KR102601981B1 - 변형된 측면 유동 면역진단 스트립 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 접합 패드와 검출 패드 사이에 위치한 고흡수성 폴리머 코팅 영역을 포함하는 변형된 측면 유동 면역진단 스트립 및 이의 제조방법에 관한 것이다. 본 발명에 따른 변형된 측면 유동 면역진단 스트립은 고흡수성 폴리머를 니트로셀룰로오스 막에 코팅하는 간단한 공정을 통해, 표적 물질을 포함하는 액체 시료의 점도를 조절하여 유속을 늦춤으로써, 검출 민감도를 현저하게 증가시킬 수 있으므로, 다양한 생물학적 시료 진단 분야에 활용될 수 있다.
Description
본 발명은 접합 패드와 검출 패드 사이에 위치한 고흡수성 폴리머 코팅 영역을 포함하는 변형된 측면 유동 면역진단 스트립 및 이의 제조방법에 관한 것이다.
최근 약 몇 십년 동안 바이오센서는 건강 의료, 환경, 식품 등과 같은 분야에서 큰 발전을 이루었다. 특히 현장 진단 장비(Point-of-care testing; POCT)와 같은 경우에는 세계보건기구(WHO)에서 제시한 ASSURED (Affordable, Sensitive, Specific, User-friendly, Rapid and robust, Equipment-free, Deliverable) 특성에 부합한다. 그 중에서도 종이 기반의 현장 진단법들(측면유동 면역분석법, 딥스틱, 종이 기반 미세유체 현장 진단 소자)이 많은 발전을 이루었다. 다양한 종이 기반 현장 체외 진단 장비 중 가장 많이 사용되는 것 중 하나는 측면 유동면역분석 (Lateral Flow Immunoassay, LFA) 이다. 측면 유동면역분석법은 전문적인 교육을 받지 않은 사람도 쉽게 조작할 수 있고, 저비용 및 비계측적인 포맷으로 인해 다양한 응용 분야에서 현장 테스트를 가능하게 하는 장점이 있는 진단 기술이다. 직접적 방법 중 하나인 샌드위치 기반의 LFA 가 가장 널리 사용되고 있다.
샌드위치 LFA의 기본적인 원리는 표지 물질이 접합되어 있는 1차 항체와 검출대상 표적 항원이 결합 후 고정화되어 있는 2차 항체에 결합되는 방식이다. 이 분석에서는 종이를 기반으로 하여 모세관 현상을 통해 물질들이 이동한다. 하지만 상대적으로 낮은 정확성 (교차 반응, 높은 최소 검출 농도 등)으로 인하여, 왁스, thread, 하이드로겔을 종이 위에 무늬화 하거나, 종이 자체의 디자인이나 아키텍쳐를 수정하여 정확성을 높이기 위한 연구가 이루어졌다.
그러나 이러한 방법은 종이 위에 무늬화하거나 디자인을 수정하는 등의 별도의 절차, 공정, 장치가 필요한 단점이 있어, 보다 간편한 방법으로 샌드위치 LFA 의 검출능을 개선할 수 있는 방법에 대한 필요성이 있다.
본 발명자들은 샌드위치 LFA 검출능을 개선할 수 있는 방법을 연구하던 중, 기존 방법과 달리 모세관 현상을 통한 물질 수송과정에서 고흡수성 폴리머(Superabsorbent polymer, SAP) 를 이용하면, 간단한 방식으로 검출 민감도를 높일 수 있음을 확인하고 본 발명을 완성하였다.
따라서 본 발명은 측면 유동 면역 진단 스트립에 있어서, 접합 패드와 검출 패드 사이에 위치한 고흡수성 폴리머 코팅 영역을 포함하는 변형된 측면 유동 면역진단 스트립, 이의 제조방법, 이를 이용한 액체 시료 내 표적 물질 검출 방법을 제공하는 것을 목적으로 한다.
상기와 같은 목적을 달성하기 위해서, 본 발명은 측면 유동 면역 진단 스트립에 있어서, 접합 패드와 검출 패드 사이에 위치한 고흡수성 폴리머 코팅 영역을 포함하는 변형된 측면 유동 면역진단 스트립을 제공한다.
또한 본 발명은 1) 니트로셀룰로오스 막에 고흡수성 폴리머를 첨가하는 단계; 2) 상기 1) 단계의 고흡수성 폴리머 첨가 니트로셀룰로오스 막을 건조시켜 고흡수성 폴리머가 코팅된 니트로셀룰로오스 막을 제조하는 단계; 및 3) 상기 고흡수성 폴리머가 코팅된 니트로셀룰로오스 막을 접합 패드와 검출 패드 사이에 연결하는 단계;를 포함하는, 변형된 측면 유동 면역진단 스트립의 제조방법을 제공한다.
또한 본 발명은 상기 본 발명의 변형된 측면 유동 면역진단 스트립의 시료 패드에 검출 대상 액체 시료를 로딩하는 단계; 를 포함하는 액체 시료 내 표적 물질 검출 방법을 제공한다.
본 발명에 따른 변형된 측면 유동 면역진단 스트립은 고흡수성 폴리머를 니트로셀룰로오스 막에 코팅하는 간단한 공정을 통해, 표적 물질을 포함하는 액체 시료의 점도를 조절하여 유속을 늦춤으로써, 검출 민감도를 현저하게 증가시킬 수 있으므로, 다양한 생물학적 시료 진단 분야에 활용될 수 있다.
도 1은 합성된 AuNP 를 색변화를 통해 확인한 결과(A), AuNP 의 합성 및 형태를 UV-vis spectroscopy (B), 및 TEM(C) 을 이용하여 확인한 결과를 나타낸 도이다.
도 2는 AuNP와 항체에 적합한 농도를 Gold aggregation test(GAT) 실험을 통해 확인하고, 농도에 따른 색변화를 확인한 결과를 나타낸 도이다.
도 3은 AuNP 및 AuNP/항체 접합을 UV-vis spectrum 으로 확인한 결과를 나타낸 도이다 (초록색: 10 ㎕, 파란색: 20㎕, 갈색: 40㎕, 연두색: 80㎕ 항체 첨가 실험군).
도 4는 시험 스트립의 제조과정을 나타낸 도이다.
도 5는 본 발명에 따른 변형된 측면 유동 면역진단 스트립의 구조를 나타낸 도이다.
도 6은 시험 스트립에서 고흡수성 폴리머 (SAP) 농도에 따른 효과를 확인한 결과를 나타낸 도(왼쪽부터 비-변형 대조군, 0.05%, 0.1%, 0.25%, 0.5%, 1% SAP) 이다.
도 7은 1% SAP 으로 변형된 니트로셀룰로오스 막의 SEM 이미지를 나타낸 도이다.
도 8은 다양한 SAP 농도 및 항체 농도에 따른 HIgG 검출능을 정량적으로 비교한 결과를 나타낸 도이다.
도 9는 유체 흐름에 대한 SAP 농도의 효과를 확인(A)한 결과 및 상이한 SAP 농도 하의 최적 상응 지연 시간(B) 을 나타낸 도이다.
도 10은 10, 50, 100, 200, 300, 및 600 초에서 종이 스트립의 유체 포화도를 측정한 결과를 나타낸 도이다(A: 비-변형된 LFA, B: SAP 변형된LFA).
도 2는 AuNP와 항체에 적합한 농도를 Gold aggregation test(GAT) 실험을 통해 확인하고, 농도에 따른 색변화를 확인한 결과를 나타낸 도이다.
도 3은 AuNP 및 AuNP/항체 접합을 UV-vis spectrum 으로 확인한 결과를 나타낸 도이다 (초록색: 10 ㎕, 파란색: 20㎕, 갈색: 40㎕, 연두색: 80㎕ 항체 첨가 실험군).
도 4는 시험 스트립의 제조과정을 나타낸 도이다.
도 5는 본 발명에 따른 변형된 측면 유동 면역진단 스트립의 구조를 나타낸 도이다.
도 6은 시험 스트립에서 고흡수성 폴리머 (SAP) 농도에 따른 효과를 확인한 결과를 나타낸 도(왼쪽부터 비-변형 대조군, 0.05%, 0.1%, 0.25%, 0.5%, 1% SAP) 이다.
도 7은 1% SAP 으로 변형된 니트로셀룰로오스 막의 SEM 이미지를 나타낸 도이다.
도 8은 다양한 SAP 농도 및 항체 농도에 따른 HIgG 검출능을 정량적으로 비교한 결과를 나타낸 도이다.
도 9는 유체 흐름에 대한 SAP 농도의 효과를 확인(A)한 결과 및 상이한 SAP 농도 하의 최적 상응 지연 시간(B) 을 나타낸 도이다.
도 10은 10, 50, 100, 200, 300, 및 600 초에서 종이 스트립의 유체 포화도를 측정한 결과를 나타낸 도이다(A: 비-변형된 LFA, B: SAP 변형된LFA).
본 발명은 측면 유동 면역 진단 스트립에 있어서, 접합 패드와 검출 패드 사이에 위치한 고흡수성 폴리머 코팅 영역을 포함하는 변형된 측면 유동 면역진단 스트립 및 이의 제조방법, 이를 이용한 액체 시료 내 표적 물질 검출 방법에 관한 것이다.
본 발명의 변형된 측면 유동면역진단 스트립(LFA)은 접합 패드와 검출 패드 사이에 위치한 고흡수성 폴리머(SAP) 코팅 영역을 포함하여, 액체 시료의 유속을 늦춤으로써 비-변형된 LFA와 비교하여 검출 민감도를 현저하게 개선 가능하다.
이하, 본 발명을 상세히 설명한다.
본 발명의 변형된 측면 유동면역진단 스트립은 접합 패드와 검출 패드 사이에 위치한 고흡수성 폴리머 코팅 영역 구성 외 기본적인 측면 유동면역진단 스트립의 구성을 포함할 수 있다.
본 발명에 있어, 고흡수성 폴리머(superabsorbent polymer, SAP)는 종이칩 기반의 스트립 상에서 모세관 현상을 이용하여 시료 패드에서 흡수패드 쪽으로 이동하는 검출 대상 액체 시료의 유속을 조절할 수 있고, 이를 통해 검출 민감도를 높일 수 있다. 상기 고흡수성 폴리머는 바람직하게는 저밀도 가교 고흡수성 폴리머일 수 있고, 저밀도 가교 고흡수성 폴리머는 고가교성 고흡수성 폴리머와 달리 단단한 입자를 형성하지 않는 미세입자 형태로 물을 흡수하면 부드럽고 점성이 생기는 성질을 이용하여 액체 시료의 유속을 적절하게 조절할 수 있다.
상기 고흡수성 폴리머는 이에 제한되는 것은 아니나, 예컨대 가교결합된 폴리아크릴레이트, 전분-아크릴로니트릴 그래프트 중합체의 중화물, 아크릴로니트릴 공중합체의 가수분해물, 아크릴아미드 공중합체의 가수분해물, 바이오 셀룰로오스 및 카라기난로 이루어진 군에서 선택된 1 종 이상일 수 있으며, 바람직하게는 폴리아크릴레이트 기반의 폴리머, 예컨대 폴리아크릴산나트륨 (sodium polyacrylate)일 수 있다.
또한 상기 고흡수성 폴리머는 액체 시료의 이동을 저해하지 않으면서, 적절한 유속 조절이 가능한 농도로 니트로셀룰로오스 막에 코팅되는 것이 바람직하고, 예컨대 바람직하게는 0.01 내지 0.8%(w/v)의 농도, 더욱 바람직하게는 0.05 내지 0.5%(w/v) 로 첨가하여 코팅될 수 있다. 고흡수성 폴리머의 농도가 너무 낮은 경우, 점도를 적절하게 부여할 수 없어 목적하는 액체 시료의 유속 저하가 달성되지 않을 수 있고, 농도가 너무 높은 경우, 모세관 현상을 통해 이동하는 액체 시료의 이동을 막아, 검출 패드까지 액체 시료가 도달하지 못할 수 있다. 본 발명의 바람직한 구현예에서는 0.5%(w/v) 의 고흡수성 폴리머가 가장 최적의 지연 시간을 달성할 수 있음을 확인하였다.
본 발명의 고흡수성 폴리머 코팅 영역은 접합 패드와 검출 패드 사이의 일부 또는 전체 영역에 위치한 것일 수 있으며, 접합 패드를 통과한 액체 시료가 모세관 현상을 통해 검출 패드 방향으로 이동하는 경로상에 위치하여, 액체 시료의 유속을 조절할 수 있다. 바람직하게 고흡수성 폴리머 코팅 영역은 접합 패드에 인접하여 위치하는 것일 수 있다. 보다 구체적으로 상기 “인접하여 위치” 하는 것은 접합 패드의 말단과 일부 중첩하여, 또는 바로 이어지도록 위치하는 것을 모두 포함한다.
본 발명의 변형된 측면 유동 면역진단 스트립은 일반적인 비-변형된 측면 유동 면역진단 스트립의 구조도 함께 포함할 수 있으며, 예컨대 순차적으로 배치된 시료 패드, 접합 패드, 고흡수성 폴리머 코팅 영역, 검출 패드 및 흡수 패드를 포함할 수 있다.
상기 시료 패드는 지지체의 상부에 위치하며, 검출하고자 하는 표적물질을 포함한 액체 시료, 예컨대 혈청, 혈장, 소변, 침, 기타 바이오 액체 시료들이 주입되는 영역이다. 시료들은 모세관 현상에 따라 이동하므로, 상기 시료 패드는 이동 경로상 최선단에 위치한다.
상기 접합 패드는 지지체 상부에 위치하며 시료 패드 다음에 순차적으로 연결된다. 접합 패드는 샌드위치 LFA 를 수행하기 위하여 1차 항체에 표지물질이 접합된 접합체를 포함하는 패드이다. 1차 항체는 표적 물질에 특이적으로 결합할 수 있는 항체를 의미하며, 1차 항체에 접합되는 표지 물질은 특정 표지물질에 한정되지 않고 결합 포화도에 따라 특정 세기의 형광 발현을 일으킬 수 있어, 검출 결과의 정성적 표지와 진단 수준의 정량적 표지가 가능 물질로 금-나노입자(Gold-nano particle), 형광 비드(Fluorescence bead), FITC(poly L-lysine-fluorescein isothiocyanate)와 같은 형광분자 또는 HRP(horseradish peroxidase)와 같은 발색효소 등의 형태를 제한 없이 포함할 수 있다. 본 발명의 일 구현예에서는 금 나노입자(AuNP) 를 표지물질로 사용하였으며, 1차 항체와 AuNP 를 접합시켜 접합 패드에 코팅하였다. AuNP 를 표지물질로 사용하면, 색 감도를 육안으로 확인할 수 있고, 형광 검출과 달리 시간이 지나도 반영구적인 검출이 가능하다는 장점이 있다.
시료 패드에 주입된 액체 시료는 접합 패드로 이동하여, 접합 패드 내부의 표지 물질이 접합된 1차 항체와 시료 내 포함된 표적 물질 사이에 항원-항체 반응을 일으켜 상호 특이적으로 결합한다. 이를 통해 시료 내 존재하는 표적 물질은 표지 물질에 의하여 표지될 수 있다.
시료는 접합 패드를 통과하여 고흡수성 폴리머가 코팅된 니트로셀룰로오스 영역으로 이동한다. 상기 영역에는 고흡수성 폴리머가 코팅되어 있으므로, 시료와의 상호작용을 통해 최적의 동적 점도를 달성할 수 있으며, 유체의 흐름을 지연시킴으로써, 표적 물질과 표지물질- 1차 항체 접합체 간의 반응 정도를 개선하여 검출 민감도 개선을 달성할 수 있다. 따라서, 상기 고흡수성 폴리머 코팅 영역은 접촉된 시료의 동적 점도를 증가시켜 유속을 늦추는 것을 특징으로 할 수 있다.
고흡수성 폴리머가 코팅된 니트로셀룰로오스 영역을 통과한 시료 내 표적물질은 표지물질- 1차 항체 접합체, 본 발명의 일구현예에 따르면 AuNP-anti-human IgG 와 충분한 접합/결합이 이루어진다.
시료는 순차적으로 검출 패드로 이동하게 되며, 상기 검출 패드는 분리된 시험 라인과 대조 라인을 포함한다. 검출 패드는 표적물질의 유무를 최종적으로 검출하는 역할을 하며, 시험 라인은 고정화된 포획제로 표지물질 및 표적물질과 접합된 상태의 1차 항체와 결합하는 2차 항체를 포함할 수 있다. 만약 시료 내 표적물질이 존재하지 않는 경우, 표지물질만 접합된 상태의 1차 항체는 시험 라인을 지나 흡수 패드 방향으로 이동하며, 대조 라인의 1차 항체에 결합하는 대조 항체와 결합한다.
또한 본 발명은 1) 니트로셀룰로오스 막에 고흡수성 폴리머를 첨가하는 단계; 2) 상기 1) 단계의 고흡수성 폴리머 첨가 니트로셀룰로오스 막을 건조시켜 고흡수성 폴리머가 코팅된 니트로셀룰로오스 막을 제조하는 단계; 및 3) 상기 고흡수성 폴리머가 코팅된 니트로셀룰로오스 막을 접합 패드와 검출 패드 사이에 연결하는 단계;를 포함하는, 변형된 측면 유동 면역진단 스트립의 제조방법에 관한 것이다.
본 발명의 제조방법은 상기 고흡수성 폴리머를 니트로셀룰로오스 막에 1 내지 5㎕ 첨가하는 것을 특징으로 할 수 있다.
또한 상기 제조방법은 통상적인 측면 유동 면역진단 스트립의 제조방법에 고흡수성 폴리머가 코팅된 니트로셀룰로오스 막을 제조하는 단계를 추가하여 변형한 것일 수 있으며, 측면 유동 면역진단 스트립의 구성인 시료 패드, 접합 패드, 흡수 패드를 제조하고, 이를 시료 패드, 접합 패드, 고흡수성 폴리머가 코팅된 니트로셀룰로오스 막 및 흡수 패드 순으로 백킹 카드, 즉 지지체에 조립하는 단계를 더 포함하는 방법일 수 있다.
상기 제조방법에 있어, 앞서 기술된 변형된 측면 유동 면역진단 스트립에 대한 설명이 동일하게 적용된다.
또한 본 발명은 본 발명의 변형된 측면 유동 면역진단 스트립의 시료 패드에 검출 대상 액체 시료를 로딩하는 단계; 를 포함하는 액체 시료 내 표적 물질 검출 방법을 제공한다.
본 발명에 있어서, 상기 액체 시료는 고흡수성 폴리머 첨가 니트로셀룰로오스 막 영역을 통과하며, 비-변형 측면 유동 면역진단 스트립 대비 유속이 감소되는 것일 수 있으며, 이를 통해 검출 민감도가 증진될 수 있다.
이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 바람직한 실험예 및 실시예를 제시한다. 그러나 하기의 실시예는 본 발명을 보다 쉽게 이해하기 위하여 제공되는 것일 뿐, 실험예 및 실시예에 의해 본 발명의 내용이 한정되는 것은 아니다.
실험예
1. 재료 및 방법
Gold(III) chloride trihydrate (HAuCl4·3H2O, 99%), 인간 혈청 유래 인간 IgG (I2511), 항-인간 IgG (polyclonal antibody developed in goat; I1886) 및 항-인간 IgG (γ체인 특이적)-비오틴 (polyclonal antibody developed in goat; B1140), 구연산 나트륨(trisodium citrate dehydrate), 제일인산칼륨(potassium phosphate monobasic, KH2PO4), Tween 20 및 BSA(bovine serum albumin)는 Sigma-Aldrich에서 구매하였다. Anti-goat IgG (polyclonal anti- body produced in chicken; ab86245)는 Abcam에서 구매하였다. 저밀도 가교성 고흡수성 폴리머(superabsorbent polymer, SAP)인 폴리아크릴산나트륨(Sodium polyacrylate, polymerization degree 22,000~70,000)은 Fujifilm Wako Pure Chemical Co. 에서 구매하였다. 수크로오스, 탄산칼륨(K2CO3), 폴리비닐알코올(PVA) 500은 Junsei Chemical Co., Ltd. (Tokyo, Japan)에서 구매하였다. LFA 칩 제작을 위한 모든 재료들은 Bore Da Biotech Co. Ltd. (Seongnam, Korea)에서 구매하였다: 흡수 패드(Absorbent pad), 니트로셀룰로오스 막(nitrocellulose membrane), 시료 패드(sample pad), 접합 패드(conjugation pad), 백킹 카드(backing card). 수학적 계산에는 Multiphase Flow in Porous Media interface를 기반으로 하는 Comsol Multiphysics 5.5 software를 사용하였다. 정량적 분석 및 니트로셀룰로오스 막의 기공 크기 측정에는 이미지 처리 소프트웨어 프로그램인 ImageJ (National Institutes of Health, USA)를 사용하였다. 모든 용액은 탈 이온수를 사용하여 준비하였다.
실험예
2. 금 나노입자의 합성
40nm 금 나노입자 (AuNPs)를 seeded growth 방법으로 합성하였다. 구체적으로 구연산 나트륨 용액(2.2 mM 및 150 mL)을 3구 둥근 바닥 플라스크에 주입하고 15분 동안 가열한 후 응축기에 의해 용액의 증발을 차단하였다. 그 후 HAuCl4(25 mM) 1mL를 첨가하여 10분간 반응시켰다. 연노란색에서 진한 붉은색으로 색 변화가 관찰되었으며, 용액은 연속적인 교반 하에 실온에서 냉각되었다. 이 제재에서 사용된 모든 유리 제품은 사전에 aqua regia로 세척하고, 증류수로 헹구었다. 이러한 과정 이후에, 샘플을 수집하고 TEM, UV-vis spectroscopy으로 확인하였다. 합성된 AuNP 를 확인한 결과를 도 1에 나타내었다.
도 1에 나타낸 바와 같이, 붉은 색의 색 변화가 관찰되었으며 (A), UV-vis spectroscopy (B), 및 TEM 을 이용하여 금 나노입자의 합성 및 형태를 확인하였다. 합성된 AuNP의 전형적인 최대 흡수 밴드가 흡광도 스펙트럼을 통해 526 nm에서 관찰되었으며 이러한 결과는 크기 분포가 일정한 현탁액의 형성을 입증한다. TEM이미지 분석을 통해 AuNP의 평균 직경은 35±2 nm으로 균질함을 확인하였다.
실험예
3. 금 나노입자와 항체의 접합
제조된 AuNP를 항-인간 IgG 항체와 결합하였다. 구체적으로 먼저, AuNP 현탁액의 pH를 0.25 M K2CO3 용액을 사용하여 0.1M 보로네이트 완충액 (pH 7)으로 조정하였다. 그 후 100 μg의 100 μg/mL 항-인간 IgG (γ체인 특이적)-비오틴 수용액을 1.5 mL의 AuNP 현탁액에 첨가하였다. 생성된 용액을 650rpm에서 20분 동안 배양하였다. 그 다음, 100μL의 1mg/mL BSA 수용액을 첨가하고 650rpm에서 추가로 20 분 동안 계속 교반하였다. 마지막으로 그 용액을 10,000rpm 및 4℃에서 20분 동안 원심분리하였다. 상층액을 제거하고 AuNP/항-인간 IgG는 500μL의 보로네이트 완충액 (2 mM, pH 7.4, 5% 수크로오스)에 재현탁하였다.
인간 IgG 에 특이적인 항체와 접합된 AuNP 를 이용하여 Gold aggregation test(GAT)을 진행하여 AuNP에 접합하는데 사용할 항체의 최소 농도를 결정하였다: pH 7에서 20μg/mL HIgG. NaCl과 같은 고농도의 염은 AuNP에서 표면전하를 탈구시키는 역할을 하고, 이에 따라 표면의 불안정성이 올라가서 AuNP의 응집을 유발한다. 하지만 NaCl은 Au-S 결합을 끊을 수 없기 때문에, AuNP 표면이 항체로 덮여있으면 그러한 현상은 발생할 수 없다. AuNP 와 항체를 40uL 부피의 각각 다른 농도로 준비하였고, 40nm AuNP 용액으로 나눠 담았다. 이 후, 10% NaCl 100uL 용액을 첨가하고 5분 동안 지속교반하였다. AuNP 응집을 방지하기 위한 최소 항체 농도는 GAT 이후 육안으로 색 변화(빨간색에서 보라색/무색)를 통하여 확인하였고, 그 결과를 도 2에 나타내었다.
도 2에 나타낸 바와 같이, AuNP에 접합된 항체의 농도가 낮을수록 육안으로 보이는 색 변화가 점점 무색으로 변하는 것을 확인했다.
또한 금나노입자에 10, 20, 40 및 80㎕의 접합 항체를 각각 첨가하고, 각 실험군에 고농도의 염으로 10% NaCl 을 첨가하여, UV-vis spectrum 을 확인하고, 항체의 최소 농도를 선정하였으며, 그 결과를 도 3에 나타내었다.
도 3에 나타낸 바와 같이, AuNP 용액의 UV-vis spectrum을 확인한 결과, AuNP에 접합된 항체의 농도에 따라 상이한 피크값이 나타났으며, 접합된 항체의 농도가 낮을수록 최대 흡광도 피크는 더 오른쪽으로 이동하였다. 보다 구체적으로 항체를 10㎕ 첨가한 실험군(초록색)에서는 AuNP가 항체에 충분히 접합되지 않아, AuNP 표면이 노출되었고, 고농도의 염에 의해 응집이 발생하여 색이 무색으로 변화한 결과, UV-vis 파장이 오른쪽으로 이동하였다. 반면 20㎕ 이상의 항체를 첨가한 실험군에서는 모두 AuNP 의 표면이 항체에 의해 완전히 코팅되어 AuNP 의 고유의 빨간색이 계속 유지되었고, UV-vis 스펙트럼의 변화가 나타나지 않았다. 상기의 결과를 종합하여, 필요한 접합 항체의 최소 농도를 20㎕ 으로 선정하였다.
실험예
4. 변형된 측방 유동 시험 스트립의 제조
시험 스트립은 시료 패드, 접합 패드, 니트로셀룰로오스(NC) 막, 및 흡수 패드로 구성하였다. 구성 요소들을 조립하기에 앞서, 시료 패드는 10 mM PBS, 5% BSA 및 0.05% tween 20에 담그고 60℃에서 2시간 동안 건조하여 준비하였다. 접합 패드를 0.05 % PVA 및 0.05% Tween 20으로 흡수시키고 실온에서 24시간 동안 건조하였다. 접합 패드를 AuNP/항-인간 IgG 분산액으로 적셔서 데시케이터로 밤새 실온에서 건조시킨 후 0.5μL의 1 mg mL-1 anti-human IgG (whole molecule), anti-goat IgG 용액들을 각각 시험 라인(test line), 대조 라인(control line)으로 고정하였다. 측방 유도 면역분석(Lateral flow immunoassay, LFA)을 기초로 다양한 부피 및 농도의 저밀도 가교성 고흡수성 폴리머(superabsorbent polymer, SAP)를 접합 패드 근처의 NC 막의 빈 영역을 덮기에 적합하도록 NC 막에 3㎕ 를 추가하여 LFA를 변형하였다. 그 다음, SAP 가 추가된 NC 막을 37℃에서 1시간 동안 건조시켜 SAP이 코팅된 NC 막을 준비하였다. 준비된 시료 패드, 접합 패드, SAP 이 코팅된 NC 막 및 흡수 패드를 백킹 카드에 조립하였다. 그 후 준비된 카드를 4 mm 스트립으로 절단하여 변형된 LFA 스트립을 얻었다. 변형된 LFA 스트립의 제조방법과 이들의 형태를 도 4 및 도 5에 모식화하여 나타내었다.
도 4 및 도 5에 나타낸 바와 같이, 본 발명의 제조방법에 의해 제조된 변형된 LFA 스트립은 접합 패드 후 시료의 이동 경로 상에 SAP로 변형된 영역이 존재하고, 시료 패드에 위치시킨 시료는 접합 패드를 거쳐 SAP 변형 영역을 지나 시험 라인 및 대조 라인에 도달하게 된다.
실시예
1.
실험 방법
상기 실험예 4 에서 제조된 변형된 LFA 를 이용하면, 복잡한 추가 장비 없이 향상된 감도로 표적 물질의 진단 테스트를 수행할 수 있는지 여부를 확인하기 위한 실험을 수행하였다. 먼저 10 ng/mL 내지 500 ng/mL 범위의 PBS (10 mM, pH 7.4)에서 200μL의 서로 다른 인간 IgG (HIgG) 농도의 표적 용액을 시료 패드에 로드하고 20분간 유지하였다. 그 후, 과잉 AuNP/항체를 씻어내기 위해 200μL의 PBS를 추가했다. 시료 패드에 동일한 양의 버퍼를 피펫팅하여 수행했으며, LFA 시스템에서 샌드위치 분석 기반의 시약의 자세한 반응과정은 이전 연구에 설명되어 있다(Parolo, C., Medina-Sanchez, M., de la Escosura-Muniz, A. & Merkoci, A. Simple paper architecture modifications lead to enhanced sensitivity in nanoparticle based lateral flow immunoassays. Lab Chip 13, 386-390 (2013)). 실험의 신뢰성을 검증하기 위해 모든 측정 테스트는 3회 반복되었다. 실험 이미지에서 colorimetric signal를 얻은 후 ImageJ Software에서는 이러한 광학 신호의 평균값과 오차 막대를 계산하여 타겟 분석물질의 양을 정량 분석하였다. 실험에 사용된 저밀도 SAP는 0.05%, 0.1%, 0.25%, 0.5%, 1% w/v 로 달리하여 NC 막에 추가하였다.
모세관 현상 및 상대 투과도에 관련한 Brooks and Corey 모델을 time-dependent 기반 시뮬레이션에 사용하였고, 그리고 막의 다공성 및 진입 압력 등 초기 조건에 필요한 매개 변수들은 이전 연구를 참고하여 설정하였다(Masoodi, R. & Pillai, K. M. Darcy's law-based model for wicking in paper-like swelling porous media. AIChE J. 59, NA-NA (2010)). 모델을 단순화하기 위해 종이 스트립의 2D 모델은 NC 막으로만 이루어지며, 대기 포화도와 수압을 고려하였다. 그리고 위상 수송의 경우 바닥 경계에서 공기 위상에 대해 가정된 Flux가 없으며, 상단 경계에서 Darcy 모델에 주어진 압력 구배로 인한 공기상의 질량 유속을 정의하였다. SAP에 의한 매개 변수는 다공성 구조와 기공 크기에 영향을 주지 않는 것으로 가정되었고, SAP에 의해 변환된 동적 점도와 모세관 현상만을 고려하였다. 도메인은 초기에 주로 공기로 채워져 있으며, 초기의 유체 포화도는 0.01으로 설정되었다. 변형된 LFA에서 다공성 미디어의 액체 흐름을 시뮬레이션 하기 위해 동적 점도와 압력의 영향을 나타내는 Darcy의 법칙을 사용할 수 있다.
여기서 Q는 체적 유량, к는 유체에 대한 종이의 상대 투과도, μ는 유체의 점도, A는 흐름의 단면적, dP/dL은 단위 길이에 따른 압력차이고 L은 다공성 미디어의 길이이다. 종이 스트립 모델에서 체적 유량은 배출 점도에 따라 다르다. 이러한 방식으로 서로 다른 패드의 동적 점도와 시간에 따른 유체 포화도를 추정할 수 있다.
1. 변형된
LFA
를 이용한 분석 수행
1.1 저밀도 가교
SAP 로
변형된
LFA
의 진단 효과 확인
저밀도 가교 SAP 로 변형된 LFA 의 진단 효과를 확인하기 위하여, 저밀도 SAP 고정화 후, 시험 라인에서의 색상 강도 변화를 확인하였고, 그 결과를 도 6에 나타내었다.
도 6에 나타낸 바와 같이, 저밀도 가교 SAP 고정화 후, 유체 유동의 지연 효과로 인해 시험 라인에서 명백한 색상 강도의 증가가 관찰되었다. 저밀도 가교 SAP 비율이 증가할수록 동적 점도의 증가와 다공성 벽에 의해 시험 라인 밴드가 더 좁아지고 더 집중되는 경향을 보였으며, 0.5% 저밀도 SAP는 250ng/ml HIgG 의 검출에 최적화된 것을 확인하였다.
1.2. SAP 코팅에 따른 NC 막 구조 변화 확인
각 수정된 프로세스 후 저밀도 가교 SAP와 NC 막의 상호 작용을 확인하기 위해 SEM(scanning electron microscopy)를 통해 표면 구조를 특성화하였다. 스트립은 흐름 후 그리고 SEM 이미지가 촬영되기 전에 재동결 건조되었다. 변형되지 않거나 SAP로 처리된 대부분의 NC 막은 평균 기공 직경이 17.18±4.27 nm으로 균질 했으며, 어떠한 형태적인 변화나 막의 손상을 관찰할 수 없었다. 기공 크기는 SAP 농도에 따라 변화가 없었으며 이는 SAP가 유체의 점도에만 영향을 미치며 막의 다공성 구조에는 영향을 주지 않음을 입증한다. 그러나 고농도의 SAP 처리된 NC 막에서는 배경 노이즈가 관찰되었으며, 이를 도 7에 나타내었다.
도 7에 나타낸 바와 같이, 1% SAP로 변형된 NC 막의 SEM 이미지에서는 SAP가 막을 변형시켰음을 확인하였다. 이는 유체 동적 점도의 상승이 생체 물질의 이동을 방해함을 시사한다. 이러한 결과는 상대적으로 높은 동적 점도와 유동성 지연으로 인해 로딩 시료에서 상당한 양의 분석물과 AuNP/항체간의 결합이 NC 막을 통해 완전히 흐르지 못하게 되는 것으로 추측되었다.
1.3. SAP 코팅에 따른 검출 효과 정량화
인간 IgG 의 농도를 10 내지 500ng/ml (10, 50, 100, 250, 500 ng/ml)로 달리하고, SAP을 0.05 내지 0.5% 로 달리하여 제조된 시험 스트립에서의 검출 효과를 정량화하여 도 8에 나타내었다.
도 8에 나타낸 바와 같이, 더 높은 농도의 HIgG가 검출될 때 정규화된 신호 강도가 증가하였다. 변형되지 않은 NC 막과 비교하여, SAP 으로 변형된 NC 막에서 신호 강도가 강하게 나타났으며 SAP 의 농도가 증가할수록 더 강한 신호가 검출되는 것을 확인하였다.
각 조건에서 얻은 민감도를 조사하기 위해 10에서 500ng/mL까지 교정 곡선을 수행했다. 각 조건의 색상 강도는 신호 강도에서 배경 노이즈의 영역의 평균 밝기를 빼서 보정하였고, 이전 실험 결과에 따라 NC 막의 다공성 구조에 영향을 줄 정도로 배경 노이즈가 높은 고농도의 SAP(1% 이상 SAP)를 제외하였다. 예상대로, 더 높은 SAP 농도를 사용할 때 더 높은 민감도가 달성되었다. 결과적으로 0.5% SAP를 사용할 때 가장 높은 감도를 얻을 수 있었고 이는 변형되지 않은 LFA와 비교했을 때 최대 3배 향상되었다.
2. 분석 시간 단축 효과 확인
2.1 SAP 변형된
LFA
의 개선된 신속성 확인
최적화된 초기 조건에 따라 SAP의 다양한 농도에서 달성된 분석 시간 지연을 평가했다. 전체 분석 시간은 AuNP가 변형되지 않거나, 다른 농도의 SAP (0.05%, 0.1%, 0.25%, 0.5%) 코팅된 NC 막에 도달한 순간부터 흡수 패드를 통과할 때까지 측정되었다. 또한, NC 막을 통한 AuNP의 위킹 거리를 시간별로 측정하여 지연 시간을 계산하였다. 결과를 도 9 및 도 10에 나타내었다.
도 9의 A에 나타낸 바와 같이, SAP 코팅 농도에 따라 지연 시간은 상이하게 나타났으며, 각 SAP 농도에 따른 최적의 지연 시간을 도 9B 에 나타내었다. SAP 코팅된 영역에서 체류 시간으로 731 초가 소요된 0.5% SAP를 사용한 실험군에서 최적의 지연 시간을 달성하였다.
예상대로 LFA 위킹 거리를 측정한 결과, SAP 코팅 농도가 증가함에 따라 액체의 유속이 점차 감소함을 확인하였다. 이는 SAP 농도가 증가하면 유체의 동적 점도가 올라가고, NC 막 내의 투과성이 감소하여 생체 물질 간의 방해 가능성이 생기기 때문이다. 특히 0.5% SAP를 사용했을 때 가장 긴 체류 시간 (731초)을 달성하였고, 1% 이상 SAP 변형된 LFA는 NC 막 내 AuNP/항체와 SAP 덩어리로 생성된 다공성 벽에 가로막혀 체류시간이 측정되지 않은 것으로 판단되었다.
2.2 SAP 변형된
LFA
의 유체포화도 및 지연 시간 확인
LFA의 액체 유속에 대한 위와 같은 결과를 더 잘 이해하기 위해 수학적 모델을 구축하고, 이를 사용하여 LFA의 NC 막을 통과하는 유체 포화도 및 지연 시간을 시뮬레이션 하였다. 보다 구체적으로 물과 비교하여 3배 높은 점도의 유체를 흘려주는 경우를 가정하여 증가한 점도에 따른 유속 지연 효과를 시뮬레이션 하였으며, 그 결과를 도 10 에 나타내었다.
도 10 에 나타낸 바와 같이, 시뮬레이션 상 10, 50, 100, 200, 300, 600초에서, 변형되지 않은 LFA (A) 와 SAP 코팅으로 변형된 LFA에 대응되는 높은 점도의 유체를 흘려주는 변형된 LFA(B)의 유체 포화도는 상이하게 나타났으며, 점도를 조절한 LFA의 변형이 유체 포화도를 지연시킴을 확인하였다. 이는 SAP 변형을 통해 유체의 동적 점도를 증가시킴으로써 LFA 에서 액체의 유속을 늦출 수 있음을 보여주는 결과이다.
상기와 같은 결과는 SAP 으로 변형된 LFA 가 SAP 와 로딩 시료 상호작용을 통해 최적의 동적 점도를 달성하고, HIgG 와 AuNP/항체 접합체 간의 반응 정도를 크게 높여, 추가 장비 없이도 반응 신호의 증폭이 가능함을 보여주는 결과이다.
Claims (11)
- 측면 유동 면역 진단 스트립에 있어서,
접합 패드와 검출 패드 사이에 위치한, 고흡수성 폴리머(superabsorbent polymer, SAP)가 표면 코팅된 코팅 영역을 포함하는 변형된 측면 유동 면역진단 스트립.
- 제1항에 있어서, 상기 고흡수성 폴리머는 저밀도 가교 고흡수성 폴리머인, 변형된 측면 유동 면역진단 스트립.
- 제1항에 있어서 상기 고흡수성 폴리머는 0.01 내지 0.8%(w/v) 농도로 코팅되는 것을 특징으로 하는, 변형된 측면 유동 면역진단 스트립.
- 제1항에 있어서, 상기 고흡수성 폴리머가 표면 코팅된 코팅 영역은 접합 패드에 인접하여 위치하는 것인, 변형된 측면 유동 면역진단 스트립.
- 제1항에 있어서, 상기 변형된 측면 유동 면역진단 스트립은
순차적으로 배치된 시료 패드, 접합 패드, 고흡수성 폴리머가 표면 코팅된 코팅 영역, 검출 패드 및 흡수 패드를 포함하는, 변형된 측면 유동 면역진단 스트립.
- 제1항에 있어서, 상기 고흡수성 폴리머가 표면 코팅된 코팅 영역은 접촉된 시료의 동적 점도를 증가시켜 유속을 늦추는 것을 특징으로 하는, 변형된 측면 유동 면역진단 스트립.
- 1) 니트로셀룰로오스 막에 고흡수성 폴리머를 첨가하는 단계;
2) 상기 1) 단계의 고흡수성 폴리머 첨가 니트로셀룰로오스 막을 건조시켜 고흡수성 폴리머가 표면에 코팅된 니트로셀룰로오스 막을 제조하는 단계; 및
3) 상기 고흡수성 폴리머가 표면 코팅된 니트로셀룰로오스 막을 접합 패드와 검출 패드 사이에 연결하는 단계;를 포함하는, 변형된 측면 유동 면역진단 스트립의 제조방법.
- 제7항에 있어서, 상기 고흡수성 폴리머를 니트로셀룰로오스 막에 1 내지 5㎕ 첨가하는, 변형된 측면 유동 면역진단 스트립의 제조방법.
- 제7항에 있어서,
시료 패드, 접합 패드, 고흡수성 폴리머가 표면 코팅된 니트로셀룰로오스 막 및 흡수 패드 순으로 백킹 카드에 조립하는 단계; 를 더 포함하는 변형된 측면 유동 면역진단 스트립의 제조방법.
- 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항의 변형된 측면 유동 면역진단 스트립의 시료 패드에 검출 대상 액체 시료를 로딩하는 단계; 를 포함하는 액체 시료 내 표적 물질 검출 방법.
- 제10항에 있어서, 상기 액체 시료는 고흡수성 폴리머가 표면 코팅된 니트로셀룰로오스 막 영역을 통과하며, 비-변형 측면 유동 면역진단 스트립 대비 유속이 감소하는 것인, 액체 시료 내 표적 물질 검출 방법.
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