KR102643810B1

KR102643810B1 - 식물에서 목적 단백질을 대량생산하는 방법

Info

Publication number: KR102643810B1
Application number: KR1020200034576A
Authority: KR
Inventors: 황인환; 강향주; 이준호; 시지엔 송; 세르반 탕가라스 무타밀
Original assignee: 포항공과대학교 산학협력단; 주식회사 바이오앱
Priority date: 2020-03-20
Filing date: 2020-03-20
Publication date: 2024-03-06
Anticipated expiration: 2040-03-20
Also published as: EP4123027A4; WO2021187750A1; JP7491517B2; US12385056B2; US20230113417A1; CN115461464A; CN115461464B; JP2023518464A; EP4123027A1; KR20210117808A

Abstract

본 발명은 식물에서 목적 단백질을 대량생산하는 방법에 관한 것으로서, 자세하게는 목적 단백질(target gene)의 고발현용 발현 카세트 컨스트럭 및 유전자 침묵 억제 인자(gene silencing suppressor)인 p38의 고발현용 발현 카세트 컨스트럭를 제조한 후, 상기 컨스트럭를 함께 가지는 식물 세포에서의 일과성 발현용(transient expression) 바이너리 벡터(binary vector)를 제조한 후, 상기 바이너리 벡터를 단일 아그로박테리움 배양을 이용하여 아그로박테리움-매개 형질전환을 이용하여 목적 단백질을 식물 잎 세포에서 높은 수준의 단백질을 생산하는 방법에 관한 것이다.

Description

식물에서 목적 단백질을 대량생산하는 방법 {A method of mass production of target gene in plants}

본 발명은 식물에서 목적 단백질을 대량생산하는 방법에 관한 것으로서, 자세하게는 목적 단백질(target gene)의 고발현용 발현 카세트 컨스트럭 및 유전자 침묵 억제 인자(gene silencing suppressor)인 p38의 고발현용 발현 카세트 컨스트럭를 제조한 후, 상기 컨스트럭를 함께 가지는 식물 세포에서의 일과성 발현용(transient expression) 바이너리 벡터(binary vector)를 제조한 후, 상기 바이너리 벡터를 단일 아그로박테리움 배양을 이용하여 아그로박테리움-매개 형질전환을 이용하여 목적 단백질을 식물 잎에서 높은 수준의 단백질을 생산하는 방법에 관한 것이다.

최근에 식물에서 재조합 단백질을 저비용을 생산할 수 있는 가능성들이 제안되었으며, 이로 인하여 다양한 시도들이 진행되고 있다 (Schillberg et al., 2003; Holtz et al., 2015; Marusic et al., 2016). 특히 다양한 의료용 단백질의 생산 가능성 등을 확인하는 연구들이 진행되고 있다. 식물에서 재조합 단백질을 생산하는 경우에 다양한 장점들이 있을 수 있는데 그 중에 하나는 대장균 등 미생물에 존재하는 내독소와 같은 독소가 거의 존재하지 않는 다는 것과 인체에 감염할 수 있는 병원체들이 없다는 것이다. 또한 프리온과 같은 유해한 단백질도 없는 것으로 알려져 있어서 동물 세포나 미생물에 비해서 안전한 재조합 단백질을 생산할 수 있다는 것이다. 또한 제조 단가에서도 동물세포보다는 대단히 저렴하며, 식물을 재배하는 방법에 따라서 대규모 생산에 있어서는 대장균 등과 같은 미생물보다 더 경제적이다. 이러한 가능성을 실현하기 위해서는 몇 가지의 필수적인 기술들의 개발이 필요하다. 그 중에 가장 중요한 첫 번째 기술이 식물에서 유전자의 고발현을 유도할 수 있는 발현 벡터의 개발이다 (Staub et al, 2000; Regnard et al., 2010). 식물에서는 다양한 방법을 통해서 유전자의 발현을 유도할 수 있다. 재조합 유전자를 식물체의 게놈에 integration 시키는 방법, 엽록체의 게놈에 integration 시키는 방법, 아그로박테리움 (Agrobacterium)을 이용하여 일과성 있게 유전자를 발현시키는 방법 등 다양한 방법들이 가능하다 (Arzola et al., 2011; Werner et al., 2011). Nuclear genome이나 엽록체 genome에 재조합 유전자를 integration 시키는 방법은 기본적으로 형질전환체를 확보하는 과정을 통해서 식물에서 단백질을 생산하게 된다. 반면에 Agrobacterium을 식물 조직에 침투시켜 유전자의 일과성 발현을 유도하여 단백질을 생산하는 경우에는 형질전환체의 제조 과정이 포함되지 않으므로 단백질 생산기간이 짧으며, 대체로 형질전환체를 통한 단백질 생산에 비해서 단백질 생산 수준이 현저하게 높은 장점이 있다 (Arzola et al., 2011). 또한 식물이 가지고 있는 다른 유전자의 발현 억제 기작을 유전자 침묵 억제 인자를 co-infiltration하여 억제할 수 있으므로 단백질의 발현 수준을 더욱 높게 유도할 수 있다 (Garabagi et al., 2011). 그러나 일과성 발현을 하고자 할 때마다 목적 단백질을 포함하는 바이너리 벡터를 도입한 아그로박테리움 배양과 p38 유전자 침묵 억제 인자를 발현하는 바이너리 벡터를 도입한 아그로박테리움 배양을 따로 만들어서 이를 적절한 비율로 섞어서 co-infiltration 하는 과정을 수행하여야 하는 단점이 있다. 특히 두 종류의 아그로박테리움을 배양하는 경우에는 시간 및 경제적인 면에서 한계가 있다.

본 발명은 목전 유전자 고발현용 발현 카세트를 제조하고 이를 목적 단백질의 발현의 저해를 억제하는 p38인 유전자 침묵 억제 인자 (gene silencing suppressor)를 하나의 바이너리 벡터에 도입하여 식물체에서 일과성 발현을 통해서 단백질을 고 수준으로 생산하는 발현 벡터에 관한 것이다.

본 발명 식물에서 목적 단백질을 대량 발현하는 방법에 관한 것으로, 식물에서 일과성 발현을 이용하여 목적 단백질을 식물에 형질전환하여 목적 유전자의 단백질을 높은 수준으로 생산하는 목적 단백질 발현용 바이너리 벡터 및 이를 이용한 식물에서 목적 단백질을 대량 발현하는 방법에 관한 것이다. 상술한 과제를 해결하기 위해, 본 발명자들은, 목적 단백질의 고발현용 발현 카세트 및 유전자 침묵 억제 인자인 p38의 고발현용 발현 카세트를 개발하였고, 상기 두 개의 고발현용 발현 카세트 (목적 단백질 및 p38 고발현 카세트)를 함께 가지는 바이너리 벡터를 개발하였다. 상기 바이너리 벡터를 이용하여 목적 단백질과 p38 유전자를 하나의 아그로박테리움 배양을 이용하여 식물 세포에 전달함으로써 목적 유전자의 단백질의 높은 수준의 생산을 확인하였다. 자세하게는 목적 단백질의 고발현 카세트를 구축하기 위해서 Mac 프로모터의 3'말단에 단일 염기 변형 (A를 T 염기 치환)을 도입하여 원래의 Mac 프로모터보다 전사 수준이 높은 MacT 프로모터를 제조하였고, 애기장대의 다양한 종결 부위의 시퀀스를 실험한 결과 RD29B의 종결 부위가 고효율 종결 부위인 것을 확인하고, 상기 MacT 프로모터및 RD29B의 종결 부위를 구성 요소로 이용하여 고발현용 발현 카세트를 제조하였다. 또한 여기에 덧붙여 고효율 번역을 유도하는 21개의 염기 쌍 길이의 번역의 효율을 높이는 translation enhancing sequence를 목적 단백질 AUG codon의 immediate upstream에 5'- 비번역 구간 (5'-UTR)으로 사용하여 목적 단백질의 단백질 생산 수준을 높이도록 하였다. 목적 단백질과 함께 아그로박테리움에 의해서 식물 세포로 도입되는 p38 유전자의 발현 수준을 높이기 위해서 전사 효율이 높은 21-염기 쌍 길이의 translational enhancer sequence를 5'-UTR에 도입하여 p38의 발현을 높임으로써 유전자 침묵 억제 인자의 효율을 높였다. 상기 두 발현 카세트 (목적 단백질과 p38 유전자)를 pCAMBIA1300의 original gene expression cassette와 hygromycin expression cassette를 치환하는 방법으로 도입하여 pTEX1L vector를 완성하였다. 이 pTEX1L을 이용하면 P38 발현용 벡터를 가진 아그로박테리움과 목적 단백질을 포함하는 아그로박테리움과 혼합하여 두 종류의 아그로박테리움을 이용하여 co-infiltration하지 않고 pTEX1L 바이너리 벡터를 가진 한 종류의 아그로박테리움에 의해서 목적 단백질과 p38을 동시에 전달하고 이를 통해서 목적 유전자의 단백질 수준의 고발현을 유도하고 이를 통해서 고효율 단백질 생산을 유도할 수 있는 효과를 확인하였다. 이를 통해서 하나의 바이너리 벡터가 목적 단백질 및 유전자 침묵 억제 인자인 p38을 동시에 전달 할 수 있는 이중 전달용 발현 벡터를 완성하였다.

본 발명은 식물에서 목적 단백질을 대량 생산하기 위한 재조합 벡터를 제공하는데 목적이 있다.

본 발명의 다른 목적은 상기 재조합 벡터로 형질 전환된 형질전환체를 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 하기의 단계를 포함하는 식물에서 목적 단백질을 대량으로 생산하기 위한 방법을 제공하는 것이다:

(a) 상기 서술한 재조합 벡터를 제작하는 단계;

(b) 상기 재조합 벡터를 세포에 도입하여 형질전환체를 제조하는 단계;

(c) 상기 형질 전환체를 배양하는 단계;

(d) 상기 배양물을 식물에 침윤하는 단계; 및

(e) 상기 식물을 분쇄하여 목적 단백질을 추출하는 단계.

상술한 과제를 해결하기 위해, 본 발명은 (i) Mac 프로모터(Mac promoter); (ii) 목적 단백질을 코딩하는 유전자; 및 (iii) RD29B-t 종결 부위를 포함하는 식물에서 목적 단백질을 대량 생산하기 위한 재조합 벡터를 제조할 수 있다.

본 발명의 바람직한 일실시예에 따르면, 상기 Mac 프로모터의 유전자 서열은 서열 번호 1의 염기서열을 포함할 수 있다.

본 발명의 바람직한 다른 일실시예에 따르면, Mac 프로모터의 3'말단 염기인 A를 T로 치환한 Mac T 프로모터일 수 있다.

본 발명의 바람직한 다른 일실시예에 따르면, 상기 Mac T 프로모터는 서열 번호 2의 염기서열을 포함할 수 있다.

본 발명의 바람직한 다른 일실시예에 따르면, 상기 RD29B-t 종결 부위는 서열 번호 3의 염기서열을 포함할 수 있다.

본 발명의 바람직한 다른 일실시예에 따르면, 상기 목적 단백질은 수용성 녹색 형광 단백질 (Soluble green fluorescent protein), 항원, 항체, 항체 단편, 구조 단백질, 조절단백질, 전사인자, 독소 단백질, 호르몬, 호르몬 유사체, 사이토카인, 효소, 효소 저해제, 수송단백질, 리셉터, 리셉터의 단편, 생체방어 유도물질, 저장단백질, 이동 단백질(movement protein), 익스플로이티브 프로틴(exploitive protein), 성장인자 및 리포터 단백질로 구성되는 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상의 단백질일 수 있다.

본 발명의 바람직한 다른 일실시에 따르면, 상기 벡터는 pCAMBIA1300일 수 있다.

본 발명의 바람직한 다른 일실시예 따르면, 상기 재조합 벡터는 유전자 침묵 억제인자 (gene silencing suppressor) 유전자를 추가로 포함할 수 있다.

본 발명의 바람직한 다른 일실시예 따르면, 상기 유전자 침묵 억제인자 (gene silencing suppressor) 유전자는 p38, P19, HC-Pro 및 TVA 2b로 구성되는 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상일 수 있다.

본 발명은 또한, 상기 재조합 벡터로 형질 전환된 형질 전환체를 제공할 수 있다.

본 발명의 바람직한 일실시예에 따르면, 상기 형질 전환체는 아그로박테리움(Agrobacterium)일 수 있다.

본 발명은 또한, 하기의 단계를 포함하는 식물에서 목적 단백질을 생산하는 방법을 제공할 수 있다:

(a) 상기 서술한 재조합 벡터를 제작하는 단계;

(c) 상기 형질 전환체를 배양하는 단계;

(d) 상기 배양물을 식물에 침윤하는 단계; 및

(e) 상기 식물을 분쇄하여 목적 단백질을 추출하는 단계.

본 발명의 바람직한 일실시예에 따르면, 상기 (d) 단계에 p38을 포함하는 재조합 벡터를 세포에 도입한 형질전환체를 추가로 식물에 침윤하는 단계를 추가할 수 있다.

본 발명에 따른 벡터는 목적 유전자의 단백질의 발현 수준을 높일 수 있는 효과가 있다. 자세하게는 위해서 Mac 프로모터의 3'말단에 단일 염기 변형 (A를 T 염기 치환)을 도입하여 원래의 Mac 프로모터보다 전사 수준이 높은 MacT 프로모터, 단백질의 발현을 높이는 M 도메인, ER의 높은 축적을 유도하는 BiP, ER에 높은 축적률을 유도하는 HDEL, RD29B의 종결 부위, 유전자 침묵 억제 인자인 p38, 번역 증폭 서열인 5'-UTR를 순서로 연결하여 제조한 벡터이다. 상기 재조합 벡터를 아그로박테리움에 형질 전환한 후 배양하여, 진공 침윤 방법으로 식물에서 목적 단백질을 저비용 고효율로 생산할 수 있는 효과가 있다.

도 1은 3 종류의 프로모터 (CaMV 35S, Mac 또는 MacT (Mac 프로모터의 3'말단에 단일염기인 A에서 T로 치환))의 효율을 비교 분석한 결과로서, (a)는 실험에 사용된 컨스트럭의 개열 지도이며, (b)는 상기 플라즈미드 컨스트럭을 원형질체에 도입한 후 단백질을 추출한 후, 상기 단백질과 anti-GFP을 반응시켜 웨스턴 블랏 분석을 수행한 결과이며, (c)는 상기 멤브레인을 쿠마시 블루 염색 dye로 염색한 결과이다: NT, non-transformed control; M, 단백질 크기 standard.
도 2은 3 종류의 3'말단의 종결 부위(HSP-t, AtExt4-t 또는 RD29B-t)에 따른 단백질의 생산 수준을 비교 분석한 결과로서, (a)는 실험에 사용된 컨스트럭의 개열 지도이며, (b)는 상기 플라즈미드 컨스트럭를 원형질체에 도입한 후 단백질을 추출한 후, 상기 단백질과 anti-GFP을 반응시켜 웨스턴 블랏 분석을 수행한 결과이며, (c)는 상기 멤브레인을 쿠마시 블루 염색 dye로 염색한 결과이다: NT, non-transformed control; M, 단백질 크기 standard.
도 3은 두 종류의 프로모터(CaMV 35S 또는 Mac T) 및 3 종류의 종결 부위(Nos-t, HSP-t 또는 RD29B-t)의 조합에 따른 단백질 생산 수준을 비교 분석한 결과로서, (a)는 실험에 사용된 컨스트럭의 개열 지도이며, (b)는 상기 플라즈미드 컨스트럭를 원형질체에 도입한 후 단백질을 추출한 후, 상기 단백질과 anti-GFP을 반응시켜 웨스턴 블랏 분석을 수행한 결과이며, (c)는 멤브레인을 쿠마시 블루 염색 dye로 염색한 결과이다: NT, non-transformed control; M, 단백질 크기 standard.
도 4은 pCAMBIA1300으로부터 Hygromycin 유전자를 제거함과 동시에 Acc65I와 SalI restriction site를 도입하였고, double 35S 프로모터의 5'말단에 BsrGI site를 도입하여 pM35M을 제작하였고, 상기 pM35M에 Acc65I와 SalI을 이용하여 P38 유전자를 도입하여 pTEX0를 제조하였고, pTEX0에 다시 MacT::BiP:sGFP:HDEL::RD29B-t를 PstI과 EcoRI을 이용하여 도입하여 pTEX1:GFP를 제조한, pCAMBIA1300으로부터 pTEX1를 제작하는 과정을 정리한 모식도이다.
도 5은 pmEGR 또는 pTEX1:GFP의 P38에 따른 단백질 생산 수준을 비교 분석한 결과로서, (a)는 실험에 사용된 컨스트럭의 개열 지도이며, (b)는 pMEGR 또는 pTEX1:GFP를 Agrobacterium을 이용하여 단독으로 또는 P38을 발현하는 바이너리 벡터를 포함하는 아그로박테리움을 섞어서 co-infiltration하여 Nicotiana benthamiana 잎 조직에서 GFP의 발현을 유도하여, Infiltration한 후 5일째 단백질을 추출하여 SDS-page를 이용하여 전개한 후, 멤브레인을 쿠마시 블루 염색 dye로 염색한 결과이고, (c)는 상기 단백질을 anti-GFP을 반응시켜 웨스턴 블랏 분석을 수행한 결과이다.
도 6은 pTEX1, pTEX1N또는 pTEX1L을 이용하여 P38 단백질의 발현 수준을 비교 분석한 결과로서, pTEX1은 coP38을 가지고 있으며, pTEX1N과 pTEX1L은 original P38 유전자를 가지고 있고, 또한 pTEX1L은 P38 앞에 L 서열을 갖는 21개의 염기쌍의 5' UTR을 포함시켰으며, (a)는 상기 pTEX1, pTEX1N또는 pTEX1L의 개열 지도이고, (b)는 pTEX1, pTEXN1 및 pTEX1L을 애기장대의 원형질체에 형질전환하여 P38의 발현을 유도하고 이를 anti-P38 antibody를 이용하여 Western blot analysis를 통해서 P38 단백질의 발현 수준을 확인한 결과이다: NT, non-transformed 원형질체s. RbcL, 단백질 loading control로 이용하였다.
도 7은 pTEX1L에 의해서 유도되는 목적 단백질의 발현 수준을 비교 분석한 결과로서, (A) pTEX1L의 목적 단백질의 발현 수준을 비교한 결과이고, pTEX1L, pMERG, 1300-BiP-GFP-HDEL을 Agrobacterium 침윤법으로 N. benthamiana도입하여 발현 수준을 비교하였고, P38을 co-transformation의 유 (+), 무 (-)에 따라서 목적 단백질인 ER targeted GFP 단백질의 발현 수준을 anti-GFP antibody를 이용하여 비교 분석한 결과이고, (B) 는 P38의 발현 수준을 비교 분석한 결과로서, N. benthamiana leaf extract을 이용하여 P38의 발현 수준을 anti-P38 antibody를 이용하여 western blot 분석을 이용하여 비교 분석한 결과이며, (C) Coomassie blue stained P38 및 RbcL의 수준을 비교한 결과로서, Western blot 분석 후 membrane을 쿠마시 블루로 staining 하여 P38의 수준과 loading control로 사용하기 위해서 RbcL의 수준을 확인한 결과이다.

이하에서 본 발명을 더욱 자세히 설명한다.

상술한 바와 같이, 동물세포 또는 미생물을 이용하여 단백질을 생산하는 것은 바이러스, 암 유전자, 장독소와 같은 여러 가지 오염원과 같은 문제를 야기하며, 대량으로 생산할 때 기간 및 비용이 많이 소비 된다는 한계들을 갖는다. 이를 극복하기 위해 식물에서 단백질을 생산하는 방법이 개발되고 있으나, 이 또한 단백질 발현이 낮다는 한계가 있다.

이에 본 발명자들은 식물에서 목적 단백질 발현량을 증가시키기 위한 재조합 벡터를 제작하였다. 본 발명의 재조합 벡터는 목적 단백질을 포함하며, 상기 목적 단백질을 포함하는 재조합 벡터를 배양한 후, 상기 배양액을 식물에 침윤한 뒤, 상기 식물에서 목적 유전자의 단백질 발현이 높은 수준으로 증가한다는 것을 확인하였다.

이하, 첨부한 도면을 참고로 하여 본 발명의 실시예에 대하여 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자가 용이하게 실시할 수 있도록 상세히 설명한다. 본 발명은 여러 가지 상이한 형태로 구현될 수 있으며 여기에서 설명하는 실시예에 한정되지 않는다.

본원 발명은 (i) Mac 프로모터(Mac promoter); (ii) 목적 단백질을 코딩하는 유전자; 및 (iii) RD29B-t 종결 부위;를 포함하는 식물에서 목적 단백질을 대량 생산하기 위한 재조합 벡터를 제공할 수 있다.

본원 발명자들은 고발현 바이너리 벡터가 포함하고 있는, CaMV 35S 프로모터, 또는 double enhancer를 갖는 35S 프로모터 보다 더 발현이 높은 고발현 프로모터를 개발하고자 하였다. 이에 CaMV 35S 프로모터, Mac 프로모터 (서열 번호 1), Mac 프로모터 염기서열의 3'말단 염기인 A를 T로 치환한 Mac T 프로모터(서열 번호 2)를 포함하는 벡터를 디자인 한 후, GFP를 발현 시킨 결과, Mac T 프로모터가 약 50% 정도의 발현 효율이 높은 것을 확인하였다 (도 1).

상기 Mac 프로모터의 유전자 서열은 서열 번호 1의 염기서열을 포함할 수 있으며, 구체적으로 상기 유전자는 서열 번호 1의 염기서열과 각각 70% 이상, 더욱 바람직하게는 80% 이상, 더 더욱 바람직하게는 90% 이상, 가장 바람직하게는 95%이상의 서열 상동성을 가지는 염기 서열을 포함할 수 있다. 폴리뉴클레오티드에 대한 "서열 상동성의 %”는 두 개의 최적으로 배열된 서열과 비교 영역을 비교함으로써 확인되며, 비교 영역에서의 폴리뉴클레오티드 서열의 일부는 두 서열의 최적 배열에 대한 참고 서열(추가 또는 삭제를 포함하지 않음)에 비해 추가 또는 삭제(즉, 갭)를 포함할 수 있다.

상기 Mac 프로모터는 Mac 프로모터의 3'말단 염기인 A를 T로 치환한 Mac T일 수 있으며, 상기 Mac T 프로모터는 서열 번호 2의 염기서열을 포함할 수 있으며, 구체적으로 상기 유전자는 서열 번호 2의 염기서열과 각각 70% 이상, 더욱 바람직하게는 80% 이상, 더 더욱 바람직하게는 90% 이상, 가장 바람직하게는 95%이상의 서열 상동성을 가지는 염기 서열을 포함할 수 있다. 폴리뉴클레오티드에 대한 "서열 상동성의 %”는 두 개의 최적으로 배열된 서열과 비교 영역을 비교함으로써 확인되며, 비교 영역에서의 폴리뉴클레오티드 서열의 일부는 두 서열의 최적 배열에 대한 참고 서열(추가 또는 삭제를 포함하지 않음)에 비해 추가 또는 삭제(즉, 갭)를 포함할 수 있다.

유전자의 발현에는 종결 부위의 종류에 따른 발현 수준을 확인하였다. 애기장대의 유전자 중 RD29B의 발현이 평소에는 대단히 낮게 유지되지만 식물이 가뭄과 같은 abiotic stress를 받게 되면 ABA와 같은 물질에 의해서 발현이 높게 빠르게 유도된다고 알려져 있다. 이에 RD29B이 전사 수준을 신속하게 높게 유도하기 위해서는 전사의 종결 부위도 고효율로 일어날 것이라는 가정하에 RD29B의 종결 부위가 (RD29B-t; 서열 번호 3)이 유전자의 발현 수준을 높이는지 확인하였다. 애기장대의 AtExt4 종결 부위 (AtExt4-t) 및 고발현을 유도한다는 HSP 종결 부위 terminator (HSP-t)를 참고 종결 부위로 (reference terminator) 이용하여 도 2에서와 같은 발현 벡터를 만든 뒤, 이를 애기장대의 원형질체에 도입하여 sGFP의 발현 수준을 확인하였다 (도 2). 그 결과 RD29B 종결 부위가 두 개의 참고 종결 부위보다 sGFP의 발현을 50% 이상 높게 유도하는 것을 확인하였다.

상기 RD29B-t 종결 부위는 서열 번호 3의 염기서열을 포함할 수 있으며, 구체적으로 상기 유전자는 서열 번호 3의 염기서열과 각각 70% 이상, 더욱 바람직하게는 80% 이상, 더 더욱 바람직하게는 90% 이상, 가장 바람직하게는 95%이상의 서열 상동성을 가지는 염기 서열을 포함할 수 있다. 폴리뉴클레오티드에 대한 "서열 상동성의 %”는 두 개의 최적으로 배열된 서열과 비교 영역을 비교함으로써 확인되며, 비교 영역에서의 폴리뉴클레오티드 서열의 일부는 두 서열의 최적 배열에 대한 참고 서열(추가 또는 삭제를 포함하지 않음)에 비해 추가 또는 삭제(즉, 갭)를 포함할 수 있다.

본원 발명자들은 도 1 및 도 2와 같이 MacT 프로모터 및 RD29B 종결 부위 (RD29B-t)가 각각 유전자의 단백질의 발현 수준을 증가시킨다는 것을 독립적으로 확인하였다. 이에 상기 구성 요소의 조합이 여전히 유전자의 단백질의 발현 수준을 높이는지 확인하였다. 상기 MacT 프로모터와 RD29B-t를 프로모터와 터미네이터로 사용하고 그 사이에 BiP-sGFP-HDEL 유전자 (서열 번호 4)를 삽입하여 발현 카세트를 제작하였다. BiP(서열 번호 5)는 소포체 타켓팅을 위한 서열이고, GFP(서열 번호 7)는 녹색형광단백질(green fluorescent protein)의 염기 서열이며, HDEL(서열 번호 8)은 단백질을 소포체에 머무르게 하기 위한 소포체 정체 염기서열로 사용하였다. 참고 컨스트럭은 (Reference construct)은 도 3과 같이, 35S::Nos-t, MacT::Nos-t, 35S::HSP-t, MacT::HSP-t, 35S::RD29B-t를 제작하였다. 여기에 BiP-sGFP-HDEL을 reporter 유전자로 하여 발현 컨스트럭(expression construct)를 완성하였다. 이들을 MacT::RD29B-t와 비교하기 위해서 애기장대 원형질체를 이용하여 GFP의 발현을 유도하고 발현 수준을 확인한 결과, 예상한 바와 같이, MacT::RD29B-t이 가장 높은 단백질 수준을 보이는 것을 확인하였다. MacT와 RD29B-t를 새로운 고발현용 발현 카세트의 프로모터 및 종결 부위의 서열로 확립하였다.

상기 "목적 단백질"는 발현하고자 하는 외래 산물을 코딩하는 유전자로써, 재조합 단백질로 발현 가능한 모든 종류의 단백질을 암호화하는 유전자이다. 대표적으로, 인슐린, 사이토카인(인터루킨, 종양괴사인자, 인터페론, 콜로니자극인자, 케모카인 등등), 에리트로포이에틴, 항원, 항체, 항체 단편, 구조 단백질, 조절단백질, 전사인자, 독소 단백질, 호르몬, 호르몬 유사체, 효소, 효소 저해제, 수송단백질, 리셉터 (예컨대, 티로신 키나아제 수용체 등), 리셉터의 단편, 생체방어 유도물질, 저장단백질, 이동단백질(movement protein), 익스플로이티브 프로틴(exploitive protein), 리포터 단백질, 성장 인자, 백신을 생산하기 위한 viral genes, 박테리아 유전자 등이 있으며, 이러한 목적 단백질은 상기 벡터에 삽입할 수 있도록 제한 효소 인지 또는 절단 부위가 도입되어 있는 핵산 서열인 "클로닝 부위" 를 포함할 수 있다.

재조합 단백질의 유전자의 N-과 C-말단에 각각 BiP의 signal sequence와 ER retention signal인 HDEL를 포함으로써, ER(소포체)에 고농도로 축적을 유도하는 효과를 가질 수 있다. 상기 재조합 벡터는 BiP(chaperone binding protein) 및 HDEL(His-Asp-Glu-Leu) 펩타이드로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나를 추가로 포함할 수 있고, 상기 BiP(chaperone binding protein)는 서열 번호 5의 염기서열을 포함할 수 있고, HDEL(His-Asp-Glu-Leu)는 서열 번호 8의 염기서열을 포함할 수 있다.

또한 상기 재조합 벡터에 번역 증폭 서열인 5'-UTR를 추가로 포함할 수 있으며, 상기 5'-UTR은 서열 번호 6 또는 서열 번호 10의 염기서열을 포함할 수 있다.

상기 재조합은 세포가 이종의 핵산을 복제하거나, 상기 핵산을 발현하거나 또는 펩티드, 이종의 펩티드 또는 이종의 핵산에 의해 암호화된 단백질을 발현하는 세포를 지칭하는 것이다. 재조합 세포는 상기 세포의 천연 형태에서는 발견되지 않는 유전자 또는 유전자 절편을 센스 또는 안티센스 형태 중 하나로 발현할 수 있다. 또한 재조합 세포는 천연 상태의 세포에서 발견되는 유전자를 발현할 수 있으며, 그러나 상기 유전자는 변형된 것으로서 인위적인 수단에 의해 세포 내 재도입된 것이다.

용어 "재조합 발현 벡터"는 세균 플라스미드, 파아지, 효모 플라스미드, 식물 세포 바이러스, 포유동물 세포 바이러스 또는 다른 벡터를 의미한다. 대체로, 임의의 플라스미드 및 벡터는 숙주 내에서 복제 및 안정화할 수 있다면 사용될 수 있다. 상기 발현 벡터의 중요한 특성은 복제 원점, 프로모터, 마커 유전자 및 번역 조절 요소(translation control element)를 가지는 것이다. 상기 재조합 발현 벡터 및 적당한 전사/번역 조절 신호를 포함하는 발현 벡터는 당업자에 주지된 방법에 의해 구축될 수 있다. 상기 방법은 시험관내 재조합 DNA 기술, DNA 합성 기술 및 생체 내 재조합 기술 등을 포함한다.

본 발명의 재조합 벡터의 바람직한 예는 적당한 숙주에 존재할 때 그 자체의 일부, 소위 T-영역을 식물 세포로 전이시킬 수 있는 Ti-플라스미드 벡터이다. 다른 유형의 Ti-플라스미드 벡터는 현재 식물 세포, 또는 잡종 DNA를 식물의 게놈 내에 적당하게 삽입시키는 새로운 식물이 생산될 수 있는 원형질체로 잡종 DNA 서열을 전이시키는데 이용되고 있다. Ti-플라스미드 벡터의 특히 바람직한 형태는 EP 0120 516 B1호 및 미국 특허 제4,940,838호에 청구된 바와 같은 소위 바이너리(binary) 벡터이다. 본 발명에 따른 DNA를 식물 숙주에 도입시키는데 이용될 수 있는 다른 적합한 벡터는 이중 가닥 식물 바이러스(예를 들면, CaMV) 및 단일 가닥 바이러스, 게미니 바이러스 등으로부터 유래될 수 있는 것과 같은 바이러스 벡터, 예를 들면 비완전성 식물 바이러스벡터로부터 선택될 수 있다. 그러한 벡터의 사용은 특히 식물 숙주를 적당하게 형질 전환하는 것이 어려울 때 유리할 수 있다.

유전자 침묵 억제 인자의 발현과 목적 단백질 발현을 유도하는 두 개의 바이너리 벡터를 이용하여 목적 단백질의 고발현을 유도한다. 일과성 발현을 이용하여 단백질을 발현하는 경우에는 유전자 침묵 억제 인자의 co-expression이 목적 단백질의 고발현에 필수적이다. 이에 두 개의 바이너리 벡터는 각각이 아그로박테리움에 형질전환 된 후 각각 아그로박테리움 배양을 만들고, 이를 상기 목적 단백질 및 유전자 침묵 억제 인자를 각각 포함하는 벡터를 형질 전환한 아그로박테리움 배양물을 적당한 비율로 혼합하여, co-infiltration한다. 이에 두 배의 노력과 두 배의 경비를 필요로 한다. 따라서 하나의 바이너리 벡터가 목적 단백질과 유전자 침묵 억제 인자인 p38을 동시에 전달하도록 발현 벡터를 제작하였다. 도 4와 같이, 순서에 따라서 tobacco codon optimized p38 (coP38) 유전자를 pCAMBIA1300의 hygromycin 유전자를 치환하는 방법으로 도입하였다. 이를 통해서 pTEX0를 구축하고 여기에 MacT::M:BiP:sGFP:HDEL:RD29B-t를 도입하여 pTEX1:GFP을 구축하였다. 이 때 BiP의 immediate upstream region의 5'-UTR로 5'-ggcgtgtgtgtgtgttaaaga-3' (M 5'-UTR, 서열 번호 6)를 갖도록 하여 번역 효율을 높게 유도하였다. 이렇게 구축한 발현 벡터용 이중 전달용 바이너리 벡터를 이용하여 발현을 확인하고자 하였다. 참고 컨스트럭으로 pCAMBIA1300에 MacT::BiP:sGFP:HDEL:RD29B-t를 갖는 발현 벡터(pMEGR)을 구축하였다. 상기 두 컨스트럭를 단독으로, 또는 p38을 갖는 Agrobacterium을 섞어서 co-infiltration하여 sGFP의 발현 수준을 확인하였다 (도 5). pMEGR의 경우에는 p38의 co-infiltration에 의해서 sGFP의 발현이 높게 유도됨을 확인하였다. 마찬가지로 pTEX1의 경우에도 p38의 추가적인 co-infiltration에 의해서 발현이 높아졌다 (도 5). 이를 통해서 pTEX1:GFP의 경우 p38을 내재적으로 가지고 있어도 여전히 따로 p38을 co-infiltration하였을 때 sGFP의 발현이 높아짐으로 pTEX1에 의해서 발현되는 p38의 양이 충분하지 않다고 결론을 내렸다. 이는 한 Agrobacterium에 의해서 도입된 T-DNA에 이 두 개의 유전자를 동시에 갖게 되면서 p38의 발현 양이 충분하지 않을 수 있을 것으로 추정하였다. 따라서 pTEX1에 포함된 p38의 발현을 높이는 컨스트럭을 재구축 하였다. Original TCV-CP의 염기서열을 포함하는 pBIN based binary vector (공개특허 10-2012-0055831의 35S:CP)로부터 PCR을 통해 35S promoter-P38-35S terminator를 확보하여 pTEX1-EMCC에서 BsrGI과 Acc65I를 이용하여 해당 fragment를 치환하였다. 이를 통해서 pTEX1N-EMCC를 구축하였다. 또한 P38의 발현 수준을 더욱 높이기 위해서 translation efficiency를 높이는 방법을 택하기로 하였다. 이는 단백질 생산 수준을 높이는 여러 방법 중에 cellular energy의 측면에서 가장 효율적이라 생각된다. P38의 5'-UTR에 고효율 translation을 유도할 수 있는 염기서열인 5'-attattacatcaaaacaaaaa-3' (서열 번호 10)를 포함하는 L:P38을 도입하여 P38 발현 카세트를 구축하였다 (pTEX1L) (도 6). 이를 통해서 P38의 발현 수준을 높이고자 하였다. pTEX1, pTEX1N 및 pTEX1L을 애기장대의 원형질체에 형질전환 한 후 P38의 발현 수준을 비교한 결과 pTEX1이 가장 낮은 발현 수준을 보였으며, pTEX1N pTEX1보다는 2배 정도 높게 발현함을 확인할 수 있었다. 반면에 pTEX1L은 또다시 이들 pTEX1N 보다도 2 배 정도 높은 발현을 보였다 (도 6D). 최종적으로 이 pTEX1L에 M::BiP:sGFP:HDEL을 포함하는 construct (pTEX1L:sGFP)를 구축하고 이를 통해서 발현의 수준을 확인하였다. 대조군으로 pCAMBIA1300벡터에 35S promoter-sGFP-HSP terminator가 들어있는 벡터와 pMEGR을 이용하였고 동시에 각각 P38 co-infiltration하는 경우와 비교하였다. 그 결과 먼저 담배에서 agro-infiltration을 통한 일과성 발현도 애기장대 원형질체 transformation과 마찬가지로 MacT 프로모터-RD29B 종결 부위에 의한 sGFP 발현이 35S promoter-HSP terminator 조합에 의한 발현보다 2-3배 높은 수준으로 확인되었다 (도 7). 그리고 P38 co-infiltration한 pMEGR과 P38 co-infiltration하지 않은 pTEX1L:sGFP의 sGFP 발현이 큰 차이가 없고, pTEX1L:sGFP를 P38과 co-transformation하는 경우도 sGFP의 발현에 거의 차이가 없음을 확인하였다. 이를 통해서 하나의 바이너리 벡터가 목적 단백질 및 유전자 침묵 억제 인자인 p38을 동시에 전달 할 수 있는 이중 전달용 발현 벡터를 완성하였다.

상기 벡터는 pCAMBIA1300일 수 있으며, pCAMBIA1300으로부터 Hygromycin 유전자를 제거함과 동시에 Acc65I와 SalI restriction site를 도입할 수 있으며, double 35S 프로모터의 5'말단에 BsrGI site를 도입하여 제작할 수 있다 (도 4의 pM35M). 상기 벡터 (도 4의 pM35M)에 Acc65I와 SalI을 이용하여 P38 유전자를 도입하여 제작할 수 있다 (도 4의 pTEX0). 상기 벡터에 (도 4의 pTEX0)에 다시 MacT::BiP:sGFP:HDEL::RD29B-t를 PstI과 EcoRI을 이용하여 도입하여 제작할 수 있다 (도 4 의 pTEX1)

상기 재조합 벡터는 유전자 침묵 억제인자 (gene silencing suppressor) 유전자를 추가로 포함할 수 있으며, 상기 유전자 침묵 억제인자 (gene silencing suppressor) 유전자는 p38, P19, HC-Pro 및 TVA 2b로 구성되는 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상일 수 있으며, 바람직하게는 p38을 추가로 포함할 수 있으며, 상기 p38은 서열 번호 9의 염기서열을 포함할 수 있으며, 구체적으로 상기 유전자는 서열 번호 9의 염기서열과 각각 70% 이상, 더욱 바람직하게는 80% 이상, 더 더욱 바람직하게는 90% 이상, 가장 바람직하게는 95%이상의 서열 상동성을 가지는 염기 서열을 포함할 수 있다. 폴리뉴클레오티드에 대한 "서열 상동성의 %”는 두 개의 최적으로 배열된 서열과 비교 영역을 비교함으로써 확인되며, 비교 영역에서의 폴리뉴클레오티드 서열의 일부는 두 서열의 최적 배열에 대한 참고 서열(추가 또는 삭제를 포함하지 않음)에 비해 추가 또는 삭제(즉, 갭)를 포함할 수 있다.

본 발명은 또한 상기 재조합 벡터로 형질 전환된 형질 전환체를 제공할 수 있다.

또한, 본 발명의 벡터를 진핵 세포에 형질 전환시키는 경우에는 숙주세포로서, 효모(Saccharomyce cerevisiae), 곤충세포, 사람세포 (예컨대, CHO 세포주 (Chinese hamster ovary), W138, BHK, COS-7, 293, HepG2, 3T3, RIN 및 MDCK 세포주) 및 식물세포 등이 이용 될 수 있으며, 바람직하게는 아그로박테리움(Agrobacterium)될 수 있다.

본 발명의 벡터를 숙주세포 내로 운반하는 방법은, 숙주 세포가 원핵 세포인 경우, CaCl2 방법, 하나한 방법 (Hanahan, D., J. Mol. Biol., 166:557-580(1983)) 및 전기천공 방법 등에 의해 실시될 수 있다. 또한, 숙주세포가 진핵세포인 경우에는, 미세주입법, 칼슘포스페이트 침전법, 전기천공법, 리포좀-매개 형질감염법, DEAE-덱스트란 처리법, 및 유전자 밤바드먼트 등에 의해 벡터를 숙주세포 내로 주입할 수 있다.

본 발명은 또한 (a) 상기 서술한 재조합 벡터를 제작하는 단계; (b) 상기 재조합 벡터를 세포에 도입하여 형질전환체를 제조하는 단계; (c) 상기 형질 전환체를 배양하는 단계; (d) 상기 배양물을 식물에 침윤하는 단계; 및 (e) 상기 식물을 분쇄하여 목적 단백질을 추출하는 단계;를 포함하는 식물에서 목적 단백질을 생산하는 방법을 제공할 수 있다.

상기 형질 전환된 식물로부터 목적 단백질을 생산하는 방법은 본 발명에 따른 재조합 벡터로 식물 세포를 형질 전환 시킨 다음, 목적 단백질이 발현되도록 적당한 시간 동안 배양한 후, 형질 전화된 세포로부터 수득할 수 있다. 이때 상기 목적 단백질을 발현시키는 방법은 당업계에 공지된 방법이라면 모두 가능하다.

본 발명은 (d) 상기 배양물을 식물에 침윤하는 단계에 본 발명의 탄산무수화효소를 생산하기 위한 재조합 벡터 배양물 외 P38을 포함하는 재조합 벡터의 배양물을 동시에 침윤할 수 있다. p38은 gene silencing suppressor이다. 이외에도 gene silencing suppressor P19, HC-Pro, TVA 2b 등일 수 있다.

상기 식물에 침유하는 방법은 화학 전지법, 진공 또는 주사기 침윤 방법이 있고 가장 바람직하게는 주사기 침윤 방법일 수 있으나, 이에 제한되는 것이 아니다.

상기 식물은 벼, 밀, 보리, 옥수수, 콩, 감자, 밀, 팥, 귀리, 수수를 포함하는 식량작물류; 애기장대, 배추, 무, 고추, 딸기, 토마토, 수박, 오이, 양배추, 참외, 호박, 파, 양파, 당근을 포함하는 채소작물류; 인삼, 담배, 목화, 참깨, 사탕수수, 사탕무, 들깨, 땅콩, 유채를 포함하는 특용작물류; 사과나무, 배 나무, 대추나무, 복숭아, 포도, 감귤, 감, 자두, 살구, 바나나를 포함하는 과수류; 장미, 카네이션, 국화, 백합, 튤립을 포함하는 화훼류로부터 선택되는 것일 수 있다.

이상에서 본 발명의 일 실시예에 대하여 설명하였으나, 본 발명의 사상은 본 명세서에 제시되는 실시 예에 제한되지 아니하며, 본 발명의 사상을 이해하는 당업자는 동일한 사상의 범위 내에서, 구성요소의 부가, 변경, 삭제, 추가 등에 의해서 다른 실시 예를 용이하게 제안할 수 있을 것이나, 이 또한 본 발명의사상범위 내에 든다고 할 것이다.

최적의 발현 수준을 보이는 프로모터의 확인

도 1에 개시된 것과 같이, 발현 벡터를 제조하였다 (도 1A). 프로모터는 CaMV 35S, Mac, 또는 MacT를 도입하였다. 상기 3 종류의 각각 프로모터, 수용성 녹색형광단백질 (soluble green fluorescent protein; sGFP), Nos 종결 부위를 연결하여 발현용 바이너리 벡터(binary vector)를 완성하였다. 바이너리 (Binary)의 기본구조(backbone)로는 pCAMBIA1300을 이용하였다 (도 1A). 상기와 같이 디자인된 바이너리 벡터(binary vector)를 오버래핑 PCR (overlapping PCR)을 통해서 제작하였다. 이들 각각의 컨스트럭을 전기 천공법으로 애기장대 잎 조직에서 얻어진 원형질체에 도입하여 발현을 유도하였다. 형질 주입 한 후 카나마이신과 리팜피신(각각 50 mg/L and 100 mg/L)를 포함하는 LB plate에 28

에서 2일 동안 배양하였다. 하나의 콜로니를 선택 한 후 5 mL의 카나마이신과 리팜피신를 포함하는 LB media에서 밤새 배양하였다. 24 시간 후 상기 원형질체로부터 단백질을 추출하였다. 단백질 추출물은 추출용 버퍼(50 mM Tris pH 7.5, 150 mM NaCl, 0.1% Triton X100, 2mM DTT and 1% protease inhibitor cocktail)를 이용하여 제조하였으며, 여기에 5Х sample buffer (250 mM Tris-HCl [pH 6.8], 10% SDS, 0.5% bromophenol blue, 50% 글리세롤 v/v, and 500 mM DTT)를 최종 1Х 농도로 첨가하여 전기영동 단백질 샘플(sample)을 만들었다. 단백질 추출물 샘플을 5 분 동안 끓인 후 10% SDS-PAGE 를 통해서 분리한 후, 이후 anti-GFP antibody를 이용하여 western blot analysis를 수행하였다. 이를 통해서 CaMV 35S, Mac, 또는 Mac의 각 프로모터의 발현 수준을 비교 분석하였다. 이를 통해서 MacT 프로모터가 CaMV 35S 보다는 월등히 높으며, Mac 프로모터보다 최소한 50% 더 높은 프로모터 강도(promoter strength)를 나타내었다 (도 1).

최적의 발현 수준을 보이는 종결 부위의 확인

도 2의 도식에서 보는 바와 같은 발현 컨스트럭을 제작하였다. 프로모터는 CaMV 35S로 고정하고 종결 부위로는 효율이 높다고 알려진 HSP 종결 부위, 애기장대의 AtExt4 유전자의 종결 부위 또는 RD29B의 종결 부위를 제작하였다. 그 사이에 ER에 발현을 유도하여 높은 수준으로 축적되도록 ER 목적 신호 (targeting signal)인 BiP, 수용성 GFP 및 ER retention signal인 HDEL을 포함하는 BiP-sGFP-HDEL 유전자를 삽입하여 발현 카세트를 제작하였다. 상기와 같이 디자인된 바이너리 벡터(binary vector)를 오버래핑 PCR (overlapping PCR)을 통해서 제작하였다. 이들 각각의 컨스트럭을 전기 천공법으로 애기장대 잎 조직에서 얻어진 원형질체에 도입하여 발현을 유도하였다. 형질 주입 한 후 카나마이신과 리팜피신(각각 50 mg/L and 100 mg/L)를 포함하는 LB plate에 28

에서 2일 동안 배양하였다. 하나의 콜로니를 선택 한 후 5 mL의 카나마이신과 리팜피신를 포함하는 LB media에서 밤새 배양하였다. 24 시간 후 상기 원형질체로부터 단백질을 추출하였다. 단백질 추출물은 추출용 버퍼(50 mM Tris pH 7.5, 150 mM NaCl, 0.1% Triton X100, 2mM DTT and 1% protease inhibitor cocktail)를 이용하여 제조하였으며, 여기에 5Х sample buffer (250 mM Tris-HCl [pH 6.8], 10% SDS, 0.5% bromophenol blue, 50% 글리세롤 v/v, and 500 mM DTT)를 최종 1Х 농도로 첨가하여 전기영동 단백질 샘플(sample)을 만들었다. 단백질 추출물 샘플을 5 분 동안 끓인 후 10% SDS-PAGE 를 통해서 분리한 후, anti-GFP antibody로 western blot 분석을 수행하였다. 이후 상기 멤브레인을 쿠마시 블루로 염색하였다. 이를 통해서 RD29B의 종결 부위가 상기 세 종류의 종결 부위 중에서 가장 발현 수준이 높은 것을 확인하였다 (도 2).

도 3에 보는 바와 같이 다양한 조합의 프로모터 및 종결 부위를 발현 컨스트럭(35S::Nos-t, MacT::Nos-t, 35S::HSP-t, MacT::HSP-t, 35S::RD29B-t, MacT::RD29B-t)을 제작하였다. 그 사이에 BiP-sGFP-HDEL 유전자 (서열 번호 4)를 삽입하여 발현 카세트를 제작하였다. 그 사이에 ER에 발현을 유도하여 높은 수준으로 축적되도록 ER 목적 신호 (targeting signal)인 BiP, sGFP 및 ER retention signal인 HDEL을 포함하는 BiP-sGFP-HDEL 유전자를 삽입하여 발현 카세트를 제작하였다. 상기와 같이 디자인된 바이너리 벡터(binary vector)를 오버래핑 PCR (overlapping PCR)을 통해서 제작하였다. 이들 각각의 컨스트럭을 전기 천공법으로 애기장대 잎 조직에서 얻어진 원형질체에 도입하여 발현을 유도하였다. 형질 주입 한 후 카나마이신과 리팜피신(각각 50 mg/L and 100 mg/L)를 포함하는 LB plate에 28

에서 2일 동안 배양하였다. 하나의 콜로니를 선택 한 후 5 mL의 카나마이신과 리팜피신를 포함하는 LB media에서 밤새 배양하였다. 24 시간 후 상기 원형질체로부터 단백질을 추출하였다. 단백질 추출물은 추출용 버퍼(50 mM Tris pH 7.5, 150 mM NaCl, 0.1% Triton X100, 2mM DTT and 1% protease inhibitor cocktail)를 이용하여 제조하였으며, 여기에 5Х sample buffer (250 mM Tris-HCl [pH 6.8], 10% SDS, 0.5% bromophenol blue, 50% 글리세롤 v/v, and 500 mM DTT)를 최종 1Х 농도로 첨가하여 전기영동 단백질 샘플(sample)을 만들었다. 단백질 추출물 샘플을 5 분 동안 끓인 후 10% SDS-PAGE 를 통해서 분리한 후, anti-GFP antibody로 western blot 분석을 수행하여 sGFP의 수준을 확인하였다. 그 결과 이들 6개의 컨스트럭 중에서 MacT와 RD29B-t를 프로모터와 결정부위로 가졌을 때 sGFP의 발현이 가장 높은 것을 확인할 수 있었다 (도 3). 이를 통해서 Mac T 프로모터와 RD29B-t 종결 부위를 갖는 발현 카세트가 목적 유전자의 단백질의 발현을 증가시킨다는 것을 확인하였다.

pCAMBIA1300으로부터 pTEX1:GFP 구축 과정

하나의 바이너리 벡터가 목적 단백질과 유전자 침묵 억제 인자인 p38을 동시에 전달하도록 발현 벡터를 제작하였다. 도 4와 같이, pCAMBIA1300으로부터 Hygromycin 유전자를 제거함과 동시에 Acc65I와 SalI restriction site를 도입하였고, double 35S 프로모터의 5'말단에 BsrGI site를 도입하여 pM35M을 제작하였고, 상기 pM35M에 Acc65I와 SalI을 이용하여 tobacco codon optimized p38 (coP38) 유전자를 도입하여 pTEX0를 제조하였고, pTEX0에 다시 MacT::BiP:sGFP:HDEL::RD29B-t를 PstI과 EcoRI을 이용하여 도입하여 pTEX1:GFP를 구축하였다. . 이 때 BiP의 immediate upstream region의 5'-UTR로 5'-ggcgtgtgtgtgtgttaaaga-3' (M 5'-UTR, 서열 번호 6)를 갖도록 하여 번역 효율을 높게 유도하였다.

pMEGR의 vector map과 이를 이용한 발현 수준의 비교

상기 실시예 4에 구축한 발현 벡터용 이중 전달용 바이너리 벡터(pTEX1:GFP)를 이용하여 발현을 확인하고자 하였다. 참고 컨스트럭으로 pCAMBIA1300에 MacT::BiP:sGFP:HDEL:RD29B-t를 갖는 발현 벡터(pMEGR)을 구축하였다. 상기 두 종류의 발현 벡터 (pTEX1:GFP 또는 pMEGR) 각각을 아그로박테리움에 도입하여 배양하였다. mL의 아그로박테리움 배양액을 카나마이신 및 리팜피신(50 mg/L and 100 mg/L)을 포함하는 50ml LB 배양액에 첨가하였다. 16 시간 동안 배양 후 아크로박테리움를 8분 동안 28

에서 4000xg 조건에서 원심분리 하여 회수하였다. 상등액은 버리고 아크로박테리움의 침전물은 침윤 버퍼(10 mM MES, 10 mM MgSO4. 7H2O; pH 5.7)에 녹였다. 세포의 농도는 침윤 버퍼를 이용하여 OD600 에서 0.8 이 되도록 하였다. 그런 후 400 μM 아세토신린곤 (acetosyringone)을 아그로박테리움 용액에 첨가 하였으며, 실온에 2 시간 동안 두었다. 아그로박테리움-매개 침윤을 위해 야생종 N. benthamiana를 재배하였다. 식물은 씨를 이용하여 24℃, 40-65% 상대습도, 장일조건 (14 h 광/10 h 암 상태) 광 세기가 130-150 μE m-2 sec-1의 조건에서 재배하였다. 6주 키운 식물을 아그로박테리움-매개 침윤에 사용하였다. 사기를 이용한 침윤은 주사바늘 없는 1mL 크기의 주사기를 사용하였다. 동시에 유전자 침묵 억제 (gene silencing suppression) 유전자인 turnip crinkle virus의 코트 단백질(coat protein)의 유전자인 P38이 들어 있는 바이너리 (binary vector)를 동시-침윤하였다. 이를 위해서 두 종류의 발현 벡터 (pTEX1:sGFP 또는 pMEGR)와 P38을 각각의 아그로박테리움에 도입한 후 적절한 농도의 아그로박테리움 배양액을 1:1의 비율로 섞어서 N. benthamiana 잎에 침윤하였다. 침윤한 후 3일째에 총 단백질 추출물을 N. benthamiana 잎 조직으로부터 확보하여 웨스턴 블랏(Western blot) 분석을 수행하여 발현 수준을 확인하였다. 전체 단백질 추출물은 추출용 버퍼(50 mM Tris pH 7.5, 150 mM NaCl, 0.1% Triton X100, 2mM DTT and 1% protease inhibitor cocktail)를 이용하여 제조하였으며, 여기에 5Х sample buffer (250 mM Tris-HCl [pH 6.8], 10% SDS, 0.5% bromophenol blue, 50% 글리세롤 v/v, and 500 mM DTT)를 최종 1Х 농도로 첨가하여 전기영동 단백질 샘플(sample)을 만들었다. 단백질 추출물 샘플 (50 μg)을 5 분 동안 끓인 후 12.5% SDS-PAGE 를 통해서 전개한 후, 쿠마시 블루로 염색하였다. 또한 anti-GFP antibody로 western blot 분석을 수행하여 sGFP의 수준을 확인하였다. 그 결과 상기 발현 벡터들 (pMEGR과 pTEX1:sGFP) 모두 P38을 따로 co-infiltration하지 않아도 sGFP의 발현을 유도하였다. 하지만 P38을 추가로 co-infiltration 하였을 때 더 높은 sGFP의 발현을 보여 주었다. 또한 두 발현 벡터는 거의 같은 수준의 sGFP 발현을 보였다. 이를 통해서 P38을 자체적으로 가지고 있지만 충분히 높은 수준의 유전자 침묵 억제 인자를 위해서는 P38이 더 필요하다는 것을 확인할 수 있었다. 따라서 pTEX1에 포함된 p38의 발현을 높이는 컨스트럭을 재구축 하였다.

pTEX1, pTEX1N과 pTEX1L의 발현 벡터 map

pTEX1이 가지고 있는 P38의 발현이 충분한 유전자 침묵 억제 인자를 주지 못했기 때문에 P38의 발현 수준을 높이는 컨스트럭을 구축하고자 하였다. Original TCV-CP의 염기서열을 포함하는 pBIN based binary vector로부터 PCR을 통해 35S promoter-P38-35S terminator를 확보하여 pTEX1-EMCC에서 BsrGI과 Acc65I를 이용하여 해당 fragment를 치환하여 pTEX1N를 구축하였다. P38의 5'-UTR에 고효율 translation을 유도할 수 있는 염기서열인 5'-attattacatcaaaacaaaaa-3' (서열 번호 10)를 포함하는 L:P38을 도입하여 pTEX1L를 구축하였다. pTEX1, pTEX1N 및 pTEX1L을 이용하여 Arabidopsis의 원형질체에 transformation하여 발현을 확인하였다. 형질 주입 한 후 카나마이신과 리팜피신(각각 50 mg/L and 100 mg/L)를 포함하는 LB plate에 28

에서 2일 동안 배양하였다. 하나의 콜로니를 선택 한 후 5 mL의 카나마이신과 리팜피신를 포함하는 LB media에서 밤새 배양하였다. 24 시간 후 상기 원형질체로부터 단백질을 추출하였다. 단백질 추출물은 추출용 버퍼(50 mM Tris pH 7.5, 150 mM NaCl, 0.1% Triton X100, 2mM DTT and 1% protease inhibitor cocktail)를 이용하여 제조하였으며, 여기에 5Х sample buffer (250 mM Tris-HCl [pH 6.8], 10% SDS, 0.5% bromophenol blue, 50% 글리세롤 v/v, and 500 mM DTT)를 최종 1Х 농도로 첨가하여 전기영동 단백질 샘플(sample)을 만들었다. 단백질 추출물 샘플을 5 분 동안 끓인 후 10% SDS-PAGE 를 통해서 분리한 후, anti-TCP-CP (P38) antibody로 western blot 분석을 수행하였다. 그리고 멤브레인을 쿠마시 블루로 염색하였다. pTEX1, pTEX1N 및 pTEX1L을 애기장대의 원형질체에 형질전환 한 후 P38의 발현 수준을 비교한 결과 pTEX1이 가장 낮은 발현 수준을 보였으며, pTEX1N pTEX1보다는 2배 정도 높게 발현함을 확인할 수 있었다. 반면에 pTEX1L은 또다시 이들 pTEX1N 보다도 2 배 정도 높은 발현을 보였다 (도 6D). 이를 통해서 pTEX1L의 translational enhancer를 갖는 발현 벡터의 P38 발현 수준이 가장 높다는 것을 확인할 수 있었다.

pTEX1L에 M::BiP:sGFP:HDEL을 포함하는 construct (pTEX1L:sGFP)를 구축하고 이를 통해서 발현의 수준을 확인하였다. pCAMBIA1300벡터에 35S promoter-sGFP-HSP terminator가 들어있는 벡터, pMEGR 벡터와 pTEX1L 벡터를 운반하는 아그로박테리움(Agrobacterium)을 담배(Nicotiana benthamiana) 잎에 주사기로 단독 침윤(infiltration) 하였고, 동시에 p38과 동시 침윤시킨 후 5일 째 담배 잎으로부터 단백질을 추출하여 GFP 항체와 TCV CP 항체를 사용해 웨스턴 블랏 방법으로 BiP-sGFP-HDEL과 P38 단백질의 발현을 확인하였다 (도 7B). 그 결과 먼저 담배에서 agro-infiltration을 통한 일과성 발현도 애기장대 원형질체 transformation과 마찬가지로 MacT promoter-RD29B terminator에 의한 sGFP 발현이 35S promoter-HSP terminator 조합에 의한 발현보다 2-3배 높은 수준으로 확인되었다 (도 7). 그리고 P38 co-infiltration한 pMEGR과 P38 co-infiltration하지 않은 pTEX1L:sGFP의 sGFP 발현이 큰 차이가 없고, pTEX1L:sGFP를 P38과 co-transformation하는 경우도 sGFP의 발현에 거의 차이가 없음을 확인하였다. 이를 통해서 하나의 바이너리 벡터가 목적 단백질 및 유전자 침묵 억제 인자인 p38을 동시에 전달 할 수 있는 이중 전달용 발현 벡터를 완성하였다.

pTEX1L에 M::BiP:sGFP:HDEL 에서 sGFP 대신에 target 유전자로 human Furin 유전자를 치환하여 pTEX1L에 M::BiP:hFurin:Hisx5:HDEL construct를 도입한 construct를 구축하고 이를 Agrobacterium에 도입한 후 N. benthamiana에 발현을 유도하여 Furin:Hisx5:HDEL을 높은 수준으로 생산하였다.

pTEX1L에 M::BiP:sGFP:HDEL 에서 sGFP 대신에 target 유전자로 Tryosinogen 유전자를 치환하여 pTEX1L에 M::BiP:Trysinogen:Hisx5:HDEL construct를 도입한 construct를 구축하고 이를 Agrobacterium에 도입한 후 N. benthamiana에 발현을 유도하여 Trysinogen:Hisx5:HDEL을 높은 수준으로 생산하였다.

<110> POSTECH ACADEMY-INDUSTRY FOUNDATION <120> A method of mass production of target gene in plants <130> 1067276 <160> 10 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 1220 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Mac promoter <400> 1 agagatctcc tttgccccag agatcacaat ggacgacttc ctctatctct acgatctagt 60 caggaagttc gacggagaag gtgacgatac catgttcacc actgataatg agaagattag 120 ccttttcaat ttcagaaaga atgctaaccc acagatggtt agagaggctt acgcagcagg 180 tctcatcaag acgatctacc cgagcaataa tctccaggag atcaaatacc ttcccaagaa 240 ggttaaagat gcagtcaaaa gattcaggac taactgcatc aagaacacag agaaagatat 300 atttctcaag atcagaagta ctattccagt atggacgatt caaggcttgc ttcacaaacc 360 aaggcaagta atagagattg gagtctctaa aaaggtagtt cccactgaat caaaggccat 420 ggagtcaaag attcaaatag aggacctaac agaactcgcc gtaaagactg gcgaacagtt 480 catacagagt ctcttacgac tcaatgacaa gaagaaaatc ttcgtcaaca tggtggagca 540 cgacacgctt gtctactcca aaaatatcaa agatacagtc tcagaagacc aaagggcaat 600 tgagactttt caacaaaggg taatatccgg aaacctcctc ggattccatt gcccagctat 660 ctgtcacttt attgtgaaga tagtggaaaa ggaaggtggc tcctacaaat gccatcattg 720 cgataaagga aaggccatcg ttgaagatgc ctctgccgac agtggtccca aagatggacc 780 cccacccacg aggagcatcg tggaaaaaga agacgttcca accacgtctt caaagcaagt 840 ggattgatgt gacgcaagac gtgacgtaag tatctgagct agtttttatt tttctactaa 900 tttggtcgtt tatttcggcg tgtaggacat ggcaaccggg cctgaatttc gcgggtattc 960 tgtttctatt ccaacttttt cttgatccgc agccattaac gacttttgaa tagatacgct 1020 gacacgccaa gcctcgctag tcaaaagtgt accaaacaac gctttacagc aagaacggaa 1080 tgcgcgtgac gctcgcggtg acgccatttc gccttttcag aaatggataa atagccttgc 1140 ttcctattat atcttcccaa attaccaata cattacacta gcatctgaat ttcataacca 1200 atctcgatac accaaatcga 1220 <210> 2 <211> 1220 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Mac T promoter <400> 2 agagatctcc tttgccccag agatcacaat ggacgacttc ctctatctct acgatctagt 60 caggaagttc gacggagaag gtgacgatac catgttcacc actgataatg agaagattag 120 ccttttcaat ttcagaaaga atgctaaccc acagatggtt agagaggctt acgcagcagg 180 tctcatcaag acgatctacc cgagcaataa 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gtaaatggca agcactcaga atttag 1056 <210> 10 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> L 5'-UTR <400> 10 attattacat caaaacaaaa a 21

Claims

(i) 서열 번호 2의 염기서열을 포함하는 Mac T 프로모터(Mac T promoter);
(ii) 목적 단백질을 코딩하는 유전자;
(iii) 서열 번호 3의 염기서열을 포함하는 RD29B-t 종결 부위; 및
(iv) 유전자 침묵 억제인자 (gene silencing suppressor) 유전자;
를 포함하는, 식물에서 목적 단백질을 대량 생산하기 위한 재조합 벡터.
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제 1항에 있어서, 상기 목적 단백질은 수용성 녹색 형광 단백질 (Soluble green fluorescent protein), 항원, 항체, 항체 단편, 구조 단백질, 조절단백질, 전사인자, 독소 단백질, 호르몬, 호르몬 유사체, 사이토카인, 효소, 효소 저해제, 수송단백질, 리셉터, 리셉터의 단편, 생체방어 유도물질, 저장단백질, 이동 단백질(movement protein), 익스플로이티브 프로틴(exploitive protein), 성장인자 및 리포터 단백질로 구성되는 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상의 단백질인, 식물에서 목적 단백질을 대량 생산하기 위한 재조합 벡터.
제1항에 있어서, 상기 벡터의 기본구조(backbone)는 pCAMBIA1300인, 식물에서 목적 단백질을 대량 생산하기 위한 재조합 벡터.
삭제
제1항에 있어서, 상기 유전자 침묵 억제인자 (gene silencing suppressor) 유전자는 p38, P19, HC-Pro 및 TVA 2b로 구성되는 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상의 단백질인, 식물에서 목적 단백질을 대량 생산하기 위한 재조합 벡터.
제 1항의 재조합 벡터로 형질 전환된 형질 전환체.
제 10항에 있어서, 상기 형질 전환체는 아그로박테리움(Agrobacterium)인, 형질 전환체.
(a) 제 1항에 따른 재조합 벡터를 제작하는 단계;
(b) 상기 재조합 벡터를 세포에 도입하여 형질전환체를 제조하는 단계;
(c) 상기 형질 전환체를 배양하는 단계;
(d) 상기 배양물을 식물에 침윤하는 단계; 및
(e) 상기 식물을 분쇄하여 목적 단백질을 추출하는 단계;
를 포함하는 식물에서 목적 단백질을 생산하는 방법.
제 12항에 있어서, 상기 (d) 단계에 p38을 포함하는 재조합 벡터를 세포에 도입한 형질전환체를 추가로 식물에 침윤하는 단계를 추가하는, 식물에서 목적 단백질을 생산하는 방법.