KR102334899B1

KR102334899B1 - 암 세포의 증식을 억제하는 펩티드 fnin2 및 이의 용도

Info

Publication number: KR102334899B1
Application number: KR1020200080156A
Authority: KR
Inventors: 도경오; 최인호; 이은주; 쿠르시드아마드; 박재원
Original assignee: 영남대학교 산학협력단
Priority date: 2019-10-28
Filing date: 2020-06-30
Publication date: 2021-12-03
Anticipated expiration: 2040-06-30
Also published as: KR20210050433A

Abstract

본 발명은 암 세포의 증식을 억제하는 펩티드 FNIN2 및 이의 용도에 관한 것으로, 보다 상세하게는 서열번호 1 또는 서열번호 2로 표시되는 아미노산 서열로 이루어진 암 세포 증식 억제 활성을 갖는 펩티드, 상기 펩티드를 유효성분으로 함유하는 항암제 치료 효과 증진용 약학 조성물, 상기 펩티드 및 항암제를 유효성분으로 포함하는 암 예방 또는 치료용 약학 조성물 등을 제공한다.
상기 펩티드는 우수한 암 세포 증식 억제 활성을 가지며 항암제의 항암 활성을 증진시킬 수 있기에, 상기 펩티드와 항암제를 병용 투여함으로써 췌장암, 유방암, 폐암 등의 다양한 암 질환을 보다 효과적으로 예방 또는 치료할 수 있다.

Description

암 세포의 증식을 억제하는 펩티드 FNIN2 및 이의 용도{PEPTIDES FNIN2 INHIBITING CANCER CELL PROLIFERATION AND USES THEREOF}

본 발명은 암 세포의 증식을 억제하는 펩티드 FNIN2 및 이의 용도에 관한 것이다.

인테그린(integrin)은 세포-매트릭스 및 세포-세포 상호작용을 매개하는 당단백질 막 수용체 패밀리이다. 인테그린은 α 및 β 서브유니트로 이루어진 이종이량체이다. 지금까지 18개의 α 및 8개의 β 서브유니트를 포함하는 적어도 24개의 별개의 인테그린 이종이량체가 보고되었다. 인테그린은 상이한 세포외기질(extracellular matrix; ECM) 단백질과의 특이적 상호작용을 통해 세포의 고착 및 이동을 매개한다.

여러 인테그린은 피브로넥틴(fibronectin; FN)에 존재하는 Arg-Gly-Asp (RGD) 모티프를 통해 피브로넥틴과 상호작용하는 것으로 공지되어 있다. 이들 인테그린은 5개의 α5 인테그린(α5β1, α5β3, α5β5, α5β6, 및 α5β8) 및 2개의 β1 인테그린(α5β1 및 α5β1)을 포함한다. 피브로넥틴은 다른 세포외기질 단백질 뿐만 아니라 인테그린에 결합하는 세포외기질의 고분자량(약 440kDa)의 당단백질이다. 피브로넥틴은 C-말단에서 디설파이드 결합(disulfide bond)에 의해 연결된 2개의 단량체의 이량체로서 존재한다. 각각의 피브로넥틴 단량체는 3개 유형의 도메인, I형, II형 및 III형을 함유하는 230 내지 250kDa의 분자량을 갖는다. I형 및 II형 도메인은 쇄내 디설파이드 결합에 의해 안정화되지만, III형 도메인은 임의의 디설파이드 결합을 함유하지 않는다. 디설파이드 결합의 부재는 FN III형 도메인의 구조에서 유연성을 유도할 수 있다.

악성 종양의 두드러진 특징은 종양 질량의 절반 이상을 차지하는 콜라겐, 피브로넥틴, 인테그린과 같은 세포외기질로 이루어진 단단한 물리적 장벽이다. 이 물리적 장벽은 약물의 침투를 저해하여 항암제의 효과를 반감시킨다. 이러한 특성 때문에 피브로넥틴과 인테그린의 결합은 종양의 성장에 중요한 인자로서 잠재적 치료 타겟이다. 이에, 상기와 같은 인테그린 및 피브로넥틴과의 상호작용을 토대로, 인테그린에 결합하는 피브로넥틴 유래 다양한 펩티드들에 대한 연구가 활발히 진행되고 있다.

미국등록특허 US 6316412 B1 (2001.11.13 등록)

본 발명의 목적은 암 세포의 증식을 억제하는 펩티드를 제공하는 데에 있다.

본 발명의 다른 목적은 상기의 펩티드를 이용하여 항암제의 치료 효과를 증진시키는 조성물을 제공하는 데에 있다.

본 발명의 또 다른 목적은 상기의 펩티드 및 항암제를 병용한 암 치료 조성물을 제공하는 데에 있다.

본 발명의 또 다른 목적은 상기의 펩티드를 이용한 암 세포 증식 억제용 조성물을 제공하는 데에 있다.

본 발명의 또 다른 목적은 상기의 펩티드를 이용한 암 세포 증식 억제 방법을 제공하는 데에 있다.

상기의 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 서열번호 1 또는 서열번호 2로 표시되는 아미노산 서열로 이루어진 암 세포 증식 억제 활성을 갖는 펩티드를 제공한다.

본 발명은 상기 펩티드를 유효성분으로 함유하는 항암제 치료 효과 증진용 약학 조성물을 제공한다.

본 발명은 상기 펩티드 및 항암제를 유효성분으로 포함하는 암 예방 또는 치료용 약학 조성물을 제공한다.

본 발명은 상기 펩티드를 유효성분으로 함유하는 암 세포 증식 억제용 시약 조성물을 제공한다.

또한, 본 발명은 사람을 제외한 동물에 상기 펩티드를 처리하는 단계를 포함하는 암 세포 증식 억제 방법을 제공한다.

본 발명은 펩티드 FNIN2 및 이의 용도에 관한 것으로서, 상기 펩티드는 우수한 암 세포 증식 억제 활성을 가지며, 이를 통해 항암제의 항암 활성을 향상시킴으로써, 이를 이용한 항암 치료 효과를 증진시킬 수 있다.

상기 펩티드는 항암제와 병용 투여됨으로써 췌장암, 유방암, 폐암 등의 다양한 암 질환을 보다 효과적으로 예방 또는 치료할 수 있고, 적은 양의 항암제로도 우수한 치료 효과를 나타낼 수 있기에, 항암제에 따른 부작용을 줄이고 보다 안전하게 치료할 수 있다.

도 1은 사람의 피브로넥틴(fibronectin; FN) 단백질의 일부 중 인테그린(integrin)과 결합하는 아미노산 부위를 중심으로 FNIN2 펩티드를 디자인한 모식도를 나타낸다. FN 단백질의 짧은 모방 펩티드를 생성하기 위해 1,267-1,540 (274개 아미노산: 세포부착에 중요 부위인 RGD 포함, 몇몇의 인테그린 수용체와 결합) 아미노산 부위를 선정하고, 이 부위의 10-20개의 아미노산 서열을 무작위로 선택하여 펩티드 FNIN2-*를 디자인하였다.
도 2는 PatchDock 및 FireDock 프로토콜을 이용하여 합성된 FNIN2-* 펩티드와 인테그린 α5β1, α5β3, αIIbβ3과의 상호작용을 분석한 결과를 나타내는데, 이를 통해 FNIN2-* 및 인테그린과 부착되는 아미노산 부분을 규명하였다. a. FNIN2-* vs. 인테그린 α5β1, b. FNIN2-* vs. αvβ3, c. FNIN2-* vs. αIIbβ3.
도 3은 FNIN2 및 젬시타빈(Gemcitabine)이 췌장암 세포의 증식에 미치는 효과를 평가한 결과를 나타낸다.
도 4는 FNIN2와 젬시타빈을 췌장암 세포에 병용하였을 때의 효과를 관찰한 결과를 나타낸다.
도 5는 FNIN2 및 독소루비신(Doxorubicin)이 폐암 세포의 증식에 미치는 효과를 평가한 결과를 나타낸다.
도 6은 FNIN2와 독소루비신을 폐암 세포에 병용하였을 때의 효과를 관찰한 결과를 나타낸다.
도 7은 FNIN2 및 독소루비신이 유방암 세포의 증식에 미치는 효과를 평가한 결과를 나타낸다.
도 8은 FNIN2와 독소루비신을 유방암 세포에 병용하였을 때의 효과를 관찰한 결과를 나타낸다.

이하, 본 발명을 상세하게 설명하기로 한다.

본 발명자는 사람의 피브로넥틴과 결합하여 세포 간 결합과 세포 증식에 관여하는 α5β1-인테그린을 타겟으로 한 펩티드(FNIN2)를 합성하고, 이를 췌장암, 유방암, 폐암 세포에 처리하여 2차 및 3차 배양 모델에서 암 세포의 증식을 관찰하였을 때 상기 FNIN2 처리에 따라 암 세포의 증식이 감소하였고, 항암제와 병용 처리하였을 때 항암 효과가 증진됨을 확인함으로써, 본 발명을 완성하였다.

본 발명은 암 세포 증식 억제 활성을 갖는 펩티드를 제공한다.

바람직하게는, 상기 펩티드는 서열번호 1 또는 서열번호 2로 표시되는 아미노산 서열로 이루어질 수 있다.

본 명세서에서, 하기 표 1과 같이 서열번호 1로 표시되는 펩티드는 FNIN2로 명명하였으며, 서열번호 2로 표시되는 펩티드는 FNIN2-1로 명명하였다.

서열번호	펩티드명	아미노산 서열
1	FNIN2	LSISPSDNAVVLTNLLPTGE
2	FNIN2-1	LSISPSDNAVVLTNLLPGTE

상기 펩티드는 상기 펩티드의 C-말단이 아마이드화(amidation)되거나, N-말단이 아세틸화(acetylation)되거나, 또는 상기 펩티드의 C-말단이 아마이드화(amidation) 및 N-말단이 아세틸화(acetylation)될 수 있다.

바람직하게는, 본 발명의 일 실시예의 "FNIN2-*"와 같이, 상기 펩티드의 C-말단이 아마이드화(amidation)될 수 있고, "*-FNIN2-*와 같이, 상기 펩티드의 C-말단이 아마이드화(amidation) 및 N-말단이 아세틸화(acetylation)될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

본 발명에 따른 펩티드에 있어서, 상기 암 세포는 췌장암 세포, 폐암 세포 및 유방암 세포로 이루어진 군에서 선택되는 하나 또는 둘 이상일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

상기 암 세포는 2차원 배양 또는 3차원 배양된 것일 수 있고, 바람직하게는 3차원 배양된 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

본 발명의 일 실험예에 따르면, 상기 펩티드를 췌장암 세포, 폐암 세포 또는 유방암 세포에 처리했을 때, 상기 암 세포의 증식이 효과적으로 억제됨을 확인할 수 있었다.

본 발명은 암 세포 증식 억제 활성을 갖는 펩티드를 유효성분으로 함유하는 항암제 치료 효과 증진용 약학 조성물을 제공한다.

이에 상응하는 특징들은 상술된 부분에서 대신할 수 있다.

본 발명에 따른 항암제 치료 효과 증진용 약학 조성물에 있어서, 상기 항암제는 세포독성 항암제, 표적항암제 및 면역항암제로 이루어진 군에서 선택될 수 있고, 바람직하게는 암 세포를 공격하여 항암 효과를 나타내는 세포독성 항암제로, 상세하게는 젬시타빈(gemcitabine), 카페시타빈(capecitabine), 시타라빈(cytarabine), 데시타빈(decitabine), 에노시타빈(enocitabine), 독소루비신(doxorubicin), 에피루비신(epirubicin), 다우노루비신(daunorubicin), 이다루비신(idarubicin) 및 미톡산트론(mitoxantrone)으로 이루어진 군에서 선택되는 하나 또는 둘 이상일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

상기 표적항암제는 세툭시맙(cetuximab), 트라스투주맙(trastuzumab), 리툭시맙(rituximab), 이매티닙(imatinib), 닐로티닙(nilotinib), 엘로티닙(erlotinib), 게피티니브(gefitinib), 소라페닙(sorafenib), 엑시티닙(axitinib), 반데타닙(vandetanib), 템시롤리무스(temsirolimus) 등이 포함될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

상기 면역항암제는 이필리무맙(ipilimumab), 펨브롤리주맙(pembrolizumab), 니볼루맙(nivolumab), 아테졸리주맙(atezolizumab), 블리나투모맙(blinatumomab) 등이 포함될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

본 발명에 따른 항암제 치료 효과 증진용 약학 조성물은 상기 항암제와 동시에(simultaneous), 별도로(separate) 또는 순차적(sequential)으로 투여될 수 있다. 상기 조성물은 상기의 항암제의 치료 효과를 증진시킬 수 있기에, 상기의 항암제와 병용하여 투여함으로써, 보다 효과적으로 암을 예방 또는 치료할 수 있다.

상기 암은 췌장암, 폐암 및 유방암으로 이루어진 군에서 선택되는 하나 또는 둘 이상일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

본 발명의 일 실험예에 따르면, 상기 펩티드와 젬시타빈 또는 독소루비신을 병용하여 처리한 경우, 췌장암, 유방암, 폐암 등의 암 세포의 증식이 현저히 감소함을 확인할 수 있었다.

본 발명은 암 세포 증식 억제 활성을 갖는 펩티드 및 항암제를 유효성분으로 포함하는 암 예방 또는 치료용 약학 조성물을 제공한다.

이에 상응하는 특징들은 상술된 부분에서 대신할 수 있다.

본 발명에 따른 암 예방 또는 치료용 약학 조성물에 있어서, 상기 항암제는 암 세포를 공격하여 항암 효과를 나타내는 세포독성 항암제일 수 있고, 바람직하게는 젬시타빈(gemcitabine), 카페시타빈(capecitabine), 시타라빈(cytarabine), 데시타빈(decitabine), 에노시타빈(enocitabine), 독소루비신(doxorubicin), 에피루비신(epirubicin), 다우노루비신(daunorubicin), 이다루비신(idarubicin) 및 미톡산트론(mitoxantrone)으로 이루어진 군에서 선택되는 하나 또는 둘 이상일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

상기 조성물은 상기 펩티드 및 항암제가 (20 내지 60) : 1의 중량비로 포함될 수 있다.

바람직하게는, 췌장암의 경우, 상기 펩티드 및 항암제가 (40 내지 60) : 1, 보다 바람직하게는, 50 : 1의 중량비로 포함될 수 있고, 폐암 또는 유방암의 경우, 상기 펩티드 및 항암제가 (20 내지 30) : 1, 보다 바람직하게는, 25 : 1의 중량비로 포함될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

상기 펩티드는 상기 항암제의 항암 활성을 증진시킬 수 있다.

본 발명에 따른 약학 조성물은 약학적 분야의 통상적인 방법에 따라 제조될 수 있다. 상기 약학 조성물은 제형에 따라 약학적으로 허용가능한 적절한 담체와 배합될 수 있고, 필요에 따라, 부형제, 희석제, 분산제, 유화제, 완충제, 안정제, 결합제, 붕해제, 용제 등을 더 포함하여 제조될 수 있다. 상기 적절한 담체 등은 본 발명에 따른 펩티드 또는 항암제의 활성 및 특성을 저해하지 않는 것으로, 투여 형태 및 제형에 따라 달리 선택될 수 있다.

본 발명에 따른 약학 조성물은 어떠한 제형으로도 적용될 수 있고, 보다 상세하게는 통상의 방법에 따라 경구형 제형, 외용제, 좌제 및 멸균 주사용액의 비경구형 제형으로 제형화하여 사용될 수 있다.

상기 경구형 제형 중 고형 제형은 정제, 환제, 산제, 과립제, 겔제, 캡슐제 등의 형태로, 적어도 하나 이상의 부형제, 예를 들면, 전분, 칼슘카보네이트, 수크로스, 락토오스, 솔비톨, 만니톨, 셀룰로오스, 젤라틴 등을 섞어 조제할 수 있고, 단순한 부형제 이외에 마그네슘 스테아레이트, 탈크 같은 윤활제들도 포함될 수 있다. 또한, 캡술제형의 경우 상기 언급한 물질 외에도 지방유와 같은 액체 담체를 더 포함할 수 있다.

상기 경구형 제형 중 액상 제형은 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제 등이 해당되는데 흔히 사용되는 단순 희석제인 물, 리퀴드 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등이 포함될 수 있다.

상기 비경구 제형은 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결건조 제제, 좌제가 포함될 수 있다. 비수성용제, 현탁제로는 프로필렌글리콜, 폴리에틸렌 글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다. 좌제의 기제로는 위텝솔(witepsol), 마크로골, 트윈 61, 카카오지, 라우린지, 글리세로제라틴 등이 사용될 수 있다. 이에 제한되지 않고, 당해 기술 분야에 알려진 적합한 제제를 모두 사용 가능하다.

또한, 본 발명에 따른 약학 조성물은 치료 효능의 증진을 위해 칼슘이나 비타민 등을 더 첨가할 수 있다.

본 발명에 따른 약학 조성물은 약학적으로 유효한 양으로 투여될 수 있다.

본 명세서에서, "약학적으로 유효한 양"이란, 의학적 치료에 적용 가능한 합리적인 수혜/위험 비율로 질환을 치료하기에 충분하며 부작용을 일으키지 않을 정도의 양을 의미한다.

상기 약학 조성물의 유효 용량 수준은 사용 목적, 환자의 연령, 성별, 체중 및 건강 상태, 질환의 종류, 중증도, 약물의 활성, 약물에 대한 민감도, 투여 방법, 투여 시간, 투여 경로 및 배출 비율, 치료기간, 배합 또는 동시 사용되는 약물을 포함한 요소 및 기타 의학 분야에 잘 알려진 요소에 따라 달리 결정될 수 있다. 예를 들어, 일정하지는 않지만 일반적으로 0.001 내지 100mg/kg으로, 바람직하게는 0.01 내지 10mg/kg을 일일 1회 내지 수회 투여될 수 있다. 상기 투여량은 어떠한 면으로든 본 발명의 범위를 한정하는 것은 아니다.

본 발명에 따른 약학 조성물은 암 질환이 발생할 수 있는 임의의 동물에 투여할 수 있고, 상기 동물은 예를 들어, 인간 및 영장류뿐만 아니라 소, 돼지, 말, 개 등의 가축 등을 포함할 수 있다.

본 발명에 따른 약학 조성물은 제제 형태에 따른 적당한 투여 경로로 투여될 수 있고, 목적 조직에 도달할 수 있는 한 경구 또는 비경구의 다양한 경로를 통하여 투여될 수 있다. 투여 방법은 특히 한정할 필요 없이, 예를 들면, 경구, 직장 또는 정맥, 근육, 피부 도포, 호흡기내 흡입, 자궁내 경막 또는 뇌혈관내(intracere-broventricular) 주사 등의 통상적인 방법으로 투여될 수 있다.

본 발명에 따른 약학 조성물은 암의 예방 또는 치료를 위하여 단독으로 사용될 수 있고, 수술 또는 다른 약물 치료 등과 병용하여 사용될 수 있다.

본 발명은 암 세포 증식 억제 활성을 갖는 펩티드를 유효성분으로 함유하는 암 세포 증식 억제용 시약 조성물을 제공한다.

이에 상응하는 특징들은 상술된 부분에서 대신할 수 있다.

또한, 본 발명은 사람을 제외한 동물에 암 세포 증식 억제 활성을 갖는 펩티드를 처리하는 단계;를 포함하는 암 세포 증식 억제 방법을 제공한다.

이에 상응하는 특징들은 상술된 부분에서 대신할 수 있다.

이하에서는, 본 발명을 한정하지 않는 실시예에 따라 본 발명을 상세히 설명한다. 본 발명의 하기 실시예는 본 발명을 구체화하기 위한 것일 뿐 본 발명의 권리범위를 제한하거나 한정하는 것이 아님은 물론이다. 따라서 본 발명의 상세한 설명 및 실시예로부터 본 발명이 속하는 기술 분야의 전문가가 용이하게 유추할 수 있는 것은 본 발명의 권리범위에 속하는 것으로 해석된다.

<제조예 1> 펩티드 디자인 및 합성

피브로넥틴(fibronectin; FN) 단백질 영역 중 1267-1540 아미노산 영역이 인테그린(integrin) 결합에 중요한 부분으로 작용하며, 세포의 부착, 증식 및 신호전달을 촉진한다고 알려져 있다. 따라서 짧은 모방 펩티드를 생성하기 위해 1,267-1,540 (274 개 아미노산: 세포부착에 중요 부위인 RGD 포함, 몇몇의 인테그린 수용체와 결합) 아미노산 부위를 선정하고, 이 부위에서 10-20개의 아미노산 서열을 무작위로 선택하여 (RGD 미포함) 아미노산의 위치 변화, 결실, 추가 등의 방법을 이용하여 펩티드를 디자인하였다 (도 1).

디자인된 각 펩티드들은 서열의 고유성(https://research.bioinformatics. udel.edu/peptidematch/index.jsp) 및 물질 화학적 속성을 분석하였다(https://www.thermofisher.Com/kr/ko/home/life-science/protein-biology/ eptides-proteins/custom-peptidesynthesis-services/peptide-analyzing-tool.html).

또한, PatchDock 및 FireDock 프로토콜을 이용하여 합성된 펩티드와 인테그린(α5β1, αvβ3 및 αIIbβ3)과의 상호작용을 분석하였다 (도 2a-c). 디자인한 펩티드는 펩트론(Korea)에 합성을 의뢰하였다.

하기 표 2는 펩티드 서열, 길이, 화학적 속성 등을 나타낸 것이다.

상기 표 2에서 나타낸 바와 같이, FNIN2-* 외 2종의 펩티드를 디자인하였다. FNIN2-* 의 경우 C-말단에 아마이드화(amidation) 된 펩티드를 나타내며, *-FNIN2의 경우 N-말단에 아세틸화(acetylation) 된 펩티드를 나타낸다. 또한, *-FNIN2-* 은 C-말단에 아마이드화(amidation), N-말단에 아세틸화(acetylation) 된 펩티드를 나타낸다.

<실험예 1> FNIN2 펩티드와 젬시타빈(Gemcitabine) 처리에 따른 췌장암 세포의 증식 관찰

1. 췌장암 세포(MIA PaCa-2)의 2차원 배양에서 FNIN2가 증식에 미치는 영향

MIA PaCa-2 (KCLB, Republic of Korea)는 DMEM (Hyclone, USA) + 10% FBS (Hyclone) + 1% P/S (Hyclone) + 1% L-Glutamine에서 배양하였으며, passage 10-12번 세포를 연구에 이용하였다. 펩티드의 효과 검증을 위해 MIA PaCa-2 (5×10³ cells/well)를 96 well 세포배양접시에 넣고 24시간 동안 부착시킨 후 1, 5, 10, 25, 50μM의 FNIN2를 처리하고 72시간 동안 배양하였다. 배양 72시간 후 MTT assay를 이용하여 세포의 증식을 확인하였다.

도 3a는 췌장암 세포의 2차원 배양에서 FNIN2의 농도에 따른 항암 활성을 나타낸 것이다. 이를 참조하면, 배양접시의 바닥면에 세포가 붙어서 자라는 2차원 배양에서는 FNIN2가 세포 성장에 대한 영향이 거의 없는 것을 확인할 수 있다.

(2) 췌장암 세포의 3차원 배양에서 FNIN2가 증식에 미치는 영향

MIA PaCa-2 (5×10³ cells/well)를 Ultra Low Cluster 96 well 세포배양접시에 넣고 7일간 배양 후 0.1, 1, 5, 10, 25, 50μM의 FNIN2를 처리하고 72시간 동안 배양하였다. 배양 72시간 후 WST assay를 이용하여 세포의 증식을 확인하였다.

도 3b는 췌장암 세포의 3차원 종양 모델에서 FNIN2의 농도에 따른 세포 증식 억제를 나타낸 것이다. 이를 참조하면, 3차원 종양 모델에서는 FNIN2가 세포 간 결합을 끊어줌으로써 FNIN2의 농도에 따라 세포 증식을 억제하는 것을 확인할 수 있다. 이는 도 4의 현미경 사진 및 형광 현미경 사진을 통해서도 확인할 수 있다. 도 4의 녹색형광은 live cell을 나타내며, 적색형광은 dead cell을 나타낸다.

(3) 췌장암 세포의 2차원 배양에서 젬시타빈(Gemcitabine)이 증식에 미치는 영향

MIA PaCa-2 (5×10³ cells/well)를 96 well 세포배양접시에 넣고 24시간 동안 부착시킨 후 0.01, 0.1, 0.5, 1, 5, 10, 50μM의 젬시타빈을 처리하고 72시간 동안 배양하였다. 배양 72시간 후 MTT assay를 이용하여 세포의 증식을 확인하였다.

도 3c는 췌장암 세포의 2차원 배양에서 젬시타빈의 농도에 따른 항암 활성을 나타낸 것이다. 이를 참조하면, 2차원 배양에서는 세포 간 결합을 통해 생기는 물리적 장벽이 없기 때문에 0.1μM에서 췌장암 세포의 증식이 50% 이상 억제되는 것을 관찰할 수 있다.

(4) 췌장암 세포의 3차원 배양에서 젬시타빈이 증식에 미치는 영향

MIA PaCa-2 (5×10³ cells/well)를 Ultra Low Cluster 96 well 세포배양접시에 넣고 7일간 배양 후 0.01, 0.1, 0.5, 1, 5, 10, 50μM의 젬시타빈을 처리하고 72시간 동안 배양하였다. 배양 72시간 후 WST assay를 이용하여 세포의 증식을 확인하였다.

도 3d는 췌장암 세포의 3차원 종양 모델에서 젬시타빈의 농도에 따른 항암 활성을 나타낸 것이다. 이를 참조하면, 3차원 종양 모델은 세포간의 결합이 단단히 이루어져 있기 때문에 물리적 장벽을 형성하여 2차원 배양 세포와는 달리 50μM의 젬시타빈을 사용하여도 세포 성장이 2차원 배양 시의 0.1μM보다 덜 억제됨을 확인할 수 있다. 이는 도 4의 현미경 사진 및 형광 현미경 사진을 통해서도 확인할 수 있다.

(5) 3차원 배양에서 FNIN2와 젬시타빈의 병용처리 시 췌장암 억제 효과

MIA PaCa-2 (5×10³ cells/well)를 96 well 세포배양접시에 넣고 7일간 배양 후 25μM의 FNIN2를 처리하고 72시간 동안 배양하였다. 그 후 0.5μM의 젬시타빈을 처리하고 다시 72시간 동안 배양하였다. Live & Dead assay를 통해 세포의 변화와 증식을 관찰 및 측정하였다.

도 3e는 췌장암 세포의 3차원 종양 모델에서 FNIN2와 젬시타빈을 각각 처리하였을 때와 병용 처리하였을 때의 항암 활성 차이를 나타낸 것이다. 이를 참조하면, 병용 처리 시 확연히 증가한 항암 활성을 확인할 수 있다. 또한, 도 4의 현미경 사진 및 형광 현미경 사진을 통해서 이에 상응하는 모습을 확인할 수 있다.

<실험예 2> FNIN2 펩티드와 독소루비신(doxorubicin) 처리에 따른 폐암 세포의 증식 관찰

(1) 폐암 세포(A 549)의 2차원 배양에서 FNIN2가 증식에 미치는 영향

A 549 (KCLB, Republic of Korea)는 RPMI (Hyclone, USA) + 10% FBS (Hyclone) + 1% P/S (Hyclone) + 1% L-Glutamine에서 배양하였으며, passage 12-15번 세포를 연구에 이용하였다. 펩티드의 효과 검증을 위해 A 549 (5×10³ cells/well)를 96 well 세포배양접시에 넣고 24시간 동안 부착시킨 후 0.1, 1, 5, 10, 25, 50μM의 FNIN2를 처리하고 72시간 동안 배양하였다. 배양 72시간 후 MTT assay를 이용하여 세포의 증식을 확인하였다.

도 5a는 폐암 세포의 2차원 배양에서 FNIN2의 농도에 따른 항암 활성을 나타낸 것이다. 이를 참조하면, 배양접시의 바닥면에 세포가 붙어서 자라는 2차원 배양에서는 FNIN2가 세포 성장에 대한 영향이 거의 없는 것을 알 수 있다.

(2) 폐암 세포의 3차원 배양에서 FNIN2가 증식에 미치는 영향

A 549 (5×10³ cells/well)를 Ultra Low Cluster 96 well 세포배양접시에 넣고 7일간 배양 후 0.1, 1, 5, 10, 25, 50μM의 FNIN2를 처리하고 72시간 동안 배양하였다. 배양 72시간 후 WST assay를 이용하여 세포의 증식을 확인하였다.

도 5b는 폐암 세포의 3차원 종양 모델에서 FNIN2의 농도에 따른 항암 활성을 나타낸 것이다. 이를 참조하면, 3차원 종양 모델에서는 FNIN2가 세포 간 결합을 끊어줌으로써 FNIN2의 농도에 따라 세포 증식을 억제하는 것을 알 수 있다. 이는 도 6의 현미경 사진 및 형광 현미경 사진을 통해서도 확인할 수 있다. 도 6의 녹색형광은 live cell을 나타내며, 적색형광은 dead cell을 나타낸다.

(3) 폐암 세포의 2차원 배양에서 독소루비신(doxorubicin)이 증식에 미치는 영향

A 549 (5×10³ cells/well)를 96 well 세포배양접시에 넣고 24시간 동안 부착시킨 후 0.01, 0.1, 0.5, 1, 2, 5, 10μM의 독소루비신을 처리하고 72시간 동안 배양하였다. 배양 72시간 후 MTT assay를 이용하여 세포의 증식을 확인하였다.

도 5c는 췌장암 세포의 2차원 배양에서 독소루비신의 농도에 따른 항암 활성을 나타낸 것이다. 2차원 배양에서는 세포 간 결합을 통해 생기는 물리적 장벽이 없기 때문에 0.1μM에서 폐암 세포의 증식이 50% 이상 억제되는 것을 관찰할 수 있다.

(4) 폐암 세포의 3차원 배양에서 Doxorubicin이 증식에 미치는 영향

A 549 (5×10³ cells/well)를 Ultra Low Cluster 96 well 세포배양접시에 넣고 7일간 배양 후 0.01, 0.1, 0.5, 1, 2, 5, 10μM의 독소루비신을 처리하고 72시간 동안 배양하였다. 배양 72시간 후 WST assay를 이용하여 세포의 증식을 확인하였다.

도 5d는 폐암 세포의 3차원 종양 모델에서 독소루비신의 농도에 따른 항암 활성을 나타낸 것이다. 이를 참조하면, 3차원 종양 모델은 세포간의 결합이 단단히 이루어져 있기 때문에 물리적 장벽을 형성하여 2차원 배양 세포와는 달리 10μM의 독소루비신을 사용하여도 세포 성장이 2차원 배양 시의 0.1μM보다 덜 억제됨을 확인할 수 있다. 이는 도 6의 현미경 사진 및 형광 현미경 사진을 통해서도 확인할 수 있다.

(5) 3차원 배양에서 FNIN2와 독소루비신의 병용처리 시 폐암 억제 효과

A 549 (5×10³ cells/well)를 96 well 세포배양접시에 넣고 7일간 배양 후 25μM의 FNIN2를 처리하고 72시간 동안 배양하였다. 그 후 1μM의 독소루비신을 처리하고 다시 72시간 동안 배양하였다. Live & Dead assay를 통해 세포의 변화와 증식을 관찰 및 측정하였다.

도 5e는 폐암 세포의 3차원 종양 모델에서 FNIN2와 독소루비신을 각각 처리하였을 때와 병용 처리하였을 때의 항암 활성 차이를 나타낸 것이다. 이를 참조하면, 병용 처리 시 확연히 증가한 항암 활성을 확인할 수 있다. 도 6의 현미경 사진 및 형광 현미경 사진을 통해서 이에 상응하는 모습을 확인할 수 있다.

<실험예 3> FNIN2 펩티드와 독소루비신(doxorubicin) 처리에 따른 유방암 세포의 증식 관찰

(1) 유방암 세포 (MDA MB-231)의 2차원 배양에서 FNIN2가 증식에 미치는 영향

MDA MB-231 (KCLB, Republic of Korea)는 RPMI (Hyclone, USA) + 10% FBS (Hyclone) + 1% P/S (Hyclone) + 1% L-Glutamine에서 배양하였으며, passage 7-10번 세포를 연구에 이용하였다. 펩티드의 효과 검증을 위해 MDA MB-231 (7×10³ cells/well)를 96 well 세포배양접시에 넣고 24시간 동안 부착시킨 후 0.1, 1, 5, 10, 25, 50μM의 FNIN2를 처리하고 72시간 동안 배양하였다. 배양 72시간 후 MTT assay를 이용하여 세포의 증식을 확인하였다.

도 7a는 유방암 세포의 2차원 배양에서 FNIN2의 농도에 따른 항암 활성을 나타낸 것이다. 이를 참조하면, 배양접시의 바닥면에 세포가 붙어서 자라는 2차원 배양에서는 FNIN2가 세포 성장에 대한 영향이 거의 없는 것을 알 수 있다.

(2) 유방암 세포의 3차원 배양에서 FNIN2가 증식에 미치는 영향

MDA MB-231 (9×10³ cells/well)를 Ultra Low Cluster 96 well 세포배양접시에 넣고 7일간 배양 후 0.1, 1, 5, 10, 25, 50μM의 FNIN2를 처리하고 72시간 동안 배양하였다. 배양 72시간 후 WST assay를 이용하여 세포의 증식을 확인하였다.

도 7b는 유방암 세포의 3차원 종양 모델에서 FNIN2의 농도에 따른 세포독성을 나타낸 것이다. 이를 참조하면, 3차원 종양 모델에서는 FNIN2가 세포 간 결합을 끊어줌으로써 FNIN2의 농도에 따라 세포 증식을 억제하는 것을 알 수 있다. 이는 도 8의 현미경 사진 및 형광 현미경 사진을 통해서도 확인할 수 있다. 도 8의 녹색형광은 live cell을 나타내며, 적색형광은 dead cell을 나타낸다.

(3) 유방암 세포의 2차원 배양에서 독소루비신이 증식에 미치는 영향

MDA MB-231 (7×10³ cells/well)를 96 well 세포배양접시에 넣고 24시간 동안 부착시킨 후 0.01, 0.1, 0.5, 1, 2, 5, 10μM의 독소루비신을 처리하고 72시간 동안 배양하였다. 배양 72시간 후 MTT assay를 이용하여 세포의 증식을 확인하였다.

도 7c는 췌장암 세포의 2차원 배양에서 독소루비신의 농도에 따른 항암 활성을 나타낸 것이다. 이를 참조하면, 2차원 배양에서는 세포 간 결합을 통해 생기는 물리적 장벽이 없기 때문에 1μM에서 폐암 세포의 증식이 50% 이상 억제되는 것을 관찰할 수 있다.

(4) 유방암 세포의 3차원 배양에서 독소루비신이 증식에 미치는 영향

MDA MB-231 (9×10³ cells/well)를 Ultra Low Cluster 96 well 세포배양접시에 넣고 7일간 배양 후 0.01, 0.1, 0.5, 1, 2, 5, 10μM의 독소루비신을 처리하고 72시간 동안 배양하였다. 배양 72시간 후 WST assay를 이용하여 세포의 증식을 확인하였다.

도 7d는 유방암 세포의 3차원 종양 모델에서 독소루비신의 농도에 따른 항암 활성을 나타낸 것이다. 이를 참조하면, 3차원 종양 모델은 세포간의 결합이 단단히 이루어져 있기 때문에 물리적 장벽을 형성하여 2차원 배양 세포와는 달리 10μM의 독소루비신을 사용하여도 세포 성장이 2차원 배양 시의 1μM보다 덜 억제됨을 확인할 수 있다. 이는 도 8의 현미경 사진 및 형광 현미경 사진을 통해서도 확인할 수 있다.

(5) 3차원 배양에서 FNIN2와 독소루비신의 병용처리 시 유방암 억제 효과

MDA MB-231 (9×10³ cells/well)를 96 well 세포배양접시에 넣고 7일간 배양 후 25μM의 FNIN2를 처리하고 72시간 동안 배양하였다. 그 후 1μM의 독소루비신을 처리하고 다시 72시간 동안 배양하였다. Live & Dead assay를 통해 세포의 변화와 증식을 관찰 및 측정하였다.

도 7e는 유방암 세포의 3차원 종양 모델에서 FNIN2와 독소루비신을 각각 처리하였을 때와 병용 처리 하였을 때의 항암 활성 차이를 나타낸 것이다. 이를 참조하면, 병용 처리시 확연히 증가한 항암 활성을 확인할 수 있다. 이는 도 8의 현미경 사진 및 형광 현미경 사진을 통해서도 이에 상응하는 모습을 확인할 수 있다.

이상으로 본 발명 내용의 특정한 부분을 상세히 기술하였는 바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서, 이러한 구체적 기술은 단지 바람직한 실시양태일 뿐이며, 이에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백하다. 즉, 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항들과 그것들의 등가물에 의하여 정의된다.

<110> Research Cooperation Foundation of Yeungnam University <120> PEPTIDES FNIN2 INHIBITING CANCER CELL PROLIFERATION AND USES THEROF <130> ADP-2020-0242 <150> KR 10-2019-0134505 <151> 2019-10-28 <160> 2 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 20 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> FNIN2 <400> 1 Leu Ser Ile Ser Pro Ser Asp Asn Ala Val Val Leu Thr Asn Leu Leu 1 5 10 15 Pro Thr Gly Glu 20 <210> 2 <211> 20 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> FNIN2-1 <400> 2 Leu Ser Ile Ser Pro Ser Asp Asn Ala Val Val Leu Thr Asn Leu Leu 1 5 10 15 Pro Gly Thr Glu 20

Claims

삭제
삭제
서열번호 1 또는 서열번호 2로 표시되는 아미노산 서열로 이루어진 펩티드를 유효성분으로 함유하는, 췌장암, 폐암 또는 유방암에 대한 항암제 치료 효과 증진용 약학 조성물.
삭제
제 3 항에 있어서,
상기 항암제는,
젬시타빈(gemcitabine), 카페시타빈(capecitabine), 시타라빈(cytarabine), 데시타빈(decitabine), 에노시타빈(enocitabine), 독소루비신(doxorubicin), 에피루비신(epirubicin), 다우노루비신(daunorubicin), 이다루비신(idarubicin) 및 미톡산트론(mitoxantrone)으로 이루어진 군에서 선택되는 하나 또는 둘 이상인 것을 특징으로 하는 췌장암, 폐암 또는 유방암에 대한 항암제 치료 효과 증진용 약학 조성물.
삭제
서열번호 1 또는 서열번호 2로 표시되는 아미노산 서열로 이루어진 펩티드 및 항암제를 유효성분으로 포함하는 췌장암, 폐암 또는 유방암 예방 또는 치료용 약학 조성물.
제 7 항에 있어서,
상기 조성물은,
상기 펩티드 및 항암제가 20 내지 60 : 1의 중량비로 포함되는 것을 특징으로 하는 췌장암, 폐암 또는 유방암 예방 또는 치료용 약학 조성물.
제 7 항에 있어서,
상기 펩티드는,
상기 항암제의 항암 활성을 증진시키는 것을 특징으로 하는 췌장암, 폐암 또는 유방암 예방 또는 치료용 약학 조성물.
제 7 항에 있어서,
상기 항암제는,
젬시타빈(gemcitabine), 카페시타빈(capecitabine), 시타라빈(cytarabine), 데시타빈(decitabine), 에노시타빈(enocitabine), 독소루비신(doxorubicin), 에피루비신(epirubicin), 다우노루비신(daunorubicin), 이다루비신(idarubicin) 및 미톡산트론(mitoxantrone)으로 이루어진 군에서 선택되는 하나 또는 둘 이상인 것을 특징으로 하는 췌장암, 폐암 또는 유방암 예방 또는 치료용 약학 조성물.
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사람을 제외한 동물에 서열번호 1 또는 서열번호 2로 표시되는 아미노산 서열로 이루어진 펩티드를 처리하는 단계를 포함하는 췌장암 세포, 폐암 세포 또는 유방암 세포 증식 억제 방법.