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KR102399732B1 - 2-[3-[4-(1h-인다졸-5-일아미노)퀴나졸린-2-일]페녹시]-n-아이소프로필아세트아마이드를 유효성분으로 함유하는 코로나-19의 예방 또는 치료용 약학적 조성물 - Google Patents

2-[3-[4-(1h-인다졸-5-일아미노)퀴나졸린-2-일]페녹시]-n-아이소프로필아세트아마이드를 유효성분으로 함유하는 코로나-19의 예방 또는 치료용 약학적 조성물 Download PDF

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KR102399732B1
KR102399732B1 KR1020210079751A KR20210079751A KR102399732B1 KR 102399732 B1 KR102399732 B1 KR 102399732B1 KR 1020210079751 A KR1020210079751 A KR 1020210079751A KR 20210079751 A KR20210079751 A KR 20210079751A KR 102399732 B1 KR102399732 B1 KR 102399732B1
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천광훈
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가천대학교 산학협력단
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Abstract

본 발명은 2-[3-[4-(1H-인다졸-5-일아미노)퀴나졸린-2-일]페녹시]-N-아이소프로필아세트아마이드(2-[3-[4-(1H-indazol-5-ylamino)quinazolin-2-yl]phenoxy]-N-isopropylacetamideamide, KD025) 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염을 유효성분으로 함유하는 코로나19의 예방 또는 치료용 약학적 조성물에 관한 것으로서, ROCK2(Rho associated coiled-coil containing protein kinase 2)의 강력한 저해제로 알려진 화합물 KD025가 CK2(casein kinase 2)와 강한 결합을 하고, 이의 활성을 nM 수준(IC50=49.7nM)에서 유의미하게 저해한다는 내용을 밝혔고, 이러한 결과를 바탕으로 KD025를 유효성분으로 함유하는 약학적 조성물이 CK2활성 저해함으로써 중증급성호흡기증후군 코로나바이러스 2(SARS-CoV-2)에 감염된 세포의 활성을 저해하여 코로나19(COVID-19)의 예방 또는 치료하는 효과를 나타냄을 확인하였다.

Description

2-[3-[4-(1H-인다졸-5-일아미노)퀴나졸린-2-일]페녹시]-N-아이소프로필아세트아마이드를 유효성분으로 함유하는 코로나-19의 예방 또는 치료용 약학적 조성물{Pharmaceutical composition for preventing or treating COVID-19 containing 2-[3-[4-(1H-indazol-5-ylamino)quinazolin-2-yl]phenoxy]-N-isopropylacetamideamide as an active ingredient}
본 발명은 2-[3-[4-(1H-인다졸-5-일아미노)퀴나졸린-2-일]페녹시]-N-아이소프로필아세트아마이드(2-[3-[4-(1H-indazol-5-ylamino)quinazolin-2-yl]phenoxy]-N-isopropylacetamideamide, KD025) 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염을 유효성분으로 함유하는 코로나19의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.
신약개발은 크게 통상적인 신약개발(de novo drug discovery and development)과 약물재창출(drug repurposing or drug repositioning)에 의한 신약개발로 나눌 수 있다.
통상적인 신약 개발(de novo drug discovery and development)은 타겟 발굴, 후보 물질 스크리닝, 최적화, 신약의 체내 흡수, 체내 분포, 신진대사, 배출, 그리고 독성 테스트(ADMET; absorption, distribution, metabolism, excretion, and toxicity), 개발, 등록 등의 과정을 거치므로 10년 이상 소요되고, 그럼에도 불구하고 성공률은 통상적으로 10% 이하로 낮다.
반면, 약물재창출(drug repurposing or drug repositioning)에 의한 신약개발은 이미 시판되어 사용되고 있어 안전성이 입증된 약물 또는 임상시험에서 안전성은 있지만 효능이 충분히 입증되지 않아 허가 받지 못한 약물을 대상으로 새로운 치료효과를 규명하여 신약으로 개발하는 한 방법으로, 화합물 규명, 화합물 획득, 개발, 등록의 과정으로 신약개발이 3년 내에도 가능하므로 약물의 개발 기간이 대폭 단축되고, 약물의 안전성이나 약동학과 관련하여 위험성이 낮은 상태에서 시작하기 때문에 성공률이 좀 더 높다.
출시 또는 실패 약물로부터 동일한 약물 표적을 통해 다른 새로운 질환에 대한 효과를 찾아내거나, 신규 표적분자를 찾아내 다른 새로운 질환에 효과가 있음을 입증하는 것으로, 신약개발에 있어 시간과 노력을 줄일 수 있는 방법 중 하나이다.
본 발명자는 약물재창출에 의한 신약개발의 방법으로 ROCK2(Rho associated coiled-coil containing protein kinase 2)인산화 효소의 저해제로 개발된 저분자화합물인 KD025(Belumosudil)의 다양한 타겟을 스크린 하였고, KD025가 CK2에 결합하여 이의 활성을 저해하는 것을 밝혀냈다.
CK2는 다양한 질병에 관련되어 있으며, 특히 암의 진행에 중요한 역할을 하여 항암제의 타겟으로 개발되고 있다.
한편, 최근에는 CK2가 코로나-19(COVID-19)의 활성을 저해한다는 연구결과가 보고되고 있다.
코로나-19를 일으키는 중증급성호흡기증후군 코로나바이러스 2(Severe acute respiratory syndrome coronavirus 2, SARS-CoV-2)에 감염된 사람의 직장결장 선암종 세포(human colorectal adenocarcinoma cell)를 불멸화시킨 세포주인 Caco-2 세포는 사상위족(filopodia)이 돌출하며, 돌출된 구조를 통해 상기 코로나바이러스 입자가 배출되는 것으로 알려져 있다. 이러한 돌출구조를 통해 상기 코로나바이러스 입자가 다른 세포로 전달이 되고, 이 과정에서 CK2가 관여하며, CK2의 활성이 증가하면 사상위족(filopodia)의 생성이 증가한다. 이때 감염된 세포에 CK2 저해제로 알려진 CX-4945(Silmitasertib)를 처리할 경우, CK2 활성이 저해가 되며 상기 코로나바이러스 활성이 감소한다(Bouhaddou et al., 2020, Cell 182, 685-712, August 6, 2020)는 보고가 있다.
현재 가장 강력한 CK2 저해제로 알려진 CX-4945(Silmitasertib)은 암을 대상으로 한 다수의 임상시험이 진행되고 있으며, 2017년 진행성 담관암(advanced cholangiocarcinoma)에 대해 미국 FDA로부터 희귀의약품으로 승인을 받았고, 또한, 상기 화합물은 현재 Kadmon Company 제약사에서 특발성 폐섬유증(Idiopathic Pulmonary Fibrosis, IPF)을 포함한 다양한 질환에 대한 치료제로 임상개발 중에 있는 물질로서 안정성에 대한 입증이 되어있는 상태이다.
또한 최근에는 Senhwa Biosiences 사가 코로나-19의 치료목적으로 이 약물에 대한 임상시험 2상을 진행중에 있다.
코로나-19의 치료제는 바이러스 자체를 공격하는 항체와 바이러스의 RNA 복제를 저해하는 렘데시비르(Remdesivir) 등이 있다. 다만, 이러한 치료제는 경구투여가 불가하고 치료제로 사용되기엔 치료활성이 높지 않고, 접근성이 낮다.
따라서, 현재 바이러스에 특이성이 높으면서도 경구투여가 가능하여 환자들에게 접근성이 높은 치료제의 개발이 시급하게 필요한 상황이다.
본 발명자는 KD025가 CK2활성 저해함으로써 중증급성호흡기증후군 코로나바이러스 2(SARS-CoV-2)에 감염된 세포의 활성을 저해하여 코로나19(COVID-19)의 예방 또는 치료하는 효과를 나타내는 것을 확인하여 본 발명을 완성하였다.
본 발명의 목적은 2-[3-[4-(1H-인다졸-5-일아미노)퀴나졸린-2-일]페녹시]-N-아이소프로필아세트아마이드(2-[3-[4-(1H-indazol-5-ylamino)quinazolin-2-yl]phenoxy]-N-isopropylacetamideamide, KD025) 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염의 CK2 억제활성을 이용하여 코로나-19(COVID-19)의 예방 또는 치료용 용도를 제공하는 것이다.
상기 목적을 달성하기 위하여 본 발명은 2-[3-[4-(1H-인다졸-5-일아미노)퀴나졸린-2-일]페녹시]-N-아이소프로필아세트아마이드(2-[3-[4-(1H-indazol-5-ylamino)quinazolin-2-yl]phenoxy]-N-isopropylacetamideamide, KD025) 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염을 유효성분으로 함유하는 CK2억제용 약학적 조성물을 제공한다.
상기 목적을 달성하기 위하여 본 발명은 2-[3-[4-(1H-인다졸-5-일아미노)퀴나졸린-2-일]페녹시]-N-아이소프로필아세트아마이드(2-[3-[4-(1H-indazol-5-ylamino)quinazolin-2-yl]phenoxy]-N-isopropylacetamideamide, KD025) 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염을 유효성분으로 함유하는 코로나-19(COVID-19)의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.
본 발명은 2-[3-[4-(1H-인다졸-5-일아미노)퀴나졸린-2-일]페녹시]-N-아이소프로필아세트아마이드(2-[3-[4-(1H-indazol-5-ylamino)quinazolin-2-yl]phenoxy]-N-isopropylacetamideamide, KD025) 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염을 유효성분으로 함유하는 CK2억제용 약학적 조성물 또는 코로나19의 예방 또는 치료용 약학적 조성물에 관한 것으로서 화합물 KD025가 CK2(casein kinase 2)와 강한 결합을 하여 CK2의 활성을 저해함으로서 중증급성호흡기증후군 코로나바이러스 2(SARS-CoV-2)에 감염된 세포의 활성을 저해하여 코로나19(COVID-19)의 예방 또는 치료 효과를 나타낸다.
도 1은 KD025의 키놈 전체에 대해 실시한 표적 식별(Kinome-wide target identification)에 관한 도이다.
도 1a KD025가 키나제-리간드(kinase-ligand) 결합을 감소시키고 남아있는 결합(binding) 활성을 플롯팅(plotting)한 도이다.
도 1b 결합 활성이 크게 저해되어 잔존활성이 적은 (≤ 10 %) 키나제(kinase)를 순위별로 나열하고 잔존 리간드(ligand) 결합(binding) 활성을 나타낸 도이다.
도 1c 468 개의 인간 키나제(human kinases) 계통도(dendrogram)에 KD025-키나제(kinase) 상호 작용을 나타낸 도이다.
도 1d KD025에 의해 영향을 받는 키나제-리간드(kinase-ligand) 잔존 결합(binding) 활성의 가족 분포 패턴을 나타낸 도이다.
도 1e KD025의 키나제(kinase) 저해 활성(inhibitory effect)의 전체적인 분포를 히스토그램(histogram)으로 나타낸 도이다.
도 2는 해리 상수(dissociation constant, Kd)의 결정에 관한 도이다. 약물 (KD025, CX-4945 및 fasudil)과 키나제 (CK2 및 ROCK2) 간의 상호 작용은 KINOMEscanTM 프로파일링 플랫폼을 적용하여 측정되었다.
도 3은 CK2에 대한 KD025의 시험관 내(in vitro) 저해 효능(inhibitory efficacy)측정을 나타낸 도이다.
도 3a는 8 점 농도 (KD025의 경우 0, 0.1, 1, 3, 10, 30, 100 및 1000 nM; CX-4945의 경우 0, 0.001, 0.01, 0.03, 0.1, 0.3, 1 및 10 nM)에서 측정된 효소 활성을 나타낸 도이다.
도 3b는 KD025의 저해 효과(inhibitory effects)를 pan-ROCK 저해제(inhibitor)인 fasudil과 비교한 도이다.
도 4a는 Vero CCL-81 세포에서 KD025의 SARS-CoV-2 바이러스 활성 저해 효능 및 세포독성을 나타낸 도이다.
도 4b는 Vero CCL-81 세포에서 렘데시비르(Remdesivir)의 SARS-CoV-2 바이러스 활성 저해 효능 및 세포독성을 나타낸 도이다.
본 발명은 2-[3-[4-(1H-인다졸-5-일아미노)퀴나졸린-2-일]페녹시]-N-아이소프로필아세트아마이드(2-[3-[4-(1H-indazol-5-ylamino)quinazolin-2-yl]phenoxy]-N-isopropylacetamideamide, KD025) 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염을 유효성분으로 함유하는 코로나-19(COVID-19)의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.
상기 KD025는 하기의 [화학식 1]로 표시되는 화합물(2-[3-[4-(1H-인다졸-5-일아미노)퀴나졸린-2-일]페녹시]-N-아이소프로필아세트아마이드(2-[3-[4-(1H-indazol-5-ylamino)quinazolin-2-yl]phenoxy]-N-isopropylacetamideamide, KD025) 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염을 포함한다.
[화학식 1]
Figure 112021070830881-pat00001
또한, 본 발명의 2-[3-[4-(1H-인다졸-5-일아미노)퀴나졸린-2-일]페녹시]-N-아이소프로필아세트아마이드(2-[3-[4-(1H-indazol-5-ylamino)quinazolin-2-yl]phenoxy]-N-isopropylacetamideamide, KD025)은 약학적으로 허용 가능한 염 뿐만아니라, 통상의 방법에 의해 제조될 수 있는 모든 염, 수화물 및 용매화물을 모두 포함한다.
본 발명은 2-[3-[4-(1H-인다졸-5-일아미노)퀴나졸린-2-일]페녹시]-N-아이소프로필아세트아마이드(2-[3-[4-(1H-indazol-5-ylamino)quinazolin-2-yl]phenoxy]-N-isopropylacetamideamide, KD025) 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염을 유효성분으로 함유하는 CK2억제용 약학적 조성물을 제공한다.
카세인 키나제 2(Casein kinase 2, CK2)는 인산화 효소로 조직에 광범위하게 발현되며, 현재까지 수백종이 넘는 기질이 알려져 있다.
CK2는 네 개의 서브유닛(subunit)으로 구성된 복합체(complex)로서, 효소활성을 나타내는 CK2α 및 CK2α' 2개의 서브유닛과 조절역할을 하는 CK2β 및 CK2β' 2개의 서브유닛이 결합하여 테트라머(tetramer)로 된 구조를 갖고 있다.
KINOMEscanTM 스크리닝 플랫폼(Eurofins DiscoverX, CA)을 적용하여 KD025와 키나제 간의 상호 작용을 정량적으로 측정한 결과(도1), 약 3%의 키나제 (468 개 중 16 개)가 KD025와 강한 결합 (POC ≤ 10%)을 나타냈다(도 1b).
CK2α 및 CK2α' 서브 유닛(유전자 명: CSNK2A1 및 CSNK2A2)은 ROCK2보다 10배 적게 저해 되었음에도 불구하고, KD025 (둘 다에서 POC = 0.5)와 높게 상호 작용하는 단백질이다.
주요 키나제 그룹(AGC, CAMK, CK1, CMGC, Lipid, Other, Pathogen, STE, TK, TKL 및 Atypical 그룹) 별로 수행한 덴드로그램(dendrogram) 작성 및 클러스터링(clustering)결과, KD025가 특정 그룹에 대해 특이적인 선호도를 가지지 않음을 보여주었다(도 1c 및 1d). KD025는 소수의 특정 키나제에 대해서만 강한 저해력을 보였고 다른 대부분에 대해서는 약한 저해력을 나타냈다(도 1e).
결론적으로, KD025는 ROCK2 및 CK2α와 CK2α'에 대해 높은 저해 활성을 갖는 매우 선택적인 저해제이다.
KINOMEscanTM 프로파일링 서비스를 사용하여 해리 상수(Kd)를 측정한 결과, KD025가 다른 ROCK 또는 CK2 저해제와 달리, ROCK2 및 CK2α를 효율적으로 표적화 할 수 있음을 보여준다(도2)
CK2억제 활성을 분석한 결과, KD025도 나노몰(nanomolar) 범위(IC50 = 49.7 nM)에서 효율적으로 CK2 활성을 저해하는 것으로 나타났다(도 3a).
본 발명은 2-[3-[4-(1H-인다졸-5-일아미노)퀴나졸린-2-일]페녹시]-N-아이소프로필아세트아마이드(2-[3-[4-(1H-indazol-5-ylamino)quinazolin-2-yl]phenoxy]-N-isopropylacetamideamide, KD025) 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염을 유효성분으로 함유하는 코로나-19(COVID-19)의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.
상기 CK2는 코로나-19(COVID-19)를 일으키는 중증급성호흡기증후군 코로나바이러스 2(Severe acute respiratory syndrome coronavirus 2, SARS-CoV-2)에 감염된 세포에서 상기 코로나바이러스 2의 증식을 저해한다.
KD025의 SARS-CoV-2 바이러스의 활성 저해 효능을 Vero CCL-81 세포에서 바이러스 S 단백질의 양 측정을 통해 평가한 결과, KD025는 50% 바이러스 증식 저해 농도(effective concentration 50, EC50)가 12.3 μM로 나타났으며(도4a) 세포독성은 실험농도 범위에서 관찰되지 않았다. 이러한 저해 효과는 양성 대조군인 렘데시비르(10.5 μM)와 비슷한 수준으로 나타났다(도 4b).
또한 KD025는 정맥주사로 투여되는 렘데시비르와 달리 KD025는 기존 임상시험 결과를 고려할 때 경구투여가 가능하다는 장점이 있다. 정맥주사는 투여를 위한 시설이 필요하며, 많은 인력과 비용을 요하므로, 경구투여 제제로서의 개발 가능성은 매우 큰 장점이다.
본 발명의 2-[3-[4-(1H-인다졸-5-일아미노)퀴나졸린-2-일]페녹시]-N-아이소프로필아세트아마이드(2-[3-[4-(1H-indazol-5-ylamino)quinazolin-2-yl]phenoxy]-N-isopropylacetamideamide, KD025)는 약학적으로 허용 가능한 염의 형태로 사용할 수 있으며, 염으로는 약학적으로 허용 가능한 유리산(free acid)에 의해 형성된 산부가염이 유용하다.
산 부가염은 염산, 질산, 인산, 황산, 브롬화수소산, 요드화수소산, 아질산 또는 아인산과 같은 무기산류, 지방족 모노 및 디카르복실레이트, 페닐-치환된 알카노에이트, 하이드록시 알카노에이트 및 알칸디오에이트, 방향족 산류, 지방족 및 방향족 설폰산류와 같은 무독성 유기산으로부터 얻는다.
이러한 약학적으로 무독한 염류로는 설페이트, 피로설페이트, 바이설페이트, 설파이트, 바이설파이트, 니트레이트, 포스페이트, 모노하이드로겐 포스페이트, 디하이드로겐 포스페이트, 메타포스페이트, 피로포스페이트 클로라이드, 브로마이드, 아이오다이드, 플루오라이드, 아세테이트, 프로피오네이트, 데카노에이트, 카프릴레이트, 아크릴레이트, 포메이트, 이소부티레이트, 카프레이트, 헵타노에이트, 프로피올레이트, 옥살레이트, 말로네이트, 석시네이트, 수베레이트, 세바케이트, 푸마레이트, 말리에이트, 부틴-1,4-디오에이트, 헥산-1,6-디오에이트, 벤조에이트, 클로로벤조에이트, 메틸벤조에이트, 디니트로 벤조에이트, 하이드록시벤조에이트, 메톡시벤조에이트, 프탈레이트, 테레프탈레이트, 벤젠설포네이트, 톨루엔설포네이트, 클로로벤젠설포네이트, 크실렌설포네이트, 페닐아세테이트, 페닐프로피오네이트, 페닐부티레이트, 시트레이트, 락테이트, β-하이드록시부티레이트, 글리콜레이트, 말레이트, 타트레이트, 메탄설포네이트, 프로판설포네이트, 나프탈렌-1-설포네이트, 나프탈렌-2-설포네이트 또는 만델레이트를 포함지만, 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 조성물을 의약품으로 사용하는 경우, 2-[3-[4-(1H-인다졸-5-일아미노)퀴나졸린-2-일]페녹시]-N-아이소프로필아세트아마이드(2-[3-[4-(1H-indazol-5-ylamino)quinazolin-2-yl]phenoxy]-N-isopropylacetamideamide, KD025) 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염을 유효성분으로 함유하는 약학적 조성물은 임상 투여 시에 다양한 하기의 경구 또는 비경구 투여 형태로 제제화되어 투여될 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
경구 투여용 제형으로는 예를 들면 정제, 환제, 경/연질 캅셀제, 액제, 현탁제, 유화제, 시럽제, 과립제, 엘릭시르제 등이 있는데, 이들 제형은 유효성분 이외에 희석제(예: 락토즈, 덱스트로즈, 수크로즈, 만니톨, 솔비톨, 셀룰로즈 및/ 또는 글리신), 활택제(예: 실리카, 탈크, 스테아르산 및 그의 마그네슘 또는 칼슘염 및/또는 폴리에틸렌 글리콜)를 함유하고 있다. 정제는 또한 마그네슘 알루미늄 실리케이트, 전분 페이스트, 젤라틴, 메틸셀룰로즈, 나트륨 카복시메틸셀룰로즈 및/또는 폴리비닐피롤리딘과 같은 결합제를 함유할 수 있으며, 경우에 따라 전분, 한천, 알긴산 또는 그의 나트륨 염과 같은 붕해제 또는 비등 혼합물 및/또는 흡수제, 착색제, 향미제, 및 감미제를 함유할 수 있다.
본 발명의 2-[3-[4-(1H-인다졸-5-일아미노)퀴나졸린-2-일]페녹시]-N-아이소프로필아세트아마이드(2-[3-[4-(1H-indazol-5-ylamino)quinazolin-2-yl]phenoxy]-N-isopropylacetamideamide, KD025) 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염을 유효성분으로 함유하는 약학적 조성물은 비경구 투여할 수 있으며, 비경구 투여는 피하주사, 정맥주사 또는 근육 내 주사를 주입하는 방법에 의한다. 이때, 비경구 투여용 제형으로 제제화하기 위하여 2-[3-[4-(1H-인다졸-5-일아미노)퀴나졸린-2-일]페녹시]-N-아이소프로필아세트아마이드(2-[3-[4-(1H-indazol-5-ylamino)quinazolin-2-yl]phenoxy]-N-isopropylacetamideamide, KD025) 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염을 유효성분으로 함유하는 약학적 조성물을 안정제 또는 완충제와 함께 물에 혼합하여 용액 또는 현탁액으로 제조하고, 이를 앰플 또는 바이알 단위 투여형으로 제조할 수 있다. 상기 조성물은 멸균되고/되거나 방부제, 안정화제, 수화제 또는 유화 촉진제, 삼투압 조절을 위한 염 및/또는 완충제 등의 보조제, 및 기타 치료적으로 유용한 물질을 함유할 수 있으며, 통상적인 방법인 혼합, 과립화 또는 코팅 방법에 따라 제제화할 수 있다.
또한, 본 발명의 조성물의 인체에 대한 투여량은 환자의 나이, 몸무게, 성별, 투여형태, 건강상태 및 질환 정도에 따라 달라질 수 있으며, 몸무게가 60 ㎏인 성인 환자를 기준으로 할 때, 일반적으로 0.001 ~ 1,000 ㎎/일이며, 바람직하게는 1 ~ 500 ㎎/일이며, 의사 또는 약사의 판단에 따라 일정시간 간격으로 1일 1회 내지 수회로 분할 투여할 수도 있다.
<실험예 1> 약물-키나제 결합 분석
KD025(Medchem Express (NJ, USA)에서 구입)의 표적을 스크리닝하기 위해, 우리는 활성 부위-지향성(active site-directed) 경쟁 결합 분석(competition binding assay)인 KINOMEscanTM 스크리닝 플랫폼(Eurofins DiscoverX, CA)을 적용하여 KD025와 키나제 간의 상호 작용을 정량적으로 측정했다. 이 플랫폼에는 56 개의 질병 관련 돌연변이가 포함된 468 개의 재조합 인간 키나제 (80 % 이상의 범위) (Fabian et al., 2005)가 포함되어 있다. 재조합 DNA-태그가 붙은 키나제를 고체 지지체에 고정된 프로브 리간드와 함께 배양한 다음, 정량적 PCR을 사용하여 고체 지지체에서 포획된 키나제의 수준을 측정하여 리간드에 결합된 키나제의 양을 정량했다. KD025 (10 μM)가 키나제에 결합하여 키나제-리간드 결합을 저해하는 활성은 아래 방정식에 의해 제어율(Percent of Control, POC)을 계산하여 평가했다. 여기서 낮은 숫자는 더 강한 적중률(hits)을 나타낸다.
POC = [signal (KD025-treated) - signal (positive control) / signal (DMSO) - signal (positive control)] x 100
키나제에 대한 KD025의 선택성을 설명하기 위해, 다음과 같이 선택적 점수 (S-점수)를 계산했다:
S (x) = [POC < x 인 비돌연변이 키나제의 수] / [테스트된 비돌연변이 키나제의 총 수(403)].
경쟁 결합 분석 접근법을 사용하여 KD025의 새로운 표적을 발견하기 위해 468 개의 재조합 인간 단백질 키나제의 패널을 스크리닝한 결과를 도 1에 나타냈다. KD025의 저해 효과는 제어율(POC)로 표시되었다(도 1a). 약 3%의 키나제 (468 개 중 16 개)가 KD025와 강한 결합 (POC ≤ 10%)을 나타냈다(도 1b). 예상대로, 알려진 1차 표적인 ROCK2는 기질 결합 (POC = 0.05)에서 가장 심하게 방해를 받아 KD025의 최대 특이성을 입증했다. 대조적으로, ROCK1의 결합 활성은 여전히 45% (ROCK2 대비 900-배의 POC)로 유지되었으며, ROCK2 이소형(isotype)에 비해 KD025의 강력한 선택성을 보여준다. CK2α 및 CK2α' 서브 유닛(유전자 명: CSNK2A1 및 CSNK2A2)은 ROCK2보다 10배 적게 저해 되었음에도 불구하고, KD025 (둘 다에서 POC = 0.5)와 그 다음으로 높게 상호 작용하는 단백질이었다.
주요 키나제 그룹(AGC, CAMK, CK1, CMGC, Lipid, Other, Pathogen, STE, TK, TKL 및 Atypical 그룹) 별로 수행한 덴드로그램(dendrogram) 작성 및 클러스터링(clustering)결과는 KD025가 특정 그룹에 대해 특이적인 선호도를 가지지 않음을 보여주었다(도 1c 및 1d). KD025는 소수의 특정 키나제에 대해서만 강한 저해력을 보였고 다른 대부분에 대해서는 약한 저해력을 나타냈다(도 1e). 선택성 점수 (S-점수)는 수준이 낮을수록 화합물이 높은 선택성을 가짐을 의미하는 수치로, KD025는 S(35) = 0.069, S(10) = 0.037 및 S(1) = 0.007으로 선택성이 높음을 보여주었다. 결론적으로, KD025는 ROCK2 및 CK2α와 CK2α'에 대해 높은 저해 활성을 갖는 매우 선택적인 저해제이다.
<실험예 2> 해리 상수(dissociation constant, K d ) 측정
해리 상수(Kd)는 KINOMEscanTM 프로파일링 서비스를 사용하여 측정되었다. 간단히 말해서, 10μM KD025, CX-4945 및 fasudil의 3 배 연속 희석의 11-지점 농도를 키나제 및 활성 부위 지향성 리간드(active site directed ligand)와 함께 배양했다. 잔류 키나제-리간드 결합 활성을 측정함으로써 저해제의 결합 활성을 모니터링 하였다. Kd는 R 소프트웨어(버전 3.6.1)에서 drc 패키지(Ritz, Baty, Streibig, & Gerhard, 2015)의 “drm” 함수를 사용하여 비선형 최소 제곱 적합 모델(nonlinear least-square fit model)을 기반으로 계산되었다.
그 결과, ROCK2와 CK2α에 대한 KD025의 Kd 값은 각각 약 54 및 128 nM로 측정됐다(도 2). 대조적으로, 알려진 CK2α-특이적 저해제인, CX-4945는 CK2α에 대해 약 0.15 nM의 Kd 값을 가졌지만 ROCK2와 선택적 상호 작용이 없었다. 한편, ROCK 저해제 fasudil은 ROCK2에 대한 Kd 값이 73 nM이지만 CK2α와 상호 작용하지 않았다. 이러한 결과는 다른 ROCK 또는 CK2 저해제와 달리, KD025가 ROCK2 및 CK2α를 효율적으로 표적화 할 수 있음을 보여준다.
<실험예 3> CK2 활성 분석
CK2 활성은 제조업체의 지침에 따라 CycLex CK2 키나제 분석/저해제 스크리닝 키트(cat# CY-1170, Medical & Biological Laboratories, Japan)를 사용하여 측정되었다. ELISA 시스템은 CK2에 의해 인산화 가능한 재조합 p53으로 코팅된 플레이트를 사용한다. 과산화효소가 결합된 항-포스포-p53 Ser46 단일 클론 항체는 CK2에 의한 인산화를 감지한다.
간단히 말해서, 저해제가 있거나 없는 CK2(cat# P6010, New England BioLabs, MA)를 웰에서 30 ℃에서 60 분 동안 배양한 다음, 검출 항체를 첨가하고 실온에서 30 분 동안 배양했다. 과산화효소의 기질 테트라-메틸 벤지딘(tetra-methylbenzidine)을 첨가하고 실온에서 10 분 동안 배양했다. 효소 활성은 Synergy H1 하이브리드 리더 (hybrid reader)(BioTek, Winooski, VT, USA)로 450 nm에서 흡광도를 측정하여 얻었다. 시험관 내(in vitro) 최대 활성을 50% 저해하는 농도(half maximal inhibitory concentration, IC50)는 R 소프트웨어에서 drc 패키지의 “drm” 함수를 사용하여 비선형 최소 제곱 적합 모델을 사용하여 용량-반응 곡선을 구성하여 계산되었다.
결과는 CX-4945가 KD025보다 훨씬 강력한 저해 활성(IC50 = 0.427 nM)을 가졌지만, KD025도 나노몰랄(nanomolar) 범위(IC50 = 49.7 nM)에서 효율적으로 CK2 활성을 저해하는 것으로 나타났다(도 3a). 대조적으로, fasudil은 상대적으로 높은 농도(150 nM)에서도 CK2를 효과적으로 저해하지 못했다(도 3b).
<실험예 4> COVID-19 항바이러스 효능평가
본 실험예에서는 본 발명의 화합물 KD025의 Vero CCL-81 세포에 대한 SARS-CoV-2 바이러스 활성 저해 효능을 분석하였다. Vero 세포주는 아프리카 사바나 원숭이(African green monkey)로부터 얻은 신장 상피세포주로서, 바이러스에 감염되어도 인터페론 알파 또는 베타를 분비하지 않는 특징이 있다. 상기 세포주는 바이러스 약물개발 연구에서 바이러스의 증식을 측정하기 위한 숙주세포로 많이 활용된다.
상기 Vero CCL-81 세포(1 x 104 /웰)를 96웰 플레이트에 하루동안 배양한 다음, KD025를 100 내지 0.005 μM의 농도까지 3배수로 희석하여 처리하였다. 이후, 동일한 부피의 SARS-CoV-2 바이러스 용액을 첨가하고 (MOI = 0.02) 48 시간동안 배양하였다. 대조군으로는 미국에서 중증 코로나 감염 입원환자의 긴급 치료제로 사용되는 렘데시비르(Remdesivir)를 사용하였다. 배양액을 제거한 후, 아세톤:메탄올(1:3) 용액을 10분간 처리하여 세포를 고정하고 막 투과 처리를 하였다.
마우스 항-S 단백질 항체(Cat. No., GTX632604; Genetex, Irvine, CA, USA)와 Alexa Fluor 488-결합 염소 항마우스 IgG(Invitrogen, Carlsbad, CA, USA)를 이용하여 세포 내 바이러스 S 단백질을 형광표지 하였다. 세포핵은 4',6-diamidino-2-phenylindole (DAPI; Invitrogen)으로 염색하였다. 형광 이미지는 Operetta High-content Screening System (Perkin Elmer, Waltham, MA, USA)과 내장된 Harmony 소프트웨어를 사용하여 정량분석 하였다.
KD025의 SARS-CoV-2 바이러스의 활성 저해 효능을 Vero CCL-81 세포에서 바이러스 S 단백질의 양 측정을 통해 평가하였다. 그 결과, KD025는 도 4a에 나타난 바와 같이 50% 바이러스 증식 저해 농도(effective concentration 50, EC50)가 12.3 μM로 나타났으며 세포독성은 실험농도 범위에서 관찰되지 않았다. 이러한 저해 효과는 양성 대조군인 렘데시비르(10.5 μM)와 비슷한 수준으로 나타났다(도 4b).
이는 KD025가 임상적으로 코로나 치료제로서 사용 가능성이 높음을 보여준다.
특기할 만한 점은, 렘데시비르 및 개발중에 있는 다양한 치료약물 후보들은 뉴클레오시드 유사체(nucleoside analog)로 바이러스의 RNA-의존성 RNA 중합효소(RNA-dependent RNA polymerase)를 저해하는 반면, 본 발명의 화합물 KD025는 뉴클레오시드 유사체가 아니고 바이러스를 저해하는 기전도 다르므로 기존의 뉴클레오시드 유사체에서 나타나는 물리화학적 효능에서의 단점들을 보완할 수 있다.
또한, 정맥주사로 투여되는 렘데시비르와 달리 KD025는 기존 임상시험 결과를 고려할 때 경구투여가 가능하다는 장점이 있다. 정맥주사는 투여를 위한 시설이 필요하며 많은 인력과 비용을 요하므로, 경구투여 제제로서의 개발 가능성이 있다는 점은 매우 큰 장점이라 볼 수 있다.
또한, 새로운 화학구조로 개발된 치료후보 약물과 달리, KD025는 여러 임상시험이 진행되거나 완료된 약물로서 인체독성과 약물안정성에 대한 검증이 완료되어 있다. 따라서, 임상에 실제 적용이 가능한 새로운 코로나 치료제로서의 개발 가능성이 매우 높다고 볼 수 있다.

Claims (13)

  1. 삭제
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  5. 2-[3-[4-(1H-인다졸-5-일아미노)퀴나졸린-2-일]페녹시]-N-아이소프로필아세트아마이드(2-[3-[4-(1H-indazol-5-ylamino)quinazolin-2-yl]phenoxy]-N-isopropylacetamideamide, KD025) 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염, 용매화물 또는 수화물을 유효성분으로 함유하고, CK2의 활성을 억제하여 코로나-19(COVID-19)를 일으키는 중증급성호흡기증후군 코로나바이러스 2(Severe acute respiratory syndrome coronavirus 2, SARS-CoV-2)에 감염된 세포에서 상기 코로나바이러스 2의 증식을 저해하는 것을 특징으로 하는 코비드-19(COVID-19)의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
  6. 삭제
  7. 삭제
  8. 제5항에 있어서,
    상기 CK2는 SARS-CoV-2 바이러스의 사상위족(filopodia)의 생성을 촉진하는 것을 특징으로 하는 코비드-19(COVID-19)의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
  9. 제5항에 있어서,
    상기 SARS-CoV-2 바이러스는 사상위족을 통하여 증식하는 것을 특징으로 하는 코비드-19(COVID-19)의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
  10. 제5항에 있어서,
    상기 KD025의 투여 방법은 경구 투여 또는 비경구투여인 것을 특징으로 하는 코비드-19(COVID-19)의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
  11. 제5항에 있어서,
    상기 KD025는 CK2(casein kinase 2)와 결합하여 CK2의 활성을 저해하는 것을 특징으로 하는 코비드-19(COVID-19)의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
  12. 제11항에 있어서,
    상기 CK2의 활성을 저해하는 것은 최대 활성을 50% 저해하는 농도(half maximal inhibitory concentration, IC50)가 0.1 내지 10,000 nM에서 효율적으로 CK2 활성을 저해하는 것을 특징으로 하는 코비드-19(COVID-19)의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
  13. 제5항에 있어서,
    상기 CK2는 효소 활성을 나타내는 CK2알파와 CK2알파' 서브 유닛, 조절역할을 하는 CK2베타와 CK2베타' 서브유닛이 결합하여 테트라머(tetramer)로 된 구조를 갖는 것을 특징으로하는 코비드-19(COVID-19)의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
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