KR102303415B1

KR102303415B1 - 감미 소재 조성물 및 이의 제조 방법

Info

Publication number: KR102303415B1
Application number: KR1020190070876A
Authority: KR
Inventors: 김정은; 추선; 박성희; 김성보; 최은정
Original assignee: 씨제이제일제당 (주)
Priority date: 2019-06-14
Filing date: 2019-06-14
Publication date: 2021-09-23
Anticipated expiration: 2039-06-14
Also published as: JP7481350B2; KR20200143057A; US20220095656A1; CN113453565B; EP3895548A1; JP2022519030A; WO2020251185A1; CN113453565A; EP3895548A4

Abstract

본 출원은 감미 소재 조성물 및 이의 제조 방법에 관한 것이다. 구체적으로, 본 출원은 당 전이 스테비올 배당체를 포함하는 감미 소재 조성물 및 이의 제조 방법에 관한 것이다. 본 출원의 감미 소재 조성물은 당전이 스테비아 및 당류를 포함하며, 상기 당류는 전체 100 중량부를 기준으로 중합도(DP) 3 이상인 올리고당을 5 내지 90 중량부를 포함한다.

Description

감미 소재 조성물 및 이의 제조 방법{Sweetening material composition and preparation method thereof}

본 출원은 감미 소재 조성물 및 이의 제조 방법에 관한 것이다. 구체적으로, 본 출원은 당 전이 스테비올 배당체를 포함하는 감미 소재 조성물 및 이의 제조 방법에 관한 것이다.

설탕(Sucrose)은 가장 많이 알려지고 범용하게 사용되고 있는 감미료로서, 인스턴트 커피를 비롯한 커피 음료, 쥬스류, 탄산 음료 등의 청량 음료수에 다량으로 사용되고 있다. 그러나 웰빙을 추구하는 사회적 기류에 따라 비만, 당뇨 등 성인병과 충치의 원인이 되는 설탕 함량을 저감하거나 설탕을 대신할 수 있는 고감미도의 감미료를 사용하는 경향이 증가하고 있는 실정이나, 사카린, 아스파탐과 같은 인공감미료는 독성, 알러지 유발 등의 유해성과 안정성의 문제로 인하여 사용이 점차 규제되는 추세에 있다. 이에 따라, 새로운 기능성 당전이 당질 소재에 대한 필요성이 대두되고 있다.

스테비올 배당체(Steviol Glycosides) 또는 스테비오사이드(Stevioside)는 스테비아(Stevial)의 잎에 들어 있는 단맛이 나는 감미료로서, 내열성, 내산성, 내알칼리성을 갖고 있으며 발효가 일어나지 않는 성분으로 알려져 있다. 스테비아 감미료로서의 세계적인 소비처는 한국이 약 30%, 일본 27%, 중국이 30% 나머지 13%가 기타 나라로 보고 되고 있으며, 특히 한국에서는 식품으로서 스테비아 감미료를 소비하는 형태는 효소를 이용하여 스테비올 배당체에 글루코스를 부가해 감미질을 개량한 제품, 즉, 효소 처리 스테비아 제품이 전체의 약 80% 이상을 차지하고 있다. 스테비올 배당체 감미료 중에서 효소 처리 스테비아가 가지는 장점은 감미질이 설탕에 가깝고, 쓴 맛이 없으며, 감미도가 설탕의 100 내지 250배로 높으나 실질적으로 칼로리가 없다는 것이다. 또한, 열과 산에 안정하여 가공, 보존중의 감미 변화가 적다는 장점이 있다. 뿐만 아니라, 미생물의 영양원이 되기 어렵고, 구강에서는 실질적으로 비우식성이며, 메일러드 반응을 일으키지 않고, 식품 가공으로 갈변되기 어려우며, 산미를 완화시키며, 어는점 내림이 작다. 또한, 침투압을 올리지 않으며, 다른 감미료와의 상승 효과가 있어서 감미를 위한 비용 절감 유효하다. 그러나 상기와 같은 장점과 스테비아 잎 추출물에서의 정제 공정 및 효소 반응에 의한 감미질 보완에도 불구하고 효소 처리 스테비아는 타 당질감미료(설탕, 프럭토스 등)와 비교하여 감미의 상승이 느리고, 뒷맛(後味)의 감미가 비교적 오래 남아, 이른바 감미의 마무리가 나쁘다는 특징이 있다.

스테비아의 감미 성분 중 미질이 설탕에 가깝고 감미도가 높은 성분은 레바우디오사이드 A (rebaudioside A)이다. 레바우디오사이드 A는 최근에 FDA에 의해서 식품으로의 사용이 허가됨에 따라 코카콜라와 펩시에서 감미료로서 사용이 되고 있다. 스테비아의 추출물 중 레바우디오사이드 A가 차지하는 함량은 30%정도이며, 스테비올 배당체가 약 50%를 차지하고 있다 (대한민국 공개특허공보 제2001-0111560호). 따라서 감미가 우수한 레바우디오사이드 A를 고농도로 함유하는 제품의 수요가 증가하고 있으나, 고(高) 레바우디오사이드 A만을 분리할 경우 필연적으로 부산물인 스테비올 배당체가 발생할 수 밖에 없는 실정이며, 레바우디오사이드 A 수요가 증가함에 따라 레바우디오사이드 A 보다 감미질이 좋지 않은 스테비올 배당체를 처리하는 문제가 제품화에 있어서 과제로 대두되고 있다.

이에 따라 본 발명의 발명자들은 스테비올 배당체로부터 생산되는 효소 처리 스테비아를 이용하면서 이의 감미질을 우수하게 개선하기 위한 예의 연구를 거듭한 끝에 본 발명을 완성하게 되었다.

본 출원의 일 목적은 감미도가 우수한 감미 소재 조성물 및 이의 제조 방법을 제공하는 것이다.

본 출원의 또 다른 목적은 우수한 감미도를 나타내면서도 열량을 낮춘 감미 소재 조성물을 제공하는 것이다.

본 출원의 또 다른 목적은 올리고당을 이용함으로써 비피도박테리아의 성장을 촉진하고, 장기능을 개선하며, 면역력 향상 등의 기능성을 갖는 감미 소재 조성물을 제공하는 것이다.

위와 같은 목적을 달성하기 위하여, 본 출원은 당전이 스테비아 및 당류를 포함하며, 상기 당류는 전체 100 중량부를 기준으로 중합도(Degree of polymerization, DP)가 3 이상인 올리고당을 5 내지 90 중량부를 포함하는 감미 소재 조성물을 제공한다.

또한, 본 출원은 포도당을 포함하는 이당류, 스테비올 배당체 및 락토바실러스 말리(Lactobacillus mali) 또는 이로부터 유래된 당전이 효소를 포함하는 감미 소재 제조용 조성물을 제공한다.

또한, 본 출원은 포도당을 포함하는 이당류 및 스테비올 배당체의 혼합물을 락토바실러스 말리 또는 이로부터 유래된 당전이 효소와 접촉하여 당전이 스테비아 및 당류를 생산하는 단계를 포함하고, 상기 당류는 중합도 3 이상의 올리고당을 포함하는 감미 소재 조성물을 제공한다.

본 출원의 감미 소재 조성물을 이용하면, 감미도가 우수하고, 동일 감미도를 나타내는 설탕을 이용하는 경우 대비 낮은 열량을 제공할 수 있다.

또한, 본 출원의 감미 소재 제조용 조성물을 이용하면, 비피도박테리아의 성장을 촉진하고, 장기능을 개선하며, 면역력 향상 등의 기능성을 갖는 감미 소재 조성물을 제공할 수 있다.

도 1은 효소 반응 전 원료로 사용하는 스테비올 배당체의 HPLC 결과 그래프이다.
도 2는 원료로부터 효소 반응 후 생성되는 생성물의 HPLC 결과 그래프이다.
도 3은 본 발명에 따라 제조되는 감미 소재 조성물의 관능 평가 결과 그래프이다.

본 출원의 하나의 양태는 당전이 스테비아 및 당류를 포함하며, 상기 당류는 전체 100 중량부를 기준으로 중합도(degree of polymerization, DP)가 3 이상인 올리고당을 5 내지 90 중량부 포함하는 감미 소재 조성물을 제공한다.

상기 올리고당은 예컨대 하기 화학식 1로 표시되는 화합물을 포함할 수 있으며, 구체적으로 이소말토스(isomaltose), 파노스 (panose), 및 이소말토트리오스(isomaltotriose) 등의 분지 올리고당을 주성분으로 할 수 있다. 본 출원에 있어서, 상기 올리고당은 포도당을 포함하는 이당류로부터의 효소 반응에 의해 생성될 수 있다. 상기 올리고당은 포도당이 α-1,4 결합으로 연결된 직쇄 결합당 외에, 한 개 이상의 α-1,6 결합을 가지는 소당류, 또는 중합도(DP) 1 내지 9의 당류를 주성분으로 할 수 있다.

[화학식 1]

(상기 화학식 1에서, n은 1 내지 9의 정수임.)

상기 올리고당은 부드러운 감미를 보유하며, 예컨대 수크로스 감미의 50%의 감미를 나타내며, 보습성이 크고, 각종 식품에서 좋은 수분 효과를 내며, 전분질의 노화 방지에 효과가 크므로, 식품의 보습제, 광택제, 부형제 및 기능성 원료 등으로 식품산업 전반에 걸쳐 사용될 수 있다. 또한, 상기 올리고당은 장내의 유산균 발효를 활성화시키거나 비피더스균을 증식시키는 효능이 있으며, 정장 작용, 충치 예방, 노화 방지 및 다이어트에도 효능이 있을 수 있다. 이에 따라, 본 출원의 상기 올리고당을 포함하는 감미 소재 조성물은 유가공품, 발효유 및 음료 등의 가공식품 분야에 다양하게 사용될 수 있다.

구체적으로, 본 출원에 따른 감미 소재 조성물은 전체 당류 100 중량부를 기준으로 DP가 3 이상인 올리고당을 5 중량부 이상, 10 중량부 이상, 15 중량부 이상, 20 중량부 이상, 25 중량부 이상, 30 중량부 이상, 35 중량부 이상, 40 중량부 이상, 45 중량부 이상, 50 중량부 이상, 55 중량부 이상, 60 중량부 이상, 65 중량부 이상, 70 중량부 이상, 및/또는 90 중량부 이하, 85 중량부 이하, 80 중량부 이하의 함량으로 포함할 수 있다. 중합도가 3 이상인 올리고당을 상기 함량으로 포함함으로써, 소비자의 기호도가 우수한 효과를 나타내는데 유리할 수 있다.

일 측면에서, 상기 감미 소재 조성물은 총 중량을 기준으로 당류를 10 내지 60 중량%의 함량으로 포함할 수 있다. 예를 들어, 15 내지 55 중량%, 20 내지 50 중량%, 25 내지 45 중량%, 25 내지 40 중량%, 25 내지 35 중량%, 또는 25 내지 30 중량%의 함량으로 포함할 수 있다.

본 출원에 있어서, 상기 당전이 스테비아 및 올리고당은, 포도당을 포함하는 이당류 및 스테비올 배당체의 혼합물의 효소 반응의 생성물일 수 있으며, 구체적으로, 상기 효소 반응은 상기 포도당을 포함하는 이당류와 스테비올 배당체의 혼합물이 락토바실러스 말리(Lactobacillus mali) 또는 이로부터 유래된 당전이 효소와 접촉하여 수행되는 것일 수 있다.

여기서, 상기 '포도당을 포함하는 이당류'는 이당류를 구성하는 단당류 중 적어도 하나가 포도당인 이당류를 나타낸다. 본 출원에 있어서, 구체적으로 상기 포도당을 포함하는 이당류는 수크로스(sucrose) 및 말토스(maltose) 중 적어도 하나를 포함하는 것일 수 있다.

보다 구체적으로 상기 포도당을 포함하는 이당류 및 스테비올 배당체는 이에 제한되는 것은 아니나 효소 반응의 효율성의 측면에서 0.1:1 내지 15:1, 0.2:1 내지 10:1, 0.5:1 내지 5:1, 1:1 내지 3:1, 또는 1:1의 중량비로 혼합될 수 있다.

본 출원의 일 양상에서, 상기 스테비올 배당체 대비 포도당을 포함하는 이당류의 상기 중량비 범위에서 상기 포도당을 포함하는 이당류의 함량이 커질수록 높은 중합도의 올리고당 생성율이 증가할 수 있다.

보다 구체적으로 상기 포도당을 포함하는 이당류는 수크로스 및 말토스를 포함할 수 있고, 상기 수크로스 및 말토스를 1:20 내지 20:1의 혼합 중량비로 포함할 수 있으며, 구체적으로 1:15 내지 15:1, 1:10 내지 10:1, 2:8 내지 8:2, 3:7 내지 7:3, 4:6 내지 6:4, 또는 5:5의 혼합 중량비로 포함할 수 있다.

일 실시예에서, 상기 수크로스:말토스:스테비올 배당체를 10-20:5-20:1, 구체적으로 12:7:1의 혼합 중량비로 포함하는 혼합물로부터 당전이 스테비아 및 올리고당을 포함하는 감미 소재 조성물을 수득하였다.

상기 스테비올 배당체는 스테비오사이드 및 레바우디오사이드 A를 포함하는 것일 수 있다.

상기 스테비오사이드는 상기 스테비올 배당체 총 중량을 기준으로 30 내지 70 중량%, 예컨대 35 내지 70 중량%, 35 내지 67 중량%, 35 내지 65 중량%, 37 내지 70 중량%, 37 내지 67 중량%, 37 내지 65 중량%, 또는 37 내지 43 중량%의 함량으로 포함하는 것일 수 있다.

상기 레바우디오사이드 A는 상기 스테비올 배당체 총 중량을 기준으로 기준으로 30 내지 70 중량%, 예컨대 35 내지 70 중량%, 35 내지 67 중량%, 35 내지 65 중량%, 37 내지 70 중량%, 37 내지 67 중량%, 37 내지 65 중량%, 또는 37 내지 43 중량%의 함량으로 포함하는 것일 수 있다.

상기 스테비올배당체는 레바우디오사이드 C, 레바우디오사이드 D, 레바우디오사이드 F, 둘코사이드, 루부소사이드로 이루어진 그룹에서 어느 하나 이상을 추가로 포함할 수 있다.

상기 당전이 스테비아는 스테비올 배당체 내 19번 탄소에 연결된 OH 위치에 적어도 하나의 포도당이 부가된 것일 수 있다. 구체적으로, 스테비올 배당체 내 19번 탄소 위치에 결합된 히드록시기(-OH)와 포도당을 포함하는 이당류로부터 전이되는 포도당이 축합 반응을 통해 부가될 수 있다.

감미소재는 글루코스, 프럭토스 및 수크로스 중 적어도 하나의 중합도 2 이하인 당류를 추가로 포함하는 것일 수 있다.

일 측면에서, 본 출원에 따른 감미 소재 조성물은 총 중량을 기준으로 글루코스를 10 중량% 이하의 함량으로 포함할 수 있다. 예를 들어 글루코스의 함량은 본 출원의 감미 소재 조성물 총 중량을 기준으로 10 중량% 이하, 9 중량% 이하, 8 중량% 이하, 7 중량% 이하, 6 중량% 이하, 5 중량% 이하, 4 중량% 이하, 3 중량% 이하, 2 중량% 이하, 1 중량% 이하, 또는 0 중량%(즉, 전혀 포함하지 않음)의 함량으로 포함할 수 있다. 글루코스를 상기 함량으로 포함함으로써 감미 소재 조성물의 열량을 더욱 낮추는 효과를 나타낼 수 있다.

일 측면에서, 본 출원에 따른 감미 소재 조성물은 총 중량을 기준으로 프럭토스를 10 중량% 이하의 함량으로 포함할 수 있다. 예를 들어 프럭토스의 함량은 본 출원의 감미 소재 조성물 총 중량을 기준으로 10 중량% 이하, 9 중량% 이하, 8 중량% 이하, 7 중량% 이하, 6 중량% 이하, 5 중량% 이하, 4 중량% 이하, 3 중량% 이하, 2 중량% 이하, 1 중량 이하 %, 또는 0 중량%(즉, 전혀 포함하지 않음)의 함량으로 포함할 수 있다. 프럭토스를 상기 함량으로 포함함으로써 감미 소재 조성물의 열량을 더욱 낮추는 효과를 나타낼 수 있다.

일 측면에서, 본 출원에 따른 감미 소재 조성물은 총 중량을 기준으로 수크로스를 10 중량% 이하의 함량으로 포함할 수 있다. 예를 들어 수크로스의 함량은 본 출원의 감미 소재 조성물 총 중량을 기준으로 10 중량% 이하, 9 중량% 이하, 8 중량% 이하, 7 중량% 이하, 6 중량% 이하, 5 중량% 이하, 4 중량% 이하, 3 중량% 이하, 2 중량% 이하, 1 중량% 이하, 또는 0 중량%(즉, 전혀 포함하지 않음)의 함량으로 포함할 수 있다. 수크로스를 상기 함량으로 포함함으로써 감미 소재 조성물의 열량을 더욱 낮추는 효과를 나타낼 수 있다.

본 출원의 다른 일 양태는 포도당을 포함하는 이당류, 스테비올 배당체 및 락토바실러스 말리(Lactobacillus mali) 또는 이로부터 유래된 당전이 효소를 포함하는 감미 소재 제조용 조성물을 제공한다.

포도당을 포함하는 이당류, 스테비올 배당체, 락토바실러스 말리, 및 당전이효소는 감미 소재 조성물에서 상술한 바와 동일하다.

본 출원의 다른 일 양태는 포도당을 포함하는 이당류 및 스테비올 배당체의 혼합물을 락토바실러스 말리 또는 이로부터 유래된 당전이 효소 당전이 스테비아 및 당류를 생산하는 단계를 포함하고, 상기 당류는 중합도(DP)가 3 이상의 올리고당을 포함하는 감미 소재 조성물의 제조 방법을 제공한다.

포도당을 포함하는 이당류 및 스테비올 배당체의 혼합물을 락토바실러스 말리 또는 이로부터 유래된 당전이 효소와 접촉시키는 것에 의해 효소 반응이 수행될 수 있다. 상기 효소 반응은, 예를 들어 상기 포도당을 포함하는 이당류 및 스테비올 배당체에 락토바실러스 말리 또는 이로부터 유래된 당전이 효소를 투입하고 효소 활성 온도에서, 예컨대 30 내지 50℃ 또는 35 내지 45℃수행될 수 있다.

상기 효소 반응은 적정시간 동안, 예컨대 10시간 내지 30시간 또는 15시간 내지 20시간 동안 수행할 수 있다.

상기 효소 반응은 pH 4 내지 6, 예컨대 pH 5 내지 5.5에서 수행할 수 있다.

본 명세서에 있어서, 상기 '효소'는 특이적 기질과 결합하여 효소-기질 복합체를 형성함으로써 반응의 활성화 에너지를 낮추어 화학 반응을 매개하는 단백질 촉매를 의미한다. 본 발명에 따르면 상기 효소는 당전이 효소를 포함할 수 있다.

본 출원에 있어서, 상기 효소 반응은 락토바실러스 말리(Lactobacillus mali) 또는 이로부터 유래된 당전이 효소를 이용하는 것일 수 있다.

일 측면에서, 상기 락토바실러스 말리는 락토바실러스 말리 DSM20444(Lactobacillus mali DSM20444) 균주를 사용할 수 있다.

일 측면에서, 상기 락토바실러스 말리로부터 유래된 당전이 효소는 서열번호 1로 표시되는 서열을 포함할 수 있다.

상기 락토바실러스 말리 또는 이로부터 유래된 당전이 효소를 이용함으로써 우수한 당전이율을 나타낼 수 있다.

구체적으로, 상기 포도당을 포함하는 이당류는 수크로스 및 말토스 중 적어도 하나를 포함하는 것일 수 있고, 보다 구체적으로 상기 포도당을 포함하는 이당류는 상기 수크로스 및 말토스를 1:20 내지 20:1의 혼합 중량비로 포함할 수 있으며, 구체적으로 1:15 내지 15:1, 1:10 내지 10:1, 2:8 내지 9:2, 3:7 내지 7:3, 4:6 내지 6:4, 또는 5:5의 혼합 중량비로 포함할 수 있다.

상기 스테비올 배당체는 레바우디오사이드, 구체적으로 레바우디오사이드 A를 포함하는 것일 수 있으며, 본 출원에 있어서 상기 스테비올 배당체는 상기 레바우디오사이드 A를 30 내지 70 중량%, 예컨대 35 내지 70 중량%, 35 내지 67 중량%, 35 내지 65 중량%, 37 내지 70 중량%, 37 내지 67 중ㄹ야%, 37 내지 65 중량%, 또는 37 내지 43 중량%의 함량으로 포함하는 것일 수 있다. 상기 레바우디오사이드 A를 상기 함량으로 포함하는 스테비올 배당체를 이용함으로써 효소 반응 후 감미 개선 정도를 더욱 개선하는 효과를 나타낼 수 있다.

본 출원의 감미 소재 조성물의 제조 방법은 상기 효소 반응 후 생성된 산물을 수득하는 단계를 더 포함할 수 있다.

상기 생성된 산물을 수득하는 단계는 당분야에서 공지된 방법으로 수행할 수 있으며, 그 방법이 특별히 한정되는 것은 아니다. 예컨대, 염석법(salting out), 재결정법, 유기 용매 추출법, 에스테르화 증류법, 크로마토그래피 및 전기투석법을 포함할 수 있다.

본 출원에 따른 감미 소재 조성물의 제조 방법에 의하여 생성된 감미 소재 조성물은 상기에서 상술한 바와 같다.

이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 실시예 등을 들어 상세하게 설명하기로 한다. 그러나, 본 발명에 따른 실시예들은 여러 가지 다른 형태로 변형될 수 있으며, 본 발명의 범위가 하기 실시예들에 한정되는 것으로 해석되어서는 안 된다. 본 발명의 실시예들은 본 발명이 속한 분야에서 평균적인 지식을 가진 자에게 본 발명을 보다 완전하게 설명하기 위해 제공되는 것이다.

실시예 1. 감미 소재 조성물의 제조

50mM Sodium acetate buffer pH5에서 레바우디오사이드 A 및 스테비오사이드를 각각 약 40 중량% 함유하는 스테비올 배당체(Jining Aoxing Stevia Products Co. Ltd, 스테비올 배당체(스테비오사이드 41.82 중량%, 레바우디오사이드 A 39.94 중량%, 레바우디오사이드 C 6.43 중량%, 레바우디오사이드 D 1.64 중량%, 레바우디오사이드 F 1.32 중량%, 둘코사이드 1.24 중량%, 루부소사이드 0.61 중량%) 93 중량%) 8%(w/v)와 수크로스(하얀설탕, ㈜CJ 제일제당) 8%(w/v)를 혼합하고, 서열번호 1의 Lactobacillus mali DSM20444로부터 유래된 당전이 효소(최종 0.3 U/ml)를 첨가하여 40℃에서 24시간 동안 효소 반응하여 감미 소재 조성물을 제조하였다.

서열번호 1의 당전이 효소는 공지된 방법으로 재조합 균주를 이용하여 수득하였다.

구체적으로 재조합 균주는 유전자 합성 방법(㈜바이오니아)으로 제작하였으며, 획득한 유전자를 pBT7-N-His 벡터에 삽입한 후 대장균 BL21(DE3)에 형질전환 시켰다. 형질전환된 대장균은 암피실린(Ampicillin)이 포함된 평판배지에 도말하여 재조합 균주(미생물)를 획득하였다.

한편, 상기 미생물을 2019년 6월 11일 부다페스트 조약 하의 국제 기탁기관인 한국 미생물보존센터(Korean Culture Center of Microorganisms)에 기탁번호 KCCM12561P로 기탁하였다.

재조합 균주로부터 당전이 효소 발현 및 정제는 재조합 대장균 균주를 암피실린(Ampicillin)이 포함된 LB배지 5ml에 접종하고 600nm에서 흡광도 2.0이 될 때까지 37℃에서 종균 배양을 실시하였다, 종균 배양된 배양액을 암피실린(Ampicillin)이 포함된 LB배지 500ml에 첨가하여 본 배양을 실시하였다, 또한 600nm에서 흡광도가 0.4가 될 때, 0.1mM IPTG(이소프로필 β-D-티오갈락토피오피라노시드)를 첨가하여 효소의 대량발현을 유도하였다, 상기 과정 중의 교반 속도는 180rpm, 배양온도는 37℃가 유지되도록 하고, IPTG 첨가 후에는 교반속도는 120rpm, 배양온도는 16℃로 배양하였다, 상기 균주의 배양액을 10000ｘg로 4℃에서 20분간 원심분리하고, 50mM 트리스 염산 완충용액을 첨가하여 상기 세포 용액을 초음파 파쇄기(sonicator)로 파쇄하였다, 세포 파쇄물은 다시 13000ｘg로 4℃에서 20분동안 원심분리하여 세포 상등액만을 효소액으로서 분리하였다.

실험예 1. 감미 소재 조성물의 성분 분석

[올리고당 성분 분석]

하기 표 1의 분석 조건에서 고속액체크로마토그래피(HPLC) 분석을 통해 올리고당 함량을 정량화하여 그 결과를 표 2에 나타내었다.

이동상	Acetonitrile (68 vol%): DW (32 vol%)
컬럼	250 x 4.6 mm Kromasil 100-10NH₂ (Kromasil)
유속	0.8 ml/min
온도	35℃
주입량	20 μl
검출기	RID

당종류		(%, w/v)
올리고당	Isomaltotriose (DP3)	13.36
	Isomaltotetraose (DP4)	0
	Isomaltopentaose (DP5)	8.02
기타당류	Fructose	6.89
	Glucose	0
	Sucrose	0

[당 전이율 분석]

하기 표 3의 분석 조건에서 HPLC 분석을 통해 효소 반응 전 후의 성분 분석 결과를 통해 당 전이율을 확인하여 그 결과를 도 1 및 2에 나타내었다.

이동상	Acetonitrile (30 vol%): DW (70 vol%)
컬럼	250 X 4.6 mm Capcell pak C18 MG II (Shiseido)
유속	1 ml/min
온도	40℃
주입량	20 μl
검출기	DAD(210nm)

원료 (RebA 40%, Jining Aoxing Stevia Products Co. Ltd) 는 레바우디오사이드 A가 주성분으로 분석되었다. 효소 반응 후, 원료 감소 기준으로 91.71% 전환율을 확인하였다.

[당전이 생성물의 구조 확인]

주성분인 스테비오사이드 및 레바우디오사이드에 대해서 포도당 전이 결합 구조를 NMR을 통해 분석한 결과, 포도당전이 스테비오사이드는 13-[(2-O-β-D- glucopyranosyl-β-D-glucopyranosyl)oxy]ent-kaur-16-en-19-oic acid 6-O-α-D- glucopyranosyl-β-D-glucopyranosyl ester로, 포도당전이 레바우디오사이드 A는 13-[(2-O-β-D-glucopyranosyl-3-O-β-D-glucopyranosyl-β-D-glucopyranosyl) oxy]ent-kaur-16-en-19-oic acid 6-O-α-D-glucopyranose-β-D-glucopyranosyl ester로 신규 화합물임을 확인하였다.

화학식 2는 포도당이 전이된 스테비오사이드의 화학 구조를 나타내며, 화학식 3은 포도당이 전이된 레바우디오사이드 A의 화학 구조를 나타낸다.

[화학식 2]

[화학식 3]

실험예 2: 관능 평가

[관능 묘사 분석]

상기 실시예 1에 작성된 효소 반응 후 시료(당전이 스테비아, 올리고당 혼합물, 기타 당류) 2%를 제조하였고, 원료(수크로스 1%(w/w), Reb A 40 1%(w/w) 혼합물)와의 비교 평가를 위해 묘사분석을 진행하였다.

효소 반응 후 시료(당전이 스테비아, 올리고당 혼합물, 기타 당류)와 원료(수크로스 1%(w/w), Reb A 40 1%(w/w) 혼합물)의 비교 결과는 표 4, 도 3에 나타내었다.

	원료	효소 반응 후	p-value
단맛 강도	3	3.19	0.465
단맛 지속성	2.85	3.04	0.635
쓴맛 강도	3.96	1.81	0.0001
무게감	2.70	2.52	0.454
이미/이취 강도	4.19	1.93	0.0001
단맛기호도	1.48	3.67	0.0001
전반기호도	1.41	3.44	0.0001
* 평가는 1(매우 낮음)부터 5(매우 높음)의 점수를 매기는 것으로 수행하였음.

[관능 기호도 평가]

상기 실시예 1과 같이 효소 반응 후 시료(당전이 스테비아, 올리고당 혼합물, 기타 당류) 2%를 제조하였고, 원료 (수크로스 1%(w/w), RebA 40 1%(w/w) 혼합물)와 관능 비교 평가를 진행하였다.

15 명에게 상기 시료 2종에 대한 단맛 기호도와 전반 기호도를 9 점 척도법을 사용하여 진행하였다(1 = 굉장히 싫어한다, 5 = 좋아하지도 싫어하지도 않는다, 9 = 굉장히 좋아한다).

그 후, 통계 분석은 5 점 척도로 환산하여 쌍체 T 검정을 통해 유의적인 차이를 검증하였다(신뢰수준 95%).

관능 속성	원료	효소반응 후	P-value
단맛기호도	1.52	3.77	0.00001
전반기호도	1.67	3.85	0.0001

표 5에서 확인할 수 있는 바와 같이, 원료에 비해 효소 반응 후 제조된 감미 소재 조성물의 단맛 기호도 및 전반 기호도가 우수하였다.

한국미생물보존센터(국외)

KCCM12561P

20190611

<110> CJ CheilJedang Corporation <120> Sweetening material composition and preparation method thereof <130> 2018-DPCJ-3077 <160> 1 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 734 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> transglycosylase derived from Lactobacillus mali <400> 1 Met Asp Gln Met Val Leu Glu Thr Gln Gln Trp Leu Asn Lys Thr Tyr 1 5 10 15 Gly Gly Val Ser Gly Phe Gly Ser Val Thr Glu Asp Gly Leu Thr Gly 20 25 30 Trp Gly Thr Val Tyr Gly Leu Thr Arg Ala Leu Gln His Glu Leu Gly 35 40 45 Ile Thr Gly Leu Val Asn Asn Phe Gly Pro Thr Ser Lys Gln Lys Phe 50 55 60 Asn Asn Ile Ala Lys Thr Ile Val Val Gly Tyr Thr Gly Asn Ile Ala 65 70 75 80 Tyr Ile Ile Gln Gly Gly Phe Trp Cys Lys Gly Ile Thr Pro Gly Glu 85 90 95 Phe Asp Gly Lys Phe Ser Ala Asp Thr Ala Ser Ala Val Thr Thr Met 100 105 110 Lys Thr Lys Ala Gly Leu Ala Asp Thr Ser Ser Ser Val Asp Gly Asn 115 120 125 Phe Met Ala Ala Leu Leu Asn Met Ser Ser Phe Asp Leu Leu Thr Gly 130 135 140 Gly Asp Ser Lys Val Arg Glu Met Gln Gln Gln Leu Asn His Asp Tyr 145 150 155 160 Leu Ala Tyr Thr Gly Ile Leu Pro Cys Asp Gly Ile Tyr Gln Arg Asp 165 170 175 Thr Asn Ser Ala Leu Ile Tyr Ala Leu Gln Ala Glu Glu Lys Ile Ser 180 185 190 Thr Ser Val Ala Thr Gly Ala Tyr Gly Ala Thr Thr Lys Lys Asp Thr 195 200 205 Pro Thr Val Lys Glu Gly Thr Thr Asn Asn Phe Val Arg Ile Leu Gln 210 215 220 Trp Gly Leu Tyr Val Asn Asn Lys Ala Tyr Thr Gly Ala Phe Asp Gly 225 230 235 240 Val Tyr Asp Ser Ala Val Val Ala Ala Val Lys Glu Phe Glu Glu Thr 245 250 255 Met Ala Leu Asp Ser Thr Asp Gly Thr Ser Ala Gly Val Asp Ile Phe 260 265 270 Met Ser Leu Leu Thr Ser Ala Gly Asn Pro Asp Arg Ser Ala Ile Ala 275 280 285 Cys Asp Thr Ser Tyr Gln Leu Asn Ala Thr Arg Val Ala Thr Leu Lys 290 295 300 Asn Ala Gly Tyr Ser Ile Val Gly Arg Tyr Leu Thr Gly Thr Val Gly 305 310 315 320 Ser Gly Thr Ser Glu Arg Ala Lys Asn Leu Thr Thr Asp Glu Ile Thr 325 330 335 Ala Ile Thr Thr Gly Gly Leu Lys Ile Phe Pro Ile Tyr Gln Asp Gly 340 345 350 Ala Ser Asp Lys Glu Ala Tyr Phe Thr Ala Ala Gln Gly Lys Thr Asp 355 360 365 Gly Thr Lys Ala Val Tyr Ala Ala Gln Asp Leu Gly Phe Lys Glu Gly 370 375 380 Val Val Ile Tyr Phe Ala Val Asp Ala Asp Ile Gln Ala Gly Asp Ile 385 390 395 400 Ala Gly Ser Ala Lys Val Tyr Phe Glu Ala Leu Tyr Asp Ile Val Thr 405 410 415 Ser Tyr Gly Tyr Glu Val Gly Ile Tyr Gly Thr Arg Asn Val Ser Ala 420 425 430 Thr Ile Ile Ser Ala Gly Leu Ala Thr Lys Ala Phe Ile Ser Asp Met 435 440 445 Ser Thr Gly Tyr Ser Gly Asn Leu Gly Tyr Ser Ile Pro Asp Glu Trp 450 455 460 Ala Phe Asp Gln Phe Ser Glu Ile Ser Ile Gly Asp Phe Ala Ile Asp 465 470 475 480 Lys Asp Ala Thr Thr Ser Ala Arg Glu Thr Ala Thr Gly Ser Phe Gly 485 490 495 Val Gly Gly Glu Ser Gly Tyr Gly Asn Ala Glu Asp Leu Ala Lys Ile 500 505 510 Asn Thr Ile Ile Asp Ala Leu Ser Gln Lys Lys Asn Phe Ser Tyr Leu 515 520 525 Ser Gly Leu Lys Ile Glu Lys Thr Ser Lys Glu Tyr Glu Ile Pro Gly 530 535 540 Phe Ala Val Asp Phe Tyr Val Gln Val Lys Phe Glu Ala Ser Val Ser 545 550 555 560 Glu Pro Gly Asp Asn Val Gly Val Val Tyr Asn Val Ser Asn Gly Lys 565 570 575 Phe Glu Ser Asp Phe Thr Asp Thr Ile Ala Gly Val Val Ala Leu Ser 580 585 590 Asp Glu Ile Asn Lys Glu Asp Ile Asn Ser Ala Leu Thr Glu Leu Ser 595 600 605 Ser Leu Ile Asn Asn Gly Gln Ile Trp Val Glu Pro Val Thr Lys Gly 610 615 620 Ser Asp Ala Gly Ile Ala Leu His Ile Lys Ser Thr Phe Asp His Thr 625 630 635 640 Leu Asp Ser Gly Glu Thr Ile Glu Leu Glu Tyr Glu Ile Ile Ile Asp 645 650 655 Glu Ile Phe His Lys Ile Glu Val Val Pro Thr Gly Val Pro Asn Thr 660 665 670 Thr Ala Asn Asp Tyr Asn Ser Leu Phe Pro Asn Gly Ile Lys Glu Phe 675 680 685 Val Gly Phe Ser Ile Val Ala Gly Leu Ala Thr Gly Gly Ile Tyr Tyr 690 695 700 Val Val Thr Ala Val Gly Ala Thr Ala Ala Val Val Thr Thr Ser Ile 705 710 715 720 Leu Ala Leu Ile Ala Leu Leu Lys Asn Asn Asp Thr Gly Val 725 730

Claims

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포도당을 포함하는 이당류, 스테비올 배당체 및 락토바실러스 말리(Lactobacillus mali)로부터 유래된 당전이 효소를 포함하는 것인 감미 소재 제조용 조성물로서,
상기 당전이 효소는 서열번호 1의 서열을 포함하는 것이고,
상기 감미 소재는 당전이 스테비아 및 중합도 3 이상의 올리고당을 포함하는 것인 감미 소재 제조용 조성물.
청구항 4에 있어서,
상기 포도당을 포함하는 이당류는 수크로스 및 말토스 중 적어도 하나를 포함하는 것인 감미 소재 제조용 조성물.
청구항 5에 있어서,
상기 포도당을 포함하는 이당류는 수크로스 및 말토스를 1:20 내지 20:1의 혼합 중량비로 포함하는 것인 감미 소재 제조용 조성물.
포도당을 포함하는 이당류 및 스테비올 배당체의 혼합물을 락토바실러스 말리로부터 유래된 당전이 효소와 접촉하여 당전이 스테비아 및 당류를 생산하는 단계를 포함하고,
상기 당전이 효소는 서열번호 1의 서열을 포함하는 것이며,
상기 당류는 중합도 3 이상의 올리고당을 포함하는 것인, 감미 소재 조성물의 제조 방법.
청구항 7에 있어서,
상기 당류는 전체 100 중량부를 기준으로 중합도(DP) 3 이상인 올리고당을 5 내지 90 중량부를 포함하는 것인 감미 소재 조성물의 제조 방법.
청구항 7에 있어서,
상기 포도당을 포함하는 이당류는 수크로스 및 말토스 중 적어도 하나를 포함하는 것인 감미 소재 조성물의 제조 방법.
청구항 9에 있어서,
상기 포도당을 포함하는 이당류는 수크로스 및 말토스를 1:20 내지 20:1의 혼합 중량비로 포함하는 것인 감미 소재 조성물의 제조 방법.
삭제
청구항 7에 있어서,
상기 스테비올 배당체는 총 중량을 기준으로 레바우디오사이드 A의 함량이 30 내지 70 중량%인 것인 감미 소재 조성물의 제조 방법.