KR102381379B1

KR102381379B1 - 쇼트닝 배송물질을 이용한 결정 시료 배송 방법

Info

Publication number: KR102381379B1
Application number: KR1020200078247A
Authority: KR
Inventors: 남기현; 조윤제
Original assignee: 고려대학교 산학협력단; 포항공과대학교 산학협력단
Priority date: 2019-06-26
Filing date: 2020-06-26
Publication date: 2022-04-01
Anticipated expiration: 2040-06-26
Also published as: KR20210002021A

Abstract

본 발명은 X선 결정학 (X-ray crystallography) 시료 배송에 관한 것으로, 더욱 상세하게는 연속 결정학 (serial crystallography)에서 결정 시료를 X선 위치까지 낮은 유속으로 안정하게 전달하기 위한 소수성 배송물질 개발에 관한 것이다.
Shortening은 LCP와는 다르게 습도, 압력에 따라 phase 변화가 존재하지 않아 데이터 수집 동안 실험 환경에 대한 영향이 없다. 또한 쇼트닝은 실온에서 반고체상태이며 융점 이상에서는 액체상태로 변하여 특징이 있다. 이에 따라 시료를 준비하는 과정에서는 온도를 융점 이상으로 올려 액체상태로 만든 후 시료를 이동을 수행하고, 실린지 내에서는 실온에 방치하여 반고체상태로 원상복귀 할 수 있어, 기존 grease 방법과 같은 시료 손실이 없다. 또한 쇼트닝은 인체에 안전할 뿐만 아니라 가격 (4.5 kg = 10,000원 이내)이 매우 저렴한 장점이 있다.

Description

쇼트닝 배송물질을 이용한 결정 시료 배송 방법{sample delivery method using shortening delivery material}

본 발명은 X선 결정학 (X-ray crystallography) 시료 배송에 관한 것으로, 더욱 상세하게는 연속 결정학 (serial crystallography)에서 결정 시료를 X선 위치까지 낮은 유속으로 안정하게 전달하기 위한 소수성 배송물질 개발에 관한 것이다.

보편적으로 사용되고 있는 가속기 기반 X선 결정학은 단백질, 핵산 등과 같은 생체 고분자를 원자 수준의 해상도로 구조를 관찰할 수 있게 하는 구조 생물학 분야의 중요한 실험 기법이다.

하지만, 가속기를 기반의 X선 결정학에서는 실험과정에서 결정시료는 X선에 지속적으로 노출되며, 이에 방사선에 의한 시료 손상이 발생하게 된다. 이를 해결하고자 보편적으로 저온 환경에서의 회절 데이터 수집을 수행하지만, 근본적으로 생물학적 환경에 동일하지 않는 실험적 한계가 있다.

이러한 문제점들은 최근 각광을 받고 있는 연속 결정학 (Serial crystallography, SX) 기법으로 해결할 수 있는데, 이들은 실온에서 결정 시료를 연속적으로 제공하여 회절데이터를 수집하는 방법이다. 결정 시료들은 X선에 한번만 노출되기 때문에 기존 X선 결정학에 비해 방사선에 의한 시료 손상이 없거나 적고, 이러한 실험 환경은 시분해 연구를 통한 생체 고분자의 동역학적 정보를 제공할 수 있게 한다.

SX 실험적 측면에서 가장 어려운 부분은 결정 시료 소비량이 많다는 것과 X선 위치에 안정적이며 지속적으로 배송하기 어렵다는 것이다. 다양한 배송 기법들이 SX 연구에서 수행되었는데, 그중 점성이 있는 배송물질을 이용한 결정 시료 배송법은 결정 시료를 낮은 유속으로 배송할 수 있기 때문에 시료 소비량이 기존 가스 동적 가상 노즐을 이용한 인젝터에 비해서 약 100-1000배 시료 소비량이 적은 장점이 있다. 시료 배송물질은 크게 소수성 (hydrophobic) 물질과 친수성 (hydrophilc) 배송물질로 구분할 수 있는데, 소수성 물질인 monoolein와 grease가 안정적인 injection stream을 제공하며 SX연구에 가장 널리 사용되고 있다. 하지만 LCP와 grease 두 물질은 각각 주변 환경에 따른 상 (phase) 변화와 시료 준비 용이성이 떨어진다는 단점이 있다. 이를 대체할 수 있으며 더 저렴하고, 보편적이며, 사용하기 편한 배송 물질 개발이 필요하다.

소수성의 배송 물질 중 monoolein와 grease가 SX 연구분야에서 가장 널리 응용되고 있다. monoolein은 용액과 일정 비율에서 Lipdic cubic phase (LCP)를 만들어 실험에 사용하게 되는데 온도, 습도, 압력에 따라 LCP가 lamellar, hexagonal, or sponge phase로 바뀌게 된다. 이에 따라 시료 준비 및 실험 환경을 유지하는데 많은 노력이 필요하다. 또한 이 물질은 고가 (1g=150,000-200,000원)로서 다양한 인젝션 테스트하는데 비용적인 측면에서 단점이 있다. grease의 경우는 제작과정에서 다양한 첨가물이 추가되어 잠정적으로 결정 시료에 화학적 영향을 줄 수 있으며, 이전 greaes를 이용한 SFX 연구에서 활성자리의 금속이 제거되는 것이 관찰되었다. 또한 grease는 반고체 특성을 지니고 있어 시료 준비과정에서 배송물질 이동시 시료 손실을 발생하는 문제가 있다.

이를 해결하기 위해서 본 발명에서는 shortening 물질을 이용한 소수성 배송물질을 개발하였다.

상기와 같은 목적을 달성하기 위한 본 발명의 일 실시예에 따라서 쇼트닝을 배송물질로 사용하는 연속 밀리초 결정학 (serial millisecond crystallography)을 수행하는 기술을 제공한다.

상기와 같은 목적을 달성하기 위한 본 발명의 다른 실시예에 따라서 쇼트닝을 배송물질로 사용하는 연속 펨토초 결정학 (serial millisecond crystallography)을 수행하는 기술을 제공한다.

본 발명에서는 단백질 결정 시료가 상호작용하지 않으며 X선 배경 산란이 없는 쇼트닝 (shortening) 배송물질을 제공한다. 쇼트닝은 지방으로 구성되었으며 독성이 없는 식품 제작에 사용되는 안전한 물질이다. 이 물질은 온도에 의해서 고체상태와 액체 상태로 상 (phase) 변화가 가능하기 때문에 시료 준비과정에서 재료 및 결정 시료 손실을 최소화할 수 있다. 또한 기존에 보고된 소수성 배송 물질에 비해서 가격적 이점을 가지고 있다. 결과적으로 새롭게 개발된 쇼트닝 배송물질 이용한 SX 연구를 수행할 수 있다.

Shortening은 LCP와는 다르게 습도, 압력에 따라 phase 변화가 존재하지 않아 데이터 수집 동안 실험 환경에 대한 영향이 없다. 또한 쇼트닝은 실온에서 반고체상태이며 융점 이상에서는 액체상태로 변하여 특징이 있다. 이에 따라 시료를 준비하는 과정에서는 온도를 융점 이상으로 올려 액체상태로 만든 후 시료를 이동을 수행하고, 실린지 내에서는 실온에 방치하여 반고체상태로 원상복귀 할 수 있어, 기존 grease 방법과 같은 시료 손실이 없다. 또한 쇼트닝은 인체에 안전할 뿐만 아니라 가격 (4.5 kg = 10,000원 이내)이 매우 저렴한 장점이 있다. 이러한 이유로 실험에 적용될 분사 테스트를 사전에 다양하게 시도할 수 있다. 결과적으로 쇼트닝은 SX분야에서 기존 널리 사용되고 있는 소수성 배송물질 LCP와 grease의 단점을 완벽하게 보완한 물질로서 연구 결과의 질적 향상, 실험 편리성 및 비용 절감에 큰 이점을 갖고 있다. shortening을 SX 실험에서 배송물질로서 적용 가능한지를 위해서 특성 분석 및 사용 가능 한지를 연구적으로 증명하였으며, 이를 통해 이미 모델 결정 시료 2건에 대한 구조를 규명하였다.

이전에 보고된 LCP (예, monoolein)과 grease와 같은 소수성 배송물질들에 비해서 가격이 저렴하며, 시료 준비과정에서 쇼트닝의 온도 조절을 이용한 상전이를 통하여 시료 손실을 최소화 할 수 있다. 또한, 물질로부터 발생하는 X선 배경 산란이 데이터 분석에 영향을 주지 않지 않아 SX에 적용이 가능하다. 결과적으로 기존에 보고된 배송물질에 단점들을 모두 해결할 수 있는 물질로서 우수한 데이터 품질을 보장하게 된다.

도 1은 본 발명에 따른 쇼트닝 배송물질을 준비하는 과정을 보인다.
도 2는 쇼트닝 A와 쇼트닝 B의 배경 산란 분석을 보인다.
도 3은 쇼트닝 A에 배송된 GI의 색인된 회절 패턴을 보인다.
도 4는 쇼트닝 A에 배송된 리소자임의 색인된 회절 패턴을 보인다.
도 5는 쇼트닝 B에 배송된 GI의 색인된 회절 패턴을 보인다.
도 6은 쇼트닝 B에 배송된 리소자임의 색인된 회절 패턴을 보인다.
도 7은 쇼트닝에 배송된 (a) GI와 (b) 리소자임의 전자밀도 지도를 보인다.
도 8은 쇼트닝 배송물질을 이용한 GI의 결정 구조와 다른 배송 매체를 이용한 결정 구조의 비교를 보인다.
도 9는 쇼트닝 배송물질을 이용한 GI의 결정 구조와 다른 배송 매체를 이용한 결정 구조의 비교를 보인다.

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 예시하기 위한 것으로, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지 않는 것은 당 업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.

[실시예 1] 연속 결정학을 위한 shortening 배송 물질 준비

본 연구에서는 2 개의 쇼트닝이 연구에 사용되었으며, 각각을 쇼트닝 A (야자 기름 및 탤로우로 구성) 및 쇼트닝 B (야자유, 탤로우 및 토코페롤로 구성) 칭한다. 먼저 SX 실험을 위해 쇼트닝을 이용한 시료 준비 방법을 확립하였다. 쇼트닝 A 및 B에 삽입 된 결정은 이중 주사기 셋업을 사용하여 기계적 혼합을 수행하였다 (도 1).

도 1은 본 발명에 따른 쇼트닝 배송물질을 준비하는 과정을 보이는 것으로서, 도 1a는 실온에서 반고체 상태의 쇼트닝은 열을 이용하여 용액 상태의 쇼트닝으로 만들고 시린지로 옮기는 과정을 보이고, 도 1b는 결정 현탁액은 실린지에 넣고 수직으로 세워 결정을 가라 앉힌 후 상층 결정용액을 제거하는 과정을 보이고, 도 1c 및 도 1d는 쇼트닝과 결정 현탁액이 포함된 실린지를 커플러로 연결한후 플런저를 이용하여 혼합하는 과정을 보이고, 도 1e는 쇼트닝에 포함된 결정 시료를 X선 위치로 배송하는 과정을 보인다.

쇼트닝의 용점은 체온보다 낮기 때문에 쇼트닝을 함유 한 바이알을 손으로 잡아서 쇼트닝의 지질 상을 얻을 수 있지만, 이 경우에는 열전달이 충분히 녹기까지 수 분이 소요된다. 샘플 준비 시간을 줄이기 위해 쇼트닝을 담은 바이알을 약 10-20 초 동안 뜨거운 물 (~ 100 ℃)이 담긴 비커에 담궈 액체 상태의 쇼트닝을 얻었다 (도 1a). 쇼트닝 액상을 피펫을 사용하여 100㎕ 실린지로 옮기고 반고체 상태가 될 때까지 실온 또는 저온 배양기에서 보관했다. 결정 현탁액을 피펫을 사용하여 실린지로 옮긴다 (도 1b). 결정을 함유 한 주사기를 수직으로 놓고 10 분 이상 방치하여, 결정이 바닥으로 가라 앉으면, 플런저를 위쪽으로 밀고 결정을 제외한 결정 용액의 상층액을 제거하였다(도 1b). 다음으로 쇼트닝과 결정 현탁액이 들어있는 두 개의 주사기를 커플러를 사용하여 연결하고 결정 시료가 고르게 분포 될 때까지 플런저를 앞뒤로 섞는다 (도 1c). 결정과 쇼트닝의 혼합물된 시료를 실린지 한쪽으로 옮기고 커플러로 파트너 주사기를 제거한 후 시린지 니들을 연결했다 (도 1d). 이후 실린지 펌프를 이용하여 결정 시료를 배송했다 (도 1e).

[실시예 2] Shortening 배경 산란 측정

X 선에 노출된 배송 물질은 데이터 처리 중에 신호 대 잡음 (SNR) 비율에 영향을 줄 수 있다. 이는 배송 물질 선택을 위한 중요한 기준 중 하나이다. 향후 SX 실험에서 참고하기 위해 배경 산란을 측정하였다. 쇼트닝 A와 B의 배경 산란 분석 결과는 보편적으로 사용되는 monoolein 60% (v/v)로 구성된 LCP와 비교하였다 (도 2).

배송물질들은 168 μm 내경의 주사기 바늘로 사출되었으며, X 선 노출 시간과 광자량은 각각 100ms과 1.2 x 10¹² photon/sec였다. 수집된 데이터에서 매우 약한 산란 링도 관찰하기 위해 이미지의 색 대비 값을 크게 하여 분석했다. 쇼트닝 A는 3.90, 4.26, 4.41, 14.32, 44 및 74A에서 총 6 개의 백그라운드 산란 링이 관찰되었고 (도 2a), 쇼트닝 B는 3.90, 4.26, 4.41, 14.32 및 44.74A에서 총 5 개의 배경 산란 링이 관찰되었고 (도 2b), 쇼트닝 A 및 B로부터의 산란 링은 지질 패킹에 의한 고상으로부터의 산란으로 간주된다. LCP의 경우 4.5와 25-100A에서 총 2 개의 백그라운드 산란이 관찰되었으며 (도 2c), 쇼트닝 A의 배경 산란 강도는 LCP보다 비슷하거나 약간 높은 배경 산란 강도를 보였다 (도 2c). 반면, 쇼트닝 B의 LCP보다 전반적인 배경 산란 강도가 낮았으며 (도 2c). 배경 산란 결과 쇼트닝 종류에 따라 배경 산란 강도의 차이가 있을 수 있으며, 본 실험에서 수행된 쇼트닝은 LCP에 비해서 유사하거나 더 낮은 산란 강도를 나타냄을 확인하였다.

[실시예 3] Shortening을 배송물질로 이용한 연속 결정학

앞서 특성 분석된 쇼트닝 A와 B의 응용을 증명하기 위해 연속 밀리초 결정학 (Seria millisecond crystallography) 실험를 가속기에서 수행했다. 샘플 위치에서 X 선의 광자는 약 1.2 x 1012 photos/sec이었다. 결정 샘플에는 100ms 동안 X 선에 노출시키며 회절 데이터를 수집하였다. 쇼트닝 주입 흐름이 실온에서 안정적이었지만, 실험 허치 (25 ℃)에서 쇼트닝 injection stream의 흐름은 불안정했다. 이는 빔라인 장치 또는 카메라의 광원에 의해서 쇼트닝이 융점에 가까원 진 것으로 간주되었다. 이 문제를 해결하기 위해 허치의 내부 온도를 20 ℃로 유지한 결과 매우 안정적인 분사 흐름을 제공했다. 쇼트닝을 이용한 SMX 실험은 모델 샘플로 lysozyme (30-40 μm의)과 glucose isomerase (GI, <60 μm의)를 사용했다. 시료를 준비하는 동안 결정 현탁액의 결정화 용액을 가능한 한 많이 제거하고 이중 주사기 설정을 사용하여 쇼트닝 A 또는 B를 기계적 혼합했다. 쇼트닝에 삽입된 결정 샘플을 포함하는 주사기를 주사기 펌프에 설치하고 샘플을 시린지 펌프의 모터 구동력으로 168㎛ 내경의 주사기 바늘로부터 200 ~ 300 nl/min의 유속으로 분출하였다. 쇼트닝 A의 경우 GI와 리소자임 각각에 대해 총 64000과 48000 개의 이미지가 수집되었습니다. GI와 리소자임의 최종 indexed images은 각각 13651과 15643이었다 (도 3 및 도 4).

쇼트닝 A에 배송된 GI는 1.9 Å까지 데이터 프로세싱이 되었으며, 전체 완성도 (completeness), SNR, CC 및 Rsplit은 각각 100, 4.09, 0.9576 및 19.11이었다. 쇼트닝 A에 배송된 Lysozyme은 A를 1.8Å까지 데이터 처리가 되었으며, completenessSNR, CC, R _split 은 각각 100, 7.87, 0.9937, 7357이었다. 쇼트닝 A에 배송된 GI와 리소자임의 최종 R_work/R_free는 각각 17.95/21.43와 17.66/20.53이다. 쇼트닝 B의 경우 GI와 리소자임에 대해 총 48000 개의 이미지가 수집되었습니다. 쇼트닝 B에배송된 GI와 리소자임의 최종 indexed 이미지는 각각 16522와 27413이었다 (도 5 및 도 6).

쇼트닝 B를 이용한 GI은 1.9 Å까지 데이터 처리 되었으며, 전체 완성도는 SNR, CC, R _split 은 각각 100, 4.10, 0.9669, 17.88이었다. 쇼트닝 B에 배송된 Lysozyme은 1.5Å까지 데이터 처리하였으며, completeness, SNR, CC, R _split 은 각각 100, 9.27, 0.9936, 6.58이었다. 쇼트닝 B를 이용한 GI와 리소자임 R_work/R_free은 각각 17.56/20.10과 18.49/20.69이다. 쇼트닝 A 및 B에서 전달 된 GI는 Tyr3에서 Arg387까지 아미노산에 대한 명확한 전자 밀도지도를 보여준다 (도 7a).

쇼트닝에 의해 배송된 GI는 그리스 (PDB 코드 4W4Q) 29와 나일론 메쉬 기반 고정 표적 주사 (6IRK)에서 전달 된 이전 GI 구조와의 높은 유사성(r.m.s.deviation= 0.1594-0.2549)을 보여주었다 (도 8).

쇼트닝에 배송된 리소자임의 경우 Lys19에서 Leu147까지 전체 아미노산의 전자 밀도 맵은 명확했다 (도 7b). 쇼트닝 A와 B를 사용 된 리소자임 구조는 액체 제트 시료 주입기 (PDB 코드 4ET8), 액적 주입기 (5DM9) 및 폴리 아크릴 아미드 (6IG6)에서 전달 된 리소자임 구조가 높은 구조적 유사성 (r.m.s.deviation = 0.0640-0.1496)을 나타냈다 (도 9). 결과적으로 SMX 실험을 통해 쇼트닝을 이용한 구조 결정이 성공적으로 시연되고 SX 실험에 적용될 수 있음을 나타낸다.

[실시예 4] 다양한 변형례 기재

본 연구에서는 개발한 shortening 기반 배송물질은 다음과 같은 다양한 변형례가 가능하다.

1) 배경 산란을 줄이기 위한 다른 배송물질 (monoolein, grease, agarose등등)과 혼합한다.

하기의 표 1은 본 연구에서 활용한 데이터 수집 및 구조 분석 통계 자료를 보인다.

Data collection	Shortening A		Shortening B
	GI	Lysozyme	GI	Lysozyme
Wavelength (Å)	0.9796
Photons/sec^a	~ 1.2 x 10¹²
Expose time	100 ms
Space group	I222	P4₃2₁2	I222	P4₃2₁2
Cell dimensions (Å)
a b c	94.19 99.92 103.25	79.55 79.55 38.51	94.19 99.92 103.25	79.18 79.18 38.34
No. collected images	64000	48000	48000	48000
No. of hits	25626	18926	30418	29290
No. of indexed images	13651	15643	16522	27413
Resolution (Å)	72.46-1.90 (1.96-1.90)	80.00-1.80 (1.86-1.80)	72.46-2.00 (2.07-2.00)	80.00-1.50 (1.55-1.50)
Unique reflections	38725 (3832)	11974 (1148)	33248 (3247)	20406 (1995)
Completeness	100.0 (100.0)	100.0 (100.0)	100.0 (100.0)	100.0 (100.0)
Redundancy	426.9 (292.6)	1451.9 (1011.7)	701.6 (481.7)	756.6 (285.8)
I/σ(I)	4.09 (2.07)	7.87 (2.21)	4.10 (1.72)	9.27 (1.68)
R _split ^b	19.11 (53.97)	7.57 (46.32)	17.88 (63.03)	6.58 (70.95)
CC	0.9576 (0.6392)	0.9937 (0.8016)	0.9669 (0.5778)	0.9936 (0.5183)
CC*	0.9891 (0.8831)	0.9984 (0.9433)	0.9915 (0.8558)	0.9984 (0.8262)
Wilson B factor (Å²)	30.85	36.24	31.57	39.72
Refinement statistics
Resolution (Å)
R_factor/ R_free (%) ^c	17.95/21.43	17.66/20.53	17.56/20.10	18.49/20.69
B-factor (Averaged)
Protein	34.02	36.88	33.63	40.33
Ligands	33.50	36.45	22.90	44.35
R.m.s. deviations
Bond lengths (Å)	0.006	0.006	0.007	0.006
Bond angles (ㅀ)	0.825	0.787	0.831	0.797
Ramachandran plot(%)
favored	96.86	98.43	97.12	99.21
allowed	3.14	1.57	2.88	0.79

이상 실시예를 통해 본 발명을 설명하였으나, 본 발명은 이에 제한되는 것은 아니다. 상기 실시예는 본 발명의 취지 및 범위를 벗어나지 않고 수정되거나 변경될 수 있으며, 본 기술분야의 통상의 기술자는 이러한 수정과 변경도 본 발명에 속하는 것임을 알 수 있을 것이다.

Claims

제1 시린지 내에 쇼트닝 배송물질을 준비하는 단계;
제2 시린지 내에 결정 시료를 준비하는 단계;
상기 제1,2 시린지를 커플러를 사용하여 연결한 상태에서 결정 시료가 고르게 분포될 때까지 상기 쇼트닝 배송물질과 결정 시료를 혼합하는 단계;
결정 시료와 쇼트닝 배송물질이 혼합된 시료를 상기 제1,2 시린지 중 어느 하나의 시린지로 옮긴 상태에서 다른 하나의 시린지를 제거한 후에 시린지 니들을 연결하는 단계; 및
시린지 펌프를 이용하여 결정 시료를 배송하는 단계;를 포함하고,
쇼트닝 배송물질을 상기 제1 시린지 내에 준비하는 단계는,
쇼트닝을 담은 바이알을 고온의 물이 담긴 비커에서 액체 상태의 쇼트닝을 획득한 후 상기 제1 시린지로 옮기는 단계;를 포함하며,
상기 제2 시린지 내에 결정 시료를 준비하는 단계는,
상기 결정 시료를 함유한 상기 제2 시린지를 수직으로 놓고 일정시간 방치하는 단계; 및
상기 결정 시료가 상기 제2 시린지의 바닥으로 가라앉으면, 플런저를 위쪽으로 밀어 상기 결정 시료를 제외한 결정 용액의 상층액을 제거하는 단계; 를 더 포함하는,
쇼트닝 배송물질 이용한 결정 시료 배송 방법.
제1항에 있어서,
쇼트닝 배송물질을 상기 제1 시린지 내에 준비하는 단계는,
상기 획득된 액체 상태의 쇼트닝을 피펫을 사용하여 상기 제1 시린지로 옮긴 상태에서 반고체 상태가 될 때까지 실온 또는 저온 배양기에서 보관하는 단계; 를 더 포함하는, 쇼트닝 배송물질 이용한 결정 시료 배송 방법.
제1항 또는 제2항에 있어서,
상기 결정 시료 배송 방법은 연속 밀리초 결정학 또는 연속 펨토초 결정학에 적용되는, 쇼트닝 배송물질 이용한 결정 시료 배송 방법.