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KR102384115B1 - 알쯔하이머병 및 다른 신경퇴행성 장애에 대한 바이오마커 및 진단 방법 - Google Patents

알쯔하이머병 및 다른 신경퇴행성 장애에 대한 바이오마커 및 진단 방법 Download PDF

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KR102384115B1
KR102384115B1 KR1020167013129A KR20167013129A KR102384115B1 KR 102384115 B1 KR102384115 B1 KR 102384115B1 KR 1020167013129 A KR1020167013129 A KR 1020167013129A KR 20167013129 A KR20167013129 A KR 20167013129A KR 102384115 B1 KR102384115 B1 KR 102384115B1
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에드워드 제이 괴츨
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나노소믹스 인코포레이티드
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Abstract

본 발명은 알쯔하이머병(Alzheimer's disease) 및 다른 신경퇴행성 장애에 대한 바이오마커 및 진단 및 예후 방법에 관한 것이다. 본 발명은 상기 바이오마커를 검출하기 위한 조성물뿐만 아니라 알쯔하이머병 및 다른 신경퇴행성 장애를 치료하는 데에 유용한 조성물 및 방법도 제공한다.

Description

알쯔하이머병 및 다른 신경퇴행성 장애에 대한 바이오마커 및 진단 방법{BIOMARKERS AND DIAGNOSTIC METHODS FOR ALZHEIMER'S DISEASE AND OTHER NEURODEGENERATIVE DISORDERS}
본 발명은 알쯔하이머병(Alzheimer's disease) 및 다른 신경퇴행성 장애에 대한 바이오마커 및 진단 및 예후 방법에 관한 것이다. 본 발명은 상기 바이오마커를 검출하기 위한 조성물뿐만 아니라 알쯔하이머병 및 다른 신경퇴행성 장애를 치료하는 데에 유용한 조성물 및 방법도 제공한다.
관련 출원
본원은 2013년 10월 24일자로 출원된 미국 가출원 제61/895,376호, 2014년 4월 14일자로 출원된 미국 가출원 제61/978,994호, 및 2014년 9월 8일자로 출원된 미국 가출원 제62/047,062호(전체로서 본원에 참고로 도입됨)를 우선권 주장한다.
5백4십만 명 초과의 미국인들 및 전세계 3천5백만 명의 사람들이 치매의 가장 흔한 형태인 알쯔하이머병을 가진다. 현재, 알쯔하이머병을 진단하는 유일한 확정적인 방법은 환자가 사망한 후 뇌 조직의 직접적인 검사이다. 의사들은 알쯔하이머병을 가진 것으로 의심받는 환자에서 상기 질환을 진단하기 위해 뇌 영상화, 거동의 평가, 정신과 검사 및 다른 수단을 이용하지만, 어느 것도 고도로 정확하지 않고, 많은 수단들이 비싸거나 실용적이지 않다.
따라서, 알쯔하이머병 및 다른 신경퇴행성 장애를 진단하기 위한 바이오마커 및 방법에 대한 필요성이 당분야에서 존재한다. 추가로, 상기 바이오마커를 검출하기 위한 조성물에 대한 필요성뿐만 아니라 알쯔하이머병 및 다른 신경퇴행성 장애를 치료하는 데에 유용한 방법에 대한 필요성도 당분야에서 존재한다. 본 발명은 알쯔하이머병 및 다른 신경퇴행성 장애를 진단하는 정확한 비침습 방법을 제공함으로써 이 필요성을 충족시킨다. 본 발명은 알쯔하이머병 및 다른 신경퇴행성 장애를 진단하고 예후하고 예측하고 치료하는 신규 방법, 분석, 키트 및 조성물도 제공한다.
본 발명은 대상체에서 신경퇴행성 장애를 진단하거나 예후하거나, 신경퇴행성 장애의 위험에 있는 대상체를 확인하거나, 신경퇴행성 장애를 가진 대상체에서 치료 요법을 처방하거나 치료로부터의 이익을 예측하는 방법으로서, 대상체로부터의 생물학적 샘플 중의 하나 이상의 바이오마커의 수준을 분석하는 단계; 및 상기 바이오마커의 수준에 근거하여 대상체에서 신경퇴행성 장애를 진단하거나 예후하거나, 신경퇴행성 장애의 위험에 있는 대상체를 확인하거나, 신경퇴행성 장애를 가진 대상체에서 치료 요법을 처방하거나 치료로부터의 이익을 예측하는 단계를 포함하되, 상기 하나 이상의 바이오마커 중 적어도 하나가 Tau, 인산화된 Tau, Aβ1-42, TDP-43, α-시누클레인(synuclein), SOD-1, FUS, FKBP51, IRS-1, 인산화된 IRS-1, 카텝신(cathepsin) D(CTSD), 1형 라이소좀-관련 막 단백질(LAMP1), 유비퀴티닐화된 단백질(UBP), 열충격 단백질 70(HSP70), 신경 특이적 에놀라제(enolase)(NSE), 신경필라멘트 경쇄(NFL), CD9, CD63, CD81 및 CD171로 구성된 군으로부터 선택되는, 방법을 제공한다. 일부 실시양태들에서, 생물학적 샘플 중의 하나 이상의 바이오마커의 수준은 대조군 샘플 중의 하나 이상의 바이오마커의 수준과 비교되고, 생물학적 샘플의 하나 이상의 바이오마커의 수준은 대조군 샘플에 비해 상승되어 있다. 다른 실시양태에서, 신경퇴행성 장애는 알쯔하이머병(AD), 혈관 질환 치매, 전두측두엽 치매(FTD), 피질기저 퇴행(CBD), 진행핵상마비(PSP), 루이소체(Lewy body) 치매, 매듭-우세 노인성 치매(tangle-predominant senile dementia), 픽병(Pick's disease)(PiD), 호은 과립(argyrophilic grain) 질환, 근위축성 측삭 경화증(ALS), 다른 운동 신경 질환, 괌(Guam) 파킨슨증-치매 복합, FTDP-17, 라이티코-보디그병(Lytico-Bodig disease), 다발성 경화증, 외상성 뇌 손상(TBI) 및 파킨슨병(Parkinson's disease)으로 구성된 군으로부터 선택된다. 다른 실시양태에서, 생물학적 샘플은 전혈, 혈청, 혈장, 소변, 간질액, 복막액, 자궁경부 면봉표본, 눈물, 타액, 협측 면봉표본, 피부, 뇌 조직 및 뇌척수액으로 구성된 군으로부터 선택된다. 다른 실시양태에서, 인산화된 Tau는 하나 이상의 세린, 쓰레오닌 또는 티로신 잔기 상에서 인산화되어 있다. 다른 실시양태에서, 인산화된 Tau는 Thr-153, Thr-181, Thr-205, Thr-231, Ser-199, Ser-202, Ser-214, Ser-235, Ser-262, Ser-356, Ser-396, Ser-422, Tyr18, Tyr29, Tyr197, Tyr310 및 Tyr394로 구성된 군으로부터 선택된 하나 이상의 잔기에서 인산화되어 있다. 다른 실시양태에서, 인산화된 Tau의 수준은 인산화된 Tau 폴리뉴클레오타이드, 인산화된 Tau 폴리펩타이드 또는 인산화된 Tau 활성의 수준을 분석함으로써 측정된다. 다른 실시양태에서, 인산화된 IRS-1은 하나 이상의 세린, 쓰레오닌 또는 티로신 잔기 상에서 인산화되어 있다. 다른 실시양태에서, 인산화된 IRS-1은 P-S312-IRS-1 및 P-panY-IRS-1로 구성된 군으로부터 선택된 하나 이상의 잔기에서 인산화되어 있다. 다른 실시양태에서, 인산화된 IRS-1의 수준은 인산화된 IRS-1 폴리뉴클레오타이드, 인산화된 IRS-1 폴리펩타이드 또는 인산화된 IRS-1 활성의 수준을 분석함으로써 측정된다. 다른 실시양태에서, 상기 방법은 생물학적 샘플로부터 소포(vesicle)를 단리하는 단계를 추가로 포함한다. 다른 실시양태에서, 소포는 엑소좀(exosome), 미세입자, 미세소포, 나노좀(nanosome), 세포외 소포 및 엑토좀(ectosome)으로 구성된 군으로부터 선택된다. 다른 실시양태에서, 상기 방법은 생물학적 샘플로부터 엑소좀을 단리하는 단계를 추가로 포함한다. 특정 실시양태에서, 단리된 엑소좀은 신경-유래 엑소좀, 성상세포-유래 엑소좀, 희소돌기아교세포-유래 엑소좀 및 미세아교세포-유래 엑소좀으로 구성된 군으로부터 선택된다. 다른 실시양태에서, 하나 이상의 바이오마커의 수준은 하나 이상의 바이오마커의 단백질, 인산화된 단백질, mRNA 또는 miRNA 수준이다.
본 발명은 대상체에서 신경퇴행성 장애를 진단하거나 예후하거나, 신경퇴행성 장애의 위험에 있는 대상체를 확인하거나, 신경퇴행성 장애를 가진 대상체에서 치료 요법을 처방하거나 치료로부터의 이익을 예측하는 방법으로서, 대상체로부터 수득된 생물학적 샘플로부터 소포를 단리하는 단계; 및 상기 소포에서 하나 이상의 바이오마커의 수준을 측정하는 단계를 포함하고, 이때 대조군 샘플 중의 상기 하나 이상의 바이오마커의 수준에 비해 상기 샘플 중의 상기 하나 이상의 바이오마커의 상승된 수준이 신경퇴행성 장애의 표시이고, 상기 하나 이상의 바이오마커 중 적어도 하나가 Tau, 인산화된 Tau, Aβ1-42, TDP-43, α-시누클레인, SOD-1, FUS, FKBP51, IRS-1, 인산화된 IRS-1, CTSD, LAMP1, UBP, HSP70, NSE, NFL, CD9, CD63, CD81 및 CD171로 구성된 군으로부터 선택되는, 방법도 제공한다. 다른 실시양태에서, 소포는 엑소좀, 미세입자, 미세소포, 나노좀, 세포외 소포 및 엑토좀으로 구성된 군으로부터 선택된다. 일부 실시양태들에서, 신경퇴행성 장애는 알쯔하이머병(AD), 혈관 질환 치매, 전두측두엽 치매(FTD), 피질기저 퇴행(CBD), 진행핵상마비(PSP), 루이소체 치매, 매듭-우세 노인성 치매, 픽병(PiD), 호은 과립 질환, 근위축성 측삭 경화증(ALS), 다른 운동 신경 질환, 괌 파킨슨증-치매 복합, FTDP-17, 라이티코-보디그병, 다발성 경화증, 외상성 뇌 손상(TBI) 및 파킨슨병으로 구성된 군으로부터 선택된다. 다른 실시양태에서, 생물학적 샘플은 전혈, 혈청, 혈장, 소변, 간질액, 복막액, 자궁경부 면봉표본, 눈물, 타액, 협측 면봉표본, 피부, 뇌 조직 및 뇌척수액으로 구성된 군으로부터 선택된다. 다른 실시양태에서, 인산화된 Tau는 하나 이상의 세린, 쓰레오닌 또는 티로신 잔기 상에서 인산화되어 있다. 다른 실시양태에서, 인산화된 Tau는 Thr-153, Thr-181, Thr-205, Thr-231, Ser-199, Ser-202, Ser-214, Ser-235, Ser-262, Ser-356, Ser-396, Ser-422, Tyr18, Tyr29, Tyr197, Tyr310 및 Tyr394로 구성된 군으로부터 선택된 하나 이상의 잔기에서 인산화되어 있다. 다른 실시양태에서, 인산화된 IRS-1은 하나 이상의 세린, 쓰레오닌 또는 티로신 잔기 상에서 인산화되어 있다. 다른 실시양태에서, 인산화된 IRS-1은 P-S312-IRS-1 및 P-panY-IRS-1로 구성된 군으로부터 선택된 하나 이상의 잔기에서 인산화되어 있다. 다른 실시양태에서, 단리된 엑소좀은 신경-유래 엑소좀, 성상세포-유래 엑소좀, 희소돌기아교세포-유래 엑소좀 및 미세아교세포-유래 엑소좀으로 구성된 군으로부터 선택된다. 다른 실시양태에서, 소포를 생물학적 샘플로부터 단리하는 단계는 상기 생물학적 샘플에 존재하는 소포가 제제에 결합하여 소포-제제 복합체를 형성하는 조건 하에서 상기 생물학적 샘플을 상기 제제와 접촉시키는 단계; 및 상기 소포를 상기 소포-제제 복합체로부터 단리하여 상기 소포를 함유하는 샘플을 수득하는 단계를 포함하되, 상기 샘플에 존재하는 소포의 순도는 상기 생물학적 샘플에 존재하는 소포의 순도보다 더 크다. 다른 실시양태에서, 소포를 생물학적 샘플로부터 단리하는 단계는 소포를 상기 생물학적 샘플로부터 단리하여 소포 샘플을 수득하는 단계; 상기 소포 샘플에 존재하는 소포가 제제에 결합하여 소포-제제 복합체를 형성하는 조건 하에서 상기 소포 샘플을 상기 제제와 접촉시키는 단계; 및 상기 소포를 상기 소포-제제 복합체로부터 단리하여 상기 소포를 함유하는 샘플을 수득하는 단계를 포함하되, 상기 샘플에 존재하는 소포의 순도는 상기 생물학적 샘플에 존재하는 소포의 순도보다 더 크다. 특정 양태에서, 상기 제제는 항체, 렉틴(lectin), 리간드, 가용성 수용체, 결합 단백질 또는 올리고뉴클레오타이드이다. 다른 양태에서, 항체는 다중클론 또는 단일클론 항체이다. 다른 양태에서, 항체는 단일클론 NCAM 항체이다. 다른 양태에서, 항체는 단일클론 항-인간 NCAM 항체이다. 다른 양태에서, 항체는 단일클론 CD171 항체이다. 다른 양태에서, 항체는 단일클론 항-인간 CD171 항체이다. 다른 양태에서, 항체는 단일클론 CD9 항체이다. 다른 양태에서, 항체는 단일클론 CD63 항체이다. 다른 양태에서, 항체는 단일클론 CD81 항체이다. 다른 실시양태에서, 소포는 엑소좀, 미세입자, 미세소포, 나노좀, 세포외 소포 및 엑토좀으로 구성된 군으로부터 선택된다. 다른 실시양태에서, 하나 이상의 바이오마커의 수준은 하나 이상의 바이오마커의 단백질, 인산화된 단백질, mRNA 또는 miRNA 수준이다.
본 발명은 대상체에서 신경퇴행성 장애를 진단하거나 예후하거나, 신경퇴행성 장애의 위험에 있는 대상체를 확인하거나, 신경퇴행성 장애를 가진 대상체에서 치료 요법을 처방하거나 치료로부터의 이익을 예측하는 방법으로서, 생물학적 샘플을 대상체로부터 수득하는 단계; 소포에 대해 특이적인 항체를 샘플에 적용하는 단계로서, 상기 소포의 존재가 항체-소포 복합체를 생성하는, 단계; 상기 항체-소포 복합체를 단리하는 단계; 상기 항체-소포 복합체에서 하나 이상의 바이오마커의 수준을 분석하는 단계; 및 상기 하나 이상의 바이오마커의 수준에 근거하여 대상체에서 신경퇴행성 장애를 진단하거나 예후하거나, 신경퇴행성 장애의 위험에 있는 대상체를 확인하거나, 신경퇴행성 장애를 가진 대상체에서 치료 요법을 처방하거나 치료로부터의 이익을 예측하는 단계를 포함하되, 상기 바이오마커 중 적어도 하나가 Tau, 인산화된 Tau, Aβ1-42, TDP-43, α-시누클레인, SOD-1, FUS, FKBP51, IRS-1, 인산화된 IRS-1, CTSD, LAMP1, UBP, HSP70, NSE, NFL, CD9, CD63, CD81 및 CD171로 구성된 군으로부터 선택되는, 방법을 제공한다. 일부 실시양태들에서, 항체-소포 복합체는 고체상(solid phase) 상에서 생성된다. 다른 실시양태에서, 상기 방법은 항체-소포 복합체로부터 소포를 방출시키는 단계를 추가로 포함한다. 특정 실시양태에서, 고체상은 비-자성 비드, 자성 비드, 아가로스 또는 세파로스이다. 다른 실시양태에서, 소포는 항체-소포 복합체를 3.5 내지 1.5의 낮은 pH에 노출시킴으로써 방출된다. 다른 실시양태에서, 방출된 소포는 높은 pH 용액을 첨가함으로써 중화된다. 다른 실시양태에서, 방출된 소포는 방출된 소포를 용해 용액과 함께 항온처리함으로써 용해된다. 다른 실시양태에서, 용해 용액은 프로테아제(protease) 및 포스파타제(phosphatase)에 대한 억제제를 함유한다. 다른 실시양태에서, 하나 이상의 바이오마커의 수준은 소포의 수 또는 소포 바이오마커의 값에 의해 표준화된다. 다른 실시양태에서, 소포는 엑소좀, 미세입자, 미세소포, 나노좀, 세포외 소포 및 엑토좀으로 구성된 군으로부터 선택된다. 특정 실시양태에서, 항체는 다중클론 또는 단일클론 항체이다. 다른 실시양태에서, 항체는 단일클론 NCAM 항체이다. 다른 실시양태에서, 항체는 단일클론 항-인간 NCAM 항체이다. 다른 양태에서, 항체는 단일클론 CD171 항체이다. 다른 양태에서, 항체는 단일클론 항-인간 CD171 항체이다. 다른 양태에서, 항체는 단일클론 CD9 항체이다. 다른 양태에서, 항체는 단일클론 CD63 항체이다. 다른 양태에서, 항체는 단일클론 CD81 항체이다. 일부 실시양태들에서, 엑소좀은 신경-유래 엑소좀, 성상세포-유래 엑소좀, 희소돌기아교세포-유래 엑소좀 및 미세아교세포-유래 엑소좀으로 구성된 군으로부터 선택된다. 다른 실시양태에서, 인산화된 Tau는 하나 이상의 세린, 쓰레오닌 또는 티로신 잔기 상에서 인산화되어 있다. 다른 실시양태에서, 인산화된 Tau는 Thr-153, Thr-181, Thr-205, Thr-231, Ser-199, Ser-202, Ser-214, Ser-235, Ser-262, Ser-356, Ser-396, Ser-422, Tyr18, Tyr29, Tyr197, Tyr310 및 Tyr394로 구성된 군으로부터 선택된 하나 이상의 잔기에서 인산화되어 있다. 다른 실시양태에서, 인산화된 IRS-1은 하나 이상의 세린, 쓰레오닌 또는 티로신 잔기 상에서 인산화되어 있다. 다른 실시양태에서, 인산화된 IRS-1은 P-S312-IRS-1 및 P-panY-IRS-1로 구성된 군으로부터 선택된 하나 이상의 잔기에서 인산화되어 있다. 다른 실시양태에서, 생물학적 샘플은 전혈, 혈청, 혈장, 소변, 간질액, 복막액, 자궁경부 면봉표본, 눈물, 타액, 협측 면봉표본, 피부, 뇌 조직 및 뇌척수액으로 구성된 군으로부터 선택된다. 일부 실시양태들에서, 신경퇴행성 장애는 알쯔하이머병(AD), 혈관 질환 치매, 전두측두엽 치매(FTD), 피질기저 퇴행(CBD), 진행핵상마비(PSP), 루이소체 치매, 매듭-우세 노인성 치매, 픽병(PiD), 호은 과립 질환, 근위축성 측삭 경화증(ALS), 다른 운동 신경 질환, 괌 파킨슨증-치매 복합, FTDP-17, 라이티코-보디그병, 다발성 경화증, 외상성 뇌 손상(TBI) 및 파킨슨병으로 구성된 군으로부터 선택된다. 다른 실시양태에서, 하나 이상의 바이오마커의 수준은 하나 이상의 바이오마커의 단백질, 인산화된 단백질, mRNA 또는 miRNA 수준이다.
본 발명은 하나 이상의 바이오마커를 포함하는, 대상체의 신경퇴행성 장애 상태를 평가하기 위한 바이오마커 세트로서, 상기 세트 내의 바이오마커의 수준이 분석되고, 상기 바이오마커의 수준이 40% 이상의 특이성으로 대상체의 신경퇴행성 장애 상태를 결정하고, 상기 바이오마커 세트 중 적어도 하나 이상이 Tau, 인산화된 Tau, Aβ1-42, TDP-43, α-시누클레인, SOD-1, FUS, FKBP51, IRS-1, 인산화된 IRS-1, CTSD, LAMP1, UBP, HSP70, NSE, NFL, CD9, CD63, CD81 및 CD171로 구성된 군으로부터 선택되는, 바이오마커 세트를 제공한다. 일부 실시양태들에서, 바이오마커 수준은 적어도 40%, 50%, 60%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 99% 또는 100%의 특이성으로 대상체의 신경퇴행성 장애 상태를 결정한다. 일부 실시양태들에서, 생물학적 샘플은 전혈, 혈청, 혈장, 소변, 간질액, 복막액, 자궁경부 면봉표본, 눈물, 타액, 협측 면봉표본, 피부 및 뇌척수액으로 구성된 군으로부터 선택된다. 다른 실시양태에서, 신경퇴행성 장애는 알쯔하이머병(AD), 혈관 질환 치매, 전두측두엽 치매(FTD), 피질기저 퇴행(CBD), 진행핵상마비(PSP), 루이소체 치매, 매듭-우세 노인성 치매, 픽병(PiD), 호은 과립 질환, 근위축성 측삭 경화증(ALS), 다른 운동 신경 질환, 괌 파킨슨증-치매 복합, FTDP-17, 라이티코-보디그병, 다발성 경화증, 외상성 뇌 손상(TBI) 및 파킨슨병으로 구성된 군으로부터 선택된다. 다른 실시양태에서, 상기 방법은 샘플로부터의 소포에서 바이오마커의 수준을 분석하는 단계를 추가로 포함한다. 다른 실시양태에서, 소포는 엑소좀, 미세입자, 미세소포, 나노좀, 세포외 소포 및 엑토좀으로 구성된 군으로부터 선택된다.
본 발명은 대상체에서 신경퇴행성 장애를 진단하거나 예후하거나, 신경퇴행성 장애의 위험에 있는 대상체를 확인하거나, 신경퇴행성 장애를 가진 대상체에서 치료 요법을 처방하거나 치료로부터의 이익을 예측하기 위한 키트로서, 소포에 특이적으로 결합하는 하나 이상의 제제, 바이오마커에 특이적으로 결합하는 하나 이상의 제제, 생물학적 샘플을 수집하고/하거나 보유하기 위한 하나 이상의 용기, 및 그의 사용을 위한 설명서를 포함하되, 상기 신경퇴행성 장애가 변경된 바이오마커의 수준과 관련되어 있고, 상기 바이오마커가 Tau, 인산화된 Tau, Aβ1-42, TDP-43, α-시누클레인, SOD-1, FUS, FKBP51, IRS-1, 인산화된 IRS-1, CTSD, LAMP1, UBP, HSP70, NSE, NFL, CD9, CD63, CD81 및 CD171로 구성된 군으로부터 선택되는, 키트도 제공한다. 다른 실시양태에서, 소포는 엑소좀, 미세입자, 미세소포, 나노좀, 세포외 소포 및 엑토좀으로 구성된 군으로부터 선택된다. 일부 실시양태들에서, 상기 제제는 다중클론 또는 단일클론 항체이다. 다른 실시양태에서, 항체는 단일클론 NCAM 항체이다. 다른 실시양태에서, 항체는 단일클론 항-인간 NCAM 항체이다. 다른 양태에서, 항체는 단일클론 CD171 항체이다. 다른 양태에서, 항체는 단일클론 항-인간 CD171 항체이다. 다른 양태에서, 항체는 단일클론 CD9 항체이다. 다른 양태에서, 항체는 단일클론 CD63 항체이다. 다른 양태에서, 항체는 단일클론 CD81 항체이다. 특정 실시양태에서, 엑소좀은 신경-유래 엑소좀, 성상세포-유래 엑소좀, 희소돌기아교세포-유래 엑소좀 및 미세아교세포-유래 엑소좀으로 구성된 군으로부터 선택된다. 다른 실시양태에서, 신경퇴행성 장애는 알쯔하이머병(AD), 혈관 질환 치매, 전두측두엽 치매(FTD), 피질기저 퇴행(CBD), 진행핵상마비(PSP), 루이소체 치매, 매듭-우세 노인성 치매, 픽병(PiD), 호은 과립 질환, 근위축성 측삭 경화증(ALS), 다른 운동 신경 질환, 괌 파킨슨증-치매 복합, FTDP-17, 라이티코-보디그병, 다발성 경화증, 외상성 뇌 손상(TBI) 및 파킨슨병으로 구성된 군으로부터 선택된다. 다른 실시양태에서, 생물학적 샘플은 전혈, 혈청, 혈장, 소변, 간질액, 복막액, 자궁경부 면봉표본, 눈물, 타액, 협측 면봉표본, 피부 및 뇌척수액으로 구성된 군으로부터 선택된다. 다른 실시양태에서, 인산화된 Tau는 하나 이상의 세린, 쓰레오닌 또는 티로신 잔기 상에서 인산화되어 있다. 다른 실시양태에서, 인산화된 Tau는 Thr-153, Thr-181, Thr-205, Thr-231, Ser-199, Ser-202, Ser-214, Ser-235, Ser-262, Ser-356, Ser-396, Ser-422, Tyr18, Tyr29, Tyr197, Tyr310 및 Tyr394로 구성된 군으로부터 선택된 하나 이상의 잔기에서 인산화되어 있다. 다른 실시양태에서, 인산화된 IRS-1은 하나 이상의 세린, 쓰레오닌 또는 티로신 잔기 상에서 인산화되어 있다. 다른 실시양태에서, 인산화된 IRS-1은 P-S312-IRS-1 및 P-panY-IRS-1로 구성된 군으로부터 선택된 하나 이상의 잔기에서 인산화되어 있다. 다른 실시양태에서, 상기 키트는 샘플에서 바이오마커 수준을 분석하기 위한 컴퓨터 모델 또는 알고리즘을 추가로 포함한다.
본 발명은 대상체에서 신경퇴행성 장애를 진단하거나 예후하거나, 신경퇴행성 장애의 위험에 있는 대상체를 확인하거나, 신경퇴행성 장애를 가진 대상체에서 치료 요법을 처방하거나 치료로부터의 이익을 예측하기 위한 키트로서, 소포에 특이적으로 결합하는 하나 이상의 제제, 바이오마커 mRNA 또는 miRNA를 검출하기 위한 하나 이상의 프로브 또는 프라이머, 생물학적 샘플을 수집하고/하거나 보유하기 위한 하나 이상의 용기, 및 그의 사용을 위한 설명서를 포함하되, 상기 신경퇴행성 장애가 변경된 바이오마커의 수준과 관련되어 있고, 상기 바이오마커가 Tau, 인산화된 Tau, Aβ1-42, TDP-43, α-시누클레인, SOD-1, FUS, FKBP51, IRS-1, 인산화된 IRS-1, CTSD, LAMP1, UBP, HSP70, NSE, NFL, CD9, CD63, CD81 및 CD171로 구성된 군으로부터 선택되는, 키트도 제공한다. 다른 실시양태에서, 소포는 엑소좀, 미세입자, 미세소포, 나노좀, 세포외 소포 및 엑토좀으로 구성된 군으로부터 선택된다. 일부 실시양태들에서, 상기 제제는 다중클론 또는 단일클론 항체이다. 다른 실시양태에서, 엑소좀은 신경-유래 엑소좀, 성상세포-유래 엑소좀, 희소돌기아교세포-유래 엑소좀 및 미세아교세포-유래 엑소좀으로 구성된 군으로부터 선택된다. 다른 실시양태에서, 신경퇴행성 장애는 알쯔하이머병(AD), 혈관 질환 치매, 전두측두엽 치매(FTD), 피질기저 퇴행(CBD), 진행핵상마비(PSP), 루이소체 치매, 매듭-우세 노인성 치매, 픽병(PiD), 호은 과립 질환, 근위축성 측삭 경화증(ALS), 다른 운동 신경 질환, 괌 파킨슨증-치매 복합, FTDP-17, 라이티코-보디그병, 다발성 경화증, 외상성 뇌 손상(TBI) 및 파킨슨병으로 구성된 군으로부터 선택된다. 다른 실시양태에서, 생물학적 샘플은 전혈, 혈청, 혈장, 소변, 간질액, 복막액, 자궁경부 면봉표본, 눈물, 타액, 협측 면봉표본, 피부 및 뇌척수액으로 구성된 군으로부터 선택된다. 다른 실시양태에서, 인산화된 Tau는 하나 이상의 세린, 쓰레오닌 또는 티로신 잔기 상에서 인산화되어 있다. 다른 실시양태에서, 인산화된 Tau는 Thr-153, Thr-181, Thr-205, Thr-231, Ser-199, Ser-202, Ser-214, Ser-235, Ser-262, Ser-356, Ser-396, Ser-422, Tyr18, Tyr29, Tyr197, Tyr310 및 Tyr394로 구성된 군으로부터 선택된 하나 이상의 잔기에서 인산화되어 있다. 다른 실시양태에서, 인산화된 IRS-1은 하나 이상의 세린, 쓰레오닌 또는 티로신 잔기 상에서 인산화되어 있다. 다른 실시양태에서, 인산화된 IRS-1은 P-S312-IRS-1 및 P-panY-IRS-1로 구성된 군으로부터 선택된 하나 이상의 잔기에서 인산화되어 있다. 다른 실시양태에서, 상기 키트는 샘플에서 바이오마커 수준을 분석하기 위한 컴퓨터 모델 또는 알고리즘을 추가로 포함한다.
다른 실시양태에서, 본 발명은 (i) 대상체로부터 소포를 함유하는 시험 생물학적 샘플을 수득하는 단계; (ii) 상기 시험 생물학적 샘플 중의 하나 이상의 바이오마커의 수준을 측정하는 단계; (iii) 상기 시험 생물학적 샘플 중의 하나 이상의 바이오마커의 수준을 대조군 생물학적 샘플 중의 하나 이상의 바이오마커의 대조군 수준과 비교하는 단계; 및 (iv) 상기 대조군 생물학적 샘플에 비해 상기 시험 생물학적 샘플 중의 하나 이상의 바이오마커의 증가된 수준을 검출함으로써 상기 대상체가 신경퇴행성 장애를 갖는지를 확인하는 단계를 포함하는, 대상체에서 신경퇴행성 장애를 진단하는 방법으로서, 상기 하나 이상의 바이오마커 중 적어도 하나가 Tau, 인산화된 Tau, Aβ1-42, TDP-43, α-시누클레인, SOD-1, FUS, FKBP51, IRS-1, 인산화된 IRS-1, CTSD, LAMP1, UBP, HSP70, NSE, NFL, CD9, CD63, CD81 및 CD171로 구성된 군으로부터 선택되는, 방법을 제공한다. 다른 실시양태에서, 소포는 엑소좀, 미세입자, 미세소포, 나노좀, 세포외 소포 및 엑토좀으로 구성된 군으로부터 선택된다. 일부 실시양태들에서, 엑소좀은 신경-유래 엑소좀, 성상세포-유래 엑소좀, 희소돌기아교세포-유래 엑소좀 및 미세아교세포-유래 엑소좀으로 구성된 군으로부터 선택된다. 다른 실시양태에서, 인산화된 Tau는 하나 이상의 세린, 쓰레오닌 또는 티로신 잔기 상에서 인산화되어 있다. 다른 실시양태에서, 인산화된 Tau는 Thr-153, Thr-181, Thr-205, Thr-231, Ser-199, Ser-202, Ser-214, Ser-235, Ser-262, Ser-356, Ser-396, Ser-422, Tyr18, Tyr29, Tyr197, Tyr310 및 Tyr394로 구성된 군으로부터 선택된 하나 이상의 잔기에서 인산화되어 있다. 다른 실시양태에서, 인산화된 IRS-1은 하나 이상의 세린, 쓰레오닌 또는 티로신 잔기 상에서 인산화되어 있다. 다른 실시양태에서, 인산화된 IRS-1은 P-S312-IRS-1 및 P-panY-IRS-1로 구성된 군으로부터 선택된 하나 이상의 잔기에서 인산화되어 있다. 다른 실시양태에서, 신경퇴행성 장애는 알쯔하이머병(AD), 혈관 질환 치매, 전두측두엽 치매(FTD), 피질기저 퇴행(CBD), 진행핵상마비(PSP), 루이소체 치매, 매듭-우세 노인성 치매, 픽병(PiD), 호은 과립 질환, 근위축성 측삭 경화증(ALS), 다른 운동 신경 질환, 괌 파킨슨증-치매 복합, FTDP-17, 라이티코-보디그병, 다발성 경화증, 외상성 뇌 손상(TBI) 및 파킨슨병으로 구성된 군으로부터 선택된다. 다른 실시양태에서, 생물학적 샘플은 전혈, 혈청, 혈장, 소변, 간질액, 복막액, 자궁경부 면봉표본, 눈물, 타액, 협측 면봉표본, 피부 및 뇌척수액으로 구성된 군으로부터 선택된다. 다른 실시양태에서, 인산화된 Tau는 하나 이상의 세린, 쓰레오닌 또는 티로신 잔기 상에서 인산화되어 있다. 다른 실시양태에서, 인산화된 IRS-1은 하나 이상의 세린, 쓰레오닌 또는 티로신 잔기 상에서 인산화되어 있다. 다른 실시양태에서, 상기 방법은 소포를 생물학적 샘플로부터 단리하는 단계를 추가로 포함한다. 다른 실시양태에서, 소포는 엑소좀, 미세입자, 미세소포, 나노좀, 세포외 소포 및 엑토좀으로 구성된 군으로부터 선택된다.
다른 실시양태에서, 본 발명은 (i) 대상체로부터 소포를 포함하는 생물학적 샘플을 수득하는 단계; (ii) 상기 생물학적 샘플 중의 하나 이상의 바이오마커의 수준을 측정하는 단계; 및 (iii) 상기 생물학적 샘플 중의 하나 이상의 바이오마커의 수준을 대조군 생물학적 샘플 중의 하나 이상의 바이오마커의 대조군 수준과 비교하는 단계를 포함하는, 대상체로부터의 샘플을 분석하는 방법을 제공한다. 일부 실시양태들에서, 대상체는 신경퇴행성 장애를 가진 것으로 진단되었거나 의심받는다. 다른 실시양태에서, 상기 방법은 대상체에서 신경퇴행성 장애를 진단하거나 예후하거나, 대상체에서 신경퇴행성 장애의 위험을 확인하거나, 신경퇴행성 장애를 갖거나 가진 것으로 의심받는 대상체에 대한 치료 요법을 처방하거나 치료로부터의 이익을 예측하는 단계를 추가로 포함한다. 특정 실시양태에서, 하나 이상의 바이오마커 중 적어도 하나는 Tau, 인산화된 Tau, Aβ1-42, TDP-43, α-시누클레인, SOD-1, FUS, FKBP51, IRS-1, 인산화된 IRS-1, CTSD, LAMP1, UBP, HSP70, NSE, NFL, CD9, CD63, CD81 및 CD171로 구성된 군으로부터 선택된다. 일부 실시양태들에서, 생물학적 샘플 중의 하나 이상의 바이오마커의 수준은 대조군 샘플 중의 하나 이상의 바이오마커의 수준과 비교되고, 생물학적 샘플의 하나 이상의 바이오마커의 수준은 대조군 샘플에 비해 상승되어 있다. 다른 실시양태에서, 신경퇴행성 장애는 알쯔하이머병(AD), 혈관 질환 치매, 전두측두엽 치매(FTD), 피질기저 퇴행(CBD), 진행핵상마비(PSP), 루이소체 치매, 매듭-우세 노인성 치매, 픽병(PiD), 호은 과립 질환, 근위축성 측삭 경화증(ALS), 다른 운동 신경 질환, 괌 파킨슨증-치매 복합, FTDP-17, 라이티코-보디그병, 다발성 경화증, 외상성 뇌 손상(TBI) 및 파킨슨병으로 구성된 군으로부터 선택된다. 다른 실시양태에서, 생물학적 샘플은 전혈, 혈청, 혈장, 소변, 간질액, 복막액, 자궁경부 면봉표본, 눈물, 타액, 협측 면봉표본, 피부, 뇌 조직 및 뇌척수액으로 구성된 군으로부터 선택된다. 다른 실시양태에서, 인산화된 Tau는 하나 이상의 세린, 쓰레오닌 또는 티로신 잔기 상에서 인산화되어 있다. 다른 실시양태에서, 인산화된 Tau는 Thr-153, Thr-181, Thr-205, Thr-231, Ser-199, Ser-202, Ser-214, Ser-235, Ser-262, Ser-356, Ser-396, Ser-422, Tyr18, Tyr29, Tyr197, Tyr310 및 Tyr394로 구성된 군으로부터 선택된 하나 이상의 잔기에서 인산화되어 있다. 다른 실시양태에서, 인산화된 Tau의 수준은 인산화된 Tau 폴리뉴클레오타이드, 인산화된 Tau 폴리펩타이드 또는 인산화된 Tau 활성의 수준을 분석함으로써 측정된다. 다른 실시양태에서, 인산화된 IRS-1은 하나 이상의 세린, 쓰레오닌 또는 티로신 잔기 상에서 인산화되어 있다. 다른 실시양태에서, 인산화된 IRS-1은 P-S312-IRS-1 및 P-panY-IRS-1로 구성된 군으로부터 선택된 하나 이상의 잔기에서 인산화되어 있다. 다른 실시양태에서, 인산화된 IRS-1의 수준은 인산화된 IRS-1 폴리뉴클레오타이드, 인산화된 IRS-1 폴리펩타이드 또는 인산화된 IRS-1 활성의 수준을 분석함으로써 측정된다. 다른 실시양태에서, 상기 방법은 소포를 생물학적 샘플로부터 단리하는 단계를 추가로 포함한다. 다른 실시양태에서, 소포는 엑소좀, 미세입자, 미세소포, 나노좀, 세포외 소포 및 엑토좀으로 구성된 군으로부터 선택된다. 다른 실시양태에서, 상기 방법은 생물학적 샘플로부터 엑소좀을 단리하는 단계를 추가로 포함한다. 특정 실시양태에서, 단리된 엑소좀은 신경-유래 엑소좀, 성상세포-유래 엑소좀, 희소돌기아교세포-유래 엑소좀 및 미세아교세포-유래 엑소좀으로 구성된 군으로부터 선택된다. 다른 실시양태에서, 상기 방법은 P-S312-IRS-1과 P-panY-IRS-1의 비(R 또는 인슐린 내성 지수)를 측정하는 단계를 추가로 포함한다. 다른 실시양태에서, 본 발명의 방법은 샘플에서 하나 이상의 바이오마커 수준을 분석하기 위한 컴퓨터 모델 또는 알고리즘을 추가로 포함한다. 다른 실시양태에서, 하나 이상의 바이오마커의 수준은 하나 이상의 바이오마커의 단백질, 인산화된 단백질, mRNA 또는 miRNA 수준이다.
본원의 개시내용에 비추어 볼 때 당분야에서 숙련된 자는 본 발명의 이 실시양태들 및 다른 실시양태들을 용이하게 생각해낼 것이고, 모든 이러한 실시양태들이 구체적으로 고려된다.
본 발명의 각각의 한정은 본 발명의 다양한 실시양태들을 포괄할 수 있다. 따라서, 어느 한 요소 또는 요소들의 조합물을 수반하는 본 발명의 각각의 한정은 본 발명의 각각의 양태에 포함될 수 있다는 것이 예상된다. 본 발명은 그의 적용에서 하기 설명에 기재된 구성요소의 구축 및 배열의 세부사항으로 한정되지 않는다. 본 발명은 다른 실시양태로 실시될 수 있고 다양한 방식들로 실시될 수 있거나 수행될 수 있다. 또한, 본원에서 사용된 어구 및 용어는 설명을 위한 것이고 한정으로서 간주되어서는 안 된다. 본원에서 "비롯한", "포함하는" 또는 "가진", "함유하는", "수반하는" 및 이들의 파생어들은 뒤이어 나열된 항목들 및 이들의 균등물들뿐만 아니라 추가 항목들도 포괄하기 위한 것이다. 본 명세서 및 첨부된 청구범위에서 사용된 바와 같이, 문맥이 달리 명시하지 않는 한, 단수형은 복수 지시대상을 포함한다는 것을 인지해야 한다.
본원에 기재된 특정 방법, 프로토콜, 세포주, 분석 및 시약이 변경될 수 있기 때문에, 본 발명은 이들로 한정되지 않는다는 것을 이해해야 한다. 본원에서 사용된 용어는 본 발명의 특정 실시양태들을 기술하기 위한 것이고 첨부된 청구범위에 기재된 본 발명의 범위를 한정하기 위한 것이 결코 아니라는 것도 이해해야 한다.
본 명세서 및 첨부된 청구범위에서 사용된 바와 같이, 문맥이 달리 명시하지 않는 한, 단수형은 복수 지시대상을 포함한다는 것을 인지해야 한다. 따라서, 예를 들면, "단편"의 언급은 복수의 이러한 단편들을 포함하고, "항체"의 언급은 하나 이상의 항체 및 당분야에서 숙련된 자에게 공지된 이의 균등물의 언급이다.
달리 정의되지 않는 한, 본원에서 사용된 모든 기술 용어들 및 과학 용어들은 본 발명이 속하는 분야에서 통상의 기술을 가진 자에 의해 통상적으로 이해된 의미와 동일한 의미를 가진다. 본원에 기재된 방법 및 재료와 유사하거나 동등한 임의의 방법 및 재료가 본 발명의 실시 또는 시험에서 사용될 수 있지만, 바람직한 방법, 장치 및 재료가 이하 기재되어 있다. 본원에서 인용된 모든 공개문헌들은 본 발명과 관련하여 사용될 공개문헌들에서 보고된 방법, 시약 및 수단을 기술하고 개시할 목적으로 전체로서 본원에 참고로 도입된다. 본원에서 어느 것도 본 발명이 선행 발명을 통해 이러한 개시를 예상할 자격이 없다는 것을 인정하는 것으로서 해석되어서는 안 된다.
달리 표시되어 있지 않는 한, 본 발명의 실시는 당분야의 기술 내에서 화학, 생화학, 분자생물학, 세포생물학, 유전학, 면역학 및 약학의 통상적인 방법을 이용할 것이다. 이러한 기법들은 문헌에 전체적으로 설명되어 있다. 예를 들면, 문헌[Gennaro, A.R., ed. (1990) Remington's Pharmaceutical Sciences, 18th ed., Mack Publishing Co.]; 문헌[Colowick, S. et al., eds., Methods In Enzymology, Academic Press, Inc.]; 문헌[Handbook of Experimental Immunology, Vols. I-IV (D.M. Weir and C.C. Blackwell, eds., 1986, Blackwell Scientific Publications)]; 문헌[Maniatis, T. et al., eds. (1989) Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd edition, Vols. I-III, Cold Spring Harbor Laboratory Press]; 문헌[Ausubel, F. M. et al., eds. (1999) Short Protocols in Molecular Biology, 4th edition, John Wiley & Sons]; 문헌[Ream et al., eds. (1998) Molecular Biology Techniques: An Intensive Laboratory Course, Academic Press]; 및 문헌[PCR (Introduction to Biotechniques Series), 2nd ed. (Newton & Graham eds., 1997, Springer Verlag)]을 참조한다.
본 발명은 부분적으로 엑소좀 바이오마커를 분석하여, 예를 들면, 알쯔하이머병(AD), 다발성 경화증(MS) 및 전두측두엽 치매(FTD)를 포함하는 신경퇴행성 장애를 갖거나 발생시킬 가능성이 있는 대상체를 확인할 수 있다는 발견에 관한 것이다.
본 발명은 부분적으로 신경퇴행성 질환(예를 들면, 알쯔하이머병)을 가진 대상체의 순환계에 존재하는 신경-유래 엑소좀에서 특정 바이오마커의 예상되지 않은 증가의 발견에 근거한다. 본 발명은 이 바이오마커들의 엑소좀 수준을 분석하여 신경퇴행성 질환을 가진 대상체에서 신경퇴행성 장애를 진단할 수 있다는 것을 입증한다. 본 발명은 대상체로부터의 신경-유래 엑소좀에서의 특정 바이오마커의 측정을 이용하여 신경퇴행성 질환의 후속 발생을 예측(예를 들면, 신경퇴행성 장애를 발생시킬 위험에 있는 대상체를 확인)할 수 있다는 것도 보여준다.
본 발명은 대상체의 신경퇴행성 상태를 평가하기 위한 바이오마커 세트를 제공한다. 이 실시양태에서, 바이오마커 수준이 분석되고, 바이오마커 수준은 40% 이상의 특이성으로 대상체의 신경퇴행성 상태를 결정한다.
본 발명은 본원에 기재된 방법에서 사용될 조성물도 제공한다. 이러한 조성물은 소분자 화합물; 항체 또는 이의 기능적 활성 단편을 포함하는 펩타이드 및 단백질; 및 작은 간섭 리보핵산(siRNA), 마이크로-RNA(miRNA), 리보자임 및 안티-센스 서열을 포함하는 폴리뉴클레오타이드를 포함할 수 있다(예를 들면, 문헌[Zeng (2003) Proc Natl Acad Sci USA 100:9779-9784]; 및 문헌[Kurreck (2003) Eur J Biochem 270:1628-1644] 참조).
본 발명은 대상체에서 신경퇴행성 장애를 진단하거나 예후하거나, 신경퇴행성 장애의 위험에 있는 대상체를 확인하거나, 신경퇴행성 장애를 가진 대상체에서 치료 요법을 처방하거나 치료로부터의 이익을 예측하기 위한 키트도 제공한다. 이 실시양태들에서, 키트는 엑소좀에 특이적으로 결합하는 하나 이상의 항체, 바이오마커에 특이적으로 결합하는 하나 이상의 항체, 생물학적 샘플을 수집하고/하거나 보유하기 위한 하나 이상의 용기, 및 키트 사용을 위한 설명서를 포함한다.
단락 제목은 조직화 목적만을 위해 본원에서 사용되고, 본원에 기재된 보호대상을 어떠한 방식으로든 한정하는 것으로서 해석되어서는 안 된다.
생물학적 샘플
본 발명은 알쯔하이머병 및 다른 신경퇴행성 장애에 대한 바이오마커 및 진단 및 예후 방법을 제공한다. 바이오마커 수준은 대상체로부터 수득된 생물학적 샘플에서 측정된다. 일부 실시양태들에서, 본 발명의 생물학적 샘플은 혈액으로부터 수득될 수 있다. 일부 실시양태들에서, 약 1 내지 10 ㎖의 혈액이 대상체로부터 채취된다. 다른 실시양태에서, 약 10 내지 50 ㎖의 혈액이 대상체로부터 채취된다. 혈액은 팔, 다리, 또는 중심 정맥 카테터를 통해 접근될 수 있는 혈액을 포함하는, 신체의 임의의 적합한 영역으로부터 채취될 수 있다. 일부 실시양태들에서, 혈액은 치료 또는 활동 후에 채취된다. 예를 들면, 혈액은 의학적 검사 후에 채취될 수 있다. 채취 시기도 샘플에 존재하는 엑소좀의 수 및/또는 조성을 증가시키도록 조정될 수 있다. 예를 들면, 혈액은 혈관 팽창을 유도하는 운동 또는 치료 후에 채취될 수 있다.
혈액은 후속 기법들을 위해 샘플을 보존하거나 준비하기 위해 채취 후에 다양한 성분들과 조합될 수 있다. 예를 들면, 일부 실시양태들에서, 혈액은 채취 후에 항응고제, 세포 고정제, 프로테아제 억제제, 포스파타제 억제제, 단백질, DNA 또는 RNA 보존제로 처리된다. 일부 실시양태들에서, 혈액은 항응고제, 예컨대, EDTA 또는 헤파린을 함유하는 진공 채취 튜브를 이용함으로써 정맥천자를 통해 채취된다. 혈액은 헤파린-코팅된 주사기 및 피하 바늘을 이용함으로써 채취될 수도 있다. 혈액은 세포 배양에 유용할 성분과 조합될 수도 있다. 예를 들면, 일부 실시양태들에서, 혈액은 세포 배양 배지 또는 보충된 세포 배양 배지(예를 들면, 사이토카인)와 조합된다.
생물학적 샘플은 전혈, 혈청, 혈장, 소변, 간질액, 복막액, 자궁경부 면봉표본, 눈물, 타액, 협측 면봉표본, 피부, 뇌척수액, 또는 예를 들면, 뇌 조직을 포함하는 다른 조직을 포함하는, 당분야에서 공지된 다른 공급원으로부터 수득될 수도 있다.
소포(엑소좀, 미세입자, 미세소포, 나노좀, 세포외 소포 및 엑토좀)의 농축 또는 단리
샘플은 양성 선별, 음성 선별, 또는 양성 선별과 음성 선별의 병용을 통해 소포에 대해 농축될 수 있다. 일부 실시양태들에서, 소포는 직접적으로 포획된다. 다른 실시양태에서, 혈액 세포는 포획되고, 소포는 남은 생물학적 샘플로부터 수집된다. 일부 실시양태들에서, 생물학적 샘플에서 농축된 소포는 엑소좀, 미세입자, 미세소포, 나노좀, 세포외 소포 또는 엑토좀이다. 일부 실시양태들에서, 생물학적 샘플에서 농축된 소포는 신경-유래 엑소좀, 성상세포-유래 엑소좀, 희소돌기아교세포-유래 엑소좀 및 미세아교세포-유래 엑소좀이다.
샘플은 소포의 생화학적 성질에서의 차이에 근거하여 소포에 대해 농축될 수도 있다. 예를 들면, 샘플은 항원, 핵산, 대사, 유전자 발현 또는 후성적(epigenetic) 차이에 근거하여 소포에 대해 농축될 수 있다. 항원 차이에 근거한 실시양태들 중 일부에서, 유동 세포측정과 함께 자기장 구배 내의 항체-접합된 자성 또는 상자성 비드 또는 형광 표지된 항체가 이용된다. 핵산 차이에 근거한 실시양태들 중 일부에서, 유동 세포측정이 이용된다. 대사 차이에 근거한 실시양태들 중 일부에서, 유동 세포측정 또는 또 다른 분류 기술에 의해 측정되는 염료 섭취/배제가 이용된다. 유전자 발현에 근거한 실시양태들 중 일부에서, 사이토카인을 사용한 세포 배양이 이용된다. 샘플은 당분야에서 공지된 다른 생화학적 성질에 근거하여 소포에 대해 농축될 수도 있다. 예를 들면, 샘플은 pH 또는 이동성에 근거하여 소포에 대해 농축될 수 있다. 추가로, 일부 실시양태들에서, 하나 초과의 방법이 소포를 농축하는 데에 이용된다. 다른 실시양태에서, 샘플은 항체, 리간드 또는 가용성 수용체를 사용함으로써 소포에 대해 농축된다.
다른 실시양태에서, 표면 마커가 샘플에서 소포를 양성적으로 농축하는 데에 사용된다. 일부 실시양태들에서, 소포는 엑소좀, 미세입자, 미세소포, 나노좀, 세포외 소포 또는 엑토좀이다. 다른 실시양태에서, NCAM, CD171, CD9, CD63, CD81, 다양한 신경 또는 성상세포 부착 단백질들, 미세아교세포 CD18/11, 또는 CD3 T 세포 막 세포 표면 마커가 엑소좀을 농축하는 데에 사용된다. 일부 실시양태들에서, 소포 집단 상에서 발견되지 않는 세포 표면 마커는 세포 집단을 고갈시킴으로써 소포를 음성적으로 농축하는 데에 사용된다. 유동 세포측정 분류도 형광 표지에 접합된 세포 표면 마커 또는 세포내 또는 세포외 마커를 사용하여 엑소좀을 더 농축하는 데에 사용될 수 있다. 세포내 마커 및 세포외 마커는 소포에서 우선적으로 발현된 세포내 또는 세포외 단백질에 대한 핵 염료 또는 항체를 포함할 수 있다. 세포 표면 마커는 엑소좀 상에서 우선적으로 발현되는 세포 표면 항원(예를 들면, NCAM)에 대한 항체를 포함할 수 있다. 일부 실시양태들에서, 세포 표면 마커는 예를 들면, NCAM 또는 CD171을 포함하는 신경-유래 엑소좀 표면 마커이다. 일부 실시양태들에서, 단일클론 NCAM, CD9, CD63, CD81 또는 CD171 항체는 샘플로부터 엑소좀을 농축하거나 단리하는 데에 사용된다. 특정 양태에서, NCAM, CD9, CD63, CD81 또는 CD171 항체는 바이오티닐화된다. 이 실시양태에서, 바이오티닐화된 NCAM 또는 CD171 항체는 스트렙타비딘-아가로스 수지 또는 비드를 사용함으로써 후속적으로 단리될 수 있는 항체-엑소좀 복합체를 형성할 수 있다. 다른 실시양태에서, NCAM, CD9, CD63, CD81 또는 CD171 항체는 단일클론 항-인간 NCAM, CD9, CD63, CD81 또는 CD171 항체이다.
일부 실시양태들에서, 생물학적 샘플로부터 농축된 소포는 특정 유형의 소포에 대해 후속적으로 농축된다. 예를 들면, 생물학적 샘플은 엑소좀에 대해 농축되고, 그 후 농축된 엑소좀은 신경-유래 엑소좀에 대해 후속적으로 농축된다. 일부 실시양태들에서, 생물학적 샘플은 소포의 개별 신경 세포 공급원에 대해 농축된다. 특정 양태에서, 소포의 신경 세포 공급원은 미세아교세포, 신경 또는 성상세포이다.
다른 실시양태에서, 소포는 생물학적 샘플에 존재하는 소포가 제제에 결합하여 소포-제제 복합체를 형성하는 조건 하에서 상기 생물학적 샘플을 상기 제제와 접촉시키는 단계; 및 상기 소포를 상기 소포-제제 복합체로부터 단리하여 상기 소포를 함유하는 샘플을 수득하는 단계를 포함하는 방법에 의해 생물학적 샘플로부터 단리되거나 농축되고, 이때 상기 샘플에 존재하는 소포의 순도는 상기 생물학적 샘플에 존재하는 소포의 순도보다 더 크다. 특정 실시양태에서, 상기 제제는 항체 또는 렉틴이다. 소포-렉틴 복합체를 형성하는 데에 유용한 렉틴은 미국 특허출원 공개 제2012/0077263호에 기재되어 있다. 일부 실시양태들에서, 소포는 엑소좀, 미세입자, 미세소포, 나노좀, 세포외 소포 또는 엑토좀이다. 일부 실시양태들에서, 엑소좀은 신경-유래 엑소좀, 성상세포-유래 엑소좀, 희소돌기아교세포-유래 엑소좀 또는 미세아교세포-유래 엑소좀이다. 일부 실시양태들에서, 다수의 단리 또는 농축 단계들이 수행된다. 본 실시양태의 특정 양태에서, 제1 단리 단계는 혈액 샘플로부터 엑소좀을 단리하기 위해 수행되고, 제2 단리 단계는 다른 엑소좀으로부터 신경-유래 엑소좀을 단리하기 위해 수행된다. 다른 실시양태에서, 소포-제제 복합체의 소포 부분은 용해 시약을 사용함으로써 용해되고, 용해된 소포의 단백질 수준이 분석된다. 일부 실시양태들에서, 항체-소포 복합체는 고체상 상에서 생성된다. 다른 실시양태에서, 상기 방법은 항체-소포 복합체로부터 소포를 방출시키는 단계를 추가로 포함한다. 특정 실시양태에서, 고체상은 비-자성 비드, 자성 비드, 아가로스 또는 세파로스이다. 다른 실시양태에서, 소포는 항체-소포 복합체를 3.5 내지 1.5의 낮은 pH에 노출시킴으로써 방출된다. 다른 실시양태에서, 방출된 소포는 높은 pH 용액을 첨가함으로써 중화된다. 다른 실시양태에서, 방출된 소포는 방출된 소포를 용해 용액과 함께 항온처리함으로써 용해된다. 다른 실시양태에서, 용해 용액은 프로테아제 및 포스파타제에 대한 억제제를 함유한다.
신경퇴행성 장애
본 발명은 대상체에서 신경퇴행성 장애를 진단하거나 예후하거나, 신경퇴행성 장애의 위험에 있는 대상체를 확인하거나, 신경퇴행성 장애를 가진 대상체에서 치료 요법을 처방하거나 치료로부터의 이익을 예측하는 방법을 제공한다.
일부 실시양태들에서, 신경퇴행성 장애는 알쯔하이머병(AD), 혈관 질환 치매, 전두측두엽 치매(FTD), 피질기저 퇴행(CBD), 진행핵상마비(PSP), 루이소체 치매, 매듭-우세 노인성 치매, 픽병(PiD), 호은 과립 질환, 근위축성 측삭 경화증(ALS), 다른 운동 신경 질환, 괌 파킨슨증-치매 복합, FTDP-17, 라이티코-보디그병, 다발성 경화증, 외상성 뇌 손상(TBI) 및 파킨슨병으로 구성된 군으로부터 선택된다.
일부 실시양태들에서, 본 발명은 의사로 하여금 대상체에서 하나 이상의 신경퇴행성 장애를 진단하거나 예후하게 할 수 있다. 다른 실시양태에서, 본 발명은 의사로 하여금 진단 가능성으로서 하나 이상의 신경퇴행성 질환을 배제하거나 제거하게 할 수 있다. 다른 실시양태에서, 본 발명은 의사로 하여금 신경퇴행성 장애를 발생시킬 위험에 있는 대상체를 확인하게 할 수 있다. 다른 실시양태에서, 본 발명은 의사로 하여금 대상체가 신경퇴행성 장애를 나중에 발생시킬지를 예측하게 할 수 있다. 추가 실시양태에서, 본 발명은 의사로 하여금 신경퇴행성 장애를 가진 대상체에서 치료 요법을 처방하거나 치료로부터의 이익을 예측하게 할 수 있다.
바이오마커
바이오마커 수준은 신경퇴행성 장애(예를 들면, 알쯔하이머병)를 갖거나 가질 위험에 있는 대상체로부터 수득된 생물학적 샘플에서 분석된다. 일부 실시양태들에서, 바이오마커는 인산화된 Tau, Aβ1-42, TDP-43, α-시누클레인, SOD-1, FUS, FKBP51, IRS-1, 인산화된 IRS-1, CTSD, LAMP1, UBP, HSP70, NSE, NFL, CD9, CD63, CD81 및 CD171이다. 다른 실시양태에서, 인산화된 Tau는 하나 이상의 세린 잔기에서 인산화되어 있다. 본 실시양태의 특정 양태에서, 인산화된 Tau는 Ser-199, Ser-202, Ser-214, Ser-235, Ser-262, Ser-356, Ser-396 및 Ser-422로 구성된 군으로부터 선택된 하나 이상의 세린 잔기 상에서 인산화되어 있다. 다른 실시양태에서, 인산화된 Tau는 하나 이상의 쓰레오닌 잔기에서 인산화되어 있다. 본 실시양태의 특정 양태에서, 인산화된 Tau는 Thr-153, Thr-181, Thr-205 및 Thr-231로 구성된 군으로부터 선택된 하나 이상의 쓰레오닌 잔기 상에서 인산화되어 있다. 다른 실시양태에서, 인산화된 Tau는 하나 이상의 티로신 잔기에서 인산화되어 있다. 본 실시양태의 특정 양태에서, 인산화된 Tau는 Tyr18, Tyr29, Tyr197, Tyr310 및 Tyr394로 구성된 군으로부터 선택된 하나 이상의 티로신 잔기에서 인산화되어 있다. 다른 실시양태에서, 인산화된 Tau 수준은 하나 이상의 인산화 부위에 대한 항체를 사용함으로써 측정되거나 분석된다. 본 실시양태의 특정 양태에서, 본 발명에서 사용된 항체는 하기 인산화 부위들 중 하나 이상에서 인산화되어 있는 인산화된 Tau에 우선적으로 결합한다: Thr-153, Thr-181, Thr-205, Thr-231, Ser-199, Ser-202, Ser-214, Ser-235, Ser-262, Ser-356, Ser-396, Ser-422, Tyr18, Tyr29, Tyr197, Tyr310 및 Tyr394. 다른 실시양태에서, 인산화된 IRS-1은 P-S312-IRS-1 또는 P-panY-IRS-1이다.
일부 실시양태들에서, 본 발명의 바이오마커 수준은 바이오마커의 유전자 발현을 측정함으로써 측정된다. 특정 실시양태에서, 유전자 발현 변화는 표 1에 제시된 유전자들 중 하나 이상의 발현 수준을 측정함으로써 측정된다. 특정 양태에서, 바이오마커의 유전자 발현은 PCR, 마이크로어레이 또는 서열결정을 이용함으로써 측정된다. 일부 실시양태들에서, 바이오마커의 발현 수준은 바이오마커의 mRNA 또는 miRNA 수준을 측정함으로써 측정된다.
당분야에서 통상의 기술을 가진 자는 본 발명의 마커의 검출 및 분석을 위해 이용될 수 있는 여러 방법들 및 장치들을 알고 있다. 환자 시험 샘플 중의 폴리펩타이드 또는 단백질에 대하여, 면역분석 장치들 및 방법들이 종종 이용된다. 이 장치들 및 방법들은 다양한 샌드위치, 경쟁적 또는 비-경쟁적 분석 포맷들에서 표지된 분자를 이용하여 관심있는 분석물의 존재 또는 양과 관련되어 있는 신호를 생성할 수 있다. 추가로, 특정 방법들 및 장치들, 예컨대, 바이오센서 및 광학 면역분석이 표지된 분자에 대한 필요성 없이 분석물의 존재 또는 양을 측정하는 데에 이용될 수 있다.
다른 방법들(예를 들면, 마커 RNA 수준의 측정)이 당분야에서 숙련된 자에게 잘 공지되어 있지만, 바람직하게는 마커는 면역분석을 이용함으로써 분석된다. 마커의 존재 또는 양은 일반적으로 각각의 마커에 대해 특이적인 항체를 사용하고 특이적 결합을 검출함으로써 확인된다. 임의의 적합한 면역분석, 예를 들면, 효소-연결된 면역분석(ELISA), 방사면역분석(RIA), 경쟁 결합 분석, 평면 도파관(planar waveguide) 기술 등이 이용될 수 있다. 항체와 마커의 특이적 면역학적 결합은 직접적으로 또는 간접적으로 검출될 수 있다. 직접적인 표지는 항체에 부착된 형광 또는 발광 태그, 금속, 염료, 방사성핵종 등을 포함한다. 간접적인 표지는 당분야에서 잘 공지된 다양한 효소들, 예컨대, 알칼리성 포스파타제, 호스라디쉬 퍼록시다제 등을 포함한다.
마커에 대해 특이적인 고정된 항체의 사용도 본 발명에 의해 고려된다. 항체는 다양한 고체 지지체들, 예컨대, 자성 또는 크로마토그래피 매트릭스 입자, 분석 장소(예컨대, 마이크로타이터 웰)의 표면, 고체 기판 물질(예컨대, 플라스틱, 나일론, 종이)의 조각 등 상에 고정될 수 있다. 분석 스트립은 항체 또는 복수의 항체들을 고체 지지체 상에 어레이로 코팅함으로써 제조될 수 있다. 그 다음, 이 스트립은 검사 샘플 내로 침지된 후 세척 및 검출 단계를 통해 신속히 프로세싱되어 측정가능한 신호, 예컨대, 착색된 스폿(spot)을 생성할 수 있다.
복수의 마커들의 분석은 한 시험 샘플과 별도로 또는 동시에 수행될 수 있다. 여러 마커들이 다수의 샘플들의 효율적인 프로세싱을 위해 한 시험으로 조합될 수 있다. 또한, 당분야에서 숙련된 자는 동일한 개체로부터 (예를 들면, 연속적인 시점들에서) 다수의 샘플들을 시험할 가치를 인식할 것이다. 일련의 샘플들의 이러한 시험은 시간의 경과에 따라 마커 수준에서의 변화를 확인할 수 있게 할 것이다. 마커 수준에서의 증가 또는 감소뿐만 아니라 마커 수준에서의 변화의 부재도 사건(event) 시작으로부터의 대략적인 시간의 확인, 구조할 수 있는(salvageable) 조직의 존재 및 양, 약물 치료의 타당성, 다양한 치료들의 효과, 사건의 중증도의 확인, 질환 중증도의 확인, 및 장래 사건의 위험을 포함하는 환자의 결과의 확인을 포함하나 이들로 한정되지 않는, 질환 상태에 대한 유용한 정보를 제공할 것이다.
본 발명에서 언급된 마커들의 조합물로 구성된 분석을 구축하여 상이한 진단과 관련된 적절한 정보를 제공할 수 있다. 이러한 패널은 1개, 2개, 3개, 4개, 5개, 6개, 7개, 8개, 9개, 10개, 15개 또는 20개 이상의 개별 마커들을 사용함으로써 구축될 수 있다. 단일 마커, 또는 보다 더 큰 패널의 마커들을 포함하는 마커 서브세트의 분석을 본 발명 내에 기재된 방법에서 수행하여 다양한 임상적 상황들에서 임상적 민감성 또는 특이성을 최적화할 수 있다. P-S312-IRS-1과 P-panY-IRS-1의 비(R 또는 인슐린 내성 지수)를 이용하여 신경퇴행성 장애의 위험 또는 진단을 예측할 수 있다.
마커의 분석도 다양한 물리적 포맷들로 수행될 수 있다. 예를 들면, 마이크로타이터 플레이트 또는 자동화를 이용하여 많은 수의 시험 샘플들의 프로세싱을 용이하게 할 수 있다. 대안적으로, 단일 샘플 포맷을 개발하여 예를 들면, 외래 수송실 또는 응급실 환경에서 시기적절한 방식으로 즉각적인 치료 및 진단을 용이하게 할 수 있다. 특히 유용한 물리적 포맷은 복수의 상이한 분석물들의 검출을 위한 복수의 분리된 주소지정가능한(addressable) 위치들을 가진 표면을 포함한다. 이러한 포맷은 단백질 마이크로어레이, 또는 "단백질 칩" 및 모세관 장치를 포함한다.
본 발명의 바이오마커는 신경퇴행성 장애(예를 들면, 알쯔하이머병)의 초기 검출 및 모니터링에서 중요한 역할을 수행한다. 이러한 장애의 마커는 전형적으로 측정될 수 있는 신체 샘플에서 발견된 물질이다. 측정된 양은 기저 장애 또는 질환 병리생리학, 신경퇴행성 장애의 존재 또는 부재, 향후 신경퇴행성 장애의 가능성과 상관관계를 가질 수 있다. 그의 상태에 대해 치료를 받고 있는 환자에서 측정된 양은 치료에 대한 반응과도 상관관계를 가질 것이다.
일부 실시양태들에서, 바이오마커는 면역조직화학, 면역세포화학, 면역형광, 면역침전, 웨스턴 블롯팅 및 ELISA로 구성된 군으로부터 선택된 방법에 의해 측정된다.
임상적 분석 성능
본 발명의 방법은 대상체에서 신경퇴행성 장애를 진단하거나 예후하고/하거나, 신경퇴행성 장애의 위험에 있는 대상체를 확인하고/하거나, 신경퇴행성 장애를 가진 대상체에서 치료 요법을 처방하거나 치료로부터의 이익을 예측하기 위한 임상적 분석에서 이용될 수 있다. 임상적 분석 성능은 분석의 민감성, 특이성, ROC 곡선하면적(AUC), 정확도, 양성 예측 값(PPV) 및 음성 예측 값(NPV)을 측정함으로써 평가될 수 있다. 대상체에서 신경퇴행성 장애를 진단하거나 예후하거나, 신경퇴행성 장애의 위험에 있는 대상체를 확인하거나, 신경퇴행성 장애를 가진 대상체에서 치료 요법을 처방하거나 치료로부터의 이익을 예측하기 위한 분석이 본원에 개시되어 있다.
상기 분석의 임상적 성능은 민감성에 근거할 수 있다. 본 발명의 분석의 민감성은 적어도 약 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 99% 또는 100%일 수 있다. 상기 분석의 임상적 성능은 특이성에 근거할 수 있다. 본 발명의 분석의 특이성은 적어도 약 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 99% 또는 100%일 수 있다. 상기 분석의 임상적 성능은 ROC 곡선하면적(AUC)에 근거할 수 있다. 본 발명의 분석의 AUC는 적어도 약 0.5, 0.55, 0.6, 0.65, 0.7, 0.75, 0.8, 0.85, 0.9 또는 0.95일 수 있다. 상기 분석의 임상적 성능은 정확도에 근거할 수 있다. 본 발명의 분석의 정확도는 적어도 약 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 99% 또는 100%일 수 있다.
조성물
본 발명의 방법에서 유용한 조성물은 신경퇴행성 장애와 관련된 바이오마커를 특이적으로 인식하는 조성물을 포함하되, 상기 바이오마커는 인산화된 Tau, Aβ1-42, 인산화된 IRS, CTSD, LAMP1, UBP, HSP70, NSE, NFL, CD9, CD63, CD81 및 CD171이다. 일부 실시양태들에서, 상기 조성물은 하나 이상의 Tau 또는 IRS-1 포스파타제의 활성을 향상시킨다. 다른 실시양태에서, 상기 조성물은 하나 이상의 Tau 또는 IRS-1 키나제의 활성을 감소시킨다. 다른 실시양태에서, 상기 조성물은 펩타이드, 핵산, 항체 및 소분자로 구성된 군으로부터 선택된다.
특정 실시양태에서, 본 발명은 신경퇴행성 장애와 관련된 바이오마커를 특이적으로 검출하는 조성물에 관한 것이다. 본원의 다른 부분에 상세히 기재된 바와 같이, 본 발명은 인산화된 Tau, 인산화된 IRS-1, CTSD, LAMP1, UBP, HSP70, NSE 및 NFL이 AD 및 다른 신경퇴행성 장애에 대한 특이적 바이오마커라는 발견에 근거한다. 한 실시양태에서, 본 발명의 조성물은 인산화된 Tau에 특이적으로 결합하고 이를 검출한다. 한 실시양태에서, 본 발명의 조성물은 Tau 상의 하나 이상의 세린, 쓰레오닌 또는 티로신 잔기에서 인산화된 Tau에 특이적으로 결합하고 이를 검출한다. 일부 실시양태들에서, 본 발명의 조성물은 S396에서 인산화된 Tau(S396 Tau 인산화)에 특이적으로 결합한다. 일부 실시양태들에서, 본 발명의 조성물은 T181에서 인산화된 Tau(T181 Tau 인산화)에 특이적으로 결합한다. 다른 실시양태에서, 본 발명의 조성물은 Thr-153, Thr-181, Thr-205, Thr-231, Ser-199, Ser-202, Ser-214, Ser-235, Ser-262, Ser-356, Ser-396, Ser-422, Tyr18, Tyr29, Tyr197, Tyr310 및 Tyr394로 구성된 군으로부터 선택된 하나 이상의 잔기에서 인산화된 Tau에 특이적으로 결합한다. 본 발명의 조성물은 항체, 펩타이드, 소분자, 핵산 등을 포함할 수 있다. 다른 실시양태에서, 본 발명의 조성물은 인산화된 IRS-1에 특이적으로 결합하고 이를 검출한다. 한 실시양태에서, 본 발명의 조성물은 P-S312-IRS-1 또는 P-panY-IRS-1에 특이적으로 결합하고 이를 검출한다. 다른 실시양태에서, 본 발명의 조성물은 CTSD, LAMP1, UBP, HSP70, NSE, NFL, CD9, CD63, CD81 및 CD171에 특이적으로 결합하고 이를 검출한다.
일부 실시양태들에서, 조성물은 항체를 포함하되, 상기 항체는 본 발명의 바이오마커 또는 소포에 특이적으로 결합한다. 본원에서 사용되고 이하에 더 논의된 용어 "항체"는 바이오마커 또는 소포(예를 들면, 엑소좀)와도 특이적으로 반응하는 그의 단편을 포함하기 위한 것이다. 항체는 통상적인 기법을 이용함으로써 단편화될 수 있고, 단편은 전체 항체에 대해 전술된 바와 동일한 방식으로 유용성에 대해 스크리닝될 수 있다. 예를 들면, F(ab)2 단편은 항체를 펩신으로 처리함으로써 생성될 수 있다. 생성된 F(ab)2 단편은 다이설파이드 가교를 환원시켜 Fab 단편을 생성하도록 처리될 수 있다. 항원 결합 부분도 재조합 DNA 기법, 또는 온전한 항체의 효소적 또는 화학적 절단에 의해 생성될 수 있다. 항원 결합 부분은 특히 Fab, Fab', F(ab')2, Fv, dAb 및 상보성 결정 영역(CDR) 단편, 단일 쇄 항체(scFv), 단일 도메인 항체, 이중특이적 항체, 키메라 항체, 인간화된 항체, 디아바디, 및 특이적 항원 결합을 폴리펩타이드에 부여하기에 충분한 면역글로불린의 적어도 일부를 함유하는 폴리펩타이드를 포함한다. 특정 실시양태에서, 항체는 그에 부착되어 검출될 수 있는 표지(예를 들면, 표지는 방사성동위원소, 형광 화합물, 효소 또는 효소 보조인자일 수 있음)를 추가로 포함한다.
특정 실시양태에서, 본 발명의 항체는 단일클론 항체이고, 특정 실시양태에서 본 발명은 본 발명의 바이오마커 또는 엑소좀에 특이적으로 결합하는 신규 항체를 생성하는 방법을 이용가능하게 만든다. 예를 들면, 바이오마커 또는 엑소좀에 특이적으로 결합하는 단일클론 항체를 생성하는 방법은 바이오마커 또는 엑소좀, 또는 이의 단편을 포함하는 면역원성 조성물을, 검출가능한 면역 반응을 자극하기에 효과적인 양으로 마우스에게 투여하는 단계, 항체 생성 세포(예를 들면, 비장으로부터의 세포)를 마우스로부터 수득하고 상기 항체 생성 세포를 골수종 세포와 융합시켜 항체 생성 하이브리도마를 수득하는 단계, 및 상기 항체 생성 하이브리도마를 시험하여 바이오마커 또는 엑소좀에 특이적으로 결합하는 단일클론 항체를 생성하는 하이브리도마를 확인하는 단계를 포함할 수 있다. 일단 수득되면, 하이브리도마는 임의적으로 하이브리도마-유래 세포가 바이오마커 또는 엑소좀에 특이적으로 결합하는 단일클론 항체를 생성하는 배양 조건에서 세포 배양물에서 증식될 수 있다. 단일클론 항체는 세포 배양물로부터 정제될 수 있다.
항체의 언급에서 사용된 용어 "특이적으로 반응하는"은 당분야에서 일반적으로 이해되는 바와 같이 항체가 관심있는 항원(예를 들면, 바이오마커 또는 엑소좀)과 관심없는 다른 항원 사이에 충분히 선택적이라는 것을 의미하기 위한 것이다. 항체를 사용하는 특정 방법, 예컨대, 치료 적용에서, 결합에서의 보다 더 높은 특이성 정도가 바람직할 수 있다. 단일클론 항체는 일반적으로 (다중클론 항체에 비해) 원하는 항원과 교차반응 폴리펩타이드를 효과적으로 식별하는 보다 더 큰 경향을 가진다. 항체:항원 상호작용의 특이성에 영향을 미치는 한 특성은 항원에 대한 항체의 친화성이다. 원하는 특이성이 다양한 상이한 친화성으로 도달될 수 있지만, 일반적으로 바람직한 항체는 약 10-6, 10-7, 10-8 또는 10-9 이하의 친화성(해리 상수)을 가질 것이다.
항체는 예를 들면, 신경-유래 엑소좀, 인산화된 Tau, Aβ1-42, 인산화된 IRS-1, CTSD, LAMP1, UBP, HSP70, NSE, NFL, CD9, CD63, CD81 및 CD171을 포함하는, 본 발명의 엑소좀 또는 바이오마커의 에피토프에 특이적으로 결합하도록 생성될 수 있다.
추가로, 바람직한 항체를 확인하기 위해 항체를 스크리닝하는 데에 이용된 기법은 수득된 항체의 성질에 영향을 미칠 수 있다. 다양한 상이한 기법들이 항체와 항원 사이의 상호작용을 시험하여 특히 바람직한 항체를 확인하는 데에 이용될 수 있다. 이러한 기법들은 ELISA, 표면 플라스몬 공명 결합 분석(예를 들면, 비아코어(Biacore) 결합 분석, 비아코어 아베(Biacore AB)(스웨덴 업살라 소재)), 샌드위치 분석(예를 들면, 아이쥐이엔 인터내셔날 인코포레이티드(IGEN International, Inc.)(미국 메릴랜드주 게이더스버그 소재)의 상자성 비드 시스템), 웨스턴 블롯, 면역침전 분석, 면역세포화학 및 면역조직화학을 포함한다.
일부 실시양태들에서, 본 발명은 신경퇴행성 장애를 치료하거나 예방하는 데에 사용되는 조성물에 관한 것이다. 본원의 다른 곳에 상세히 기재된 바와 같이, 본 발명은 Tau 인산화가 다양한 신경퇴행성 장애들, 예를 들면, 알쯔하이머병의 병리와 연관되어 있다는 발견에 근거한다. 따라서, 한 실시양태에서, 본 발명은 Tau 인산화를 방해하는 조성물을 제공한다. 한 실시양태에서, 상기 조성물은 Tau 상의 하나 이상의 세린 잔기에서 Tau 인산화를 방해한다. 다른 실시양태에서, 상기 조성물은 Tau 상의 하나 이상의 쓰레오닌 잔기에서 Tau 인산화를 방해한다. 다른 실시양태에서, 상기 조성물은 Tau 상의 하나 이상의 티로신 잔기에서 Tau 인산화를 방해한다. 또 다른 실시양태에서, 본 발명은 Tau 인산화를 감소시키는 조성물을 제공한다. 한 실시양태에서, 상기 조성물은 Tau 상의 하나 이상의 세린, 쓰레오닌 및/또는 티로신 잔기에서 Tau 인산화를 감소시킨다. 다른 실시양태에서, 상기 조성물은 Thr-153, Thr-181, Thr-205, Thr-231, Ser-199, Ser-202, Ser-214, Ser-235, Ser-262, Ser-356, Ser-396, Ser-422, Tyr18, Tyr29, Tyr197, Tyr310 및 Tyr394로 구성된 군으로부터 선택된 하나 이상의 잔기에서 Tau 인산화를 감소시킨다.
일부 실시양태들에서, 본 발명은 신경퇴행성 장애를 치료하거나 예방하는 데에 사용되는 조성물에 관한 것이다. 본원의 다른 곳에 상세히 기재된 바와 같이, 본 발명은 IRS-1 인산화가 다양한 신경퇴행성 장애들, 예를 들면, 알쯔하이머병의 병리와 연관되어 있다는 발견에 근거한다. 따라서, 한 실시양태에서, 본 발명은 IRS-1 인산화를 방해하는 조성물을 제공한다. 또 다른 실시양태에서, 본 발명은 IRS-1 인산화를 감소시키는 조성물을 제공한다.
Tau 또는 IRS-1 인산화를 방해하고/하거나 감소시키는 데에 유용한 조성물은 단백질, 펩타이드, 핵산, 소분자 등을 포함한다.
치료 방법
본 발명은 유효량의 조성물을 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는, 상기 대상체에서 신경퇴행성 장애를 치료하는 방법으로서, 상기 조성물이 Tau 및/또는 IRS-1 인산화의 수준을 감소시키는, 방법을 제공한다. 다른 실시양태에서, 조성물은 하나 이상의 Tau 또는 IRS-1 포스파타제의 활성을 향상시킨다. 다른 실시양태에서, 조성물은 하나 이상의 Tau 또는 IRS-1 키나제(kinase)의 활성을 감소시킨다. 다른 실시양태에서, 조성물은 펩타이드, 핵산, 항체 및 소분자로 구성된 군으로부터 선택된다. 다른 실시양태에서, 본 발명은 유효량의 조성물을 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는, 상기 대상체에서 신경퇴행성 장애를 치료하는 방법으로서, 상기 조성물이 CTSD, LAMP1 또는 UBP의 수준을 감소시키는, 방법을 제공한다. 다른 실시양태에서, 본 발명은 유효량의 조성물을 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는, 상기 대상체에서 신경퇴행성 장애를 치료하는 방법으로서, 상기 조성물이 HSP70의 수준을 증가시키는, 방법을 제공한다. 다른 실시양태에서, 본 발명은 유효량의 조성물을 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는, 상기 대상체에서 신경퇴행성 장애를 치료하는 방법으로서, 상기 조성물이 인산화된 Tau, Aβ1-42, 인산화된 IRS-1, CTSD, LAMP1, UBP, HSP70, NSE NFL, CD9, CD63, CD81 및 CD171의 수준을 기준 수준으로 표준화하는, 방법을 제공한다.
키트
본 발명의 또 다른 양태는 대상체에서 신경퇴행성 장애를 검출하거나 모니터링하는 키트를 포괄한다. 상이한 성분들을 가진 다양한 키트들이 본 발명에 의해 고려된다. 일반적으로 말하면, 상기 키트는 대상체에서 하나 이상의 바이오마커를 정량하는 수단을 포함할 것이다. 또 다른 실시양태에서, 상기 키트는 생물학적 샘플을 수집하는 수단, 생물학적 샘플에서 하나 이상의 바이오마커를 정량하는 수단, 및 키트 내용물의 사용을 위한 설명서를 포함할 것이다. 특정 실시양태에서, 상기 키트는 생물학적 샘플에서 엑소좀을 농축하거나 단리하는 수단을 포함한다. 추가 양태에서, 엑소좀을 농축하거나 단리하는 수단은 생물학적 샘플로부터 엑소좀을 농축하거나 단리하기 위해 필요한 시약을 포함한다. 특정 양태에서, 상기 키트는 바이오마커의 양을 정량하는 수단을 포함한다. 추가 양태에서, 바이오마커의 양을 정량하는 수단은 바이오마커의 양을 검출하기 위해 필요한 시약을 포함한다.
Figure 112016047611392-pct00001
본원의 개시내용에 비추어 볼 때 당분야에서 통상의 기술을 가진 자는 본 발명의 이 실시양태들 및 다른 실시양태들을 용이하게 생각해낼 것이다.
실시예
본 발명은 본 발명을 오직 예시하기 위한 것인 하기 실시예들을 참조함으로써 더 이해될 것이다. 이 실시예들은 오직 특허청구된 본 발명을 예시하기 위해 제공된다. 본 발명은 단지 본 발명의 단일 양태들을 예시하기 위한 예시된 실시양태들에 의해 범위 면에서 한정되지 않는다. 기능적으로 균등한 임의의 방법이 본 발명의 범위 내에 있다. 본원에 기재된 변경 이외의 본 발명의 다양한 변경들이 상기 설명으로부터 당분야에서 숙련된 자에게 명확해질 것이다. 이러한 변경은 첨부된 청구범위 내에 속한다.
실시예 1: 알쯔하이머병을 가진 인간 대상체에서 신경-유래 혈청 엑소좀의 인산화된 Tau 및 Aβ1-42 수준
인산화된 Tau 및 Aβ1-42 단백질의 수준을 알쯔하이머병(AD)을 가진 인간 대상체에서 다음과 같이 분석하였다. 10 ㎖의 정맥혈을 대조군 대상체(n=20) 및 AD를 가진 대상체(n=20)로부터 채취하였다. AD 대상체가 인지적으로 온전하였을 때 제1 혈액 샘플을 채취하였다. AD 대상체가 거의 확실한 AD를 발생시킨 후에 제2 혈액 샘플을 채취하였다. AD의 진단은 표준 임상적 및 실험실 기준에 의해 확립되었다.
혈액 채취를 위해, 10 ㎖의 정맥혈을 각각의 대상체로부터 채취하고 45분 동안 37℃에서 유지하고 4℃에서 20분 동안 1,000xg에서 원심분리하여 -80℃에서 0.5 ㎖ 분취물로 저장하기 위한 혈청을 수득하였다. 그 다음, 0.5 ㎖의 각각의 혈청 샘플을, 권장된 농도의 2배 농도의 프로테아제 억제제 칵테일(로슈 어플라이드 사이언시스 인코포레이티드(Roche Applied Sciences, Inc.), 미국 인디애나주 인디애나폴리스 소재) 및 포스파타제 억제제 칵테일(피어스 홀트(Pierce Halt), 써모 사이언티픽 인코포레이티드(Thermo Scientific, Inc.), 미국 일리노이주 록포드 소재)을 함유하는 0.5 ㎖의 칼슘 및 마그네슘 무함유 둘베코 균형 염 용액(DBS)과 혼합하고 실온에서 15분 동안 항온처리하였다.
혈장의 경우, 0.5 ㎖의 샘플에 0.1 ㎖의 트롬보플라스틴-D(피셔 사이언티픽 인코포레이티드(Fisher Scientific, Inc.), 미국 일리노이주 하노버 파크 소재)를 첨가한 후, 30분 동안 실온에서 항온처리하고 5분 동안 1,500xg에서 원심분리하였다. 그 다음, 권장된 농도의 2.5배 농도의 프로테아제 및 포스파타제 억제제 칵테일을 함유하는 0.4 ㎖의 DBS를 각각의 상청액에 첨가하였다.
이 혈청 상청액 및 혈장 상청액을 252 ㎕의 엑소퀵(ExoQuick) 엑소좀 침전 용액(EXOQ; 시스템 바이오사이언시스 인코포레이티드(System Biosciences, Inc.), 미국 캘리포니아주 마운틴뷰 소재)과 철저히 혼합하고 혼합물을 4℃에서 1시간 동안 항온처리하였다. 생성된 엑소좀 현탁액을 4℃에서 30분 동안 1,500xg에서 원심분리하고, 상청액을 제거하고 엑소좀의 각각의 펠렛을, 프로테아제 및 포스파타제 억제제 칵테일을 가진 250 ㎕의 DBS에 재현탁하여 신경 공급원으로부터 엑소좀을 면역화학적으로 농축하였다. 그 다음, EZ-링크(Link) 설포-NHS-바이오틴 시스템(써모 사이언티픽 인코포레이티드)으로 이미 바이오티닐화되어 있는 2 ㎍의 마우스 항-인간 NCAM 항체(ERIC 1, sc-106, 산타 크루즈 바이오테크놀로지(Santa Cruz Biotechnology), 미국 캘리포니아주 산타 크루즈 소재)를 각각의 샘플에 첨가하였다. 4℃에서 2시간 후, 20 ㎕의 스트렙타비딘-아가로스 수지(써모 사이언티픽 인코포레이티드)를 각각의 샘플에 첨가한 후, 흔들면서 4℃에서 1시간 동안 항온처리하였다. 그 다음, 샘플을 4℃에서 10분 동안 200g에서 원심분리하고, 상청액을 제거하고, 각각의 펠렛을, 프로테아제 및 포스파타제 억제제 칵테일을 가진 250 ㎕의 ELISA 결합 완충제(시스템스 바이오사이언시스 인코포레이티드)에 재현탁하였다.
인간 정제된 재조합 CD81 항원(오리진 테크놀로지스 인코포레이티드(Origene Technologies, Inc.), 미국 메릴랜드주 록빌 소재), 인간 Aβ1-42, 총 인간 Tau 및 인간 인산화된 Tau [pS396](라이프 테크놀로지스(Life Technologies)/인비트로겐(Invitrogen), 미국 캘리포니아주 카마릴로 소재) 및 인간 인산화된 Tau [pT181](이노제네틱스 인코포레이티드(Innogenetics, Inc.), 미국 조지아주 알파레타 소재)로 항원을 확인하면서 인간 CD81에 대한 ELISA 키트(시스템스 바이오사이언시스 인코포레이티드 및 홀젤 다이아그노스티카(Holzel Diagnostika), 독일 쾰른 소재)를 공급자의 지시에 따라 사용하여 신경-유래 엑소좀 단백질을 정량하였다.
하기 표 2에 제시된 바와 같이, 신경-유래 혈청 엑소좀의 인산화된 Tau(pS396) 수준은 AD를 가진 대상체에서 대조군 대상체 혈청 엑소좀의 수준에 비해 유의하게 증가되었다. 유사하게, 혈청 엑소좀의 Aβ1-42 수준은 AD를 가진 대상체에서 대조군 수준에 비해 유의하게 증가되었다. 혈청 엑소좀의 총 Tau 수준은 AD 대상체와 대조군 대상체 사이에 유의하게 상이하지 않았다.
Figure 112016047611392-pct00002
이 결과는 Aβ1-42 및 인산화된 Tau의 신경-유래 혈청 엑소좀 수준이 AD를 가진 대상체를 확인하는 데에 유용하다는 것을 보여주었다. 이 결과는 본 발명의 방법 및 조성물이 알쯔하이머병 및 다른 신경퇴행성 장애를 진단하는 데에 유용하다는 것도 시사하였다.
일련의 제2 실험을 수행하여 초기 알쯔하이머병(즉, 최소 인지 손상, MCI) 및 후기 알쯔하이머병을 가진 인간 대상체에서 인산화된 Tau 및 Aβ1-42 단백질의 수준을 측정하였다. 초기 AD를 가진 대상체(n=10) 및 후기 AD를 가진 대상체(n=8)로부터 10 ㎖의 정맥혈을 채취하였다. 혈액 샘플을 전술된 바와 같이 프로세싱하고 전술된 ELISA 키트를 사용하여 Aβ1-42, Tau 및 인산화된 Tau에 대한 신경-유래 엑소좀 단백질 수준을 정량하였다.
하기 표 3에 제시된 바와 같이, 신경-유래 혈청 엑소좀 인산화된 Tau(pS396) 수준은 초기 AD 및 후기 AD에서 유사하였다. 혈청 엑소좀 Aβ1-42 수준도 초기 AD 및 후기 AD에서 유사하였다.
Figure 112016047611392-pct00003
이 결과는 Aβ1-42 및 인산화된 Tau의 신경-유래 혈청 엑소좀 수준이 초기 AD 또는 후기 AD를 가진 대상체를 확인하는 데에 유용하다는 것을 보여주었다. 이 결과는 본 발명의 방법 및 조성물이 알쯔하이머병 및 다른 신경퇴행성 장애를 진단하는 데에 유용하다는 것도 시사하였다.
실시예 2: 알쯔하이머병을 가진 인간 대상체에서 신경-유래 혈청 엑소좀의 인산화된 Tau 수준
알쯔하이머병(AD)을 가진 인간 대상체에서 인산화된 Tau 단백질의 신경-유래 엑소좀 수준을 다음과 같이 분석하였다. AD를 가진 인간 대상체로부터 혈액 샘플을 채취하고, 샘플이 신경-유래 엑소좀 농축 후에 하기 인산화된 Tau 단백질들에 대해 분석된다는 점을 제외하고 상기 실시예 1에 기재된 바와 같이 상기 혈액 샘플을 프로세싱하였다: pSer-199 Tau, pSer-202 Tau, pSer-214 Tau, pSer-235 Tau, pSer-262 Tau, pSer-356 Tau, pSer-422 Tau, pThr-153 Tau, pThr-181 Tau, pThr-205 Tau 또는 pThr-231 Tau.
신경-유래 엑소좀 인산화된 Tau 수준은 대조군 수준에 비해 유의하게 증가된다. 이 결과는 인산화된 Tau의 신경-유래 혈청 엑소좀 수준이 AD를 가진 대상체를 확인하는 데에 유용하다는 것을 보여준다. 이 결과는 본 발명의 방법 및 조성물이 알쯔하이머병 및 다른 신경퇴행성 장애를 진단하는 데에 유용하다는 것도 시사한다.
실시예 3: 다발성 경화증을 가진 인간 대상체에서 신경-유래 혈청 엑소좀 단백질 수준
다발성 경화증(MS)을 가진 인간 대상체에서 인산화된 Tau 단백질의 수준을 다음과 같이 분석한다. MS를 가진 인간 대상체로부터 혈액 샘플을 채취하고, 샘플이 신경-유래 엑소좀 농축 후에 하기 엑소좀 단백질들에 대해 분석된다는 점을 제외하고 상기 실시예 1에 기재된 바와 같이 상기 혈액 샘플을 프로세싱한다: pSer-199 Tau, pSer-202 Tau, pSer-214 Tau, pSer-235 Tau, pSer-262 Tau, pSer-356 Tau, pSer-396 Tau, pSer-422 Tau, pThr-153 Tau, pThr-181 Tau, pThr-205 Tau 또는 pThr-231 Tau.
신경-유래 엑소좀의 인산화된 Tau 수준은 대조군 수준에 비해 유의하게 증가된다. 이 결과는 인산화된 Tau의 신경-유래 혈청 엑소좀 수준이 MS를 가진 대상체를 확인하는 데에 유용하다는 것을 보여준다. 이 결과는 본 발명의 방법 및 조성물이 다발성 경화증 및 다른 신경퇴행성 장애를 진단하는 데에 유용하다는 것도 시사한다.
실시예 4: 전두측두엽 치매를 가진 인간 대상체에서 신경-유래 혈청 엑소좀 단백질 수준
전두측두엽 치매(FTD)를 가진 인간 대상체에서 인산화된 Tau 단백질의 수준을 다음과 같이 분석한다. FTD를 가진 인간 대상체로부터 혈액 샘플을 채취하고, 샘플이 신경-유래 엑소좀 농축 후에 하기 엑소좀 단백질들에 대해 분석된다는 점을 제외하고 상기 실시예 1에 기재된 바와 같이 상기 혈액 샘플을 프로세싱한다: pSer-199 Tau, pSer-202 Tau, pSer-214 Tau, pSer-235 Tau, pSer-262 Tau, pSer-356 Tau, pSer-396 Tau, pSer-422 Tau, pThr-153 Tau, pThr-181 Tau, pThr-205 Tau 또는 pThr-231 Tau.
신경-유래 엑소좀의 인산화된 Tau 수준은 대조군 수준에 비해 유의하게 증가된다. 이 결과는 인산화된 Tau의 신경-유래 혈청 엑소좀 수준이 FTD를 가진 대상체를 확인하는 데에 유용하다는 것을 보여준다. 이 결과는 본 발명의 방법 및 조성물이 전두측두엽 치매 및 다른 신경퇴행성 장애를 진단하는 데에 유용하다는 것도 시사한다.
실시예 5: 신경-유래 엑소좀의 단백질 수준은 인간 대상체에서 알쯔하이머병을 예측한다.
알쯔하이머병(AD)을 예측하기 위해(예를 들면, 알쯔하이머병을 발생시킬 위험에 있는 대상체를 확인하기 위해) 인간 대상체에서 인산화된 Tau 단백질의 신경-유래 엑소좀 수준을 다음과 같이 분석한다. AD의 진단 전(예를 들면, AD 발병 전) 및 알쯔하이머병의 진단 후에(예를 들면, 명확한 치매의 발생 후에) 인간 대상체로부터 혈액 샘플을 채취한다. 샘플이 신경-유래 엑소좀 농축 후에 하기 엑소좀 단백질들에 대해 분석된다는 점을 제외하고 상기 실시예 1에 기재된 바와 같이 혈액 샘플을 프로세싱한다: pSer-199 Tau, pSer-202 Tau, pSer-214 Tau, pSer-235 Tau, pSer-262 Tau, pSer-356 Tau, pSer-396 Tau, pSer-422 Tau, pThr-153 Tau, pThr-181 Tau, pThr-205 Tau 또는 pThr-231 Tau.
신경-유래 엑소좀의 인산화된 Tau 수준은 AD 진단 전 및 후에 채취된 혈액 샘플에서 대조군 수준에 비해 유의하게 증가되어 있다(즉, AD 발병 전 및 명백한 치매 발생 후에 증가된 신경-유래 엑소좀의 인산화된 Tau 수준). 이 결과는 인산화된 Tau의 신경-유래 혈청 엑소좀 수준이, 대상체가 AD를 발생시킬지를 예측하는 데에 유용하다는 것을 보여준다. 이 결과는 본 발명의 방법 및 조성물이 알쯔하이머병 및 다른 신경퇴행성 장애를 예후하고 진단하는 데에 유용하다는 것도 시사한다.
실시예 6: 신경-유래 혈청 엑소좀의 인산화된 Tau, 총 Tau 및 Aβ1 -42 수준이 알쯔하이머병을 가진 인간 대상체에서 증가된다 .
알쯔하이머병(AD)을 가진 인간 대상체에서 총 Tau, 인산화된 Tau(P-T181 및 P-S396) 및 Aβ1-42 단백질 수준의 엑소좀 수준을 다음과 같이 분석하였다. AD를 가진 대상체(n=57) 및 대조군 대상체(n=57)로부터 10 ㎖의 정맥혈을 채취하였다. 혈액 샘플을 프로세싱하고 엑소좀을 상기 실시예 1에 기재된 바와 같이 단리하였다.
인간 정제된 CD81 항원(오리진 테크놀로지스 인코포레이티드, 미국 메릴랜드주 록빌 소재)을 사용하여 CD81 항원 표준 곡선을 확인하면서 인간 Aβ1-42, 인간 총 Tau 및 인간 P-S396-Tau(라이프 테크놀로지스/인비트로겐, 미국 캘리포니아주 카마릴로 소재), 인간 P-T181-Tau(퓨지레바이오 유에스 인코포레이티드의 이노제네틱스 디비젼(Innogenetics Division of Fujirebio US, Inc.), 미국 조지아주 알파레타 소재) 및 인간 CD81(홀젤 다이아그노스티카-쿠사바이오(Holzel Diagnostika-Cusabio), 독일 쾰른 소재)에 대한 ELISA 키트로 공급자의 지시에 따라 엑소좀 단백질을 정량하였다.
AD 대상체를 대조군 대상체와 비교하기 위해 별도의 식별 분류자 분석을 수행하여 최상의 단순 회귀 모델을 정의하였다. 2회 식별 분석은 모든 변수들을 고려하였고 단계적으로 수행되었다. 최종 모델은 입력하기 위한 3.84의 최소 부분 F 및 제거하기 위한 2.71의 최소 부분 F를 가진 변수만을 보유하였다. 사전 확률은 모든 군들에 대해 동등한 것으로서 간주되었다. 피셔 함수 계수 및 군내 공변량을 계산하였다. 면적의 표준 오차에 대한 비-모수적 분포 가정 하에서 수신자 조작 특성(Receiver operating characteristics)(ROC) 분석을 수행하여, 대조군 대상체로부터 AD 대상체를 식별하는 상기 모델의 성능을 측정하였다. 식별 분석 및 ROC 분석을 SPSS v21.0(IBM)으로 수행하였다.
하기 표 4에 제시된 바와 같이, 신경-유래 혈청 엑소좀의 총 Tau, P-T181-Tau, P-S396-Tau 및 Aβ1-42 수준은 AD를 가진 대상체에서 대조군 대상체 혈청 엑소좀 수준에 비해 유의하게 증가되었다.
Figure 112016047611392-pct00004
단계적 식별 분석은 0.229의 윌크스 람다(Wilk's Lambda) 및 119의 정확 F를 생성한, P-T181-Tau, P-S396-Tau 및 Aβ1-42를 점진적으로 도입하되, 총 Tau를 점진적으로 도입하지 않는 모델을 생성하였다(p < 0.001). 최종 모델은 96.4%의 AD 환자를 정확하게 분류하였다. ROC 분석으로부터의 최종 모델에 대한 곡선하면적(AUC)은 0.999이었고, 개별 단백질에 대한 개별 AUC 값은 P-T181-Tau, P-S396-Tau, Aβ1-42 및 총 Tau에 대해 각각 0.991, 0.988, 0.987 및 0.731이었다.
이 결과는 총 Tau, P-T181-Tau, P-S396-Tau 및 Aβ1-42의 신경-유래 혈청 엑소좀 수준이 알쯔하이머병을 가진 대상체에서 증가되고 알쯔하이머병을 가진 대상체를 확인하는 데에 유용하다는 것을 보여주었다. 이 결과는 본 발명의 분석 및 방법이 알쯔하이머병을 가진 대상체를 정확히 분류하였다는 것도 보여주었다. 이 결과는 본 발명의 방법 및 조성물이 알쯔하이머병 및 다른 신경퇴행성 장애를 진단하는 데에 유용하다는 것도 시사하였다.
실시예 7: 신경-유래 혈청 엑소좀의 인산화된 Tau, 총 Tau 및 Aβ1 -42 수준은 전두측두엽 질환을 가진 인간 대상체에서 증가된다 .
전두측두엽 질환(FTD)을 가진 인간 대상체에서 총 Tau, 인산화된 Tau(P-T181 및 P-S396) 및 Aβ1-42 단백질 수준의 엑소좀 수준을 다음과 같이 분석하였다. FTD를 가진 대상체(n=16) 및 대조군 대상체(n=16)로부터 10 ㎖의 정맥혈을 채취하였다. 혈액 샘플을 프로세싱하고 엑소좀을 상기 실시예 1에 기재된 바와 같이 단리하였다.
인간 정제된 재조합 CD81 항원(오리진 테크놀로지스 인코포레이티드, 미국 메릴랜드주 록빌 소재)을 사용하여 CD81 항원 표준 곡선을 확인하면서 인간 Aβ1-42, 인간 총 Tau 및 인간 P-S396-Tau(라이프 테크놀로지스/인비트로겐, 미국 캘리포니아주 카마릴로 소재), 인간 P-T181-Tau(퓨지레바이오 유에스 인코포레이티드의 이노제네틱스 디비젼, 미국 조지아주 알파레타 소재) 및 인간 CD81(홀젤 다이아그노스티카-쿠사바이오, 독일 쾰른 소재)에 대한 ELISA 키트로 공급자의 지시에 따라 엑소좀 단백질을 정량하였다.
FTD 대상체를 대조군 대상체와 비교하기 위해 별도의 식별 분류자 분석을 수행하여 최상의 단순 회귀 모델을 정의하였다. 2회 식별 분석은 모든 변수들을 고려하였고 단계적으로 수행되었다. 최종 모델은 입력하기 위한 3.84의 최소 부분 F 및 제거하기 위한 2.71의 최소 부분 F를 가진 변수만을 보유하였다. 사전 확률은 모든 군들에 대해 동등한 것으로서 간주되었다. 피셔 함수 계수 및 군내 공변량을 계산하였다. 면적의 표준 오차에 대한 비-모수적 분포 가정 하에서 수신자 조작 특성(ROC) 분석을 수행하여, 대조군 대상체로부터 FTD 대상체를 식별하는 상기 모델의 성능을 측정하였다. 식별 분석 및 ROC 분석을 SPSS v21.0(IBM)으로 수행하였다.
하기 표 5에 제시된 바와 같이, 신경-유래 혈청 엑소좀 P-T181-Tau 및 Aβ1-42 수준은 FTD를 가진 대상체에서 대조군 대상체 혈청 엑소좀 수준에 비해 유의하게 증가되었다.
Figure 112016047611392-pct00005
단계적 식별 분석에서, P-T181-Tau는 0.324의 윌크스 람다 값 및 62.5의 정확 F를 달성하였다(p < 0.001). 최종 모델에서, 엑소좀 P-T181-Tau는 대조군 대상체와 대비된 87.5%의 FTD 환자를 정확하게 분류하였다(75%의 FTD 및 100%의 대조군). ROC 분석으로부터의 최종 모델의 경우, P-T181-Tau에 대한 AUC는 0.992이었고 Aβ1-42에 대한 AUC는 0.969이었다.
이 결과는 P-T181-Tau 및 Aβ1-42의 신경-유래 혈청 엑소좀 수준이 전두측두엽 질환을 가진 대상체에서 증가되고 전두측두엽 질환을 가진 대상체를 확인하는 데에 유용하다는 것을 보여주었다. 이 결과는 본 발명의 분석 및 방법이 전두측두엽 질환을 가진 대상체를 정확하게 분류하였다는 것도 보여주었다. 이 결과는 본 발명의 방법 및 조성물이 전두측두엽 질환 및 다른 신경퇴행성 장애를 진단하는 데에 유용하다는 것도 시사하였다.
실시예 8: 신경-유래 혈청 엑소좀의 인산화된 Tau 및 Aβ1-42 수준은 인간 대상체에서 알쯔하이머병의 발생을 예측한다.
인간 대상체에서 총 Tau, 인산화된 Tau(P-T181 및 P-S396) 및 Aβ1-42 단백질 수준의 엑소좀 수준을 다음과 같이 분석하였다. 하기 2개의 시점들에서 대상체들(n=24)로부터 10 ㎖의 정맥혈을 채취하였다: 제1 시점 - 대상체의 알쯔하이머병 진단 전(알쯔하이머의 임상전, AP) 1년 내지 10년, 및 제2 시점 - 알쯔하이머병(AD)의 최초 진단 시. 대조군 대상체들(n=24)로부터도 정맥혈 샘플을 채취하였다. 혈액 샘플을 프로세싱하고 엑소좀을 상기 실시예 1에 기재된 바와 같이 단리하였다.
인간 정제된 재조합 CD81 항원(오리진 테크놀로지스 인코포레이티드, 미국 메릴랜드주 록빌 소재)을 사용하여 CD81 항원 표준 곡선을 확인하면서 인간 Aβ1-42, 인간 총 Tau 및 인간 P-S396-Tau(라이프 테크놀로지스/인비트로겐, 미국 캘리포니아주 카마릴로 소재), 인간 P-T181-Tau(퓨지레바이오 유에스 인코포레이티드의 이노제네틱스 디비젼, 미국 조지아주 알파레타 소재) 및 인간 CD81(홀젤 다이아그노스티카-쿠사바이오, 독일 쾰른 소재)에 대한 ELISA 키트로 공급자의 지시에 따라 엑소좀 단백질을 정량하였다.
하기 표 6에 제시된 바와 같이, 신경-유래 혈청 엑소좀 P-T181-Tau, P-S396-Tau 및 Aβ1-42 수준은 AD를 가진 대상체에서 대조군 대상체 혈청 엑소좀 수준에 비해 유의하게 증가되었다. 추가로, 신경-유래 혈청 엑소좀 P-T181-Tau 및 P-S396-Tau 수준은 AD의 임상적 진단 전 10년만큼 이른 시기에 대상체에서 유의하게 증가되었다(표 6 참조). Aβ1-42의 경우, AD 군 및 AP 군 둘 다에 대한 평균 수준은 대조군 대상체 수준보다 유의하게 더 높았고, 평균 AD 수준도 AP 군보다 유의하게 더 높았다(표 6 참조).
Figure 112016047611392-pct00006
이 결과는 P-T181-Tau, P-S396-Tau 및 Aβ1-42의 신경-유래 혈청 엑소좀 수준이 알쯔하이머병을 가진 대상체에서 증가되고 알쯔하이머병을 가진 대상체를 확인하는 데에 유용하다는 것을 보여주었다. 이 결과는 P-T181-Tau, P-S396-Tau 및 Aβ1-42의 신경-유래 혈청 엑소좀 수준이 알쯔하이머병의 임상적 진단 전 10년만큼 이른 시기에 대상체에서 증가된다는 것도 보여주었다. 이 결과는 본 발명의 분석 및 방법이 신경퇴행성 장애(예를 들면, 알쯔하이머병)의 위험에 있는 대상체를 확인하는 데에 유용하다는 것도 보여주었다. 추가로, 이 결과는 본 발명의 분석 및 방법이 알쯔하이머병의 초기 검출 및 진행 확인에 유용할 수 있다는 것을 보여주었다. 이 결과는 본 발명의 방법 및 조성물이 알쯔하이머병 및 다른 신경퇴행성 장애를 진단하는 데에 유용하다는 것도 시사하였다.
실시예 9: 신경퇴행성 장애 또는 당뇨병을 가진 인간 대상체에서 신경-유래 혈장 엑소좀 총 IRS-1 및 인산화된 IRS-1 수준
인간 대상체에서 총 IRS-1 및 인산화된 IRS-1(P-S312-IRS-1 및 P-panY-IRS-1) 단백질 수준의 엑소좀 수준을 다음과 같이 분석하였다. AD를 가진 26명의 대상체들, 2형 진성당뇨병(DM2)을 가진 20명의 대상체들, FTD를 가진 16명의 대상체들 및 일치된 대조군 대상체들로부터 30 ㎖의 정맥혈을 채취하였다. 혈액 샘플을 실온에서 10분 동안 항온처리하고 1,500g에서 15분 동안 원심분리하였다. 혈장을 흡입하고 -80℃에서 분취물로 저장하였다.
0.5 ㎖의 혈장을 1시간 동안 실온에서 0.15 ㎖의 트롬보플라스틴-D(피셔 사이언티픽 인코포레이티드, 미국 일리노이주 하노버 파크 소재)와 함께 항온처리한 후, 제안된 최종 농도의 3배 최종 농도의 프로테아제 억제제 칵테일(로슈 어플라이드 사이언시스 인코포레이티드, 미국 인디애나주 인디애나폴리스 소재) 및 포스파타제 억제제 칵테일(피어스 홀트, 써모 사이언티픽 인코포레이티드, 미국 일리노이주 록포드 소재)을 가진 0.35 ㎖의 칼슘 및 마그네슘 무함유 둘베코 균형(Dulbecco's balanced) 염 용액(DBS-2)을 첨가하였다. 20분 동안 1,500g에서 원심분리한 후, 상청액을 252 ㎕의 엑소퀵 엑소좀 침전 용액(EXOQ; 시스템 바이오사이언시스 인코포레이티드, 미국 캘리포니아주 마운틴뷰 소재)과 혼합하고 4℃에서 1시간 동안 항온처리하였다. 생성된 엑소좀 현탁액을 4℃에서 30분 동안 1,500g에서 원심분리하였고, 신경 공급원으로부터 엑소좀을 면역화학적으로 농축하기 전에 -80℃ 동결-해동 주기 후에 볼텍스-혼합함으로써 억제제 칵테일을 가진 250 ㎕의 증류수에 각각의 펠렛을 재현탁하였다.
각각의 샘플을 50 ㎕의 3% BSA(PBS 중의 차단제 BSA 10% 용액의 1:3.33 희석액, 써모 사이언티픽 인코포레이티드) 중의 1 ㎍ 마우스 항-인간 CD171(L1CAM 신경 부착 단백질) 바이오티닐화된 항체(클론 5G3, 이바이오사이언스(eBioscience), 미국 캘리포니아주 샌 디에고 소재)와 함께 4℃에서 1시간 동안 항온처리하고 4℃에서 30분 동안 항온처리하였다. 4℃에서 10분 동안 200g에서 원심분리하고 상청액을 제거한 후, 1 M 트라이스-HCl(pH 8.6)로 pH 8.0까지 조절되고 프로테아제 및 포스파타제 억제제 칵테일을 함유하는 0.5 ㎖의 M-PER 포유동물 단백질 추출 시약(써모 사이언티픽 인코포레이티드)에 각각의 펠렛을 재현탁하였다. 이 현탁액들을 20분 동안 37℃에서 항온처리하고 ELISA에서 사용할 때까지 -80℃에서 저장하기 전에 15초 동안 볼텍스-혼합하였다.
인간 정제된 재조합 CD81 항원(오리진 테크놀로지스 인코포레이티드, 미국 메릴랜드주 록빌 소재)을 사용하여 CD81 항원 표준 곡선을 확인하면서 인간 P-S312-IRS-1(라이프 테크놀로지스 코포레이션(Life Technologies Corp.), 미국 캘리포니아주 칼스바드 소재), 인간 P-panY-IRS-1(셀 시그날링 테크놀로지(Cell Signaling Technology), 미국 매사추세츠주 댄버스 소재), 인간 총 IRS-1(암스바이오 엘엘씨(AMSBIO, LLC), 미국 매사추세츠주 캠브리지 소재) 및 테트라스패닝(tetraspanning) 엑소좀 마커 인간 CD81(홀젤 다이아그노스티카-쿠사바이오, 독일 쾰른 소재)에 대한 ELISA 키트로 공급자의 지시에 따라 엑소좀 단백질을 정량하였다. 각각의 분석 군에서 CD81의 모든 측정에 대한 평균 값을 1.00으로 설정하였고, 각각의 샘플에 대한 상대적인 값을 사용하여 그들의 회수를 표준화하였다. 인슐린 내성 지수인 R은 P-S312-IRS-1과 P-panY-IRS-1의 비로서 정의되었다.
해석(그래프패드 프리즘(GraphPad Prism) 6, 미국 캘리포니아주 라 졸라 소재)에서의 본페로니(Bonferroni) 보정을 포함하는 비대응 t 검정으로 AD, FTD 또는 DM2를 가진 환자에 대한 군 평균들 사이의 차이의 통계학적 유의성, 및 각각의 환자 군과 그들 각각의 일치된 대조군 사이의 차이의 통계학적 유의성을 측정하였다. 군 AD와 그의 대조군(AC)을 비교하고 FTD와 그의 대조군(FTC)을 비교하고 DM2와 그의 대조군(DC)을 비교하기 위해 별도의 식별 분류자 분석을 수행하여 최상의 단순 회귀 모델을 정의하였다. 식별 분석을 윌크스의 람다 방법으로 단계적으로 수행하였다. 각각의 단계에서, 입력하기 위한 3.84의 최소 부분 F 및 제거하기 위한 2.71의 최소 부분 F를 가진 변수만이 보유되었다. 사전 확률은 모든 군들에 대해 동등한 것으로서 간주되었다. 피셔 함수 계수 및 군내 공변량도 계산하였다. 면적의 표준 오차에 대한 비-모수적 분포 가정 하에서 수신자 조작 특성(ROC) 분석을 수행하여, AC로부터 AD를 식별하고 FTC로부터 FTD를 식별하고 DC로부터 DM2를 식별하고 DM2 및 FTD로부터 AD를 식별하는 상기 모델의 성능을 측정하였다. 식별 분석 및 ROC 분석을 SPSS v21.0(IBM)으로 수행하였다. AD 환자에서의 CSF 바이오마커와 신경에서 농축된 엑소좀에서의 IRS-1 단백질 사이의 연관성의 유의성을 평가하기 위해, 본 발명자들은 0차 피어슨(Pearson) 상관관계 및 부분 상관관계(연령 및 성별을 조절하기 위함)를 계산하였다. 세로축 분석을 위해, MCI 또는 치매의 발병 전 및 후에 수득된 AD 환자에 대한 일련의 값들 사이의 차이의 유의성을 대응 t 검정(그래프패드)으로 계산하였다.
하기 표 7에 제시된 바와 같이, 신경-유래 혈청 엑소좀 P-S312-IRS-1 수준은 AD, DM2 및 FTD를 가진 대상체들에서 그들 각각의 대조군 대상체 혈청 엑소좀 수준에 비해 유의하게 증가되었다. 인슐린 내성 지수(R)의 비는 AD, DM2 및 FTD를 가진 대상체들에서 그들 각각의 대조군에 비해 유의하게 증가되었다(표 7 참조). P-panY-IRS-1의 경우, AD 군 및 DM2 군 둘 다에 대한 평균 수준은 대조군 대상체 수준보다 유의하게 더 높았다(표 7 참조).
Figure 112016047611392-pct00007
AD 및 AC 데이터의 단계적 식별 분석은 첫 번째로 P-panY-IRS-1을 도입하고 두 번째로 P-S312-IRS-1을 도입한 모델을 생성하였다. 최종 모델은 0.105의 윌크스 람다 및 207.9의 정확 F를 달성하였고(p < 0.001), 100%의 AD 환자 및 AC 대상체를 정확하게 분류하였다. AD 군 및 AC 군의 분류의 ROC 분석에서, 최종 모델로부터의 개별 대상체 점수는 1의 곡선하면적(AUC)을 달성하였다(점근 유의성 < 0.001). 총 IRS-1, P-S312-IRS-1 및 P-panY-IRS-1에 대한 AUC 값은 각각 0.722, 0.862 및 0.999이었다. DC로부터 DM2를 식별한 데이터의 단계적 식별 분석은 첫 번째로 P-panY-IRS-1을 도입하고 두 번째로 P-S312-IRS-1을 도입한 모델을 생성하였다. 최종 모델은 0.168의 윌크스 람다 및 91.8의 정확 F를 달성하였고(p < 0.001), 97.5%의 DM2 환자 및 DC 대상체를 정확하게 분류하였다. DM2 군 및 DC 군의 분류의 ROC 분석에서, 최종 모델로부터의 개별 대상체 점수는 1의 AUC를 달성하였다. P-panY-IRS-1 및 P-S312-IRS-1에 대한 AUC 값은 각각 0.741(점근 유의성 = 0.009) 및 0.999(점근 유의성 < 0.001)이었다. FTC로부터 FTD를 식별한 데이터의 단계적 식별 분석은 P-S312-IRS-1을 도입한 모델을 생성하였다. 최종 모델은 0.576의 윌크스 람다 및 22.1의 정확 F를 달성하였고(p < 0.001), 84%의 FTD 환자 및 FTC 대상체를 정확하게 분류하였다. FTD 및 FTC 군의 분류의 ROC 분석에서, P-S312-IRS-1은 0.928의 AUC를 달성하였다(점근 유의성 < 0.001).
이 결과는 P-S312-IRS-1 및 P-panY-IRS-1의 신경-유래 혈청 엑소좀 수준, 및 인슐린 내성 지수의 비(R)가 AD, DM2 및 FTD를 가진 대상체들에서 증가되고 AD, DM2 및 FTD를 가진 대상체들을 확인하는 데에 유용하다는 것을 보여주었다. 이 결과는 본 발명의 방법 및 조성물이 알쯔하이머병, 당뇨병, 전두측두엽 치매 및 다른 신경퇴행성 장애를 진단하는 데에 유용하다는 것도 시사하였다.
실시예 10: 신경-유래 혈청 엑소좀의 인산화된 IRS-1 수준 및 인슐린 내성 지수는 인간 대상체에서 알쯔하이머병의 발생을 예측한다.
인간 대상체에서 총 IRS-1 및 인산화된 IRS-1(P-S312-IRS-1 및 P-panY-IRS-1) 단백질 수준의 엑소좀 수준을 다음과 같이 분석하였다. 하기 2개의 시점들에서 대상체들(n=22)로부터 10 ㎖의 정맥혈을 채취하였다: 제1 시점 - 대상체의 알쯔하이머병 진단 전(알쯔하이머의 임상전, AP) 1년 내지 10년, 및 제2 시점 - 알쯔하이머병(AD)의 최초 진단 시. 대조군 대상체들(n=22)로부터도 정맥혈 샘플을 채취하였다. 혈액 샘플을 프로세싱하고 엑소좀을 상기 실시예 9에 기재된 바와 같이 단리하였다.
하기 표 8에 제시된 바와 같이, 신경-유래 혈청 엑소좀 P-S312-IRS-1, P-panY-IRS-1 및 R은 AD를 가진 대상체에서 대조군 대상체 혈청 엑소좀 수준에 비해 유의하게 증가되었다. 추가로, 신경-유래 혈청 엑소좀 P-S312-IRS-1, P-panY-IRS-1 및 R은 AD의 임상적 진단 전 10년만큼 이른 시기에 대상체에서 유의하게 증가되었다(표 8 참조).
Figure 112016047611392-pct00008
이 결과는 P-S312-IRS-1, P-panY-IRS-1 및 R의 신경-유래 혈청 엑소좀 수준이 알쯔하이머병을 가진 대상체에서 증가되고 알쯔하이머병을 가진 대상체를 확인하는 데에 유용하다는 것을 보여주었다. 이 결과는 P-S312-IRS-1, P-panY-IRS-1 및 R의 신경-유래 혈청 엑소좀 수준이 알쯔하이머병의 임상적 진단 전 10년만큼 이른 시기에 대상체에서 증가된다는 것도 보여주었다. 이 결과는 본 발명의 분석 및 방법이 신경퇴행성 장애(예를 들면, 알쯔하이머병)의 위험에 있는 대상체를 확인하는 데에 유용하다는 것도 보여주었다. 추가로, 이 결과는 본 발명의 분석 및 방법이 알쯔하이머병의 초기 검출 및 진행 확인에 유용할 수 있다는 것을 보여주었다. 이 결과는 본 발명의 방법 및 조성물이 알쯔하이머병 및 다른 신경퇴행성 장애를 진단하는 데에 유용하다는 것도 시사하였다.
실시예 11: 신경퇴행성 장애를 가진 인간 대상체에서 신경-유래 혈장 엑소좀 단백질 수준
카텝신 D(CTSD), 1형 라이소좀-관련 막 단백질(LAMP1), 유비퀴티닐화된 단백질(UBP) 및 열충격 단백질 70(HSP70) 수준의 엑소좀 수준을 인간 대상체에서 다음과 같이 분석하였다. 알쯔하이머병(AD)을 가진 26명의 대상체들, 전두측두엽 치매(FTD)를 가진 16명의 대상체들 및 일치된 대조군 대상체들(알쯔하이머의 대조군 - AC 및 전두측두엽 치매 대조군 - FTC)로부터 30 ㎖의 정맥혈을 채취하였다. 혈액 샘플을 실온에서 10분 동안 항온처리하고 1,500g에서 15분 동안 원심분리하였다. 혈장을 흡입하고 -80℃에서 분취물로 저장하였다.
0.5 ㎖의 혈장을 1시간 동안 실온에서 0.15 ㎖의 트롬보플라스틴-D(피셔 사이언티픽 인코포레이티드, 미국 일리노이주 하노버 파크 소재)와 함께 항온처리한 후, 제안된 최종 농도의 3배 최종 농도의 프로테아제 억제제 칵테일(로슈 어플라이드 사이언시스 인코포레이티드, 미국 인디애나주 인디애나폴리스 소재) 및 포스파타제 억제제 칵테일(피어스 홀트, 써모 사이언티픽 인코포레이티드, 미국 일리노이주 록포드 소재)을 가진 0.35 ㎖의 칼슘 및 마그네슘 무함유 둘베코 균형 염 용액(DBS-2)을 첨가하였다. 20분 동안 1,500g에서 원심분리한 후, 상청액을 252 ㎕의 엑소퀵 엑소좀 침전 용액(EXOQ; 시스템 바이오사이언시스 인코포레이티드, 미국 캘리포니아주 마운틴뷰 소재)과 혼합하고 4℃에서 1시간 동안 항온처리하였다. 생성된 엑소좀 현탁액을 4℃에서 30분 동안 1,500g에서 원심분리하였고, 신경 공급원으로부터 엑소좀을 면역화학적으로 농축하기 전에 -80℃ 동결-해동 주기 후에 볼텍스-혼합함으로써 억제제 칵테일을 가진 250 ㎕의 증류수에 각각의 펠렛을 재현탁하였다.
각각의 샘플을 50 ㎕의 3% BSA(PBS 중의 차단제 BSA 10% 용액의 1:3.33 희석액, 써모 사이언티픽 인코포레이티드) 중의 1 ㎍ 마우스 항-인간 CD171(L1CAM 신경 부착 단백질) 바이오티닐화된 항체(클론 5G3, 이바이오사이언스, 미국 캘리포니아주 샌 디에고 소재)와 함께 4℃에서 1시간 동안 항온처리하고 4℃에서 30분 동안 항온처리하였다. 4℃에서 10분 동안 200g에서 원심분리하고 상청액을 제거한 후, 1 M 트라이스-HCl(pH 8.6)로 pH 8.0까지 조절되고 프로테아제 및 포스파타제 억제제 칵테일을 함유하는 0.5 ㎖의 M-PER 포유동물 단백질 추출 시약(써모 사이언티픽 인코포레이티드)에 각각의 펠렛을 재현탁하였다. 이 현탁액들을 20분 동안 37℃에서 항온처리하고 ELISA에서 사용할 때까지 -80℃에서 저장하기 전에 15초 동안 볼텍스-혼합하였다.
인간 정제된 재조합 CD81 항원(오리진 테크놀로지스 인코포레이티드, 미국 메릴랜드주 록빌 소재)을 사용하여 CD81 항원 표준 곡선을 확인하면서 총 유비퀴틴(파이브포톤 바이오케미칼스(FIVEphoton Biochemicals), 미국 캘리포니아주 샌 디에고 소재), 1형 라이소좀-관련 막 단백질(LAMP1)(유에스바이올로지칼 라이프 사이언시스(USBiological Life Sciences), 미국 매사추세츠주 살렘 소재), 열충격 단백질 70(HSP70)(엔조 라이프 사이언시스(Enzo Life Sciences), 미국 뉴욕주 파밍달 소재), 카텝신 D(이엠디 밀리포어 코포레이션(EMD Milipore Corp.), 미국 매사추세츠주 빌러리카 소재) 및 테트라스패닝 엑소좀 마커 인간 CD81(홀젤 다이아그노스티카-쿠사바이오, 독일 쾰른 소재)에 대한 ELISA 키트로 공급자의 지시에 따라 엑소좀 단백질을 정량하였다. 각각의 분석 군에서 CD81의 모든 측정에 대한 평균 값을 1.00으로 설정하였고, 각각의 샘플에 대한 상대적인 값을 사용하여 그들의 회수를 표준화하였다.
해석(그래프패드 프리즘 6, 미국 캘리포니아주 라 졸라 소재)에서의 본페로니 보정을 포함하는 비대응 t 검정으로 횡단 환자 군들에 대한 군 평균들 사이의 차이의 통계학적 유의성, 및 각각의 환자 군과 그들 각각의 일치된 대조군 사이의 차이의 통계학적 유의성을 측정하였다. 군 AD와 그의 대조군(AC)을 비교하고 FTD와 그의 대조군(FTC)을 비교하기 위해 별도의 식별 분류자 분석을 수행하여 최상의 단순 회귀 모델을 정의하였다. 식별 분석을 윌크스의 람다 방법으로 단계적으로 수행하였다. 각각의 단계에서, 입력하기 위한 3.84의 최소 부분 F 및 제거하기 위한 2.71의 최소 부분 F를 가진 변수만이 보유되었다. 사전 확률은 모든 군들에 대해 동등한 것으로서 간주되었다. 피셔 함수 계수 및 군내 공변량도 계산하였다. 면적의 표준 오차에 대한 비-모수적 분포 가정 하에서 수신자 조작 특성(ROC) 분석을 수행하여, 분류자 모델의 성능을 측정하였다. 세로축 분석을 위해, MCI 또는 치매의 발병 전 및 후에 수득된 AD 환자에 대한 일련의 값들 사이의 차이의 유의성을 대응 t 검정(그래프패드)으로 계산하였다.
하기 표 9에 제시된 바와 같이, AD를 가진 대상체들에서 그들 각각의 대조군 대상체 혈청 엑소좀 수준에 비해 신경-유래 혈청 엑소좀 CTSD, LAMP1, 및 UBP 단백질 수준은 유의하게 증가되었고 HSP70 단백질 수준은 유의하게 감소되었다. FTD를 가진 대상체들에서 그들 각각의 대조군 대상체 혈청 엑소좀 수준에 비해 신경-유래 혈청 엑소좀 CTSD 단백질 수준은 유의하게 증가되었고 HSP70 단백질 수준은 유의하게 감소되었다(표 9 참조).
Figure 112016047611392-pct00009
AD 및 AC 데이터의 단계적 식별 분석은 CTSD 및 이에 이어 UBP를 도입하고 마지막으로 HSP70을 도입하되 LAMP1을 도입하지 않은 모델을 생성하였다. AD 대 AC의 ROC 곡선은 100%의 AD 환자들의 정확한 분류와 함께 최종 모델로부터의 CTSD 및 복합 점수 둘 다에 대한 1.0의 곡선하면적(AUC)을 보여주었다. 유사한 ROC 분석은 FTC 대조군에 비해 100%의 FTD를 정확하게 분류하였고 FTD에 비해 95.8%의 AD를 정확하게 분류하였다.
이 결과는 AD를 가진 대상체들에서 CTSD, LAMP1 및 UBP 단백질 수준의 신경-유래 혈청 엑소좀 수준이 증가되고 HSP70 단백질 수준이 감소되고 AD를 가진 대상체를 확인하는 데에 유용하다는 것을 보여주었다. 이 결과는 FTD를 가진 대상체들에서 CTSD의 신경-유래 혈청 엑소좀 수준이 증가되고 HSP70 단백질 수준이 감소되고 FTD를 가진 대상체를 확인하는 데에 유용하다는 것도 입증하였다. 이 결과는 본 발명의 방법 및 조성물이 알쯔하이머병, 전두측두엽 치매 및 다른 신경퇴행성 장애를 진단하는 데에 유용하다는 것도 시사하였다.
실시예 12: 신경-유래 혈청 엑소좀 단백질 수준은 인간 대상체에서 알쯔하이머병의 발생을 예측한다.
카텝신 D(CTSD), 1형 라이소좀-관련 막 단백질(LAMP1), 유비퀴티닐화된 단백질(UBP) 및 열충격 단백질 70(HSP70) 수준의 엑소좀 수준을 인간 대상체에서 다음과 같이 분석하였다. 하기 2개의 시점들에서 대상체들(n=20)로부터 10 ㎖의 정맥혈을 채취하였다: 제1 시점 - 대상체의 알쯔하이머병 진단 전(알쯔하이머의 임상전, AP) 1년 내지 10년, 및 제2 시점 - 알쯔하이머병(AD)의 최초 진단 시. 대조군 대상체들(n=20)로부터도 정맥혈 샘플을 채취하였다. 혈액 샘플을 프로세싱하고 엑소좀을 상기 실시예 11에 기재된 바와 같이 단리하였다.
하기 표 10에 제시된 바와 같이, AD를 가진 대상체에서 대조군 대상체 혈청 엑소좀 수준에 비해 신경-유래 혈청 엑소좀 CTSD, LAMP1 및 UBP는 유의하게 증가되었고 HSP70 단백질 수준은 유의하게 감소되었다. 추가로, AD의 임상적 진단 전 10년만큼 이른 시기에 대상체에서 신경-유래 혈청 엑소좀 CTSD, LAMP1 및 UBP는 증가되었고 HSP70 단백질 수준은 감소되었다(표 10 참조).
Figure 112016047611392-pct00010
이 결과는 알쯔하이머병을 가진 대상체에서 CTSD, LAMP1 및 UBP의 신경-유래 혈청 엑소좀 수준이 증가되고 HSP70이 감소되고 알쯔하이머병을 가진 대상체를 확인하는 데에 유용하다는 것을 보여주었다. 이 결과는 알쯔하이머병의 임상적 진단 전 10년만큼 이른 시기에 대상체에서 CTSD, LAMP1 및 UBP의 신경-유래 혈청 엑소좀 수준이 증가되고 HSP70이 감소된다는 것도 보여주었다. 이 결과는 본 발명의 분석 및 방법이 신경퇴행성 장애(예를 들면, 알쯔하이머병)의 위험에 있는 대상체를 확인하는 데에 유용하다는 것도 보여주었다. 추가로, 이 결과는 본 발명의 분석 및 방법이 알쯔하이머병의 초기 검출 및 진행 확인에 유용할 수 있다는 것을 보여주었다. 이 결과는 본 발명의 방법 및 조성물이 알쯔하이머병 및 다른 신경퇴행성 장애를 진단하는 데에 유용하다는 것도 시사하였다.
실시예 13: 신경퇴행성 장애를 가진 인간 대상체에서 신경-유래 혈장 엑소좀 단백질 수준
신경 특이적 에놀라제(enolase)(NSE) 및 신경 필라멘트 경쇄(NFL) 수준의 엑소좀 수준을 인간 대상체에서 다음과 같이 분석하였다. 알쯔하이머병(AD)을 가진 20명의 대상체들 및 일치된 대조군 대상체들(알쯔하이머의 대조군 - AC)로부터 30 ㎖의 정맥혈을 채취하였다. 혈액 샘플을 실온에서 10분 동안 항온처리하고 1,500g에서 15분 동안 원심분리하였다. 혈장을 흡입하고 -80℃에서 분취물로 저장하였다.
0.5 ㎖의 혈장을 1시간 동안 실온에서 0.15 ㎖의 트롬보플라스틴-D(피셔 사이언티픽 인코포레이티드, 미국 일리노이주 하노버 파크 소재)와 함께 항온처리한 후, 제안된 최종 농도의 3배 최종 농도의 프로테아제 억제제 칵테일(로슈 어플라이드 사이언시스 인코포레이티드, 미국 인디애나주 인디애나폴리스 소재) 및 포스파타제 억제제 칵테일(피어스 홀트, 써모 사이언티픽 인코포레이티드, 미국 일리노이주 록포드 소재)을 가진 0.35 ㎖의 칼슘 및 마그네슘 무함유 둘베코 균형 염 용액(DBS-2)을 첨가하였다. 20분 동안 1,500g에서 원심분리한 후, 상청액을 252 ㎕의 엑소퀵 엑소좀 침전 용액(EXOQ; 시스템 바이오사이언시스 인코포레이티드, 미국 캘리포니아주 마운틴뷰 소재)과 혼합하고 4℃에서 1시간 동안 항온처리하였다. 생성된 엑소좀 현탁액을 4℃에서 30분 동안 1,500g에서 원심분리하였고, 신경 공급원으로부터 엑소좀을 면역화학적으로 농축하기 전에 -80℃ 동결-해동 주기 후에 볼텍스-혼합함으로써 억제제 칵테일을 가진 250 ㎕의 증류수에 각각의 펠렛을 재현탁하였다.
각각의 샘플을 50 ㎕의 3% BSA(PBS 중의 차단제 BSA 10% 용액의 1:3.33 희석액, 써모 사이언티픽 인코포레이티드) 중의 1 ㎍ 마우스 항-인간 CD171(L1CAM 신경 부착 단백질) 바이오티닐화된 항체(클론 5G3, 이바이오사이언스, 미국 캘리포니아주 샌 디에고 소재)와 함께 4℃에서 1시간 동안 항온처리하고 4℃에서 30분 동안 항온처리하였다. 4℃에서 10분 동안 200g에서 원심분리하고 상청액을 제거한 후, 1 M 트라이스-HCl(pH 8.6)로 pH 8.0까지 조절되고 프로테아제 및 포스파타제 억제제 칵테일을 함유하는 0.5 ㎖의 M-PER 포유동물 단백질 추출 시약(써모 사이언티픽 인코포레이티드)에 각각의 펠렛을 재현탁하였다. 이 현탁액들을 20분 동안 37℃에서 항온처리하고 ELISA에서 사용할 때까지 -80℃에서 저장하기 전에 15초 동안 볼텍스-혼합하였다.
인간 정제된 재조합 CD81 항원(오리진 테크놀로지스 인코포레이티드, 미국 메릴랜드주 록빌 소재)을 사용하여 CD81 항원 표준 곡선을 확인하면서 총 신경 특이적 에놀라제(알앤드디 시스템스(R&D Systems), 미국 미네소타주 세인트 폴 소재), 신경필라멘트 경쇄 단백질(NFL)(어메리칸 리서치 프로덕츠(American Research Products), 미국 매사추세츠주 왈쌈 소재) 및 테트라스패닝 엑소좀 마커 인간 CD81(홀젤 다이아그노스티카-쿠사바이오, 독일 쾰른 소재)에 대한 ELISA 키트로 공급자의 지시에 따라 엑소좀 단백질을 정량하였다. 각각의 분석 군에서 CD81의 모든 측정에 대한 평균 값을 1.00으로 설정하였고, 각각의 샘플에 대한 상대적인 값을 사용하여 그들의 회수를 표준화하였다.
해석(그래프패드 프리즘 6, 미국 캘리포니아주 라 졸라 소재)에서의 본페로니 보정을 포함하는 비대응 t 검정으로 횡단 환자 군들에 대한 군 평균들 사이의 차이의 통계학적 유의성, 및 각각의 환자 군과 그들 각각의 일치된 대조군 사이의 차이의 통계학적 유의성을 측정하였다. 군 AD와 그의 대조군(AC)을 비교하기 위해 별도의 식별 분류자 분석을 수행하여 최상의 단순 회귀 모델을 정의하였다. 식별 분석을 윌크스의 람다 방법으로 단계적으로 수행하였다. 각각의 단계에서, 입력하기 위한 3.84의 최소 부분 F 및 제거하기 위한 2.71의 최소 부분 F를 가진 변수만이 보유되었다. 사전 확률은 모든 군들에 대해 동등한 것으로서 간주되었다. 피셔 함수 계수 및 군내 공변량도 계산하였다. 면적의 표준 오차에 대한 비-모수적 분포 가정 하에서 수신자 조작 특성(ROC) 분석을 수행하여 분류자 모델의 성능을 측정하였다.
하기 표 11에 제시된 바와 같이, 신경-유래 엑소좀 NSE 및 NFL 단백질 수준은 AD를 가진 대상체들에서 그들 각각의 대조군 대상체 혈청 엑소좀 수준에 비해 유의하게 증가되었다.
Figure 112016047611392-pct00011
이 결과는 NSE 및 NFL 단백질 수준의 신경-유래 혈청 엑소좀 수준이 AD를 가진 대상체에서 증가되고 AD를 가진 대상체를 확인하는 데에 유용하다는 것을 보여주었다. 이 결과는 본 발명의 방법 및 조성물이 알쯔하이머병 및 다른 신경퇴행성 장애를 진단하는 데에 유용하다는 것도 시사하였다.
본원에 제시되고 기재된 변경 이외의 다양한 변경들이 상기 설명으로부터 당분야에서 숙련된 자에게 자명해질 것이다. 이러한 변경들은 첨부된 청구범위 내에 속한다.
본원에서 인용된 모든 참고문헌들은 전체로서 본원에 참고로 도입된다.

Claims (73)

  1. (i) 소포를 포함하는 생물학적 샘플을 대상체로부터 수득하는 단계;
    (ii) 상기 생물학적 샘플로부터 소포를 단리하는 단계; 및
    (iii) 단리된 소포로부터 바이오마커(biomarker)의 수준을 측정하는 단계
    를 포함하는, 대상체에서 신경퇴행성 장애를 진단하거나 예후하거나, 신경퇴행성 장애의 위험에 있는 대상체를 확인하거나, 신경퇴행성 장애를 가진 대상체에서 치료 요법을 처방하거나 치료로부터의 이익을 예측하기 위해, 신경퇴행성 장애를 갖고 있거나 가진 것으로 의심되는 대상체로부터의 샘플을 분석하는 방법으로서,
    상기 바이오마커가 인산화된 Tau이고,
    상기 생물학적 샘플이 전혈, 혈청 또는 혈장이고,
    상기 소포가 신경(neuron)-유래 엑소좀, 성상세포-유래 엑소좀, 희소돌기아교세포-유래 엑소좀 및 미세아교세포-유래 엑소좀으로 구성된 군으로부터 선택되는, 방법.
  2. 삭제
  3. 제1항에 있어서,
    대상체가 신경퇴행성 장애를 가진 것으로 진단되었거나 의심되는, 방법.
  4. 제1항에 있어서,
    소포를 생물학적 샘플로부터 단리하는 단계가, 상기 생물학적 샘플에 존재하는 소포가 제제에 결합하여 소포-제제 복합체를 형성하는 조건 하에서 상기 생물학적 샘플을 상기 제제와 접촉시키는 단계; 및 상기 소포를 상기 소포-제제 복합체로부터 단리하여 상기 소포를 함유하는 샘플을 수득하는 단계를 포함하고, 상기 샘플에 존재하는 소포의 순도가 상기 생물학적 샘플에 존재하는 소포의 순도보다 더 큰, 방법.
  5. 삭제
  6. 삭제
  7. 대상체에서 신경퇴행성 장애를 진단하거나 예후하거나, 신경퇴행성 장애의 위험에 있는 대상체를 확인하거나, 신경퇴행성 장애를 가진 대상체에서 치료 요법을 처방하거나 치료로부터의 이익을 예측하기 위한 키트로서,
    상기 키트가 소포에 특이적으로 결합하는 하나 이상의 제제, 바이오마커에 특이적으로 결합하는 하나 이상의 제제, 생물학적 샘플을 수집하거나 보유하기 위한 하나 이상의 용기, 및 그의 사용을 위한 설명서를 포함하며,
    상기 신경퇴행성 장애가 변경된 바이오마커의 수준과 관련되어 있고, 상기 바이오마커가 인산화된 Tau이며,
    상기 생물학적 샘플이 전혈, 혈청 또는 혈장이고,
    상기 소포가 신경-유래 엑소좀, 성상세포-유래 엑소좀, 희소돌기아교세포-유래 엑소좀 및 미세아교세포-유래 엑소좀으로 구성된 군으로부터 선택되는, 키트.
  8. 제7항에 있어서,
    제제가 다중클론 또는 단일클론 항체인, 키트.
  9. 제7항에 있어서,
    제제가 단일클론 항-인간 NCAM 항체, 단일클론 항-인간 CD171 항체, 단일클론 CD9 항체, 단일클론 CD63 항체 또는 단일클론 CD81 항체인, 키트.
  10. 삭제
  11. 삭제
  12. 제1항, 제3항 및 제4항 중 어느 한 항에 있어서,
    바이오마커의 수준이 바이오마커의 단백질, 인산화된 단백질, mRNA 또는 miRNA 수준인, 방법.
  13. 제1항, 제3항 및 제4항 중 어느 한 항에 있어서,
    신경퇴행성 장애가 알쯔하이머병(AD), 혈관 질환 치매, 전두측두엽 치매(FTD), 피질기저 퇴행(CBD), 진행핵상마비(PSP), 루이소체 치매, 매듭-우세 노인성 치매, 픽병(PiD), 호은 과립 질환, 근위축성 측삭 경화증(ALS), 다른 운동 신경 질환, 괌 파킨슨증-치매 복합, FTDP-17, 라이티코-보디그병, 다발성 경화증, 외상성 뇌 손상(TBI) 및 파킨슨병으로 구성된 군으로부터 선택되는, 방법.
  14. 삭제
  15. 제1항, 제3항 및 제4항 중 어느 한 항에 있어서,
    인산화된 Tau가 Thr-153, Thr-181, Thr-205, Thr-231, Ser-199, Ser-202, Ser-214, Ser-235, Ser-262, Ser-356, Ser-396, Ser-422, Tyr18, Tyr29, Tyr197, Tyr310 및 Tyr394로 구성된 군으로부터 선택되는 하나 이상의 잔기에서 인산화되는, 방법.
  16. 제7항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서,
    신경퇴행성 장애가 알쯔하이머병(AD), 혈관 질환 치매, 전두측두엽 치매(FTD), 피질기저 퇴행(CBD), 진행핵상마비(PSP), 루이소체 치매, 매듭-우세 노인성 치매, 픽병(PiD), 호은 과립 질환, 근위축성 측삭 경화증(ALS), 다른 운동 신경 질환, 괌 파킨슨증-치매 복합, FTDP-17, 라이티코-보디그병, 다발성 경화증, 외상성 뇌 손상(TBI) 및 파킨슨병으로 구성된 군으로부터 선택되는, 키트.
  17. 제7항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서,
    인산화된 Tau가 Thr-153, Thr-181, Thr-205, Thr-231, Ser-199, Ser-202, Ser-214, Ser-235, Ser-262, Ser-356, Ser-396, Ser-422, Tyr18, Tyr29, Tyr197, Tyr310 및 Tyr394로 구성된 군으로부터 선택되는 하나 이상의 잔기에서 인산화되는, 키트.
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