KR102322349B1

KR102322349B1 - 척수 손상 또는 척추관 협착증의 예방 또는 치료용 약제학적 조성물

Info

Publication number: KR102322349B1
Application number: KR1020200041361A
Authority: KR
Inventors: 이재열; 이경태; 윤태영
Original assignee: 주식회사 뉴로비트사이언스
Priority date: 2019-04-09
Filing date: 2020-04-06
Publication date: 2021-11-05
Anticipated expiration: 2040-04-06
Also published as: KR20200119204A; KR20210134552A

Abstract

본 발명은 3-(4-클로로페닐)-4-(4-아미노설폰일-페닐)-1-메틸-1H-피롤-2,5-디온 또는 이의 약제학적으로 허용되는 염을 포함하는 척수 손상 또는 척추관 협착증의 치료 또는 예방용 약제학적 조성물에 관한 것이다.
본 발명자들은 본 발명에 따른 화합물이 염증 매개 물질인 전염증성 사이토카인 및 PGE₂을 억제해 척수 손상 또는 척추관 협착증의 염증 또는 통증을 억제하는 것을 새롭게 발견하였는바, 본 발명에 따른 화합물은 척수 손상 또는 척추관 협착증으로 인한 염증 또는 통증 등을 효과적으로 억제할 수 있어 상기 손상 또는 협착증의 예방 또는 치료가 이루어지는 데 유용하게 쓰일 것으로 기대된다.

Description

척수 손상 또는 척추관 협착증의 예방 또는 치료용 약제학적 조성물 {Pharmaceutical composition for prevention or treatment of spinal cord injury or spinal stenosis}

본 발명은 3-(4-클로로페닐)-4-(4-아미노설폰일-페닐)-1-메틸-1H-피롤-2,5-디온 또는 이의 약제학적으로 허용되는 염을 포함하는 척수 손상 또는 척추관 협착증의 예방 또는 치료용 약제학적 조성물에 관한 것으로, 보다 구체적으로는 척수 손상 또는 척추관 협착증의 염증 매개 물질을 억제하여 상기 척수 손상 또는 협착증을 예방 또는 치료하는 조성물에 관한 것이다.

척추관 협착증 (spinal stenosis)은 뼈와 신경 구조를 이루는 연조직으로 둘러싸인 척추관이 좁아지는 의학적 상태를 말하며, 간헐성 파행증(intermittent claudication), 하지 통증, 보행 불능 등을 일으킨다.

척추관 협착증의 치료방법으로 외과적 감압술이 가장 일반적으로 제안되는 외과 치료적 옵션이나, 수술의 성공 가능성을 예측하기 어렵고, 박판 절제로 인해 근섬유 인대 등과 같은 해부학적 지지 구조의 파괴를 일으켜 근육 위축을 유발할 위험이 있어, 염증 또는 통증에 관여하는 생체 물질을 타깃 하는 약물의 적용으로 척추관 협착증을 치료하는 방법이 선호된다.

척추관 협착증의 약물은 주로 소염제, 진통제, 근 이완제 등이 사용되거나 스테로이드를 주사하는 방법 등이 있다. 이 중 스테로이드는 면역 억제 작용과 강력한 항 염증작용이 있는 부신 피질 호르몬제로서, 다발성 경화증과 같은 중추신경계 탈수 초성질환 등의 치료제로 널리 사용되지만, 장기간 사용시 스테로이드 유발 당뇨병, 골다공증, 혈압 증가 및 전해질 이상, 체중 증가, 면역력 약화 및 감염 가능성 증가, 소화성 궤양, 근병증, 뼈괴사, 백내장, 피부 변화, 행동 장애 등의 부작용이 있다.

척수 손상 (Spinal cord injury)은 척수의 기능에 일시적 또는 영구적 변화를 일으키는 손상을 의미하며, 손상 입은 부위 아래에 위치한 신체 부위의 감각의 상실, 근육 기능의 상실 및 요추의 통증 등을 일으킨다.

척수 손상의 치료로는 크게 약물치료와 외과적 수술에 의한 치료가 있는데 약물치료의 경우 급성 척수 손상에 대해 다량의 스테로이드를 투여하는 것이 회복에 효과가 있다는 보고가 있으나, 이 또한 상기 협착증의 스테로이드 사용 부작용과 동일한 부작용을 가지고 있어 사용상의 단점이 존재한다.

이에, 상기 척수 손상 또는 척추관 협착증의 치료를 위한 소염제로 셀레콕시브 (celecoxib)와 로페콕시브 (rofecoxib) 등, 콕시브 (coxib) 약물이 고려될 수 있으나, 2004년 머크사의 로페콕시브와 같은 콕시브 약물은 장기간 사용으로 심장 마비와 뇌졸중의 위험을 과도하게 증가시켜 금지된 바 있다.

또한, 일부 연구에서 심혈관계에 관한 로페콕시브의 부작용 문제가 로페콕시브의 신진대사(metabolism)와 관련된 본질적인 화학적 성질일 수 있다는 것이 확인된 바 있어, 새로운 화합물 구조의 발굴이 절실히 요구되고 있으며 이에 관한 연구도 활발히 이루어지고 있다 (British Journal of Pharmacology (2012) 165, Shin et al.).

본 발명자들은 척수 손상 또는 척추관 협착증에 효과적인 화합물을 발굴하기 위한 연구를 진행한 결과, 본 발명의 화합물을 포함하는 조성물이 염증 또는 통증을 일으키는 전염증성 매개 물질의 발현을 억제하는 것을 확인함으로써, 본 발명을 완성 하였다.

이에, 본 발명은 하기 화학식 (Ⅰ)의 화합물 또는 이의 약제학적으로 허용되는 염을 포함하는 척수 손상 또는 척추관 협착증에 의해 유발되는 증상의 예방 또는 치료용 약제학적 조성물을 제공하는 것을 목적으로 한다.

[화학식 Ⅰ]

그러나 본 발명이 이루고자 하는 기술적 과제는 이상에서 언급한 과제에 제한되지 않으며, 언급되지 않은 또 다른 과제들은 아래의 기재로부터 당업자에게 명확하게 이해될 수 있을 것이다.

상기와 같은 본 발명의 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은

하기 화학식 (Ⅰ)의 화합물 또는 이의 약제학적으로 허용되는 염을 포함하는 척수 손상 또는 척추관 협착증에 의해 유발되는 증상의 예방 또는 치료용 약제학적 조성물을 제공한다.

[화학식 Ⅰ]

또한, 본 발명은 상기 척추 협착증은 요추 척추관 협착증(Lumbar spinal stenosis)인 것을 특징으로 하는, 약제학적 조성물을 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 조성물은 간헐성 파행증(intermittent claudication), 부전마비, 감각 저하, 감각 이상, 감각 장애, 염증 또는 통증을 억제하는 것을 특징으로 하는, 약제학적 조성물을 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 조성물을 개체에 투여하는 단계를 포함하는, 척수 손상 또는 척추관 협착증으로 인한 증상의 예방 또는 치료방법을 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 조성물의 척수 손상 또는 척추관 협착증으로 인한 증상의 예방 또는 치료용도를 제공한다.

본 발명자들은 3-(4-클로로페닐)-4-(4-아미노설폰일-페닐)-1-메틸-1H-피롤-2,5-디온 또는 이의 약제학적으로 허용되는 염을 포함하는 화합물이 척수 손상 및 척추관 협착증의 염증 또는 통증을 억제하는 것을 새롭게 발견하였는바, 본 발명에 따른 화합물은 척수 손상 또는 척추관 협착증으로 인한 염증 또는 통증을 효과적으로 억제할 수 있어 상기 손상 또는 협착증의 예방 또는 치료가 이루어지는 데 유용하게 쓰일 것으로 기대된다.

도 1은 마미(cauda equina) 압박을 통한 만성 기계 이질통 유발 동물 모델 제조에 관한 것으로, 도 1a는 타깃 요추 부위를 나타낸 것이고, 도 1b는 상기 동물 모델 제작에 사용되는 실리콘 블록을 나타낸 것이며, 도 1c는 타깃 요추 부위에 실리콘 블록이 삽입된 모습을 나타낸 것이다.
도 2는 본 발명에 따른 화합물의 LPS에 의해 유도된 PEG₂ 생성 억제 효과를 나타낸 것이다.
도 3은 만성 기계 이질통이 유발된 랫트의 마미(cauda equina)에서 대식세포의 침윤을 확인한 결과에 관한 것으로, 도 3a는 만성 기계 이질통 유발 동물 모델과 모의 대조군 (허위 수술 그룹)의 로타로드 테스트 결과를 나타낸 것이고, 도 3b는 만성 기계 이질통 유발 동물 모델과 모의 대조군 (허위 수술 그룹)의 회피반응 역치 (paw withdrawal threshold, PWT)를 측정한 결과를 나타낸 것이며, 도 3c는 만성 기계 이질통 유발 동물 모델에서 마미(cauda equina)를 압박한 후 압박 부위 및 비 압박 부위에서 ED-1 양성 대식세포의 관찰 결과를 나타낸 것이다.
도 4는 마미(cauda equina) 압박으로 인해 유발된 기계적 통증과 염증에 억제제의 역할을 확인한 결과에 관한 것으로, 도 4a는 셀레콕시브를 만성 기계 이질통 유발 동물 모델에 적용한 경우의 PWT 측정 결과를 나타낸 것이고, 도 4b는 본 발명에 따른 화합물을 만성 기계 이질통 유발 동물 모델에 적용한 경우의 PWT 측정 결과를 나타낸 것이며, 도 4c는 셀레콕시브와 본 발명에 따른 화합물을 만성 기계 이질통 유발 동물 모델에 적용한 경우에 30분 후의 TNF-α, 인터루킨-1β(interleukin-1β, IL-1β), IL-6, inducible nitric oxide synthase (iNOS) mRNA의 발현 결과를 나타낸 것이며, 도 4d는 셀레콕시브와 본 발명에 따른 화합물을 만성 기계 이질통 유발 동물 모델에 적용한 경우의 상기 염증 매개 물질의 상대 발현량을 측정한 결과를 나타낸 것이고, 도 4e는 셀레콕시브와 본 발명에 따른 화합물을 만성 기계 이질통 유발 동물 모델에 적용한 경우의 PEG₂ 발현량을 측정한 결과를 나타낸 것이다.

이하, 본 발명을 상세히 설명한다.

본 발명은, 화학식 (Ⅰ)의 화합물 또는 이의 약제학적으로 허용되는 염을 포함하는 척수 손상 또는 척추관 협착증의 치료 또는 예방용 약제학적 조성물에 관한 것이다.

[화학식 Ⅰ]

본 발명의 화합물은 1-H 피롤 또는 푸란-2,5-디온의 유도체로서, 3-(4-클로로페닐)-4-(4-아미노설폰일-페닐)-1-메틸-1H-피롤-2,5-디온이라 명명한다.

본 발명에서 사용되는 용어, "예방"이란 본 발명에 따른 약제학적 조성물의 투여에 의해 척수 손상 또는 척추관 협착증을 억제시키거나 발병을 지연시키는 모든 행위를 의미한다.

본 발명에서 사용되는 용어, "치료"란 본 발명에 따른 약제학적 조성물의 투여에 의해 척수 손상 또는 척추관 협착증에 대한 증세가 호전되거나 이롭게 변경되는 모든 행위를 의미한다.

본 발명에서 사용되는 용어 "염"은 약학적으로 허용 가능한 유리산(free acid)에 의해 형성된 산 부가염이 유용하다. 산 부가염은 염산, 질산, 인산, 황산, 브롬화수소산, 요드화수소산, 아질산 또는 아인산과 같은 무기산 류와 지방족 모노 및 디카르복실레이트, 페닐-치환된 알카노에이트, 하이드록시 알카노에이트 및 알칸디오에이트, 방향족 산류, 지방족 및 방향족 설폰산류와 같은 무독성 유기산으로부터 얻는다. 이러한 약학적으로 무독한 염류로는 설페이트, 피로설페이트, 바이설페이트, 설파이트, 바이설파이트, 니트레이트, 포스페이트, 모노하이드로겐 포스페이트, 디하이드로겐 포스페이트, 메타포스페이트, 피로포스페이트 클로라이드, 브로마이드, 아이오다이드, 플루오라이드, 아세테이트, 프로피오네이트, 데카노에이트, 카프릴레이트, 아크릴레이트, 포메이트, 이소부티레이트, 카프레이트, 헵타노에이트, 프로피올레이트, 옥살레이트, 말로네이트, 석시네이트, 수베레이트, 세바케이트, 푸마레이트, 말리에이트, 부틴-1,4-디오에이트, 헥산-1,6-디오에이트, 벤조에이트, 클로로벤조에이트, 메틸벤조에이트, 디니트로벤조에이트, 하이드록시벤조에이트, 메톡시벤조에이트, 프탈레이트, 테레프탈레이트, 벤젠설포네이트, 톨루엔설포네이트, 클로로벤젠설포네이트, 크실렌설포네이트, 페닐아세테이트, 페닐프로피오네이트, 페닐부티레이트, 시트레이트, 락테이트, 베타-하이드록시부티레이트, 글 리콜레이트, 말레이트, 타트레이트, 메탄설포네이트, 프로판설포네이트, 나프탈렌-1-설포네이트, 나프탈렌-2-설포네이트 또는 만델레이트를 포함한다.

본 발명에 따른 산 부가염은 통상의 방법, 예를 들면, 상기 화합물을 과량의 산 수용액 중에 용해시키고, 이 염을 수혼화성 유기 용매, 예를 들면 메탄올, 에탄올, 아세톤 또는 아세토니트릴을 사용하여 침전시켜서 제조할 수 있다. 또한 이 혼합물에서 용매나 과량의 산을 증발시킨 후 건조시키거나 또는 석출된 염을 흡입 여과시켜 제조할 수도 있다.

또한, 염기를 사용하여 약학적으로 허용 가능한 금속염을 만들 수도 있다. 알칼리 금속 또는 알칼리 토금속 염은 예를 들면, 화합물을 과량의 알칼리 금속 수산화물 또는 알칼리 토금속 수산화물 용액 중에 용해하고, 비용해 화합물 염을 여과하고, 여액을 증발, 건조시켜 얻는다. 이때, 금속염으로는 나트륨, 칼륨 또는 칼슘염을 제조하는 것이 제약상 적합하다. 이에 대응하는 은염은 알칼리 금속 또는 알칼리 토금속 염을 적당한 음염 (예, 질산은)과 반응시켜 얻는다.

또한, 본 발명의 화합물은 약학적으로 허용되는 염 뿐만 아니라, 통상의 방법에 의해 제조될 수 있는 모든 염, 이성질체, 수화물 및 용매화물을 모두 포함한다.

본 발명에서 대상으로 하는 질환인, "척수 손상 (spinal cord injury, SCI)"은　사고나 질병에 의해 척추 (척추 내에 존재하는 중추신경)가 손상되면서 척수가 함께 손상되거나, 질병에 의해 척수가 손상되는 것을 말하며, 증상으로는 뇌와 신체 사이에 신경전달이 제대로 일어나지 못해 발생하는 운동, 감각 마비 등이 있으나, 이에 제한되지 않는다.

또한, 척추관은 척추 가운데 관 모양의 속이 빈 곳으로, 아래 위 척추에 의해 추간공이 생기며 가운데 관 속은 뇌로부터 팔다리까지 신경 (척수)이 지나가는 통로가 된다. 관 모양은 타원형 또는 삼각형으로 경추 부위 (목 쪽)에서 가장 크며 흉추 부위 (가슴　쪽)에서 좁아졌다가 요추부 (허리 쪽)에서 다시 커진 후 하부로 갈수록 좁아지는 구조를 가지는데, "척추관 협착증 (spinal　stenosis)"은 척추　중앙의 척추관, 신경근관 또는 추간공이 좁아져서 허리의　통증을 유발하거나　다리에 여러 복합적인　신경증세를 일으키는 질환이다. 척추관 협착증은 요추부에 주로 많이 발생하여, 일반적으로 척추관 협착증이라 하는 것은 요추 척추관 협착증을 말하나, 본 발명의 척추관 협착증은 요추 척추 협착증일 수 있으며, 이에 제한되지 않고 척추관과 관련하여 발생하는 다양한 협착증을 포함하는 의미이다.

또한, "요추 척추관 협착증 (lumbar spinal stenosis, LSS)"은 요추부의 뼈와 신경 구조를 이루는 연조직으로 둘러싸인 척추관이 좁아지는 질환을 말한다. 상기 척추관 협착증의 원인으로는 요추 전방전위증 (lumbar spondylolisthesis), 추간원판 탈출 (slipped disk), 인대 비후 (ligamentous thickening) 및 노화에 따른 척추 퇴행을 들 수 있다. 본 발명에 따른 상기 척추관 협착증의 증상으로는 간헐성 파행증 (intermittent claudication), 하지 통증, 보행 불능, 마미(cauda equina) 신경섬유의 압축 (compression), 과민증 (hypersensitivity), 중추신경계 및 말초신경계의 감작 (sensitization) 유도, 이로 인해 심각한 신경병증성 통증, 부전마비, 감각 저하, 감각 이상, 감각 장애 등이 있으나, 이에 제한되지 않는다.

한편, 신경 염증 반응은 척추 신경병증 통증 발달 및 유지에 중요한 역할을 하는 것으로 알려져 있다. 조직 손상이 일어난 후, 면역세포가 손상 지점으로 이동하여 전염증성 사이토카인 (pro-inflammatory cytokine)을 생산하고, 염증반응을 매개한다. 전염증성 사이토카인으로는 TNF-α, IL-1β, IL-6, iNOS 및 신경세포의 통증 전달을 민감하게 만드는 프로스타글란딘 E2 (prostaglandin E2)가 있다.

본 발명의 일 실시예에서는, 본 발명의 화합물을 신경병증성 통증 유발 랫트에 투여하여 통증에 대한 역치가 비히클 군에 비해 유의하게 증가한 것을 관찰함으로써, 본 발명의 화합물이 효과적으로 척추관 협착증의 통증을 억제하는 것을 확인할 수 있었다 (시험예 4 참조).

또한, 본 발명의 화합물을 고용량으로 투여한 경우, 투여 후 3시간 경과 시까지 진통 효과가 유지되는 것을 관찰함으로써, 본 발명의 화합물이 마미(cauda equina)를 압박하여 발생하는 만성 기계 이질통에 대해 완화 효과가 있음을 확인할 수 있었다 (시험예 4 참조).

본 발명의 다른 실시예에서는 소염제인 셀레콕시브 또는 본 발명에 따른 화합물이 투여된 랫트를 사용하여 염증 매개 물질의 생성이 억제되는지 여부를 RT-PCR을 통해 관찰하는 실험을 수행하였고, 전염증성 사이토카인 및 PGE₂의 생성이 억제되는지 여부를 ELISA를 통해 관찰하는 실험을 수행한 결과, TNF-α, IL-1β, IL-6, 및 iNOS mRNA의 발현이 유의적으로 감소하였으며, 마미(cauda equina)에서의 PGE₂ 생성이 유의하게 감소하는 것을 통해, 본 발명의 화합물이 마미(cauda equina)를 압박하여 발생하는 염증에 대한 예방 또는 완화 효과가 있음을 확인할 수 있었다 (시험예 5 참조).

상기 결과들은 척수 손상 또는 척추관 협착증의 증상인 만성 기계 이질통 또는 염증을 완화시킬 수 있는, 본 발명의 화합물의 유용성을 입증하는 것이다.

본 발명에 따른 약제학적 조성물은 3-(4-클로로페닐)-4-(4-아미노설폰일-페닐)-1-메틸-1H-피롤-2,5-디온 또는 이의 약제학적으로 허용되는 염을 유효성분으로 포함하며, 또한 약제학적으로 허용 가능한 담체를 포함할 수 있다.

상기 약제의 제조에 있어서 본 발명의 화합물 또는 이의 약제학적으로 허용되는 염의 함량은 약제의 형태에 따라 다르지만, 바람직하게는 0.01 내지 100 중량%의 농도이다. 상기 약제학적으로 허용 가능한 담체는 제제시에 통상적으로 이용되는 것으로서, 식염수, 멸균수, 링거액, 완충 식염수, 사이클로덱스트린, 덱스트로즈 용액, 말토덱스트린 용액, 글리세롤, 에탄올, 리포좀 등을 포함하지만 이에 한정되지 않으며, 필요에 따라 항산화제, 완충액 등 다른 통상의 첨가제를 더 포함할 수 있다. 또한 희석제, 분산제, 계면활성제, 결합제, 윤활제 등을 부가적으로 첨가하여 수용액, 현탁액, 유탁액 등과 같은 주사용 제형, 환약, 캡슐, 과립, 또는 정제로 제제화할 수 있다. 적합한 약제학적으로 허용되는 담체 및 제제화에 관해서는 레밍턴의 문헌에 개시되어 있는 방법을 이용하여 각 성분에 따라 바람직하게 제제화할 수 있다. 본 발명의 약제학적 조성물은 제형에 특별한 제한은 없으나 주사제, 흡입제, 피부 외용제, 또는 경구 섭취제 등으로 제제화할 수 있다.

본 발명의 약제학적 조성물은 목적하는 방법에 따라 경구 투여하거나 비경구투여 (예를 들어, 정맥 내, 피하, 피부, 비강, 기도에 적용)할 수 있으며, 투여량은 환자의 상태 및 체중, 질병의 정도, 약물형태, 투여경로 및 시간에 따라 다르지만, 당업자에 의해 적절하게 선택될 수 있다.

본 발명에 따른 조성물은 약제학적으로 유효한 양으로 투여한다. 본 발명에 있어서, “약제학적으로 유효한 양”은 의학적 치료에 적용 가능한 합리적인 수혜/위험 비율로 질환을 치료하기에 충분한 양을 의미하며, 유효용량 수준은 환자의 질환의 종류, 중증도, 약물의 활성, 약물에 대한 민감도, 투여 시간, 투여 경로 및 배출 비율, 치료 기간, 동시 사용되는 약물을 포함한 요소 및 기타 의학 분야에 잘 알려진 요소에 따라 결정될 수 있다. 본 발명에 따른 조성물은 개별 치료제로 투여하거나 다른 치료제와 병용하여 투여될 수 있고 종래의 치료제와는 순차적 또는 동시에 투여될 수 있으며, 단일 또는 다중 투여될 수 있다. 상기한 요소들을 모두 고려하여 부작용 없이 최소한의 양으로 최대 효과를 얻을 수 있는 양을 투여하는 것이 중요하며, 이는 당업자에 의해 용이하게 결정될 수 있다.

구체적으로, 본 발명에 따른 조성물의 유효량은 환자의 나이, 성별, 체중에 따라 달라질 수 있으며, 일반적으로는 체중 1 kg 당 0.001 내지 150 mg, 바람직하게는 0.01 내지 100 mg을 매일 또는 격일 투여하거나 1일 1회 내지 3회로 나누어 투여할 수 있다. 그러나 투여 경로, 척수 손상 또는 척추관 협착증의 중증도, 성별, 체중, 연령 등에 따라서 증감될 수 있으므로 상기 투여량이 어떠한 방법으로도 본 발명의 범위를 한정하는 것은 아니다.

한편, 본 발명의 다른 양태로서, 본 발명은 상기 약제학적 조성물을 개체에 투여하는 단계를 포함하는 척수 손상 또는 척추관 협착증 예방, 조절 또는 치료방법을 제공한다.

본 발명에서 "개체"란 질병의 예방, 조절 또는 치료방법을 필요로 하는 대상을 의미하고, 보다 구체적으로는, 인간 또는 비-인간인 영장류, 생쥐(mouse), 쥐(rat), 개, 고양이, 말 및 소 등의 포유류를 의미한다.

이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 바람직한 실시예를 제시한다. 그러나 하기의 실시예는 본 발명을 보다 쉽게 이해하기 위하여 제공되는 것일 뿐, 하기 실시예에 의해 본 발명의 내용이 한정되는 것은 아니다.

[실시예]

실시예 1. 실험준비 및 실험방법

1-1. ¹ H NMR Spectra와 ¹³ C NMR Spectra

본 실험에서 ¹H NMR Spectra와 ¹³C NMR Spectra에 사용된 기기는 Bruker Avance DXR 400 (400 MHz) Spectrometer이다.

또한, chemical shift (δ)는 테트라메틸실란(tetramethylsilane) (TMS)을 내부 기준 물질로 사용하여 ppm으로 표시하였고, coupling constant (J)는 Hertz (Hz)로 표시하였으며, signal multiplicities는 s (singlet), d (doublet), t (triplet), q (quartet), br (broad), m (multiplet), dd (doulet of doublet)로 표시하였다.

또한, Low-Resolution 및 High-Resolution Mass Spectra (FABMS, FAB+ energy; 6kev, Emission Current: 5mA, Acceleration Voltage: 10kV)는 JMS-700 Mass Spectrometer (JEOL, JAPAN)를 이용하였다.

한편, TLC는 실리카 겔(silica gel) (E.Merck Kiesegel 60F₂₅₄layer Thickness 0.25 mm)이 도포된 유리판을 사용하였으며, TLC 상에서의 유기 화합물 확인을 위해 254 mm와 365 mm의 자외선이나 포스포몰리브덴산(phosphomolybdic acid) (PMA) 5 % 에탄올(ethanol) 용액, p-아니스알데하이드(p-anisaldehyde) 5 % 에탄올(ethanol) 용액 또는 닌하이드린(ninhydrin) 5 % 에탄올(ethanol) 용액을 발색제로 이용하였다.

또한, 유기 혼합물의 분리에 사용한 flash column chromatography의 실리카 겔은 Merck Kiesegel 60Art 9385 (230~400 mesh)를 사용하였다.

마지막으로, 반응에 필요한 시약들은 주로 Sigma-Aldroch, TCI, Acros 또는 Fluka 등의 회사에서 구입하였으며, 정제가 필요한 용매는 이미 알려진 방법에 의해 정제하여 사용하였다.

1-2. 동물 및 윤리강령 (ethics statement)

본 발명에 관한 실험을 위해, 총 167마리의 Spraque-Dawley 수컷 랫트 (250 내지 270 g, Samtako, Osan, Korea)를 사용하였다. 동물은 물과 먹이에 자유롭게 접근할 수 있도록 12 h light/ dark cycle (light on 07:30-19:30 h) 하에서 상온 (23 ± 1 ℃) 및 습도 (60 ± 10 %)의 환경에서 보관되었다. 랫트를 아스펜 쉐이빙 베딩을 깔아 놓은 케이지 (410 X 282 X 153 mm, 투명 폴리 카보네이트)에 한 마리씩 수용하고 상업 식이요법 (5L79, PMI Nutrition International, St Louis, MO), 상업 표준 먹이 (Lab Diet 5L791 Purina Mills, Richmond, IN)를 제공하였다. 모든 동물 실험은 경희 대학교의 동물 보호 위원회 가이드라인 (허가번호: KHUASP(SE)-15-006)에 따라 수행되었으며, 통증 연구를 위한 국제 협회의 윤리 이슈를 준수하였다.

1-3. 수술과 마미(cauda equina) 압박

마미(Cauda equina) 압박은 이전 보고서에 기초하여 유도되었다[PLoS One (2013) e56580, Ma et al.].

랫트의 수술과정은 도 1에서 나타낸 바와 같다. 보다 구체적으로, 복강 내 주사로 chloral hydrate (500 mg/kg)를 투여하여 랫트를 마취시키고 등 (back) 영역을 면도하고 L4-S2 척추판을 노출시켰다.

그 다음으로, L4와 L5 사이의 척추 인대(ligamenta flava)를 제거하고, 사다리꼴 모양의 실리콘 블록 (1.00 mm 길이 X 1.2 내지 1.3 mm 너비 X 1.00 mm 높이)을 경막 외 공간에 삽입하여 L5 및 L6 척추판에 놓고 경막낭 (dural sac)을 파괴시켰다.

한편, 모의 대조군 (허위 수술 그룹)의 경우, 랫트에 실리콘 블록을 삽입하지 않고 단지 후방 개방 및 천공만 수행하였다.

수술 과정을 거치면서 랫트의 체온은 가열 패드 (Biomed S.L., Alicante, Spain)를 사용하여 37 ± 0.5 ℃로 유지하였다. 상기의 손상 후 근육과 피부를 막은 다음 랫트를 온도 및 습도 조절 챔버에 밤새 두었다.

수술을 받은 랫트는 5일 동안 1일 1회 피하 보충 수액 (5 ml, lactated ringer)과 항생제 (gentamicin, 5 mg/kg, 복강 내 주사)를 투여 받았다. 모든 동물 모델에 대해 체중과 남은 음식 및 수분량을 매일 아침 기록하였다.

1-4. 행동 평가(behavior assessment)

로타로드 시스템 (rotarod system, Rota ROD-R V2.0, B. S. Technolab.Inc)을 사용하여 운동 부하 (locomotor activity)를 측정하였다.

보다 구체적으로, 랫트를 4 rpm에서 40 rpm까지 속도가 증가하는 막대(rod) 상에 두었다 (5초 당 1 rpm으로 가속). 랫트가 막대에서 떨어질 때까지 걷는 시간은 각 동물에 대해 3번 측정하였다. 상기의 측정 전에 랫트를 4 rpm의 일정 속도로 3분 동안 막대에 적응시켰다. 실험 간 간격은 20분으로 하였다. 통계 분석을 위해 3번의 임상 실험의 평균 값을 계산하였다.

Mechanicl allodynia는 보정된 von Frey 필라멘트 자극에 의한 반응을 감지 (probing)한 것으로, 회피반응 역치 (paw withdrawal threshold, PWT)에 의해 평가되었다. 통증 행동 검사는 실험 조건에 관해 모르는 숙련된 연구자에 의해 수행되었다.

1-5. 약물 투여

마미(Cauda equina) 압박 후 28일 째에 350 내지 380 g 사이의 만성 기계 이질통 (mechanical allodynia, 2.5-4.0 g)이 유발된 랫트만을 실험군으로 선택하였다. 상기 랫트들을 비히클, 셀레콕시브, 본 발명에 따른 화합물을 처리한 각 실험군으로 무작위로 분류하였다.

셀레콕시브 (Sigma, St. Louis, MO) 또는 본 발명에 따른 화합물을 메틸 피롤리돈 (methyl pyrrolidone) : Tween-80 : saline (1 : 1 : 8, 100 μl)에 용해시키고 복강 내 주사로 2, 5 또는 10 mg/kg로 투여하였다. 비히클 군은 해당 시점에서 1-메틸-2-피롤리돈(1-Methyl-2-pyrrolidone : Tween-80 : saline (1 : 1 : 8))을 등용량으로 주입하였다.

1-6. 조직 준비

피크 효과 (약물 주입 후 30분) 시, 랫트를 클로랄수화물(chloral hydrate) (500 mg/kg)를 주입하여 마취시키고 0.1 M PBS (pH 7.4)로 관류시킨 다음, PBS에 4 % 파라 포름알데히드를 넣은 용액으로 관류시켰다.

동결 절편을 만들기 위해 세그먼트를 OCT에 엠베딩하고 크라이오스탯(cryostat) (CM1850; Leica, Wetzlar, Germany)를 이용하여 10 ℃에서 절편으로 절단하였다.

분자 수준의 분석 작업을 위해, 랫트를 0.1 M PBS로 관류시키고, 손상 부위가 중심에 위치한 20 mm의 마미(cauda equina) 절편을 분리하여, 사용할 때까지 -80 ℃에서 동결시켰다.

1-7. 면역조직화학(immunohistochemistry)

동결 절편을 ED-1에 대한 항체 (CD68, 1 : 200, Serotec, Raleigh, NC) 및 COX-2에 대한 항체 (1 : 100, Abcam, MA)로 면역 조직 화학적으로 처리를 하였다. 형광 신호는 형광 현미경 (BX51, Olympus, Japan)에 의해 검출되었고, 신호 동시 측정 (measurement of signal colocalization)은 MetaMorph 소프트웨어 (Molecular devaices, Sunnyvale, CA)를 사용하여 수행되었다.

1-8. 웨스턴 블롯(Western blot)

압박 부위를 포함하는 마미(cauda equina) 절편으로부터의 총 단백질을 준비하고 웨스턴 블롯 분석을 수행하였는데, 웨스턴 블롯에 사용된 일차 항체는 다음과 같다; COX-2 (1 : 1000, Abcam) 및 β-tublin (1 : 3000, Sigma).

밴드의 정량화는 AlphaImager 소프트웨어 (Alpha Innotech Coperation, San Leandro, CA)를 사용하여 수행되었다.

1-9. RNA 분리 및 실시간 RT-PCR

tnf-α, il-1β, il-6, inos 및 gapdh의 RT-PCR을 수행하였다. 각 서열의 프라이머는 하기의 표 1과 같다 (5' -> 3').

구분	명칭	forward	reverse
1	TNF-α	5'-CCC AGA CCC TCA CAC TCA GAT-3'	5'-TTG TCC CTT GAA GAG AAC CTG-3'
2	IL-1β	5'-GCA GCT ACC TAT GTC TTG CCC GTG-3'	5'-GTC GTT GCT TGT CTC TCC TTG TA-3'
3	IL-6	5'-AAG TTT CTC TCC GCA AGA TAC TTC CAG CCA-3'	5'-AGG CAA ATT TCC TGG TTA TAT CCA GTT-3'
4	COX-2	5'-CCA TGT CAA AAC CGT GGT GAA TG-3'	5'-ATG GGA GTT GGG CAG TCA TCA G-3'
5	iNOS	5'-CTC CAT GAC TCT CAG CAC AGA G-3'	5'-GCA CCG AAG ATA TCC TCA TGA T-3'
6	GAPDH	5'-AAC TTT GGC ATT GTG GAA GG-3'	5'-GGA GAC AAC CTG GTC CTC AG-3'

1-10. PGE ₂ level 측정

마미(cauda equina) 섬유에서의 PEG₂의 수준은 PEG₂ ELISA 키트 (Monoclonal, Cayman Chemical Ann Arbor, MI)를 사용하여 제조자의 지시에 따라 분석하였다.

1-11. 통계 분석

데이터는 평균 ±SD 또는 SEM으로 표시된다.

실험군 간 비교는 unpaired student t test를 사용하여 통계적 유의성을 평가하였다. 그룹 간의 다중 비교는 one-way ANOVA로 수행되었다.

일부 행동 평가 점수는 반복 측정 ANOVA로 분석되었다. Dunnett의 경우 비교는 Posthoc anlaysis로 사용되었다.

그룹의 크기는 각 그룹의 동물 수로 표현되었다. 통계적 유의성은 p < 0.05로 받아들여졌다. 모든 통계 분석은 SPSS 15.0 (SPSS science, Chicago, IL)를 사용하여 수행되었다.

실시예 2. 본 발명의 화합물인 3-(4-클로로페닐)-4-(4-아미노설폰일-페닐)-1-메틸-1 H -피롤-2,5-디온의 제조

2-1. 2-(4-(클로로설폰일)페닐)아세트산의 제조

ICE bath에서 ClSO₃(20 ml)을 냉각시켰다. 여기에 페닐아세트산 (phenylacetic acid, 5.00 g, 36.72 mmol)을 천천히 첨가한 후, ice bath를 제거하고 용액의 온도를 상온으로 올려 12시간 동안 교반하였다. 반응이 완료되면, 용액을 얼음물에 천천히 떨어뜨려 남아있는 ClSO₃H를 제거하였다. 이를 여과하여 흰색의 고체 생성물인 2-(4-(클로로설폰일)페닐)아세트산을 얻었다 (7.84 g, 91 %).

¹H-NMR (400 MHz, DMSO-d ₆) δ: 11.6 (1H, s), 7.56 (2H, d, J = 8.4Hz), 7.23 (2H, d, J = 8.4Hz), 3.58 (2H, s).

2-2. 2-(4-설파암모일페닐)아세트산의 제조

ICE bath에서 실시예 2-1에서 얻은 2-(4-(클로로설폰일)페닐)아세트산 (2.00 g, 8.55 mmol)을 무수 MeOH에 녹이고 냉각시켰다. 여기에 NH₄OH (25 %)를 과량 적가한 후 ice bath를 제거하고 용액의 온도를 상온으로 올려 12시간 동안 교반하였다. 반응이 종결되면 HCl을 가하여 산성화시키고 감압 하에 12시간 동안 교반하였다. 반응이 종결된 후 HCl을 가하여 산성화시키고 감압 하에 용매를 제거하였다, EtOAc를 이용하여 추출하고 유기층을 무수 MgSO₄로 건조시킨 뒤, 감압하여 용매를 제거하였다. 유기층으로부터 얻은 반응 혼합물을 ACN과 DCN을 이용하여 결정화하고 이로부터 흰색의 고체 생성물인 2-(4-설파암모일페닐)아세트산을 얻었다 (1.03 g, 56 %).

¹H-NMR (400 MHz, DMSO-d ₆) δ: 7.75 (2H, d, J = 8.4Hz), 7.44 (2H, d, J = 8.4Hz), 7.34 (2H, s), 3.68 (2H, s).

2-3. 에틸 2-(4-메틸페닐)-2-옥소아세테이트의 제조

클로로벤젠 (2.00 g, 17.77 mmol)을 무수 조건 하에서, 무수 DCM에 녹이고 저온 반응기를 이용하여 -5 ℃로 냉각시켰다. 여기에 무수 AlCl₃(2.1 g, 16.28 mmol)와 에틸 클로로옥소아세테이트 (ethyl chlorooxoacetate, 0.6 ml, 5.43 mmol)를 천천히 적가하였다. 0 ℃에서 4시간 동안 교반한 후 얼음에 생성물을 가하여 반응을 종결시켰다. DCM으로 추출한 후, 유기층을 증류수로 닦아주었다. 그 다음으로, 무수 MgSO₄로 건조시킨 후 감압하여 여과하였다. 다시 감압 하에서 용매를 제거하여 연 노랑색의 액체 생성물인 에틸 2-(4-메틸페닐)-2-옥소아세테이트를 얻었다 (3.01 g, 80 %).

¹H-NMR (400 MHz, CDCL₃-d) δ: 7.99 (2H, d, J = 8.4Hz), 7.49 (2H, d, J = 8.4Hz), 4.45 (2H, q, J = 7.2Hz), 1.43 (3H, t, J = 7.2Hz).

2-4. 2-(4-클로로페닐)-2-옥소아세트산의 제조

실시예 2-3에서 얻은 에틸 2-(4-메틸페닐)-2-옥소아세테이트 (0.26 g, 1.23 mmol)를 DCM에 녹이고 2N NaOH를 과량으로 넣은 후 상온에서 3시간 동안 교반하였다. 반응이 종결되면 HCl을 가하여 산성화시키고 DCM으로 추출하였다. 유기층을 무수 MgSO₄로 건조시킨 뒤, 감압하여 용매를 제거하였다. 유기층으로부터 얻은 반응 혼합물을 DCM과 헥산 (hexane)을 이용하여 결정화하고 이로부터 흰색의 고체 생성물인 2-(4-클로로페닐)-2-옥소아세트산을 얻었다 (0.14g, 60%).

¹H-NMR (400 MHz, CDCL₃-d) δ: 8.31 (2H, d, J = 8.8Hz), 7.53 (2H, d, J = 8.8Hz)

2-5. 3-(4-클로로페닐)-4-(4-아미노설폰일-페닐)-1-메틸-1 H -피롤-2,5-디온의 제조

실시예 2-2에서 얻은 2-(4-설파암모일페닐)아세트산 (0.10 g, 0.46 mmol)과 실시예 2-4에서 얻은 2-(4-클로로페닐)-2-옥소아세트산 (0.09 g, 0.46 mmol)을 Ac₂O로 녹인 후, 85 ℃에서 환류시키며 8시간 동안 교반하였다. 반응이 완료되면 높은 온도에서 감압 하에 용매를 제거하였다. 반응 혼합물을 EtOH에 녹인 후 CH₃NH₂(33 %) (0.38 ml, 3.74 mmol)을 과량 넣고 18시간 동안 교반하였다. 반응이 완료된 후 감압 하에 용매를 제거하고 EtOAc로 추출하였다. 유기층을 무수 MgSO₄로 건조시키고 감압 하에 용매를 제거하였다. 컬럼 크로마토그래피를 하여 얻은 생성물을 IPE를 이용하여 결정화하고 이로부터 연노란색 고체 생성물인 3-(4-클로로페닐)-4-(4-아미노설폰일-페닐)-1-메틸-1H-피롤-2,5-디온을 얻었다 (0.05 g, 28 %).

¹H-NMR (400 MHz, DMSO-d ₆) δ: 7.86 (2H, d, J= 8.4Hz), 7.56 (2H, d, J= 8.4Hz), 7.53 (2H, d, J = 8.4Hz), 7.45 (2H, br), 7.41 (2H, d, J = 8.4Hz), 3.04 (3H, s).

¹³C-NMR (100 MHz, Acetone-d ₆) δ: 171.35, 171.29, 145.82, 138.13, 137.06, 136.39, 133.39, 132.58, 131.36, 129.64, 128.37, 127.05, 23.35.

하기의 표 2는 최종 생성물인 3-(4-클로로페닐)-4-(4-아미노설폰일-페닐)-1-메틸-1H-피롤-2,5-디온 및 이를 제조하기 위한 실시예 2의 각 단계에서의 생성물의 구조 및 ¹H-NMR 결과를 나타낸 것이다.

구분	명칭	구조	분광학 데이터
실시예 2-1.	2-(4(chlorosulfonyl)phenyl)acetic acid		¹H-NMR (400 MHz, DMSO-d ₆) δ: 11.6 (1H, s), 7.56 (2H, d, J= 8.4Hz), 7.23 (2H, d, J=8.4Hz), 3.58 (2H, s).
실시예 2-2.	2-(4-sulfamoylphenyl)acetic acid		¹H-NMR (400 MHz, DMSO-d ₆) δ: 7.75 (2H, d, J= 8.4Hz), 7.44 (2H, d, J= 8.4Hz), 7.34 (2H, s), 3.04 (2H, s).
실시예 2-3.	ethyl 2-(4-chlorophenyl)-2-oxoacetate		¹H-NMR (400 MHz, DMSO-d ₆) δ: 7.99 (2H, d, J= 8.4Hz), 7.49 (2H, d, J= 8.4Hz), 4.45 (2H, q, J=7.2Hz), 1.43 (3H, t, J= 7.2Hz).
실시예 2-4.	2-(4-chlorophenyl)-2-oxoacetic acid		¹H-NMR (400 MHz, DMSO-d ₆) δ: 8.31 (2H, d, J= 8.8Hz), 7.53 (2H, d, J= 8.8Hz)
실시예 2-5.	3-(4-chlorophenyl)-4-(4-aminosulfonyl-phenyl)-1-methyl-1H-pyrrol-2,5-dione		¹H-NMR (400 MHz, DMSO-d ₆) δ: 7.86 (2H, d, J= 8.4Hz), 7.56 (2H, d, J= 8.4Hz), 7.53 (2H, d, J=8.4Hz), 7.45 (2H, br), 7.41 (2H, d, J= 8.4Hz), 3.04 (3H, s). ¹³C-NMR (100 MHz, Acetone-d ₆) δ: 171.35, 171.29, 145.82, 138.13, 137.06, 136.39, 133.39, 132.58, 131.36, 129.64, 128.37, 127.05, 23.35.

시험예 1: 3-(4-클로로페닐)-4-(4-아미노설폰일-페닐)-1-메틸-1 H -피롤-2,5-디온 의 생물학적 평가

생리활성의 검색

실시예 2에 따라 제조된 3-(4-클로로페닐)-4-(4-아미노설폰일-페닐)-1-메틸-1H-피롤-2,5-디온의 생리활성 효과는 해당 효소의 활성이 50% 저해될 때 농도 값인 IC₅₀로 나타내었다. 한편, 본 발명의 화합물들의 세포독성은 MTT 분석법을 사용하여 세포 생존 (viability) 값 (IC₅₀)을 측정하였다.

1-1. 대식세포주의 LPS-유도 PGE ₂ 생성 억제 검색

RAW 264.7 (마우스 대식세포주)는 한국 세포주 은행 (KCLB)에서 분양 받아 사용하였으며, 10% FBS (Foetal Bovine Serum), 페니실린 (100 유니트/mL), 스트렙토마이신 설페이트 (100㎍/mL)가 포함된 DMEM 배지 (Dulbecco's modified Eagle's medium)에서 37 ℃, 5 % 이산화탄소의 습기 있는 환경에서 배양하였다.

RAW 264.7을 DMEM배지를 이용하여 5Х10⁵ 세포/mL로 24 웰에 1 ml씩 시딩하고, 하룻밤 동안 방치한 후 배지를 갈아준 다음 약물을 적당 농도로 처리했다. 1시간 동안 인큐베이션한 후 LPS를 1 ㎍/ml로 처리하고 24시간 (혹은 적당한 시간) 동안 인큐베이션했다. 상등액을 취하여 5배 희석했다. NSB (Non Specific Binding) 웰에 150 μl의 분석 버퍼를 넣고, 100 μl의 분석 버퍼를 영점 표준 (B₀) 웰에 넣었다. 나머지 웰에 100 μl의 표준 샘플을 넣고 50 μl의 PEG₂ 컨쥬게이트를 넣었다 (NSB 제외). 50 μl의 PGE2 항체 용액을 넣고 2시간 동안 진탕하였다. 각 웰을 흡인 (suction)하고 세척 버퍼로 5회 세척했다. 200 μl의 pNPP (para-Nitrophenyl phosphate) 기질을 전체 웰에 넣고 1시간 동안 상온 보관 (bench 내에서)한 후 50 μl의 정지액을 넣고 405 nm에서 흡광도를 측정하였다. 측정한 흡광도 값과 표준 곡선을 이용하여 PEG₂ 생성량을 정량하고 LPS만 단독 처리한 군과 비교하여 50 %를 저해하는 농도 (IC₅₀)를 구하였다. 그 결과를 하기 표 3에 나타내었다. 또한, 도 2에 나타낸 바와 같이, PEG₂ 생성 억제에 대한 IC₅₀ 값은 5.95 nM로 측정된 것을 확인하였다 (양성 대조군은 NS-398, 3 μM). 이는 3-(4-클로로페닐)-4-(4-아미노설폰일-페닐)-1-메틸-1H-피롤-2,5-디온이 LPS에 의해 유도된 PEG₂생합성을 저해하는 효과가 8.70 nM (IC₅₀)라는 것을 의미한다.

1-2. 대식세포주에 대한 세포독성 측정

RAW 264.7 (마우스 대식세포주)를 10 % FBS, 페니실린 (100 유니트/ml), 스트렙토마이신 설페이트 (100 ㎍/ml)가 포함된 DMEM 배지에서 37 ℃, 5 % 이산화탄소의 습기 있는 환경에서 배양하였다. 세포들은 원심분리 및 스크래퍼로 수집하여, 10 % FBS를 포함하는 RPMI (Roswell Park Memorial Institute) 1640 배지 100 μl를 포함하는 96 웰 플레이트에 1Х10⁵/웰을 넣었다. 3 베타, 4 베타-에폭시-8a-이소부티릴옥시구아이아-1(10),11,(13)-디엔-12.6a-올라이드는 메틸설폭사이드 (DMSO) 용매에 용해시켰으며, 모든 시험에서 DMSO의 농도는 0.1 %를 초과하지 않았다. 하룻밤 경과 후, 시료 및 LPS (1 ㎍/ml)를 첨가하고 플레이트를 24시간 동안 배양하였다. 세포들을 한 차례 세척한 후, 5 ㎎/ml의 MTT[(3-(4,5-Dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide]를 함유하는 FBS 없는 배지 50 μl를 첨가하였으며, 37℃에서 4시간 배양한 후, 배지를 제거하고 세포 내에서 형성된 포마잔 블루 (formazan blue)를 100 μl의 DMSO에 녹인 후, 540 nm에서 흡광도를 측정하여 세포 독성효과를 IC₅₀ 값으로 구하였다. IC₅₀은 화합물을 처리하지 않았을 때 비하여 세포의 숫자가 50 % 감소 효과를 나타내는 농도를 의미한다.

하기의 표 3에 3-(4-클로로페닐)-4-(4-아미노설폰일-페닐)-1-메틸-1H-피롤-2,5-디온의 세포독성을 나타내었다.

화합물	Cell viability (μM)	IC ₅₀ (μM)
화합물	Cell viability (μM)	PGE ₂
	>10	0.0087
Celecoxib		0.008

*참고문헌값: Bioorg. Med. Chem. Lett. (2012) , Kaur, J. et al.).

시험예 2: 실리콘 블록을 이용한 만성 기계 이질통(mechanical allodynia)의 유도 확인

먼저, 실시예 1-3의 수술을 마친 랫트를 사용하여, 마미(cauda equina) 압박 후 만성 신경병증성 통증이 발생하는지 여부를 검사했다. 운동 및 감각 검사는 수술 전과 수술 후 1 내지 28일 사이의 특정 시점에서 수행하였다.

그 결과 도 3a에서 나타낸 바와 같이, 모든 동물 모델은 수술 전 289±15초 동안 로타로드 (rotarod)를 걸을 수 있었으나, 마미(cauda equina) 압박 후 1일째에는 로타로드의 대기 시간이 48.2±16초로 현저히 감소하였다. 또한, 자연 회복의 진행으로 인해 마미(cauda equina) 압박 후 28일째의 보행 효율 (walking efficiency)은 75.2±14초로 조금 더 증가하였다.

한편, 도 3b에서 나타낸 바와 같이, 무해한 기계적 자극에 대한 반응에서 기계적 회피반응 역치 (PWT)는 마미(cauda equina) 압박 후 3일째부터 점진적으로 감소하였고, 중요한 촉각 이질통증 (tactile allodynia)은 28일째까지 나타났다 (PWT 3.22 ± 0.6).

또한, 모의 대조군 (허위 수술 그룹)에서는 로타로드의 보행 시간과 tactile withdrawal threshold에서 변화를 보이지 않았다.

시험예 3: 마미(cauda equina) 압박으로 인한 대식세포 침윤 확인

염증세포의 침윤은 신경계 손상에 대한 반응으로, 상주하는 면역 세포의 활성화뿐만 아니라 전염증성 사이토카인 및 PGE₂를 포함하는 다양한 염증 매개 물질의 생성 및 분비를 유도한다. 상기의 염증 매개 물질은 신경 면역 활성화를 촉진하고 일차 구심성 신경 세포를 민감하게 하여 통증 과민증을 일으킬 수 있다.

이에, 대식세포의 침윤이 나타나는 부위에서의 염증 매개 물질의 발현 여부를 확인하기 위해, 대식세포의 침윤이 나타나는 부위를 관찰하는 실험을 수행하였다.

또한, 마미(cauda equina) 압박 후 28일째 ED-1 항체에 대한 면역염색을 수행하여 척수와 마미(cauda equina) 외 다른 지역에서 침윤한 대식세포의 공간 패턴 (spatial pattern)을 관찰하기 위한 실험을 수행하였다.

그 결과 도 3c에서 나타낸 바와 같이, 마미(cauda equina) 압박 후 14일째에 척수 조직과 마미(cauda equina) 신경섬유에서 대식세포의 침윤을 확인하였다.

보다 구체적으로, ED-1 양성 대식세포는 마미(cauda equina) 압박 부위에서 확인할 수 있었으며, 나아가 침윤된 대식세포는 비 압축 부위 및 압박 진원(lesion epicenter)에서 30 mm 떨어진 척수의 등쪽 신경섬유 묶음 (dorsal funiculus)에서도 확인할 수 있었다.

시험예 4: 본 발명에 따른 화합물의 요추 척추관 협착증 유발 만성 기계 이질통의 완화 확인

만성 기계 이질통에서 본 발명 화합물의 효과를 조사하기 위해, 소염제인 셀레콕시브 (2, 5, 10 mg/kg, 복강 내 주사)를 손상 후 28일째인 만성 기계 이질통 유발 랫트에 투여하였다.

그 결과 도 4a에서 나타낸 바와 같이, 셀레콕시브 (10 mg/kg) 주사 후 30분 및 60분이 경과한 때 기계적 통증에 대한 회피반응 역치 (PWT)는 비히클 군에 비해 유의하게 증가한 것을 확인하였다.

또한, 본 발명에 따른 화합물 (2, 5, 10 mg/kg, 복강 내 주사)을 만성 기계 이질통 유발 랫트에 투여하였다.

그 결과 도 4b에서 나타낸 바와 같이, 본 발명에 따른 화합물의 주사 후 30분이 경과한 때 기계적 통증에 대한 회피반응 역치 (PWT)는 용량 의존적 방식으로 비히클 군에 비해 유의하게 증가한 것을 확인하였다.

또한, 본 발명에 따른 화합물을 고용량 투여한 경우의 진통 효과는 투여 후 3 시간 동안 유지되었다. 이러한 결과로부터 본 발명에 따른 화합물이 마미(cauda equina) 압박 후에 발생하는 만성 기계 이질통을 완화할 수 있음을 확인하였다.

시험예 5: 본 발명에 따른 화합물의 염증 매개 물질의 발현 억제 확인

셀레콕시브와 본 발명에 따른 화합물이 투여된 랫트를 사용하여 염증 매개 물질의 생성이 억제되는지 여부를 RT-PCR을 통해 확인하는 실험을 수행하였고, PGE₂의 생성이 억제되는지 여부를 ELISA를 통해 확인하는 실험을 수행하였다.

그 결과 도 4c 및 도 4d에서 나타낸 바와 같이, 만성 기계 이질통 유발 랫트에 셀레콕시브 또는 본 발명에 따른 화합물을 처리하고 30분이 경과한 때에 TNF-α, IL-1β, IL-6 및 iNOS mRNA의 발현이 유의적으로 감소한 것을 확인하였다.

또한, 도 4e에서 나타낸 바와 같이, 모의 대조군 (허위 수술 그룹)과 비교할 때, 만성 기계 이질통 유발 랫트의 마미(cauda equina)에서 PEG₂ 생성 수준은 마미(cauda equina) 압박에 의해 현저하게 증가하였다.

한편, 비히클 군과 비교할 때, 만성 기계 이질통 유발 랫트에 셀레콕시브 또는 본 발명에 따른 화합물을 투여한 경우 PGE₂ 생성을 유의하게 감소시킴을 확인하였다.

상기 진술한 본 발명의 설명은 예시를 위한 것이며, 본 발명이 속하는 기술분야의 통상의 지식을 가진 자는 본 발명의 기술적 사상이나 필수적인 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 쉽게 변형이 가능하다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 이상에서 기술한 실시예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적이 아닌 것으로 이해해야만 한다.

Claims

화학식 (Ⅰ)의 화합물 또는 이의 약제학적으로 허용되는 염을 포함하는, 척수 손상 또는 척추관 협착증의 통증 경감용 약제학적 조성물.
[화학식 Ⅰ]
제1항에 있어서,
상기 척추 협착증은 요추 척추관 협착증(Lumbar spinal stenosis)인 것을 특징으로 하는, 약제학적 조성물.
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