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KR102604096B1 - 윌슨병을 치료하기 위한 유전자 치료 - Google Patents

윌슨병을 치료하기 위한 유전자 치료 Download PDF

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KR102604096B1
KR102604096B1 KR1020197021756A KR20197021756A KR102604096B1 KR 102604096 B1 KR102604096 B1 KR 102604096B1 KR 1020197021756 A KR1020197021756 A KR 1020197021756A KR 20197021756 A KR20197021756 A KR 20197021756A KR 102604096 B1 KR102604096 B1 KR 102604096B1
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mice
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KR20190101410A (ko
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제임스 엠. 윌슨
제니 아그네스 시드레인
락쉬마난 고빈다사미
Original Assignee
더 트러스티스 오브 더 유니버시티 오브 펜실베니아
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Abstract

윌슨병을 치료하는 데 유용한 조성물 및 섭생이 제공된다. 상기 조성물은 인간 ATP7B의 발현을 추진시키는 트란스타이레틴 인핸서 및 촉진자를 갖는 재조합 아데노 연관된 바이러스(rAAV)를 포함한다.

Description

윌슨병을 치료하기 위한 유전자 치료
전자 형태로 제출된 자료의 참고에 의한 포함
출원인은 본 명세서로부터 전자 형태로 제출된 서열 목록 자료를 참고로 본 명세서에 포함시킨다. 이 파일은 "UPN-16-7940PCT_ST25.txt"로 표지된다.
1. 도입
본 출원은 윌슨병(Wilson's Disease)을 치료하기 위한 유전자 치료에 유용한 실시형태에 관한 것이다.
본 출원은 윌슨병을 치료하기 위한 유전자 치료에 유용한 실시형태에 관한 것이다. 윌슨병은 13번 염색체에서 구리 수송 ATPase 2(ATP7B) 유전자의 돌연변이로 인한 상염색체 열성 유전 장애 구리 저장 장애이다. 구리는, 통상적으로 12세 내지 23세에 관찰되는, 신경학적 또는 정신의학적 증상 및 간 질환으로서 표출되는 조직에서 축적한다. 적절한 치료 없이 시간이 지나면서, 높은 구리 수준은 삶을 위협하는 기관 손상을 야기할 수 있다.
윌슨병에 대한 현재의 치료 접근법은 이환된 개체가 평생 약제를 섭취할 것을 필요로 하는 킬레이트화제(페니실라민[Cuprimine] 및 트라이엔틴 하이드로클로라이드[Syprine]), (구리의 장세포 흡수를 차단하기 위한) 아연 및 테트라티오몰리브데이트(TM), 순환 시 알부민과 착체를 형성하는 구리 킬레이터에 의한 매일의 경구 치료이다. 더욱이, 이 치료는 부작용, 예컨대 약물 유도된 루푸스, 근무력증, 역설적인 악화를 야기할 수 있고, 일반 구리 대사를 복원하지 않는다. 간 이식은 윌슨병에 치유력이 있지만, 이식 수혜자는 거부를 막기 위해 일정한 면역 억제 섭생을 유지할 것이 요구된다.
본 명세서에 기재된 실시형태는, 윌슨병("WD")의 임상적으로 의미 있는 수정을 장기간, 아마도 10년 이상 발생시키는, 벡터의 정맥내(IV) 투여 이후에 이를 필요로 하는 대상체에게 정상 인간 구리 수송 ATPase 2(ATP7B)를 전달하기 위한 AAV 유전자 치료 벡터에 관한 것이다. 벡터 용량은 순환 구리 수준을 약 25% 이상 감소시키도록 ATP7B의 혈액 수준을 전달하도록 의도된다. 일 실시형태에서, 순환 구리의 수준을 뇨에서의 구리의 배설을 통해 평가하였다. 또 다른 실시형태에서, 혈장에서의 순환 구리의 수준을 평가하였다.
일 양태에서, 본 출원은 WD로 진단된 환자(인간 대상체)의 간 세포에 인간 구리 수송 ATPase 2(ATP7B) 유전자를 전달하기 위한 복제 결핍 아데노 연관된 바이러스(AAV)의 용도를 제공한다. hATP7B 유전자("rAAV.hATP7B")를 전달하기 위해 사용된 재조합 AAV 벡터(rAAV)는 간에 대한 지향성(tropism)(예를 들어, AAV8 캡시드를 보유하는 rAAV)을 가져야 하고, hATP7B 전이유전자는 간 특이적 발현 제어 요소에 의해 제어되어야 한다. 일 실시형태에서, 발현 제어 요소는 하기 중 하나 이상을 포함한다: 인핸서; 촉진자; 인트론; WPRE; 및 polyA 신호. 이러한 요소는 본 명세서에 추가로 기재되어 있다. hATP7B 암호화 서열의 크기로 인해, 효과적인 발현을 허용하는 제어 요소의 선택이 중요하다. 전이유전자의 발현이 충분하지 않는 경우, 결함의 수정에 필요한 벡터 투약량은 실행하기에 너무 높을 것이다. 따라서, 본 명세서에 기재된 바대로, 예를 들어 인핸서, 촉진자 및 polyA의 선택은 중요하다.
일 실시형태에서, hATP7B 암호화 서열은 서열 번호 1에 기재되어 있다. 일 실시형태에서, ATP7B 단백질 서열은 서열 번호 2에 기재되어 있다. hATP7B에 대한 암호화 서열은, 일 실시형태에서, 인간에서의 발현을 위해 코돈 최적화된다. 이러한 서열은 네이티브 hATP7B 암호화 서열(서열 번호 3)과 80% 미만의 동일성을 공유할 수 있다. 일 실시형태에서, hATP7B 암호화 서열은 서열 번호 1에 기재된 것이다.
또 다른 양태에서, 본 명세서에 기재된 rAAV를 포함하는, WD 환자에게 투여하기에 적합한, 수성 현탁액이 본 명세서에 제공된다. 몇몇 실시형태에서, 현탁액은 수성 현탁 액체 및 약 1x1012 내지 약 1x1014의 rAAV의 게놈 카피(GC)/㎖를 포함한다. 현탁액은, 일 실시형태에서, 정맥내 주사에 적합하다. 다른 실시형태에서, 현탁액은 수성 현탁 액체 중에 용해된 계면활성제, 보존제, 및/또는 완충제를 추가로 포함한다.
또 다른 실시형태에서, 본 명세서에 기재된 바대로 rAAV에 의해 WD를 갖는 환자를 치료하는 방법이 본 명세서에 제공된다. 일 실시형태에서, 약 1x1011 내지 약 3x1013의 rAAV의 게놈 카피(GC)/환자 체중(㎏)은 수성 현탁액 중에 환자 전달된다.
도 1은 AAV8.En34.TBG-S1.hATP7Bco.PA75 벡터의 도식적 표시이다.
도 2a 내지 도 2b는 뇨 및 혈청 구리 수준이 Atp7b KO 마우스에서 시간이 지나면서 증가한다는 것을 나타낸다. 시간에 걸친 Atp7b KO 마우스에서의 (a) 뇨 및 (b) 혈청 구리 수준(검정). 이형접합성 한배새끼(Het)는 대조군으로서 작용하였다(회색). 샘플은 자연사 연구에서 주마다 수집되고, 유도 커플링된 플라즈마-질량 분광법은 구리 수준을 평가하도록 수행되었다.
도 3a 내지 도 3c는 Atp7b KO 마우스에서 뇨, 구리 수준, 혈청 구리 수준, 및 간 질환 스코어링을 나타낸다. (a) 뇨 및 (b) 혈청 구리 수준은 시간이 지나면서 수컷 및 암컷 이형접합성(Het) 및 Atp7b KO 마우스(KO)에서 유도 커플링된 플라즈마-질량 분광법에 의해 평가되었다. (c) Atp7b KO 마우스를 2, 3, 4, 5, 9, 10 및 12개월령에 부검하였다. 간을 수확하고, H&E에 의해 염색하고, 1 내지 5 스코어링 시스템에 따라 조직학적으로 평가하였다. 값은 평균±SEM으로 표시되었다.
도 4는 Atp7b KO 마우스에서의 팀 염색(Timm's staining)을 나타낸다. 확인 번호 1345를 갖는 2개월령 Atp7b KO 마우스의 간에서의 구리에 대한 팀 염색의 대표적인 결과. 검정 침착물은 구리에 대한 양성 염색을 나타낸다. 확인 번호 307을 갖는 3.7개월령 야생형 마우스는 음성 대조군으로서 작용하였다.
도 5는 Atp7b KO 마우스에서 간 질환이 시간이 지나면서 발생한다는 것을 나타낸다. Atp7b KO 마우스를 2, 3, 4, 5, 9, 10 및 12개월령에 부검하고, 간을 수확하여 간 질환을 평가하였다. H&E, 씨리우스 레드 및 팀 염색을 섬유증 및 구리 축적을 포함하는 간 병변의 조직병리학적 평가를 위해 수행하였다. *, 12개월령 Atp7b KO 마우스의 간 내의 재생의 부위. WT, 팀 염색에 의해 보이는 것처럼 구리 축적에 대한 음성 대조군으로서의 야생형 마우스로부터의 절편.
도 6a 내지 도 6c는 8개월령 Atp7b KO 마우스에서의 혈청 화학 값을 나타낸다. 8개월령 Atp7b KO 마우스(KO) 및 이형접합성 마우스(Het)에서의 (a) ALT, (b) AST 및 (c) 총 빌리루빈 수준.
도 7은 8개월령 Atp7b KO 마우스에서의 간 질환을 나타낸다. Atp7b KO 및 이형접합성(Het) 마우스를 8개월령에 부검하였다. 간을 수확하고, H&E에 의해 염색하고, 1 내지 5 스코어링 시스템에 따라 조직학적으로 평가하였다. 값은 평균±SEM으로 표시되었다.
도 8a 및 도 8b는 8개월령 Atp7b KO 마우스에서의 간 섬유증 및 구리 축적을 나타낸다. Atp7b KO(KO) 및 이형접합성(Het) 마우스를 8개월령에 부검하였다. 간을 수확하고, 각각 섬유증 및 구리 축적의 평가를 위해 씨리우스 레드 및 팀 염색에 의해 염색하였다. (a) 섬유증 및 (b) 구리 축적을 포함하는 간 병변의 조직병리학적 평가를 1 내지 5 스코어링 시스템에 따라 수행하였다. 값은 평균±SEM으로 표시되었다.
도 9는 8개월령 Atp7b KO 마우스 Atp7b KO(KO) 및 이형접합성(Het) 마우스에서의 간 구리 수준이 8개월령에 부검된다는 것을 나타낸다. 간을 수확하고, 간 구리 수준을 유도 커플링된 플라즈마-질량 분광법에 의해 평가하였다. 값은 평균±SEM으로 표시되었다.
도 10a 내지 도 10c는 AAV8 유전자 치료가 Atp7b KO 마우스에서 정상 간 구리 대사를 복원할 수 있다는 것을 나타낸다. 수컷 Atp7b KO 마우스에 AAV8.TTR.hATP7Bco의 1011 GC/마우스 및 1010 GC/마우스에 의해 i.v. 주사하고, 암컷 Atp7b KO 마우스에 동일한 벡터의 1011, 1010 및 109 GC/마우스에 의해 i.v. 주사하였다. (a) 수컷 및 (b) 암컷에서의 혈청 구리 수준은 유도 커플링된 플라즈마-질량 분광법에 의해 평가되고, 연령 일치된 수컷 및 암컷 이형접합성(het) 및 Atp7b KO 마우스로부터의 혈청 구리 수준과 비교되었다. 마우스를 9개월령에 부검하고, 간을 수확하였다. (c) 간 구리 수준은 또한 유도 커플링된 플라즈마-질량 분광법에 의해 평가되고, 연령 일치된 비주사된 이형접합성(het) 및 Atp7b KO 마우스와 비교되었다. 값은 평균±SEM으로 표시되었다. ns, 무의미; ** p<0.01, **** p<0.0001.
도 11은 고용량 AAV8 유전자 치료가 Atp7b KO 마우스에서 간 질환의 발생을 예방한다는 것을 나타낸다. 수컷 Atp7b KO 마우스에 AAV8.TTR.hATP7Bco의 1011 GC/마우스 및 1010 GC/마우스에 의해 i.v. 주사하고, 암컷 Atp7b KO 마우스에 동일한 벡터의 1011, 1010 및 109 GC/마우스에 의해 i.v. 주사하였다. 마우스를 9개월령에 부검하고, 간을 수확하여 간 질환을 평가하였다. H&E, 씨리우스 레드 및 팀 염색을 수행하여 섬유증 및 구리 축적을 포함하는 간의 조직병리학적 병변을 평가하였다. 연령 일치된 비주사된 Atp7b KO 마우스로부터의 영상은 비교에 포함되었다(또한 도 2에 제시됨). WT, 팀 염색에 의해 보이는 것처럼 구리 축적에 대한 음성 대조군으로서의 야생형(WT) 마우스로부터의 절편. KO, 팀 염색에 의해 보이는 것처럼 구리 축적에 대한 양성 대조군으로서의 2개월령 Atp7b KO 마우스로부터의 절편.
도 12a 내지 도 12c는 Atp7b KO 마우스에서의 고용량 AAV8 유전자 치료 이후에 간 질환의 예방의 정량화를 나타낸다. 수컷 Atp7b KO 마우스에 AAV8.TTR.hATP7Bco의 1011 GC/마우스 및 1010 GC/마우스에 의해 i.v. 주사하고, 암컷 Atp7b KO 마우스에 동일한 벡터의 1011, 1010 및 109 GC/마우스에 의해 i.v. 주사하였다. 마우스를 9개월령에 부검하고, 조직학적 평가를 위해 간을 수확하였다. (a) 간 절편을 H&E에 의해 염색하고, 1 내지 5 스코어링 시스템에 따라 조직학적으로 평가하였다. (b) 간 절편을 씨리우스 레드에 의해 염색하고, 1 내지 3 스코어링 시스템에 따라 섬유증에 대해 평가하고, (c) 팀 염색을 1 내지 5 스코어링 시스템에 따라 구리 축적의 평가를 위해 간 절편에서 수행하였다. 평균±SEM으로 표시된 값은 연령 일치된 비주사된 이형접합성(Het) 및 Atp7b KO 마우스와 비교되었다, ns, 무의미; * p<0.05, ** p<0.01, *** p<0.001, **** p<0.0001.
도 13a 내지 도 13c는 AAV8 유전자 치료 이후에 Atp7b KO 마우스에서의 혈청 화학 수준을 나타낸다. 수컷 Atp7b KO 마우스에 AAV8.TTR.hATP7Bco의 1011 GC/마우스 및 1010 GC/마우스에 의해 IV 주사하고, 암컷 Atp7b KO 마우스에 동일한 벡터의 1011, 1010, 및 109 GC/마우스에 의해 i.v. 주사하였다. (a) ALT, (b) AST 및 (c) 총 빌리루빈 수준을 혈청에서 평가하였다.
도 14는 웨스턴 블롯에 의한 세룰로플라스민의 검출을 나타낸다. 마우스당 AAV8.EnTTR.TTR.hATP7Bco.PA75의 1010 또는 1011 GC가 i.v. 주사된 Atp7b KO 마우스에서의 세룰로플라스민의 구리 결합(Holo, 하부 밴드) 및 구리 비결합(Apo, 상부 밴드) 형태를 검출하는 웨스턴 블롯. 혈액 샘플을 투여 후 21에 수집하였다. 단백질 마커는 비교를 위해 중앙 레인에 제공되었다. 벡터 주사가 없는 Atp7b KO 및 이형접합성(het) 한배새끼는 대조군으로서 작용하였다(1318, 6개월령 het; 1313, 6개월령 Atp7b KO; 388, Atp7b KO).
도 15a 내지 도 15b는 암컷 및 수컷 AAV8 벡터 투여된 Atp7b KO 마우스에서의 혈청 구리 수준을 나타낸다. Atp7b KO 마우스에 상이한 인핸서/촉진자 조합(원, EnTTR.TTR, AAV8.EnTTR.TTR.hATP7Bco.PA75; 정사각형, En34.TBG-S1, AAV8.En34.TBG-S1.hATP7Bco.PA75; 정삼각형, En34.TTR, AAV8.En34.TTR.hATP7Bco.PA75; 역삼각형, ABPS.TBG-S1, AAV8.ABPS.TBG-S1.hATP7Bco.PA75; 마름모, En34.mTTR, AAV8.En34.mTTR.hATP7Bco.PA75)에 의한 hATP7Bco의 발현을 위해 AAV8 벡터의 3x1012 GC/㎏를 i.v. 투여하였다. 비주사된 Atp7b KO 및 이형접합성(Het) 마우스는 대조군으로서 작용하였다. 혈청 구리 수준은 (a) 암컷 및 (b) 수컷 Atp7b KO 마우스에서 유도 커플링된 플라즈마-질량 분광법에 의해 평가되었다. 값은 평균±SEM으로 표시되었다.
도 16a 내지 도 16c는 암컷 및 수컷 AAV8 벡터 투여된 Atp7b KO 마우스에서의 혈청 화학을 나타낸다. 암컷 및 수컷 Atp7b KO 마우스에 상이한 인핸서/촉진자 조합(EnTTR.TTR, AAV8.EnTTR.TTR.hATP7Bco.PA75; En34.TBG-S1, AAV8.En34.TBG-S1.hATP7Bco.PA75; En34.TTR, AAV8.En34.TTR.hATP7Bco.PA75; ABPS.TBG-S1, AAV8.ABPS.TBG-S1.hATP7Bco.PA75; En34.mTTR, AAV8.En34.mTTR.hATP7Bco.PA75)에 의한 hATP7Bco의 발현을 위해 AAV8 벡터의 3x1012 GC/㎏를 i.v. 투여하였다. 비히클 대조군 투여된 Atp7b KO(PBS) 마우스는 대조군으로서 작용하였다. (a) ALT, (b) AST 및 (c) 총 빌리루빈 수준은 혈청에서 평가되었다. 값은 평균±SEM으로 표시되었다.
도 17은 웨스턴 블롯에 의해 결정된 간 ATP7Bco 발현을 나타낸다. 암컷 및 수컷 Atp7b KO 마우스에 상이한 인핸서/촉진자 조합(EnTTR TTR, AAV8.EnTTR.TTR.hATP7Bco.PA75; En34.TBG-S1, AAV8.En34.TBG-S1.hATP7Bco.PA75; En34.TTR, AAV8.En34.TTR.hATP7Bco.PA75; ABPS.TBG-S1, AAV8.ABPS.TBG-S1.hATP7Bco.PA75; En34.mTTR, AAV8.En34.mTTR.hATP7Bco.PA75)에 의한 hATP7Bco의 발현을 위해 AAV8 벡터의 3x1012 GC/㎏를 i.v. 투여하고, 6개월령에 희생시켰다. Atp7b KO 마우스에서 ATP7B를 검출하는 웨스턴 블롯은 밴드 농도계에 의해 정량화되었다. 값은 평균±SEM으로 표시되었다.
도 18은 암컷 및 수컷 AAV8 벡터 투여된 Atp7b KO 마우스에서의 간 질환을 나타낸다. 암컷 및 수컷 Atp7b KO 마우스에 상이한 인핸서/촉진자 조합(EnTTR.TTR, AAV8.EnTTR.TTR.hATP7Bco.PA75; En34.TBG-S1, AAV8.En34.TBG-S1.hATP7Bco.PA75; En34.TTR, AAV8.En34.TTR.hATP7Bco.PA75; ABPS.TBG-S1, AAV8.ABPS.TBG-S1.hATP7Bco.PA75; En34.mTTR, AAV8.En34.mTTR.hATP7Bco.PA75)에 의한 hATP7Bco의 발현을 위해 AAV8 벡터의 3x1012 GC/㎏를 i.v. 투여하고, 6개월령에 희생시켰다. 비히클 대조군 투여된 Atp7b KO(PBS) 마우스는 대조군으로서 작용하였다. 간 절편은 H&E에 의해 염색되고, 1 내지 5 스코어링 시스템에 따라 조직학적으로 평가되었다. 값은 평균±SEM으로 표시되었다.
도 19a 내지 도 19b는 암컷 및 수컷 AAV8 벡터 투여된 Atp7b KO 마우스에서의 간 섬유증 및 구리 축적을 나타낸다. 암컷 및 수컷 Atp7b KO 마우스에 상이한 인핸서/촉진자 조합(EnTTRTTR, AAV8.EnTTR.TTR.hATP7Bco.PA75; En34.TBG-S1, AAV8.En34.TBG-S1.hATP7Bco.PA75; En34.TTR, AAV8.En34.TTR.hATP7Bco.PA75; ABPS.TBG-S1, AAV8.ABPS.TBG-S1.hATP7Bco.PA75; En34.mTTR, AAV8.En34.mTTR.hATP7Bco.PA75)에 의한 hATP7Bco의 발현을 위해 AAV8 벡터의 3x1012 GC/㎏를 i.v. 투여하고, 6개월령에 희생시켰다. 비히클 대조군 투여된 Atp7b KO(PBS) 마우스는 대조군으로서 작용하였다. (a) 간 절편은 씨리우스 레드에 의해 염색되고, 1 내지 3 스코어링 시스템에 따라 섬유증에 대해 평가되고, (b) 팀 염색은 1 내지 5 스코어링 시스템에 따라 구리 축적의 평가를 위해 간 절편에서 수행되었다. 평균±SEM으로 표시된 값은 연령 일치된 비주사된 이형접합성(Het) 및 Atp7b KO(KO) 마우스와 비교되었다.
도 20은 암컷 및 수컷 AAV8 벡터 투여된 Atp7b KO 마우스에서의 간 구리 수준을 나타낸다. 암컷 및 수컷 Atp7b KO 마우스에 상이한 인핸서/촉진자 조합(EnTTR.TTR, AAV8.EnTTR.TTR.hATP7Bco.PA75; En34.TBG-S1, AAV8.En34.TBG-S1.hATP7Bco.PA75; En34.TTR, AAV8.En34.TTR.hATP7Bco.PA75; ABPS.TBG-S1, AAV8.ABPS.TBG-S1.hATP7Bco.PA75; En34.mTTR, AAV8.En34.mTTR.hATP7Bco.PA75)에 의한 hATP7Bco의 발현을 위해 AAV8 벡터의 3x1012 GC/㎏를 i.v. 투여하고, 6개월령에 희생시켰다. 비히클 대조군 투여된 Atp7b KO(PBS) 마우스는 대조군으로서 작용하였다. 간 구리 수준은 유도 커플링된 플라즈마-질량 분광법에 의해 평가되고, 연령 일치된 비주사된 이형접합성(het) 및 Atp7b KO(KO) 마우스와 비교되었다. 값은 평균±SEM으로 표시되었다.
도 21은 수컷 AAV8 벡터 투여된 Atp7b KO 마우스에서의 웨스턴 블롯에 의한 세룰로플라스민의 검출을 나타낸다. 수컷 Atp7b KO 마우스에서의 세룰로플라스민의 구리 결합(Holo, 하부 밴드) 및 구리 비결합(Apo, 상부 밴드) 형태를 검출하는 웨스턴 블롯은 상이한 인핸서/촉진자 조합(1, AAV8.EnTTR.TTR.hATP7Bco.PA75; 2, AAV8.En34.TBG-S1.hATP7Bco.PA75; 3, AAV8.En34.TTR.hATP7Bco.PA75; 4, AAV8.ABPS.TBG-S1.hATP7Bco.PA75)에 의한 hATP7Bco의 발현을 위해 AAV8 벡터의 3x1012 GC/㎏를 i.v. 투여하였다. 혈액 샘플을 투여 후 21일에 수집하였다. 단백질 마커는 비교를 위해 중앙 레인에 제공되었다. 벡터 주사가 없는 Atp7b KO, 이형접합성(het) 및 야생형(WT) 한배새끼는 대조군으로서 작용하였다(1313, 6개월령 Atp7b KO; 1318, 6개월령 het; 1345, 2개월령 Atp7b KO; 1945, WT).
도 22는 수컷 AAV8 절두된 ATP7B 벡터 투여된 Atp7b KO 마우스에서의 혈청 구리 수준을 나타낸다. 수컷 Atp7b KO 마우스에 hATP7Bco의 상이한 절두된 버전(MBD1Del, AAV8.En34.TBG-S1.hATP7BcoMBD1Del.PA75; MBD2Del, AAV8.En34.TBG-S1.hATP7BcoMBD2Del.PA75; MBD3Del, AAV8.En34.TBG-S1.hATP7BcoMBD3Del.PA75; MBD1-2Del, AAV8.En34.TBG-S1.hATP7BcoMBD1-2Del.PA75; MBD1-4Del, AAV8.En34.TBG-S1.hATP7BcoMBD1-4Del.PA75; MBD1-5Del, AAV8.En34.TBG-S1.hATP7BcoMBD1-5Del.PA75; TBG-MBD1-4Del, AAV8.TBG.hATP7BcoMBD1-4Del.PA75; TBG-MBD1-5Del, AAV8.TBG.hATP7BcoMBD1-5Del.PA75)의 발현을 위해 AAV8 벡터의 3x1012 GC/㎏를 i.v. 투여하였다. 혈청 구리 수준은 유도 커플링된 플라즈마-질량 분광법에 의해 평가되고, 시간이 지나면서 이형접합성(Het) 및 Atp7b KO 마우스(KO)와 비교되었다. 값은 평균±SEM으로 표시되었다.
도 23a 내지 도 23c는 수컷 AAV8 절두된 ATP7B 벡터 투여된 Atp7b KO 마우스에서의 혈청 화학을 나타낸다. 수컷 Atp7b KO 마우스에 hATP7Bco의 상이한 절두된 버전(MBD1Del, AAV8.En34.TBG-S1.hATP7BcoMBD1Del.PA75; MBD2Del, AAV8.En34.TBG-S1.hATP7BcoMBD2Del.PA75; MBD3Del, AAV8.En34.TBG-S1.hATP7BcoMBD3Del.PA75; MBD1-2Del, AAV8.En34.TBG-S1.hATP7BcoMBD1-2Del.PA75; MBD1-4Del, AAV8.En34.TBG-S1.hATP7BcoMBD1-4Del.PA75; MBD1-5Del, AAV8.En34.TBG-S1.hATP7BcoMBD1-5Del.PA75; TBG-MBD1-4Del, AAV8.TBG.hATP7BcoMBD1-4Del.PA75; TBG-MBD1-5Del, AAV8.TBG.hATP7BcoMBD1-5Del.PA75)의 발현을 위해 AAV8 벡터의 3x1012 GC/㎏를 i.v. 투여하였다. 마우스를 6개월령에 부검하고, (a) ALT, (b) AST 및 (c) 총 빌리루빈 수준은 혈청에서 평가되었다. 값은 평균±SEM으로 표시되었다.
도 24는 수컷 AAV8 절두된 ATP7B 벡터 투여된 Atp7b KO 마우스에서 웨스턴 블롯에 의해 결정된 간 ATP7Bco 발현을 나타낸다. 수컷 Atp7b KO 마우스에 hATP7Bco의 상이한 절두된 버전(MBD1Del, AAV8.En34.TBG-S1.hATP7BcoMBD1Del.PA75; MBD2Del, AAV8.En34.TBG-S1.hATP7BcoMBD2Del.PA75; MBD3Del, AAV8.En34.TBG-S1.hATP7BcoMBD3Del.PA75; MBD1-2Del, AAV8.En34.TBG-S1.hATP7BcoMBD1-2Del.PA75; MBD1-4Del, AAV8.En34.TBG-S1.hATP7BcoMBD1-4Del.PA75; MBD1-5Del, AAV8.En34.TBG-S1.hATP7BcoMBD1-5Del.PA75; TBG-MBD1-4Del, AAV8.TBG.hATP7BcoMBD1-4Del.PA75; TBG-MBD1-5Del, AAV8.TBG.hATP7BcoMBD1-5Del.PA75)의 발현을 위해 AAV8 벡터의 3x1012 GC/㎏를 i.v. 투여하였다. 마우스를 6개월령에 부검하였다. Atp7b KO 마우스에서 ATP7B를 검출하는 웨스턴 블롯은 밴드 농도계에 의해 정량화되었다. 값은 평균±SEM으로 표시되었다.
도 25는 수컷 AAV8 절두된 ATP7B 벡터 투여된 Atp7b KO 마우스에서의 간 질환을 나타낸다. 수컷 Atp7b KO 마우스에 hATP7Bco의 상이한 절두된 버전(MBD1Del, AAV8.En34.TBG-S1.hATP7BcoMBD1Del.PA75; MBD2Del, AAV8.En34.TBG-S1.hATP7BcoMBD2Del.PA75; MBD3Del, AAV8.En34.TBG-S1.hATP7BcoMBD3Del.PA75; MBD1-2Del, AAV8.En34.TBG-S1.hATP7BcoMBD1-2Del.PA75; MBD1-4Del, AAV8.En34.TBG-S1.hATP7BcoMBD1-4Del.PA75; MBD1-5Del, AAV8.En34.TBG-S1.hATP7BcoMBD1-5Del.PA75; TBG-MBD1-4Del, AAV8.TBG.hATP7BcoMBD1-4Del.PA75; TBG-MBD1-5Del, AAV8.TBG.hATP7BcoMBD1-5Del.PA75)의 발현을 위해 AAV8 벡터의 3x1012 GC/㎏를 i.v. 투여하였다. 마우스를 6개월령에 부검하였다. 비히클 대조군 투여된 Atp7b KO(PBS) 마우스는 대조군으로서 작용하였다. 간 절편은 H&E에 의해 염색되고, 1 내지 5 스코어링 시스템에 따라 조직학적으로 평가되었다. 값은 평균±SEM으로 표시되었다.
도 26a 내지 도 26b는 수컷 AAV8 절두된 ATP7B 벡터 투여된 Atp7b KO 마우스에서의 간 섬유증 및 구리 축적을 나타낸다. 수컷 Atp7b KO 마우스에 hATP7Bco의 상이한 절두된 버전(MBD1Del, AAV8.En34.TBG-S1.hATP7BcoMBD1Del.PA75; MBD2Del, AAV8.En34.TBG-S1.hATP7BcoMBD2Del.PA75; MBD3Del, AAV8.En34.TBG-S1.hATP7BcoMBD3Del.PA75; MBD1-2Del, AAV8.En34.TBG-S1.hATP7BcoMBD1-2Del.PA75; MBD1-4Del, AAV8.En34.TBG-S1.hATP7BcoMBD1-4Del.PA75; MBD1-5Del, AAV8.En34.TBG-S1.hATP7BcoMBD1-5Del.PA75; TBG-MBD1-4Del, AAV8.TBG.hATP7BcoMBD1-4Del.PA75; TBG-MBD1-5Del, AAV8.TBG.hATP7BcoMBD1-5Del.PA75)의 발현을 위해 AAV8 벡터의 3x1012 GC/㎏를 i.v. 투여하였다. 마우스를 6개월령에 부검하였다. 비히클 대조군 투여된 Atp7b KO(PBS) 마우스는 대조군으로서 작용하였다. (a) 간 절편은 씨리우스 레드에 의해 염색되고, 1 내지 3 스코어링 시스템에 따라 섬유증에 대해 평가되고, (b) 팀 염색은 1 내지 5 스코어링 시스템에 따라 구리 축적의 평가를 위해 간 절편에서 수행되었다. 평균±SEM으로 표시된 값은 연령 일치된 비주사된 이형접합성(Het) 및 Atp7b KO(KO) 마우스와 비교되었다.
도 27은 수컷 AAV8 절두된 ATP7B 벡터 투여된 Atp7b KO 마우스에서의 간 구리 수준을 나타낸다. 수컷 Atp7b KO 마우스에 hATP7Bco의 상이한 절두된 버전(MBD1Del, AAV8.En34.TBG-S1.hATP7BcoMBD1Del.PA75; MBD2Del, AAV8.En34.TBG-S1.hATP7BcoMBD2Del.PA75; MBD3Del, AAV8.En34.TBG-S1.hATP7BcoMBD3Del.PA75; MBD1-2Del, AAV8.En34.TBG-S1.hATP7BcoMBD1-2Del.PA75; MBD1-4Del, AAV8.En34.TBG-S1hATP7BcoMBD1-4Del.PA75; MBD1-5Del, AAV8.En34.TBG-S1.hATP7BcoMBD1-5Del.PA75; TBG-MBD1-4Del, AAV8.TBG.hATP7BcoMBD1-4Del.PA75; TBG-MBD1-5Del, AAV8.TBG.hATP7BcoMBD1-5Del.PA75)의 발현을 위해 AAV8 벡터의 3x1012 GC/㎏를 i.v. 투여하였다. 마우스를 6개월령에 부검하였다. 비히클 대조군 투여된 Atp7b KO(PBS) 마우스는 대조군으로서 작용하였다. 간 구리 수준은 유도 커플링된 플라즈마-질량 분광법에 의해 평가되고, 연령 일치된 비주사된 이형접합성(het) 및 Atp7b KO(KO) 마우스와 비교되었다. 평균±SEM으로 표시된 값은 연령 일치된 비주사된 이형접합성(Het) 및 Atp7b KO(KO) 마우스와 비교되었다.
본 출원에 기재된 실시형태는 윌슨병(WD)으로 진단된 환자(인간 대상체)의 간 세포에 인간 구리 수송 ATPase 2(ATP7B) 유전자를 전달하기 위한 복제 결핍 아데노 연관된 바이러스(AAV)의 용도에 관한 것이다. hATP7B 유전자("rAAV.hATP7B")를 전달하기 위해 사용된 재조합 AAV 벡터(rAAV)는 간에 대한 지향성(예를 들어, AAV8 캡시드를 보유하는 rAAV)을 가져야 하고, hATP7B 전이유전자는 간 특이적 발현 제어 요소에 의해 제어되어야 한다. 일 실시형태에서, 발현 제어 요소는 하기 중 하나 이상을 포함한다: 인핸서; 촉진자; 인트론; WPRE; 및 polyA 신호. 이러한 요소는 본 명세서에 추가로 기재되어 있다.
본 명세서에 사용된 바대로, "AAV8 캡시드"는 GenBank, 수탁번호: YP_077180.1, 서열 번호 16(본 명세서에 참고로 포함됨)의 아미노산 서열을 갖는 AAV8 캡시드를 의미한다. 이 암호화된 서열로부터의 약간의 변동이 허용되고, 이는 YP_077180.1 및 WO 제2003/052051호(본 명세서에 참고로 포함됨)에서 기준 아미노산 서열과 약 99% 동일성을 갖는 서열(즉, 기준 서열로부터 약 1% 미만의 변동)을 포함할 수 있다. 캡시드를 생성하는 방법, 이에 대한 암호화 서열 및 rAAV 바이러스 벡터를 제조하는 방법이 기재되어 있다. 예를 들어, 문헌[Gao, et al, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 100 (10), 6081-6086 (2003)] 및 US 제2015/0315612호를 참조한다.
본 명세서에 사용된 바대로, 용어 "NAb 역가"는 이의 표적화된 에피토프(예를 들어, AAV)의 생리학적 효과를 중화시키는 중화 항체(예를 들어, 항-AAV Nab)가 얼마나 많이 생성되는지의 측정치이다. 항-AAV NAb 역가는 예를 들어 문헌[Calcedo, R., et al., Worldwide Epidemiology of Neutralizing Antibodies to Adeno-Associated Viruses. Journal of Infectious Diseases, 2009. 199(3): p. 381-390](본 명세서에 참고로 포함됨)에 기재된 바대로 측정될 수 있다.
아미노산 서열의 맥락에서 용어 "동일성 백분율(%)", "서열 동일성", "서열 동일성 백분율" 또는 "동일 백분율"은 관련성에 대해 정렬될 때 동일한 2개의 서열에서의 잔기를 의미한다. 동일성 백분율은 단백질의 전장, 폴리펩타이드, 약 32개의 아미노산, 약 330개의 아미노산, 또는 이의 펩타이드 단편 또는 상응하는 핵산 서열 암호화 시퀀서에 대해 아미노산 서열에 대해 용이하게 결정될 수 있다. 적합한 아미노산 단편은 적어도 약 8개의 아미노산 길이일 수 있고, 약 700개 이하의 아미노산일 수 있다. 일반적으로, 2개의 상이한 서열 사이의 "동일성 ", "상동성" 또는 "유사성"을 언급할 때, "동일성", "상동성" 또는 "유사성"은 "정렬된" 서열을 참조하여 결정된다. "정렬된" 서열 또는 "정렬"은 기준 서열과 비교하여 미싱 또는 추가적인 염기 또는 아미노산에 대한 수정을 대개 함유하는 다수의 핵산 서열 또는 단백질(아미노산) 서열을 의미한다. 정렬은 임의의 다양한 공공으로 또는 상업적으로 이용 가능한 Multiple Sequence Alignment Programs를 이용하여 수행된다. 서열 정렬 프로그램, 예를 들어 "Clustal Omega", "Clustal X", "MAP", "PIMA", "MSA", "BLOCKMAKER", "MEME" 및 "Match-Box" 프로그램은 아미노산 서열에 이용 가능하다. 일반적으로, 임의의 이들 프로그램은 디폴트 설정에서 사용되지만, 당업자는 필요한 바대로 이 설정을 변경할 수 있다. 대안적으로, 당업자는 언급된 알고리즘 및 프로그램에 의해 제공된 것과 적어도 동일성 또는 정렬의 수준을 제공하는 또 다른 알고리즘 또는 컴퓨터 프로그램을 이용할 수 있다. 예를 들어, 문헌[J. D. Thomson et al, Nucl. Acids. Res., "A comprehensive comparison of multiple sequence alignments", 27(13):2682-2690 (1999)]을 참조한다.
본 명세서에 사용된 바대로, 용어 "작동 가능하게 연결된"은 관심 대상의 유전자와 인접한 발현 제어 서열 및 관심 대상의 유전자를 제어하도록 트랜스로 또는 일정한 거리에서 작용하는 발현 제어 서열 둘 다를 의미한다.
"복제 결핍 바이러스" 또는 "바이러스 벡터"는 관심 대상의 유전자를 함유하는 발현 카세트가 바이러스 캡시드 또는 엔벨로프에 패키징된 합성 또는 인공 바이러스 입자를 의미하고, 바이러스 캡시드 또는 엔벨로프 내에 또한 패키징된 임의의 바이러스 게놈 서열은 복제 결핍이고; 즉, 이들은 자손 비리온을 생성할 수 없지만, 표적 세포를 감염시키는 능력을 보유한다. 일 실시형태에서, 바이러스 벡터의 게놈은 복제하는 데 필요한 효소를 암호화하는 유전자를 포함하지 않지만(게놈은 "무장(gutless)"이도록 조작될 수 있다 - 인공 게놈의 증폭 및 패키징에 필요한 신호에 의해 측접된 관심 대상의 전이유전자를 오직 함유), 이들 유전자는 제조 동안 공급될 수 있다. 따라서, 자손 비리온에 의한 복제 및 감염이 복제에 필요한 바이러스 효소의 존재 하에를 제외하고 생길 수 없으므로, 이것은 유전자 치료에서 사용하기에 안전하다고 간주된다.
용어 "일" 또는 "하나"는 하나 이상을 의미한다는 것이 주목되어야 한다. 그러므로, 용어 "일"(또는 "하나"), "하나 이상" 및 "적어도 하나"는 본 명세서에서 상호 교환되어 사용된다.
단어 "포함한다", "포함" 및 "포함하는"은 배타적이기보다는 포함적으로 해석되어야 한다. 단어 "이루어진다", "이루어지는" 및 이의 변형어는 포함적이기보다는 배타적으로 해석되어야 한다. 본 명세서에서 다양한 실시형태가 "포함하는" 언어를 사용하여 제시되어 있지만, 다른 상황 하에, 관련된 실시형태는 "이루어진' 또는 "본질적으로 이루어진' 언어를 사용하여 해석되고 기재되는 것으로 또한 의도된다.
본 명세서에 사용된 바대로, 용어 "약"은, 달리 기재되지 않는 한, 주어진 기준으로부터 10%의 변동을 의미한다.
본 명세서에서 달리 정의되지 않는 한, 본 명세서에서 사용된 기술 및 과학 용어는 본 출원에 사용된 많은 용어에 일반 가이드를 제공하는 공개 텍스트에 참고로 당업자에 의해 흔히 이해되는 것과 동일한 의미를 갖는다.
5.1 유전자 치료 벡터
일 양태에서, 인간 ATP7B 유전자를 보유하는 재조합 아데노 연관된 바이러스(rAAV) 벡터는 유전자 치료에서 사용하기 위해 제공된다. rAAV.hATP7B 벡터는 간에 대한 지향성(예를 들어, AAV8 캡시드를 보유하는 rAAV)을 가져야 하고, hATP7B 전이유전자는 간 특이적 발현 제어 요소에 의해 제어되어야 한다. 벡터는 인간 대상체에 대한 점적주사에 적합한 완충제/캐리어에서 제제화된다. 완충제/캐리어는 rAAV가 점적주사 배관에 점착하는 것을 막지만 생체내 rAAV 결합 활성을 방해하지 않는 성분을 포함해야 한다.
5.1.1. rAAV.hATP7B 벡터
5.1.1.1. hATP7B 서열
윌슨병은 구리 수송 P형 ATPase를 암호화하는 ATP7B 유전자의 돌연변이에 의해 주로 생기는 대사의 유전적 오류이다. ATP7B는 담즙으로의 배설 및 기능적 세룰로플라스민의 합성을 위한 아포-세룰로플라스민으로의 도입 둘 다를 위해 세포내 샤페론 단백질로부터 분비 경로로의 구리의 수송을 담당한다. 윌슨병의 발생은 이환된 조직에서의 구리의 축적으로 인한다. 문헌[EASL Clinical Practice Guidelines: Wilson's disease, EASL Journal of Hepatology, 2012, 56(671-85)](본 명세서에 참고로 포함됨)을 참조한다.
윌슨병의 임상 특징은 신경학적 증상을 갖는 환자의 95% 및 신경학적 증상이 없는 사람의 다소 절반 너머 존재하는 카이저-플리셔 고리(Kayser-Fleischer ring)이다. 신경학적 징후, 가장 대개 진전, 운동실조 및 근긴장이상증은 가변적이다. 임의의 유형의 간 질환은 윌슨병을 갖는 환자에 맞닥쳐질 수 있다. 임상적으로 명확한 간 질환이 10년만큼 신경학적 표출에 앞서갈 수 있고, 신경학적 증상을 갖는 대부분의 환자는 제시에서 간 질환의 약간의 정도를 갖는다. 간 질환의 증상의 제시는 오직 생화학 비정상에 의한 무증상으로부터 모든 이의 합병증을 갖는 명확한 간경변까지의 범위로 고도로 가변적일 수 있다. 윌슨병은 또한 때때로 쿠움스(Coombs) 음성 용혈 빈혈과 연관된 급성 간부전 및 급성 신부전으로 제시될 수 있다. 하기 표 1은 WD에서의 예후 지수를 제공한다. (문헌[EASL Clinical Practice Guidelines: Wilson's disease, EASL Journal of Hepatology, 2012, 56(671-85)](본 명세서에 참고로 포함됨)을 참조한다.)
ATP7B는 구리 전좌를 위해 세포막을 통한 경로를 형성하는 8개의 막관통 도메인; 및 6개의 금속 결합 도메인(MBD)을 갖는 큰 N 말단(각각 대략 70개의 아미노산 및 고도로 보존된 금속 결합 모티프 GMxCxxC(여기서, x는 임의의 아미노산임)를 포함함)을 갖는다. 다른 도메인은 막을 통한 구리 전좌에 필요한 막내 CPC 모티프, ATP 결합 부위를 함유하는 N-도메인, 보존된 아스파르트산 잔기를 함유하는 P-도메인 및 포스파타제 도메인을 포함하는 A-도메인을 포함한다. hATP7B 유전자 및/또는 생성된 단백질의 다양한 돌연변이는 윌슨병을 갖는 몇몇의 또는 모든 환자에서 존재한다고 공지되어 있다. WB에 기여하는 공지된 돌연변이의 완전한 목록은 http://www.uniprot.org/uniprot/P35670(본 명세서에 참고로 포함됨)에서 발견될 수 있다. 추가로, 정규 서열(가장 긴 아이소폼인 아이소폼 a라고도 칭함; NCBI 기준 서열: NP_000044.2) 이외에, 4개의 추가적인 아이소폼이 공지되어 있다: NCBI 기준 서열 NP_001005918.1, NP_001230111.1, NP_001317507.1, NP_001317508.1(이들의 각각은 본 명세서에 참고로 포함됨). 본 명세서에 기재된 조성물 및 방법은 질환을 야기하는 임의의 ATP7B 변이체 단백질을 갖는 대상체를 치료하기 위해 사용될 수 있다.
일 실시형태에서, hATP7B 유전자는 서열 번호 2에 기재된 hATP7B 단백질을 암호화한다. 따라서, 일 실시형태에서, hATP7B 전이유전자는 첨부된 서열 목록(본 명세서에 참고로 포함됨)에 제공된 서열 번호 1 또는 서열 번호 3에 의해 제공된 서열을 포함할 수 있지만, 이들로 제한되지는 않는다. 서열 번호 3은 네이티브 인간 ATP7B에 대한 cDNA를 제공한다. 서열 번호 1은 인간에서의 발현에 코돈 최적화된 인간 ATP7B에 대한 조직된 cDNA(때때로 본 명세서에 hATP7Bco라 칭해짐)를 제공한다. 본 명세서에서 hATP7B에 대한 언급은, 몇몇 실시형태에서, 본 명세서에 기재된 hATP7B 네이티브 또는 코돈 최적화된 서열, 또는 임의의 변이체를 의미할 수 있다고 이해되어야 한다. 대안적으로 또는 추가적으로, 웹 기반 또는 상업적으로 구입 가능한 컴퓨터 프로그램, 및 서비스 기반 회사는 RNA 및/또는 cDNA 둘 다를 포함하는 핵산 암호화 서열로 아미노산 서열을 다시 번역하도록 사용될 수 있다. 예를 들어, EMBOSS에 의한 backtranseq, www.ebi.ac.uk/Tools/st/; Gene Infinity (www.geneinfinity.org/sms-/sms_backtranslation.html); ExPasy(www.expasy.org/tools/)를 참조한다. (예를 들어, 코돈 최적화에 의해) 원하는 표적 대상체에서의 발현에 최적화된 핵산 서열을 포함하는, 기재된 hATP7B 폴리펩타이드 서열을 암호화하는 모든 핵산이 포함되는 것으로 의도된다.
ATP7B의 네이티브 암호화 서열은 1465개의 아미노산 단백질(서열 번호 2)을 생성시키는 4.3kb 초과이다(서열 번호 3; Genbank 수탁번호 XM_005266430). ATP7B의 큰 크기 및 AAV 벡터를 포함하는 바이러스 벡터의 패키징 능력으로 인해, 몇몇 실시형태에서, ATP7B 암호화 서열이 짧아지는 것이 바람직하다. 처음의 5개의 MBD의 결실이 야생형과 일치하는 생성된 단백질의 촉매 인산화의 수준을 나타낸다는 것이 밝혀졌다. 문헌[Huster and Lutsenko, J. Biological Chem, June 2003(본 명세서에 참고로 포함됨)]을 참조한다. 따라서, 일 실시형태에서, ATP7B 암호화 서열은 하나 이상의 MDB를 결실시킴으로써 짧아진다. 일 실시형태에서, ATP7B 암호화 서열은 (예를 들어, 서열 번호 17 및 서열 번호 35의 403번 nt 내지 4368번 nt에 기재된 바대로) MBD1-2 결실된다. 또 다른 실시형태에서, ATP7B 암호화 서열은 MBD1-3 결실된다. 또 다른 실시형태에서, ATP7B 암호화 서열은 (예를 들어, 서열 번호 18, 및 서열 번호 34의 403번 nt 내지 3762번 nt 및 서열 번호 29의 1059번 nt 내지 4418번 nt에 기재된 바대로) MBD1-4 결실된다. 또 다른 실시형태에서, ATP7B 암호화 서열은 (예를 들어, 서열 번호 19, 서열 번호 33의 403번 nt 내지 3369번 nt 및 서열 번호 28의 1059번 nt 내지 4025번 nt에 기재된 바대로) MBD1-5 결실된다. 또 다른 실시형태에서, ATP7B 암호화 서열은 (예를 들어, 서열 번호 20 및 서열 번호 32의 403번 nt 내지 4686번 nt에 기재된 바대로) MBD1 결실된다. 또 다른 실시형태에서, ATP7B 암호화 서열은 (예를 들어, 서열 번호 21 및 서열 번호 31의 403번 nt 내지 4617번 nt에 기재된 바대로) MBD2 결실된다. 또 다른 실시형태에서, ATP7B 암호화 서열은 (예를 들어, 서열 번호 22 및 서열 번호 30의 403번 nt 내지 4719번 nt에 기재된 바대로) MBD3 결실된다. 또 다른 실시형태에서, ATP7B 암호화 서열은 (예를 들어, 문헌[Cater et al, Biochem J. 2004 Jun 15; 380(Pt 3): 805-813](본 명세서에 참고로 포함됨)에 기재된 바대로) MBD1-4 및 6 결실된다. 또한, 문헌[Gourdon et al, Biol Chem. 2012 Apr;393(4):205-16; Lutsenko, S., et al. (2007). "Function and regulation of human copper-transporting ATPases." Physiological reviews 87(3): 1011-1046; Safaei, R., et al. (2013). "The role of metal binding and phosphorylation domains in the regulation of cisplatin-induced trafficking of ATP7B." Metallomics 5(8): 964-972]; 및 미국 특허 공보 제2015/0045284호(이들은 각각 본 명세서에 참고로 포함됨)를 참조한다.
일 실시형태에서, hATP7B를 암호화하는 핵산 서열은 서열 번호 3 또는 서열 번호 1, 또는 서열 번호 17, 서열 번호 18, 서열 번호 19, 서열 번호 20, 서열 번호 21 또는 서열 번호 22에 기재된 임의의 변이체의 네이티브 hATP7B 암호화 서열과 적어도 95%의 동일성을 공유한다. 또 다른 실시형태에서, hATP7B를 암호화하는 핵산 서열은 서열 번호 3 또는 서열 번호 1, 또는 서열 번호 17, 서열 번호 18, 서열 번호 19, 서열 번호 20, 서열 번호 21 또는 서열 번호 22에 기재된 임의의 변이체의 네이티브 hATP7B 암호화 서열과 적어도 90%, 85%, 80%, 75%, 70% 또는 65%의 동일성을 공유한다. 일 실시형태에서, hATP7B를 암호화하는 핵산 서열은 서열 번호 3 또는 서열 번호 1, 또는 서열 번호 17, 서열 번호 18, 서열 번호 19, 서열 번호 20, 서열 번호 21 또는 서열 번호 22에 기재된 임의의 변이체의 네이티브 hATP7B 암호화 서열과 적어도 79%의 동일성을 공유한다. 일 실시형태에서, hATP7B를 암호화하는 핵산 서열은 서열 번호 1이다. 또 다른 실시형태에서, hATP7B를 암호화하는 핵산 서열은 서열 번호 17이다. 또 다른 실시형태에서, hATP7B를 암호화하는 핵산 서열은 서열 번호 18이다. 또 다른 실시형태에서, hATP7B를 암호화하는 핵산 서열은 서열 번호 19이다. 또 다른 실시형태에서, hATP7B를 암호화하는 핵산 서열은 서열 번호 20이다. 또 다른 실시형태에서, hATP7B를 암호화하는 핵산 서열은 서열 번호 21이다. 또 다른 실시형태에서, hATP7B를 암호화하는 핵산 서열은 서열 번호 22이다.
코돈 최적화된 암호화 영역은 다양한 상이한 방법에 의해 설계될 수 있다. 이 최적화는 온라인으로 이용 가능한 방법(예를 들어, GeneArt), 공개된 방법 또는 예를 들어 DNA2.0(캘리포니아주 멜론 파크)으로서 코돈 최적화 서비스를 제공하는 회사를 사용하여 수행될 수 있다. 하나의 코돈 최적화 접근법은 예를 들어 국제 특허 공보 WO 제2015/012924호(본 명세서에 참고로 포함됨)에 기재되어 있다. 또한, 예를 들어 미국 특허 공보 제2014/0032186호 및 미국 특허 공보 제2006/0136184호를 참조한다. 적합하게, 생성물에 대한 오픈 리딩 프레임(open reading frame: ORF)의 전체 길이는 변형된다. 그러나, 몇몇 실시형태에서, 오직 ORF의 단편이 변경될 수 있다. 이들 방법 중 하나를 사용함으로써, 임의의 소정의 폴리펩타이드 서열에 빈도수를 적용하고, 폴리펩타이드를 암호화하는 코돈 최적화된 암호화 영역의 핵산 단편을 생성할 수 있다.
코돈에 실제 변형을 수행하거나 또는 본 명세서에 기재된 바대로 설계된 코돈 최적화된 암호화 영역을 합성하기 위한 다수의 옵션이 이용 가능하다. 이러한 변형 또는 합성은 당업자에게 널리 공지된 표준 및 일상적 분자 생물학적 조작을 이용하여 수행될 수 있다. 하나의 접근법에서, 각각 원하는 서열의 길이의 및 이 길이에 이르는 80개 내지 90개의 뉴클레오타이드의 일련의 상보성 올리고뉴클레오타이드 쌍은 표준 방법에 의해 합성된다. 이 올리고뉴클레오타이드 쌍은 어닐링 시 이들이 응집성 말단을 함유하는 80개 내지 90개의 염기쌍의 이중 표준 단편을 형성하도록 합성되고, 예를 들어 쌍에서의 각각의 올리고뉴클레오타이드는 쌍에서의 다른 올리고뉴클레오타이드에 상보성인 영역을 넘어 3개, 4개, 5개, 6개, 7개, 8개, 9개, 10개, 또는 이것 초과의 염기를 확장하도록 합성된다. 올리고뉴클레오타이드의 각각의 쌍의 단일 가닥 말단은 올리고뉴클레오타이드의 또 다른 쌍의 단일 가닥 말단과 어닐링하도록 설계된다. 올리고뉴클레오타이드 쌍은 어닐링하도록 허용되고, 이들 이중 가닥 단편의 대략 5개 내지 6개는 이후 응집성 단일 가닥 말단을 통해 함께 어닐링하도록 허용되고, 이후 이들은 함께 결찰되고, 표준 박테리아 클로닝 벡터, 예를 들어 Thermo Fisher Scientific Inc.로부터 구입 가능한 TOPO(등록상표) 벡터로 클로닝된다. 작제물은 이후 표준 방법에 의해 서열분석된다. 함께 결찰되는 80개 내지 90개의 염기쌍 단편의 5개 내지 6개의 단편, 즉 약 500개의 염기쌍의 단편으로 이루어진 이들 작제물 중 몇몇은 제조되어서, 전체 원하는 서열은 일련의 플라스미드 작제물에서 표시된다. 이들 플라스미드의 인서트는 이후 적절한 제한 효소에 의해 절단되고 함께 결찰되어 최종 작제물을 형성한다. 최종 작제물은 이후 표준 박테리아 클로닝 벡터로 클로닝되고 서열분석된다. 추가적인 방법은 당업자에게 즉시 명확할 것이다. 또한, 유전자 합성은 용이하게 상업적으로 이용 가능하다.
본 명세서에 기재된 치료의 목표는 25% 이상의 혈청 구리 수준을 감소시키는 기능적 ATP7B 효소를 제공하는 것이다. 일 실시형태에서, 24시간마다 3 내지 8pmol 이하의 뇨 구리 배설이 요망된다.
본 명세서에 기재된 치료의 1차/2차 목표는, 제한 없이, 하기를 포함한다.
Figure 112019075951179-pct00002
혈청 비세룰로플라스민 결합된 구리(NCC)의 정상화(150㎍/ℓ 미만)
Figure 112019075951179-pct00003
혈청 아미노전환효소의 정상화(간 생화학물질, ALT/AST)
Figure 112019075951179-pct00004
뇨 Cu의 정상화(40㎍/24시간(0.6μmol/24시간) ULN 미만)
Figure 112019075951179-pct00005
혈청 세룰로플라스민의 정상화(200㎎/ℓ 초과)[부합하지 않을 수 있음]
Figure 112019075951179-pct00006
Clinician Global Impression(CGI) 척도의 개선[1: 중증도 및 2: 전체 개선)
Figure 112019075951179-pct00007
AE의 발생률
배타적:
Figure 112019075951179-pct00008
65Cu, 질량 분광법에 의해 검출될 수 있는 구리의 비방사성 동위원소
Figure 112019075951179-pct00009
IQ, 신경인지 및 정신의학 기능의 개선(통합된 윌슨병 순취 척도(Unified Wilson's Disease Rating Scale: UWDRS) 및 미니 국제 신경정신의학 인터뷰(Mini International Neuropsychiatric Interview: M.I.N.I.)); 및
Figure 112019075951179-pct00010
PRO(EQ5D, MMAS-8, TSQM)
일 실시형태에서, "대상체" 또는 "환자"는 상기 기재된 바와 같은 WD를 갖는 포유류 대상체이다. 임의의 중증도의 WD를 갖는 환자가 의도된 대상체인 것으로 의도된다.
5.1.1.2. rAAV 벡터
ATP7B가 간에서 자연적으로 발현되므로, 간에 대한 지향성을 나타내는 AAV를 사용하는 것이 바람직하다. 일 실시형태에서, 캡시드를 공급하는 AAV는 AAV8이다. 또 다른 실시형태에서, 캡시드를 공급하는 AAV는 AAVrh.10이다. 더욱 또 다른 실시형태에서, 캡시드를 공급하는 AAV는 계통군 E AAV이다. 이러한 AAV는 rh.2; rh.10; rh.25; bb.1, bb.2, pi.1, pi.2, pi.3, rh.38, rh.40, rh.43, rh.49, rh.50, rh.51, rh.52, rh.53, rh.57, rh.58, rh.61, rh.64, hu.6, hu.17, hu.37, hu.39, hu.40, hu.41, hu.42, hu.66 및 hu.67을 포함한다. 이 계통군은 변형된 rh.2; 변형된 rh.58; 및 변형된 rh.64를 추가로 포함한다. WO 제2005/033321호(본 명세서에 참고로 포함됨)를 참조한다. 그러나, 간 지향성을 갖는 임의의 다수의 rAAV 벡터를 사용할 수 있다.
하기에, 실시예에 기재된 구체적인 실시형태에서, 유전자 치료 벡터는 AAV8.En34.TBG-S1.hATP7Bco.PA75라 칭해지는 타이록신 결합 글로불린(TBG-S1) 촉진자의 제어 하에 hATP7B 전이유전자를 발현하는 AAV8 벡터이다. 외부 AAV 벡터 성분은 혈청형 8이다, T = 1, 1:1:10의 비율로 VP1, VP2 및 VP3인 3개의 AAV 바이러스 단백질의 60개의 카피로 이루어진 20면체 캡시드. 캡시드는 단일 가닥 DNA rAAV 벡터 게놈을 함유한다. 이때, 벡터 게놈은 인트론 서열을 추가로 포함할 수 있으며, 상기 인트론 서열은 인간 베타 글로빈 IVS2 또는 SV40로부터 유래인 것일 수 있다.
일 실시형태에서, rAAV.hATP7B 게놈은 2개의 AAV 역위 말단 반복(ITR)에 의해 측접된 hATP7B 전이유전자를 함유한다. 일 실시형태에서, hATP7B 전이유전자는 인핸서, 촉진자, hATP7B 암호화 서열 및 폴리아데닐화(polyA) 신호 중 하나 이상을 포함한다. 이 제어 서열은 hATP7B 유전자 서열에 "작동 가능하게 연결"된다. 이 서열을 함유하는 발현 카세트는 바이러스 벡터의 제조에 사용된 플라스미드로 조작될 수 있다.
ITR은 벡터 제조 동안 게놈의 복제 및 패키징을 담당하는 유전 요소이고, rAAV를 생성하기 위해 필요한 유일한 바이러스 cis 요소이다. AAV 바이러스 입자로 발현 카세트를 패키징하기 위해 필요한 최소 서열은 캡시드와 동일한 AAV 기원이거나, (AAV 위형을 제조하기 위한) 상이한 AAV 기원일 수 있는 AAV 5' 및 3' ITR이다. 일 실시형태에서, AAV2로부터의 ITR 서열, 또는 이의 결실된 버전(ΔITR)을 사용한다. 그러나, 다른 AAV 소스로부터의 ITR을 선택할 수 있다. ITR의 소스가 AAV2 유래이고 AAV 캡시드가 또 다른 AAV 소스 유래일 때, 생성된 벡터는 위형이라 칭해질 수 있다. 통상적으로, AAV 벡터에 대한 발현 카세트는 AAV 5' ITR, hATP7B 암호화 서열 및 임의의 조절 서열 및 AAV 3' ITR을 포함한다. 그러나, 이 요소의 다른 구성이 적합할 수 있다. D-서열 및 말단 분해 부위(trs)가 결실된, ΔITR이라 칭해지는, 5' ITR의 짧아진 버전이 기재되어 있다. 다른 실시형태에서, 전장 AAV 5' 및 3' ITR을 사용한다. 일 실시형태에서, 5' ITR은 서열 번호 14에 기재된 것이다. 일 실시형태에서, 3' ITR은 서열 번호 15에 기재된 것이다.
일 실시형태에서, 발현 제어 서열은 하나 이상의 인핸서를 포함한다. 일 실시형태에서, 서열 번호 4에 기재된 En34 인핸서(인간 아포리포단백질 간 제어 영역으로부터의 34bp 코어 인핸서)가 포함된다. 또 다른 실시형태에서, EnTTR(트란스타이레틴으로부터의 100bp 인핸서 서열)이 포함된다. 이러한 서열은 서열 번호 5에 기재되어 있다. 문헌[Wu et al, Molecular Therapy, 16(2):280-289, Feb. 2008](본 명세서에 참고로 포함됨)을 참조한다. 더욱 또 다른 실시형태에서, α1-마이크로글로불린/비쿠닌 전구체 인핸서가 포함된다. 더욱 또 다른 실시형태에서, ABPS(α1-마이크로글로불린/비쿠닌 전구체[ABP]로부터 42bp로 100bp 원위 인핸서의 짧아진 버전) 인핸서가 포함된다. 이러한 서열은 서열 번호 6에 기재되어 있다. 더욱 또 다른 실시형태에서, ApoE 인핸서가 포함된다. 이러한 서열은 서열 번호 7에 기재되어 있다. 또 다른 실시형태에서, 하나 초과의 인핸서가 존재한다. 이러한 조합은 본 명세서에 기재된 임의의 인핸서의 하나 초과의 카피, 및/또는 인핸서의 하나 초과의 유형을 포함할 수 있다.
hATP7B 암호화 서열의 발현은 간 특이적 촉진자로부터 추진된다. ATP7B 전이유전자의 크기 때문에, 비교적 작은 크기의 촉진자의 사용이 바람직하다. 본 명세서에 기재된 예시적인 플라스미드 및 벡터는 변형된 타이록신 결합 글로불린(TBG-S1) 촉진자(서열 번호 8)를 사용한다. 또 다른 실시형태에서, TBG 촉진자를 사용한다. TBG 촉진자 서열은 서열 번호 9에 기재되어 있다. 대안적으로, 다른 간 특이적 촉진자, 예컨대 서열 번호 11에 기재된 바와 같은 트란스타이레틴 촉진자(TTR 촉진자) 또는 서열 번호 11의 21번 nt 내지 190번 nt에 기재된 바와 같은 변형된 트란스타이레틴 촉진자(mTTR 촉진자)를 사용할 수 있다. 또 다른 적합한 촉진자는 알파 1 항-트립신(AlAT), 또는 이의 변형된 버전(이의 서열은 서열 번호 10에 기재됨)이다. 다양한 촉진자 및 인핸서 조합은 하기 실시예에 기재되어 있다.
다른 적합한 촉진자는 인간 알부민(Miyatake et al., J. Virol., 71:5124 32 (1997)), humAlb; 간 특이적 촉진자(LSP) 및 B형 간염 바이러스 코어 촉진자(Sandig et al., Gene Ther., 3:1002-9 (1996))를 포함한다. 예를 들어, 문헌[The Liver Specific Gene Promoter Database, Cold Spring Harbor, http://rulai.schl.edu/LSPDrulai.schl.edu/LSPD](참고로 포함됨)을 참조한다. 덜 바람직하지만, 다른 촉진자, 예컨대 바이러스 촉진자, 구성적 촉진자, 조절 가능한 촉진자[예를 들어, WO 제2011/126808호 및 WO 제2013/04943호 참조], 또는 생리학적 신호에 반응하는 촉진자는 본 명세서에 기재된 벡터에서 사용될 수 있다.
촉진자 이외에, 발현 카세트 및/또는 벡터는 다른 적절한 전사 개시, 종결, 인핸서 서열 및 효율적인 RNA 처리 신호를 함유할 수 있다. 이러한 서열은 스플라이싱 및 폴리아데닐화(polyA) 신호; 발현을 증대시키는 조절 요소(예를 들어, WPRE); 세포질 mRNA를 안정화시키는 서열; 번역 효율을 증대시키는 서열(즉, Kozak 공통 서열); 단백질 안정성을 증대시키는 서열; 및 원할 때, 암호화된 생성물의 분비를 증대시키는 서열을 포함한다. 일 실시형태에서, KOZAK 서열이 포함된다. 일 실시형태에서, 폴리아데닐화(polyA) 신호는 hATP7B mRNA 전사체의 종결을 매개하도록 포함된다. 본 명세서에서 유용한 polyA 신호는 서열 번호 13에 기재된 약 75bp 크기인 인공 polyA(PA75)이다. 다른 적합한 polyA 서열의 예는 무엇보다도 예를 들어 소 성장 호르몬(서열 번호 12), SV40, 토끼 베타 글로빈 및 TK polyA를 포함한다.
일 실시형태에서, 조절 서열은 전체 rAAV 벡터 게놈이 약 3.0 내지 약 5.5 킬로염기 크기이도록 선택된다. 일 실시형태에서, rAAV 벡터 게놈가 네이티브 AAV 게놈의 크기에 근접한 것이 바람직하다. 따라서, 일 실시형태에서, 조절 서열은 전체 rAAV 벡터 게놈이 약 4.7kb 크기이도록 선택된다. 또 다른 실시형태에서, 전체 rAAV 벡터 게놈은 5.2kb 크기 미만이다. 추가의 실시형태에서, 전체 rAAV 벡터 게놈은 약 5.1kb 또는 약 5.0kb 크기이다. 벡터 게놈의 크기는 촉진자, 인핸서, 인트론, polyA 등을 포함하는 조절 서열의 크기에 기초하여 조작될 수 있다. 문헌[Wu et al, Mol Ther, Jan 2010 18(1): 80-6](본 명세서에 참고로 포함됨)을 참조한다.
일 실시형태에서, rAAV 벡터 게놈은 서열 번호 23의 1번 nt 내지 5134번 nt, 서열 번호 24의 1번 nt 내지 5056번 nt, 서열 번호 25의 1번 nt 내지 5064번 nt, 서열 번호 26의 1번 nt 내지 5068번 nt, 서열 번호 27의 1번 nt 내지 5048번 nt, 서열 번호 28의 1번 nt 내지 4284번 nt, 서열 번호 29의 1번 nt 내지 4677번 nt, 서열 번호 30의 1번 nt 내지 4978번 nt, 서열 번호 31의 1번 nt 내지 4876번 nt, 서열 번호 32의 1번 nt 내지 4945번 nt, 서열 번호 33의 1번 nt 내지 3628번 nt, 서열 번호 34의 1번 nt 내지 4021번 nt 또는 서열 번호 35의 1번 nt 내지 4627번 nt를 포함한다.
rAAV를 생성하기 위한 예시적인 제조 플라스미드는 서열 번호 23, 서열 번호 24, 서열 번호 25, 서열 번호 26, 서열 번호 27, 서열 번호 28, 서열 번호 29, 서열 번호 30, 서열 번호 31, 서열 번호 32, 서열 번호 33, 서열 번호 34 및 서열 번호 35에 기재되어 있다.
5.1.2. 조성물
일 실시형태에서, rAAV.hATP7B 바이러스는 수성 담체, 부형제, 희석제 또는 완충제를 포함하는 약제학적 조성물에 제공된다. 일 실시형태에서, 완충제는 PBS이다. 구체적인 실시형태에서, rAAV.hATP7B 제제는 TMN200(200mM 염화나트륨, 1mM 염화마그네슘, 20mM Tris(pH 8.0)) 중에 0,001% Pluronic F-68을 함유하는 수성 용액 중에 현탁된 유효량의 rAAV.hATP7B 벡터를 함유하는 현탁액이다. 그러나, 완충 식염수, 계면활성제 및 약 100mM 염화나트륨(NaCl) 내지 약 250mM 염화나트륨에 동등한 이온 농도로 조정된 생리학적으로 상용성인 염 또는 염의 혼합물, 또는 동등한 이온 농도로 조정된 생리학적으로 상용성인 염 중 하나 이상을 포함하는 것을 포함하는, 다양한 적합한 용액이 공지되어 있다.
예를 들어, 본 명세서에 제공된 바와 같은 현탁액은 NaCl 및 KCl 둘 다를 함유할 수 있다. pH는 6.5 내지 8.5, 또는 7 내지 8.5, 또는 7.5 내지 8의 범위일 수 있다. 적합한 계면활성제, 또는 계면활성제의 조합은 폴록사머, 즉 폴리옥시에틸렌(폴리에틸렌 옥사이드)의 2개의 친수성 사슬에 의해 측접된 폴리옥시프로필렌(폴리프로필렌 옥사이드)의 중앙 소수성 사슬로 이루어진 비이온성 삼중블록 공중합체, SOLUTOL HS 15(마크로골-15 하이드록시스테아레이트), LABRASOL(폴리옥시 카프릴릭 글라이세라이드), 폴리옥시 10 올레일 에터, TWEEN(폴리옥시에틸렌 소르비탄 지방산 에스터), 에탄올 및 폴리에틸렌 글라이콜 중에서 선택될 수 있다. 일 실시형태에서, 제제는 폴록사머를 함유한다. 이 공중합체는 흔히 철자 "P"(폴록사머에 대해), 이어서 3개의 숫자에 의해 명명된다: 처음의 2개의 숫자 x 100은 폴리옥시프로필렌 코어의 근사 분자 질량을 주고, 마지막 숫자 x 10은 백분율 폴리옥시에틸렌 함량을 준다. 일 실시형태에서, 폴록사머 188이 선택된다. 계면활성제는 현탁액의 약 0.0005% 내지 약 0.001% 이하의 양으로 존재할 수 있다. 또 다른 실시형태에서, 벡터는 180mM 염화나트륨, 10mM 인산나트륨, 0.001% 폴록사머 188(pH 7.3)을 함유하는 수성 용액 중에 현탁된다.
일 실시형태에서, 제제는 인간 대상체에서 사용하기에 적합하고, 정맥내 투여된다. 일 실시형태에서, 제제는 볼루스 주사에 의해 말초 정맥을 통해 전달된다. 일 실시형태에서, 제제는 약 10분(±5분)에 걸쳐 점적주사에 의해 말초 정맥을 통해 전달된다. 일 실시형태에서, 제제는 약 20분(±5분)에 걸쳐 점적주사에 의해 말초 정맥을 통해 전달된다. 일 실시형태에서, 제제는 약 30분(±5분)에 걸쳐 점적주사에 의해 말초 정맥을 통해 전달된다. 일 실시형태에서, 제제는 약 60분(±5분)에 걸쳐 점적주사에 의해 말초 정맥을 통해 전달된다. 일 실시형태에서, 제제는 약 90분(±10분)에 걸쳐 점적주사에 의해 말초 정맥을 통해 전달된다. 그러나, 이 시간은 필요한 바대로 또는 원하는 바대로 조정될 수 있다. 임의의 적합한 방법 또는 경로는 본 명세서에 기재된 바대로 AAV 함유 조성물을 투여하고, 선택적으로, 본 명세서에 기재된 hATP7B의 AAV 매개된 전달과 함께 다른 활성 약물 또는 치료제를 동시투여하도록 사용될 수 있다. 투여의 경로는 예를 들어 전신, 경구, 흡입, 비강내, 기관내, 동맥내, 눈내, 정맥내, 근육내, 피하, 피내 및 투여의 다른 비경구 경로를 포함한다.
일 실시형태에서, 제제는 예를 들어 문헌[M. Lock et al, Hum Gene Ther Methods. 2014 Apr;25(2): 115-25. doi: 10.1089/hgtb.2013.131. Epub 2014 Feb 14](본 명세서에 참고로 포함됨)에 기재된 바와 같은 oqPCR 또는 디지털 드롭플렛 PCR(ddPCR)에 측정될 때 예를 들어 환자 체중의 1킬로그램당 약 1.0x1011 게놈 카피(GC/㎏) 내지 약 1x1014 GC/㎏, 환자 체중의 1킬로그램당 약 5x1011 게놈 카피(GC/㎏) 내지 약 3x1013 GC/㎏, 또는 약 1x1012 내지 약 1x1014 GC/㎏를 함유할 수 있다. 일 실시형태에서, rAAV.hATP7B 제제는 예를 들어 상기 M. Lock 등의 문헌에 기재된 바와 같은 oqPCR 또는 디지털 드롭플렛 PCR(ddPCR)에 측정될 때 적어도 1x1O13 게놈 카피(GC)/㎖, 또는 이것 초과를 함유하는 현탁액이다.
빈 캡시드가 환자에게 투여되는 AAV hATP7B의 용량으로부터 제거되도록 보장하도록, 빈 캡시드는 예를 들어 본 명세서에 기재된 방법을 이용하여 벡터 정제 공정 동안 벡터 입자로부터 분리된다. 일 실시형태에서, 패키징된 게놈을 함유하는 벡터 입자는 발명의 명칭이 "Scalable Purification Method for AAV8"인 WO 제2017/100676호(본 명세서에 참고로 포함됨)에 기재된 공정을 이용하여 빈 캡시드로부터 정제된다. 간단히, rAAV 제조 세포 배양의 청징된 농축 상청액으로부터 게놈 함유 rAAV 벡터 입자를 선택적으로 포획하고 단리시키는, 2단계 정제 계획이 기재되어 있다. 상기 공정은 실질적으로 rAAV 중간체가 없는 rAAV 벡터 입자를 제공하도록 고염 농도에서 수행된 친화도 포획 방법, 이어서 높은 pH에서 수행된 음이온 교환 수지 방법을 이용한다. 유사한 정제 방법은 다른 캡시드를 갖는 벡터에 사용될 수 있다.
임의의 종래의 제조 공정을 사용할 수 있지만, 본 명세서(및 WO 제2017/100676호)에 기재된 공정은 입자의 50% 내지 70%가 벡터 게놈을 갖는(즉, 50 내지 70% 충전 입자) 벡터 제제를 생성한다. 따라서, 1.6x1012 GC/㎏의 예시적인 용량에 대해, 전체 입자 용량은 2.3x1012 내지 3x1012 입자일 것이다. 또 다른 실시형태에서, 제안된 용량은 로그의 반 초과 또는 5x1012 GC/㎏이고, 전체 입자 용량은 7.6x1012 내지 1.1x1013 입자일 것이다. 일 실시형태에서, 제제는 1 이하, 바람직하게는 0.75 미만, 더 바람직하게는, 0.5, 바람직하게는 0.3 미만의 "빈" 대 "충전"의 비율을 갖는 rAAV 스톡을 특징으로 한다.
rAAV8 입자(패키징된 게놈)의 스톡 또는 제제는, 스톡 중의 rAAV8 입자가 스톡 중에 적어도 약 75% 내지 약 100%, 적어도 약 80%, 적어도 약 85%, 적어도 약 90%, 적어도 약 95% 또는 적어도 99%의 rAAV8이거나, "빈 캡시드"가 스톡 또는 제제 중에 약 1% 미만, 약 5% 미만, 약 10% 미만, 약 15% 미만의 rAAV8일 때, AAV 빈 캡시드(및 다른 중간체)가 "실질적으로 없다".
일반적으로, 패키징된 게놈을 갖는 빈 캡시드 및 AAV 벡터 입자를 평가하는 방법은 당해 분야에 공지되어 있다. 예를 들어, 문헌[Grimm et al., Gene Therapy (1999) 6:1322-1330; Sommer et al., Molec. Ther. (2003) 7:122-128]을 참조한다. 변성된 캡시드를 시험하기 위해, 상기 방법은 처리된 AAV 스톡을 3개의 캡시드 단백질을 분리시킬 수 있는 임의의 겔로 이루어진 SDS-폴리아크릴아마이드 겔 전기영동, 예를 들어 완충제 중에 3% 내지 8% Tris-아세테이트를 함유하는 구배 겔로 처리하고, 이후 샘플 재료가 분리될 때까지 겔을 흐르게 하고, 겔을 나일론 또는 나이트로셀룰로스 막, 바람직하게는 나일론으로 블로팅하는 것을 포함한다. 항-AAV 캡시드 항체는 이후 변성된 캡시드 단백질, 바람직하게는 항-AAV 캡시드 단일클론 항체, 가장 바람직하게는 B1 항-AAV-2 단일클론 항체에 결합하는 1차 항체로서 사용된다(Wobus et al., J. Virol. (2000) 74:9281-9293). 이후, 1차 항체에 결합하는 것인 2차 항체를 사용하고, 1차 항체, 더 바람직하게는 이것에 공유 결합된 검출 분자를 함유하는 항-IgG 항체, 가장 바람직하게는 겨자무 과산화효소에 공유 연결된 양 항-마우스 IgG 항체와의 결합을 검출하기 위한 수단을 함유한다. 결합을 검출하기 위한 방법, 바람직하게는 방사성 동위원소 방출, 전자기 방사선 또는 비색 변화를 검출할 수 있는 검출 방법, 가장 바람직하게는 화학발광 검출 키트는 1차 항체와 2차 항체 사이의 결합을 반정량적으로 결정하도록 사용된다. 예를 들어, SDS-PAGE에 대해, 칼럼 분획으로부터의 샘플을 환원제(예를 들어, DTE)를 함유하는 SDS-PAGE 로딩 완충제 중에 취해지고 가열될 수 있고, 캡시드 단백질은 프리 캐스팅된 구배 폴리 아크릴아마이드 겔(예를 들어, Novex)에서 해상되었다. 은 염색은 제조사의 지시에 따라 SilverXpress(Invitrogen(캘리포니아주))를 사용하여 수행될 수 있다. 일 실시형태에서, 칼럼 분획에서의 AAV 벡터 게놈(vg)의 농도는 정량적 실시간 PCR(Q-PCR)에 의해 측정될 수 있다. 샘플은 희석되고, 외인성 DNA를 제거하도록 DNase I(또는 또 다른 적합한 뉴클레아제)에 의해 분해된다. 뉴클레아제의 불활화 후, 샘플은 추가로 희석되고, 프라이머 및 프라이머 사이의 DNA 서열에 특이적인 TaqMan(상표명) 형광원 프로브를 사용하여 증폭된다. 한정된 형광 수준에 도달하는 데 필요한 사이클의 횟수(한계치 사이클, Ct)는 Applied Biosystems Prism 7700 Sequence Detection System에서 각각의 샘플에 대해 측정된다. AAV 벡터에 함유된 것과 동일한 서열을 함유하는 플라스미드 DNA는 Q-PCR 반응에서 표준 곡선을 생성하도록 사용된다. 샘플로부터 얻은 사이클 한계치(Ct) 값은 플라스미드 표준 곡선의 Ct 값에 이것을 정규화함으로써 벡터 게놈을 결정하도록 사용된다. 디지털 PCR에 기초한 종점 검정을 또한 사용할 수 있다.
일 양태에서, 광범위 세린 프로테아제, 예를 들어 단백분해효소 K(예컨대, Qiagen으로부터 상업적으로 구입 가능)를 사용하는 최적화된 q-PCR 방법이 본 명세서에 제공된다. 더 특히, 최적화된 qPCR 게놈 역가 검정은, DNase I 분해 후, 샘플이 단백분해효소 K 완충제에 의해 희석되고 단백분해효소 K에 의해 처리된 후 열 불활화된다는 것을 제외하고는, 표준 검정과 유사하다. 적합하게, 샘플은 샘플 크기와 동일한 양으로 단백분해효소 K 완충제에 의해 희석된다. 단백분해효소 K 완충제는 2배 이상으로 농축될 수 있다. 통상적으로, 단백분해효소 K 처리는 약 0.2㎎/㎖이지만, 0.1㎎/㎖ 내지 약 1㎎/㎖로 변할 수 있다. 처리 단계는 일반적으로 약 15분 동안 약 55℃에서 수행되지만, 더 긴 시간 기간(예를 들어, 약 20분 내지 약 30분)에 걸쳐 더 낮은 온도(예를 들어, 약 37℃ 내지 약 50℃)에서 또는 더 짧은 시간 기간(예를 들어, 약 5 내지 10분) 동안 더 높은 온도(예를 들어. 약 60℃ 이하)에서 수행될 수 있다. 유사하게, 열 불활화는 일반적으로 약 15분 동안 약 95℃에 있지만, 온도는 낮아지고(예를 들어, 약 70 내지 약 90℃), 시간 연장(예를 들어, 약 20분 내지 약 30분)이 될 수 있다. 샘플은 이후 희석(예를 들어, 1000배)되고, 표준 검정에 기재된 바대로 TaqMan 분석으로 처리될 수 있다.
추가적으로, 또는 대안적으로, 디지털 드롭플렛 PCR(ddPCR)을 사용할 수 있다. 예를 들어, ddPCR에 의해 단일 가닥 및 자가 상보성 AAV 벡터 게놈 역가를 결정하기 위한 방법은 기재되어 있다. 예를 들어, 문헌[M. Lock et al, Hu Gene Therapy Methods, Hum Gene Ther Methods. 2014 Apr;25(2): 115-25. doi: 10.1089/hgtb.2013.131. Epub 2014 Feb 14]을 참조한다.
5.2. 환자 집단
상기 기재된 바대로, 임의의 중증도의 WD를 갖는 대상체는 본 명세서에 기재된 조성물 및 방법의 의도된 수혜자이다.
대상체는 이의 보호 의사의 결정에 의해 유전자 치료제 치료 전에 및 이와 동시에 이의 관리 표준 치료(들)(예를 들어, 저 구리 식이; 킬레이트화제, 예컨대 D-페니실라민 및 트라이엔틴에 의한 치료. 다른 물질은 나트륨 다이머캅토숙시네이트, 다이머캅토숙신산, 아연 및 테트라티오몰리브데이트를 포함)를 계속하도록 허용될 수 있다. 대안에서, 의사는 유전자 치료제 치료를 투여하기 전에 관리 표준 치료를 중단하는 것을 선호하고, 선택적으로, 유전자 치료의 투여 후 동시치료로서 관리 표준 치료를 재개할 수 있다.
유전자 치료 섭생의 원하는 종점이 25% 이상의 혈청 구리 수준을 감소시키는 기능적 ATP7B 효소를 제공할 것이다. 일 실시형태에서, 24시간당 3 내지 8pmol 이하의 뇨 구리 배설이 바람직하다.
윌슨병을 가질 수 있는 환자를 조사하기 위해 비세룰로플라스민 결합된 구리(NCC; 또한 "유리 구리" 또는 구리 지수라 칭함), 24시간 뇨 구리, 간 구리 및 유전자 돌연변이 시험을 포함하는, 많은 시험이 사용될 수 있다. 구리 수준을 측정하는 방법은 예를 들어 문헌[McMillin et al, Am J Clin Pathol. 2009; 131(2): 160-165](본 명세서에 참고로 포함됨)에 기재된 바대로 당해 분야에 공지되어 있다. 일 실시형태에서, 환자는 단독의 및/또는 보조 치료의 사용과 조합된 rAAV.hATP7B에 의한 치료 후 원하는 순환 ATP7B 수준을 달성한다.
5.3. 투약 및 투여의 경로
일 실시형태에서, rAAV.hATP7B 벡터는 환자마다 단일 용량으로 전달된다. 일 실시형태에서, 대상체는 (본 명세서에서 실시예에 기재된 전임상 연구에 의해 결정된 바대로) 최소 유효 용량(minimal effective dose: MED)이 전달된다. 본 명세서에 사용된 바대로, MED는 25% 이상의 혈청 구리 수준을 감소시키는 기능적 ATP7B 효소를 제공하는 데 필요한 rAAV.hATP7B 용량을 의미한다.
종래처럼, 벡터 역가는 벡터 제제의 DNA 함량에 기초하여 결정된다. 일 실시형태에서, 실시예에 기재된 바와 같은 정량적 PCR 또는 최적화된 정량적 PCR은 rAAV.hATP7B 벡터 제제의 DNA 함량을 결정하도록 사용된다. 일 실시형태에서, 상기에 기재된 바와 같은 디지털 드롭플렛 PCR은 rAAV.hATP7B 벡터 제제의 DNA 함량을 결정하도록 사용된다. 일 실시형태에서, 투약량은 종점을 포함하여 약 1x1O11 게놈 카피(GC)/㎏(체중) 내지 약 1x1013 GC/㎏이다. 일 실시형태에서, 투약량은 5x1011 GC/㎏이다. 또 다른 실시형태에서, 투약량은 5x1012 GC/㎏이다. 구체적인 실시형태에서, 환자에게 투여되는 rAAV.hATP7B의 용량은 적어도 5x1011 GC/㎏, 1x1012 GC/㎏, 1.5x1012 GC/㎏, 2.0x1012 GC/㎏, 2.5x1012 GC/㎏, 3.0x1012 GC/㎏, 3.5x1012 GC/㎏, 4.0x1012 GC/㎏, 4.5x1012 GC/㎏, 5.0x1012 GC/㎏, 5.5x1012 GC/㎏, 6.0x1012 GC/㎏, 6.5x1012 GC/㎏, 7.0x1012 GC/㎏, 또는 7.5x1012 GC/㎏이다. 또한, 복제 결핍 바이러스 조성물은 약 1.0x109 GC 내지 약 1.0x1015 GC의 범위인 복제 결핍 바이러스의 양을 함유하도록 투약량 단위에서 제제화될 수 있다. 본 명세서에 사용된 바대로, 용어 "투약량"은 치료 과정에서 대상체에게 전달되는 전체 투약량, 또는 단일(또는 복수) 투여에서 전달되는 양을 의미할 수 있다.
몇몇 실시형태에서, rAAV.hATP7B는 WD의 치료를 위한 하나 이상의 치료, 예컨대 저 구리 식이 또는 D-페니실라민, 트라이엔틴, 나트륨 다이머캅토숙시네이트, 다이머캅토숙신산, 아연, 및/또는 테트라티오몰리브데이트의 투여와 조합되어 투여된다.
5.4. 임상 목적의 측정
치료의 효율의 측정은 ATP7B 활성 및 또는 비세룰로플라스민 결합된 구리(NCC; 또한 "유리 구리" 또는 구리 지수라고 칭함), 24시간 뇨 구리 또는 간 구리 수준에 의해 결정된 바대로 전이유전자 발현 및 활성에 의해 측정될 수 있다. 효율의 추가의 평가는 식이 구리 내약성의 임상 평가에 의해 결정될 수 있다.
본 명세서에 사용된 바대로, 본 명세서에서 rAAV.hATP7B 벡터는, 환자가 비세룰로플라스민 결합된 구리, 24시간 뇨 구리, 및/또는 간 구리의 25% 이상 감소를 발생시키는 ATP7B 활성을 달성하도록 충분한 수준의 ATP7B를 발현할 때 활성 ATP7B에 의해 환자 결핍 ATP7B를 "기능적으로 대체한다" 또는 "기능적으로 보충한다".
하기 실시예는 오직 예시적이고 본 발명을 제한하도록 의도되지 않는다.
실시예
하기 실시예는 오직 예시적이고 본 발명을 제한하도록 의도되지 않는다.
실시예 1: hATP7B를 함유하는 AAV 벡터(AAV.hATP7Bco)
예시적인 유전자 치료 벡터 AAV8.En34.TBG-S1.hATP7Bco.PA75를 TBG-S1 촉진자 및 En34 인핸서의 제어 하에 코돈 최적화된 인간 hATP7B cDNA(hATP7Bco)를 보유하는 AAV8 벡터에 의해 작제하였다(도 1). ATP7B 발현 카세트는 AAV2 유래 역위 말단 반복(ITR)에 의해 측접되고 Kozak 공통 서열 및 PA75 poly(A) 신호를 추가로 포함하였다. AAV8.En34.TBG-S1.hATP7Bco.PA75 게놈의 서열은 서열 번호 24의 1번 nt 내지 5056번 nt에 기재되어 있다.
벡터 AAV8.En34.TTR.hATP7Bco.PA75를 TBG-S1 대신에 간세포 특이적 TTR 촉진자에 의해 상기 기재된 바대로 작제하였다. AAV8.En34.TTR.hATP7Bco.PA75의 서열은 서열 번호 26의 1번 nt 내지 5068번 nt에 기재되어 있다.
TBG-S1 대신에 서열 번호 11의 21번 nt 내지 190번 nt로 기재된 서열을 갖는 변형된 TTR 촉진자는 벡터 AAV.En34.mTTR.hATP7Bco.PA75를 작제하도록 사용되었다. AAV.En34.mTTR.hATP7Bco.PA75의 서열은 서열 번호 27의 1번 nt 내지 5048번 nt에 기재되어 있다.
AAV8.EnTTR.TTR.hATP7Bco.PA75 벡터의 ATP7B 발현 카세트는 Kozak 공통 서열 및 PA75 poly(A) 신호를 갖는 EnTTR 인핸서 및 TTR 촉진자에 의해 추진되었다. AAV8.EnTTR.TTR.hATP7Bco.PA75의 서열은 서열 번호 23의 1번 nt 내지 5134번 nt에 기재되어 있다.
AAV8.EnABPS.TBG-S1.hATP7Bco.PA75 벡터는 Kozak 공통 서열 및 PA75 poly(A) 신호를 갖는 ABP-S2(ABPS 인핸서) 인핸서 및 TBG-S1 촉진자의 제어 하에 코돈 최적화된 인간 ATP7B cDNA(hATP7Bco)를 암호화한다. AAV8.ABPS.TBG-S1.hATP7Bco.PA75의 서열은 서열 번호 25의 1번 nt 내지 5064번 nt에 기재되어 있다.
추가적으로, AAV8.En34.TBG-S1.hATP7Bco(MBD1Del).PA75(서열 번호 32의 1번 nt 내지 4945번 nt에 기재됨), AAV8.En34.TBG-S1.hATP7Bco(MBD2Del).PA75(서열 번호 31의 1번 nt 내지 4876번 nt에 기재됨), AAV8.En34.TBG-S1.hATP7Bco(MBD3Del).PA75(서열 번호 30의 1번 nt 내지 4978번 nt), AAV8.En34.TBG-S1.hATP7Bco(MBD1-2Del).PA75(서열 번호 35의 1번 nt 내지 4627번 nt), AAV8.En34.TBG-S1.hATP7Bco(MBD1-4Del).PA75(서열 번호 34의 1번 nt 내지 4021번 nt), AAV8.En34.TBG-S1.hATP7Bco(MBD1-5Del).PA75(서열 번호 33의 1번 nt 내지 3628번 nt), AAV8.TBG.hATP7Bco(MBD1-4Del).PA75(서열 번호 29의 1번 nt 내지 4677번 nt) 및 AAV8.TBG.hATP7Bco(MBD1-5Del).PA75(서열 번호 28의 1번 nt 내지 4284번 nt)를 포함하는 절두된 hATP7Bco 벡터를 표 2에 기재된 바대로 Kozak 공통 서열, PA75 Ploy(A) 신호 및 촉진자 및 인핸서를 갖는 표시된 절두된 hATP7Bco로서 설계하고 작제하고 제조하였다.
간단히, 감소된 크기의 트란스타이레틴 인핸서 및 촉진자로부터의 hATP7B(hATP7Bco)의 코돈 최적화된 버전을 발현하는 플라스미드를 AAV8 바이러스 캡시드에 의해 패키징하였다.
예를 들어, 문헌[Mizukami, Hiroaki, et al. A Protocol for AAV vector production and purification. Diss. Division of Genetic Therapeutics, Center for MolecularMedicine, 1998](본 명세서에 참고로 포함됨)에 의해 기재된 바대로 293 세포에서 종래의 삼중 형질주입 기법을 이용하여 벡터를 제조하였다. 모든 벡터는 이전에 기재된 바대로[Lock, M., et al, Hum Gene Ther, 21: 1259-1271 (2010)] 펜실베니아 대학교(University of Pennsylvania)에서의 Vector Core에 의해 제조되었다.
실시예 2: 윌슨병의 마우스 모델
윌슨병의 치료를 위한 유전자 치료학적 접근법의 개발 전에, 질환 표현형의 동물 모델은 완전히 규명되어야 한다. 본 명세서에 기재된 연구는 tx j 마우스 균주 둘 다의 처음의 자세한 규명 및 모든 Atp7b KO 마우스의 출생부터 양육 이후에 구리 대사 및 질환 병리학의 평가이다. 질환이 있는 모체의 유선의 Atp7b 결핍증으로 인해 약해지기 전에 제공된 상반되는 구리 결핍증의 부재 하에, 질환 진행의 시간 선은 정확히 결정되었다. Atp7b KO 마우스는 출생부터 간에 구리를 축적하고, 2개월령에 심각한 구리 축적이 공존하는 간 질환으로 명확하다.
단일 기관에 영향을 미치는 단일유전자 질환은 특히 비교적 조금 연관된 조직학적 병변이 있는 경우 유전자 치료 접근법에 대한 매력적인 표적이다. 그러나, 간에 영향을 미치는 대사 장애에 대해, 질환의 결과로서 간 유조직에 심각한 손상이 있을 수 있다. 이의 고전적인 예의 하나는 윌슨병 단백질(구리 수송 P형 ATPase, Atp7b)에서의 돌연변이에 의해 생긴 상염색체 열성 질환인 윌슨병이다. 기능적 Atp7b의 결여는 간 및 다른 조직에서 구리를 축적시키고, 이는 신경학적 또는 정신의학적 증상을 갖는 간 질환으로서 표출된다. 윌슨병은 킬레이트화 치료를 이용하여 구리 흡수를 감소시키거나 신체로부터 과도한 구리를 제거함으로써 치료될 수 있지만, 많은 다른 대사 장애에 대해서는, 간 이식은 질환과 연관된 유전자 결핍증을 수정하면서 기능이상 기관을 대체할 수 있다.
윌슨병은 상이한 질환 증상 및 진행을 갖는 30,000명 중 1명의 사람에게 영향을 미친다. 킬레이트화 및 간 이식에 대한 새로운 치료학적 대안의 개발이 가능하게 하도록, 이 질환의 신뢰할만한 동물 모델은 완전히 규명되어야 한다. 롱-에반스 계피(Long-Evans Cinnamon: LEC) 래트 및 다양한 형질전환 마우스 균주를 포함하는 윌슨병의 몇몇 이전에 보고된 래트 및 마우스 동물 모델이 있다(1-6). 마우스 모델에서의 윌슨병 표현형의 평가를 위해, 본 발명자들은 Jackson Labs로부터 구입 가능한 독성 젖 마우스(tx j )를 선택하였다(2). 이 마우스는 Atp7b 유전자에서 Gly712Asp 미스센스 돌연변이를 갖고, 이것은 암호화된 단백질의 제2 추정상 막-스패닝 도메인에 위치하고 기능이상 Atp7b 단백질을 발생시킨다.
독성 젖 마우스인 이 균주의 원래의 이름은 간 이외의 유방 조직에서 또한 발현되는 Atp7b의 결과이다. 따라서, 이 모델에서의 독성 젖 표현형의 "자발적 발생"은 윌슨병의 직접적인 결과이다(7). Atp7b 단백질의 결핍증으로 인해, 구리는 모체로부터 모유로 운반될 수 없다(8). 이환된 모체로부터 젖을 빠는 이환된 새끼는 이들이 젖을 떼고 일반 마우스 먹이를 소비할 때까지 식이에서 어떠한 구리도 받을 수 없으므로 윌슨병의 역형식(구리 결핍증)이 제시될 것이다. 윌슨병의 이 역형식은 또한 이전에 기재된 백색 코트 색상 및 정신 결함을 설명한다(9). 여기서, 본 발명자들은, 기능이상 Atp7b 단백질 및 이 연구에서 사용된 모든 마우스가 독성 젖 논의를 완화시키도록 출생의 72시간 내에 Balb/c 양육 모체로 양육된다는 사실로 인해, 이 마우스 모델을 tx j 로서가 아니라 Atp7b 넉아웃(KO)으로 기재하는 것을 선호한다. 따라서, 여기에 기재된 윌슨병 표현형의 규명은 젖 떼기 전에 구리 결핍증과 관련된 임의의 기초하는 논의로부터 분리된다.
모든 동물 절차는 펜실베니아 대학교의 동물 실험 윤리 위원회(Institutional Animal Care and Use Committee: IACUC)가 승인한 프로토콜에 따라 수행되었다.
ATP7B KO 마우스는 기능적 구리 수송 ATPase를 발현하지 않고(Lutsenko et al, Function and Regulation of Human Copper-Transporting ATPases, Physiological Reviews, 87(3): 1011-46 (July 2007), 이에 따라 윌슨병에 대한 마우스 모델로서 작용한다. 자연사 연구는 ATP7B KO 마우스에서 윌슨병의 진행을 평가하도록 수행되었다. 연구는 2개 단계로 수행되었다. 처음에, 마우스는 간 질환의 평가를 위한 다른 연령에 부검되었다 제2 단계에서, 마우스는 몇몇 바이오마커의 평가를 위해 9개월령으로 이어졌다.
Atp7b 이형접합성 및 KO 마우스는 2개월령으로부터 7개월 동안 각각 주마다 및 2주마다 기준으로 뇨 및 혈청 구리 수준에 대해 평가되었다(도 3a 및 도 3b). 간에서의 Atp7b는 대변에서의 배설을 위해 담즙으로 구리를 내보낸다(7). Atp7b의 부재 하에, 구리의 배설은 요로를 통해 발생할 것이다. 뇨 구리 수준은 시험된 유전자형 둘 다에서 초기에 유사하지만, 3개월령에 Atp7b KO 마우스의 뇨에서의 구리의 수준은 이형접합성 동물과 비교하여 증가하기 시작하였다(도 3a). 연구의 완료 시, 뇨 구리 수준은 평균하여 이형접합성 마우스에서 0.18pg/g 및 Atp7b KO 마우스에서 1.08pg/g이었다. 2개월령에 Atp7b KO 마우스에서의 혈청 구리 수준은 0.47pg/g와 비교하여 0.07pg/g에서 이형접합성 동물로부터 유의미하게 상이하였다(스튜던츠 t 시험에 의해 p<0.0001, 도 3b). 3 내지 4개월령에, Atp7b KO 마우스에서의 혈청 구리 수준은 상승하기 시작하여서, 이형접합성 마우스의 것과 동등한 수준에 도달하였다. 수컷 또는 암컷 마우스에서의 뇨 또는 혈청 구리 수준의 차이가 없거나 아주 적었다. 제1 단계의 결과는 출생부터 간에서의 구리의 축적이 관찰된다는 것을 보여준다. Atp7b KO 마우스가 2개월령에 도달할 때, Timm 구리 염색은 간에서의 심각한 구리 축적을 나타냈다(도 4).
간 대사에 영향을 미치는 단일유전자 질환은 간 병변을 갖는 것 및 갖지 않는 것의 2개의 하위카테고리로 분할될 수 있다. 윌슨병 환자는 보통 간경변으로 표출되는 증등도 내지 중증도의 간 질환을 나타낸다(13, 14). 따라서, 본 발명자들은 윌슨병의 이 마우스 모델에서 간 병리학의 발생에 대한 시간 과정을 평가하기를 원했다. Atp7b KO 마우스를 시간에 걸쳐 간 경변의 평가를 위해 2, 3, 4, 5, 9, 10 및 12개월령에 부검하였다(도 5). 간의 절편은 H&E에 의해 염색하고, 1 내지 5 스코어링 시스템에 따라 조직병리학에 대해 평가하였다(도 3c). 단일 세포 괴사 및 염증과 함께 최소 간세포 비대 및 퇴행은 2개월령으로부터의 Atp7b KO 마우스에 존재하였다. 간세포 비대, 퇴행 및 괴사의 중증도는 6개월령에 가장 높았고, 이후 일정하게 있었다. 염증, 담관 증생 및 타원형 세포 증생을 포함하는 평가된 다른 매개변수는 2 내지 3개월령으로부터 7개월령으로 시간이 지나면서 증가하였다. 각각 ALT 및 AST에 대해 10개월에 2개월령에서의 정상 값으로부터 199 U/ℓ 및 381 U/ℓ로, ALT 및 AST인 간 아미노기전이효소의 공존하는 상승이 있었다(표 3). 10개월령에서의 간 손상의 정도는 2.5㎎/㎗에서 급격히 스파이킹된 것으로서 혈청 총 빌리루빈 수준으로부터 또한 명확했다. 간 병변 이외에, 간 결절 재생의 부위는 이 마우스 모델에서 6개월령으로부터 명확했다(예는 도 5에서 별표로 표시됨). 이것은 아마도 간 질환의 중증도로 인해 놀랍지 않다.
간 절편을 또한 각각 씨리우스 레드 및 팀 염색에 의해 섬유증 및 구리 축적에 대해 평가하였다(도 5). 국소 또는 다원성 문맥주위 섬유증은 Atp7b KO 마우스에서 3개월령에 보였다. 이것은 7개월령에 구성적 파괴에 의해 미만성 가교 섬유증으로 빠르게 진행하였다. 간 병변의 발생은 아마도 팀 염색에 의해 보인 것처럼 간에서의 거대한 구리 축적으로 인한다(도 5). 2개월령으로부터, Atp7b KO 마우스의 간은 검정 염색에 의해 보인 것처럼 구리에 의해 포화되었다. 간에서의 구리의 축적은 기능적 Atp7b의 부재 하에 담즙으로의 구리의 방해된 배출로 인해 생긴다. 간에서의 구리의 수준은 아마도 간세포 손상 및 혈청으로의 구리의 방출로 인해 시간이 지나면서 감소하였다. 이것은 이전에 나타났고, 여기서 구리 값은 준거대 또는 거대 괴사에 의해 유의미하게 감소하고, 재생 및 섬유증에 의해 더욱 더 감소하였다(1, 15-17). 섬유성 연결 조직 및 재생 간세포는 과도한 구리 농도를 함유하지 않는다(18).
ATP7B KO 마우스의 뇨에서의 구리 수준은 또한 모니터링되었다. 샘플을 자연사 연구에서 주마다 수집하고, 이후 유도 커플링된 플라즈마-질량 분광법을 수행하여 구리 농도를 평가하였다. 결과는 이형접합성 한배새끼가 낮은 구리 수준을 유지하는 한편, Atp7b KO 마우스가 약 제3 주에 시작하여 뇨에서의 구리의 오버플로우, 이어서 관찰 기간에 걸쳐 구리의 뇨 농도의 정상상태 성장을 나타낸다는 것을 입증하여서(도 2a, 도 3a), 윌슨병 환자에서 관찰된 높은 뇨 구리 배설률을 나타낸다.
Atp7b KO 마우스의 혈청은 유도 커플링된 플라즈마-질량 분광법을 통해 구리 농도를 평가하도록 2주마다 수집되었다. 결과는 이형접합성 한배새끼와 비교하여 2개월령까지 매우 낮은 혈청 구리 수준을 나타내서, Atp7b KO 마우스에서 조직으로부터 혈액으로 구리를 추출하는 손상된 능력을 제안한다. Atp7b KO 마우스가 3 내지 4개월령일 때, 구리의 혈청 농도는 유의미하게 증가하고, 이형접합성 한배새끼의 수준에 도달하였다(도 2b, 도 3b).
이 Atp7b KO 마우스 모델에서, 질환의 진행은 하기와 같다: 간에서의 중증 구리 축적은 2개월령에 Timm의 구리 염색에 의해 보이지만, 다른 사람에 의해 이전에 기재된 것과 유사하게 시간에 따른 감소하였다(1, 15-17). 새끼의 양육으로 인해, 구리는 아마도 출생으로부터 Atp7b KO 마우스의 간에서 축적하고 대략 2 내지 3개월령에 포화 수준에 도달하였다. 2개월령에 간 질환의 발생 이후에, 구리는 아마도 혈청으로 방출되어서, 3 내지 4개월령에 간세포에서의 명확한 축적 감소 및 혈청 구리 수준 상승을 발생시켰다. 초기에서 낮은 수준으로부터 이형접합성 마우스와 유사한 것으로의 혈청 구리 수준의 이 상승은 윌슨병의 또 다른 마우스 모델에 대해 이전에 보고된 것과 다르고(17), 여기서 Atp7b-/- 균주의 혈청 구리 수준은 6주령에 야생형 마우스에서 보인 것과 유사하고, 시간이 지나면서 44주령에 야생형 마우스보다 2배 내지 3배 높게 증가하였다.
본 발명자들은 뇨로의 구리의 오버플로우가 약 3개월령에 시작한다는 것을 관찰하였고, 이것은 유사하게 간세포 괴사 및 축적된 구리의 후속하는 방출로 인할 수 있다. 배설 증가를 발생시키는 신장에서의 Atp7b 활성의 결여(23-25), 또는 Ctrl인 간 구리 운반체의 하향조절을 발생시키는 간에서의 구리의 축적, 및 작은 구리 운반체에 의한 뇨 배설(26)을 포함하는, 신장을 통한 구리의 배설에 대안적인 기전이 제안되어 있다. 다시, 뇨 구리 배설의 시간 경과는 이전에 보고된 이 마우스 모델에서 다르다. 여기서, 뇨 구리 배설은 초기에 이형접합성 및 Atp7b KO 마우스에서 유사하지만, 연구의 과정에 걸쳐 KO 마우스에서 증가하였다. 비교하면, 뇨 구리 수준은 Atp7b-/- 균주에서 6주령에서 야생형 마우스의 3배 초과이고, 14 내지 20주령까지 증가하고, 이후 20주령에 실질적으로 감소하였다(26).
간세포 비대, 퇴행 및 괴사는 이 연령으로부터 앞으로 간 결절 재생의 부위의 그럴듯한 동반한 관찰에 의해 6개월령에 피크이다. 재생에 대한 이 진행은 윌슨병의 다른 마우스 모델에 대해 보고되었다(17). 그러나, 다른 마우스 모델에서와 달리, 여기에 기재된 Atp7b KO 마우스에서 담관암종의 증거가 없었다. 섬유증의 영역은 3개월령에 보였고, 이는 7개월령에 구성적 파괴에 의해 시간이 지나면서 중증도에서 신속히 증가하였다. 3 내지 4개월령에 혈청 아미노기전이효소의 현저한 증가가 있지만, 혈청 총 빌리루빈 수준의 증가는 오직 9개월에 나타나기 시작하여서, 진행된 간 질환을 나타낸다.
자연사 연구의 2 단계에서, Atp7b KO 및 이형접합성 한배새끼를 8개월령에 희생시켰다. ALT, AST 및 총 빌리루빈 수준을 얻었다. 도 6a 내지 도 6c. H&E 염색 및 이후 조직병리학은 도 7에 도시된 스코어링 계획에 대해 병리학자에 의해 평가되었다. 각각 도 8a 및 도 8b에 도시된 바와 같은 섬유증 점수 및 팀 염색에 의한 구리 염색 점수. 간에서의 구리 수준은 도 9에 도시되어 있다.
실시예 3: 윌슨병의 모델에서의 AAV8.hATP7Bco 벡터
수컷 Atp7b KO 마우스에 AAV8.TTR.hATP7Bco의 1010 GC/마우스 및 1011 GC/마우스에 의해 IV 주사하고, 암컷 Atp7b KO 마우스에 동일한 벡터의 109, 1010 및 1011 GC/마우스에 의해 IV 주사하였다. 혈청 구리 수준을 벡터 주사 후 모니터링하였다(도 10a 및 도 10b). 수컷 Atp7b KO 마우스에서의 1010 또는 1011 GC/마우스의 투여는 각각 벡터 투여 후 2주에 0.11pg/g 내지 0.52pg/g 및 0.34pg/g의 평균으로부터 혈청 구리 수준을 증가시켰다(도 10a). 그러나, 암컷 마우스에서 더 적은 효과가 있었다(도 10b). 마우스를 약 9개월령에 벡터 투여 후 7개월에 희생시키고, 간 구리 수준의 평가를 위해 간을 수확하였다. 이형접합성 및 Atp7b KO 마우스에서의 간 구리 수준은 각각 평균 6pg/g 및 222pg/g이었다(도 10c). 용량 > 109 GC/마우스에서의 AAV8 벡터 투여는 연령 일치된 비주사된 Atp7b KO 마우스와 비교하여 간 구리 수준의 유의미한 감소를 발생시켰다. 그러나, 109 GC/마우스가 투여된 암컷 마우스와 대조군 Atp7b KO 마우스에서 간 구리 수준 사이의 유의미한 차이가 없었다. 이 측정을 위해, 간 구리 수준이 이형접합성 마우스로부터 유의미하게 다르지 않으므로, 암컷 마우스에서 높은 벡터 용량의 더 강한 효과가 있었다(도 10c).
AAV8 벡터가 투여된 마우스를 9개월령에 부검하고, 섬유증 및 팀 염색에 의한 구리 수준을 포함하는 구리 연관된 간 질환의 매개변수에 대해 간을 조직학적으로 평가하였다(도 11). 간의 절편을 H&E에 의해 염색하고, 1 내지 5 스코어링 시스템에 따라 조직학적으로 평가하였다(도 12a). 간 구리 수준에 보인 것과 유사하게, 연령 일치된 비주사된 Atp7b KO 마우스와 AAV8 벡터의 109 GC/마우스가 투여된 암컷 마우스 사이에 간 병변의 유의미한 차이가 없었다. 오직 경증의 거대핵세포(간세포 비대 및 퇴행을 나타냄), 경증의 염증 및 국소 또는 다원성 문맥주위 타원형 세포 증생을 갖는다고 관찰된, 1011 GC/마우스가 주사된 수컷 마우스에 의해 간 병변의 용량 의존적 감소가 있었다. 1010 및 1011 GC/마우스가 투여된 마우스에서 연령 일치된 비주사된 Atp7b KO 마우스와 비교하여 간세포 비대, 퇴행/괴사 및 담관 증생의 유의미한 감소가 있었다(p<0.05). 염증 및 타원형 세포 증생에 대해, 연령 일치된 비주사된 Atp7b KO 마우스와 비교된 유의미한 감소는 1011 GC/마우스의 용량에서 오직 관찰되었다(p<0.05). 조직병리학적 매개변수가 조합되고 Fisher 조합 확률 시험을 이용하여 평가될 때, 1010 및 1011 GC/마우스 둘 다의 투여 이후에 연령 일치된 비주사된 Atp7b KO 마우스와 비교하여 유의미한 차이가 있었다(p<0.0001).
가장 높은 벡터 용량을 받은 수컷 마우스는 또한 섬유증을 갖지 않았고, 이는 씨리우스 레드 염색에 의해 평가되었다(도 11 및 도 12b). 모든 다른 벡터 투여된 마우스에 대해, 연령 일치된 비주사된 Atp7b KO 마우스와 비교하여 섬유증의 유의미한 차이가 없었다(도 12b). 그러나, 1011 GC/마우스가 투여된 암컷 마우스에서 보인 섬유증의 감소는 충분하여서, 이들 마우스 및 암컷 Atp7b 이형접합성 마우스에서의 간 섬유증 점수 사이의 유의미한 차이가 또한 없었다. 간에서의 구리 축적에 대한 팀 염색은 유도 커플링된 플라즈마-질량 분광법에 의해 결정된 정량적 간 구리 수준에 의해 보인 유사한 결과를 나타냈다(도 12c). 연령 일치된 비주사된 Atp7b KO 마우스와 임의의 벡터 투여된 그룹 사이에 팀 염색 점수의 유의미한 차이가 없었다. AAV8.hATP7Bco 벡터의 효율을 평가하기 위해, Atp7b KO 마우스는 AAV8.EnTTR.TTR.hATP7Bco.PA75(도 21, 그룹 1), AAV8.En34.TBG-S1.hATP7Bco.PA75(도 21, 그룹 2), AAV8.En34.TTR.hATP7Bco.PA75(도 21, 그룹 3) 및 AAV8.EnABPS.TBG-S1.hATP7Bco.PA75(도 21, 그룹 4)를 포함하는 3x1012 GC/㎏에서의 다양한 유전자 치료 벡터의 i.v. 투여를 받았다. 치료가 없는 이형접합성 및 야생형 한배새끼 및 Atp7b KO 마우스는 대조군으로서 작용하였다. 혈액 샘플을 주마다 수집하여 웨스턴 블롯을 통해 세룰로플라스민의 구리 결합 형태 및 구리 비결합 형태 둘 다의 수준을 평가하였다. 투여 후 21일에, 구리 결합된 세룰로플라스민의 출현이 AAV8.En34.TBG-S1.hATP7Bco.PA75에 의해 치료된 Atp7b KO 마우스에서 관찰되어서, 혈액으로의 촉진된 구리 추출을 나타냈다(도 21, 그룹 2). 그러나, 상기 기재된 실험 환경 하에, 다른 3개의 시험된 벡터는 구리 결합된 세룰로플라스민의 증가를 나타내지 않았다(도 21).
본 명세서에 기재된 AAV8.hATP7Bco 벡터가 주사된 ATP7B KO 마우스의 간에서의 구리 축적을 평가하기 위해, Timm 구리 염색은 이의 간 절편에서 수행되었다. 검정 침착물은 구리 축적을 나타낸다. 결과는 도 19b에 도시되어 있다. 수컷 Atp7b KO 마우스에 대한 모든 5개의 벡터에 의한 주사는 비치료된 또는 PBS-단독 마우스로부터의 샘플과 비교하여 간 절편의 검정 침착물을 감소시키는 한편, AAV8.EnTTR.TTR.hATP7Bco.PA75 벡터는 가장 적은 검정 침착물 및 야생형과 유사한 패턴을 나타냈다(도 19b). 암컷 Atp7b KO 마우스(도 19b)는 수컷과 비교하여 간에서 더 많은 구리 침착물을 나타내서, 성별 차이를 나타낸다. 여전히 비치료된 마우스와 비교하여, 암컷 Atp7b KO 마우스는 간에서의 더 적은 구리 침착물을 나타냈다. 본 명세서에 기재된 AAV hATP7Bco 벡터가 주사된 수컷 및 암컷 Atp7b KO 마우스 둘 다에서의 인간 ATP7B 단백질에 대한 항체의 생성은 조사 중에 있다.
한편, 혈청 샘플은 수집되고, 구리 농도는 실시예 2에 기재된 바대로 평가되었다. 데이터는 각각 암컷 및 수컷 마우스에 대해 도 15a 및 도 15b에 작도되어 있다. 결과는 본 명세서에 기재된 AAV8.hATP7Bco 벡터의 3x1O12 GC/㎏의 치료가 Atp7b KO 마우스에서 혈청 구리 수준을 성공적으로 증가시켰다는 것을 나타낸다(도 15a 및 도 15b).
추가의 시험을 하기와 같이 수행하였다:
시간에 걸친 혈청 구리 수준은 도 15a 및 도 15b에 도시되어 있다. ALT, AST 및 총 빌리루빈 수준을 얻었다. 도 16a 내지 도 16c. 상대 ATP7B 발현은 도 17에 도시되어 있다. H&E 염색 및 이후 조직병리학은 도 18에 도시된 스코어링 계획에 대해 병리학자에 의해 평가되었다. 팀 염색에 의한 섬유증 점수 및 구리 염색 점수는 각각 도 19a 및 도 19b에 도시되어 있다.
실시예 4: AAV.hATP7Bco 벡터가 주사된 윌슨병의 모델에서의 세룰로플라스민의 산화효소 활성
구리는 잠재적으로 독성인 금속이지만, 이것은 다양한 효소의 보인자로서 작용하는 매우 많은 수의 생리학적 기능에 필수적이다. 이의 장 흡수 후, 구리는 간세포로 운반되고, 여기서 이것은 이동-골지망(trans-Golgi network: TGN)의 막에 위치한 ATP7B에 결합한다. 이 큰 막관통 단백질은 구리 의존적 효소로의 금속의 이동을 담당한다. 세룰로플라스민으로의 구리의 로딩은 이 효소의 페록시다제 활성에 필수적이고, 건강한 개체의 혈장에 존재하는 구리의 95%가 세룰로플라스민에 결합되면서, 금속의 중요한 분비 경로를 구성한다. 예를 들어, 문헌[Murillo, Oihana, et al. "Long-term metabolic correction of Wilson's disease in a murine model by gene therapy" Journal of Hepatology 64.2 (2016): 419-426](본 명세서에 참고로 포함됨)을 참조한다.
산화효소 활성을 측정하기 위해, 20㎕의 혈청을 상응하는 제품 정보(본 명세서에 참고로 포함됨)에 기재된 프로토콜에 따라 Sigma Ceruloplasmin Activity Colorimetric Kit(MAK177) 또는 BioVision Ceruloplasmin Activity Colorimetric Kit를 사용하여 처리하였다. 산화효소 활성 검정은 또한 문헌[Schosinsky et al, "Measurement of ceruloplasmin from its oxidase activity in serum by use of o-dianisidine dihydrochloride" Clinical Chemistry 20.12 (1974): 1556-1563 및 Murillo et al. "Long-term metabolic correction of Wilson's disease in a murine model by gene therapy" Journal of Hepatology 64.2 (2016): 419-426](본 명세서에 참고로 포함됨)에 기재된 프로토콜에 따라 수행되었다.
Atp7b KO 마우스의 혈청 세룰로플라스민의 산화효소 활성은 상기 기재된 4개의 검정을 이용하여 측정되었다. 야생형 및 이형접합성 마우스로부터의 샘플은 대조군으로서 작용하였다. 야생형과 Atp7b KO 마우스 사이의 차이가 검출되지 않았다.
더욱이, Atp7b KO 마우스를 황산암모늄에 의해 또는 이것 없이 처리하였다. 야생형 마우스는 대조군으로서 제공되었다. 문헌[Schosinsky et al, "Measurement of ceruloplasmin from its oxidase activity in serum by use of o-dianisidine dihydrochloride" Clinical Chemistry 20.12 (1974): 1556-1563]에 기재된 프로토콜을 이용하여 야생형 또는 Atp7b KO 마우스 사이에 세룰로플라스민 산화효소 활성 검정의 차이가 없었다.
또 다른 실험에서, Atp7b KO 마우스를 황산구리에 의해 또는 이것 없이 처리하였다. 야생형 마우스는 대조군으로서 제공되었다. 상기 기재된 4개의 방법을 이용하여 황산구리에 의해 또는 이것 없이 처리된 마우스 사이의 차이를 검출하도록 세룰로플라스민 산화효소 활성 검정을 수행하였다. 본 명세서에 기재된 마우스의 간 균질액을 또한 수집하고, 상기 기재된 4개의 방법을 이용하여 세룰로플라스민의 산화효소 활성에 대해 시험하였다. 황산구리는 추가로 간 균질액에 첨가되고, 양성 대조군으로서 작용하였다.
실시예 5: AAV8.TTR.hATP7Bco 벡터의 추가의 시험
AAV8.EnTTR.TTR.hATP7Bco.PA75 벡터의 용량 의존적 효과 및 최소 유효 용량(MED)을 결정하기 위해, 수컷 및 암컷 2개월령 ATP7B KO 마우스 둘 다에 벡터의 1x109, 1x1010 또는 1x1011 GC/마우스를 정맥내 주사하였다. 세룰로플라스민에 대한 웨스턴 블롯은 AAV8.EnTTR.TTR.hATP7Bco.PA75의 1x1011 GC를 받은 4마리 중 3마리의 시험된 마우스의 혈청에서의 구리 결합된 세룰로플라스민의 출혈은 나타내어서, 구리 추출의 증가를 제안한다(도 14). 동일한 벡터의 1x1010 GC에 의한 치료 시, 5마리 중 1마리의 시험된 마우스가 혈액에서 구리 결합된 세룰로플라스민을 나타냈다(도 14). 이 데이터는 마우스당 1x1011 GC의 용량에서 AAV8.EnTTR.TTR.hATP7Bco.PA75의 단일 정맥내 주사가 윌슨병의 쥣과 모델에서 구리 추출을 성공적으로 촉진한다는 것을 검증하였다.
실시예 6: 절두된 벡터
단일유전자 질환은 AAV 벡터를 사용한 유전자 대체 치료 접근법에 대한 훌륭한 후보이다. 그러나, AAV 벡터 캡시드 내부에 패키징될 수 있는 cDNA의 크기에 재한이 있다. 야생형 AAV 게놈은 4,700bp이고, 더 큰 게놈을 패키징하려는 요청은 AAV 캡시드 내에 캡슐화된 DNA 서열의 통합성을 감소시킬 수 있다(19). 이전에, 소정의 전이유전자 및 발현에 필요한 전사 및 polyA 제어 서열의 크기 둘 다를 감소시키는 방식을 조사하기 위해 광범위한 조사가 수행되었다. 이것이 어디서 성공적으로 수행되는지의 일 예는 4,374bp 길이인 인간 응고 VIII 인자에 대한 B 도메인 결실된 전이유전자 서열의 생성을 수반하는 A 혈우병의 치료를 위한 유전자 치료 벡터의 개발이다(19-21). 윌슨병의 치료를 위해, ATP7B cDNA가 4,395bp이면서 문제가 증가한다. 따라서, 본 발명자들은 75bp 합성 polyA 서열(PA75)와 조합된 인간 ATP7B 전이유전자의 코돈 최적화된 버전의 발현을 위해 감소된 크기의 트란스타이레틴 인핸서 및 촉진자(TTR) 서열을 사용할 것을 선택하였다(19). 생성된 AAV 게놈은 5.1kb이고, AAV8 캡시드 내에 패키징되었다.
추가적으로, AAV8.En34.TBG-S1.hATP7Bco(MBD1Del).PA75, AAV8.En34.TBG-S1.hATP7Bco(MBD2Del).PA75, AAV8.En34.TBG-S1.hATP7Bco(MBD3Del).PA75, AAV8.En34.TBG-S1.hATP7Bco(MBD1-2Del).PA75, AAV8.En34.TBG-S1.hATP7Bco(MBD1-4Del).PA75, AAV8.En34.TBG-S1.hATP7Bco(MBD1-5Del).PA75, AAV8.TBG.PI.hATP7Bco(MBD1-4Del).PA75 및 AAV8.TBG.PI.hATP7Bco(MBD1-5Del).PA75를 포함하는 절두된 hATP7Bco 벡터가 설계되고 제조되고 3x1012 GC/㎏의 용량으로 정맥내 ATP7B KO 마우스에 주사되었다.
상기 기재된 다양한 절두된 벡터에 의해 처리된 Atp7b KO 마우스, 및 이형접합성 한배새끼를 연구하고 6개월령에 희생시켰다. 시간에 따른 혈청 구리 수준은 도 22에 도시되어 있다. ALT, AST 및 총 빌리루빈 수준을 얻었다. 도 23. 상대 ATP7B 발현은 도 24에 도시되어 있다. H&E 염색 및 이후 조직병리학은 도 25에 도시된 스코어링 계획에 대해 병리학자에 의해 평가되었다. 팀 염색에 의한 섬유증 점수 및 구리 염색 점수는 도 26에 도시되어 있다. 부검 시 간 구리 수준은 도 27에 도시되어 있다.
실시예 7: 상기 실험에 대한 재료 및 방법
A. AAV 벡터 제조
모든 AAV 벡터는 이전에 기재된 바대로 펜실베니아 대학교에서의 Penn Vector Core에 의해 제조되었다(10). 간단히, 감소된 크기의 트란스타이레틴 인핸서 및 촉진자로부터 hATP7B의 코돈 최적화된 버전(hATP7Bco)을 발현하는 플라스미드는 AAV8 바이러스 캡시드에 의해 패키징되었다.
B. 마우스
이형접합성 Atp7b+/_ 마우스의 교배 쌍을 The Jackson Laboratory(미국 메인주 바 하버)로부터 얻고, 콜로니를 특별한 무균 조건 하에 펜실베니아 대학교에서 유지시켰다. 모든 동물 절차 및 프로토콜은 펜실베니아 대학교의 동물 실험 윤리 위원회(IACUC)에 의해 승인되었다. Atp7b KO를 생성하고 후속하는 교배에 사용하였다. Atp7b KO 짝짓기 쌍으로부터 생성된 모든 새끼를 출생의 72시간 내에 Balb/c 양육 모체에서 양육하였다. 수컷 및 암컷 Atp7b KO 마우스 2개월령에 꼬리 정맥을 통해 AAV8.TTR.hATP7Bco의 109 내지 1011 게놈 카피(GC)/마우스를 IV 주사하였다(n = 5/성/그룹).
C. 혈청 분석
혈액을 혈청 세퍼레이터 관에서 표시된 시점에서 수집하고, 응고되게 하고, 혈청을 실온에서 5분 동안 3,500 x g에서 원심분리에 의해 단리하였다. 혈청은 Antech Diagnostics(미국 캘리포니아주 어바인)에 의해 알라닌 아미노전환효소(ALT), 아스파르테이트 아미노전환효소(AST) 및 총 빌리루빈 수준에 대해 분석되었다. 혈청 및 뇨는 또한 Exova(영국 에딘버러)에 의해 구리 수준에 대해 분석되었다.
D. 간 구리 분석
부검 시 취한 간 샘플은 Exova(영국 에딘버러)에 의해 구리 수준에 대해 분석되었다.
E. 조직병리학
포르말린 고정된 파라핀 포매된 조직 샘플은 절편화되고, 표준 프로토콜에 따라 헤마톡실린 및 에오신(H&E)에 대해 염색되었다. 간 섬유증을 검출하기 위해, 씨리우스 레드 염색을 파라핀 절편에서 수행하였다. 절편을 탈파라핀화하고, 0.1%(w/v) Direct Red(Sigma), 4%(w/v) 피크르산(Sigma)의 용액 중에 90분 동안 염색하고, 0.01N HCl(2x1분)에 의해 세척하고, 에탄올 및 자일렌 시리즈를 통해 탈수시키고, 커버 슬립을 적용하였다.
F. Timm 구리 염색
포르말린 고정된 파라핀 포매된 간으로부터의 절편을 탈랍하고, 0.5% 황화암모늄(5분), 탈이온수(1분 세정), 0.1N HCl(2분 내지 3분), 탈이온수(2분 내지 3분 세정) 및 현상제(대략 10분 동안 1부 5% 질산은, 5부 2%(w/v) 하이드로퀴논/5%(w/v) 시트르산) 중에 순차적으로 항온처리하였다. 대조군 동물(야생형 및 ATP7B KO)로부터의 간 절편은 각각의 실행에 포함되고, 한결같은 염색 강도에 대해 모니터링하였다. 절편을 마지막으로 물 중에 세척하고, Nuclear Fast Red에 의해 대조염색하고, 탈수시키고, 커버 슬립을 적용하였다.
G. 조직병리학 스코어링
하기 기준에 기초하여 조직병리학적 병변을 점수 매겼다. 간세포 비대 및 퇴행: 0, 무의미한 병변; 1, 최소 거대핵세포(드물거나 때때로, 소엽 내 1-2 간세포), 2, 경증 거대핵세포(소엽 내 간세포의 10% 미만); 3, 중등도 거대핵세포(소엽 내 간세포의 10% 내지 50%)와 함께 간세포 분해 및 드물거나 아주 적은 단일 세포 괴사; 4, 중증 거대핵세포(소엽 내 간세포의 51% 내지 90%)와 함께 광범위한 간세포 분해 및 빈번한 단일 세포 괴사; 비교적 정상인 간 구조가 유지됨; 5, 현저한 거대핵세포(소엽 내 간세포의 90% 초과)와 함께 소엽 붕괴 및 많은 단일 세포 괴사. 염증: 0, 무; 1, 문맥 부위 내에 경증 내지 아주 적은 응집체 및 유조직 내의 드문 병소; 정상 한계 내로 생각됨; 2, 중등도 - 둘러싼 문맥주위 간세포로 또는 유조직 내에 다원성으로 확장; 3, 현저한 - 가교 또는 박리하는 간세포 또는 유조직 내에 유착으로 다원성. 담관 증생: 0, 무; 1, 문맥 부위 내에 국소 또는 다원성; 2, 문맥주위 부위에서 박리하는 간세포; 3, 구조 왜곡과 함께 가교 또는 박리하는 간세포. 타원형 세포 증생: 0, 무; 1, 국소 또는 다원성(문맥주위); 2, 가교 또는 박리하는 간세포; 3, 구조 왜곡과 함께 가교 또는 박리하는 간세포. 결절 재생: 0, 부재; 1, 존재.
씨리우스 레드 염색에 기초한 섬유증에 대한 등급화 계획은 문헌에 보고된 것으로부터 유래되었다(11): 분포가 중심소엽, 중간대, 문맥주위 또는 미만성인지에 대한 표기에 의해, 0, 무; 1, 국소 또는 다원성; 2, 가교; 3, 구조 왜곡과 함께 가교.
H. 팀 염색에 기초한 구리 축적에 대한 등급화 계획은 문헌에 이전에 기재된 것과 동일하였다(12): 1, 때때로 간세포의 세포질에서의 부재하거나 아주 적은 구리 함유 과립; 정상 한계로 생각됨; 2, 일부 중심소엽 간세포에서의 명확한 구리 함유 과립; 정상 한계로 생각됨; 3, 경증 - 가장 중심소엽 간세포에서의 많은 과립(각각의 소엽의 ⅓); 4, 중등도 - 모든 중심소엽 및 중간대 간세포에서의 많은 과립의 존재(모든 소엽에서 간세포의 대략 ⅔); 5 현저한 - 모든 소엽에서 간 세포의 ⅔ 초과로 풍부한 과립. 통계 분석
모든 데이터에 대해, 그룹 평균 및 평균의 표준 오차(SEM)가 계산되고 보고되었다. 스튜던츠 t 시험은 2개의 그룹을 비교하도록 수행되고, Tukey 다중 비교 시험에 의한 변량의 1방향 분석(AVOVA)은 그룹에 걸쳐 수행되고, 성별에 의해 계층화되었다. 5개의 병리학 매개변수는 벡터 투여에서 분석되고, 연령 일치된 비주사된 Atp7b KO 마우스에서의 것과 비교되었다. 비교는 R 프로그램(버전 3.3.1; https//cran.r-project.org) 내에 Wilcoxon 순위 합 시험을 이용하여 수행되었다. 조합된 병리학 매개변수의 차이는 "metap" 패키지에서 함수 "sumlog"를 사용하여 R 프로그램 내에 Fisher 조합 확률 시험을 이용하여 연령 일치된 비주사된 ATP7B KO 마우스와 비교하여 각각의 용량 그룹에 대해 또한 평가되었다. 0.05의 p 값은 유의미하다고 생각되었다.
실시예 8: 토의
질환의 마우스 모델이 클리닉에 대한 치료학적 접근법의 번역 가능성을 평가하기 위해 사용될 수 있기 전에, 모델을 광범위하게 규명해야 한다. 윌슨병의 다른 마우스 모델의 규명이 수행되었지만(1, 15, 17), 이 연구는 출생으로부터 모든 Atp7b KO 마우스의 양육 이후에 txJ 마우스 염색 및 구리 대사 및 간 질환의 평가 둘 다의 처음의 자세한 규명이다. 이환된 모체의 유선에서의 Atp7b 결핍증으로 인한 젖떼기 전에 생기는 상충하는 구리 결핍증의 부재에서, 이 마우스에서의 질환 진행의 시간 선은 젖떼기 전에 구리 결핍증과 관련된 임의의 기초하는 논의로부터 질환 표현형의 분리를 보장함으로써 더 정확히 결정될 수 있다. 이 마우스 모델에서의 간 질환의 발생 및 결절 재생은 다른 사람에 의해 개발된 Atplb -/- 균주에 대해 이전에 보고된 것과 유사하였다(1, 17). 그러나, 시간 선은 구리의 연속 공급을 발생시키는, 아마도 출생으로부터의 새끼의 양육으로 인해, 이 마우스 균주에서 약간 증가하였다.
이 Atp7b KO 마우스 모델에서, 질환의 진행은 하기와 같다: 간에서의 중증 구리 축적은 2개월령에 Timm의 구리 염색에 의해 보이지만, 다른 사람에 의해 이전에 기재된 것과 유사하게 시간에 따른 감소하였다(1, 15-17). 새끼의 양육으로 인해, 구리는 아마도 출생으로부터 Atp7b KO 마우스의 간에서 축적하고 대략 2 내지 3개월령에 포화 수준에 도달하였다. 2개월령에 간 질환의 발생 이후에, 구리는 아마도 혈청으로 방출되어서, 3 내지 4개월령에 간세포에서의 명확한 축적 감소 및 혈청 구리 수준 상승을 발생시켰다. 초기에서 낮은 수준으로부터 이형접합성 마우스와 유사한 것으로의 혈청 구리 수준의 이 상승은 윌슨병의 또 다른 마우스 모델에 대해 이전에 보고된 것과 다르고(17), 여기서 Atp7b -/- 균주의 혈청 구리 수준은 6주령에 야생형 마우스에서 보인 것과 유사하고, 시간이 지나면서 44주령에 야생형 마우스보다 2배 내지 3배 높게 증가하였다.
본 발명자들은 뇨로의 구리의 오버플로우가 약 3개월령에 시작한다는 것을 관찰하였고, 이것은 유사하게 간세포 괴사 및 축적된 구리의 후속하는 방출로 인할 수 있다. 배설 증가를 발생시키는 신장에서의 Atp7b 활성의 결여(23-25), 또는 Ctrl인 간 구리 운반체의 하향조절을 발생시키는 간에서의 구리의 축적, 및 작은 구리 운반체에 의한 뇨 배설(26)을 포함하는, 신장을 통한 구리의 배설에 대안적인 기전이 제안되어 있다. 다시, 뇨 구리 배설의 시간 경과는 이전에 보고된 이 마우스 모델에서 다르다. 여기서, 뇨 구리 배설은 초기에 이형접합성 및 Atp7b KO 마우스에서 유사하지만, 연구의 과정에 걸쳐 KO 마우스에서 증가하였다. 비교하면, 뇨 구리 수준은 Atp7b -/- 균주에서 6주령에서 야생형 마우스의 3배 초과이고, 14 내지 20주령까지 증가하고, 이후 20주령에 실질적으로 감소하였다(26).
간세포 비대, 퇴행 및 괴사는 이 연령으로부터 앞으로 간 결절 재생의 부위의 그럴듯한 동반한 관찰에 의해 6개월령에 피크이다. 재생에 대한 이 진행은 윌슨병의 다른 마우스 모델에 대해 보고되었다(17). 그러나, 다른 마우스 모델에서와 달리, 여기에 기재된 Atp7b KO 마우스에서 담관암종의 증거가 없었다. 섬유증의 영역은 3개월령에 보였고, 이는 7개월령에 구성적 파괴에 의해 시간이 지나면서 중증도에서 신속히 증가하였다. 3 내지 4개월령에 혈청 아미노기전이효소의 현저한 증가가 있지만, 혈청 총 빌리루빈 수준의 증가는 오직 9개월에 나타나기 시작하여서, 진행된 간 질환을 나타낸다.
이 Atp7b KO 마우스 모델의 규명 이후에, 본 발명자들은 윌슨병의 치료를 위한 유전자 치료 접근법을 개발하였다. 2개월령에 Atp7b KO 마우스로 인간 ATP7B 전이유전자의 코돈 최적화된 버전을 발현하는 AAV8 벡터의 IV 투여는 벡터 투여 후 2주에 혈청 구리 수준의 증가를 발생시켰다. 여기서 평가된 벡터의 더 높은 용량(109 GC/마우스 초과)은 연령 일치된 비주사된 Atp7b KO 마우스와 비교하여 간 구리 수준의 유의미한 감소를 발생시켰다. 오직 1011 GC/마우스가 주사된 수컷 마우스에 존재하는 경증의 조직병리학적 발견 및 간 섬유증의 완전한 결여에 의해, 간 병변의 유의미한 용량 의존적 감소가 있었다. 따라서, 질환 발생의 초기 병기 동안 유전자 치료 접근법의 투여는 윌슨병의 마우스 모델에서 간 손상을 막고, 구리 대사를 수정하였다.
본 명세서에 인용된 모든 공보, 및 미국 특허 가출원 제62/440,659호 및 제62/473,656호는 본 명세서에 참고로 포함된다. 유사하게, 본 명세서에 언급되고 첨부된 서열 목록에 보이는 서열 번호는 참고로 포함된다. 본 발명이 특정한 실시형태와 관련하여 기재되어 있지만, 본 발명의 사상으로부터 벗어나지 않으면서 변형이 이루어질 수 있는 것으로 이해될 것이다. 이러한 변형은 첨부된 청구항의 범위 내에 해당하도록 의도된다.
[서열목록 자유텍스트]
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gcacatcggc 3180 atggacgaca gatggcggga cagccctaga gccacccctt gggatcaggt gtcatacgtg 3240 tcacaggtgt ccctgagcag cctgaccagc gacaagccca gcagacatag cgccgctgcc 3300 gacgacgatg gggacaagtg gtccctgctg ctgaacggcc gggatgagga acagtacatc 3360 <210> 19 <211> 2967 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> constructed sequence <400> 19 atgcccgagc aggaaagaca gatcaccgcc agagagggcg ccagccggaa gatcctgagc 60 aagctgagcc tgcccaccag agcctgggag cccgccatga agaagtcctt cgccttcgac 120 aacgtgggct acgagggcgg cctggacgga ctgggaccat cttctcaggt ggccacaagc 180 accgtgcgcc tggaaatcgc ccagtttatc caggacctgg gctttgaagc cgccgtgatg 240 gaagattacg ccggctccga cggcaacatc gagctgacca tcaccggaat gacctgcgcc 300 tcctgtgtgc acaacattga gtccaagctg acccggacca acggcatcac ctacgcctct 360 gtggctctgg ccacctccaa ggccctcgtg aagttcgatc ccgagatcat cggccccagg 420 gacatcatca agatcatcga agagatcggc ttccacgcca gcctggccca gaggaaccct 480 aacgcccacc acctggacca caagatggaa atcaagcagt ggaagaaaag cttcctgtgc 540 agcctggtgt tcggcatccc cgtgatggcc ctgatgatct acatgctgat ccccagcaac 600 gagccccacc agtccatggt gctggatcac aacatcatcc ccggcctgtc tatcctgaac 660 ctgatcttct tcatcctgtg caccttcgtg cagctgctgg gcggctggta cttctacgtg 720 caggcctaca agtccctgcg gcacagatcc gccaacatgg acgtgctgat cgtgctggcc 780 acatctatcg cctacgtgta ctccctcgtg atcctggtgg tggccgtggc cgagaaagcc 840 gagagaagcc ctgtgacctt cttcgacacc ccccctatgc tgttcgtgtt tatcgccctg 900 ggccggtggc tggaacacct ggccaaaagc aagaccagcg aggccctggc taagctgatg 960 agtctgcagg ccaccgaggc cacagtcgtg accctgggcg aggacaacct gatcatccgc 1020 gaggaacagg tgccaatgga actggtgcag cggggcgaca tcgtgaaggt ggtgcctggc 1080 ggcaagttcc ccgtggacgg aaaagtgctg gaagggaata ccatggccga cgagagcctg 1140 atcacaggcg aggccatgcc cgtgaccaag aaacctggca gcacagtgat cgccggcagc 1200 atcaatgccc acggcagcgt gctgattaag gccacacacg tgggcaacga taccaccctg 1260 gctcagattg tgaagctggt ggaagaggcc cagatgagca aggcccccat tcagcagctg 1320 gctgaccggt tcagcggcta cttcgtgccc tttatcatca tcatgagcac cctgacactg 1380 gtcgtgtgga tcgtgatcgg ctttatcgac ttcggagtgg tgcagagata 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gctctgccgc catggctgca agctccgtgt ctgtggtgct gtccagcctg 3480 cagctgaagt gctacaagaa gcccgacctg gaaagatacg aggcccaggc ccacggacac 3540 atgaagcctc tgacagcctc ccaggtgtcc gtgcacatcg gcatggacga cagatggcgg 3600 gacagcccta gagccacccc ttgggatcag gtgtcatacg tgtcacaggt gtccctgagc 3660 agcctgacca gcgacaagcc cagcagacat agcgccgctg ccgacgacga tggggacaag 3720 tggtccctgc tgctgaacgg ccgggatgag gaacagtaca tctgataagc atgcaataaa 3780 gtctgagtgg gcggcagcct gtgtgtgcct gggttctctc tgtcccggaa tgtgcaaaca 3840 atggaggtgc tcgagtagat aagtagcatg gcgggttaat cattaactac aaggaacccc 3900 tagtgatgga gttggccact ccctctctgc gcgctcgctc gctcactgag gccgggcgac 3960 caaaggtcgc ccgacgcccg ggctttgccc gggcggcctc agtgagcgag cgagcgcgca 4020 gccttaatta acctaattca ctggccgtcg ttttacaacg tcgtgactgg gaaaaccctg 4080 gcgttaccca acttaatcgc cttgcagcac atcccccttt cgccagctgg cgtaatagcg 4140 aagaggcccg caccgatcgc ccttcccaac agttgcgcag cctgaatggc gaatgggacg 4200 cgccctgtag cggcgcatta agcgcggcgg gtgtggtggt tacgcgcagc gtgaccgcta 4260 cacttgccag cgccctagcg cccgctcctt tcgctttctt cccttccttt ctcgccacgt 4320 tcgccggctt tccccgtcaa gctctaaatc gggggctccc tttagggttc cgatttagtg 4380 ctttacggca cctcgacccc aaaaaacttg attagggtga tggttcacgt agtgggccat 4440 cgccctgata gacggttttt cgccctttga cgttggagtc cacgttcttt aatagtggac 4500 tcttgttcca aactggaaca acactcaacc ctatctcggt ctattctttt gatttataag 4560 ggattttgcc gatttcggcc tattggttaa aaaatgagct gatttaacaa aaatttaacg 4620 cgaattttaa caaaatatta acgcttacaa tttaggtggc acttttcggg gaaatgtgcg 4680 cggaacccct atttgtttat ttttctaaat acattcaaat atgtatccgc tcatgagaca 4740 ataaccctga taaatgcttc aataatattg aaaaaggaag agtatgagta ttcaacattt 4800 ccgtgtcgcc cttattccct tttttgcggc attttgcctt cctgtttttg ctcacccaga 4860 aacgctggtg aaagtaaaag atgctgaaga tcagttgggt gcacgagtgg gttacatcga 4920 actggatctc aacagcggta agatccttga gagttttcgc cccgaagaac gttttccaat 4980 gatgagcact tttaaagttc tgctatgtgg cgcggtatta tcccgtattg acgccgggca 5040 agagcaactc ggtcgccgca tacactattc tcagaatgac ttggttgagt actcaccagt 5100 cacagaaaag catcttacgg atggcatgac agtaagagaa ttatgcagtg ctgccataac 5160 catgagtgat aacactgcgg ccaacttact tctgacaacg atcggaggac cgaaggagct 5220 aaccgctttt ttgcacaaca tgggggatca tgtaactcgc cttgatcgtt gggaaccgga 5280 gctgaatgaa gccataccaa acgacgagcg tgacaccacg atgcctgtag caatggcaac 5340 aacgttgcgc aaactattaa ctggcgaact acttactcta gcttcccggc aacaattaat 5400 agactggatg gaggcggata aagttgcagg accacttctg cgctcggccc ttccggctgg 5460 ctggtttatt gctgataaat ctggagccgg tgagcgtggg tctcgcggta tcattgcagc 5520 actggggcca gatggtaagc cctcccgtat cgtagttatc tacacgacgg ggagtcaggc 5580 aactatggat gaacgaaata gacagatcgc tgagataggt gcctcactga ttaagcattg 5640 gtaactgtca gaccaagttt actcatatat actttagatt gatttaaaac ttcattttta 5700 atttaaaagg atctaggtga agatcctttt tgataatctc atgaccaaaa tcccttaacg 5760 tgagttttcg ttccactgag cgtcagaccc cgtagaaaag atcaaaggat cttcttgaga 5820 tccttttttt ctgcgcgtaa tctgctgctt gcaaacaaaa aaaccaccgc taccagcggt 5880 ggtttgtttg ccggatcaag agctaccaac tctttttccg aaggtaactg gcttcagcag 5940 agcgcagata ccaaatactg ttcttctagt gtagccgtag ttaggccacc acttcaagaa 6000 ctctgtagca ccgcctacat acctcgctct gctaatcctg ttaccagtgg ctgctgccag 6060 tggcgataag tcgtgtctta ccgggttgga ctcaagacga tagttaccgg ataaggcgca 6120 gcggtcgggc tgaacggggg gttcgtgcac acagcccagc ttggagcgaa cgacctacac 6180 cgaactgaga tacctacagc gtgagctatg agaaagcgcc acgcttcccg aagggagaaa 6240 ggcggacagg tatccggtaa gcggcagggt cggaacagga gagcgcacga gggagcttcc 6300 agggggaaac gcctggtatc tttatagtcc tgtcgggttt cgccacctct gacttgagcg 6360 tcgatttttg tgatgctcgt caggggggcg gagcctatgg aaaaacgcca gcaacgcggc 6420 ctttttacgg ttcctggcct tttgctggcc ttttgctcac atgttctttc ctgcgttatc 6480 ccctgattct gtggataacc gtattaccgc ctttgagtga gctgataccg ctcgccgcag 6540 ccgaacgacc gagcgcagcg agtcagtgag cgaggaagcg gaagagcgcc caatacgcaa 6600 accgcctctc cccgcgcgtt ggccgattca ttaatgcagc tggcacgaca ggtttcccga 6660 ctggaaagcg ggcagtgagc gcaacgcaat taatgtgagt tagctcactc attaggcacc 6720 ccaggcttta cactttatgc ttccggctcg tatgttgtgt ggaattgtga gcggataaca 6780 atttcacaca ggaaacagct atgaccatga ttacgccaga tttaattaag g 6831 <210> 35 <211> 7437 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> constructed sequence <400> 35 ctgcgcgctc gctcgctcac tgaggccgcc cgggcaaagc ccgggcgtcg ggcgaccttt 60 ggtcgcccgg cctcagtgag cgagcgagcg cgcagagagg gagtggccaa ctccatcact 120 aggggttcct tgtagttaat gattaacccg ccatgctact tatctactta agtgtttgct 180 gcttgcaatg tttgcccatt ttaggggaat tcactcaaag ttcaaacctt atcatttttt 240 gctttgttcc tcttggcctt ggttttgtac atcagctttg aaaataccat cccagggtta 300 atgctggggt taatttataa ctaagagtgc tctagttttg caatacagga catgctataa 360 aaatggaaag atgttgcttt ctgagagaca gcggccgcca ccatgcccga gcaggaaaga 420 cagatcaccg ccagagaggg cgccagccgg aagatcctga gcaagctgag cctgcccacc 480 agagcctggg agcccgccat gaagaagtcc ttcgccttcg acaacgtggg ctacgagggc 540 ggcctggacg gactgggacc atcttctcag gtggccacaa gcaccgtgcg cgaggccgcc 600 atcaagagca aggtggcccc tctgtctctg ggccccatcg acatcgagag actgcagagc 660 accaacccca agcggcctct gagcagcgcc aaccagaact tcaacaacag cgagacactg 720 ggccaccagg gcagccacgt cgtgacactg cagctgcgga tcgacggaat gcactgcaag 780 agctgtgtgc tgaacatcga ggaaaacatc ggccagctgc tgggagtgca gagcatccag 840 gtgtcactgg aaaacaagac cgcccaggtg aagtacgacc ccagctgcac aagccccgtg 900 gccctgcaga gagccattga agctctgccc cctggcaact tcaaagtgtc cctgcctgac 960 ggagccgagg gctccggaac agatcacaga agcagcagca gccacagccc tggcagcccc 1020 cctagaaatc aggtgcaggg cacctgtagc accaccctga tcgccattgc cggcatgaca 1080 tgcgccagct gcgtgcactc tattgagggc atgatctccc agctggaagg cgtgcagcag 1140 atcagtgtgt ctctggccga gggcaccgcc acagtgctgt acaaccctag cgtgatcagc 1200 cccgaagaac tgagagccgc cattgaggac atgggattcg aagccagcgt ggtgtccgag 1260 agctgctcca ccaaccctct gggcaatcac agcgccggca acagcatggt gcagaccacc 1320 gacggcaccc ccaccagcgt gcaggaagtg gccccacata caggcagact gcccgccaat 1380 cacgcccccg atatcctggc caagagcccc cagagtacaa gagccgtggc cccccagaag 1440 tgcttcctgc agatcaaggg catgacttgt gcctcttgtg tgtccaatat cgagcggaac 1500 ctgcagaaag aggccggcgt gctgtctgtg ctggtggctc tgatggccgg caaggccgag 1560 atcaaatacg accccgaagt gattcagccc ctggaaatcg cccagtttat ccaggacctg 1620 ggctttgaag ccgccgtgat ggaagattac gccggctccg acggcaacat cgagctgacc 1680 atcaccggaa tgacctgcgc ctcctgtgtg cacaacattg agtccaagct gacccggacc 1740 aacggcatca cctacgcctc tgtggctctg gccacctcca aggccctcgt gaagttcgat 1800 cccgagatca tcggccccag ggacatcatc aagatcatcg aagagatcgg cttccacgcc 1860 agcctggccc agaggaaccc taacgcccac cacctggacc acaagatgga aatcaagcag 1920 tggaagaaaa gcttcctgtg cagcctggtg ttcggcatcc ccgtgatggc cctgatgatc 1980 tacatgctga tccccagcaa cgagccccac cagtccatgg tgctggatca caacatcatc 2040 cccggcctgt ctatcctgaa cctgatcttc ttcatcctgt gcaccttcgt gcagctgctg 2100 ggcggctggt acttctacgt gcaggcctac aagtccctgc ggcacagatc cgccaacatg 2160 gacgtgctga tcgtgctggc cacatctatc gcctacgtgt actccctcgt gatcctggtg 2220 gtggccgtgg ccgagaaagc cgagagaagc cctgtgacct tcttcgacac cccccctatg 2280 ctgttcgtgt ttatcgccct gggccggtgg ctggaacacc tggccaaaag caagaccagc 2340 gaggccctgg ctaagctgat gagtctgcag gccaccgagg ccacagtcgt gaccctgggc 2400 gaggacaacc tgatcatccg cgaggaacag gtgccaatgg aactggtgca gcggggcgac 2460 atcgtgaagg tggtgcctgg cggcaagttc cccgtggacg gaaaagtgct ggaagggaat 2520 accatggccg acgagagcct gatcacaggc gaggccatgc ccgtgaccaa gaaacctggc 2580 agcacagtga tcgccggcag catcaatgcc cacggcagcg tgctgattaa ggccacacac 2640 gtgggcaacg ataccaccct ggctcagatt gtgaagctgg tggaagaggc ccagatgagc 2700 aaggccccca ttcagcagct ggctgaccgg ttcagcggct acttcgtgcc ctttatcatc 2760 atcatgagca ccctgacact ggtcgtgtgg atcgtgatcg gctttatcga cttcggagtg 2820 gtgcagagat acttccccaa ccctaacaag cacatcagcc agacagaagt gatcatcaga 2880 ttcgcctttc agaccagcat caccgtgctg tgtatcgcct gcccctgtag cctgggactg 2940 gccacaccta ccgctgtgat ggtgggaaca ggcgtggccg ctcagaacgg catcctgatc 3000 aaggggggca agcctctgga aatggctcac aagatcaaga ccgtgatgtt cgacaagacc 3060 ggcaccatca cccacggcgt gcccagagtg atgagagtgc tgctgctggg ggatgtggcc 3120 accctgcctc tgagaaaggt gctggctgtc gtgggcacag ccgaggctag ctctgaacac 3180 ccactgggag tggccgtgac aaagtactgc aaagaggaac tgggcaccga aaccctgggc 3240 tactgcaccg actttcaggc cgtgcctggc tgtggcatcg gctgcaaggt gtccaacgtg 3300 gaaggcatcc tggcccacag cgagaggcca ctgtctgccc ctgccagcca cctgaacgag 3360 gccggatctc tgcccgccga aaaggacgct gtgccccaga ccttctctgt gctgattggc 3420 aacagagagt ggctgcggcg gaacggcctg accatctcct ccgatgtgtc cgacgccatg 3480 accgaccacg agatgaaggg ccagaccgcc attctggtgg ccattgacgg ggtgctgtgc 3540 ggcatgatcg caatcgccga tgccgtgaaa caggaagcag cactggccgt gcacaccctg 3600 cagtctatgg gagtggatgt ggtgctgatc accggcgaca acagaaagac cgccagggcc 3660 attgccaccc aggtgggcat caacaaggtg ttcgccgagg tgctgcccag ccacaaagtg 3720 gccaaggtgc aggaactgca gaacaaaggc aaaaaggtgg ccatggtggg agatggcgtg 3780 aacgactctc ctgctctggc ccaggcagat atgggcgtgg ccatcggcac aggcaccgac 3840 gtggcaattg aggctgctga cgtggtgctg attcggaacg acctgctgga cgtggtggcc 3900 tccatccacc tgtccaagag aaccgtgcgg cggatcagaa tcaacctggt gctggcactg 3960 atctataacc tcgtgggcat ccctatcgcc gctggcgtgt tcatgcctat cggaatcgtg 4020 ctgcagccct ggatgggctc tgccgccatg gctgcaagct ccgtgtctgt ggtgctgtcc 4080 agcctgcagc tgaagtgcta caagaagccc gacctggaaa gatacgaggc ccaggcccac 4140 ggacacatga agcctctgac agcctcccag gtgtccgtgc acatcggcat ggacgacaga 4200 tggcgggaca gccctagagc caccccttgg gatcaggtgt catacgtgtc acaggtgtcc 4260 ctgagcagcc tgaccagcga caagcccagc agacatagcg ccgctgccga cgacgatggg 4320 gacaagtggt ccctgctgct gaacggccgg gatgaggaac agtacatctg ataagcatgc 4380 aataaagtct gagtgggcgg cagcctgtgt gtgcctgggt tctctctgtc ccggaatgtg 4440 caaacaatgg aggtgctcga gtagataagt agcatggcgg gttaatcatt aactacaagg 4500 aacccctagt gatggagttg gccactccct ctctgcgcgc tcgctcgctc actgaggccg 4560 ggcgaccaaa ggtcgcccga cgcccgggct ttgcccgggc ggcctcagtg agcgagcgag 4620 cgcgcagcct taattaacct aattcactgg ccgtcgtttt acaacgtcgt gactgggaaa 4680 accctggcgt tacccaactt aatcgccttg cagcacatcc ccctttcgcc agctggcgta 4740 atagcgaaga ggcccgcacc gatcgccctt cccaacagtt gcgcagcctg aatggcgaat 4800 gggacgcgcc ctgtagcggc gcattaagcg cggcgggtgt ggtggttacg cgcagcgtga 4860 ccgctacact tgccagcgcc ctagcgcccg ctcctttcgc tttcttccct tcctttctcg 4920 ccacgttcgc cggctttccc cgtcaagctc taaatcgggg gctcccttta gggttccgat 4980 ttagtgcttt acggcacctc gaccccaaaa aacttgatta gggtgatggt tcacgtagtg 5040 ggccatcgcc ctgatagacg gtttttcgcc ctttgacgtt ggagtccacg ttctttaata 5100 gtggactctt gttccaaact ggaacaacac tcaaccctat ctcggtctat tcttttgatt 5160 tataagggat tttgccgatt tcggcctatt ggttaaaaaa tgagctgatt taacaaaaat 5220 ttaacgcgaa ttttaacaaa atattaacgc ttacaattta ggtggcactt ttcggggaaa 5280 tgtgcgcgga acccctattt gtttattttt ctaaatacat tcaaatatgt atccgctcat 5340 gagacaataa ccctgataaa tgcttcaata atattgaaaa aggaagagta tgagtattca 5400 acatttccgt gtcgccctta ttcccttttt tgcggcattt tgccttcctg tttttgctca 5460 cccagaaacg ctggtgaaag taaaagatgc tgaagatcag ttgggtgcac gagtgggtta 5520 catcgaactg gatctcaaca gcggtaagat ccttgagagt tttcgccccg aagaacgttt 5580 tccaatgatg agcactttta aagttctgct atgtggcgcg gtattatccc gtattgacgc 5640 cgggcaagag caactcggtc gccgcataca ctattctcag aatgacttgg ttgagtactc 5700 accagtcaca gaaaagcatc ttacggatgg catgacagta agagaattat gcagtgctgc 5760 cataaccatg agtgataaca ctgcggccaa cttacttctg acaacgatcg gaggaccgaa 5820 ggagctaacc gcttttttgc acaacatggg ggatcatgta actcgccttg atcgttggga 5880 accggagctg aatgaagcca taccaaacga cgagcgtgac accacgatgc ctgtagcaat 5940 ggcaacaacg ttgcgcaaac tattaactgg cgaactactt actctagctt cccggcaaca 6000 attaatagac tggatggagg cggataaagt tgcaggacca cttctgcgct cggcccttcc 6060 ggctggctgg tttattgctg ataaatctgg agccggtgag cgtgggtctc gcggtatcat 6120 tgcagcactg gggccagatg gtaagccctc ccgtatcgta gttatctaca cgacggggag 6180 tcaggcaact atggatgaac gaaatagaca gatcgctgag ataggtgcct cactgattaa 6240 gcattggtaa ctgtcagacc aagtttactc atatatactt tagattgatt taaaacttca 6300 tttttaattt aaaaggatct aggtgaagat cctttttgat aatctcatga ccaaaatccc 6360 ttaacgtgag ttttcgttcc actgagcgtc agaccccgta gaaaagatca aaggatcttc 6420 ttgagatcct ttttttctgc gcgtaatctg ctgcttgcaa acaaaaaaac caccgctacc 6480 agcggtggtt tgtttgccgg atcaagagct accaactctt tttccgaagg taactggctt 6540 cagcagagcg cagataccaa atactgttct tctagtgtag ccgtagttag gccaccactt 6600 caagaactct gtagcaccgc ctacatacct cgctctgcta atcctgttac cagtggctgc 6660 tgccagtggc gataagtcgt gtcttaccgg gttggactca agacgatagt taccggataa 6720 ggcgcagcgg tcgggctgaa cggggggttc gtgcacacag cccagcttgg agcgaacgac 6780 ctacaccgaa ctgagatacc tacagcgtga gctatgagaa agcgccacgc ttcccgaagg 6840 gagaaaggcg gacaggtatc cggtaagcgg cagggtcgga acaggagagc gcacgaggga 6900 gcttccaggg ggaaacgcct ggtatcttta tagtcctgtc gggtttcgcc acctctgact 6960 tgagcgtcga tttttgtgat gctcgtcagg ggggcggagc ctatggaaaa acgccagcaa 7020 cgcggccttt ttacggttcc tggccttttg ctggcctttt gctcacatgt tctttcctgc 7080 gttatcccct gattctgtgg ataaccgtat taccgccttt gagtgagctg ataccgctcg 7140 ccgcagccga acgaccgagc gcagcgagtc agtgagcgag gaagcggaag agcgcccaat 7200 acgcaaaccg cctctccccg cgcgttggcc gattcattaa tgcagctggc acgacaggtt 7260 tcccgactgg aaagcgggca gtgagcgcaa cgcaattaat gtgagttagc tcactcatta 7320 ggcaccccag gctttacact ttatgcttcc ggctcgtatg ttgtgtggaa ttgtgagcgg 7380 ataacaattt cacacaggaa acagctatga ccatgattac gccagattta attaagg 7437

Claims (24)

  1. 윌슨병(Wilson's Disease: WD)에 대한 간 지향된 치료제로서 유용한 재조합 아데노 연관된 바이러스(recombinant adeno-associated virus: rAAV)로서, 상기 rAAV는 AAV 캡시드 및 내부에 패키징된 벡터 게놈을 포함하고, 상기 벡터 게놈은
    (a) AAV 5' 역위 말단 반복(inverted terminal repeat: ITR) 서열;
    (b) 인핸서 서열 및 TTR 촉진자 서열;
    (c) 절두된 인간 구리 수송 ATPase 2(ATP7B)를 암호화하는 암호화 서열로서, 상기 절두된 ATP7B는 금속 결합 도메인 1-3(MBD1-3)이 결실된, 암호화 서열; 및
    (d) AAV 3' ITR 서열
    을 포함하는, rAAV.
  2. 제1항에 있어서, 상기 AAV 캡시드는 AAV8 캡시드인, rAAV.
  3. 제1항에 있어서, 상기 촉진자 서열은 서열 번호 11 또는 서열 번호 11의 21번 뉴클레오타이드 내지 190번 뉴클레오타이드를 포함하는, rAAV.
  4. 제1항에 있어서, 상기 AAV 5' ITR 서열 및/또는 AAV 3' ITR 서열은 AAV2 유래인, rAAV.
  5. 제1항에 있어서, 상기 벡터 게놈은 polyA 서열을 추가로 포함하는, rAAV.
  6. 제5항에 있어서, 상기 polyA 서열은 75개의 bp 길이인, rAAV.
  7. 제1항에 있어서, 상기 벡터 게놈은 WPRE 서열을 추가로 포함하는, rAAV.
  8. 제1항에 있어서, 상기 벡터 게놈은 인트론 서열을 추가로 포함하는, rAAV.
  9. 제8항에 있어서, 상기 인트론 서열은 인간 베타 글로빈 IVS2 또는 SV40로부터 유래인, rAAV.
  10. 제1항에 있어서, 상기 인핸서 서열은 α1-마이크로글로불린/비쿠닌 전구체(ABP) 인핸서, ABPS 인핸서, TTR 인핸서, en34 인핸서, 또는 ApoE 인핸서인, rAAV.
  11. 제1항에 있어서, 상기 벡터 게놈은 3 킬로염기 내지 5.5 킬로염기 크기인, rAAV.
  12. 제1항에 있어서, 상기 암호화 서열 (c)는 네이티브 암호화 서열인, rAAV.
  13. 제1항에 있어서, 상기 암호화 서열 (c)는 코돈 최적화된 서열인, rAAV.
  14. 윌슨병에 대한 간 지향된 치료제로서 유용한 rAAV로서, 상기 rAAV는 AAV 캡시드 및 내부에 패키징된 벡터 게놈을 포함하고, 상기 벡터 게놈은
    (a) AAV 5' ITR 서열;
    (b) TTR 인핸서 서열 및 TTR 촉진자 서열;
    (c) 인트론 서열;
    (d) 절두된 인간 구리 수송 ATPase 2(ATP7B)를 암호화는 네이티브 암호화 서열로서, 상기 절두된 ATP7B는 금속 결합 도메인 1-3(MBD1-3)이 결실된, 네이티브 암호화 서열;
    (e) polyA 서열; 및
    (f) AAV 3' ITR 서열
    을 포함하는 rAAV.
  15. 1x1012 GC(게놈 카피)/㎖ 내지 1x1014 GC/㎖의 rAAV를 포함하고, 상기 rAAV는 청구항 제1항 내지 제13항 중 어느 한 항에 따른 rAAV인, 윌슨병을 치료하기 위한 약제학적 조성물.
  16. 제15항에 있어서, 상기 약제학적 조성물은 정맥내 주사용인, 약제학적 조성물.
  17. 제15항에 있어서, 상기 약제학적 조성물 중에 용해된 계면활성제, 보존제, 및/또는 완충제를 추가로 포함하는, 약제학적 조성물.
  18. 제15항에 있어서, 상기 GC는 oqPCR 또는 ddPCR에 기초하여 결정된 바대로 계산되는, 약제학적 조성물.
  19. 제15항에 있어서, 상기 AAV 캡시드는 AAV8 캡시드인, 약제학적 조성물.
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