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KR102386735B1 - 변형된 인터루킨-7 융합 단백질의 제형 - Google Patents

변형된 인터루킨-7 융합 단백질의 제형 Download PDF

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KR102386735B1
KR102386735B1 KR1020150156124A KR20150156124A KR102386735B1 KR 102386735 B1 KR102386735 B1 KR 102386735B1 KR 1020150156124 A KR1020150156124 A KR 1020150156124A KR 20150156124 A KR20150156124 A KR 20150156124A KR 102386735 B1 KR102386735 B1 KR 102386735B1
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Abstract

본 발명은 변형된 인터루킨-7 단백질을 포함하는 약학적 조성물의 제형에 관한 것으로, (a) 변형된 IL-7 융합 단백질; (b) 10 내지 50 mM의 기저 완충액(basal buffer); (c) 2.5 내지 5w/v%의 당; 및 (d) 0.05 내지 6w/v%의 계면 활성제를 포함하는 약학적 제형이 응집체(aggregation)를 형성하지 않고, 산화(oxidation) 또는 교반(agitation)과 같은 스트레스 조건하에서 단백질 보호 효과를 나타냄으로써, 이를 이용한 환자의 치료에 유용하게 사용될 수 있다.

Description

변형된 인터루킨-7 융합 단백질의 제형{Formulation for modified interleukin-7 fusion protein}
본 발명은 변형된 인터루킨-7 융합 단백질을 포함하는 약학적 조성물의 제형에 관한 것이다.
인터루킨-7(IL-7)은 B 세포와 T 세포를 매개로 하는 면역 반응을 촉진하는 면역촉진 사이토카인으로서, 특히 적응 면역체계에서 중요한 역할을 한다. 주로 골수와 흉선의 기질 세포에서 분비되나, 각질세포, 수지상 세포, 간세포, 신경 및 상피세포에서도 생산된다(Heufler C et al., 1993, J. Exp . Med . 178 (3): 1109-14; Kroncke R et al., 1996, Eur. J. Immunol . 26 (10): 2541-4: Sawa Y et al., 2009, Immunity 30 (3): 447-57; Watanabe M et al., 1995, J. Clin . Invest. 95 (6): 2945-53).
IL-7은 T 세포(T cell)와 B 세포(B cell)의 생존 및 분화에 영향을 주고, NK(natural killer) 세포의 활성을 촉진하는 등 면역 기능을 활성화하는 역할을 하며, 특히 T 세포와 B 세포의 발달에 중요한 역할을 한다. 또한, IL-7은 사이토카인의 한 종류인 IL-2 및 인터페론 감마(interferon-γ)의 분비를 촉진함으로써 인체 내의 면역반응을 증진시킨다.
즉, IL-7은 T-세포, B-세포 및 기타 면역 세포의 생존 및 증식을 촉진하는 사이토카인으로, 바이러스 감염, 암 치료, 면역계 손상 치료 등 다양한 질환에 적용 가능한, 뛰어난 면역치료제 후보 물질이다. 최근 다양한 악성종양과 인간 면역결핍 바이러스 감염에 대한 IL-7의 효과를 확인하기 위한 임상시험이 진행되었으며, 이를 통해 IL-7에 의한 인체 면역 증가효과가 보고된바 있다(Fry TJ et al., 2002, Blood 99 (11): 3892-904; Muegge K et al., 1993, Science 261 (5117): 93-5; Rosenberg SA et al., J. Immunother. 29 (3): 313-9). 또한 IL-7은 동종줄기세포(allogenic stem cell) 이식 후 면역회복에도 도움이 되는 것으로 보고 되었으며(Snyder KM, 2006, Leuk . Lymphoma 47(7): 1222-8), 림프구감소증(lymphopenia) 치료에도 활용되고 있다. 따라서, IL-7은 면역세포를 재조직하고 T 세포 기능을 향상시키고, 면역억제를 유도하는 물질과 경쟁하여, 암치료나 만성감염 치료를 위한 활용에 적절하다고 볼 수 있다.
그러나 IL-7과 같은 단백질을 약학적 용도로 사용하기 위해서는, 단백질의 구조 및 주변 환경에 의한 물리화학적 안정성을 고려하여 적절한 제형을 제조하는 것이 필요하다. 또한, 단백질의 물리화학적 안정성은 약학적 제형의 제조, 단백질의 정제, 배송 및 보관과 같은 외부적인 요인에 영향을 받는다. 일반적으로 단백질은 구조적 및 열역학적으로 불안정하기 때문에 그들의 응집체 형성 또는 물리화학적 분해(degradation)에 매우 민감하다. 또한, 융합 파트너로서 면역글로불린의 Fc 영역을 사용하는 경우, Fc 영역의 분자량이 크고 구조가 복잡하기 때문에 전체 융합 단백질의 열역학적 특성, 제타 전위, 스트레스 안정성 등 물리화학적 특성이 크게 달라진다. 특히 변형된 IL-7 융합 단백질의 경우 안정화된 제형에 관하여 알려진 바가 거의 없다. 따라서, 약학적 용도로 사용되기 위한 단백질의 안정성을 증가시키기 위해 단백질의 제형을 최적화하는 것이 필요하다.
이에, 본 발명자들은 다양한 질병의 치료에 사용될 수 있는 변형된 IL-7 융합 단백질의 안정성을 증가시키는 적절한 제형을 확립함으로써 본 발명을 완성하였다.
본 발명의 목적은 안정성이 증가된 변형된 IL-7 융합 단백질을 포함하는 약학적 제형을 제공하는 것이다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 (a) 변형된 IL-7 융합 단백질; (b) 10 내지 50 mM의 기저 완충액(basal buffer); (c) 2.5 내지 6w/v%의 당; 및 (d) 0.05 내지 6w/v%의 계면 활성제를 포함하는 약학적 제형을 제공한다.
본 발명에 따른 변형된 IL-7 융합 단백질의 약학적 제형은 응집체(aggregation)가 형성되지 않고, 산화(oxidation) 또는 교반(agitation)과 같은 스트레스 조건하에서 변형된 IL-7 융합 단백질의 안정성을 유지시켜, 환자의 치료에 유용하게 사용될 수 있다.
도 1은 본 발명에 따른 변형된 IL-7 융합 단백질의 구조를 나타내는 모식도이다.
도 2는 다양한 조건의 기저 완충액(basal buffer)하에서 변형된 IL-7 융합 단백질의 시차주사 열량 측정(differential scanning calorimetry, DSC) 결과를 나타내는 그래프이다.
도 3은 다양한 조건의 기저 완충액하에서 변형된 IL-7 융합 단백질의 동적 광산란(dynamic light scattering; DLS) 분석 결과를 나타내는 그래프이다.
도 4는 히스티딘-아세테이트 완충액에 다양한 부형제를 첨가하였을 때 변형된 IL-7 융합 단백질의 DLS 분석 결과를 나타내는 그래프이다.
도 5는 시트르산나트륨 완충액에 다양한 부형제를 첨가하였을 때 변형된 IL-7 융합 단백질의 DLS 분석 결과를 나타내는 그래프이다.
이하, 본 발명을 상세하게 설명한다.
본 발명은 (a) 변형된 IL-7 융합 단백질; (b) 10 내지 50 mM의 기저 완충액(basal buffer); (c) 2.5 내지 5w/v%의 당; 및 (d) 0.05 내지 6w/v%의 계면 활성제를 포함하는 약학적 제형을 제공한다.
본 발명에 사용된 용어 "인터루킨(interleukin-7, IL-7)"은 조혈 성장인자로서, 다양한 기질 세포, 케라틴 생성 세포, 수지상 세포, 뉴런, 표피 세포 등에서 발현 또는 분비되는 인자이다. IL-7은 수용체와 결합하여 면역 반응을 촉진하고, 면역 시스템에 관여하는 T 세포, B 세포, 단핵구 세포 등 다양한 면역 세포를 활성화시킬 수 있다.
상기 IL-7은 인터루킨-7(IL-7) 또는 이와 유사한 활성을 갖는 폴리펩티드이다.
본 발명에 따른 IL-7은 서열번호 1 내지 서열번호 6으로 표시되는 아미노산 서열로 이루어진 폴리펩티드를 포함한다. 또한, 상기 IL-7 융합 단백질의 아미노산 서열은 서열번호 1 내지 서열번호 6의 서열과 약 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 이상 동일한 것일 수 있다. 상기 IL-7은 IL-7 융합 단백질 또는 이의 단편을 포함하는 융합 단백질일 수 있다. 또한, 상기 IL-7은 인간, 흰쥐, 생쥐, 원숭이, 소 또는 양에서 유래된 것일 수 있다.
구체적으로, 인간 유래 IL-7은 서열번호 1(Genbank Accession No. P13232)로 표시되는 아미노산 서열을 가질 수 있고; 흰쥐 유래 IL-7은 서열번호 2(Genbank Accession No. P56478)로 표시되는 아미노산 서열을 가질 수 있으며; 생쥐 유래 IL-7은 서열번호 3(Genbank Accession No. P10168)으로 표시되는 아미노산 서열을 가질 수 있고; 원숭이 유래 IL-7은 서열번호 4(Genbank Accession No. NP_001279008)로 표시되는 아미노산 서열을 가질 수 있으며; 소 유래 IL-7은 서열번호 5(Genbank Accession No. P26895)로 표시되는 아미노산 서열을 가질 수 있고; 양 유래 IL-7은 서열번호 6(Genbank Accession No. Q28540)으로 표시되는 아미노산 서열을 가질 수 있다.
본 명세서에서 사용된 용어 "변형된 IL-7"은 1 내지 10개의 아미노산으로 구성된 올리고펩티드가 IL-7의 말단에 존재하여 야생형 IL-7과 다른 서열을 가지는 분자를 의미한다.
본 발명에 따른 변형된 IL-7은 하기 구조를 갖는 것이 바람직하다:
A - IL-7;
본 발명에서 상기 A는 IL-7의 N-말단에 연결될 수 있다. 상기 A를 암호화하는 핵산은 DNA 컨스트럭트상에서 IL-7의 유전자와 함께 연속으로 존재하여 단백질로 발현될 수 있다. 또한, 상기 A는 IL-7과 독립적으로 발현 또는 합성된 후, 화학적 결합을 통하여 IL-7과 연결될 수 있다.
상기 A는 1개 내지 10개, 구체적으로는 2 내지 8개, 더욱 구체적으로는 1 내지 5개의 아미노산을 포함하는 것을 특징으로 하며, 이때 포함되는 아미노산은 메티오닌(M), 글리신(G) 및 이들의 조합으로 이루어진 군에서 선택될 수 있다. A의 예로는 M, G, MM, MG, GM, GG, MMM, GMM, MGM, MMG, GGM, GMG, MGG, GGG, MMMM(서열번호 9), GMMM(서열번호 10), MGMM(서열번호 11), MMGM(서열번호 12), MMMG(서열번호 13), GGMM(서열번호 14), MGGM(서열번호 15), MMGG(서열번호 16), GMGM(서열번호 17), MGMG(서열번호 18), GMMG(서열번호 19), GGGM(서열번호 20), MGGG(서열번호 21), GMGG(서열번호 22), GGMG(서열번호 23), GGGG(서열번호 24), MMMMM(서열번호 25), GMMMM(서열번호 26), GGMMM(서열번호 27), GGGMM(서열번호 28), GGGGM(서열번호 29), MGMMM(서열번호 30), MGGMM(서열번호 31), MGGGM(서열번호 32), MGGGG(서열번호 33), MMGMM(서열번호 34), MMGGM(서열번호 35), MMGGG(서열번호 36), MMMGM(서열번호 37), MMMGG(서열번호 38), MMMMG(서열번호 39), MGGGM(서열번호 40), MGMGM(서열번호 41), GMGMG(서열번호 42), GMMMG(서열번호 43), GGMGM(서열번호 44), GGMMG(서열번호 45), MGGMG(서열번호 46), MGMGG(서열번호 47), GMMGM(서열번호 48), MGMMG(서열번호 49), GMGGM(서열번호 50), MMGMG(서열번호 51), GMMGG(서열번호 52), GMGGG(서열번호 53), GGMGG(서열번호 54), GGGMG(서열번호 55), GGGGG(서열번호 56) 등이 있다. 본 발명의 일 실시예에 따르면 A는 M, MM, GM, MGM 또는 MMM일 수 있다.
본 발명에 따른 변형된 IL-7 융합 단백질은 C-말단에 변형된 면역글로불린의 Fc 영역을 더 포함할 수 있다.
본 명세서에서 사용된 용어 "변형된 IL-7 융합 단백질"은 변형된 IL-7의 C-말단에 변형된 면역글로불린 Fc 영역이 결합되어 있는 분자를 의미한다.
이때, 변형된 면역글로불린 Fc 영역은 Fc 수용체와 결합력 또는 보체와 결합력이 변형되어 항체의존성세포독성(ADCC) 또는 보체의존성세포독성(CDC)이 약화된 것일 수 있다. 상기 변형은 유전자 변이를 통하여 Fc 결합 수용체의 서열을 치환 또는 결손시키는 등의 방법으로 달성할 수 있으며, 공지된 기술에 따라 변형된 IgG4를 융합하여 발현시킬 수 있다. 또한, 상기 변형은 서로 다른 타입의 면역글로불린의 서열을 섞어서, 즉 하이브리드 Fc를 만듦으로서도 달성할 수 있다.
본 명세서에서 사용된 용어 "Fc 영역", "Fc 단편" 또는 "Fc"란 면역글로불린의 N-말단에서 C-말단 방향으로 힌지 영역, 중쇄 불변 영역 2(CH2) 도메인 및 중쇄 불변 영역 3(CH3) 도메인을 포함할 수 있다. 상기 영역은 힌지 영역을 추가로 포함할 수 있으며, 이러한 경우 힌지 영역은 링커의 역할을 할 수 있고 분자의 물성 개선을 위해 적절히 변이되어 사용될 수 있다.
본 명세서에서 사용된 용어 "hFc" 또는 "hyFc"로 지칭되는 Fc 영역 또는 그 단편은 하이브리드 Fc의 일종으로써, 서로 다른 종류의 Fc 영역을 조합하여 제조된 것을 의미한다. 상기 hyFc는 인간 IgD 힌지 영역, 인간 IgD CH2 도메인의 아미노산 잔기, 인간 IgG4의 CH2 도메인의 아미노산 잔기 및 인간 IgG4의 CH3 도메인의 아미노산 잔기의 부분을 포함하는 것일 수 있다.
상기 Fc 영역 변이체는 힌지 부위에서 절단되는 것을 예방하기 위해 변형될 수 있다. 구체적으로, 서열번호 7의 144번째 아미노산 및/또는 145번째 아미노산이 변형될 수 있다. 바람직하게는 서열번호 7의 144번째 아미노산인 K를 G 또는 S로 치환하고, 145번째 아미노산인 E를 G 또는 S로 치환한 변이체일 수 있다.
또한, 두 개의 융합 단백질이 하나의 이량체를 형성할 수 있는데, 예를 들어, 제3도메인이 Fc 영역인 경우, Fc 영역끼리 결합하여 이량체를 형성할 수 있다.
본 발명의 일 실시예에 따르면, 상기 변형된 면역글로불린 Fc 영역은 서열번호 7로 표시되는 아미노산 서열로 이루어진 폴리펩티드일 수 있다. 본 발명에 따른, 변형된 면역글로불린의 Fc 영역은 미국 특허 제7,867,491호에 기재된 것일 수 있으며, 상기 변형된 면역글로불린의 Fc 영역의 생산은 미국 특허 제7,867,491호에 기재된 바를 참조하여 수행될 수 있다.
본 발명의 일 실시예에 따르면, 상기 변형된 IL-7은 서열번호 8의 아미노산 서열을 가질 수 있다. 또한, 상기 변형된 IL-7은 서열번호 8의 아미노산 서열에 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99%의 상동성을 갖는 서열을 가질 수 있다.
본 발명에서 사용된 용어 "기저 완충액(basal buffer)"은, 상기 완충액의 산-염기 콘쥬게이트(conjugate) 성분의 작용에 의해 pH 변화를 견디는 완충된 용액을 나타낸다.
본 발명에 따른 기저 완충액은 히스티딘-아세테이트(histidine-acetate) 또는 시트르산나트륨(sodium citrate) 용액일 수 있다. 상기 기저 완충액은 10 내지 50 mM, 15 내지 40 mM, 20 내지 30 mM의 농도로 사용될 수 있다. 본 발명의 일 실시예에 따르면 20 mM의 농도일 수 있다.
상기 히스티딘-아세테이트 용액은 히스티딘 이온을 포함하는 완충제이다. 상기 히스티딘-아세테이트 용액은 L-히스티딘을 액체의 아세트산으로 적정함으로써 제조한다. 한편, 상기 시트르산나트륨 용액은 시트르산나트륨 용액을 함수 구연산으로 최종 농도 및 pH를 적정하여 제조한다.
본 발명에 따른 당은 융합 단백질을 안정화시킨다. 또한, 상기 당은 물에 쉽게 용해되고 단맛을 가지고 있어 약학적 제제에 부형제로 많이 사용된다.
본 발명에 따른 제형에서 상기 당은 2.5 내지 5w/v%, 3.5 내지 5w/v%, 4.5 내지 5w/v%의 농도로 포함될 수 있다. 본 발명의 일실시예에 따르면 상기 당은 5w/v%일 수 있다.
본 발명에 따른 제형에서 당은 수크로스(sucrose), 트레할로즈, 덱스트로즈 또는 이의 혼합물일 수 있다. 본 발명의 일실시예에서, 상기 당은 수크로스일 수 있다. 수크로스는 포도당과 과당이 1,2 결합한 이당류로 알칼리성에서는 비교적 안정하지만 산에 의해 가수분해되기 쉽다.
본 발명에 따른 약학적 제형에서 당은 산화에 의한 스트레스로부터 융합 단백질을 보호하는 효과가 있고, 당을 대체 또는 보조하는 물질로 당알콜을 사용할 수 있다. 상기 사용될 수 있는 당알콜의 예는 솔비톨, 크실리톨, 말티톨, 만니톨 또는 이의 혼합물일 수 있다. 본 발명의 일실시예에서, 상기 당알콜은 솔비톨일 수 있다.
본 명세서에서 용어 "계면 활성제"는 표면 활성제로, 구체적으로 비이온성 계면 활성제를 나타낸다. 본 발명에 따른 약학적 제형에서 계면 활성제는 융합 단백질의 응집체 형성을 억제함으로써, 이의 안정성을 증가시키는 역할을 한다.
본 발명에 따른 제형에서 계면 활성제는 0.05 내지 6w/v%, 0.1 내지 5.5w/v%, 0.1 내지 5.0w/v%의 농도로 첨가될 수 있다.
상기 계면 활성제는 폴리소르베이트, 폴리옥시에틸렌 알킬에테르, 폴리옥시에틸렌 스테아레이트, 알킬 설페이트, 폴리비닐피리돈, 플록사머 또는 이의 혼합물일 수 있다. 구체적으로, 상기 계면 활성제는 폴리소르베이트 또는 플록사머일 수 있다.
본 발명에 따른 폴리소르베이트는 소르비탄 지방산에스테르에 에틸렌옥시드를 결합시킨 폴리옥시에틸렌 고급 지방족 알코올로, 폴리옥시에틸렌기의 수 및 지방산의 차이에 따라, 폴리소르베이트 20(모노라우르산), 40(모노팔미트산), 60(모노스테아르산), 65(트리스테아르산) 또는 80(모노올레산)이 있다. 또한, 폴록사머는 폴리옥시프로필렌-폴리옥시에틸렌 블록 공중합체로, 폴리머의 길이에 따라 다양한 종류의 폴록사머가 있다.
본 발명의 일실시예에서, 계면 활성제는 폴리소르베이트 20, 폴리소르베이트 80 또는 폴록사머(poloxamer) 188일 수 있다.
본 발명에 따른 약학적 제형은 아르기닌, 글루타메이트, 글리신, 히스티딘 또는 이의 혼합물 등의 아미노산을 추가로 포함할 수 있다. 아미노산은 단백질의 안정화를 위해서 포함되는 부형제로, 단백질의 종류에 따라 다른 아미노산이 포함될 수 있다. 상기 아미노산은 아르기닌, 글루타메이트, 글리신 또는 히스티딘일 수 있고, 본 발명의 일 실시예에 따르면 글루타메이트일 수 있다. 상기 아미노산의 농도는 40 내지 60 mM로 첨가될 수 있고, 본 발명의 일실시예에 따르면 50 mM일 수 있다.
본 발명의 약학적 제형을 주사제로 사용하는 경우 삼투압을 조절하기 위해 당알콜을 추가로 포함할 수 있다. 당알콜은 당류가 갖는 카르보닐기(carbonyl group)를 환원시켜 수산기(-OH)로 변형시킨 장쇄 알코올을 나타낸다. 상기 당알콜의 농도는 1 내지 2w/v%가 되도록 추가할 수 있고, 본 발명의 일실시예에 따르면 1.5w/v%일 수 있다.
사용될 수 있는 당알콜의 예는 솔비톨, 크실리톨, 말티톨, 만니톨 또는 이의 혼합물일 수 있으며, 본 발명의 일실시예에 따르면 솔비톨일 수 있다. 솔비톨은 포도당을 고압첨가, 환원시켜 얻어지는 6개의 수산기를 가진 당알콜로 D-솔비톨 또는 D-글루시톨(glucitol)이라고도 불린다.
본 발명의 약학적 제형은 pH가 5.0 내지 6.0일 수 있고, 구체적으로 5.0일 수 있다. 기저 완충액의 pH가 5.0 미만인 경우에는 융합 단백질의 구조적 안정성이 떨어지고, pH가 6.0을 초과하는 경우에는 특정 조성 성분의 조합의 경우 융합 단백질의 응집체가 발생할 수 있다.
상기 제형은 액상 제형일 수 있다.
본 발명자들은 N-말단에 올리고펩티드가 결합되고 C-말단에 면역글로불린의 Fc 영역이 결합되어 있는, 변형된 IL-7 융합 단백질을 제조하고, 상기 융합 단백질의 약학적 제형을 확립하기 위한 기저 완충액 및 부형제를 선별하였다.
먼저, 다양한 pH의 조건에서 기저 완충액에 따른 변형된 IL-7 융합 단백질의 안정성을 확인하였다. 시트르산나트륨을 기저 완충액으로 사용하는 경우, pH가 높을수록 융합 단백질의 안정성이 증가하였으나(표 2 및 도 2), pH의 증가로 인해 제타 전위가 감소하고 융합 단백질의 응집이 발생하였다. 히스티딘-아세테이트를 기저 완충액으로 사용하는 경우에도 유사한 결과를 나타내었기에, 우선 pH 5.0의 조건을 선별하여 시험하였다(표 3 및 도 3).
또한, 교반(agitation) 및 산화(oxidation)와 같은 스트레스 환경에 대한 융합 단백질의 보호 효과를 확인하기 위하여 부형제로 당 또는 당알콜, 계면 활성제 및 아미노산을 첨가하였다. 그 결과, 수크로스 및 솔비톨은 산화에 의한 스트레스로부터 융합 단백질을 보호하는 효과가 있고, 트윈 20, 트윈 80 및 폴록사머 188과 같은 계면 활성제는 종류에 상관없이 교반에 의한 스트레스로부터만 융합 단백질을 보호하였다. 추가적으로 아미노산을 사용하는 경우, 아르기닌, 글루타메이트, 글리신 및 히스티딘을 첨가하였을 때 본 발명에 따른 융합 단백질 보호 효과를 확인하였는데, 전체적으로 글루타메이트가 우수한 융합 단백질 보호 효과를 나타내었다(표 4 및 표 5).
또한, 상기의 방법으로 융합 단백질의 보호 효과를 나타내는 트윈 80 및 수크로스를 선정하여 부형제의 조합에 따른 융합 단백질 보호 효과를 확인하였다. 그 결과, 히스티딘-아세테이트 기저 완충액에 트윈 80 및 수크로스를 혼합하였을 때 교반 또는 산화 스트레스로부터 융합 단백질을 보호하였고, 히스티딘-아세테이트 기저 완충액에 수크로스, 솔비톨 및 트윈 80을 첨가한 경우 다양한 스트레스 조건에 대하여 평균 변화가 1% 내외로 상기의 제형이 우수함을 확인하였다(표 7, 표 8 및 표 10).
이하, 본 발명을 실시예에 의해 상세하게 설명한다. 단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명이 이들에 의해 한정되는 것은 아니다.
실시예 1. 변형된 인터루킨-7( interleukin -7) 융합 단백질의 제조
IL-7 융합 단백질의 N-말단 및 C-말단 각각에 올리고펩티드 및 면역글로불린 Fc 영역이 결합된 IL-7 융합 단백질을 제조하였다. 이때, IL-7은 인간 IL-7(서열번호 1)의 서열을 사용하였고, 올리고펩티드는 메티오닌(methione, M) 및 글리신(glycine, G)의 조합서열을 사용하였다. 이때, Fc 영역은 인간 IgD의 Fc와 인간 IgG4의 Fc 영역의 하이브리드 형으로써, 기존의 변형된 면역글로불린의 Fc 영역과 비교하여 생리 활성 융합 단백질과 결합 시 우수한 체내 반감기 증가를 나타낼 수 있다.
먼저, M-IL-7-hyFc, G-IL-7-hyFc, MM-IL-7-hyFc, MG-IL-7-hyFc, GM-IL-7-hyFc, GG-IL-7-hyFc, MMM-IL-7-hyFc, GMM-IL-7-hyFc, MGM-IL-7-hyFc, MMG-IL-7-hyFc, GGM-IL-7-hyFc, GMG-IL-7-hyFc, MGG-IL-7-hyFc, GGG-IL-7-hyFc, MMMM-IL-7-hyFc, GMMM-IL-7-hyFc, MGMM-IL-7-hyFc, MMGM-IL-7-hyFc, MMMG-IL-7-hyFc, GGMM-IL-7-hyFc, MGGM-IL-7-hyFc, MMGG-IL-7-hyFc, GMGM-IL-7-hyFc, MGMG-IL-7-hyFc, GMMG-IL-7-hyFc, GGGM-IL-7-hyFc, MGGG-IL-7-hyFc, GMGG-IL-7-hyFc, GGMG-IL-7-hyFc, GGGG-IL-7-hyFc, MMMMM-IL-7-hyFc, GMMMM-IL-7-hyFc, GGMMM-IL-7-hyFc, GGGMM-IL-7-hyFc, GGGGM-IL-7-hyFc, MGMMM-IL-7-hyFc, MGGMM-IL-7-hyFc, MGGGM-IL-7-hyFc, MGGGG-IL-7-hyFc, MMGMM-IL-7-hyFc, MMGGM-IL-7-hyFc, MMGGG-IL-7-hyFc, MMMGM-IL-7-hyFc, MMMGG-IL-7-hyFc, MMMMG-IL-7-hyFc, MGMGM-IL-7-hyFc, GMGMG-IL-7-hyFc, GMMMG-IL-7-hyFc, GGMGM-IL-7-hyFc, GGMMG-IL-7-hyFc, MGGMG-IL-7-hyFc, MGMGG-IL-7-hyFc, GMMGM-IL-7-hyFc, MGMMG-IL-7-hyFc, GMGGM-IL-7-hyFc, MMGMG-IL-7-hyFc, GMMGG-IL-7-hyFc, GMGGG-IL-7-hyFc, GGMGG-IL-7-hyFc, GGGMG-IL-7-hyFc 또는 GGGGG-IL-7-hyFc의 아미노산 서열을 암호화하는 유전자 서열을 pAD15 발현 벡터에 삽입하였다. 발현 벡터 pAD15에 융합 유전자를 삽입하기 위하여, 먼저 융합 단백질 유전자 서열의 5' 말단에 EcoRI 부위를 생성하고, hyFc의 유전자 서열의 3' 말단에 XbaI 부위를 생성하였다. 발현 벡터 pAD15는 RcCMV 골격(backbone)으로부터 수득하였다(Invitrogen, Carlsbad로부터 가능). pAD15은, CMV(cytomegalovirus)로부터 유래된 프로모터, 우태 성장 호르몬으로부터 유래된 폴리 (A) 서열(poly (A) sequence), 토끼 베타 글로빈에서 유래된 gIVS(globin intervening sequence)(Mol Cell Biol . 1988, 8:4395) 및 기타 요소를 포함한다. pAD15 벡터의 제조를 위하여 RcCMV 벡터(Invitrogen)를 여러 군데 변형하였다. 우선, 네오마이신 저항성(neomycin resistant) 부위는 XhoI 효소로 제거하고, gIVS를 CMV 프로모터 부위의 3' 말단에 추가하였다. 또한, 마우스 DHFR(dihydrofolate reductase) 유전자(Pubmed, NM 010049)는 CMV 프로모터의 5' 말단에 추가하였다. 프레임 내에서 IL-7의 3' 말단과 hyFc의 5' 말단 사이에 연결 부위를 제조하기 위하여, IL-7 코딩 서열의 3' 말단과 hyFc 코딩 서열의 5' 말단에 NheI 부위를 생성하였다. 각 제한효소 부위를 이용하여 서브클로닝 후, 최종 발현 벡터가 제조되었다. 변형된 Fc 도메인 제조와 관련하여 보다 자세한 내용은 미국 특허 7,867,491을 참조할 수 있다(하이브리드(Fc) 단백질이라고 기재됨). 본 실시예의 hyFc 단백질은 IgD CH1 도메인 C-말단의 9개 아미노산(90-98), IgD 힌지 영역의 30개 아미노산(133-162), IgD CH2 도메인 N-말단의 8개 아미노산(SHTQPLGV 163-170), IgG4 CH2 도메인의 100개의 아미노산(121-220), 및 IgG4 CH3 도메인의 107개의 아미노산(221-327)을 포함한다.
본 발명은 변형된 Fc 도메인으로 구성되는 hyFc 단백질과 관련하여, 대한민국 등록특허공보 제10-0897938호의 실시예에 기재되어 있는 hFc-2, hFc-3, hFc-4, hFc-5 및 hFc-6의 제조방법을 모두 참조한다. 본 발명의 실시예에서 사용한 hyFc 단백질은 대한민국 등록특허공보 제10-0897938호의 실시예에 기재되어 있는 hFc-5와 동일한 하이브리드 단백질이다.
PCR은 하기 표 1의 조건으로, 변성(denature), 어닐링(annealing) 및 신장(extension) 과정을 각각 98℃에서 15초, 55℃에서 30초 및 72℃에서 60초에서 수행되었다.
변형된 IL-7 융합 단백질의 유전자를 포함하는 pAD15 주형 2 ㎕
Forward primer(5'-accgaattcatgttccacgtgagcttcag-3') 1.5 ㎕
Reverse primer(5'-ggttctagattagtgctccttggtgcccatc-3') 1.5 ㎕
5×HF 완충액 20 ㎕
2.5 mM dNTP 8 ㎕
DMSO 3 ㎕
Phusion(Thermo Scientific) 1 ㎕
3차 증류수 64 ㎕
상기 제조된 M-IL-7-hyFc, G-IL-7-hyFc, MM-IL-7-hyFc, MG-IL-7-hyFc, GM-IL-7-hyFc, GG-IL-7-hyFc, MMM-IL-7-hyFc, GMM-IL-7-hyFc, MGM-IL-7-hyFc, MMG-IL-7-hyFc, GGM-IL-7-hyFc, GMG-IL-7-hyFc, MGG-IL-7-hyFc, GGG-IL-7-hyFc, MMMM-IL-7-hyFc, GMMM-IL-7-hyFc, MGMM-IL-7-hyFc, MMGM-IL-7-hyFc, MMMG-IL-7-hyFc, GGMM-IL-7-hyFc, MGGM-IL-7-hyFc, MMGG-IL-7-hyFc, GMGM-IL-7-hyFc, MGMG-IL-7-hyFc, GMMG-IL-7-hyFc, GGGM-IL-7-hyFc, MGGG-IL-7-hyFc, GMGG-IL-7-hyFc, GGMG-IL-7-hyFc, GGGG-IL-7-hyFc, MMMMM-IL-7-hyFc, GMMMM-IL-7-hyFc, GGMMM-IL-7-hyFc, GGGMM-IL-7-hyFc, GGGGM-IL-7-hyFc, MGMMM-IL-7-hyFc, MGGMM-IL-7-hyFc, MGGGM-IL-7-hyFc, MGGGG-IL-7-hyFc, MMGMM-IL-7-hyFc, MMGGM-IL-7-hyFc, MMGGG-IL-7-hyFc, MMMGM-IL-7-hyFc, MMMGG-IL-7-hyFc, MMMMG-IL-7-hyFc, MGMGM-IL-7-hyFc, GMGMG-IL-7-hyFc, GMMMG-IL-7-hyFc, GGMGM-IL-7-hyFc, GGMMG-IL-7-hyFc, MGGMG-IL-7-hyFc, MGMGG-IL-7-hyFc, GMMGM-IL-7-hyFc, MGMMG-IL-7-hyFc, GMGGM-IL-7-hyFc, MMGMG-IL-7-hyFc, GMMGG-IL-7-hyFc, GMGGG-IL-7-hyFc, GGMGG-IL-7-hyFc, GGGMG-IL-7-hyFc 또는 GGGGG-IL-7-hyFc 유전자 발현 벡터를 CHO DG44(from Dr. Chasin, Columbia University, USA) 세포에 전기천공방법으로 형질주입하고, 48시간 후, HT가 없는 10% dFBS+MEMα 배지를 사용하여 HT 선별을 수행하였다. 그 후, 생산성을 증폭시키기 위하여 HT 선별된 클론을 이용하여 MTX 증폭을 수행하고, 확보된 단일 세포에 대한 장기안정성을 시험한 뒤, 변형된 IL-7 융합 단백질의 제조에 사용하였다.
실시예 2. 변형된 IL-7 융합 단백질의 정제
상기 실시예 1의 방법으로 제조된 변형된 IL-7 융합 단백질을 포함하는 배양액을 수득한 후, 하기 표 2의 조건에 따라 크기-배재(size-exclusion, SE) HPLC를 수행하여 생산성을 측정하였다. TSK-GEL G3000WxL 컬럼을 사용하여 40분간 수행하였다.
먼저, 변형된 IL-7 융합 단백질 시료 검액 각각을 버퍼로 1 ㎎/㎖ 농도가 되도록 희석하고, 이를 1 ㎖ 주사기(syringe) 및 0.2 ㎛ 필터로 여과한 뒤, 인서트(insert)에 넣고 바이알(vial)에 삽입하여 캡을 닫아 두었다. 그 후, 상기 검액을 각각 20 ㎕씩 SE-HPLC 시스템에 주입하였으며, 피크(peak) 값을 통해 순도 및 상대 생산성을 측정하였다.
그 결과, 도 1에 나타난 구조를 갖고, 높은 생산성 및 순도를 갖는 변형된 IL-7 융합 단백질을 정제하였다(변형된 IL-7 융합 단백질의 제조 및 정제의 구체적인 방법은 대한민국 출원번호 제10-2015-0082793호에 따라 수행하였다).
실험예 1. 기저 완충액(basal buffer)의 선별
1.1. 열역학적 특성에 따른 선별
상기 실시예 2에서 정제된 변형된 IL-7 융합 단백질의 제형을 확립하기 위하여, 세 가지 종류의 완충액에서 상기 융합 단백질의 열역학적 특성을 시차주사 열량 측정(differential scanning calorimetry, DSC) 방법으로 확인하였다.
먼저, 상기 실시예 2에서 정제된 변형된 IL-7 융합 단백질을 pH가 5.0, 5.5 또는 6.0인 20 mM의 히스티딘-아세테이트(histidine-acetate) 완충액 및 시트르산나트륨(sodium citrate) 완충액, 또는 pH 8.0의 트리스(tris) 완충액에 투석(dialysis)하였고, 투석은 4℃에서 수행하였다.
반면, DSC는 샘플(sample) 및 대조군 용액을 위해 0.5147 ㎤ 크기의 두 칸(twin cells)을 갖는 Microcal VP-DSC(Northampton, USA)를 사용하여 수행하였다. 온도를 15℃ 내지 110℃로 변화시켜 1.25℃/분의 속도로 스캔하였고, 값을 측정하기 전에 모든 용액을 교반하면서 진공상태로 가스를 제거하였다. 그 후, 먼저 융합 단백질을 포함하지 않는 용액에 대해 기준 값을 구하고, 변형된 IL-7 융합 단백질의 온도 기록은 측정된 값에서 기준 값을 빼서 나타내었다.
결과 그래프는 기기와 함께 제공되는 Origin 7.0 소프트웨어 패키지가 연결된 Microcal LLC DSC(Northampton, USA)를 이용하여 나타내었다. 또한, 상기 결과로부터 Origin 7.0 소프트웨어를 이용하여 융합 단백질의 전이온도(Tm) 및 엔탈피(ΔH) 값을 얻었다.
그 결과 도 2에 나타난 바와 같이, MGM-IL-7-hyFc 융합 단백질의 경우, 세 종류의 완충액에 대한 전형적인 DSC 열분석도(thermogram)에서 IL-7 및 hyFc 각각의 전이온도(transition temperature)인 Tm 1 및 Tm 2와 열에 의해 융합 단백질 구조가 풀린 두 개의 피크를 확인할 수 있었다. 이는 열에너지 흡수에 의해 IL-7 및 hyFc가 각각 풀린 상태로 존재하고, 구조적으로 안정함을 나타낸다. 또한, Tm 2와 비교하여 Tm 1이 더 높은 값을 나타내고 있어, 이로부터 IL-7이 hyFc보다 안정적임을 알 수 있다.
일반적으로, hyFc는 IgD[힌지(hinge)-CH2] 및 IgG4(CH2-CH3)가 혼성화된 약효-지속형 융합단백질(long-acting protein)의 제조를 위한 디자인의 기반(platform)으로 다양한 환경요소에 의해 IgG4로부터 하나 또는 두 개의 전이를 가지나, 본 실험 결과에서는 하나의 전이 피크를 갖는 것으로 확인되었다.
또한, 하기 표 2에 나타난 바와 같이 히스티딘-아세테이트 완충액의 pH가 5.0에서 6.0으로 증가함에 따라, Tm 1 및 Tm 2의 값 또한 58.89℃에서 62.92℃ 및 66.93℃에서 69.91℃로 각각 증가하였다. 게다가 ΔH도 Tm과 함께 증가하였다. 이로부터, pH가 증가함에 따라 높은 온도 및 열에너지가 IL-7 및 hyFc 단백질의 구조를 펴는데 필요함을 확인하였다. 즉, IL-7 및 hyFc 단백질의 구조적 안정성(conformational stability)은 pH가 증가함에 따라 함께 증가할 가능성이 있다.
시트르산나트륨의 pH를 5.0, 5.5 또는 6.0으로 맞춰 기저 완충액으로 사용하였을 때에도 pH가 증가함에 따라 Tm 1 및 Tm 2의 값이 증가함으로써, 히스티딘-아세테이트 완충액을 사용하였을 때와 동일한 결과를 나타냄을 확인하였다. 다만, pH가 5.0에서 6.0으로 증가하면서, Tm 1 및 Tm 2의 값이 57.23℃에서 65.12℃ 및 66.74℃에서 71.34℃로 증가하여, 히스티딘-아세테이트 완충액을 사용한 경우와 비교하여 더욱 우수한 효과를 나타내었다.
시트르산나트륨을 기저 완충액으로 사용하였을 때 ΔH 값을 살펴보면, pH가 5.0일 때, Tm 1 및 Tm 2의 ΔH 값이 가장 낮게 나타나, 이로부터 융합 단백질의 구조를 안정적으로 유지하기 위한 기저 완충액의 pH는 5.5 또는 6.0이 적절함을 알 수 있었다.
pH 8.0의 트리스 완충액을 사용한 경우, 다른 완충액과 비교하여 높은 Tm 1, Tm 2 및 Tm 1의 ΔH 값을 나타내었고, 이는 상기 서술한 바와 같이 pH가 증가함에 따라 변형된 IL-7 융합 단백질의 구조적 안정성이 증가한 것과 일치하였다. 그러나 트리스 완충액을 기저 완충액으로 사용한 경우, 두 개의 피크가 완전히 분리되지 않은 것을 볼 수 있었다. 높은 pH의 트리스 완충액의 경우, pH가 6.0인 다른 완충액과 비교하여 Tm 2 값이 증가하였으나, Tm 2의 ΔH 값이 작아졌으므로 hyFc보다 IL-7의 구조적 안정성에 미치는 영향이 클 가능성이 있다.
완충액/pH
(MGM-IL-7-hyFc 농도, ㎎/㎖)		 전이온도(℃) 엔탈피(kJ/㏖)
Tm 1 Tm 2 ΔH1 ΔH2
히스티딘-아세테이트 pH 5.0(8.6) 58.89 66.93 263.47 102.91
pH 5.5(8.8) 61.11 68.72 290.68 104.17
pH 6.0(8.6) 62.92 69.91 332.06 115.41
시트르산나트륨 pH 5.0(9.3) 57.23 66.74 242.15 110.48
pH 5.5(9.6) 62.17 70.28 305.27 124.77
pH 6.0(9.8) 65.12 71.34 292.10 126.19
트리스 pH 8.0(7.8) 71.53 66.06 384.27 104.58
1.2. 동적 광산란 (dynamic light scattering; DLS) 분석을 통한 선별
단백질 사이의 정전기적 상호작용, 및 Z-평균 크기, 다분산 지수(polydispersity index, PDI) 및 제타 전위(zeta potential)의 응집 형성에서 pH 및 완충액의 영향을 평가하기 위해 DLS 분석을 수행하였다. 단백질의 입자 크기 및 제타 전위 측정은 Zetasizer Nano ZS90(Malvern Instruments, UK)을 사용하여 수행되었다.
Z-평균 크기는 단편, 단량체 및 응집체와 같은 요소들의 평균을 말하고, 이는 작은 응집 부분의 존재와 같은 작은 변화에도 매우 민감하다. 측정된 PDI 값이 0.005 보다 작은 경우 드물게 단분산 표준으로 보이고, 값이 0.7보다 높으면, 샘플의 크기 분포가 광범위함을 나타낸다. 제타 전위는 유체표면을 둘러싼 단백질의 전기적 반발로, 제타 전위의 절댓값이 높으면 용액에서 단백질의 응집 및 불안정성에 강하다.
먼저, 동적 광산란 분석을 위해 변형된 IL-7 융합 단백질 샘플을 측정 온도인 10℃에서 평형화하였다. 1 ㎖의 샘플을 이용하여 일회용 사이징 큐벳(sizing cuvette)에서 입자 크기를 5회, 및 일회용 모세관 칸(capillary cell)에서 제타 전위를 90℃로 각을 고정하여 3번 측정하였다. 피크의 강도, 평균 입자 크기, PDI 및 제타 전위의 값은 기기와 함께 제공되는 Zetasizer 소프트웨어 버전 7.11(Malvern Instruments, UK)을 이용하여 산출하였다.
기저 완충액으로 pH 5.0인 히스티딘-아세테이트 또는 시트르산나트륨, 및 pH 8.0인 트리스를 사용하였을 때 단백질 피크의 강도를 통해 분포된 단백질의 크기를 도 3에 나타내었고, 상기 3가지 완충액의 다른 pH 조건에서 Z-평균 크기, PDI 및 제타 전위를 표 3에 나타내었다.
도 3에 나타난 바와 같이, 기저 완충액으로 pH 5.0인 히스티딘-아세테이트 또는 시트르산나트륨을 사용하였을 때, 결과 그래프는 연이은 5번의 측정에서 하나의 좁은 피크를 나타내었다. 반면, pH 8.0인 트리스 완충액을 사용한 경우에는 100 내지 1,000 ㎚에 응집된 것으로 보이는 새로운 피크가 확인되었다.
표 3에 나타난 바와 같이 히스티딘-아세테이트를 기저 완충액으로 사용하였을 때, pH가 5.0에서 6.0으로 증가함에 따라 새롭게 응집이 생기면서 Z-평균 크기는 10.43 ㎚에서 10.64 ㎚로, PDI 값은 0.02에서 0.07로 증가하였다. 또한, pH가 증가함에 따라 제타 전위 절대값은 4.42에서 1.28로 감소하였다.
상기와 같은 pH에 따른 응집 현상은 시트르산나트륨을 기저 완충액으로 사용하였을 때에서 동일하게 나타났다. 즉, 시트르산나트륨 기저 완충액에서도 Z-평균 크기 및 PDI 증가, 및 제타 전위의 감소가 관찰되었다.
그러나, 트리스 기저 완충액에서 Z-평균 크기 및 PDI는 다른 완충액과 비교하여 각각 12.38 ㎚ 및 0.34로 높게 증가하였고, 상기 완충액에서 융합단백질 응집 현상이 발생하였다. 또한, 응집체가 발생하였음에도 불구하고, 트리스 완충액에서의 제타 전위 절대값은 20.27로 다른 완충액보다 높은 값을 나타내었다.
따라서, 본 발명의 변형된 IL-7 융합 단백질의 응집 현상을 감소시키기 위해서는 기저 완충액은 히스티딘-아세테이트 또는 시트르산나트륨을, 특히 낮은 제타 전위를 갖는 pH 조건이 적합할 수 있다. 높은 pH 조건에서는 단백질의 응집 저해제를 함께 사용할 수 있다.
완충액/pH
(MGM-IL-7-hyFc 농도, ㎎/㎖)		 Z-평균 크기
(d.㎚*)		 다분산
지수(PDI)		 제타 전위
절대값(㎷)
히스티딘-아세테이트 pH 5.0(8.6) 10.43±0.06 0.02±0.01 4.42±0.32
pH 5.5(8.8) 10.58±0.09 0.03±0.02 1.11±0.43
pH 6.0(8.6) 10.64±0.24 0.07±0.05 1.28±0.47
시트르산나트륨 pH 5.0(9.3) 10.73±0.09 0.02±0.01 5.18±0.74
pH 5.5(9.6) 10.82±0.10 0.03±0.02 3.38±0.57
pH 6.0(9.8) 11.03±0.17 0.08±0.03 2.46±0.42
트리스 pH 8.0(7.8) 12.38±0.84 0.34±0.05 20.27±0.42
* d.nm: diameter in nanometers
실험예 2. 부형제의 선별
2.1. 스트레스 조건에 대한 보호효과에 의한 선별
교반 및 산화와 같은 스트레스 환경에 대해 부형제의 보호 효과를 확인하기 위하여, 5w/v% 농도의 계면 활성제, 5w/v% 농도의 당 및 50 mM 농도의 아미노산을 포함하는 다양한 부형제를 혼합하여 크기-배재 크로마토그래피를 수행하였다. 이때, 대조군으로는 기저 완충액에 변형된 IL-7 융합 단백질만을 첨가하여 사용하였다. 기저 완충액은 pH 5.0인 히스티딘-아세테이트 또는 시트르산나트륨을 사용하였다.
구체적으로, 변형된 IL-7 융합 단백질을 pH 5.0인 히스티딘-아세테이트 또는 시트르산나트륨 기저 완충액에 다양한 종류의 부형제를 첨가한 용액으로 4℃에서 투석하였다. 그리고 스트레스 환경을 위해 0.5 ㎖의 투석된 변형된 IL-7 융합 단백질을 마이크로튜브(microtube)에 넣고, 상기 마이크로튜브를 박스에 담아 강도 7로 설정된 Vortex-Genie 2(Scientific Industries, Inc., USA)를 사용하여 상온에서 2시간 동안 교반하였다.
반면, 산화에 의한 스트레스 환경을 위해서는 0.5 ㎖의 투석된 MGM-IL-7-hyFc 융합 단백질에 과산화수소를 최종 농도가 1.0%(v/v)가 되도록 첨가한 뒤, 상온에서 20 시간 동안 보관하였다. 크기-배제 크로마토그래피는 214 ㎚ 흡수 스펙트럼의 UV 파장에서 고성능 액체 크로마토그래피(high performance liquid chromatography; HPLC) 시스템(Waters e2695, USA)을 사용하여 수행되었다.
<HPLC 수행조건>
컬럼: TSKgel G3000SWXL SEC 컬럼(300 ㎜×7.8 ㎜)(TOSOH Bioscience, USA)
이동상: 100 mM NaCl 및 10% 아세토니트릴이 포함된 50 mM 인산나트륨(pH 6.8) 용액
유속: 0.5 ㎖/분
HPLC 수행 결과, 수용성 응집, 단량체 및 단편을 포함하는 요소들이 관찰되었고, 각각의 요소들의 비율은 하기 수학식 1에 의해 계산되었다.
Figure 112015108471663-pat00001
상기 수학식에서, Ct는 각 요소(수용성 응집, 단량체 및 단편)의 면적이고, Cs는 샘플을 수득하였을 때, 상기 요소의 피크의 합이다.
그 결과 표 4 및 5에 나타난 바와 같이, 시트르산나트륨 완충액에서 대조군 샘플의 단량체 함량이 96.34%이었으나, 이는 교반에 의해서 78.18%로, 산화에 의해 48.16%로 감소하였다.
히스티딘-아세테이트 또는 시트르산나트륨 완충액에 트윈(Tween) 또는 폴록사머(poloxamer)와 같이 잘 알려진 비이온 계면 활성제를 첨가하였을 때 MGM-IL-7-hyFc 융합 단백질이 교반에 의한 스트레스로부터 보호되었다. 이와 같은 비이온 계면 활성제는 소수성 인터페이스(interface)에서 단백질 풀림으로부터 단백질을 보호하는 능력이 우수하다. 트윈 20, 트윈 80 및 폴록사머 188이 완충액에 첨가된 경우, 단량체 함량의 유의적인 감소는 관찰되지 않았다. 그러나 이들 계면 활성제의 보호 효과는 거의 유사하였고, 이로부터 교반에 의해 지속적으로 변하는 소수성 환경에서 계면 활성제가 본 발명에 따른 융합 단백질을 보호함을 확인하였다.
반면, 계면 활성제는 산화에 대해서는 MGM-IL-7-hyFc 융합 단백질의 보호 효과를 전혀 나타내지 않았고, 심지어 대조군보다 단량체 함량을 더 감소시켰다. 게다가, 트윈 20 및 트윈 80은 단백질을 산화시키는 것이 잘 알려져 있다. 트윈 20 및 트윈 80과 같이 폴록사머 188도 산화 조건에서 본 발명에 따른 융합 단백질을 불안정하게 하였다.
수크로스 및 솔비톨과 같은 당 또는 당알콜은 MGM-IL-7-hyFc 융합 단백질을 안정화시키기 위하여 약학적 부형제로 자주 사용된다. 그러나, 상기 수크로스 및 솔비톨은 대조군과 비교하여 더 낮은 단량체 함량을 나타냄으로써, 교반에 의한 스트레스에 대하여 본 발명에 따른 융합 단백질을 보호하는 효과가 없었다.
시트르산나트륨 완충액에서 교반 후, 단량체 함량은 스트레스에 노출되지 않은 참조 값을 기준으로, 대조군에서 18.16%만큼 감소하였으나, 수크로스 및 솔비톨을 각각 첨가한 경우에는 39.29% 및 53.51%만큼 감소하였다. 한편, 히스티딘-아세테이트 완충액에서 교반 후, 단량체 함량은 스트레스에 노출되지 않은 참조 값을 기준으로, 대조군에서 2.23%만큼 감소하였고, 수크로스 및 솔비톨을 각각 첨가한 경우에는 11.53% 및 13.77%만큼 감소하였다.
당 및 당알콜을 제형에 첨가하면 교반 동안 IgG의 응집체 형성을 촉진하는 것이 알려져 있는데, 수크로즈 및 솔비톨을 제형에 첨가하는 경우, 기저 완충액에 따른 차이 없이, 교반 동안 응집체를 증가시켜 MGM-IL-7-hyFc 융합 단백질의 안정성을 떨어뜨렸다.
반면, 수크로스 및 솔비톨은 산화에 대해서는 융합단백질의 안정성을 증가시켰다. 시트르산나트륨 완충액에서 대조군의 단량체 함량은 스트레스에 노출되지 않은 참조 값을 기준으로, 48.18%만큼 감소하였다. 그러나 수크로스 및 솔비톨을 첨가한 경우에는 각각 2.55% 및 2.79%만큼 감소하였다. 유사하게 히스티딘-아세테이트 완충액에서 대조군의 단량체 함량은 스트레스에 노출되지 않은 참조 값을 기준으로, 35.36%만큼 감소하였다. 그러나 수크로스 및 솔비톨을 첨가한 경우에는 각각 1.68% 및 1.47%만큼 감소하였다. 이는 수크로스 및 솔비톨이 산화작용으로부터 단백질 보호효과가 있음을 의미한다. 상기 두 물질은 단백질 표면으로부터 우선적 배제(preferential exclusion)에 의해 단백질을 안정화시킬 수 있음이 보고되어 있다.
다음으로, 스트레스에 대한 MGM-IL-7-hyFc 융합 단백질 안정성에서 아미노산의 영향을 살펴보면, 시트르산나트륨 완충액에, 50 mM의 아르기닌, 글루타메이트, 글리신 및 히스티딘의 아미노산을 각각 첨가하였을 때, 교반에 대해서는 보호 효과가 매우 낮음을 확인하였다. 대조군에서 단량체 함량은 스트레스에 노출되지 않은 참조 값에 비해 18.16%만큼 감소했지만, 아르기닌, 글루타메이트, 글리신 및 히스티딘을 처리하였을 때에는 각각 49.71%, 64.75%, 30.96% 및 46.75%만큼 감소하였다. 한편, 히스티딘-아세테이트 완충액을 사용하였을 때도 아르기닌 및 글루타메이트는 본 발명에 따른 융합 단백질을 불안정화시키는 것으로 확인되었다.
반면, 히스티딘-아세테이트 완충액에 글리신을 첨가하였을 경우에는, MGM-IL-7-hyFc 융합 단백질의 단량체 함량이 스트레스에 노출되지 않은 참조 값과 비교하여 감소하지 않았다. 상기 결과는 시트르산나트륨의 결과와는 상반된 결과였고, 이로부터 완충액 및 부형제를 포함하는 환경적인 요소에 의존적으로 MGM-IL-7-hyFc 융합 단백질의 안정성이 변화할 수 있음을 알 수 있다.
또한, 시트르산나트륨 완충액에 아르기닌 및 글리신을 첨가하였을 때는 산화 스트레스에 대해 보호효과가 있는 것으로 나타났으나, 히스티딘-아세테이트 완충액에 이들을 첨가하였을 때는 동일한 효과를 확인할 수 없었다. 그러나 산화 스트레스에 대해서, 시트르산나트륨 완충액에 아르기닌 및 글리신을 첨가하였을 때, 단량체의 함량은 스트레스에 노출되지 않은 참조 값을 기준으로, 대조군(48.18% 감소)보다 낮은 30.66% 및 3.21%만큼의 감소를 각각 나타내었다. 한편, 히스티딘-아세테이트 완충액에서는 단량체의 함량이 스트레스에 노출되지 않은 참조 값을 기준으로, 대조군(35.36% 감소)에 비해 아르기닌 및 글리신을 첨가하여 각각 39.34% 및 37.90%만큼의 유의적인 감소를 보였다. 특히, 두 종류의 완충액 모두에서 글리신의 첨가는 본 발명에 따른 융합 단백질을 교반 및 산화에 대한 스트레스로부터 보호하였고, 글루타메이트의 첨가는 상기 융합 단백질을 산화 스트레스로부터 우수한 효과로 보호함을 확인하였다.
시트르산나트륨 pH 5.0[MGM-IL-7-hyFc 농도: 9.5 ㎎/㎖(최종 농도 3.0 ㎎/㎖)]
부형제 응집체(%) 단량체(%) 단편(%)
참조* 교반 산화 참조* 교반 산화 참조* 교반 산화
대조군 0.81 20.58 47.98 96.34 78.18 48.16 2.85 1.24 3.86
당 & 당알콜 수크로스 0.69 41.78 0.65 95.65 56.36 93.10 3.66 1.86 6.25
솔비톨 0.57 55.79 0.98 96.08 42.57 93.29 3.34 1.64 5.74
계면
활성제		 트윈 20 0.57 0.84 48.13 95.74 95.77 48.02 3.69 3.39 3.85
트윈 80 0.69 0.64 48.02 95.76 95.80 47.34 3.55 3.56 4.63
폴록사머
188		 0.69 0.74 50.17 95.71 95.68 46.45 3.60 3.58 3.38
아미
노산		 아르기닌 0.75 52.65 31.39 95.62 45.91 64.96 3.36 1.44 3.65
글루타
메이트		 0.55 67.66 0.81 95.60 30.85 93.73 3.85 1.48 5.46
글리신 0.69 34.09 2.44 95.76 64.80 92.55 3.55 1.11 5.01
히스티딘 0.77 50.34 22.37 95.70 48.95 73.53 3.53 0.72 4.10
*참조: 스트레스에 노출되지 않음
히스티딘-아세테이트 pH 5.0[MGM-IL-7-hyFc 농도: 9.5 ㎎/㎖(최종 농도 3.0 ㎎/㎖)]
부형제 응집체(%) 단량체(%) 단편(%)
참조* 교반 산화 참조* 교반 산화 참조* 교반 산화
대조군 0.45 4.52 35.03 95.39 93.16 60.03 4.16 2.33 4.94
당 & 당알콜 수크로스 0.42 13.71 0.52 95.62 84.09 93.94 3.96 2.20 5.54
솔비톨 0.46 15.80 0.37 95.74 81.97 94.27 3.80 2.23 5.36
계면
활성제		 트윈 20 0.43 0.55 39.36 95.32 95.73 56.59 4.25 3.72 4.06
트윈 80 0.36 0.60 40.93 96.00 95.30 55.29 3.64 4.10 3.79
폴록사머
188		 0.50 0.64 41.89 95.77 95.87 54.37 3.73 3.49 3.75
아미
노산		 아르기닌 0.51 29.11 39.35 96.04 69.26 56.70 3.45 1.63 3.95
글루타
메이트		 0.42 56.11 0.77 96.22 39.40 93.87 3.36 1.50 5.36
글리신 0.53 2.93 38.42 95.55 94.83 57.65 3.92 2.24 3.93
*참조: 스트레스에 노출되지 않음
2.2. DLS 분석을 통한 선별
계면 활성제, 당 및 아미노산을 포함하는 다양한 부형제가 변형된 IL-7 융합 단백질의 안정성에 어떠한 영향을 주는지 확인하기 위하여 상기 실험예 1.2에 기재된 방법으로 DLS 분석을 수행하였고, 이때 입자 크기 측정 및 제타 전위(90℃)는 각각 3번씩 수행하였다.
pH 5.0 시트르산나트륨 완충액에서 교반 및 산화 스트레스를 가한 MGM-IL-7-hyFc 융합 단백질의 크기 분포를 도 4 및 표 6에 나타내었다.
시트르산나트륨 pH 5.0
부형제 참조* 교반 산화
Z-평균 크기(d.nm) 다분산
지수(PDI)		 Z-평균 크기(d.nm) 다분산
지수(PDI)		 Z-평균 크기(d.nm) 다분산
지수(PDI)
대조군 11.29 0.07 19.40 0.19 177.10 0.85
당 &
당알콜		 수크로스 11.80 0.17 - - 13.07 0.28
솔비톨 11.89 0.14 - - 14.11 0.32
계면
활성제		 트윈 20 10.61 0.07 10.77 0.11 - -
트윈 80 10.69 0.03 10.78 0.07 - -
폴록사머 188 11.01 0.05 11.32 0.11 - -
아미노산 글루타
메이트		 11.09 0.06 - - 11.26 0.06
글리신 11.65 0.13 - - 50.71 0.58
*참조: 스트레스에 노출되지 않음
도 4a에 나타난 바와 같이, 대조군은 3회에 걸친 입자 크기 측정에서 하나의 좁은 피크만을 형성하였다. 그러나 교반한 대조군은 100 ㎚의 크기에서 또 다른 피크가 관찰되었다. 또한, 상기 교반한 대조군에서 Z-평균 크기는 11.29 ㎚에서 19.40 ㎚로 증가하였고, PDI 또한, 0.07에서 0.19로 증가하여, 응집체가 발생하였음을 나타내었다. 한편, 트윈 20, 트윈 80 및 플록사머 188을 첨가하였을 때에도 Z-평균 크기는 각각 0.16, 0.09 및 0.31 ㎚만큼, PDI는 0.04, 0.04 및 0.06만큼 증가하였다. Z-평균 크기 및 PDI의 증가는 교반에 의해 응집이 유도됨을 의미한다. 계면 활성제의 첨가로 인해 이들의 증가된 값이 감소함으로써, 계면 활성제가 응집으로부터 단백질 보호활성이 있음을 알 수 있다. 도 4b에 나타난 바와 같이, 계면 활성제를 첨가하였을 때는 응집체 피크가 확인되지 않았다.
산화 스트레스를 가한 산화 대조군은 1,000 ㎚의 크기에서 추가적인 피크가 확인되었고, Z-평균 크기 및 PDI도 각각 11.29 ㎚에서 177.10 ㎚로, 0.07에서 0.85 ㎚로 증가하였다. 이는 산화에 의해서 응집체가 형성되고, 이때 형성되는 응집체는 교반에 의해 형성되는 응집체보다 크기가 크다는 것을 의미한다. 도 4c에 나타난 바와 같이, 수크로스, 솔비톨 및 글리신을 각각 첨가한 경우에도 응집체 피크가 관찰되었으나, 글루타메이트를 첨가한 경우에는 응집체가 형성되지 않았다. 글루타메이트 첨가 샘플의 경우 Z-평균 크기가 0.17 ㎚만큼 증가하였고, PDI는 변하지 않았다. 이로부터 pH 5.0 시트르산나트륨 완충액에 글루타메이트를 첨가하면 산화 스트레스에 대한 MGM-IL-7-hyFc 융합 단백질 보호 효과가 우수함을 알 수 있다. 한편, 수크로스, 솔비톨 및 글리신을 각각 첨가한 경우의 Z-평균 크기는 각각 1.27 ㎚, 2.22 ㎚ 및 39.06 ㎚만큼 증가하였고, PDI는 각각 0.11, 0.18 및 0.45만큼 증가하였으나, 이는 다른 부형제를 첨가한 경우와 비교하면 낮은 수치이다. 이로부터, 상기 실험예 2.1.의 결과와 일관되게 수크로스, 솔비톨 및 글리신이 산화 스트레스로부터 본 발명에 따른 융합 단백질을 보호함을 알 수 있다.
한편, pH 5.0 히스티딘-아세테이트 완충액에서 교반 및 산화 스트레스를 가한 MGM-IL-7-hyFc 융합 단백질의 크기 분포는 도 5 및 표 7에 나타내었다.
히스티딘-아세테이트 pH 5.0
부형제 참조* 교반 산화
Z-평균 크기(d.nm) 다분산
지수(PDI)		 Z-평균 크기(d.nm) 다분산
지수(PDI)		 Z-평균 크기(d.nm) 다분산
지수(PDI)
대조군 10.50 0.02 11.70 0.10 17.43 0.37
당 &
당알콜		 수크로스 11.21 0.17 - - 12.47 0.22
솔비톨 12.02 0.13 - - 11.61 0.09
계면
활성제		 트윈 20 10.66 0.10 10.79 0.12 - -
트윈 80 10.40 0.03 10.50 0.03 - -
폴록사머 188 10.83 0.04 10.74 0.07 - -
아미노산 글루타
메이트		 10.90 0.04 - - 11.31 0.06
글리신 10.68 0.03 15.66 0.41 - -
*참조: 스트레스에 노출되지 않음
도 5a에 나타난 바와 같이, 대조군 및 교반 대조군은 하나의 좁은 피크를 나타냈고, 이는 시트르산나트륨 완충액의 교반 대조군과는 다른 결과를 보여준다. 그러나 도 5b에 나타난 바와 같이, 글리신을 첨가하였을 때, 응집체 피크의 형성이 관찰되었고, 트윈 20, 트윈 80 및 플록사머 188과 같은 계면 활성제를 첨가하였을 때는 응집체 피크도 관찰되지 않았고, Z-평균 크기 및 PDI도 변하지 않았다. 이는 MGM-IL-7-hyFc 융합 단백질의 제형에 글리신을 첨가하면 교반에 의해 응집체가 발생할 수 있음을 의미한다.
도 5c에 나타난 바와 같이, 수크로스를 첨가한 경우에는 산화에 의해 Z-평균 크기는 11.21 ㎚에서 12.47 ㎚로, PDI는 0.17에서 0.22로 각각 증가하였다. 두 값의 변화는 대조군보다 낮았으며, 이는 수크로스가 산화에 대해 단백질 보호효과가 있음을 나타내었으나, 응집체가 형성되었다는 문제점이 발견되었다. 반면에, 솔비톨을 첨가한 경우 Z-평균 크기 및 PDI가 산화에 의해 각각 12.02 ㎚에서 11.61로, 0.13에서 0.09로 감소하였고, 이 경우에는 응집체 피크도 발견되지 않았다. 그러나, Z-평균 크기 및 PDI의 감소는 유의적이지 않아도 단편이 증가했을 가능성이 있음을 의미한다. 글루타메이트를 첨가한 경우에 Z-평균 크기 및 PDI는 약간 증가하였고, 응집체 및 단편도 발견되지 않았다.
따라서, 상기로부터 트윈 20, 트윈 80 및 플록사머 188과 같은 계면 활성제는 산화 또는 교반 스트레스에 대해 본 발명에 따른 융합 단백질 보호 효과가 있고, 수크로스 및 솔비톨과 같은 당 또는 당알콜은 산화 스트레스에 대해 보호 효과를 나타내며, 아미노산의 경우 기저 완충액에 따라 상이한 효과를 나타내었으나, 전체적으로는 글루타메이트가 높은 보호 효과를 갖는 것을 확인하였다.
실험예 3. 부형제의 조합
상기 실험예 2의 결과에 의해 각각 교반 및 산화 스트레스에 대해 변형된 IL-7 융합 단백질의 보호 효과를 나타내는 트윈 80과 수크로스를 선정하였다. 이들 두 가지 부형제에 대한 조합실험에 Design of Experiment 소프트웨어(Design-Expert®, Stat-Ease Inc., USA)를 이용하였다. 상기 두 가지 부형제는 하기 표 8에 기재된 바와 같이 조합하여 변형된 IL-7 융합 단백질의 안정성에 대한 영향을 확인하였다. 스트레스 조건은 상기 실험예 2.1.과 동일하게 수행하였고, 제형 내 변형된 IL-7 융합 단백질의 최종 농도는 3 내지 100 ㎎/㎖가 되도록 하였다.
부형제(첨가농도 w/v%)
트윈 80 수크로스
1 0.00 0
2 0.05 0
3 0.10 0
4 0.00 2.5
5 0.05 2.5
6 0.10 2.5
7 0.00 5
8 0.05 5
9 0.10 5
10 0.05 2.5
스트레스 조건에 대한 보호효과를 확인하기 위하여, 크기-배제 크로마토그래피를 수행하였으며[214 nm 흡수 스펙트럼의 UV 파장에서 고성능 액체크로마토그래피(high performance liquid chromatography, HPLC) 시스템(Waters e2695, USA)을 사용], HPLC 수행 조건은 상기 실험예 2.1.과 동일하다.
우선, 3 ㎎/㎖의 농도로 변형된 IL-7 융합 단백질을 포함하는 제형에 대하여 시험하였다. 그 결과 하기 표 9에 나타난 바와 같이, 시트르산나트륨 완충액의 대조군은 단량체 함량이 95.65%이었으나, 이는 교반에 의해서 74.77%로, 산화에 의해서 49.81%로 감소하였다. 트윈 80을 첨가한 경우 교반에 의한 스트레스 보호 효과를, 수크로스를 첨가한 경우 산화에 의한 스트레스 보호 효과를 확인할 수 있었으며, 두 가지 부형제를 조합하여 첨가한 경우 교반 및 산화에 의한 스트레스 보호 효과를 확인할 수 있었다.
기저
완충액		 샘플 부형제 최종농도(w/v%) SE-HPLC(%)
참조* 교반 산화
시트르산나트륨 1 트윈 80 수크로스 0.00 0 95.65 74.77 49.81
2 트윈 80 수크로스 0.05 0 95.06 95.39 48.88
3 트윈 80 수크로스 0.10 0 95.39 95.28 50.51
4 트윈 80 수크로스 0.00 2.5 94.42 71.26 92.24
5 트윈 80 수크로스 0.05 2.5 95.08 95.19 91.93
6 트윈 80 수크로스 0.10 2.5 95.06 95.85 91.68
7 트윈 80 수크로스 0.00 5 95.29 71.70 92.67
8 트윈 80 수크로스 0.05 5 95.51 95.02 91.96
9 트윈 80 수크로스 0.10 5 95.42 95.27 92.49
10 트윈 80 수크로스 0.05 2.5 94.96 95.30 91.71
*참조: 스트레스에 노출되지 않음
한편, 히스티딘-아세테이트 완충액의 경우, 하기 표 10에 나타난 바와 같이 대조군의 단량체 함량은 95.46%이었으나, 이는 교반에 의해서 93.60%로, 산화에 의해 50.63%로 감소하였다. 시트르산나트륨 완충액과 비교하여, 히스티딘-아세테이트 완충액이 더 우수하게 교반에 의한 스트레스 보호 효과를 보이고 있었으며, 첨가한 부형제에 따른 보호 효과는 시트르산나트륨과 유사하였다.
기저
완충액		 샘플 부형제 최종농도(w/v%) SE-HPLC(%)
참조* 교반 산화
히스티딘-
아세
테이트		 1 트윈 80 수크로스 0.00 0 95.46 93.60 50.63
2 트윈 80 수크로스 0.05 0 95.77 94.62 50.68
3 트윈 80 수크로스 0.10 0 95.35 95.30 50.59
4 트윈 80 수크로스 0.00 2.5 95.49 94.93 93.23
5 트윈 80 수크로스 0.05 2.5 95.52 94.36 92.32
6 트윈 80 수크로스 0.10 2.5 95.75 94.82 91.43
7 트윈 80 수크로스 0.00 5 95.34 94.86 93.66
8 트윈 80 수크로스 0.05 5 95.29 94.90 93.36
9 트윈 80 수크로스 0.10 5 95.38 94.42 93.58
10 트윈 80 수크로스 0.05 2.5 94.90 94.90 92.12
상기 결과를 이용하여 부형제의 조건을 선정하였다. 주사제의 적정한 삼투압 세기를 맞추기 위하여 솔비톨 및 만니톨을 추가로 첨가하여 교반 및 산화 스트레스 실험을 진행하였으며, 그 중 1.5w/v% 솔비톨 첨가 조건에 대한 추가 실험을 진행하였다.
시트르산나트륨 완충액과 히스티딘-아세테이트 완충액 각각에 대한 후보 제형으로 5w/v% 수크로스, 1.5w/v% 솔비톨, 0.05w/v% 트윈 80을 첨가하여 MGM-IL-7-hyFc 융합 단백질의 제형을 선정하였다. 상기 제형을 이용하여 동결/융해(freeze/thaw), 온도 및 산화에 의한 스트레스 실험을 하였다. 스트레스 조건은 하기 표 11에 기재된 바와 같으며, 분석 결과는 하기 표 12에 나타내었다.
스트레스 조건
상태 스트레스 방법
대조군 -80℃
동결/융해 -80℃→상온(5회)
온도 37℃(39h, 3day), 50℃(20h)
산화 0.1% 또는 1% H2O2, 상온 20h
기저 완충액 pH 삽투압 SE-HPLC(%)
스트
레스
노출 전		 스트
레스
노출 전		 스트
레스
노출 전		 동결/융해 37℃, 39h 50℃, 20h 0.1% H2O2 1% H2O2
20 mM 시트르산나트륨, 5w/v% 수크로스, 1.5w/v% 솔비톨, 0.05w/v% 트윈 80, pH 5.0 5.02 303 95.76 95.77 94.83 93.81 95.71 92.86
20 mM 히스티딘-아세테이트, 5w/v% 수크로스, 1.5w/v% 솔비톨, 0.05w/v% 트윈 80, pH 5.0 4.98 300 95.59 95.64 95.41 95.47 95.95 93.83
후보 제형에 대한 스트레스 실험 결과, 표 12에 나타난 바와 같이 시트르산나트륨을 기저 완충액으로 사용한 경우, 대조군의 단량체 함량은 95.76%이었고, 스트레스에 의한 변화는 3% 내외로 확인되었다. 반면, 히스티딘-아세테이트 후보 제형에서 대조군의 단량체 함량은 95.59%였으며, 스트레스에 의한 변화는 1% 내외로 확인되어 시트르산나트륨 완충액과 비교하여 조금 더 나은 보호 효과를 나타내었다.
다양한 농도의 변형된 IL-7 융합 단백질에 대한 상기 후보제형의 효과를 시험하였다. 우선 3 내지 100 ㎎/㎖ 농도의 변형된 IL-7 융합 단백질, 20 mM 시트르산나트륨, 5w/v% 수크로스를 포함하는 제형을 제조하였다. 여기에 추가로 당알코올로서 1 내지 2w/v%의 솔비톨 또는 만니톨과, 계면활성제로서 0.05w/v% 트윈 80 또는 폴록사머를 첨가한 후, 최종 pH를 5.0으로 조절하였다. 그 결과, 하기 표에 나타난 바와 같이 다양한 조합 조건에서 3 내지 100 ㎎/㎖ 농도의 변형된 IL-7 융합 단백질이 잘 보존되는 것을 알 수 있었다.
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Sequence <220> <223> amino acid sequence of mouse IL-7 (Accession number : P10168) <400> 3 Met Phe His Val Ser Phe Arg Tyr Ile Phe Gly Ile Pro Pro Leu Ile 1 5 10 15 Leu Val Leu Leu Pro Val Thr Ser Ser Glu Cys His Ile Lys Asp Lys 20 25 30 Glu Gly Lys Ala Tyr Glu Ser Val Leu Met Ile Ser Ile Asp Glu Leu 35 40 45 Asp Lys Met Thr Gly Thr Asp Ser Asn Cys Pro Asn Asn Glu Pro Asn 50 55 60 Phe Phe Arg Lys His Val Cys Asp Asp Thr Lys Glu Ala Ala Phe Leu 65 70 75 80 Asn Arg Ala Ala Arg Lys Leu Lys Gln Phe Leu Lys Met Asn Ile Ser 85 90 95 Glu Glu Phe Asn Val His Leu Leu Thr Val Ser Gln Gly Thr Gln Thr 100 105 110 Leu Val Asn Cys Thr Ser Lys Glu Glu Lys Asn Val Lys Glu Gln Lys 115 120 125 Lys Asn Asp Ala Cys Phe Leu Lys Arg Leu Leu Arg Glu Ile Lys Thr 130 135 140 Cys Trp Asn Lys Ile Leu Lys Gly Ser Ile 145 150 <210> 4 <211> 177 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> amino acid sequence of monkey IL-7 (Accession number : NP_001279008) <400> 4 Met Phe His Val Ser Phe Arg Tyr Ile Phe Gly Leu 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Leu Leu Pro Val Ala Ser Ser Asp Cys Asp Ile Ser Gly Lys 20 25 30 Asp Gly Gly Ala Tyr Gln Asn Val Leu Met Val Asn Ile Asp Asp Leu 35 40 45 Asp Asn Met Ile Asn Phe Asp Ser Asn Cys Leu Asn Asn Glu Pro Asn 50 55 60 Phe Phe Lys Lys His Ser Cys Asp Asp Asn Lys Glu Ala Ser Phe Leu 65 70 75 80 Asn Arg Ala Ser Arg Lys Leu Arg Gln Phe Leu Lys Met Asn Ile Ser 85 90 95 Asp Asp Phe Lys Leu His Leu Ser Thr Val Ser Gln Gly Thr Leu Thr 100 105 110 Leu Leu Asn Cys Thr Ser Lys Gly Lys Gly Arg Lys Pro Pro Ser Leu 115 120 125 Ser Glu Ala Gln Pro Thr Lys Asn Leu Glu Glu Asn Lys Ser Ser Lys 130 135 140 Glu Gln Lys Lys Gln Asn Asp Leu Cys Phe Leu Lys Ile Leu Leu Gln 145 150 155 160 Lys Ile Lys Thr Cys Trp Asn Lys Ile Leu Arg Gly Ile Lys Glu His 165 170 175 <210> 6 <211> 176 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> amino acid sequence of sheep IL-7 (Accession number : Q28540) <400> 6 Met Phe His Val Ser Phe Arg Tyr Ile Phe Gly Ile Pro Pro Leu Ile 1 5 10 15 Leu Val Leu Leu Pro Val Ala Ser Ser Asp Cys Asp Phe Ser Gly Lys 20 25 30 Asp Gly Gly Ala Tyr Gln Asn Val Leu Met Val Ser Ile Asp Asp Leu 35 40 45 Asp Asn Met Ile Asn Phe Asp Ser Asn Cys Leu Asn Asn Glu Pro Asn 50 55 60 Phe Phe Lys Lys His Ser Cys Asp Asp Asn Lys Glu Ala Ser Phe Leu 65 70 75 80 Asn Arg Ala Ala Arg Lys Leu Lys Gln Phe Leu Lys Met Asn Ile Ser 85 90 95 Asp Asp Phe Lys Leu His Leu Ser Thr Val Ser Gln Gly Thr Leu Thr 100 105 110 Leu Leu Asn Cys Thr Ser Lys Gly Lys Gly Arg Lys Pro Pro Ser Leu 115 120 125 Gly Glu Ala Gln Pro Thr Lys Asn Leu Glu Glu Asn Lys Ser Leu Lys 130 135 140 Glu Gln Arg Lys Gln Asn Asp Leu Cys Phe Leu Lys Ile Leu Leu Gln 145 150 155 160 Lys Ile Lys Thr Cys Trp Asn Lys Ile Leu Arg Gly Ile Thr Glu His 165 170 175 <210> 7 <211> 245 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> amino acid sequence of hyFc <400> 7 Arg Asn Thr Gly Arg Gly Gly Glu Glu Lys Lys Lys Glu Lys Glu Lys 1 5 10 15 Glu Glu Gln Glu Glu Arg Glu Thr Lys Thr Pro Glu Cys Pro Ser His 20 25 30 Thr Gln Pro Leu Gly Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr 35 40 45 Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val 50 55 60 Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val 65 70 75 80 Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser 85 90 95 Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu 100 105 110 Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ser 115 120 125 Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro 130 135 140 Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln 145 150 155 160 Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala 165 170 175 Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr 180 185 190 Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Arg Leu 195 200 205 Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser 210 215 220 Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser 225 230 235 240 Leu Ser Leu Gly Lys 245 <210> 8 <211> 400 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> amino acid sequence of modified IL-7(MGM) fused hyFc <400> 8 Met Gly Met Asp Cys Asp Ile Glu Gly Lys Asp Gly Lys Gln Tyr Glu 1 5 10 15 Ser Val Leu Met Val Ser Ile Asp Gln Leu Leu Asp Ser Met Lys Glu 20 25 30 Ile Gly Ser Asn Cys Leu Asn Asn Glu Phe Asn Phe Phe Lys Arg His 35 40 45 Ile Cys Asp Ala Asn Lys Glu Gly Met Phe Leu Phe Arg Ala Ala Arg 50 55 60 Lys Leu Arg Gln Phe Leu Lys Met Asn Ser Thr Gly Asp Phe Asp Leu 65 70 75 80 His Leu Leu Lys Val Ser Glu Gly Thr Thr Ile Leu Leu Asn Cys Thr 85 90 95 Gly Gln Val Lys Gly Arg Lys Pro Ala Ala Leu Gly Glu Ala Gln Pro 100 105 110 Thr Lys Ser Leu Glu Glu Asn Lys Ser Leu Lys Glu Gln Lys Lys Leu 115 120 125 Asn Asp Leu Cys Phe Leu Lys Arg Leu Leu Gln Glu Ile Lys Thr Cys 130 135 140 Trp Asn Lys Ile Leu Met Gly Thr Lys Glu His Arg Asn Thr Gly Arg 145 150 155 160 Gly Gly Glu Glu Lys Lys Lys Glu Lys Glu Lys Glu Glu Gln Glu Glu 165 170 175 Arg Glu Thr Lys Thr Pro Glu Cys Pro Ser His Thr Gln Pro Leu Gly 180 185 190 Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg 195 200 205 Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro 210 215 220 Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala 225 230 235 240 Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val 245 250 255 Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr 260 265 270 Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr 275 280 285 Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu 290 295 300 Pro Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys 305 310 315 320 Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser 325 330 335 Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp 340 345 350 Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser 355 360 365 Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala 370 375 380 Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Leu Gly Lys 385 390 395 400 <210> 9 <211> 4 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> oligopeptides conjugated with IL-7 <400> 9 Met Met Met Met 1 <210> 10 <211> 4 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> oligopeptides conjugated with IL-7 <400> 10 Gly Met Met Met 1 <210> 11 <211> 4 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> oligopeptides conjugated with IL-7 <400> 11 Met Gly Met Met 1 <210> 12 <211> 4 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> oligopeptides conjugated with IL-7 <400> 12 Met Met Gly Met 1 <210> 13 <211> 4 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> oligopeptides conjugated with IL-7 <400> 13 Met Met Met Gly 1 <210> 14 <211> 4 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> oligopeptides conjugated with IL-7 <400> 14 Gly Gly Met Met 1 <210> 15 <211> 4 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> oligopeptides conjugated with IL-7 <400> 15 Met Gly Gly Met 1 <210> 16 <211> 4 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> oligopeptides conjugated with IL-7 <400> 16 Met Met Gly Gly 1 <210> 17 <211> 4 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> oligopeptides conjugated with IL-7 <400> 17 Gly Met Gly Met 1 <210> 18 <211> 4 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> oligopeptides conjugated with IL-7 <400> 18 Met Gly Met Gly 1 <210> 19 <211> 4 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> oligopeptides conjugated with IL-7 <400> 19 Gly Met Met Gly 1 <210> 20 <211> 4 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> oligopeptides conjugated with IL-7 <400> 20 Gly Gly Gly Met 1 <210> 21 <211> 4 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> oligopeptides conjugated with IL-7 <400> 21 Met Gly Gly Gly 1 <210> 22 <211> 4 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> oligopeptides conjugated with IL-7 <400> 22 Gly Met Gly Gly 1 <210> 23 <211> 4 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> oligopeptides conjugated with IL-7 <400> 23 Gly Gly Met Gly 1 <210> 24 <211> 4 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> oligopeptides conjugated with IL-7 <400> 24 Gly Gly Gly Gly 1 <210> 25 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> oligopeptides conjugated with IL-7 <400> 25 Met Met Met Met Met 1 5 <210> 26 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> oligopeptides conjugated with IL-7 <400> 26 Gly Met Met Met Met 1 5 <210> 27 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> oligopeptides conjugated with IL-7 <400> 27 Gly Gly Met Met Met 1 5 <210> 28 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> oligopeptides conjugated with IL-7 <400> 28 Gly Gly Gly Met Met 1 5 <210> 29 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> oligopeptides conjugated with IL-7 <400> 29 Gly Gly Gly Gly Met 1 5 <210> 30 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> oligopeptides conjugated with IL-7 <400> 30 Met Gly Met Met Met 1 5 <210> 31 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> oligopeptides conjugated with IL-7 <400> 31 Met Gly Gly Met Met 1 5 <210> 32 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> oligopeptides conjugated with IL-7 <400> 32 Met Gly Gly Gly Met 1 5 <210> 33 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> oligopeptides conjugated with IL-7 <400> 33 Met Gly Gly Gly Gly 1 5 <210> 34 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> oligopeptides conjugated with IL-7 <400> 34 Met Met Gly Met Met 1 5 <210> 35 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> oligopeptides conjugated with IL-7 <400> 35 Met Met Gly Gly Met 1 5 <210> 36 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> oligopeptides conjugated with IL-7 <400> 36 Met Met Gly Gly Gly 1 5 <210> 37 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> oligopeptides conjugated with IL-7 <400> 37 Met Met Met Gly Met 1 5 <210> 38 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> oligopeptides conjugated with IL-7 <400> 38 Met Met Met Gly Gly 1 5 <210> 39 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> oligopeptides conjugated with IL-7 <400> 39 Met Met Met Met Gly 1 5 <210> 40 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> oligopeptides conjugated with IL-7 <400> 40 Met Gly Gly Gly Met 1 5 <210> 41 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> oligopeptides conjugated with IL-7 <400> 41 Met Gly Met Gly Met 1 5 <210> 42 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> oligopeptides conjugated with IL-7 <400> 42 Gly Met Gly Met Gly 1 5 <210> 43 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> oligopeptides conjugated with IL-7 <400> 43 Gly Met Met Met Gly 1 5 <210> 44 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> oligopeptides conjugated with IL-7 <400> 44 Gly Gly Met Gly Met 1 5 <210> 45 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> oligopeptides conjugated with IL-7 <400> 45 Gly Gly Met Met Gly 1 5 <210> 46 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> oligopeptides conjugated with IL-7 <400> 46 Met Gly Gly Met Gly 1 5 <210> 47 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> oligopeptides conjugated with IL-7 <400> 47 Met Gly Met Gly Gly 1 5 <210> 48 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> oligopeptides conjugated with IL-7 <400> 48 Gly Met Met Gly Met 1 5 <210> 49 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> oligopeptides conjugated with IL-7 <400> 49 Met Gly Met Met Gly 1 5 <210> 50 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> oligopeptides conjugated with IL-7 <400> 50 Gly Met Gly Gly Met 1 5 <210> 51 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> oligopeptides conjugated with IL-7 <400> 51 Met Met Gly Met Gly 1 5 <210> 52 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> oligopeptides conjugated with IL-7 <400> 52 Gly Met Met Gly Gly 1 5 <210> 53 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> oligopeptides conjugated with IL-7 <400> 53 Gly Met Gly Gly Gly 1 5 <210> 54 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> oligopeptides conjugated with IL-7 <400> 54 Gly Gly Met Gly Gly 1 5 <210> 55 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> oligopeptides conjugated with IL-7 <400> 55 Gly Gly Gly Met Gly 1 5 <210> 56 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> oligopeptides conjugated with IL-7 <400> 56 Gly Gly Gly Gly Gly 1 5

Claims (17)

  1. (a) 변형된 IL-7 융합 단백질;
    (b) 10 내지 50 mM의 기저 완충액(basal buffer);
    (c) 2.5 내지 5w/v%의 당; 및
    (d) 0.05 내지 6w/v%의 계면 활성제
    를 포함하는, 약학적 제형으로서,
    상기 변형된 IL-7 융합 단백질은 메티오닌(M) 및 글리신(G)으로부터 선택된 1 내지 10의 아미노산을 포함하는 올리고펩티드; IL-7; 및 면역글로불린의 Fc 영역을 포함하고,
    상기 올리고펩티드는 IL-7의 N-말단에 결합된 것이고,
    상기 면역글로불린의 Fc 영역은 IL-7의 C-말단에 결합되는 것이고,
    상기 기저 완충액은 히스티딘-아세테이트(histidine-acetate) 또는 시트르산나트륨(sodium citrate) 용액이고,
    상기 당은 수크로스(sucrose)이고,
    상기 계면 활성제는 폴리소르베이트, 폴록사머 및 이의 혼합물로 구성된 군으로부터 선택된 어느 하나인 것인, 약학적 제형.
  2. 삭제
  3. 제1항에 있어서,
    상기 올리고펩티드는 M, G, MM, MG, GM, GG, MMM, GMM, MGM, MMG, GGM, GMG, MGG, GGG, MMMM(서열번호 9), GMMM(서열번호 10), MGMM(서열번호 11), MMGM(서열번호 12), MMMG(서열번호 13), GGMM(서열번호 14), MGGM(서열번호 15), MMGG(서열번호 16), GMGM(서열번호 17), MGMG(서열번호 18), GMMG(서열번호 19), GGGM(서열번호 20), MGGG(서열번호 21), GMGG(서열번호 22), GGMG(서열번호 23), GGGG(서열번호 24), MMMMM(서열번호 25), GMMMM(서열번호 26), GGMMM(서열번호 27), GGGMM(서열번호 28), GGGGM(서열번호 29), MGMMM(서열번호 30), MGGMM(서열번호 31), MGGGM(서열번호 32), MGGGG(서열번호 33), MMGMM(서열번호 34), MMGGM(서열번호 35), MMGGG(서열번호 36), MMMGM(서열번호 37), MMMGG(서열번호 38), MMMMG(서열번호 39), MGGGM(서열번호 40), MGMGM(서열번호 41), GMGMG(서열번호 42), GMMMG(서열번호 43), GGMGM(서열번호 44), GGMMG(서열번호 45), MGGMG(서열번호 46), MGMGG(서열번호 47), GMMGM(서열번호 48), MGMMG(서열번호 49), GMGGM(서열번호 50), MMGMG(서열번호 51), GMMGG(서열번호 52), GMGGG(서열번호 53), GGMGG(서열번호 54), GGGMG(서열번호 55) 및 GGGGG(서열번호 56)로 구성된 군으로부터 선택된 하나인 것인, 약학적 제형.
  4. 삭제
  5. 제1항에 있어서,
    상기 IL-7은 서열번호 1 내지 6의 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드인, 약학적 제형.
  6. 삭제
  7. 제1항에 있어서,
    상기 면역글로불린의 Fc 영역은 서열번호 7의 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드인, 약학적 제형.
  8. 삭제
  9. 삭제
  10. 삭제
  11. 제1항에 있어서,
    상기 제형에 아르기닌, 글루타메이트, 글리신, 히스티딘 및 이의 혼합물로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나의 아미노산을 추가로 포함하는 것인, 약학적 제형.
  12. 제11항에 있어서,
    상기 아미노산의 농도는 40 내지 60 mM인, 약학적 제형.
  13. 제12항에 있어서,
    상기 아미노산의 농도는 50 mM인, 약학적 제형.
  14. 제1항에 있어서,
    상기 제형에 1 내지 2w/v%의 당알콜을 추가로 포함하는 것인, 약학적 제형.
  15. 제14항에 있어서,
    상기 당알콜은 솔비톨인, 약학적 제형.
  16. 제1항에 있어서,
    상기 제형의 pH는 5.0인, 약학적 제형.
  17. 제1항에 있어서,
    상기 제형은 액상 제형인, 약학적 제형.
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