이미지이다.
도 6 및 도 7은 동결건조 후 보관온도 조건에 따른 재수화시 복합 하이드로겔-스캐폴드 지지체의 팽윤도 실험 결과(도 6) 및 투명도 분석 결과(도 7)를 나타낸 그래프이다.
도 8 및 도 9은 동결건조 후 보관시간 조건에 따른 재수화시 복합 하이드로겔-스캐폴드 지지체의 팽윤도 실험 결과(도 8) 및 투명도 분석 결과(도 9)를 나타낸 그래프이다.
도 10은 복합 하이드로겔-스캐폴드 지지체의 세포 생존 실험 결과를 종래 세포 및 하이드로겔을 충진할 때 사용되어지는 열가교 조건 (대조군)과 비교한 이미지이다.
도 11은 복합 하이드로겔-스캐폴드 지지체의 세포 증식 결과를 종래 세포 및 하이드로겔을 충진할 때 사용되어지는 열가교조건 (대조군)과 비교한 그래프이다.
도 12는 장기유래 탈세포화된 세포외기질 (Decellularized Extracellular Matrix; dECM)을 하이드로겔로 사용하여 복합 하이드로겔-스캐폴드를 제작하고 이의 재 수화 전 후의 이미지이다.
도 13 및 14는 콜라젠을 하이드로겔로 사용하여 제작한 복합 하이드로겔-스캐폴드(Col F-D)와 장기유래 탈세포화된 세포외기질을 하이드로겔로 사용하여 제작한 복합 하이드로겔-스캐폴드(dECM F-D)의 팽윤도 실험 결과(도 13) 및 투명도 분석 결과(도 14)를 비교해주는 그래프이다.
이상의 목적들, 다른 목적들, 특징들 및 이점들은 첨부된 도면과 관련된 이하의 바람직한 실시예들을 통해서 쉽게 이해될 것이다. 그러나 여기서 설명되는 실시예들에 한정되지 않고 다른 형태로 구체화될 수도 있다. 오히려, 여기서 소개되는 실시예들은 개시된 내용이 철저하고 완전해질 수 있도록 그리고 통상의 기술자에게 기술적 사상이 충분히 전달될 수 있도록 하기 위해 제공되는 것이다.
각 도면을 설명하면서 유사한 참조부호를 유사한 구성요소에 대해 사용하였다. 첨부된 도면에 있어서, 구조물들의 치수는 본 발명의 명확성을 위하여 실제보다 확대하여 도시한 것이다. 제1, 제2 등의 용어는 다양한 구성요소들을 설명하는데 사용될 수 있지만, 상기 구성요소들은 상기 용어들에 의해 한정되어서는 안 된다. 상기 용어들은 하나의 구성요소를 다른 구성요소로부터 구별하는 목적으로만 사용된다. 예를 들어, 본 발명의 권리 범위를 벗어나지 않으면서 제1 구성요소는 제2 구성요소로 명명될 수 있고, 유사하게 제2 구성요소도 제1 구성요소로 명명될 수 있다. 단수의 표현은 문맥상 명백하게 다르게 뜻하지 않는 한, 복수의 표현을 포함한다.
본 명세서에서, "포함하다" 또는 "가지다" 등의 용어는 명세서 상에 기재된 특징, 숫자, 단계, 동작, 구성요소, 부품 또는 이들을 조합한 것이 존재함을 지정하려는 것이지, 하나 또는 그 이상의 다른 특징들이나 숫자, 단계, 동작, 구성요소, 부분품 또는 이들을 조합한 것들의 존재 또는 부가 가능성을 미리 배제하지 않는 것으로 이해되어야 한다. 또한, 층, 막, 영역, 판 등의 부분이 다른 부분 "상에" 있다고 할 경우, 이는 다른 부분 "바로 위에" 있는 경우뿐만 아니라 그 중간에 또 다른 부분이 있는 경우도 포함한다. 반대로 층, 막, 영역, 판 등의 부분이 다른 부분 "하부에" 있다고 할 경우, 이는 다른 부분 "바로 아래에" 있는 경우뿐만 아니라 그 중간에 또 다른 부분이 있는 경우도 포함한다.
달리 명시되지 않는 한, 본 명세서에서 사용된 성분, 반응 조건, 폴리머 조성물 및 배합물의 양을 표현하는 모든 숫자, 값 및/또는 표현은, 이러한 숫자들이 본질적으로 다른 것들 중에서 이러한 값을 얻는 데 발생하는 측정의 다양한 불확실성이 반영된 근사치들이므로, 모든 경우 "약"이라는 용어에 의해 수식되는 것으로 이해되어야 한다. 또한, 본 기재에서 수치범위가 개시되는 경우, 이러한 범위는 연속적이며, 달리 지적되지 않는 한 이러한 범 위의 최소값으로부터 최대값이 포함된 상기 최대값까지의 모든 값을 포함한다. 더 나아가, 이러한 범위가 정수를 지칭하는 경우, 달리 지적되지 않는 한 최소값으로부터 최대값이 포함된 상기 최대값까지를 포함하는 모든 정수가 포함된다.
본 명세서에 있어서, 범위가 변수에 대해 기재되는 경우, 상기 변수는 상기 범위의 기재된 종료점들을 포함하는 기재된 범위 내의 모든 값들을 포함하는 것으로 이해될 것이다. 예를 들면, "5 내지 10"의 범위는 5, 6, 7, 8, 9, 및 10의 값들뿐만 아니라 6 내지 10, 7 내지 10, 6 내지 9, 7 내지 9 등의 임의의 하위 범위를 포함하고, 5.5, 6.5, 7.5, 5.5 내지 8.5 및 6.5 내지 9 등과 같은 기재된 범위의 범주에 타당한 정수들 사이의 임의의 값도 포함하는 것으로 이해될 것이다. 또한 예를 들면, "10% 내지 30%"의 범위는 10%, 11%, 12%, 13% 등의 값들과 30%까지를 포함하는 모든 정수들뿐만 아니라 10% 내지 15%, 12% 내지 18%, 20% 내지 30% 등의 임의의 하위 범위를 포함하고, 10.5%, 15.5%, 25.5% 등과 같이 기재된 범위의 범주 내의 타당한 정수들 사이의 임의의 값도 포함하는 것으로 이해될 것이다.
종래 스캐폴드 지지체를 제조할 때 충진 도구 등으로 스캐폴드 지지체에 하이드로겔과 세포를 동시에 주입해야 하는 바 섬세하고 세밀한 작업이 요구되는 어려움이 있었을 뿐만 아니라, 기존의 하이드로겔이 포함된 스캐폴드 지지체는 수분을 기본적으로 포함하고 있고 가교가 되기 전 상태에서 유통 시 온도, 습도, pH 변화, 등 환경에 의해 변형이나 수축이 발생하여 형태 변형이 쉽게 발생하는 문제점이 있었다.
이에 본 발명자들은 문제점을 해결하기 위해 예의 연구한 결과, 스캐폴드 지지체에 하이드로겔을 충진한 후 가교제로 화학적 가교시킨 다음 동결건조시키는 단계를 포함하는 복합 하이드로겔-스캐폴드 지지체 제조방법에 따라 제조된 복합 하이드로겔-스캐폴드 지지체는 동결건조시킨 결과물로써 형태 변경없이 보관과 유통이 용이한 장점이 있다. 또한, 동결건조시킨 결과물에 최종 수요자가 세포 혼합용액을 투입시킬 때 젤의 팽윤시 생기는 흡수동력에 의해, 종래 세포 및 하이드로겔을 동시에 충진할 때보다도, 간이하게 투입시킬 수 있는 장점이 있을 뿐만 아니라, 이에 따라 복합 하이드로겔-스캐폴드 지지체에 포함된 세포가 균일하게 배치되는 장점이 있다는 것을 발견하고 이를 완성하였다.
도 1a는 복합 하이드로겔-스캐폴드 지지체 제조방법을 간략하게 나타낸흐름도이다. 도 1a를 참고하면, 일 양태에 따라, 복합 하이드로겔-스캐폴드 지지체 제조방법은 스캐폴드 지지체를 준비하는 단계; 하이드로겔의 외부 형태가 상기 스캐폴드 지지체의 내부 형태에 의해 결정되도록 상기 스캐폴드 지지체에 하이드로겔을 충진하는 단계; 상기 충진된 결과물에 가교제를 투입하는 단계; 상기 충진된 결과물을 가교시키는 단계; 및 상기 가교시킨 결과물을 동결건조시키는 단계;를 포함한다.
일 구현예에 따라, 스캐폴드 지지체를 준비하는 단계에서 스캐폴드 지지체는 스캐폴드 지지체와 관련된 기술분야에서 사용할 수 있는 통상의 스캐폴드 지지체, 예를 들어, 유리(glass)를 포함하는 투명 세라믹류, 폴리디메틸실록세인(Polydimethyl Siloxane; PDMS)과 에코플렉스(ecoflex) 중 적어도 하나를 포함하는 실리콘고무류, 폴리스티렌(polystyrene), 폴리메틸메타크릴레이트(polymethylmethacrylate), 폴리프로필렌(polypropylene), 폴리카보네이트(polycarbonate)와 폴리우레탄(polyurethane), 중 적어도 하나를 포함하는 엔지니어링 플라스틱류, 투명 세라믹류, 실리콘고무류와 엔지니어링 플라스틱류 중 적어도 하나를 포함하는 혼합물, 투명 세라믹류의 화학적 변형체, 실리콘고무류의 화학적 변형체, 엔지니어링 플라스틱류의 화학적 변형체, 또는 투명 세라믹류의 화학적 변형체, 실리콘고무류의 화학적 변형체와 엔지니어링 플라스틱류의 화학적 변형체 중 하나를 포함하는 혼합물을 포함할 수 있다. 또한, 광경화형 플라스틱류, 필름, 열가소성 플라스틱 및 금속 등 3D 프린터 소재로 이용될 수 있는 소재를 하나 이상 포함하거나 이의 화학적 변형체를 모두 포함할 수 있다.
일 구현예에 따라, 스캐폴드 지지체에 하이드로겔을 충진하는 단계는 미리 준비한 스캐폴드 지지체에 하이드로겔을 충진하여 가교 전 예비 지지체인 충진 결과물을 제조 및 준비하는 단계이다.
일 실시예에 따라, 하이드로겔은 3차원 세포 배양을 위한 지지체 내 충진용인 생체 재료로써, 예를 들어, 콜라겐(Collagen), 탈세포화된 세포외기질(Decellularized Extracellular Matri, dECM), 젤라틴(Gelatin), 마트리젤(Matrigel), 메타크릴레이트화된 젤라틴(Methacrylated Gelatin, GelMA), 히알루론산(Hyaluronic acid), 알지네이트(Alginate), 피브린(Fibrin), 키토산(Chitosan), 아가로스(Agarose), 등으로 이루어진 군으로부터 선택된 1종 이상일 수 있다.
일 실시예에 따라, 하이드로겔을 충진하는 방법은 파이펫을 이용하여 지지체의 내부에 직접 주입하는 방식 또는 자동화 주입 장치를 이용한 간접적 주입방식으로 수행될 수 있다.
일 실시예에 따라, 스캐폴드 지지체 내에 충진된 하이드로겔의 농도는 전체 하이드로겔 100중량% 기준, 0.05중량% 내지 5중량%이며, 바람직하게는 콜라겐(Collagen) 혹은 탈세포화된 세포외기질(dECM)을 포함할 경우 0.5중량% 내지 2중량%가 될 수 있다. 상기 범위를 벗어나, 하이드로겔의 함량이 너무 낮으면 가교제 투입 후 가교가 잘 형성되지 않거나 결과물의 물성이 지나치게 낮을 수 있다는 단점이 있고, 하이드로겔의 함량이 너무 많으면 하이드로겔의 종류에 따라 너무 높은 점성으로 인해 지지체에 균일한 주입이 어렵다는 단점이 있다.
일 구현예에 따라, 충진된 결과물에 가교제를 투입하는 단계는 가교 전 예비 지지체인 충진 결과물에 가교제를 투입하여 가교제가 투입된 결과물을 가교시키기 위한 준비 단계이다.
일 실시예에 따라, 가교제는 글루타르알데하이드(Glutaraldehyde), Ethyl(dimethylaminopropyl) carbodiimide/N-hydroxysuccinimide(EDC/NHS) 등과 같은 화학적 가교제, 트롬빈(thrombin)과 같은 효소물질, 염화 칼슘 용액 (CaCl2), Genipin 등과 같은 천연물질에서 유래된 천연가교제로 이루어진 군으로부터 선택된 1종 이상일 수 있고, 바람직하게는, 하이드로젤의 가교 후 물성 조절이 용이한 글루타르알데하이드(Glutaraldehyde)일 수 있다.
일 실시예에 따라, 가교제를 투입하는 방법은 가교제가 포함된 용매에 구조체를 침지하는 방법으로 수행될 수 있다.
일 실시예에 따라, 투입된 가교제가 포함된 가교용액의 전체 100중량% 기준, 가교제는 0.01중량% 내지 10중량%의 함량으로 포함할 수 있고, 바람직하게는, 글루타르알테하이드(Glutaraldehyde)를 사용할 경우, 가교제는 0.1중량% 내지 1중량% 함량으로 포함할 수 있다. 또한, 가교제의 함량이 너무 낮으면 하이드로겔의 가교 효율이 떨어지는 단점이 있고, 가교제의 함량이 너무 많으면 가교제의 종류에 따라 추후 세포 주입 후 잔류하는 가교제로 인해 세포에 독성을 나타낼 수 있다는 단점이 있다.
일 구현예에 따라, 충진된 결과물을 가교시키는 단계는 가교제를 투입한 결과물에 가교를 수행하여 스캐폴드 지지체와 충진된 하이드로겔을 가교결합시켜 연결시키는 단계이다.
일 실시예에 따라, 가교는 화학적 가교로 수행될 수 있고, 5 분 내지 48 시간 동안, 4 ℃ 내지 60 ℃의 온도의 가교조건에서 화학적 가교를 수행할 수 있다. 바람직하게는 콜라겐(Collagen) 혹은 탈세포화된 세포외기질(dECM)을 충진용 하이드로겔로 사용하고, 글루타르알데하이드(Glutaraldehyde)를 가교제로 사용할 경우, 30 분 내지 24 시간 동안, 4 ℃ 내지 37 ℃의 온도의 가교조건이 사용될 수 있다. 상기 조건을 벗어나, 가교시간이 너무 짧으면 하이드로겔의 충분한 가교가 이루어지지 않는다는 단점이 있으며, 가교시간이 너무 길면 제작 과정이 비효율적이며, 시료의 변성 가능성이 있다는 단점이 있다. 또한, 가교온도가 너무 낮으면 용액상태인 가교제가 얼거나 가교 효율이 감소할 수 있다는 단점이 있고, 가교온도가 너무 높으면 하이드로겔 성분의 열가교가 일어나거나 성분 변성이 일어날 수 있다는 단점이 있다.
일 실시예에 따라, 화학적 가교를 통해 제조된 화학적 가교시킨 결과물은 동결건조 전에 1 시간 내지 72 시간 동안 PBS(phosphate-buffered saline) 용액으로 세척하는 단계를 더 포함할 수 있다. 바람직하게는, 이에 제한되지는 않지만, 콜라겐(Collagen) 혹은 탈세포화된 세포외기질(dECM)을 충진용 하이드로겔로 사용하고, 글루타르알데하이드(Glutaraldehyde)를 가교제로 사용할 경우, 24 시간 내지 48 시간이 사용될 수 있다. 이는 세포 독성을 갖을 수 있는 가교제의 충분한 세척을 통하여 하이드로겔-스캐폴드 지지체의 세포 적합성을 향상시키기 위함이다. 상기 조건을 벗어나, 세척시간이 너무 짧으면 가교제의 충분한 세척이 이루어지지 않는다는 단점이 있다. 또한, 세척 시간이 너무 길면 제작 과정이 비효율 적이며, 시료의 변성 가능성이 있다는 단점이 있다.
일 구현예에 따라, 가교시킨 결과물을 동결건조시키는 단계는 화학적 가교를 통해 제조된 가교시킨 결과물을 동결건조시켜 예비 복합 하이드로겔-스캐폴드 지지체인 동결건조된 결과물을 제조하는 단계이다.
사용되는 용어, "동결건조"는 동결건조 대상 물질이 포함된 용기의 온도를 급격하게 낮추어 용매를 동결시키는 "동결"과 용기 내부 압력을 진공에 가깝게 하여 대상 물질에 포함된 고체화된 용매를 바로 수증기로 승화시켜 "건조"하는 방법이다.
일 실시예에 따라, 가교시킨 결과물에 대한 동결 조건은 -200 ℃ 내지 -10 ℃의 온도일 수 있으며, 바람직하게는 -80 ℃ 내지 -20 ℃의 온도가 사용될 수 있다. 상기 조건을 벗어나, 동결 온도가 너무 낮으면 급속한 동결로 인한 하이드로겔의 파손이 발생할 수 있다는 단점이 있고, 동결 온도가 너무 높으면 용매가 충분히 또는 균일하게 동결되지 못한다는 단점이 있다.
즉, 복합 하이드로겔-스캐폴드 지지체 제조방법에 따라 제조된 복합 하이드로겔-스캐폴드 지지체는 동결건조시킨 결과물로써 수축하거나 변형이 적고 고체화된 용매가 생긴 자리에 공간이 생겨 가볍고 복원성이 우수한 장점이 있으므로 보관과 유통이 용이한 장점이 있다.
일 구현예에 따라, 복합 하이드로겔-스캐폴드 지지체 제조방법은 상기 동결건조된 결과물에 세포 혼합용액을 투입하는 단계를 더 포함할 수 있다. 이는, 동결건조 결과물에 최종수요자가 세포 혼합용액을 투입을 용이하게 하여 팽윤도 및 투명도 등이 우수한 복합 하이드로겔-스캐폴드 지지체를 얻을 수 있는 장점이 있다.
일 실시예에 따라, 세포 혼합용액에 포함된 세포는 복합 하이드로겔-스캐폴드 지지체를 활용하기 위한 세포는 특별히 제한되지 않고, 인간, 동물 등을 포함하는 생물체 유래의 세포주 혹은 일차배양세포, 또는 인공적으로 유도된 줄기세포 등으로 이뤄진 군으로부터 선택된 1종 이상일 수 있다. 또한, 세포 이외에도 세포 혼합용액은 최소배지, 성장인자, 비타민, 항생제 등 세포성장 및 분화를 위한 유효물질을 더 포함할 수 있다. 이때, 세포 혼합용액에 있어 상기 세포는 104 내지 108 cells/ml 농도로 포함될 수 있다.
일 실시예에 따라, 세포 혼합용액을 투입하는 방법은 하이드로겔-스캐폴드 지지체 입구 또는 주변부에 액체 상태인 세포 혼합용액이 하이드로겔과 접촉될 수 있도록 간단히 떨어뜨려주는 방법일 수 있다. 즉, 동결건조 결과물에 최종수요자가 세포 혼합용액을 더 용이하게 투입할 수 있을 뿐만 아니라, 품질이 우수한 복합 하이드로겔-스캐폴드 지지체를 얻을 수 있는 장점이 있다.
다른 일 양태에 따른 복합 하이드로겔-스캐폴드 지지체는 본 발명의 일 양태에 의해 제조되는 복합 하이드로겔-스캐폴드 지지체로서, 3차원적 공간을 포함하는 스캐폴드 지지체; 및 복수의 기공을 포함하는 하이드로겔;을 포함한다. 이때, 복합 하이드로겔-스캐폴드 지지체에 대한 내용 중 복합 하이드로겔-스캐폴드 지지체 제조방법에서 설명한 내용과 동일한 내용은 생략할 수 있다.
일 구현예에 따라, 복합 하이드로겔-스캐폴드 지지체에 세포 혼합용액을 더 투입함으로써, 상기 스캐폴드 지지체 내에 충진된 상기 하이드로겔의 기공 내에 포함되어, 스캐폴드 지지체에 균일하게 배치된 세포를 더 포함할 수 있다.
일 구현예에 따라, 복합 하이드로겔-스캐폴드 지지체에 포함된 스캐폴드 지지체 내에 충진된 상기 하이드로겔의 기공의 최대직경은 1 μm 내지 500 μm일 수 있다. 상기 범위를 벗어나, 기공의 최대직경이 너무 작으면 세포의 균일한 분포가 어렵다는 단점이 있고, 상기 명시된 세포의 종류에 따라 적절한 기공 크기가 결정될 수 있다.
일 실시예에 따라 복합 하이드로겔-스캐폴드 지지체는 바이오칩, 3차원세포 배양 구조체, 고효율 스크리닝을 위한 플랫폼 등으로 이루어진 군으로부터 선택된 1종 이상의 형태로 사용될 수 있다.
즉, 복합 하이드로겔-스캐폴드 지지체는 동결건조시킨 결과물로써 형태 변형없이 보관과 유통이 용이한 장점이 있을 뿐만 아니라, 동결건조시킨 결과물에 최종 수요자가 세포 혼합용액을 투입시킬 때 젤의 팽윤시 생기는 흡수동력에 의해, 종래 세포 및 하이드로겔을 동시 충진할 때보다도, 간이하게 투입시킬 수 있는 장점이 있을 뿐만 아니라, 복합 하이드로겔-스캐폴드 지지체에 포함된 세포가 적절한 기공의 최대직경으로 인해 균일하게 배치되는 장점이 있다.
이하 본 발명을 실시예를 통하여 보다 상세하게 설명한다. 그러나, 이들 실시예는 본 발명을 예시적으로 설명하기 위한 것으로 본 발명의 범위가 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.
제조예 1 : 복합 하이드로겔-스캐폴드 지지체 제조
스캐폴드 지지체로 PDMS(Polydimethyl Siloxane, Dow Corning)로 제작한 칩을 사용하였다. 그 다음, 하이드로겔인 콜라겐 용액(Darim Tissen)을 파이펫을 이용하여 스캐폴드 지지체에 충진시켰다. 그 다음, 가교제인 글루타르알데하이드(Glutaraldehyde, GTA)을 포함한 용액을 이용하여 충진된 결과물을 침지시켰다. 그 다음, 약 2시간 동안 4 ℃의 온도 조건에서 화학적 가교를 시켰다. 그 다음, 화학적 가교시킨 결과물을 세척 (24 시간)하여 가교제 혹은 덜 가교된 하이드로겔 등을 제거하였다. 그 다음, 1시간 동안 -80℃의 온도 조건에서 동결 및 24시간 동안 건조시켜 동결건조 결과물을 제조하였다. 그 다음, 인간 간세포주 (HepG2), 최소필수배지(DMEM), 소태아혈청(FBS) 및 항생제를 포함하는 세포 혼합용액을 준비시킨 다음, 칩 형태를 갖는 동결건조 결과물 칩 입구 쪽에 파이펫을 사용하여 세포 혼합용액을 떨어뜨려 동결건조된 하이드로겔과 접촉시킴으로써 세포가 흡수될 수 있도록 하였으며 하이드로겔도 재수화시켰다. 그 다음, 세포 혼합용액을 37 ℃, 5% CO2 조건으로 약 30 분 인큐베이션(incubation) 시킨 후, 충분한 배양액을 추가한 후 37 ℃, 5% CO2의 조건으로 배양 (culture)시켜 최종적으로 복합 하이드로겔-스캐폴드 지지체를 제조 및 복합지지체 내에서의 세포배양을 수행하였다.
실시예 1 : 복합 하이드로겔-스캐폴드 지지체의 하이드로젤 및 가교제 농도에 따른 물리적 강성 비교
제조예 1에 따라 복합 하이드로겔-스캐폴드 지지체를 준비하되, 0.5-1%(w/v, 중량%)의 하이드로겔과 0.1-0.5 중량%의 가교제를 준비하여 각각의 하이드로겔 농도에서 제작한 복합 하이드로겔-스캐폴드 지지체를 각각의 가교제에 탐지한 후 그 결과물의 각 제조단계별 탄성계수(Elastic modulus)를 측정한 다음 그 결과를 도 1에 나타내었다. 이때, 각 제조단계별 탄성계수(Elastic modulus)는 Universal testing machine(UTM)을 이용하여 측정하였다. 이를 위하여 하이드로겔 시료를 1 mm/min 속도로 압축하며 기록된 strain-stress 커브의 10% strain에서의 탄성계수를 계산하였다.
구체적으로, 도 1b은 하이드로겔 및 가교제의 농도를 달리한 제조단계에 따른 복합 하이드로겔-스캐폴드 지지체의 탄성계수(Elastic modulus) 결과를 나타낸 그래프이다.
도 1b을 참고하면, 하이드로겔 및 가교제의 농도 조건에 따른 다양한 탄성계수 물성을 갖는 복합 하이드로겔-스캐폴드 지지체를 갖는다는 것을 확인할 수 있었다. 한편, 0.5 중량%의 하이드로겔(Collagen; Col)을 0.1 중량%의 가교제(Glutaraldehyde)로 가교시키는 경우 가교가 안되는 것을 확인할 수 있었고, 하이드로젤의 농도가 높아질수록, 또는 가교제의 농도가 높아질수록 하이드로겔의 탄성계수가 상승하는 양상을 확인할 수 있다. 특히, 간조직의 경우 2.5kPa 주변 값을 갖는 바, 정상 간조직에 활용할 수 있는 복합 하이드로겔-스캐폴드 지지체를 제조할 경우 1.0 중량% 하이드로겔(Col)로 제조하고 0.25 중량% 가교제(Glutaraldehyde) 로 가교시키는 것이 가장 적절한 것을 확인할 수 있었다.
실시예 2 : 가교조건 및 건조조건에 따른 복합 하이드로겔-스캐폴드 지지체의 이미지 분석
제조예 1에 따라 1.0 중량%의 하이드로겔(Col) 제조 및 0.25 중량%의 가교제(Glutaraldehyde)에 의한 가교 (실시예 1)로서 제조한 복합 하이드로겔-스캐폴드 지지체와, 비교군으로서, 화학적 가교(GTA crosslinking) 대신 열가교(Thermal crosslinking)로 제조하거나 동결건조(Freeze dry) 대신 상온건조(RT dry)한 복합 하이드로겔-스캐폴드 지지체들을 준비하고, 이들 제조과정 각각의 시료들로부터 고속광학현미경 시스템 (Celena X (Logos Biosystems))을 통해 칩 전체의 이미지를 얻은 후 그 결과를 도 2에 나타내었다. 이때 열가교 조건은 37℃ 인큐베이터에서 30분동안 열가교시켰다.
구체적으로, 도 2는 가교조건 및 건조조건을 달리하여 제조한 복합 하이드로겔-스캐폴드 지지체의 이미지이다.
도 2를 참고하면, 화학적 가교 및 동결건조의 조합에 의해 제조한 복합 하이드로겔-스캐폴드 지지체가 화학적 가교-상온건조, 열가교-상온 또는 열가교-동결 건조방식의 조합에서보다 칩과 같은 복합체 형태에서도 하이드로젤의 형태가 우수하게 유지되는 것을 확인할 수 있었다.
실시예 3 : 복합 하이드로겔-스캐폴드 지지체의 팽윤도 및 투명도 분석
제조예 1에 따라 1.0 중량%의 하이드로겔(Col) 제조 및 0.25 중량% 가교제(Glutaraldehyde)에 의한 가교 (실시예 1)로 제조한 복합 하이드로겔-스캐폴드 지지체를 가교조건과 건조조건에 따른 팽윤도와 투명도를 분석하고 그 결과를 도 3 내지 도 4b에 나타내었다. 이때, 팽윤도(수화된 최종 무게와 동결건조된 결과물 무게 간의 차)는 다음과 같은 방법으로 측정하였다. 동결건조된 결과물의 무게를 측정하고 이를 PBS에서 24시간 수화(swelling)후 결과물의 총무게를 측정한 다음, 수화후 결과물 총무게에서 동결건조된 결과물의 무게를 빼서 수화된 최종 무게 (swelling weight)를 측정하였다. 또한, 투명도 분석은 동결건조된 결과물에 PBS에서 24시간 수화(swelling)시킨 수화된 결과물에 대해 각각 UV-VIS를 이용하여 410 nm 파장에서의 흡광도(optical density, OD)를 측정하였다. 이 때 측정된 흡광도는 구조체의 불투명한 정도를 나타냄으로, 그 값이 낮을수록 구조체가 투명하다는 것을 알 수 있다.
구체적으로, 도 3은 복합 하이드로겔-스캐폴드 지지체의 팽윤도 실험 결과를 열가교 또는 상온/동결 건조 조건으로 가교한 결과물들과 비교한 그래프이다. 또한, 도 4a 및 도 4b는 복합 하이드로겔-스캐폴드 지지체의 동결건조된 결과물(도 4a) 및 수화된 결과물(도 4b)의 투명도 실험 결과를 열가교 또는 상온/동결 건조 조건으로 가교한 결과물들과 비교한 그래프이다.
도 3과 도 4a 및 도 4b를 참고하면, 화학적 가교한 이후 동결건조 방식을 사용하여 제조한 복합 하이드로겔-스캐폴드 지지체가 수화이후의 팽윤도 및 투명도가 모두 우수함을 확인할 수 있었다. 특히, 상기 기술된 실시예2 및 실시예3을 함께 고려할 경우, 화학가교 후 동결건조 방식을 사용한 하이드로겔의 팽윤도가 크게 향상되고, 재수화 후 불투명도도 줄어듦으로 복합 하이드로겔-스캐폴드 지지체 제작에 적합함을 확인할 수 있다.
실시예 4 : 동결건조 조건에 따른 복합 하이드로겔-스캐폴드 지지체의 팽윤도 및 투명도 분석
제조예 1에 따라 1.0 중량%의 하이드로겔(Col) 제조 및 0.25중량%의 가교제(Glutaraldehyde)에 의한 가교(실시예 1)로 제조한 복합 하이드로겔-스캐폴드 지지체를 이후 동결건조 과정에서, 동결온도가 -80℃ 또는 -20℃인 복합 하이드로겔-스캐폴드 지지체를 각각 준비하고, 이들 제조과정 각각에서의 결과물 이미지를 고속광학이미징시스템(Celena X (Logos Biosystems))을 통해 얻은 다음 그 결과를 도 5에 나타내었다.
구체적으로, 도 5는 동결 온도 조건 변화한 동결건조단계에 따른 복합 하이드로겔-스캐폴드 지지체의 이미지이다.
도 5를 참고하면, -80 ℃에서의 동결 조건에서 -20℃의 경우보다 하이드로겔 내의 기공이 보다 균일하고 조밀함을 확인할 수가 있었다.
실시예 5 : 복합 하이드로겔-스캐폴드 지지체의 보관온도 조건 및 보관기간 조건에 따른 팽윤도 및 투명도 분석
제조예 1에 따라 1.0 중량%의 하이드로겔(Col) 제조 및 0.25중량%의 가교제(Glutaraldehyde)에 의한 가교(실시예 1)로 제조한 복합 하이드로겔-스캐폴드 지지체를 이후 -80 ℃에서 동결건조 한 후 얻은 최종 동결건조 결과물을 직후(d0)와 7일동안 상온(RT), 4℃, 및 -80℃ 각각에 보관한 다음 재수화시켰을 때의 팽윤도와 투명도를 분석하고 그 결과를 도 6 및 도 7에 나타내었다. 이때, 팽윤도 및 투명도 분석은 실시예 3과 동일한 방법으로 수행하였다.
구체적으로, 도 6 및 도 7은 동결건조 후 보관온도 조건에 따른 복합 하이드로겔-스캐폴드 지지체의 팽윤도 실험 결과(도 6) 및 투명도 분석 결과(도 7)를 나타낸 그래프이다.
도 6 및 도 7을 참고하면, 제조예 1에 따라 제조한 복합 하이드로겔-스캐폴드 지지체에서의 동결건조 결과물을 낮은 보관온도 조건뿐 만 아니라 상온 온도 보관한 후에도 팽윤도와 투명도가 우수하게 유지될 수 있다는 점을 확인할 수 있다.
한편, 제조예 1에 따라 1.0 중량%의 하이드로겔(Col) 제조, 및 0.25 중량% 가교제(Glutaraldehyde)에 의한 가교(실시예 1)로 제조한 복합 하이드로겔-스캐폴드 지지체에 대해, 동결건조 결과물을 상온(RT)온도 조건에서 직후(d0), 7일(d7), 14일(d14), 및 28일(d28) 동안 보관한 다음 재수화시켰을 때의 팽윤도와 투명도를 분석하고 그 결과를 도 8 및 도 9에 나타내었다. 이때, 팽윤도 및 투명도 분석은 실시예 3과 동일한 방법으로 수행하였다.
구체적으로, 도 8 및 도 9은 동결건조 후 상온에서 보관시간 조건에 따른 복합 하이드로겔-스캐폴드 지지체의 팽윤도 실험 결과(도 8) 및 투명도 분석 결과(도 9)를 나타낸 그래프이다.
도 8 및 도 9을 참고하면, 제조예 1에 따라 제조한 복합 하이드로겔-스캐폴드 지지체에서의 동결건조 결과물을 상온에서 대략 한달까지 보관한 이후에도 팽윤도와 투명도가 우수하게 유지될 수 있다는 점을 확인할 수 있었다.
실시예 6 : 복합 하이드로겔-스캐폴드 지지체의 세포 생존 실험 및 증식 실험 분석
제조예 1에 따라 1.0 중량%의 하이드로겔(Col) 제조 및 0.25 중량%의 가교제(Glutaraldehyde)에 의한 가교(실시예 1), 이후 -80℃로 동결건조 제조한 복합 하이드로겔-스캐폴드 지지체의 세포 생존 실험 및 세포 증식 실험한 후 그 결과를 도 10 및 도 11에 나타내었다. 이때, 대조군으로서 종래 세포 및 하이드로겔을 충진할 때 주로 사용되어지는 열가교조건 (Thermal crosslinking/without dry)을 사용하여 하이드로겔-스캐폴드를 제작하고 그 결과를 비교하였다. 이때, 세포 생존 실험은 복합 하이드로겔-스캐폴드 지지체를 live/dead staining kit를 이용하여 염색한 후 고속형광현미경(Celena X (Logos Biosystems))을 사용하여 세포이미지를 얻었다. 한편, 세포 증식 실험은 Alamar blue 시약을 이용하여 배양기간(culture)에 따른 세포의 증식 정도를 형광세기(Fluorescence intensity)로 평가하였다.
구체적으로, 도 10은 복합 하이드로겔-스캐폴드 지지체에서의 세포 생존 실험 결과 이미지이고, 도 11은 복합 하이드로겔-스캐폴드 지지체에서의 세포 증식 결과 그래프이다.
도 10 및 도 11을 참고하면, 제조예 1에 따라 제조한 복합 하이드로겔-스캐폴드 지지체 내에 투입된 세포의 생존율 및 증식율이 대조군과 유사하게 모두 높게 유지되는 것을 확인할 수 있었다.
실시예 7 : 탈세포화된 세포외기질을 하이드로겔로 사용하여 제조한 복합 하이드로겔-스캐폴드 지지체의 이미지 분석 및 팽윤도 및 투명도 분석
제조예 1에 따라 하이드로겔로서 콜라겐 대신 돼지 간조직 유래 탈세포화된 세포외기질(Decellularized extracellular matrix; dECM)로 제조한 복합 하이드로겔-스캐폴드 지지체 (dECM F-D)의 이미지 분석과 팽윤도 및 투명도 분석한 결과를 도 12 내지 14에 나타내었다. 1.0 중량%의 하이드로겔의 농도로 제작, 0.25중량% 가교제(Glutaraldehyde) 사용 및 -80℃로 동결건조하는 복합 하이드로겔-지지체 제조방법은 동일하다.
구체적으로, 도 12는 하이드로겔로 콜라겐 대신 돼지 간 유래 탈세포화된 세포외기질을 사용하여 제조한 복합 하이드로겔-스캐폴드 지지체의 동결건조 후 및 재수화 후 이미지이고, 도 13 및 도 14는 하이드로겔로 콜라겐 대신 탈세포화된 세포외기질사용하여 제조한 복합 하이드로겔-스캐폴드 지지체의 팽윤도 분석 결과 그래프(도 13) 및 투명도 분석 결과 그래프(도 14)이다.
도 12 내지 도 14를 참고하면, 하이드로겔로 콜라겐 대신 조직으로부터 직접추출해 얻은 탈세포화된 세포외기질을 사용하여 제조한 복합 하이드로겔-스캐폴드 지지체가 성공적으로 제조된 것을 확인할 수 있었으며, 단일 성분인 콜라겐으로 제조한 복합 하이드로겔-스캐폴드 지지체와 마찬가지로 팽윤도 및 투명도도 우수한 것을 확인할 수 있었다.
Claims (13)
- 스캐폴드 지지체 자체의 내부 공간으로의 개구부가 없이 폐쇄된 내부 표면을 갖는 스캐폴드 지지체를 준비하는 단계;
하이드로겔의 외부 형태가 상기 스캐폴드 지지체의 폐쇄된 내부 표면에 의해 형성되는 내부 형태에 의해 결정되도록 상기 스캐폴드 지지체에 하이드로겔을 충진하는 단계;
상기 충진된 결과물을, 가교제가 포함된 가교용액에 침지하는 단계;
상기 충진된 결과물을 가교시키는 단계;
상기 가교시킨 결과물을 동결건조시키는 단계; 및
상기 동결건조된 결과물이 보관 및 유통된 이후, 최종 사용자에 의해 상기 동결건조된 결과물에 세포 혼합용액을 투입하는 단계를 포함하는 복합 하이드로겔-스캐폴드 지지체 제조방법으로서,
상기 복합 하이드로겔-스캐폴드 지지체는 바이오칩 형태로 사용되는 것인,
복합 하이드로겔-스캐폴드 지지체 제조방법. - 삭제
- 제1항에 있어서,
상기 하이드로겔은 콜라겐(Collagen), 탈세포화된 세포외기질(Decellularized Extracellular Matri, dECM), 젤라틴(Gelatin), 마트리젤(Matrigel), 메타크릴레이트화된 젤라틴(Methacrylated Gelatin, GelMA), 히알루론산(Hyaluronic acid), 알지네이트(Alginate), 피브린(Fibrin), 키토산(Chitosan), 및 아가로스(Agarose)으로 이루어진 군으로부터 선택된 1종 이상인, 복합 하이드로겔-스캐폴드 지지체 제조방법. - 제1항에 있어서,
상기 가교제는 글루타르알데하이드(Glutaraldehyde), Ethyl(dimethylaminopropyl) carbodiimide/N-hydroxysuccinimide(EDC/NHS), 트롬빈(thrombin), 염화 칼슘 용액 (CaCl2), Genipin 으로 이루어진 군으로부터 선택된 1종 이상인, 복합 하이드로겔-스캐폴드 지지체 제조방법. - 제1항에 있어서,
상기 충진된 결과물을 가교시키는 단계에서,
가교조건은 5분 내지 48시간 동안 4℃ 내지 60℃의 온도에서 수행되는, 복합 하이드로겔-스캐폴드 지지체 제조방법. - 제1항에 있어서,
상기 가교시킨 결과물을 동결건조시키는 단계에서,
상기 동결건조 조건은 -200℃내지 -10℃의 온도에서 수행되는, 복합 하이드로겔-스캐폴드 지지체 제조방법. - 제1항에 있어서,
상기 하이드로겔의 농도는, 하이드로겔 전체100중량% 기준, 0.05중량% 내지 5중량%인, 복합 하이드로겔-스캐폴드 지지체 제조방법. - 제1항에 있어서,
상기 가교제의 농도는, 가교용액 전체 100중량% 기준, 0.01중량% 내지 10중량%인, 복합 하이드로겔-스캐폴드 지지체 제조방법. - 제1항에 있어서,
상기 세포 혼합용액을 투입하는 단계에서,
상기 세포 혼합용액의 투입조건은 4 ℃에서 37 ℃의 온도에서 수행되는 것인, 복합 하이드로겔-스캐폴드 지지체 제조방법. - 제1항에 있어서,
상기 세포 혼합용액에 포함된 세포는 104 내지 108 cells/ml 농도인 복합 하이드로겔-스캐폴드 지지체 제조방법. - 제1항에 의해 제조되는 복합 하이드로겔-스캐폴드 지지체로서,
3차원적 공간을 포함하는 스캐폴드 지지체; 및
복수의 기공을 포함하는 하이드로겔;을 포함하고,
상기 기공의 최대직경은 1 μm 내지 500 μm인 것을 특징으로 하는, 복합 하이드로겔-스캐폴드 지지체. - 제11항에 있어서,
상기 하이드로겔은 콜라겐(Collagen), 탈세포화 된 세포외기질(Decellularized Extracellular Matri, dECM), 젤라틴(Gelatin), 마트리젤(Matrigel), 메타크릴레이트화된 젤라틴(Methacrylated Gelatin, GelMA), 히알루론산(Hyaluronic acid), 알지네이트(Alginate), 피브린(Fibrin), 키토산(Chitosan), 및 아가로스(Agarose)으로 이루어진 군으로부터 선택된 1종 이상인, 복합 하이드로겔-스캐폴드 지지체. - 제11항에 있어서,
상기 스캐폴드 지지체 내에 충진된 상기 하이드로겔의 기공 내에 포함되어, 스캐폴드 지지체에 균일하게 배치된 세포를 더 포함하는, 복합 하이드로겔-스캐폴드 지지체.
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| Hongxu Lu et al., "PLLA-collagen and PLLA-gelatin hybridscaffolds with funnel-like porous structurefor skin tissue engineering." (2012), Sci. Technol. Adv. Mater. (2012), Vol. 13, pp. 1-9* |
| 안수진 외., "Type Ⅰ Atelocollgen의 가교형성비 분석, 의공학회지 (1996), 제7권, 제4호, pp. 479-489* |
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