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KR102281701B1 - 아세토인을 제조하는 방법 - Google Patents

아세토인을 제조하는 방법 Download PDF

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KR102281701B1
KR102281701B1 KR1020177005199A KR20177005199A KR102281701B1 KR 102281701 B1 KR102281701 B1 KR 102281701B1 KR 1020177005199 A KR1020177005199 A KR 1020177005199A KR 20177005199 A KR20177005199 A KR 20177005199A KR 102281701 B1 KR102281701 B1 KR 102281701B1
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Abstract

본 발명은 피루베이트 디카복실라제 활성이 감소된 재조합 효모에 관한 것으로서, 이의 게놈에는 - 아세토락테이트 신타제 또는 ALS를 코딩하는 1 이상의 핵산, - 아세토락테이트 디카복실라제 또는 ALD를 코딩하는 1 이상의 핵산, 및 - NADH 옥시다제 또는 NOXE를 코딩하는 핵산의 1 이상의 카피가 삽입되어있다.

Description

아세토인을 제조하는 방법{METHOD FOR PRODUCING ACETOIN}
본 발명은 개선된 아세토인 경로를 갖는 미생물에 관한 것이다. 재조합 미생물은 미변형된 미생물과 비교하여 아세토인의 생산을 개선하도록 변형된다. 본 발명은 또한 아세토인을 생산하는 그러한 미생물을 사용하는 방법을 제공한다.
3-하이드록시부탄온 또는 아세틸 메틸 카르비놀이라고도 알려진, 아세토인은 2개의 효소, 즉 단일 디카복실화에 의한 2개 피루베이트 분자의 축합을 촉매하여, α-아세토락테이트를 제공하는 α-아세토락테이트 신타제, 및 이 마지막 하나를 아세토인으로 디카복실화시키는 α-아세토락테이트 디카복실라제의 작용에 의해 피루베이트로부터 박테리아에서 형성된다(Juni, 1952).
아세토인은 안전하다고 여겨지므로 디아세틸을 대체한 식품 산업에서 통용되는 향미제이다(Huang, 2011). 아세토인은 라스베리, 딸기, 바닐라, 호두, 럼주, 버터, 버터스카치, 카라멜, 코코넛, 커피 및 과일 향용 제제의 향미 성분으로서 사용된다. 아세토인은 알콜성 및 무알콜성 음료 예컨대 크림 소다에 부가될 수 있다. 이의 버터향은 아이스크림, 얼음, 사탕, 베이킹 제품, 마가린, 젤라틴 디저트, 코티지 치즈, 마가린 및 쇼트닝에 매우 적합하다. 아세토인은 또한 아로마 담체로서 방향제, 및 향수의 화장품 산업에서도 사용된다. 마지막으로, 아세토인은 전자 담배의 향미제로서 그리고 담배의 최고 화학 첨가제 중 하나이다. 아세토인은 또한 화학 중간체로서 유용한 메틸 비닐 케톤(MVK)의 전구체이다.
아세토인의 전통적인 화학 합성은 석유 결핍 및 환경 오염의 단점에 직면한 한편, 식품 향미제로서 아세토인의 시장은 현재 여전히 연간 5 내지 5.5%로 성장하고 있고, 2018년에는 140억 달러에 도달할 것으로 예상된다. 방향제 시장은 2018년에 160억 달러가 넘을 것으로 예상된다.
과거의 전통적인 화학 공정으로만 생산될 수 있는 많은 화학물들은 이제 재생가능한 자원을 사용하여, 생물학적으로 생성시킬 수 있는 잠재력을 가질 수 있다(Danner & Braun, 1999; Hatti-Kaul et al., 2007). 아세토인의 미생물 생산이 그러한 예의 하나이다. 이러한 생물공정의 관심은 아세토인이 상기 기술된 바와 같이, 수많은 산업적 용도를 가지며, 미생물 생산이 플랫폼 화학물의 생산을 위한 오일 공급 의존성을 완화시키므로 주목할만하게 증가되고 있다. 사카로마이세스 세레비지아(Saccharomyces cerevisiae)는 특히 이러한 생물 공정에 매우 적합한 플랫폼이다(Nielsen 2013). 아세토인의 미생물 생산과 관련하여, 아세토인을 생산하기 위해, 대부분의 연구들이 미생물, 예컨대 캔디다 글라브라타(Candida glabrata), 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis) 등을 사용하였다(Shubo Li et al., Microbial Cell Factories 2014, 13:55; Silbersack J et al., Appl Microbiol Biotechnol. 2006 Dec;73(4):895-903).
따라서, GRAS(즉, 일반적으로 안전하다고 인정됨) 미생물에 의한 아세토인 생산이 바람직하다. 효모, 보다 구체적으로 사카로마이세스 세레비지아는 이러한 정황에서 적절한 미생물이다. 에스. 세레비지아는 자연적으로 아세토인을 생산하는 것으로 알려져 있지만, 아세토인의 수율 및 생산성은 빈약하다. 게다가 핵심 중간체인 피루베이트가 아세토인 대신 에탄올을 생산하는데 우선적으로 사용되기 때문에 에탄올 생산이 실제로 에스. 세레비지아에서 효율적인 아세토인 생산을 위한 가장 명백한 장벽이다.
따라서, 명백한 이유로, 미생물적 과정, 보다 구체적으로 피루베이트에서 아세토인으로의 전환을 통한 아세토인의 생산을 개선시키기 위한, 끊임없는 목표가 남아 있다. 보다 구체적으로, 구체적으로 산업화 요건과 합치되는, 아세토인의 생산 수율이 향상된 안정한 재조합 미생물에 대한 요구가 여전히 존재한다.
본 발명은 피루베이트 디카복실라제 활성이 감소된 재조합 효모에 관한 것으로서, 이의 게놈은
- 아세토락테이트 신타제 또는 ALS를 코딩하는 1 이상의 핵산,
- 아세토락테이트 디카복실라제 또는 ALD를 코딩하는 1 이상의 핵산, 및
- NADH 옥시다제(NOXE)를 코딩하는 핵산의 1 이상의 카피
가 삽입되어있다.
특정 실시형태에 따라서, 본 발명에 따른 재조합 효모는 하기 식을 포함하는 군에서 선택된 하나 이상의 DNA 구성체를 포함할 수 있다:
(I) 5'-[유전자 1]x1-3' 및 5'-[유전자 2]x2-3' 및 5'-[유전자 3]x3-3',
(II) 5'-[유전자 1]x1-[유전자 2]x2-3' 및 5'-[유전자 3]x3-3',
(III) 5'-[유전자 1]x1-[유전자 2]x2-[유전자 3]x3-3', 및
이의 조합,
여기서,
- "유전자 1"은 ALS, ALD 또는 NOXE를 포함하는 군에서 선택된 핵산을 의미하고;
- "유전자 2"는 ALS, ALD 또는 NOXE를 포함하는 군에서 선택되지만 유전자 1과 상이한 핵산을 의미하고;
- "유전자 3"은 ALS, ALD 또는 NOXE를 포함하는 군에서 선택되지만 유전자 1 및 유전자 2와 상이한 핵산을 의미하고;
- "ALS"는 아세토락테이트 신타제를 코딩하는 핵산이고;
- "ALD"는 아세토락테이트 디카복실라제를 코딩하는 핵산이고;
- "NOXE"는 NADH 옥시다제를 코딩하는 핵산이며;
- "x1", "x2" 및 "x3"의 각각은 서로가 독립적으로, 0 내지 50 범위의 정수, 바람직하게는 0 내지 20 범위의 정수를 나타내며,
단 상기 재조합 효모는 ALS, ALD 및 NOXE 각각을 코딩하는 적어도 하나의 핵산을 포함한다.
바람직하게, "x1", "x2" 및 "x3" 중 각각은 서로 독립적으로, 0 내지 12를 포함한, 0 내지 15 범위의 정수, 보다 바람직하게는 0 내지 5의 정수, 구체적으로 0 내지 3의 정수를 나타내고, 여전히 더 바람직하게는 1과 같은 정수를 나타낸다.
다른 특정 실시형태에 따라서, 본 발명에 따른 재조합 효모는 동일하거나 또는 상이한, 적어도 하나, 바람직하게는 적어도 2개의, 상기 언급된 식 (II)의 DNA 구성체(들)를 포함할 수 있고, 이때 "유전자 3"은 NADH 옥시다제를 코딩하는 핵산을 의미한다.
또 다른 특정 실시형태에 따라서, 본 발명에 따른 재조합 효모는 동일하거나 또는 상이한, 적어도 하나, 바람직하게는 적어도 2개의, 식 (IIa)의 DNA 구성체(들)를 포함할 수 있고, 이때 각각의 식 (IIa)는 하기 식을 갖는다:
(IIa) 5'-[(prom5)y1-유전자 1-term5]x5-[prom1-유전자 1-term1]x1-[prom2-유전자 2-(term2)z1]x2-3' 및 5'-[(prom3)y2-유전자 3-(term3)z2]x3-3'
상기 식에서,
- 유전자 1, 유전자 2, 유전자 3, "x1", "x2" 및 "x3"은 상기에 정의된 바와 같고;
- "x5"는 0 또는 1과 동일한 정수를 나타내고;
- "y1", "y2", "z1" 및 "z2"는 서로 독립적으로, 0 또는 1과 동일한 정수를 나타내며;
- 상기 재조합 효모가 적어도 2개의 화학식 (IIa)의 DNA 구성체를 포함하는 경우, "x1", "x2", "x3", "x5", "y1", "y2", "z1" 및 "z2"는 동일하거나 또는 상이할 수 있고;
- "prom 1"은 유저자 1을 코딩하는 서열의 발현을 제어하는 조절 서열이고;
- "prom 2"는 유전자 2를 코딩하는 서열의 발현을 제어하는 조절 서열이고;
- "prom 3"은 유전자 3을 코딩하는 서열의 발현을 제어하는 조절 서열이고;
- "prom5"는 유전자 1의 발현을 제어하는 조절 서열로서, 상기 prom5는 prom1과 동일하거나 또는 상이하고;
- "term1"은 유전자 1을 코딩하는 서열의 발현을 종결시키는 전사 종결인자 서열이고;
- "term2"는 유전자 2를 코딩하는 서열의 발현을 종결시키는 전사 종결인자 서열이고;
- "term3"은 유전자 3을 코딩하는 서열의 발현을 종결시키는 전사 종결인자 서열이고;
- "term5"는 유전자 1의 발현을 종결시키는 전사 종결인자 서열로서, 상기 term5는 term1과 동일하거나 또는 상이하다.
다른 특정 실시형태에 따라서, 본 발명에 따른 재조합 효모는 동일하거나 또는 상이한, 적어도 하나, 바람직하게는 적어도 2개의, 식 (IIb)의 DNA 구성체(들)를 포함할 수 있고, 이때 각각의 식 (IIb)는 하기의 식을 갖는다:
(IIb) 5'-[(prom5)y1-ALS-term5]x5-[prom1-ALS-term1]x1-[prom2-ALD-(term2)z1]x2-3' 및 5'-[(prom3)y2-NOXE-(term3)z2]x3-3'
상기 식에서,
- ALS, ALD, NOXE; "x1", "x2", "x3", "x5", "y1", "y2", "z1" 및 "z2"는 상기에 정의된 바와 같고;
- 상기 재조합 효모가 적어도 2개의 식 (IIb)의 DNA 구성체를 포함하는 경우, "x1", "x2", "x3", "x5", "y1", "y2", "z1" 및 "z2"는 동일하거나 또는 상이할 수 있고;
- "prom 1"은 아세토락테이트 신타제를 코딩하는 서열의 발현을 제어하는 조절 서열이고;
- "prom 2"는 아세토락테이트 디카복실라제를 코딩하는 서열의 발현을 제어하는 조절 서열이고;
- "prom 3"은 NADH 옥시다제를 코딩하는 서열의 발현을 제어하는 조절 서열이고;
- "prom5"는 아세토락테이트 신타제를 코딩하는 서열의 발현을 제어하는 조절 서열로서, 상기 prom5는 prom1과 동일하거나 또는 상이하고;
- "term1"은 아세토락테이트 신타제를 코딩하는 서열의 발현을 종결시키는 전사 종결인자 서열이고;
- "term2"는 아세토락테이트 디카복실라제를 코딩하는 서열의 발현을 종결시키는 전사 종결인자 서열이고;
- "term3"은 NADH 옥시다제를 코딩하는 서열의 발현을 종결시키는 전사 종결인자 서열이고;
- "term5"는 아세토락테이트 신타제를 코딩하는 서열의 발현을 종결시키는 전사 종결인자 서열로서, 상기 term5는 term1과 동일하거나 또는 상이하다.
다른 특정 실시형태에 따라서, 본 발명에 따른 재조합 효모는 적어도 2개의, 식 (II), (IIa) 또는 (IIb)의 DNA 구성체를 포함하고, 단 NOXE의 핵산의 모든 카피는 적어도 2개의, 식 (II), (IIa) 또는 (IIb)의 DNA 구성체 중 하나에 위치한다.
다른 특정 실시형태에 따라서, 본 발명에 따른 재조합 효모는 적어도 2개, 바람직하게는 정확하게 2개의, 하기 식 (IIc) 및 (IId)의 DNA 구성체를 포함할 수 있다:
(IIc) 5'-[(prom5)y1-ALS-term5]x5-[prom1-ALS-term1]x1-[prom2-ALD-(term2)z1]x2-3' 및 5'-[(prom3)y2-NOXE-(term3)z2]x6-3'; 및
(IId) 5'-[(prom5)y1-ALS-term5]x5-[prom1-ALS-term1]x1-[prom2-ALD-(term2)z1]x2-3' 및 5'-[(prom3)y2-NOXE-(term3)z2]x7-3';
상기 식에서,
- ALS, ALD, NOXE; "prom1", "prom2", "prom3", "prom5", "term1", "term2", "term3" 및 "term5"; "x1", "x2" 및 "x3" 및 "x5", "y1", "y2", "z1" 및 "z2"는 상기 정의된 바와 같고;
- 각각의 식 (IIc) 및 (IId)에 대한 "x1" 내지 "x3", "x5", "y1", "y2", "z1" 및 "z2"는 동일하거나 또는 상이하고;
- "x6" 및 "x7"은 0 내지 50, 바람직하게는 0 내지 20, 바람직하게는 0 내지 12 범위의 정수, 보다 구체적으로 2 내지 5, 바람직하게는 3 내지 4 범위의 정수, 여전히 더 바람직하게는 3과 같은 정수를 나타내며, 단 "x6" 및 "x7" 중 하나는 0을 나타낸다.
본 발명은 또한, 아세토인 및/또는 메틸 비닐 케톤을 포함한, 이의 유도체의 생산을 위한, 본 발명에 따른 재조합 효모의 용도에 관한 것이다.
본 발명은 또한 아세토인의 생산을 위한 방법에 관한 것으로서, 상기 방법은
(a) 적절한 배양 배지에서 본 발명에 따른 재조합 효모를 배양하는 단계; 및
(c) 아세토인을 회수하는 단계
를 포함한다.
바람직하게, 상기 배양 배지는 바람직하게는 포도당 및 수크로스를 포함하는 군에서 선택된, 탄소 공급원을 포함한다.
도 1은 아세토인에 유리하게 에탄올의 생산이 대체되도록 하는 재조합 효모 균주의 대사 경로를 도시한다.
발명의 상세한 설명
정의
본원에서 사용시, 용어 "미생물"은 인공적으로 변형되지 않은 효모를 의미한다. 미생물은 그 외래 유전자 성분을 발현할 미생물 "억셉터"에서 통합되는 유전자 성분을 제공하거나 또는 유전자 구축 또는 단백질 발현을 위한 도구로서 사용되면 "도너"일 수 있다. 본 발명의 미생물은 아세토인 생물합성을 위한 유전자를 발현하는 효모 중에서 선택된다.
본원에서 사용시 용어 "재조합 미생물" 또는 "유전자 변형된 미생물" 또는 "재조합 효모" 또는 "유전자 변형된 효모"는 유전자 변형되거나 또는 유전자 조작된 효모를 의미한다. 이들 용어의 일반적인 의미에 따라서, 본 발명의 미생물은 자연계에서 발견되지 않고 자연계에 존재하는 균등한 미생물 유래의 유전자 성분에 의해 변형되거나 또는 결실 또는 도입되어 변형되는 것을 의미한다. 또한 특별한 선별 압력 하에서 지정 돌연변이유발법 및 진화법을 조합하여 신규한 대사 경로의 발생 및 진화를 강제하여 변형시킬 수도 있다(예를 들어, WO 2004/076659 참조).
미생물은 숙주 미생물에서 그들 발현을 가능케하는 모든 성분과 함께 미생물에 외생성 유전자들이 도입되면 그 외생성 유전자를 발현하도록 변형될 수 있다. 미생물은 내생성 유전자의 발현 수준을 조정하도록 변형될 수 있다. 외생성 DNA로의 효모와 같은 미생물의 변형 또는 "형질전환"은 당업자의 통상적인 작업이다. 구체적으로, 본 발명에 따른 미생물의 유전자 변형, 보다 구체적으로 본원에 정의된 유전자 변형(들)은 문헌 [DiCarlo et al. (Nucl. Acids Res., vol. 41, No. 7, 2013: 4336-4343)]에 기술된 바와 같이, CRISPR-Cas 시스템을 사용해 수행될 수 있다.
용어 "내생성 유전자"는 유전자가 야생형 균주에서, 임의의 유전자 변형 전에 존재하는 것을 의미한다. 내생성 유전자는 내생성 조절 성분에 추가로, 또는 그를 대체하여, 이종성 서열을 도입하거나, 또는 염색체 또는 플라스미드에 유전자의 1 이상의 추가 카피를 도입하여 과발현될 수 있다. 내생성 유전자는 또한 그들의 발현 및/또는 활성을 조정하도록 변형될 수 있다. 예를 들면, 돌연변이는 유전자 생성물을 변형시키도록 코딩 서열에 도입되거나 또는 이종성 서열이 내생성 조절 성분에 추가로 또는 그를 대체하여 도입될 수 있다. 내생성 유전자의 조정은 유전자 생성물의 활성의 상향 조절 및/또는 향상을 야기하거나, 또는 대안적으로 내생성 유전자 생성물의 활성의 하향 조절 및/또는 감쇠(attenuation)를 야기할 수 있다. 내생성 유전자의 발현을 향상시키는 다른 방식은 염색체 또는 플라스미드 상에 유전자의 1 이상의 추가 카피를 도입하는 것이다.
용어 "외생성 유전자"는 당업자에게 잘 알려진 수단에 의해, 미생물에 유전자를 도입시키는 한편, 이 유전자는 야생형 미생물에서 천연 발생된 것이 아님을 의미한다. 미생물은 이들 유전자가 숙주 미생물에서 그들 발현을 허용하는 모든 성분과 함께 미생물에 도입되면 외생성 유전자를 발현할 수 있다. 외생성 DNA로의 미생물의 형질전환은 당업자에게 일상적인 작업이다. 외생성 유전자는 숙주 염색체에 통합되거나, 또는 플라스미드 또는 벡터로부터 염색체 외에서 발현될 수 있다. 그들의 복제 기원 및 세포에서 그들의 카피수 관점에서 상이한, 다양한 플라스미드가 당분야에 모두 알려져 있다. 외생성 유전자의 서열은 숙주 미생물에서 그 발현을 위해 적합화될 수 있다. 실제로, 당업자는 코돈 용법 편중의 개념을 알고 있으며 추론되는 단백질을 변형시키지 않고 특정 코돈 용법에 핵산 서열을 어떻게 적합화시키는지 알고 있다.
용어 "이종성 유전자"는 유전자가 그것을 발현하는 수용자 미생물과 상이한 미생물 종에서 유도되었음을 의미한다. 이는 미생물에서 천연적으로 발생되지 않은 유전자를 의미한다.
본 출원에서, 모든 유전자는 그들의 보통 명칭으로, 그리고 그들의 뉴클레오타이드 서열과 관련하여, 그들의 아미노산 서열에 대하여 표시된다. 공지된 유전자에 대한 수탁 번호로 주어진 참조 번호를 사용하여, 당업자는 다른 유기체, 박테리아 균주, 효모, 진균, 포유동물, 식물 등에서 균등한 유전자를 결정할 수 있다. 이러한 통상의 작업은 다른 미생물에서 유래하는 유전자와 서열 정렬을 수행하고 축퇴성 프로브를 디자인하여 다른 유기체에서 상응하는 유전자를 클로닝하여 결정할 수 있는 공통 서열을 사용해 유리하게 수행된다.
당업자는 내생성 유전자의 발현을 조정, 구체적으로 상향조절 또는 하향조절하는 다양한 수단들을 알고 있다. 예를 들어, 내생성 유전자의 발현을 향상시키는 방식은 염색체 또는 플라스미드 상에 유전자의 1 이상의 추가 카피를 도입시키는 것이다.
다른 방식은 유전자의 내생성 프로모터를 보다 강력한 프로모터로 대체하는 것이다. 이들 프로모터는 동종성이거나 또는 이종성일 수 있다. 효모에서 높은 수준의 발현을 가능하게 하는 것으로 알려진 동종성 프로모터는 다음의 군에서 선택된 것들이다: ADH1, GPDH, TEF1, 절단형 HXT7, PFK1, FBA1, PGK1 및 TDH3 등. 본 발명에서 특히 관심있는 프로모터를 이하에 보다 상세하게 정의한다.
효모에서, 핵산 발현 구성체는 바람직하게, 각각의 고려되는 유전자, 보다 구체적으로 본 발명에 따라서 상기에 언급된 각각의 ALS, ALD 및 NOXE 효소를 코딩하는 핵산 서열에 작동적으로 연결된, 조절 서열, 예컨대 프로모터 및 종결인자 서열을 포함한다.
핵산 발현 구성체는 5' 및/또는 3' 인식 서열 및/또는 선별 마커를 더 포함할 수 있다.
용어 "과발현"은 미변형된 미생물과 비교하여 유전자 또는 효소의 발현이 증가됨을 의미한다. 효소의 발현 증가는 상기 효소를 코딩하는 유전자의 발현을 증가시켜 획득된다. 유전자의 발현 증가는 당업자에게 공지된 모든 기술에 의해 수행될 수 있다. 이러한 관점에서, 과발현시키고자 하는 핵산 상류에 강력한 프로모터의 제공 또는 프로모터, 특히 강력한 프로모터와 종결인자 사이의 상기 핵산의 몇 카피의 도입을 특히 언급할 수 있다.
효소의 "활성"은 용어 "기능"과 상호교환적으로 사용되며 본 발명에서는 원하는 반응을 촉매하는 효소의 능력을 의미한다.
용어 효소의 "감소된 활성" 또는 "감쇠된 활성"은 아미노산 서열의 돌연변이에 의해 얻은 단백질의 감소된 특이적 촉매 활성 및/또는 뉴클레오타이드 서열의 돌연변이 또는 동족의 상응하는 유전자의 결실에 의해 획득된 세포 내 단백질의 감소된 농도를 의미한다.
용어 효소의 "향상된 활성"은 예를 들어 효소를 코딩하는 유전자의 과발현에 의해 얻어진, 세포에서 효소의 증가된 양/이용률, 및/또는 효소의 증가된 특이적 촉매 활성을 의미한다.
용어 "코딩하는" 또는 "코딩"은 전사 및 번역 기전을 통해서 폴리뉴클레오타이드가 아미노산 서열을 생산하는 과정을 의미한다.
본 발명에서 고려되는 효소(들)를 코딩하는 유전자(들)는 외생성이거나 또는 내생성일 수 있다.
유전자의 "감쇠(attenuation)"는 유전자가 변형되지 않은 미생물에서 보다 열등한 속도로 발현되는 것을 의미한다. 감쇠는 당업자에게 공지된 수단 및 방법에 의해 획득될 수 있고 상동성 재조합에 의해 얻은 유전자 결실, 유전자에 외부 성분의 삽입에 의한 유전자 감쇠 또는 약한 프로모터 하의 유전자 발현을 포함한다. 당업자는 상이한 강도를 나타내는 다양한 프로모터 및 약한 유전자 발현에 사용되는 프로모터가 무엇인지 알고 있다.
본 발명에서 제공하는 방법은 바람직하게 유전자 변형된 미생물 세포에서 하나 이상의 표적 유전자의 기능적 파괴를 위해서 또는 염색체 상의 특별한 위치에 이종성 뉴클레오타이드 서열의 안정한 도입을 위해서 하나 이상의 염색체 통합 구성체의 사용을 필요로 한다. 일부 실시형태에서, 표적 유전자의 파괴는 관련된 기능적 단백질의 발현을 방해한다. 일부 실시형태에서, 표적 유전자의 파괴는 파괴된 유전자로부터 비기능적 단백질의 발현을 일으킨다.
본 발명의 실시에서 가변적일 수 있는 염색체 통합 구성체의 변수는 제한없이, 상동성 서열의 길이; 상동성 서열의 뉴클레오타이드 서열; 통합 서열의 길이; 통합 서열의 뉴클레오타이드 서열; 및 표적 유전자좌의 뉴클레오타이드 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, 각 상동성 서열의 길이에 대한 효과적인 범위는 20 내지 5,000 염기쌍, 바람직하게는 50 내지 100 염기쌍이다. 구체적인 실시형태에서, 각 상동성 서열의 길이는 약 50 염기쌍이다. 유전자 표적화에 필요한 상동성 길이에 대한 추가 정보는 문헌 [D. Burke et al., Methods in yeast genetics - A cold spring harbor laboratory course Manual (2000)]을 참조한다.
일부 실시형태에서, 상기 언급된 DNA 구성체(들)를 삽입하고자 하는 파괴된 피루베이트 디카복실라제 유전자(들)는 형질전환된 미생물 세포의 선별에 유용한 하나 이상의 선별 마커를 유리하게 포함할 수 있다. 바람직하게는, 상기 선별 마커(들)는 본 발명에 따른 DNA 구성체(들)에 포함된다.
일부 실시형태에서, 선별 마커는 항생제 내성 마커이다. 항생제 내성 마커의 예시적인 예에는 제한없이, NAT1, AURl-C, HPH, DSDA, KAN<R>, 및 SH BLE 유전자 생성물이 포함된다. 에스. 노우르세이(S. noursei) 유래의 NAT 1 유전자 생성물은 노우르세오트리신에 대한 내성을 부여하고, 사카로마이세스 세레비지아(Saccharomyces cerevisae) 유래의 AURl-C 유전자 생성물은 아우에로바시딘 A(AbA)에 대한 내성을 부여하며, 클렙시엘라 뉴모니아(Klebsiella pneumonia)의 HPH 유전자 생성물은 하이그로마이신 B에 대한 내성을 부여하고; 이. 콜라이(E. coli) 유래의 DSDA 유전자 생성물은 단독 질소 공급원으로 D-세린을 함유한 플레이트 상에서 세포가 성장할 수 있게 하고, Tn903 트랜스포존의 KAN<R> 유전자는 G418에 대한 내성을 부여하고, 스트렙토알로테이커스 힌더스타너스(Streptoalloteichus hindustanus) 유래의 SH BLE 유전자 생성물은 제오신(블레오마이신)에 대한 내성을 부여한다.
일부 실시형태에서, 항생제 내성 마커는 본 발명의 유전자 변형된 미생물 세 포를 단리한 후 결실된다. 당업자는 특정한 유전적 상황에서 적합한 마커를 선택할 수 있다.
일부 실시형태에서, 선별 마커는 유전자 변형된 미생물 세포에서 영양요구성(예를 들어, 영양분의 영양요구성)을 복구시킨다. 그러한 실시형태에서, 부모 미생물 세포는 아미노산 또는 뉴클레오타이드 생물합성 경로에서 기능하는 1 이상의 유전자 생성물, 예컨대 예를 들어 효모에서 HIS3, LEU2, LYS1, LYS2, MET 15, TRP1, ADE2, 및 URA3 유전자 생성물의 기능적 파괴를 포함하여, 부모 미생물 세포가 1 이상의 영양분이 보충되지 않은 배지에서 성장할 수 없게 한다(영양요구성 표현형). 영양요구성 표현형은 파괴된 유전자 생성물의 기능적 카피(NB: 유전자의 기능적 카피는 가까운 종, 예컨대 글루베로마이세스, 캔디다 등에서 기원할 수 있음)를 코딩하는 염색체 통합으로 부모 미생물 세포를 형질전환시켜 복구시킬 수 있고, 생성된 유전자 변형된 미생물 세포는 부모 미생물 세포의 영양요구성 표현형의 상실을 기반으로 선별될 수 있다.
프로모터 서열, 코딩 서열(예를 들어, 효소 코딩 서열), 또는 종결인자 서열을 포함하는 핵산 서열 각각의 경우, 기준 서열은 본원에 기술된다. 본 설명은 또한 기준 핵산 서열과 특정한 핵산 동일성 비율을 갖는 핵산 서열을 포함한다.
관심의 아미노산 서열 각각의 경우, 기준 서열을 본원에 기술한다. 본 설명은 또한 기준 아미노산 서열과 특정 비율의 아미노산 동일성을 갖는, 아미노산 서열(예를 들어, 효소 아미노산 서열)을 포함한다.
명백한 이유로, 본 설명의 전부에서, 개별적으로, 고려되는 뉴클레오타이드 또는 아미노산 동일성에 따르는 특정 핵산 서열 또는 특정 아미노산 서열은 원하는 생물학적 활성을 나타내는 단백질(또는 효소)을 더욱 얻을 수 있도록 해야 한다. 본원에서 사용시, 2가지 핵산 서열 또는 2가지 아미노산 서열 간의 "동일성 비율"은 비교창을 통해 최적으로 정렬된 서열을 비교하여 결정된다.
비교창에서 뉴클레오타이드 또는 아미노산 서열의 비율은 따라서 양쪽 서열 간에 최적 정렬을 획득하기 위해 기준 서열(부가 또는 결실을 포함하지 않음)과 비교하여 부가 또는 결실(예를 들어, "갭")을 포함할 수 있다.
동일성 비율은 동일한 핵산 염기, 또는 동일한 아미노산 잔기가 양쪽 비교 서열에 대해 나타날 수 있는 위치수를 결정한 후, 양쪽 핵산 염기 사이에서, 또는 양쪽 아미노산 잔기 사이에서 동일성이 관찰될 수 있는 위치의 개수를 비교창의 총 위치 개수로 나눈 다음, 그 결과에 100을 곱해서 2개 서열 간 뉴클레오타이드 동일성 비율 또는 2개 서열 간 아미노산 동일성 비율을 얻음으로써 계산된다.
서열 최적 정렬의 비교는 공지된 알고리즘을 사용해 컴퓨터에 의해 수행될 수 있다.
가장 바람직하게는, 서열 동일성 비율은 다음과 같이 변수가 설정된 CLUSTAL W 소프트웨어(버전 1.82)를 사용해 결정한다: (1) CPU 방식=ClustalW mp; (2) 정렬="전체"; (3) 출력 형식="aln w/개수"; (4) 출력 순서="정렬됨"; (5) 색상 정렬="없음"; (6) KTUP(글자 크기)="디폴트"; (7) 윈도우 길이="디폴트"; (8) 점수 유형="백분율"; (9) TOPDIAG="디폴트"; (10) PAIRGAP="디폴트"; (11) 계통 나무/나무 유형="없음"; (12) 매트릭스="디폴트"; (13) 갭 오픈="디폴트"; (14) 엔드 갭="디폴트"; (15) 갭 확장="디폴트"; (16) 갭 거리="디폴트"; (17) 나무 유형="분기도" 및 (18) 나무 간격 거리="숨김".
"발효배양" 또는 "배양"은 적어도 하나의 단순 탄소 공급원, 및 필요하다면 보조 기질을 함유하는, 배양하려는 미생물에 적합화된 적절한 배양 배지가 있는 발효배양기에서 대체로 수행된다.
본원에 개시된 미생물은 피루베이트로부터 생성물의 생산을 위한 발효배양 배지에서 성장될 수 있다. 아세토인의 최대 생산을 위해서, 생산 숙주로서 사용되는 미생물 균주는 바람직하게 높은 탄수화물 이용률을 갖는다. 이들 특징은 돌연변이유발법 및 선별법, 유전자 조작법에 의해 부여되거나, 또는 자연적인 것일 수 있다. 본 발명의 세포를 위한 발효배양 배지, 또는 "배양 배지"는 적어도 약 10 g/L의 포도당을 함유할 수 있다. 추가의 탄소 기질이 포함될 수 있지만 제한없이 단당류 예컨대 프룩토스, 만노스, 자일로스 및 아라비노스; 올리고당 예컨대 락토스, 말토스, 갈락토스, 또는 수크로스; 다당류 예컨대 전분 또는 셀룰로스 또는 이의 혼합물 및 재생성 공급 원료 유래의 미정제 혼합물 예컨대 치즈 유장 투과 옥수수 침지액, 사탕무 당밀, 및 엿기름을 포함할 수 있다. 다른 탄소 기질은 글리세롤을 포함할 수 있다.
따라서, 본 발명에서 이용하는 탄소 공급원은 광범위하게 다양한 탄소 함유 기질을 포함할 수 있고 유기체의 선택에 의해서만 제한됨을 이해한다.
상기에 언급된 모든 탄소 기질 및 이의 혼합물이 본 발명에서 적합한 것으로 간주되지만, 바람직한 탄소 기질은 포도당, 프룩토스, 및 수크로스, 또는 C5 당을 사용하도록 개질된 미생물을 위한 C5 당 예컨대 자일로스 및/또는 아라비노스와 이들의 혼합물이고, 보다 구체적으로는 포도당이다.
바람직한 탄소 기질은 수크로스이다.
구체적인 실시형태에 따라서, 본 발명에 따른 탄소 기질은 자일로스로 이루어지지 않는다.
적절한 탄소 공급원 이외에도, 발효배양 배지는 배양물의 성장 및 원하는 생성물의 생산에 필요한 효소 경로의 촉진에 적합한, 당업자에게 공지된, 적합한 미네랄, 염, 보조인자, 완충제 및 다른 성분들을 함유할 수 있다.
그외에도, 본 발명에 따른 재조합 미생물의 성장에 적합한 추가의 유전자 변형이 고려될 수 있다.
2,3-BDO로의 아세토인의 누출을 방지하기 위해서, 2,3 BDO로의 아세토인의 환원에 관여하는 유전자가 불활성화될 수 있다. 이러한 점에서, 내생성 부탄디올 디하이드로게나제 bdh1 및 bdh2(특히 EC 번호 1.1.1.4.로 알려짐)를 비롯하여, 내생성 알콜 디하이드로게나제 adh1, adh3 및 adh4(특히 EC 번호 1.1.1.1로 알려짐)를 언급할 수 있다. 상기 유전자의 불활성화는 당업자의 일반 지식에 속한다.
약산의 존재가 성장을 제한한다고 알려져 있고 종종 배지 유래의 셀룰로스 또는 당밀에 존재한다.
추가의 유전자 변형 예컨대 JEN1 유전자(또는 계통명: YKL217W 또는 단백질 수탁 번호 P36035(UniProtKB swiss-Prot))의 파괴 및/또는 HAA-1 유전자(계통명: YPR008W 또는 수탁 번호 Q12753(UniProtKB swiss-Prot))의 과발현은 제공된 배양 배지 내 약산에 대한 균주 내성을 개선시킨다.
Jen 1은 세포에서의 락테이트 유입을 담당하는 막 단백질이다(Casal M, et al. (1999), J. Bacteriol., 181(8): 2620-3).
HAA-1은 약산에 대한 내성을 담당하는 막 스트레스 단백질의 발현을 제어하는 전사 활성인자이다. 이의 과발현은 아세트산에 대한 효모의 내성을 향상시킨다(Tanaka et al. (2012) Appl Environ Microbiol., 78(22): 8161-3).
JEN1 유전자의 파괴 및 HAA-1 유전자의 과발현은 당업자의 일반 지식에 속하고 특히 본원에 제시된 방법을 사용해 수행할 수 있다.
효모에서 아세토인의 합성에 대한 방정식 이후에 본원의 관점에서, 본 발명에서 고려되는 조건은 반드시 호기성 조건이다.
용어 "호기성 조건"은 최종 전자 억셉터로서 디-옥시겐을 사용하는데 호기성 또는 조건적 혐기성 미생물에게 충분한 배양 배지 내 산소 농도를 의미한다.
"미세호기성 조건"은 산소의 농도가 공기보다 낮은, 즉 최대 6% 02의 산소 농도인 배양 배지를 의미한다
"적절한 배양 배지"는 세포의 유지 및/또는 성장에 필수적이거나 또는 혜택이 있는 영양분 예컨대 탄소 공급원 또는 탄소 기질, 질소 공급원, 예를 들어 펩톤, 효모 추출물, 고기 추출물, 맥아 추출물, 우레아, 암모늄 설페이트, 암모늄 클로라이드, 암모늄 나이트레이트 및 암모늄 포스페이트; 인 공급원, 예를 들어 모노칼륨 포스페이트 디칼륨 포스페이트; 미량 원소(예를 들어, 금속염), 예를 들어 마그네슘 염, 코발트 염 및/또는 망간 염을 비롯하여, 성장 인자 예컨대 아미노산, 비타민, 성장 촉진제 등을 포함하는 배지(예를 들어, 멸균, 액체 배지)를 의미한다. 본 발명에 따른 용어 "탄소 공급원" 또는 "탄소 기질" 또는 "탄소의 공급원"은 헥소스(예컨대 포도당, 갈락토스 또는 락토스), 펜토스, 단당류, 올리고당, 이당류(예컨대 수크로스, 셀로바이오스 또는 말토스), 당밀, 전분 또는 이의 유도체, 셀룰로스, 헤미셀룰로스 및 이의 조합을 포함하여, 미생물의 정상적인 성장을 뒷받침하는 당업자가 사용할 수 있는 임의의 탄소 공급원을 의미한다.
본 발명에 따른 재조합 효모
상기에서 언급한 바와 같이, 본 발명은 그의 게놈에
- 아세토락테이트 신타제 또는 ALS를 코딩하는 1 이상의 핵산,
- 아세토락테이트 디카복실라제 또는 ALD를 코딩하는 1 이상의 핵산, 및
- NADH 옥시다제(또는 NOXE)를 코딩하는 핵산의 1 이상의 카피
가 삽입된, 감소된 피루베이트 디카복실라제 활성을 갖는 재조합 효모에 관한 것이다.
본원의 실시예에서 도시한 바와 같이, 본 발명자들은 피루베이트 디카복실라제 활성이 감소되고 아세토인의 합성에 필요한 ALS 및 ALD 효소의 발현을 가능케 하는 유전자가 더욱 통합된 재조합 효모에서 NADH 옥시다제를 코딩하는 핵산의 존재, 유리하게는 이의 다수 카피의 존재가 상기 재조합 효모를 안정화시키는데 기여할 뿐만 아니라 이 균주의 성장을 비롯해, 아세토인 생산 수율을 유의하게 향상시킬 수 있다는 것을 예상치 않게 발견하였다.
크랩트리 양성 효모 유기체 예컨대 사카로마이세스 세레비지아, 및 특히 관심 대사산물을 생산하기 위한, 재조합 효모 유기체 예컨대 사카로마이세스 세레비지아의 사용은 박테리아와 대조적으로, 효모 세포는 충분한 양의 포도당 또는 수크로스 등과 같은 당 존재 하에 산소 존재 하에서 발효배양을 수행할 수 있는 능력을 갖기 때문에 유리하다. 이와 달리 박테리아는 혐기성 조건에서만 발효배양을 수행한다. 또한, 효모 유기체는 박테리아에 대한 박테리오파지와 달리 바이러스 감염을 겪지않는다. 또한, 효모 유기체의 배양은 효모 세포가 그들 환경을 예를 들어 그들 성장을 지원하는 배양 배지를 최대 pH 4로 급속하게 산성화시키기 때문에 원치않는 미생물 예컨대 박테리아에 의한 감염을 거의 겪지 않는다. 뿐만 아니라, 효모 세포는 배양 배지에서 그 존재가 관심 대사산물(들)의 후속 정제의 실제로 문제가 되는, 수많은 원치 않는 대사산물 예컨대 락트산을 배출하지 않는다. 또한, 재조합 효모 유기체를 포함하여, 효모 유기체는 박테리아와 비교하여 보다 높은 유전적 안정성을 갖는다.
효모에서 아세토인의 합성에 대한 방정식은 다음과 같다:
Figure 112017018861512-pct00001
상기 질량 방정식은 에스. 세레비지아가 산소 존재 하에서도 발효배양할 수 있다는 사실로 인해 가능하다.
상기 방정식의 관점에서, 아세토인의 최대 이론적 수율은 200 g의 포도당 투입량에 대해 97.78 g이다.
본원의 실시예에서 도시하는 바와 같이, 본 발명에 따른 재조합 효모를 사용한 아세토인의 효율적인 수율은 이 최대 이론적 수율에 비교적 근접한다(최대 83%). 발명자의 지식에 따라서, 이러한 수율은 이제까지 효모에서 전혀 획득되지 않았다.
따라서, 높은 수율로 아세토인의 생산이 본 발명에 따른 재조합 효모에서 성공적으로 달성되어, 효모에서 아세토인의 산업적 생산을 위한 방안이 준비되었다.
놀랍게도, 본원의 실시예에서 역시 도시한 바와 같이, 합성된 아세토인의 농도가 높음에도, 효모 세포에 대한 생산된 아세토인의 독성이 관찰되지 않았다. 게다가, 합성된 아세토인이 전체적으로 세포 밖으로 유출되어, 실질적으로 정제 과정이 단순화된다.
본 발명에 따른 재조합 효모에서 사용된 NADH 옥시다제(또는 NOXE)는 임의의 탄소화된 억셉터를 소비하지 않으므로 매우 특이적인 "NADH-의존적" 효소이다. 이러한 이유로, 선택된 NADH 옥시다제는 탄소화 물질대사를 직접적으로 방해하지 않지만, 물 생산에서 NAD+ 풀을 보충한다.
이러한 점에서, 본 발명에 따른 재조합 효모에서 사용된 NADH 옥시다제는 상기에 언급된 종래 문허, 특히 US 2011/0124060 및 WO 2013/076144에 개시된 "NADH-의존적" 효소와 특히 상이하다.
일정 실시형태에 따라서, 재조합 효모는 하기 식을 포함하는 군에서 선택된 하나 이상의 DNA 구성체를 포함할 수 있다:
(I) 5'-[유전자 1]x1-3' 및 5'-[유전자 2]x2-3' 및 5'-[유전자 3]x3-3',
(II) 5'-[유전자 1]x1-[유전자 2]x2-3' 및 5'-[유전자 3]x3-3',
(III) 5'-[유전자 1]x1-[유전자 2]x2-[유전자 3]x3-3', 및
이의 조합,
상기 식에서,
- "유전자 1"은 ALS, ALD 또는 NOXE를 포함하는 군에서 선택된 핵산을 의미하고;
- "유전자 2"는 ALS, ALD 또는 NOXE를 포함하는 군에서 선택되지만 유전자 1과는 상이한 핵산을 의미하고;
- "유전자 3"은 ALS, ALD 또는 NOXE를 포함하는 군에서 선택되지만 유전자 1 및 유전자 2와 상이한 핵산을 의미하고;
- "ALS"는 아세토락테이트 신타제를 코딩하는 핵산이고;
- "ALD"는 아세토락테이트 디카복실라제를 코딩하는 핵산이고;
- "NOXE"는 NADH 옥시다제를 코딩하는 핵산이고;
- "x1", "x2" 및 "x3" 각각은, 서로 독립적으로, 0 내지 50 범위, 바람직하게는 0 내지 20 범위의 정수를 나타내고,
단, 상기 재조합 효모는 ALS, ALD 및 NOXE 각각을 코딩하는 적어도 하나의 핵산을 포함한다.
바람직하게는, "x1", "x2" 및 "x3" 중 각각은 서로 독립적으로, 0 내지 10 범위, 보다 구체적으로 0 내지 5 범위, 구체적으로 0 내지 3 범위의 정수, 여전히 바람직하게는 1과 동등한 정수를 나타낸다.
본원에서 의도하는 바와 같이, x1, x2 및 x3 각각은 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49 및 50을 포함하는 군에서 선택된 값을 가질 수 있다.
일정 실시형태에서, 상기 식 (I) 내지 (III)의 DNA 구성체에서, 정수 "x1", "x2" 및/또는 "x3" 중 1 이상은, 서로 독립적으로, 2 이상의 값을 가져서, 관련 유전자 1, 유전자 2 및/또는 유전자 3 중에서 상응하는 유전자의 2 이상의 카피 각각이 동일하거나 또는 상이할 수 있다. ALS, ALD 및 NOXE의 다양한 개별 서열은 본원의 표 1에 도시하였다.
상기 식 (I) 내지 (III) 중에서 선택된 DNA 구성체의 예시적인 실시형태에서, "x1"은 2와 같은 정수이고 유전자 1이 아세토락테이트 신타제(ALS)를 코딩하는 핵산이면, 상기 DNA 구성체에 함유된 2개의 ALS-코딩 서열은 동일하거나 또는 상이할 수 있다.
예를 들어, 이러한 구체적인 실시형태에 따라서, 아세토락테이트 신타제를 코딩하는 핵산의 제1 카피는 ALS.Bs를 코딩하는 핵산일 수 있고, 아세토락테이트 신타제를 코딩하는 핵산의 제2 카피는 ALS.Pp를 코딩하는 핵산일 수 있음을 의미한다.
본 발명에 따른 재조합 효모의 실시형태에서, 상기 재조합 효모는 식 (I) 내지 (III)의 DNA 구성체를 포함하는 군에서 선택된 적어도 2개의 DNA 구성체를 포함하고, 보다 구체적으로 그에 함유된 관련 유전자 1, 유전자 2 및/또는 유전자 3 중 각각의 유전자는 동일하거나 또는 상이할 수 있다.
본원에서는 이하 식 (I), (II) 및 (III)의 DNA 구성체를 포함하는 군에서 선택된 DNA 구성체의 일부 예시적인 실시형태를 제시한다.
하나의 식 (I)의 DNA 구성체를 포함하는 재조합 효모:
(I) 5'-[ALS]2-3' 및 5'-[ALD]2-3' 및 5'-[NOXE]3-3',
상기 식 (I)의 DNA 구성체를 포함하는 재조합 효모는 감소된 피루베이트 디카복실라제 활성을 가지며, 그의 게놈에 도입된 이하 4종의 DNA 하위-구성체 (i) 내지 (iii)를 보유한다:
(i) 각각 ALS를 코딩하는, 서로 동일하거나 또는 상이한, 2개 핵산을 포함하는 DNA 하위 구성체로서, 상기 DNA 하위 구성체는 상기 재조합 효모의 게놈 내 제1 위치에 도입된다;
(ii) 각각 ALD를 코딩하는, 서로 동일하거나 또는 상이한, 2개 핵산을 포함하는 DNA 하위 구성체로서, 상기 DNA 하위 구성체는 ALS를 코딩하는 핵산을 포함하는 DNA 하위 구성체가 삽입된 위치와는 상이한, 상기 재조합 효모의 게놈 내 제2 위치에 도입된다; 그리고
(iii) 각각 NOXE를 코딩하는, 서로 동일하거나 또는 상이한, 3개 핵산을 포함하는 DNA 하위 구성체로서, 상기 DNA 하위 구성체는 ALS를 코딩하는 핵산을 포함하는 DNA 하위 구성체 및 ALD를 코딩하는 핵산을 포함하는 DNA 하위 구성체가 각각 삽입된 제1 및 제2 위치와 상이한, 상기 재조합 효모의 게놈 내 제3 위치에 도입된다.
일부 실시형태에서, 상기 특별한 재조합 효모의 요구되는 감소된 피루베이트 디카복실라제 활성은 적어도 하나의 DNA 하위 구성체 (i) 내지 (iii), 또는 대안적으로 이의 조합의 효모 pdc 유전자의 적어도 하나로의 삽입에 의해 얻을 수 있다.
하나의 식 (II)의 DNA 구성체를 포함하는 재조합 효모:
(II) 5'-[ALS]2-[ALD]2-3' 및 5'-[NOXE]3-3',
상기 식 (II)의 DNA 구성체를 포함하는 재조합 효모는 감소된 피루베이트 디카복실라제 활성을 가지며, 하기 2개의 DNA 하위 구성체 (A) 및 (B)가 삽입된 게놈을 갖는다:
(A) 제1 DNA 하위 구성체 5'-[ALS]2-[ALD]2-3'로서, 상기 제1 DNA 하위 구성체는 상기 재조합 효모의 게놈 내 제1 위치에 도입되고, 상기 제1 DNA 하위 구성체는
(i) 각각의 핵산이 ALS를 코딩하는, 서로 동일하거나 또는 상이한 2개 핵산; 및
(ii) 각각의 핵산이 ALD를 코딩하는, 서로 동일하거나 또는 상이한 2개 핵산을 포함한다;
(B) 제2 DNA 하위 구성체 5'-[NOXE]3-3'로서, 상기 DNA 하위 구성체는 제1 DNA 하위 구성체가 삽입된 제1 위치와는 상이한, 상기 제조합 효모의 게놈 내 제2 위치에 도입되고, 상기 제2 DNA 하위 구성체는 (iii) 각각의 핵산이 NOXE를 코딩하는, 서로 동일하거나 또는 상이한 3개 핵산을 포함한다.
일정 실시형태에서, 상기 특별한 재조합 효모의 요구되는 감소된 피루베이트 디카복실라제 활성은 제1 DNA 하위 구성체 및/또는 제2 DNA 하위 구성체의 효모 pdc 유전자의 적어도 하나로의 삽입에 의해 얻을 수 있다.
하나의 식 (III)의 DNA 구성체를 포함하는 재조합 효모:
(III) 5'-[ALS]2-[ALD]2-[NOXE]3-3',
상기 식 (III)의 DNA 구성체를 포함하는 재조합 효모는 감소된 피루베이트 디카복실라제 활성을 가지며 상기 재조합 효모의 게놈에 원하는 위치에 위치된 하나의 DNA 구성체가 삽입된 게놈을 보유하며, 상기 DNA 구성체는
(i) 각각의 핵산이 ALS를 코딩하는, 서로 동일하거나 또는 상이한 2개 핵산;
(ii) 각각의 핵산이 ALD를 코딩하는, 서로 동일하거나 또는 상이한 2개 핵산; 및
(iii) 각각의 핵산이 NOXE를 코딩하는, 서로 동일하거나 또는 상이한 3개 핵산
을 포함한다.
일정 실시형태에서, 상기 특별한 재조합 효모의 요구되는 감소된 피루베이트 디카복실라제 활성은 효모 pdc 유전자의 적어도 하나에 상기 DNA 구성체의 삽입에 의해 얻을 수 있다.
본 발명에 따르고, 상기에 언급된 바와 같은 재조합 효모의 상기 예시적인 이들 3가지 실시형태 각각의 경우에서, "x1" 내지 "x3"이 서로 독립적으로, 2 또는 그 이상의 값을 갖는 정수를 나타내면,
- 단일 DNA 구성체 내 ALS의 한 카피는 상기 DNA 구성체에 포함된 ALS의 다른 카피와 동일할 수 있거나 또는 상기 DNA 구성체에 함유된 ALS의 다른 모든 카피와 동일할 수 있거나, 또는 대안적으로 ALS의 상기 한 카피는 상기 DNA 구성체에 함유된 ALS의 서로 다른 카피와 상이할 수 있다.
- 단일 DNA 구성체 내 ALD의 한 카피는 상기 DNA 구성체에 포함된 ALD의 다른 카피와 동일할 수 있거나 또는 상기 DNA 구성체에 함유된 ALD의 다른 모든 카피와 동일할 수 있거나, 또는 대안적으로 상기 ALD의 한 카피는 상기 DNA 구성체에 함유된 ALD의 서로 다른 카피와 상이할 수 있다.
- 단일 DNA 구성체 내 NOXE의 한 카피는 상기 DNA 구성체에 포함된 NOXE의 다른 카피와 동일할 수 있거나 또는 상기 DNA 구성체에 함유된 NOXE의 다른 모든 카피와 동일할 수 있거나, 또는 대안적으로 상기 NOXE의 한 카피는 상기 DNA 구성체에 함유된 NOXE의 서로 다른 카피와 상이할 수 있다.
하나의 식 (III)의 DNA 구성체 및 하나의 식 (I)의 DNA 구성체를 포함하는 재조합 효모:
(III) 5'-[ALS]1-[ALD]1-[NOXE]1-3', 및
(I) 5'-[ALS]0-3' 및 5'-[ALD]0-3' 및 5'-[NOXE]12-3',
최종 재조합 효모는 감소된 피루베이트 디카복실라제 활성을 가지며, 이하의 2가지 DNA 하위 구성체 (A) 및 (B)가 삽입된 게놈을 갖는다:
(A) 제1 DNA 하위 구성체 5'-[ALS]1-[ALD]1-[NOXE]1-3'로서, 상기 제1 DNA 하위 구성체는 상기 재조합 효모의 게놈 내 제1 위치에서 도입되고, 상기 제1 DNA 하위 구성체는
(i) ALS를 코딩하는 하나의 핵산;
(ii) ALD를 코딩하는 하나의 핵산; 및
(iii) NOXE를 코딩하는 하나의 핵산
을 포함한다; 그리고
(B) 제2 DNA 하위 구성체 5'-[ALS]0-3' 및 5'-[ALD]0-3' 및 5'-[NOXE]12-3'로서, 상기 제2 DNA 하위 구성체는 상기 재조합 효모의 게놈 내 제2 위치에서 도입되고, 상기 제2 DNA 하위 구성체는
(i) NOXE를 코딩하는 12개 핵산을 포함한다.
2개의 식 (III)의 DNA 구성체 및 하나의 식 (I)의 DNA 구성체를 포함하는 재조합 효모:
(III-1) 5'-[ALS]1-[ALD]1-[NOXE]1-3',
(III-2) 5'-[ALS]1-[ALD]1-[NOXE]1-3',
(I) 5'-[ALS]0-3' 및 5'-[ALD]0-3' 및 5'-[NOXE]12-3',
최종 재조합 효모는 감소된 피루베이트 디카복실라제 활성을 가지며, 이하의 2개 DNA 하위 구성체 (A), (B), 및 (C)가 삽입된 게놈을 갖는다:
(A) 제1 DNA 하위 구성체 5'-[ALS]1-[ALD]1-[NOXE]1-3'로서, 상기 제1 DNA 하위 구성체는 상기 재조합 효모의 게놈 내 제1 위치에 도입되고, 상기 제1 DNA 하위 구성체는
(i) ALS를 코딩하는 하나의 핵산;
(ii) ALD를 코딩하는 하나의 핵산; 및
(iii) NOXE를 코딩하는 하나의 핵산
을 포함한다;
(B) 제2 DNA 하위 구성체 5'-[ALS]1-[ALD]1-[NOXE]1-3'로서, 상기 제2 DNA 하위 구성체는 상기 재조합 효모의 게놈 내 제2 위치에 도입되고, 상기 제2 DNA 하위 구성체는
(i) ALS를 코딩하는 하나의 핵산;
(ii) ALD를 코딩하는 하나의 핵산; 및
(iii) NOXE를 코딩하는 하나의 핵산
을 포함한다; 그리고
(B) 제3 DNA 하위 구성체 5'-[ALS]0-3' 및 5'-[ALD]0-3' 및 5'-[NOXE]12-3'로서, 상기 제3 DNA 하위 구성체는 상기 재조합 효모의 게놈 내 제3 위치에 도입되고, 상기 제3 DNA 하위 구성체는
(i) NOXE를 코딩하는 12개 핵산을 포함한다.
2개의 식 (II)의 DNA 구성체 및 하나의 식 (I)의 DNA 구성체를 포함하는 재조합 효모:
(II-1) 5'-[ALS]1-[ALD]1-3' 및 5'-[NOXE]0-3',
(II-2) 5'-[ALS]1-[ALD]1-3' 및 5'-[NOXE]0-3',
(I) 5'-[ALS]0-3' 및 5'-[ALD]0-3' 및 5'-[NOXE]12-3',
최종 재조합 효모는 감소된 피루베이트 디카복실라제 활성을 가지며, 하기 3개의 DNA 하위 구성체 (A), (B), 및 (C)가 삽입된 게놈을 갖는다:
(A) 제1 DNA 하위 구성체 5'-[ALS]1-[ALD]1-3' 및 5'-[NOXE]0-3'로서, 상기 제1 DNA 하위 구성체는 상기 재조합 효모의 게놈 내 제1 위치에 도입되고, 상기 제1 DNA 하위 구성체는
(i) ALS를 코딩하는 한개의 핵산; 및
(ii) ALD를 코딩하는 한개의 핵산
을 포함한다;
(B) 제2 DNA 하위 구성체 5'-[ALS]1-[ALD]1-3' 및 5'-[NOXE]0-3'로서, 상기 제2 DNA 하위 구성체는 상기 재조합 효모의 게놈 내 제2 위치에 도입되고, 상기 제2 DNA 하위 구성체는
(i) ALS를 코딩하는 한개의 핵산; 및
(ii) ALD를 코딩하는 한개의 핵산
을 포함한다; 그리고
(B) 제3 DNA 하위 구성체 5'-[NOXE]12-3'로서, 상기 DNA 하위 구성체는 제1 DNA 하위 구성체가 삽입된 제1 위치와 상이한, 상기 재조합 효모의 게놈 내 제3 위치에 도입되고, 상기 제2 DNA 하위 구성체는 (iii) 각각의 핵산이 NOXE를 코딩하는, 서로 동일하거나 또는 상이한 12개 핵산을 포함한다.
일정 실시형태에서, 상기 특별한 재조합 효모의 요구되는 감소된 피루베이트 디카복실라제 활성은 제1 DNA 하위 구성체 및/또는 제2 DNA 하위 구성체의 효모 pdc 유전자의 적어도 하나로의 삽입에 의해 얻을 수 있다.
일정 특정 실시형태에 따라서, 본 발명에 따른 재조합 효모는 적어도 하나, 바람직하게는 적어도 2개의, 상기 언급된 식 (II)의 DNA 구성체(들)를 포함하고, 여기서 "유전자 3"은 NADH 옥시다제(또는 NOXE)를 코딩하는 핵산을 의미한다.
이들 특정 실시형태에 따라서, 유전자 1 및 유전자 2 중 각각의 핵산은 반드시 ALS 및 ALD를 포함하는 군에서 선택된 핵산을 의미한다. 이들 실시형태에서, 삽입된 ALS 및 ALD의 적어도 한 카피가 존재한다. 실시형태에서, 오직 하나의 식 (II)의 구성체가 효모 게놈에 도입되면, 유전자 1 및 유전자 2 중 각각의 핵산은 반드시 ALS 및 ALD를 포함하는 군에서 선택된 핵산을 의미하고 ALS 및 ALD 각각의 한 카피가 존재한다. 실시형태에서, 식 (II)의 2개 이상의 구성체 세트가 효모 게놈에 삽입되면, 유전자 1 및 유전자 2 중 각 핵산은 반드시 ALS 및 ALD를 포함하는 군에서 선택된 핵산을 의미하고, ALS 및 LD 각각의 적어도 한 카피가 상기 식 (II)의 2개 이상의 DNA 구성체 세트에 존재한다.
또한, 본 발명에 따른 상기 재조합 효모가 적어도 2개의 상기 식 (II)의 DNA 구성체를 포함하는 경우, 상기 언급된 식 (II)의 상기 DNA 구성체는 동일하거나 또는 상이할 수 있다.
바람직한 실시형태에 따라서, 본 발명에 따른 재조합 효모는 동일하거나 또는 상이한, 적어도 하나, 바람직하게는 적어도 2개의, 식 (IIa)의 DNA 구성체(들)를 포함하고, 여기서 각각의 식 (IIa)는 다음의 식을 갖는다:
(IIa) 5'-[(prom5)y1-유전자 1-term5]x5-[prom1-유전자 1-term1]x1-[prom2-유전자 2-(term2)z1]x2-3' 및 5'-[(prom3)y2-유전자 3-(term3)z2]x3-3'
상기 식에서,
- 유전자 1, 유전자 2 및 유전자 3, "x1", "x2" 및 "x3"은 상기에 정의된 바와 같고;
- "x5"는 0 또는 1과 동등한 정수를 나타내고;
- "y1", "y2", "z1" 및 "z2"는 서로 독립적으로, 0 또는 1과 동등한 정수를 나타내고;
- 상기 재조합 효모가 적어도 2개의 식 (IIa)의 DNA 구성체를 포함하는 경우, "x1", "x2", "x3", "x5", "y1", "y2", "z1" 및 "z2"는 동일하거나 또는 상이할 수 있고;
- "prom 1"은 유전자 1을 코딩하는 서열의 발현을 제어하는 조절 서열이고;
- "prom 2"는 유전자 2를 코딩하는 서열의 발현을 제어하는 조절 서열이고;
- "prom 3"은 유전자 3을 코딩하는 서열의 발현을 제어하는 조절 서열이고;
- "prom5"는 유전자 1의 발현을 제어하는 조절 서열로서, 상기 prom5는 prom1와 동일하거나 또는 상이하고;
- "term1"은 유전자 1을 코딩하는 서열의 발현을 종결시키는 전사 종결인자 서열이고;
- "term2"는 유전자 2를 코딩하는 서열의 발현을 종결시키는 전사 종결인자 서열이고;
- "term3"은 유전자 3을 코딩하는 서열의 발현을 종결시키는 전사 종결인자 서열이고;
- "term5"는 유전자 1의 발현을 종결시키는 전사 종결인자 서열로서, 상기 term5는 term1과 동일하거나 또는 상이하다.
지표 "x5" 및 "y1"에 관하여 보다 명확하게 하기 위해, 관련된 특정 실시형태에서 보다 상세하게 예시하기 위한 예들을 이하에 제시한다:
● "x5"가 1과 같은 정수이고 "y1"이 0과 같은 정수를 나타내는 경우면, 고려되는 유전자 1은 고려된 DNA 구성체가 삽입된 재조합 효모의 유전자의 프로모터 제어 하에 존재함을 의미하거나; 또는
● "x5"가 1과 같은 정수이고 "y1"이 1과 같은 정수를 나타내는 경우면, 고려되는 유전자 1이 프로모터 "prom5"의 제어 하에 존재함을 의미한다. 이러한 점에서, DNA 구성체가 삽입된, 내생성 유전자, 바람직하게는 pdc 유전자의 프로모터 서열을 비롯하여 이의 관련 코딩 영역의 서열이 제거되거나, 또는 적어도 차단된다.
또한, 특히 지표 "y2" 및 "z2"와 관련하여, 관련된 특정 실시형태를 보다 상세하게 예시하는 예를 이하에 제시한다(물론, 예들 이후 본원에서, "x3"은 1 또는 그 이상과 같은 정수를 나타냄):
● "y2"가 0과 같은 정수인 경우이면, 고려된 유전자 3이 고려된 DNA 구성체가 삽입된 재조합 효모의 유전자의 프로모터 제어 하에 존재함을 의미하거나; 또는
● "y2"가 1과 같은 정수인 경우면, 고려된 유전자 3이 프로모터 "prom3"의 제어 하에 존재함을 의미한다. 이러한 점에서, DNA 구성체가 삽입된 내생성 유전자의 프로모터 서열을 비롯하여, 이의 관련 코딩 영역의 서열은 제거되거나, 또는 적어도 차단된다.
● "z2"가 0과 같은 정수인 경우이면, 고려되는 유전자 3은 고려된 DNA 구성체가 삽입된 재조합 효모의 유전자의 전사 종결인자에 연결됨을 의미하거나; 또는
● "z2"가 1과 같은 정수인 경우이면, 고려되는 유전자 3은 전사 종결인자 "term3"에 연결됨을 의미한다. 이러한 점에서, DNA 구성체가 삽입된 내생성 유전자의 전사 종결인자의 서열을 비롯하여, 이의 관련 코딩 영역의 서열은 제거되거나, 또는 적어도 차단된다.
본 명세서에서 기술된 식들에 존재시 "z1"의 경우, "z2"에 관해 상기에 언급된 것들이 준용된다.
다른 바람직한 실시형태에 따라서, 본 발명에 따른 재조합 효모는 적어도 하나의, 바람직하게는 적어도 2개의, 하기 식 (IIb)의 DNA 구성체(들)를 포함할 수 있다:
(IIb) 5'-[(prom5)y1-ALS-term5]x5-[prom1-ALS-term1]x1-[prom2-ALD-(term2)z1]x2-3' 및 5'-[(prom3)y2-NOXE-(term3)z2]x3-3'
상기 식에서,
- ALS, ALD, NOXE, "x1", "x2", "x3","x5", "y1", "y2", "z1" 및 "z2"는 상기에 정의된 바와 같고;
- 상기 재조합 효모가 적어도 2개의 식 (IIb)의 DNA 구성체를 포함하는 경우, "x1", "x2", "x3", "x5", "y1", "y2", "z1" 및 "z2"는 동일하거나 또는 상이할 수 있고;
- "prom 1"은 아세토락테이트 신타제를 코딩하는 서열의 발현을 제어하는 조절 서열이고;
- "prom 2"는 아세토락테이트 디카복실라제를 코딩하는 서열의 발현을 제어하는 조절 서열이고;
- "prom 3"은 NADH 옥시다제를 코딩하는 서열의 발현을 제어하는 조절 서열이고;
- "prom5"는 아세토락테이트 신타제를 코딩하는 서열의 발현을 제어하는 조절 서열로서, 상기 prom5는 prom1과 동일하거나 또는 상이하고;
- "term1"은 아세토락테이트 신타제를 코딩하는 서열의 발현을 종결시키는 전사 종결인자 서열이고;
- "term2"는 아세토락테이트 디카복실라제를 코딩하는 서열의 발현을 종결시키는 전사 종결인자 서열이고;
- "term3"은 NADH 옥시다제를 코딩하는 서열의 발현을 종결시키는 전사 종결인자 서열이고;
- "term5"는 아세토락테이트 신타제를 코딩하는 서열의 발현을 종결시키는 전사 종결인자 서열로서, 상기 term5는 term1과 동일하거나 또는 상이하다.
다른 바람직한 실시형태에 따라서, 본 발명에 따른 재조합 효모는 적어도 2개의 식 (II), (IIa) 또는 (IIb)의 DNA 구성체를 포함할 수 있고, 단, NOXE 핵산의 모든 카피는 적어도 2개의 식 (II), (IIa) 또는 (IIb)의 DNA 구성체의 하나에 위치된다.
다른 바람직한 실시형태에 따라서, 본 발명에 따른 재조합 효모는 적어도 2개, 바람직하게는 정확히 2개의, 하기 식 (IIc) 및 (IId)의 DNA 구성체를 포함할 수 있다:
(IIc) 5'-[(prom5)y1-ALS-term5]x5-[prom1-ALS-term1]x1-[prom2-ALD-(term2) z1]x2-3' 및 5'-[(prom3)y2-NOXE-(term3)z2]x6-3'; 및
(IId)5'-[(prom5)y1-ALS-term5]x5-[prom1-ALS-term1]x1-[prom2-ALD--(term2)z1]x2-3' 및 5'-[(prom3)y2-NOXE-(term3)z2]x7-3';
상기 식에서,
- ALS, ALD, NOXE, "prom1", "prom2", "prom3", "prom5", "term1", "term2", "term3", "term5", "x1", "x2", "x3", "x5", "y1", "y2", "z1" 및 "z2"는 상기에 정의된 바와 같고;
- 식 (IIc) 및 (IId) 각각에 대한 "x1" 내지 "x3", "x5", "y1", "y2", "z1" 및 "z2"는 동일하거나 또는 상이하고;
- "x6" 및 "x7"은 0 내지 50 범위, 바람직하게는 0 내지 20 범위, 바람직하게는 0 내지 12 범위, 보다 구체적으로 2 내지 5 범위, 바람직하게는 3 내지 4 범위의 정수이고, 보다 바람직하게는 3과 같은 정수이며, 단 "x6" 및 "x7" 중 하나는 0을 나타낸다.
유리하게, 식 (I) 내지 (III)의 DNA 구성체의 5'의 제1 유전자 1은 바람직하게 ALS를 코딩하는 핵산으로 표시되는 유전자이고, 보다 구체적으로 상기 제1 유전자 1은 고려되는 DNA 구성체가 삽입되는 재조합 효모의 유전자 프로모터의 제어 하에 존재한다.
보다 구체적으로, 식 (IIa), (IIb), (IIc) 또는 (IId)의 DNA 구성체의 경우, "x5"는 유리하게 1과 같은 정수를 의미하고 "y1"은 0과 같은 정수를 나타냄을 의미한다.
본 발명에 따른 상기 언급된 DNA 구성체 및 DNA 하위 구성체의 복잡성 면에서, 다음을 강조한다:
● 본 발명의 하나의 DNA 구성체와 관련하여, "x1", "x2" 및/또는 "x3"이 2보다 크거나 또는 그와 같은 정수를 나타내는 경우면,
○ 유전자 1, 유전자 2 및/또는 유전자 3 중 관련 핵산의 각 카피는 동일하거나 또는 상이하고/하거나,
○ 유전자 1, 유전자 2 및/또는 유전자 3 중 관련 핵산의 각 카피에 대한 프로모터 및/또는 종결인자는 동일하거나 또는 상이하고;
● 재조합 효모가 적어도 2개의 DNA 구성체를 포함하는 경우면, 상기 적어도 2개의 DNA 구성체는 하기와 관련하여 동일하거나 또는 상이할 수 있다:
(i) DNA 구성체가 식 (I) 내지 (III)을 포함하는 군에서 선택된 식을 특징으로 하는 그들의 일반식;
(ii) "x1" 내지 "x3" 및 "x5" 내지 "x7", "y1", "y2", "z1" 및/또는 "z2"의 값;
(iii) 동일한 유전자에 관한 프로모터의 성질;
(iv) 동일한 유전자에 관한 종결인자의 성질; 및/또는
(v) 특히 이하 표 1에 제시된 바와 같이, ALS, ALD 및 NOXE가 상이한 속에 속하는 유기체에서 유래될 수 있는 동일 유전자 그 자체의 성질.
상기 정의된 바와 같은 DNA 구성체를 인식하기 위해 제공되는 방법은 당업자의 일반 지식에 속한다.
이러한 점에서 당업자는 유리하게 실제로 오직 소수의 변형만을 가하여, 문헌 [Shao et al. (Nucleic Acids Research, 2009, Vol. 37, No. 2: e16)] 및 [Shao et al. (Methods in Enzymology, 2012 Elsevier Inc., Vol. 517: 203]에 기술된 방법을 참조할 수 있고, 이하 본원의 예들에서 보다 구체적으로 설명한다.
감소된 피루베이트 디카복실라제 활성
효모의 내생성 피루베이트 디카복실라제 활성은 피루베이트를 아세트알데하이드로 전환시키고, 이어서 에탄올로 전환시키거나 아세테이트를 통해 아세틸-CoA로 전환시킨다.
이전에 언급한 바와 같이, 본 발명은 그의 게놈에 특별한 DNA 구성체가 삽입된, 감소된 피루베이트 디카복실라제 활성을 갖는 재조합 효모에 관한 것이다.
특정 실시형태에 따라서, 재조합 효모는 1 이상의 내생성 피루베이트 디카복실라제-코딩 유전자(들)가 스위치 오프(switch off)될 수 있다는 점을 특징으로 한다.
본 발명에 따른 재조합 효모의 피루베이트 디카복실라제 활성은 당업자가 알고있는 모든 방법에 의해 감소될 수 있다.
이러한 점에서, 본 발명에 따른 재조합 효모의 피루베이트 디카복실라제 활성은 예를 들어 (i) 당업자에게 공지된 방법에 의해서 적어도 하나의 외생성 DNA 구성체를 피루베이트 디카복실라제를 코딩하는 상기 적어도 하나의 유전자 내에 삽입시켜 피루베이트 디카복실라제를 코딩하는 적어도 하나의 유전자의 파괴, (ii) 피루베이트 디카복실라제 전사를 감소시키는 조절 영역의 돌연변이, (iii) 특히 AUG를 GUG로 치환시키는, 출발 코돈의 돌연변이, 및 (iv) 활성을 변경시키는 코딩 서열의 돌연변이, (v) 단백질 안정성을 변경시키는 코딩 서열의 돌연변이, 삽입 또는 결실, (vi) 피루베이트 디카복실라제 mRNA 반감기를 변경시키는 돌연변이에 의해 감소될 수 있다.
제1 선택안 (i)과 관련하여, 고려되는 pdc 유전자를 파괴하도록 제공되는 DNA 구성체는 이전에 기술된 바와 같은 본 발명에 따른 DNA 구성체와 상이한 외생성 DNA 구성체, 본 발명에 따른 DNA 구성체, 또는 이의 조합일 수 있다.
또한, 상기에 언급한 바와 같이, 식 (I) 및 (II)의 본 발명에 따른 DNA 구성체는 각각 2개 이상의 DNA 하위 구성체로 구성된다.
따라서, 인식되는 특정 변이에 따라서, 본 발명에 따른 재조합 효모의 피루베이트 디카복실라제 활성은, 본 발명에 따른 적어도 하나의 식 (I) 및 (II)의 DNA 구성체의 오직 적어도 하나의 DNA 하위 구성체를 상기 유전자 내에 삽입시켜 피루베이트 디카복실라제를 코딩하는 적어도 하나의 유전자를 파괴시켜 감소시킬 수 있다.
바람직하게는, 내생성 피루베이트 디카복실라제 활성은 적어도 하나의 pdc 유전자의 파괴에 의해 감소될 수 있다.
실제로, 효모는 피루베이트 디카복실라제를 코딩하는 하나 이상의 유전자를 가질 수 있다. 예를 들어, 클루이베로마이세스 락티스(Kluyveromyces lactis)에서는 피루베이트 디카복실라제를 코딩하는 하나의 유전자가 존재하지만, 사카로마이세스 세레비지아에는 PDC1, PCD5, 및 PDC6 유전자에 의해 코딩되는 피루베이트 디카복실라제의 3개 이소자임을 비롯하여, 피루베이트 디카복실라제 조절 유전자 PDC2가 존재한다.
바람직하게 본원에서 이하에 정의된 바와 같이, 본 발명에 따른 재조합 효모는 재조합 사카로마이세스 속, 바람직하게는 재조합 사카로마이세스 세레비지아 종일 수 있다.
이러한 점에서, 제1 변이에 따라서, 피루베이트 디카복실라제 활성은 적어도 하나의 pdc 유전자, 바람직하게는 적어도 2개의 pdc 유전자, 보다 구체적으로는 오직 2개의 pdc 유전자의 파괴에 의해 감소될 수 있다.
또한, 파괴된 pdc 유전자(들)는 pdc1, pdc5, pdc6 및 이의 혼합물, 및 바람직하게는 pdc1 및 pdc6으로 이루어진 군에서 선택될 수 있다.
바람직하게는, 재조합 효모가 사카로마이세스 속에 속하는 경우면, 피루베이트 디카복실라제 활성은 바람직하게는 pdc1, pdc5, pdc6 및 이의 조합으로 이루어진 군, 보다 구체적으로는 pdc1 및 pdc6으로 이루어진 군에서 선택된, 적어도 2개의 pdc 유전자의 파괴에 의해 감소될 수 있다.
또한, 사카로마이세스 속, 바람직하게는 사카로마이세스 세레비지아 종의 3개 pdc 유전자의 차단은 균주 성장을 극적으로 감소시켜, 임의의 산업적 용도와 호환될 수 없게 만든다.
특정 변이에 따라서, 사카로마이세스 속, 바람직하게는 사카로마이세스 세레비지아 종에서, 오직 pdc1 및 pdc6 유전자를 파괴하고 pdc5의 발현을 감쇠시킨다.
특정한 유전자의 발현을 감쇠시키기 위해 제공되는 방법은 당업자의 일반적 지식에 속한다.
이러한 면에서, 당업자는 당분야에 공지된 임의 방법을 유리하게 참조할 수 있다.
유리하게, pdc 5의 발현을 감쇠시키기 위해, 이의 전사를 약한 프로모터, 예컨대 특히 RPLA1, URA3, MET25, HIS3, TRP1, GAP1, NUP57 또는 TFC1, 및 바람직하게는 RPLA1(= 서열번호 29)의 제어 하에 위치시킬 수 있다.
피루베이트 디카복실라제의 활성도를 측정하기 위해 제공되는 방법은 당업자의 일반 지식에 속한다.
이러한 점에서, 당업자는 문헌 [Wang et al. (Biochemistry, 2001, 40: 1755-1763)]에 기술된 방법을 유리하게 참조할 수 있다.
아세토락테이트 신타제
아세토락테이트 신타제(ALS) 효소(아세토하이드록시 산 신타제 (AHAS), α-아세토하이드록시 산 신써타제, α-아세토하이드록시 산 신타제, α-아세토락테이트 신타제, α-아세토락테이트 신써타제, 아세토하이드록시 산 신써타제, 아세토하이드록시 산 신타제, 아세토락테이트 피루베이트-리아제(카르복실화), 아세토락트산 신써타제라고도 알려짐)는 분지쇄 아미노산(발린, 류신, 및 이소류신) 합성의 제1 단계를 촉매하는 단백질이다.
ALS는 2개 피루베이트 분자를 아세토락테이트 분자 및 이산화탄소로 전환시키는데 관여되는 화학 반응에 특별히 관여하는 효소이다. 이 반응은 2개 피루베이트 분자를 연결하기 위해 티아민 파이로포스페이트를 사용한다.
아세토락테이트 신타제의 활성도를 측정하기 위해 제공되는 방법은 당업자의 일반적인 지식에 속한다.
이러한 점에서, 당업자는 문헌 [Poulsen et al. (Eur. J. Biochem. 185, 1989: 433-439)]에 기술된 방법을 유리하게 참조할 수 있다.
본 발명에서 바람직한 아세토락테이트 신타제는 EC 번호 2.2.1.6으로 알려져 있다.
바람직한 실시형태에 따라서, 아세토락테이트 신타제 또는 ALS를 코딩하는 핵산(들)은 바람직하게 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis), 니코티아나 타바컴(Nicotiana tabacum), 파에니바실러스 폴리믹사(Paenibacillus polymyxa), 및 이의 혼합물, 바람직하게는 니코티아나 타바컴 및 파에니바실러스 폴리믹사를 포함하는 군에서 선택된 핵산(들)일 수 있다.
다른 바람직한 실시형태에 따라서, 아세토락테이트 신타제 또는 ALS를 코딩하는 핵산은 서열번호 1, 3 및 5의 핵산 서열과 적어도 65%, 바람직하게는 적어도 80%의 핵산 동일성을 갖는 서열로 이루어진 군에서 선택된 핵산(들)일 수 있다.
본원에 기술된 바와 같이, 기준 핵산 서열과 적어도 65% 뉴클레오타이드 동일성을 갖는 핵산 서열은 상기 기준 핵산 서열과 적어도 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 및 99%의 뉴클레오타이드 동일성을 갖는 핵산 서열을 포함한다.
본원에서 기술한 바와 같이, 기준 핵산 서열과 적어도 80% 뉴클레오타이드 동일성을 갖는 핵산 서열은 상기 기준 핵산 서열과 적어도 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 및 99%의 뉴클레오타이드 동일성을 갖는 핵산 서열을 포함한다.
다른 특정 실시형태에 따라서, 아세토락테이트 신타제를 코딩하는 핵산(들)은 서열번호 2, 5 및 6의 서열과 적어도 65%, 바람직하게는 적어도 80%의 동일성을 갖는 서열로 이루어진 군에서 선택된 아미노산 서열을 코딩하는 핵산(들)일 수 있다.
본원에 기술된 바와 같이, 기준 아미노산 서열과 적어도 65% 아미노산 동일성을 갖는 아미노산 서열은 상기 기준 아미노산 서열과 적어도 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 및 99%의 아미노산 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다.
본원에 기술된 바와 같이, 기준 아미노산 서열과 적어도 80% 아미노산 동일성을 갖는 아미노산 서열은 상기 기준 아미노산 서열과 적어도 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 및 99%의 아미노산 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다.
상기에 언급한 바와 같이, 본 발명의 ALS의 발현 수준은 ALS를 코딩하는 핵산의 각각 5' 및 3' 위치에 존재하는, 본원에서 이하에 상세하게 정의된 바와 같은, 적어도 하나의 프로모터 및 적어도 하나의 종결인자에 의해 조절된다.
아세토락테이트 디카복실라제
아세토락테이트 디카복실라제(ALD) 효소(α-아세토락테이트 디카복실라제, (S)-2-하이드록시-2-메틸-3-옥소부타노에이트 카르복시-리아제, (S)-2-하이드록시-2-메틸-3-옥소부타노에이트 카르복시-리아제[(R)-2-아세토인-형성] 또는 (S)-2-하이드록시-2-메틸-3-옥소부타노에이트 카르복시-리아제[(3R)-3-하이드록시부탄-2-온-형성]라고도 알려짐)는 탄소-탄소 결합을 절단하고 부타노에이트 대사 및 C5-분지된 이염기 산 대사에 관여하는, 리아제, 특히 카르복시-리아제 패밀리에 속한다.
ALD는 α-아세토락테이트 분자를 아세토인 분자 및 이산화탄소로 전환시키는데 관여하는 화학 반응에 특별히 관여하는 효소이다.
아세토락테이트 디카복실라제의 활성 수준을 측정하기 위해 제공되는 방법은 당업자의 일반 지식에 속한다.
이러한 점에서, 당업자는 문헌 [Dulieu et al. (Enzyme and Microbial Technology 25, 1999: 537-542)]에 기술된 방법을 유리하게 참조할 수 있다.
본 발명에서 바람직한 아세토락테이트 디카복실라제는 EC 번호 4.1.1.5로 알려져 있다.
바람직한 실시형태에 따라서, 아세토락테이트 디카복실라제 또는 ALD를 코딩하는 핵산(들)은 브레비바실러스 브레비스(Brevibacillus brevis), 엔테로박터 에로게네스(Enterobacter aerogenes), 락토코커스 락티스(Lactococcus lactis), 및 이의 혼합물, 바람직하게는 브레비바실러스 브레비스 및 엔테로박터 에로게네스를 포함하는 군에서 선택된 핵산(들)일 수 있다.
또 다른 실시형태에 따라서, 아세토락테이트 디카복실라제 또는 ALD를 코딩하는 핵산(들)은 서열번호 7, 9 및 11의 핵산 서열과 적어도 36%, 바람직하게는 적어도 80%의 핵산 동일성을 갖는 서열로 이루어진 군에서 선택된 핵산(들)일 수 있다.
본원에 기술한 바와 같이, 기준 핵산 서열과 적어도 36% 뉴클레오타이드 동일성을 갖는 핵산 서열은 상기 기준 핵산 서열과 적어도 37%, 38%, 39%, 40%, 41%, 42%, 43%, 44%, 45%, 46%, 47%, 48%, 49%, 50%, 51%, 52%, 53%, 54%, 55%, 56%, 57%, 58%, 59%, 60%, 61%, 62%, 63%, 64%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 및 99%의 뉴클레오타이드 동일성을 갖는 핵산 서열을 포함한다.
다른 특정 실시형태에 따라서, 아세토락테이트 디카복실라제를 코딩하는 핵산(들)은 서열번호 8, 10 및 12의 서열과 적어도 36%, 바람직하게는 적어도 80%의 동일성을 갖는 서열로 이루어진 군에서 선택된 아미노산 서열을 코딩하는 핵산(들)일 수 있다.
본원에 기술한 바와 같이, 기준 아미노산 서열과 적어도 36% 아미노산 동일성을 갖는 아미노산 서열은 상기 기준 아미노산 서열과 적어도 37%, 38%, 39%, 40%, 41%, 42%, 43%, 44%, 45%, 46%, 47%, 48%, 49%, 50%, 51%, 52%, 53%, 54%, 55%, 56%, 57%, 58%, 59%, 60%, 61%, 62%, 63%, 64%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 및 99%의 아미노산 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다.
상기에 언급한 바와 같이, 본 발명에서 ALD의 발현 수준은 ALD를 코딩하는 핵산 서열의 5' 및 3' 위치에 각각 존재하는, 이하 본원에서 상세하게 정의하는 바와 같은, 적어도 하나의 프로모터 및 적어도 하나의 종결인자에 의해 조절된다.
NADH 옥시다제
적어도 하나의 pdc 유전자의 활성의 불활성화 또는 감소는 효모에서 에탄올 발효 경로를 불활성화시키거나 또는 감소시킨다. 결과적으로, 이는 ALS 및 ALD의 발현에 의해 경감되지 않는 불균형 산화환원 상태를 유발시킨다. 또한, 포도당에서 2개 피루베이트로의 경로는 2 NADH 당량을 생성시키는 한편, 2 피루베이트에서 아세토인으로의 변형은 어떠한 NADH도 NAD+로 재순환시키지 않는다(도 1 참조).
본 발명자는 특별한 발현 수준의, 박테리아 수분 형성 NADH 옥시다제(본원에서는 또한 NOXE 옥시다제 또는 NOXE라고 함) 효소가 이 균주의 안정성을 향상시킬 수 있는 산화환원 상태를 평형화시킬 뿐만 아니라 이 균주의 성장을 향상시키고 아세토인의 수율을 더욱 개선시킬 수 있음을 발견하였다.
박테리아 수분 형성 NADH 옥시다제는 하기 반응을 촉매하는 효소이다:
2 NADH + ½ O2 → 2NAD+ + H20
본 발명에서 바람직한 수분 형성 NADH 옥시다제는 EC 번호 1.6.3.1 및 1.6.99.3(또한 EC 1.6.3.1의 경우 NAD(P)H 옥시다제 (H(2)O(2)-형성), 이중 옥시다제, NAD(P)H 옥시다제, ThOX, THOX2, 갑상선 NADPH 옥시다제, 갑상선 옥시다제, 갑상선 옥시다제 2로서 알려져 있고, EC 1.6.99.3의 경우 NADH 디하이드로게나제, 베타-NADH 디하이드로게나제 디뉴클레오타이드, 사이토크롬 c 리덕타제, 디아포라제, 디하이드로코디하이드로게나제 I 디하이드로게나제, 디하이드로니코틴아미드 아데닌 디뉴클레오타이드 디하이드로게나제, 디포스포피리나제, DPNH 디아포라제, NADH 디아포라제, NADH 하이드로게나제, NADH 옥시도리덕타제, NADH-메나디온 옥시도리덕타제, NADH:사이토크롬 c 옥시도리덕타제, 환원된 디포스포피리딘 뉴클레오타이드 디아포라제, 1형 디하이드로게나제, I형 디하이드로게나제로 알려짐)라고 알려져 있다.
본 발명에서 고려할 수 있는 수분 형성 NADH 옥시다제는 특히 WO 2006/134277에 기술되어 있다.
본 발명에 따른 NADH 옥시다제의 활성 수준을 측정하기 위해 제공되는 방법은 당업자의 일반 지식에 속한다.
이러한 점에서, 당업자는 문헌 [Lopez DE FELIPE et al. (International Daily Journal, 2001, vol. 11: 37-44 (ISSN 0958-6946))]에 기술된 방법을 유리하게 참조할 수 있다.
바람직한 실시형태에 따라서, NADH 옥시다제 또는 NOXE를 코딩하는 핵산(들)은 스트렙토코커스 뉴모니아(Streptococcus pneumoniae), 락토코커스 락티스(Lactococcus lactis), 엔테로코커스 패칼리스(Enterococcus faecalis), 락토바실러스 브레비스(Lactobacillus brevis) 및 이의 혼합물, 바람직하게는 스트렙토코커스 뉴모니아를 포함하는 군에서 선택된 핵산(들)일 수 있다.
다른 바람직한 실시형태에 따라서, NADH 옥시다제 또는 NOXE를 코딩하는 핵산(들)은 서열번호 13, 15, 17 및 19의 핵산 서열과 적어도 78%, 바람직하게는 적어도 80%의 핵산 동일성을 갖는 서열로 이루어진 군에서 선택된 핵산(들)일 수 있다.
본원에 기술된 바와 같이, 기준 핵산과 적어도 78%의 뉴클레오타이드 동일성을 갖는 핵산 서열은 상기 기준 핵산 서열과 적어도 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 및 99%의 뉴클레오타이드 동일성을 갖는 핵산 서열을 포함한다.
다른 특정 실시형태에 따라서, NADH 옥시다제를 코딩하는 핵산(들)은 서열번호 14, 16, 18 및 20의 서열과 적어도 78%, 바람직하게는 적어도 80%의 동일성을 갖는 서열로 이루어진 군에서 선택된 아미노산 서열을 코딩하는 핵산(들)일 수 있다.
본원에 기술된 바와 같이, 기준 아미노산 서열과 적어도 78%의 아미노산 동일성을 갖는 아미노산 서열은 상기 기준 아미노산 서열과 적어도 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 및 99%의 아미노산 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다.
상기에 언급한 바와 같이, 본 발명에서 NADH 옥시다제의 발현 수준은 NADH 옥시다제를 코딩하는 핵산 서열의 5'- 및 -3' 위치에 각각 존재하는, 이하 본원에서 더욱 상세하게 정의하는 바와 같은, 적어도 하나의 프로모터 및 적어도 하나의 종결인자에 의해 조절된다.
또한, 상기에 언급한 유리한 기술적 효과는 상기 NADH 옥시다제의 발현 수준과 연결된다. 게다가, 본원의 이하 예로부터 확인할 수 있는 바와 같이, 단지 NADH 옥시다제의 존재가 중요할 뿐만 아니라 NADH 옥시다제 발현 수준도 아세토인 생산에 매우 중요하다.
상기에 언급한 바와 같이, 본 발명에 따른 재조합 효모는 감소된 피루베이트 디카복실라제 활성을 가지며, 그의 게놈에 특히, NADH 옥시다제 또는 NOXE를 코딩하는 핵산의 1 이상의 카피가 삽입되었다.
이러한 점에서, 본 발명에 따른 재조합 효모는 특히 NADH 옥시다제를 코딩하는 핵산의 1 내지 20 카피를 포함할 수 있다.
바람직하게는, 본 발명에 따른 재조합 효모는 NADH 옥시다제를 코딩하는 핵산을 1 내지 12, 구체적으로 2 내지 5, 바람직하게는 3 내지 4 카피, 보다 바람직하게는 3 카피를 포함할 수 있다.
특정 실시형태에 따라서, 적어도 NOXE 유전자(들)를 포함하는 적어도 식 (I) 내지 (III)의 DNA 구성체는 상기 재조합 효모의 내생성 URA3 유전자에 삽입될 수 있다.
상기 관점에서, 아세토락테이트 신타제, 아세토락테이트 디카복실라제 및 NADH 옥시다제를 코딩하는 각각의 핵산은 특히 이하 본원에 정의된 바와 같은, 원치않는 조절이 방지되도록 하는 프로모터 및 종결인자의 제어 하에 존재한다.
프로모터
명백한 이유로, 아세토락테이트 신타제, 아세토락테이트 디카복실라제 및 NADH 옥시다제를 코딩하는 각각의 핵산은 동일하거나 또는 상이한 프로모터의 제어 하에 존재한다.
소정 유전자의 항상성 과발현을 허용하는, 동일하거나 또는 상이한 상기 프로모터는 문헌에서 확인할 수 있다(velculescu et al. (1997) Cell 88, 243-251).
본 발명에서 보다 특히 관심있는 프로모터는
● 알콜 디하이드로게나제를 코딩하는 유전자(ADH1 유전자 = 서열번호 24) 유래의 pADH1,
● 글리세랄데하이드-3-포스페이트 디하이드로게나제를 코딩하는 유전자(TDH3 유전자 = 서열번호 31) 유래의 pTDH3,
● 번역 연장 인자 EF-1 알파를 코딩하는 유전자(TEF2 유전자 = 서열번호 22) 유래의 pTEF2.Kl,
● 글리세레이트 포스포뮤타제를 코딩하는 유전자(GPM1 유전자 = 서열번호 25) 유래의 pGPM1,
● 피루베이트 디카복실라제를 코딩하는 유전자(PDC1 유전자 = 서열번호 27) 유래의 pPDC1,
● 에놀라제 II를 코딩하는 유전자(ENO2 유전자 = 서열번호 21) 유래의 pENO2,
● 번역 연장 인자 eEF1B의 감마 서브유닛을 코딩하는 유전자(TEF3 유전자 = 서열번호 23) 유래의 pTEF3,
● 프룩토스 1,6-비스포스페이트 알돌라제 II를 코딩하는 유전자(FBA1 유전자 = 서열번호 26) 유래의 pFBA1,
● 3-포스포글리세레이트 키나제를 코딩하는 유전자(PGK1 유전자 = 서열번호 28) 유래의 pPGK1,
● 피루베이트 키나제를 코딩하는 유전자(PYK1 유전자 = 서열번호 41) 유래의 pPYK1,
● 트리오스 포스페이트 이소머라제를 코딩하는 유전자(TPI1 유전자 = 서열번호 42) 유래의 pTPI1, 또는
● 번역 연장 인자 EF-1 알파를 코딩하는 유전자(TEF1 유전자 = 서열번호 30) 유래의 pTEF1
을 포함하는 군에서 선택될 수 있다.
또한, 다른 밀접하게 관련된 효모 유래의 상동성 프로모터가 사카로마이세스 속의 다른 효모, 또는 다른 속 예컨대 캔디다, 데바리오마이세스(Debaryomyces), 피키아(Pichia) 또는 클루베로마이세스의 효모 유래의 프로모터로서 사용될 수 있다.
문헌 [Blazeck & Alper (2013) Biotechnol. J. 846-58]에 기술된 바와 같은 합성 프로모터가 또한 사용될 수 있다.
보다 구체적으로, 동일하거나 또는 상이한, 상기 프로모터는 바람직하게는 서열번호 21 내지 31, 41 및 42의 핵산 서열과 적어도 80% 핵산 동일성을 갖는 서열로 이루어진 군에서 선택된 핵산의 서열을 특징으로 할 수 있다.
특정 실시형태에 따라서, 아세토락테이트 신타제, 아세토락테이트 디카복실라제 및 NADH 옥시다제를 코딩하는 각각의 핵산은 동일하거나 또는 상이한 전사 종결인자의 제어 하에 존재하고, 상기 전사 종결인자는 서열번호 32 내지 40의 핵산 서열과 적어도 80% 핵산 동일성을 갖는 서열로 이루어진 군에서 선택된 핵산 서열을 특징으로 한다.
종결인자
명백한 이유로, 아세토락테이트 신타제, 아세토락테이트 디카복실라제 및 NADH 옥시다제를 코딩하는 핵산 각각은 동일하거나 또는 상이한 전사 종결인자(또한 본원에서 "종결인자"라고 할 수 있음)에 연결된다.
동일하거나 또는 상이한, 상기 전사 종결인자는 문헌 [Yamanishi et al., (2013) ACS synthetic biology 2, 337-347]에서 확인할 수 있다.
본 발명에서 보다 구체적으로 관심있는 종결인자는
● 트리오스 포스페이트 이소머라제를 코딩하는 유전자(TPI1 유전자 = 서열번호 36) 유래의 tTPI1,
● O-아세틸 호모세린-O-아세틸 세린 설프하이드릴라제를 코딩하는 유전자(Met25 유전자 = 서열번호 37) 유래의 tMET25,
● 알콜 디하이드로게나제를 코딩하는 유전자(ADH1 유전자 = 서열번호 35) 유래의 tADH1,
● 에놀라제 II를 코딩하는 유전자(ENO2 유전자 = 서열번호 38) 유래의 tENO2,
● 글리세랄데하이드-3-포스페이트 디하이드로게나제, 이소자임 2를 코딩하는 유전자(TDH2 유전자 = 서열번호 32) 유래의 tTDH2,
● 3-포스포글리세레이트 키나제를 코딩하는 유전자(PGK1 유전자 = 서열번호 40) 유래의 tPGK1,
● tCYC1(= 서열번호 33),
● tMET3(= 서열번호 39), 및
● tTDH3(= 서열번호 34), 및
● tDIT1(= 서열번호 43)
을 포함하는 군에서 선택될 수 있다.
보다 구체적으로, 동일하거나 또는 상이한 상기 종결인자는 서열번호 32 내지 40 및 43의 서열과 적어도 80% 동일성을 갖는 서열로 이루어진 군에서 선택된 핵산 서열을 특징으로 한다.
재조합 효모
대체로, 효모는 박테리아와 비교하여 빠르게 성장할 수 있고 더 높은 밀도로 배양될 수 있으며, 산업적 상황에서 무균 환경을 필요로 하지 않는다. 또한, 효모 세포는 박테리아 세포와 비교하여 배양 배지로부터 더욱 쉽게 분리될 수 있어, 생성물 추출 및 정제를 위한 과정이 상당히 단순화된다.
우선적으로, 본 발명의 효모는 사카로마이세스, 캔디다, 아시비야(Ashbya), 덱케라(Dekkera), 피키아(한세눌라(Hansenula)), 데바리오마이세스(Debaryomyces), 클라비스포라(Clavispora), 로데로마이세스(Lodderomyces), 야로위아(Yarrowia), 지고사카로마이세스(Zigosaccharomyces), 스키조사카로마이세스(Schizosaccharomyces), 토룰라스포라(Torulaspora), 클루이베로마이세스(Kluyveromyces), 브레타노마이세스(Brettanomycces), 크립토코커스(Cryptococcus) 또는 말라세지아(Malassezia) 속 중에서 선택될 수 있다.
보다 바람직하게, 효모는 사카로마이세스, 덱케라, 스키조사카로마이세스, 클루이베로마이세스, 토룰라스포라, 지고사카로마이세스, 또는 브레타노마이세스 속의 크랩트리 양성 효모일 수 있다.
보다 바람직하게, 효모는 사카로마이세스 세레비지아(Saccharomyces cerevisiae), 사카로마이세스 불라르디(Saccharomyces boulardii), 사카로마이세스 두글라시(Saccharomyces douglasii), 사카로마이세스 바야너스(Saccharomyces bayanus) 또는 지고사카로마이세스 바일리(Zigosaccharomyces bailii), 스키조사카로마이세스 폼베(Schizosaccharomyces pombe), 덱케라 브루셀렌시스(Dekkera brucelensis), 덱케라 인터메디아(Dekkera intermedia), 브레타노마이세스 커스테르시(Brettanomycces custersii), 브레타노마이세스 인테르메디우스(Brettanomycces intermedius), 클루이베로마이세스 써모톨러렌스(Kluyveromyces themotolerens), 토룰라스포라 글로보사(Torulaspora globosa), 토룰라스포라 글라브라타(Torulaspora glabrata) 종 유래일 수 있다.
보다 바람직하게, 재조합 효모는 사카로마이세스 속에 속하고, 바람직하게는 사카로마이세스 세레비지아 종에 속한다.
상기에 언급한 바와 같이, 본 발명에 따른 재조합 효모는 식 (I) 내지 (III)을 포함하는 군에서 선택된 적어도 하나의 DNA 구성체(들), 바람직하게는 ALS 및/또는 ALD를 코딩하는 적어도 하나의 핵산(들)만을 포함하는 상기 DNA 구성체(들) 중 적어도 하나의 삽입에 의해 감소된 피루베이트 디카복실라제 활성을 갖는다.
바람직한 실시형태에 따라서, 재조합 효모는 재조합 사카로마이세스 세레비지아일 수 있고 피루베이트 디카복실라제 활성은 오직 2개의 pdc 유전자의 파괴에 의해 감소된다. 보다 바람직하게는, 파괴된 pdc 유전자(들)는 pdc1, pdc5, pdc6 및 이의 혼합물, 바람직하게는 pdc1 및 pdc6으로 이루어진 군에서 선택될 수 있다.
유전자, 보다 구체적으로 피루베이트 디카복실라제 유전자 내 특별한 DNA 구성체를 삽입하기 위해 제공되는 방법은 당업자의 일반 지식에 속한다. 관련 방법은 이하 본원의 예에서 보다 상세하게 설명한다.
가장 바람직한 실시형태
유리하게, 본 발명에서 제공하는 효소를 코딩하는 핵산은 유리하게 ALS.Bs, ALS.Pp, ALD.Ll, ALD.Ea, NOXE.spn, NOXE.Ll 및 이의 혼합물 중에서 선택된다.
바람직한 실시형태에 따라서, 본 발명에 따른 재조합 효모는 사카로마이세스 속, 구체적으로 사카로마이세스 세레비지아 종에 속하는 것을 특징으로 할 수 있고, 이때 내생성 피루베이트 디카복실라제 활성은 적어도 2개의 pcd 유전자의 파괴, 구체적으로 pdc1 및 pdc6 유전자의 파괴에 의해 감소되고,
- pdc 유전자들 중 하나, 바람직하게 pdc 1 유전자는 하기 식 (IIe)의 DNA 구성체의 삽입에 의해 파괴된다:
5'-[(prom5)y1-ALS.Bs-term5]x5-[prom1-ALS.Bs-term1]x1-[prom2-ALD.Ll-(term2)z1]x2-3' (IIe);
- 상기 언급된 파괴된 pdc 유전자, 바람직하게는 pdc 6 유전자와 상이한, 적어도 다른 pdc 유전자는 하기 식 (IIf')의 DNA 구성체의 삽입에 의해 파괴되고, 하기 식 (IIf'')의 DNA 구성체가 URA3 유전자에 삽입된다:
5'-[(prom5)y1-ALS.Pp-term5]x5-[prom1-ALS.Pp-term1]x1-[prom2-ALD.Ea-(term2)z1]x2-3' (IIf'),
5'-[(prom3)y2-NOXE.Ll-(term3)z2]x3-3' (IIf''),
상기 식에서,
- prom1, prom2, prom3, prom5, term1, term2, term3, term5, "y1", "y2", "z1" 및 "z2"는 상기에 정의된 바와 같고, ALS.Bs, ALS.Pp, ALD.Ll, ALD.Ea 및 NOXE.Ll은 이하 표 1에 정의된 바와 같고,
- "x1", "x2" 및 "x3" 각각은 서로 독립적으로, 0 내지 50 범위, 바람직하게는 0 내지 20 범위, 바람직하게는 0 내지 10 범위, 더욱 구체적으로는 0 내지 3 범위의 정수를 나타내고, 구체적으로는 1과 같은 정수를 나타내며;
- "x3"은 0 내지 50 범위, 바람직하게는 0 내지 20 범위, 바람직하게는 0 내지 12 범위, 보다 구체적으로 2 내지 5 범위, 바람직하게는 3 내지 4 범위의 정수를 나타내고, 여전히 바람직하게는 3과 같은 정수를 나타내고,
단, 상기 재조합 효모는 각각의 ALS, ALD 및 NOXE를 코딩하는 적어도 하나의 핵산을 포함하고, 보다 구체적으로, 단, 식 (IIe) 및 (IIf')의 각 DNA 구성체는 각각의 ALS 및 ALD를 코딩하는 적어도 하나의 핵산을 각각 포함한다.
상기 관점에서, 본원에서 암시적으로 개시하였지만, 각각의 식 (IIe) 및 (IIf') 간에,
- "x1" 내지 "x3", "x5", "y1", "y2", "z1" 및 "z2"; 및/또는
- 고려되는 유전자의 각 핵산 카피에 대한 프로모터 및/또는 종결인자
는 동일하거나 또는 상이할 수 있음을 명시한다.
특히 바람직한 실시형태에 따라서, 본 발명에 따른 재조합 효모는 사카로마이세스 속, 구체적으로 사카로마이세스 세레비지아 종에 속하는 것을 특징으로 할 수 있고, 여기서 내생성 피루베이트 디카복실라제 활성은 적어도 2개의 pdc 유전자의 파괴, 구체적으로 pdc 1 및 pdc 6 유전자의 파괴에 의해 감소되고, 여기서
- pdc 유전자들 중 하나, 바람직하게는 pdc 1 유전자는 하기 식 (IIg)의 DNA 구성체의 삽입에 의해 파괴된다:
5'-[ALS.Bs-tTDH2]1-[pENO2-ALD.Ll-tCYC1]1-3' (IIg);
- 상기에 언급된 파괴된 pdc 유전자, 바람직하게는 pdc 6 유전자와 상이한, 적어도 다른 pdc 유전자는 하기 식 (IIh')의 DNA 구성체의 삽입에 의해 파괴되고, 하기 식 (IIh')의 DNA 구성체가 URA3 유전자에 삽입된다:
5'-[pADH1-ALS.Pp-tDPI1]1-[pTDH3-ALD.Ea-tMET25]1-3'a (IIh')
5'-[pENO2-NOXE.Ll-tPGK1]12-3' (IIh'')
상기 식에서,
- 식 (IIg)의 DNA 구성체의 "ALS.Bs" 유전자는 상기 식 (IIg)의 DNA 구성체가 삽입된 pdc 유전자의 프로모터 제어 하에 존재하고,
- pENO2, pADH1, pTDH3, tTDH2, tCYC1, tDPI1, tMET25 및 tPGK1은 본 명세서에서 정의된 바와 같고, 보다 구체적으로는 이하 서열 목록에 정의된 바와 같으며,
- ALS.Bs, ALS.Pp, ALD.Ll, ALD.Ea 및 NOXE.Ll은 이하 표 1에 정의된 바와 같고, 보다 구체적으로는 이하 서열 목록에서 정의된 바와 같다.
특정 실시형태에 따라서, 본 발명에 따른 재조합 효모는 아세토인 생산을 최적화하기 위해 더욱 개질될 수 있다.
당의 대체 공급원의 사용:
당의 대체 공급원 예컨대 전분의 직접 사용은 효모에서 외생성 α-아밀라제 및 글루코아밀라제의 과발현을 더욱 필요로 한다(buscke et al. biosource technology 2013).
당 유입 - C5 당 유입의 개선
재조합 미생물에 의한 펜토스의 유입은 C5 당이 가수분해된 리그노셀룰로스 생물량의 주요 성분이기 때문에 산업적 공정에서 주요한 사안이다. 다른 많은 효모 유형처럼, 에스. 세레비지아의 천연 균주는 발효배양 기질로서 자일로스 또는 아라비노스를 이용할 수 없다(Hahn-Hagerdal et al., 2007; Jin et al., 2004). 흥미롭게도, 자일로스가 천연 기질이 아님에도 자일로스를 흡수할 수 있다(Hamacher et al., 2002).
에스. 세레비지아 GAL2, HXT1, HXT2, HXT4, HXT5, 및 HXT7은 그들이 광범위한 기질 특이성을 가지므로 자일로스의 흡수를 촉매한다(Hamacher et al., 2002; Saloheimo et al., 2007; Sedlak & Ho 2004). 그러나, 자일로스에 대한 그들 친화성은 포도당에 대한 것보다 훨씬 낮고 수송체에 의한 자일로스 흡수는 포도당에 의해 강력하게 억제된다(Saloheimo et al., 2007).
자일로스 및/또는 아라비노스를 소비하고 이에서 성장할 수 있는 균주를 얻기 위해 몇몇 변화가 필요하다. 이들 상이한 변형은 본 발명의 일부이다.
이종성 자일로스 수송체의 과발현
자일로스 및 아라비노스 흡수를 개선시키기 위해, 재조합 아세토인 생산 균주는 자일로스 또는 아라비노스 수송체를 코딩하는 이종성 유전자를 발현하도록 변형되어야 한다. 예를 들어, 각각 캔디다 인터미디아(Candida intermedia), 피키아 스티피티스(Pichia stipitis) 및 아라비돕시스 탈리아나(Arabidopsis thaliana) 유래의 유전자 GXF1, SUT1 및 AT5g59250은 효모에 의한 자일로스 이용성을 개선시키도록 과발현된다(Runquist et al. , 2010).
자일로스 및 아라비노스의 대사에 관여하는 경로의 과발현
효모 균주는 그 당이 천연 기질이 아님에도 자일로스를 흡수할 수 있다. 자일로스 동화 반응을 위한 유전자가 에스. 세레비지아에 존재하더라도, 그들은 상당한 당 동화 반응을 할 수 있는 충분한 수준으로 발현되지 않는다. 따라서, 유전자 변형은 펜토스 당의 동화 반응을 개선시키는데 필요하다. 자일로스 또는 아라비노스를 자일리톨로 변형시킬 수 있는 모든 효소를 비롯하여 자일리톨을 자일룰로스로, 자일룰로스를 자일룰로스-5-포스페이트로 전환시키는 효소는 향상될 필요가 있다. 자일로스 및 아라비노스 경로의 상동성 유전자가 과발현되어야 하거나 또는 박테리아 유래의 이종성 유전자가 과발현되어야 한다.
본 발명의 일 실시형태에서, 균주에 의한 자일로스 흡수 및 이의 동화 반응은 예를 들어, 하기 유전자를 과발현시켜 개선된다:
1) 각각 에스. 세레비지아 및 피. 스티피티스 유래의 자일룰로키나제를 코딩하는 유전자 XKS 1 또는 XYL3의 과발현과 조합한, 피. 스티피티스 유래 자일리톨 디하이드로게나제를 코딩하는 XYL2의 과발현과 연관된, 각각 피. 스티피티스 및 에스. 세레비지아의 알돌라제 리덕타제를 코딩하는 유전자 XYL1 또는 GRE3,
2) 각각 에스. 세레비지아 및 피. 스티피티스 유래의 자일룰로키나제를 코딩하는 유전자 XKS1 또는 XYL3의 과발현과 연관된 박테리아 또는 피로마이세스(Piromyces) 유래의 자일로스 이소머라제를 코딩하는 유전자 xylA.
본 발명의 다른 실시형태에서, 균주에 의한 아라비노스 흡수 및 이의 동화 반응은 예를 들어, 하기 유전자를 과발현시켜 개선된다:
1) 피. 스티피티스 유래의 자일리톨 디하이드로게나제를 코딩하는 XYL2의 과발현, 및 또한 각각 에스. 세레비지아 및 피. 스티피티스 유래의 자일룰로키나제를 코딩하는 유전자 XKS1 또는 XYL3의 과발현과 조합된, 트리코더마 레에세이(Trichoderma reesei) 유래의 L-아라비니톨 4-하이드로게나제를 코딩하는 lad1 및 L-자일룰로스 리덕타제를 코딩하는 Ixr1와 연관된, 각각 피. 스티피티스 및 에스. 세레비지아의 알돌라제 리덕타제를 코딩하는 상동성 유전자 XYL1 또는 GRE3,
2) 박테리아 아라비노스 이소머라제 및 리불로스 키나제를 코딩하는 이종성 유전자 araA 및 araB.
펜토스 포스페이트 경로의 최적화
이는 효모 균주 유래의 비산화성 펜토스 포스페이트 경로에 속하는 적어도 하나의 유전자(; TALI, TKL1, RKL1 및 RPE1)를 과발현시켜 수행할 수 있다.
C5-당의 대사에 관여하는 효소에 의해 요구되는 NAPDH 보조인자의 이용률 최적화
이는 효모 균주에서 이. 콜라이의 트랜스하이드로게나제를 발현시켜 달성된다. 이. 콜라이 유래의 유전자 udhA 및 또는 pntAB를 생산 균주에서 과발현시킨다.
글리세롤 합성으로의 포도당 소비의 방지:
이는 글리세롤-3-포스페이트 디하이드로게나제 EC 1.1.1.8.(GPDH)를 코딩하는 GPD1 유전자를 파괴하여 수행될 수 있다.
이러한 실시형태에 따른 본 발명은 GPD1 유전자의 파괴가 NAD에 유리하게 NADH를 소비하는 효소 활성을 제거하도록 초래한다는 점에도 불구하고 아세토인의 수율 관점에서 특히 흥미롭다. 이렇게 생성된 산화환원 불균형을 상쇄시키기 위해서, GPD1 파괴된 균주는 NOXE의 추가 발현을 필요로 할 수 있다.
특정 실시형태에 따라서, 본 발명에 따른 재조합 균주는 WO 2011/041426 또는 문헌 [ Kim et al. (Bioresource Technology, vol. 146, 2013 : 274)]에 개시된 바와 같이, 포도당 억제를 감소시키는 효과를 갖는 임의의 유전자 변형(들)을 포함하지 않는 것이다.
특정 실시형태에 따라서, 본 발명에 따른 재조합 균주는 문헌 [Kim et al. (Journal of Biotechnology, 2014)]에 개시된 바와 같이, 임의의 자일로스 동화 경로를 발현하도록 하기 위한 임의의 유전자 변형(들)을 포함하지 않는다.
배양 조건
본 발명은 또한 아세토인 및/또는 이의 유도체, 구체적으로 메틸 비닐 케톤(MVK)을 생산하기 위한, 상기 정의된 바와 같은 재조합 효모의 용도에 관한 것이다.
본 발명은 또한 하기 단계를 포함하는 아세토인의 생산 방법에 관한 것이다:
- 이전에 기술된 바와 같은 재조합 미생물을 제공하여, 재조합 미생물을 탄소의 공급원을 함유하는 배양 배지에서 배양시키는 단계, 및
- 아세토인을 회수하는 단계.
전형적으로, 본 발명의 미생물은 적절한 배양 배지에서, 약 20℃ 내지 약 37℃ 범위의 온도, 바람직하게는 27℃ 내지 34℃ 범위의 온도에서 성장된다.
본 발명에 따른 재조합 효모가 에스. 세레비지아 종에 속하는 경우, 온도는 유리하게, 적절한 배양 배지에서 27℃ 내지 34℃ 범위일 수 있다.
효모에 적합한 성장 배지는 효소 질소 베이스, 암모늄 설페이트, 및 탄소/에너지 공급원으로서 덱스트로스를 포함하는 액체 배지 또는 YPD 배지, 펩톤, 효모 추출물 및 덱스트로스의 블렌드(최대 성장을 위한 최적 비율)와 같은, YPD 배지 등과 같이 통상 상업적으로 제조되는 배지이다. 다른 한정되거나 또는 합성된 성장 배지가 또한 사용될 수 있고 특정 미생물의 성장에 적절한 배지는 미생물 또는 발효 과학의 당업자에게 알려져 있다.
용어 "적절한 배양 배지"는 상기에 정의하였다.
본 발명에 따른 재조합 효모를 위한 공지된 배양 배지의 예는 당업자에게 공지되어 있고, 하기 출판 문헌 [D. Burke et al., Methods in yeast genetics - A cold spring harbor laboratory course Manual (2000)]에 제시되어 있다.
발효배양에 적합한 pH 범위는 pH 3.0 내지 pH 7.5이고, pH 4.5 내지 pH 6.5가 초기 조건으로서 바람직하다.
발효배양은 호기성 조건 또는 미세-호기성 조건 하에서 수행될 수 있다.
발효배양 배지 내 생성물의 양은 당분야에 공지된 수많은 방법들, 예를 들어 고성능 액상 크로마토그래피(HPLC) 또는 가스 크로마토그래피(GC)를 사용해 측정할 수 있다.
본 방법은 발효배양의 회분식 방법을 이용한다. 고전적인 회분식 발효배양은 배지 조성이 발효배양 시작시 설정되어 발효배양 동안 인공적으로 변경되지 않는 폐쇄 시스템이다. 따라서, 발효배양 시작시, 배지는 원하는 유기체(들)와 함께 접종되어, 시스템에 어떠한 것도 부가되지 않고 발효배양이 일어나게 된다. 그러나, 전형적으로, "회분식" 발효배양은 탄소원 부가 면에서 회분식이고 종종 온도, pH 및 산소 농도 등과 같은 요인들을 제어하려는 시도가 이루어진다. 회분식 시스템에서, 시스템의 대사산물 및 생물량 조성은 발효배양이 중지되는 시간까지 일정하게 변화된다. 회분식 배양내에서, 세포는 정적 유도기를 통해 고성장 대수기로 진행하여 최종적으로 성장률이 감소되거나 또는 중단되는 정지기로 진행된다. 미처리 시, 정지기 세포는 결국 사멸된다. 대수기 세포는 대체로 최종 생성물 또는 중간체의 대량 생산을 담당한다.
유가 배양 새스템이 또한 본 발명에서 사용될 수 있다. 유가 배양 시스템은 발효배양이 진행됨에 따른 증분으로 탄소 공급원 기질이 부가되는 점을 제외하고 전형적인 회분식 시스템과 유사하다. 유가 배양 시스템은 분해대사물 억제(예를 들어, 포도당 억제)가 세포의 대사를 억제하는 경향이 있고 배지에 제한된 양의 기질을 갖는 것이 바람직한 경우에 유용하다. 유가 배양 시스템에서 실제 기질 농도의 측정은 쉽지 않아서, 측정가능한 인자들 예컨대 pH, 용존 산소 및 폐가스 예컨대 C02의 분압의 변화를 기반으로 추정된다.
발효배양은 당분야에서 일반적이고 충분히 공지되어 있으며 예들을 참조로 본원에 편입된 문헌 [Sunderland et al., (1992)]에서 확인할 수 있다. 본 발명을 회분식 방식으로 수행할 수 있지만 이 방법을 연속 발효배양에 적합화시킬 수 있음을 고려한다.
연속 발효배양은 정해진 발효배양 배지가 연속적으로 생물반응기에 부가되고 균등량의 조건화 배지가 프로세싱을 위해 동시에 제거되는 개방 시스템이다. 연속 발효배양은 일반적으로 세포가 주로 대수기 성장하는 일정한 고밀도의 배양을 유지한다.
연속 발효배양은 세포 성장 또는 최종 생성물 농도에 영향을 미치는 한가지 인자 또는 임의 수의 인자들의 변경을 가능하게 한다. 예를 들어, 한가지 방법은 제한 영양분 예컨대 탄소 공급원 또는 질소 수준을 고정된 비율로 유지시키고 모든 다른 변수들을 가변화시킬 수 있다. 다른 시스템에서, 성장에 영향을 주는 수많은 인자들이 연속적으로 변경될 수 있는 한편, 배지 탁도로 측정되는 세포 농도는 일정하게 유지된다. 연속 시스템은 정상 상태 성장 조건을 유지하기 위해 노력하기 때문에 배지 배출로 인한 세포 손실은 발효배양의 세포 성장률에 대응하여 균형을 유지해야만 한다. 연속 발효배양 과정을 위해 영양분 및 성장 인자를 조정하는 방법을 비롯하여 생성물 형성 속도를 최대화하는 기술은 산업 미생물 분야에서 충분히 공지되어 있다.
본 발명은 회분식, 유가식 또는 연속 공정을 사용하여 실시될 수 있고 임의의 공지된 방식의 발효배양이 적합할 수 있다고 여겨진다. 부가적으로, 세포는 전체 세포 촉매로서 기재 상에 고정되어 생산을 위한 발효배양 상태를 겪을 수 있음을 고려한다.
여전히 아세토인 생산을 개선시키기 위해서, 구체적인 실시형태는 상기에 언급한 바와 같은, 적절한 배양 배지에서 재조합 효모 세포를 배양하는 단계로 이루어질 수 있고, 상기 배양 배지는 최적량의 탄소 공급원, 특히 포도당을 포함한다.
바람직하게, 세포는 전체 배양 지속 기간의 단지 일부분 동안 이러한 최적 배양 배지에서 배양된다. 일부 실시형태에서, 효모 세포는 배양 개시 후 11, 12, 13, 14, 15 또는 16시간을 포함하여, 배양 개시 후 10시간 또는 그 이상 동안 상기 최적 배양 배지에서 항온배양된다.
바람직하게, 세포는 배양 개시 이후 6시간 내지 10시간, 예를 들어 8시간을 포함하여, 5시간 내지 15시간 범위의 기간 동안 이러한 최적 배양 배지에서 배양된다.
바람직한 실시형태에서, 상기 최적 배양 배지에 포함된 탄소 공급원은 포도당으로 이루어진다. 바람직한 실시형태에서, 상기 최적 배양 배지는 15% w/w 또는 그 이상의 포도당을 포함하여, 12% w/w 또는 그 이상의 포도당을 포함한다. 바람직한 실시형태에서, 상기 최적 배양 배지는 최대 35% w/w 포도당을 포함하여, 최대 40% w/w의 포도당을 포함한다.
따라서, 상기 기술된 바람직한 실시형태에서, 본 발명에 따라 아세토인을 생산하기 위한 방법은 단계 (a) 및 (c) 사이에, 상기 최적 배양 배지에서 효모 세포를 배양하는 것으로 이루어진 중간 단계 (b)를 더 포함할 수 있다.
아세토인의 정제
본 발명의 특정 측면에 따라서, 아세토인의 발효배양 생산은 배양 배지로부터 아세토인을 단리하는 단계를 포함한다. 배양 배지로부터 아세토인의 회수는 당업자에게는 통상적인 작업이다. 이는 제한없이, 증류, 가스-스트립핑, 투석증발 또는 액체 추출을 포함한 당분야에 공지된 수많은 기술에 의해 성취될 수 있다. 당분야의 숙련가는 분리하려는 물질의 특징에 따라서 각 기술의 변수들을 어떻게 적합화시키는지 알고 있다.
본 발명에서 미생물 모델로서 효모는 합성된 아세토인을 전체로 세포 외부로 유출시켜서, 정제 과정을 단순화한다는 점에서 유지된다.
합성된 아세토인은 증류에 의해 수집될 수 있다. 증류는 공비혼합물을 특히 물과 형성하여 다세토인의 단리를 촉진시키기 위해 배양 배지와는 상이한 선택적 성분을 포함할 수 있다. 이러한 선택적 성분은 유기 용매 예컨대 시클로헥산, 펜탄, 부탄올, 벤젠, 톨루엔, 트리클로로에틸렌, 옥탄, 디에틸에테르 또는 이의 혼합물이다.
가스 스트립핑은 헬륨, 아르곤, 이산화탄소, 수소, 질소 또는 이의 혼합물 중에서 선택된 스트립핑 가스로 이루어진다.
액체 추출은 펜탄, 헥산, 헵탄, 도데칸 등과 같은 소수성 상으로서 유기 용매를 사용해 이루어진다.
본 명세서에서 기술된 재조합 효모 세포에 의해 생산된 아세토인에서 출발하여, 아세토인 유도체(메틸 비닐 케톤 포함)는 당업자에게 잘 알려진 다양한 방법을 통해 얻을 수 있다.
청구항을 포함하여 명세서 전반에서, "하나를 포함하는"의 표현은 달리 명시하지 않으면, "적어도 하나를 포함하는"의 동의어로서 이해해야 한다.
또한, 고려되는 상황에 따라서 달리 표시하지 않으면, "식 (I) 내지 (III)"의 표현은 식 (I), (II) 및 (III) 뿐만 아니라 (IIa), (IIb), (IIc), (IId), (IIe), (IIf'), (IIf"), (IIg), (IIh') 및/또는 (IIh")의 DNA 구성체를 의미한다.
용어 "∼ 사이" 및 "∼의 범위"는 달리 명시하지 않으면, 한계를 포함하는 것으로 이해해야 한다.
이하의 실시예 및 도면은 예시로서 제시되며 본 발명을 한정하는 것이 아니다.
실시예
a) 본 발명에 따른 재조합 사카로마이세스 세레비지아 균주를 제조하기 위한 프로토콜
이하에서 제공되는 모든 재조합 사카로마이세스 세레비지아 균주는 표준 효모 분자 유전학 절차를 사용해 표준 균주 W303(Thomas and Rothstein (1989), Cell. 56, 619-630)로부터 제작하였다(Methods in yeast genetics - A cold spring harbor laboratory course Manual (2000) by D. Burke, D. Dawson, T. Stearns CSHL Press).
이들 균주에서, 피루베이트 디카복실라제 활성은 pdc 유전자(pdc1, pdc5, pdc6) 중 적어도 하나의 파괴에 의하거나 또는 약한 프로모터로 그들의 동족 전사 프로모터를 대체하여 감소된다.
가장 효율적인 균주에서, 오직 pdc1 및 pdc6만이 결실되었다.
다양한 외생성 효소가 고려된 재조합 사카로마이세스 세레비지아 균주에서 발현되었다. 그들은 이용가능한 경우 미카엘리스 멘텐 효소 변수에 따라서 선택하였다(이하 표 1에서 확인). 고효율을 위한 높은 kcat, 및 기질의 상이한 농도를 포괄하기 위한 다양한 Km. 바에니바실러스 폴리믹사 효소를, 이 유기체가 아세토인에서 직접적으로 유도되는 생성물인 천연 2,3 부탄 디올의 생산자이므로 선택하였다. 따라서, 이는 아세토인 합성을 효율적으로 촉매하는 효소를 보유한다.
이행된 외생성 효소 아세토락테이트 신타제, 아세토락테이트 디카복실라제 및 수분 형성 NADH 옥시다제와 관련된 유전자 명명법을 이하 표 1에 나타내었다.
이들 유전자는 다음과 같이 효소의 두문자어 뒤에 기원 유기체의 두문자어로 표시하였다:
Figure 112017018861512-pct00002
또한, 하기 유전자형의 보다 나은 이해를 위해서,
- ade2, his3, leu2, trp1 및 ura3은 영양요구성 마커 유전자이다.
- 소문자는 고려된 유전자가 불활성임을 의미하고, 대분자는 활성 유전자를 반영한다.
- "::": 유전자 명칭 뒤에 후속되면 그 유전자가 그 후속되는 것에 의해 파괴되었음을 의미한다(하나 초과의 유전자가 삽입되면, 괄호 []에 표시됨). 유전자의 파괴는 코딩 서열의 전체 결실을 수반하지만 프로모터는 보존된다. 결과적으로 "::"가 후속되는 유전자는 불활성이고 소문자로 표시된다. 특정하지 않으면 삽입된 유전자의 전사는 파괴된 유전자의 프로모터에 의해 제어된다.
- "유전자.Kl"은 클루이베로마이세스 락티스에서 기원하는 유전자를 의미한다.
- 소정 유전자의 항상성 과발현을 허용하는 전사 프로모터는 문헌에서 확인된다(velculescu et al. (1997) Cell 88, 243-251). 본원에서 사용되는 프로모터는 그들 동족 유전자 명칭이 후속되는 "p"로 표시된다. 그들의 개별 서열 번호가 또한 이하에 언급된다.
- 전사 종결인자는 각각의 유전자 뒤에 위치된다. 원치않는 조절을 피하기 위해, 하나의 삽입된 유전자를 구성하는 프로모터 및 종결인자는 동일한 기원의 유전자에서 선택하지 않았다. 본원에서 사용되는 종결인자는 그들의 동족 유전자 명칭이 후속되는 "t"로 표시한다. 그들의 개별 서열 번호가 역시 이하에 언급된다.
상기 언급한 유전자 무리는 서열 상동성을 갖는 자유 DNA 말단을 효과적으로 재결합시키는 효모의 능력을 사용하여 한번에 재조합 효모에 통합시켰다.
재조합 효모는 당업자가 이용할 수 있는 공개된 방법에 따라서 획득하였다. 특히, 실지로 오직 소수의 변형을 가하여, 문헌 [Shao et al. (Nucleic Acids Research, 2009, Vol. 37, No. 2: e16)] 및 [Shao et al. (Methods in Enzymology, 2012 Elsevier Inc., Vol. 517: 203)]에 기술된 방법에 따를 수 있다.
보다 구체적으로, 클로닝하려는 코딩 서열은 인공적으로 합성하였다. 이종성 서열(비효모)의 경우, 핵산 서열은 효모 코돈 용법을 사용해 동의의 코딩 서열을 얻도록 변형시켰다. 제한효소 및 고전적인 클로닝 기술을 사용해, 각각의 합성 서열을 전사 프로모터와 전사 종결인자 사이에 클로닝하였다. 각각의 프로모터 서열에는 상류 유전자의 종결인자의 서열과 상동성인 50 내지 200개 뉴클레오타이드 서열이 선행된다. 유사하게, 각 유전자(프로모터-코딩 서열-종결인자를 포함하는 유전자)의 종결인자에는 곧바로 후속되는 유전자에 상동성인 서열이 뒤따른다. 그래서 통합되는 유닛 각각은 상류 유닛과 하류 유닛 둘 모두가 중복되는 50-200개 뉴클레오타이드를 갖는다. 제1 유닛의 경우, 프로모터에는 통합되는 유전자좌에 대한 효모 염색체 뉴클레오타이드와 상동성인 50-200개 뉴클레오타이드가 선행된다. 유사하게, 마지막 유닛의 경우, 종결인자에는 통합되는 유전자좌에 대해 효모 염색체 뉴클레오타이드와 상동성인 50-200개 뉴클레오타이드가 후속된다.
이어서, 각각의 유닛은 플라스미드 구성체로부터 PCR 증폭되어, 중복된 서열을 갖는 선형 DNA의 X 유닛이 산출된다. 이 유전자 중 하나는 재조합 사건을 선별하기 위한, 영양요구성 마커이다. 모든 선형 마커를 한번에 효모에 형질전환시키고, 재조합 효모는 사용된 마커에 대한 영양요구성에 대해 선별한다. 서열의 온전성은 이후 PCR 및 서열분석으로 검증한다.
b) ALS 및 ALD 효소에 관하여
ALS 및 ALD 효소는 개별적으로 평가하지 않았으며, 아세토인의 수율을 통해 쌍으로(ALS + ALD) 평가하였다. 3종의 외생성 ALD 및 ALS가 그들의 동역학적 변수에 따라 선택되었다: ALS.Nt, ALS.Pp, ALS.Bs 및 ALD.Bb, ALD.Ll, ALD.Ea(상기를 참조함).
ALS 및 ALD의 9가지 가능한 조합 중 8가지를 프로모터 뒤에 ura3-효모 균주의 염색체 상에 공동으로 삽입시키고 하나의 종결인자를 후속시켰다.
이들 두 유전자의 삽입은 pdc1 유전자를 파괴한다. URA3 마커 유전자는 형질전환체를 선별하기 위해 부수적으로 삽입된다. ALS/ALD 조합을 하기 유전자형을 갖는 W303 유도체인, YA747 균주에 삽입시켰다:
YA747 : MAT-a, ade2, bdh1::TRP1.Kl, his3, leu2, pdc1::HIS5.Sp, pdc6::LEU2.Kl, trp1, ura3.
하기 균주를 제작하였다:
YA768 : MAT-a, ade2, bdh1::TRP1.Kl, his3, leu2, pdc1:: [-ALS.Bs-tTPI1, pTDH3-ALD.Ea-tMET25, URA3.Kl], pdc6::LEU2.Kl, trp1, ura3
NB: 이 경우에서, 유전자 "ALS.Bs"는 pdc1의 천연 프로모터, 즉 프로모터 pPDC1의 제어 하에 존재한다.
YA769 : MAT-a, ade2, bdh1::TRP1.Kl, his3, leu2, pdc1:: [-ALS.Nt-tTPI1, pTDH3-ALD.Ea-tMET25, URA3.Kl], pdc6::LEU2.Kl, trp1, ura3
YA770 : MAT-a, ade2, bdh1::TRP1.Kl, his3, leu2, pdc1::[-ALS.Pp-tTPI1, pTDH3-ALD.Ea-tMET25, URA3.Kl], pdc6::LEU2.Kl, trp1, ura3
YA771 : MAT-a, ade2, bdh1::TRP1.Kl, his3, leu2, pdc1::[-ALS.Nt-tTPI1, pTDH3-ALD.Bb-tMET25, URA3.Kl], pdc6::LEU2.Kl, trp1, ura3
YA772 : MAT-a, ade2, bdh1::TRP1.Kl, his3, leu2, pdc1::[- ALS.Nt-tTPI1, pTDH3-ALD.Ll-tMET25, URA3.Kl], pdc6::LEU2.Kl, trp1, ura3
YA773 : MAT-a, ade2, bdh1::TRP1.Kl, his3, leu2, pdc1::[-ALS.Pp-tTPI1, pTDH3-ALD.Ll-tMET25, URA3.Kl], pdc6::LEU2.Kl, trp1, ura3
YA810 : MAT-a, ade2, bdh1::TRP1.Kl, his3, leu2, pdc1::[-ALS.Bs-tTPI1, pTDH3-ALD.Bb-tMET25, URA3.Kl], pdc6::LEU2.Kl, trp1, ura3
YA811 : MAT-a, ade2, bdh1::TRP1.Kl, his3, leu2, pdc1::[-ALS.Pp-tTPI1, pTDH3-ALD.Bb-tMET25, URA3.Kl], pdc6::LEU2.Kl, trp1, ura3
모든 이들 균주는 8% 포도당 YPA(효모 추출물 1%, 박토 펩톤 2%, 아데닌 0.1 mM, 포도당 8%)에서 24시간 동안 성장시켰다. 그들을 회수하고 아세토인 및 에탄올 함량은 문헌 [Gonzales et al. (2010), Applied and environmental Microbiology 76 670-679]으로부터 적합화시킨 특이성으로 표준 방법에 따라 측정하였다.
일부 균주의 경우, 몇몇 클론을 검정하였고, "-" 뒤의 마지막 번호는 클론 번호이다. 내생성 bdh 효소가 파괴되었기 때문에, 2,3-BDO는 생산되지 않음을 주의한다.
에탄올 및 아세토인 생산은 표준 방법 및 문헌 [Gonzales et al. (2010), Applied and environmental Microbiology 76 670-679]에 따라서 모니터링하였다.
결과
이하의 표 2는 상기 언급된 시험 균주의 아세토인 생산을 보여준다.
Figure 112017018861512-pct00003
이들 결과로부터, 개별적으로 취하여, 아세토인 생산을 강화시키는 최고 효소들은 ALS Pp, ALS Nt, ALD Ea 및 ALD Bb이고, ALD Bb가 가장 효율적인 효소인 것으로 결론내릴 수 있다.
c) 아세토인 수율에 대한 NOXE 효소의 유리한 기술적 효과
YA1609에 따른 재조합 효모를 제조하였다.
YA1609 : MAT-a, his3, leu2, pdc1::[-ALS.Bs-tTDH2- pENO2-ALD.Ll- tCYC1, HIS5.Sp], pdc6::[pADH1-ALS.Pp-tDPI1, pTDH3-ALD.Ea-tMET25, LEU2.Kl], trp1, ura3::[pENO2-NOXE.Ll-tPGK1, URA3]x12
YA1609-1, YA1609-2 및 YA1609-4는 이 YA1609 균주와는 상이한 클론이다.
이들 재조합 효모는 항상 그들의 천연 내생성 BHH 활성을 가짐을 주목한다.
이들 균주를 상기 기술된 바와 동일한 조건 하에 16% 포도당 YPA(효모 추출물 1%, 박토 펩톤 2%, 아데닌 0.1 mM, 포도당 8%) 중에서 아세토인 생산에 대해 검정하였다.
에탄올 및 아세토인 생산은 표준 방법 및 문헌 [Gonzales et al. (2010), Applied and environmental Microbiology 76 670-679]에 따라 모니터링하였다
결과
결과를 하기 표 3에 보고한다.
Figure 112017018861512-pct00004
이들 결과는 NOXE의 존재가 매우 유의한 아세토인의 축적을 초래함을 보여준다.
YA1609-4를 이제 상기에 언급한 바와 동일한 배양 배지에서 이행시킨다. 그러나, 이 검정법은 하기 변수가 상이하다:
환경: 0.5 ℓ YPA, 16% 포도당.
세포 배양 출발 후 16시간 후에, 세포를 최종 농도 16% w/w의 포도당을 포함하는 배양 배지에서 8시간의 기간 동안 항온반응시켰다.
교반: 800 rpm (2페일), 1.9 ms-1
온도: 30℃
공기: 0.15 L/분 (0.3vvm)
세포를 아세토인 생산에 대해 검정하였다. 에탄올 및 아세토인 생산은 표준 방법 및 문헌 [Gonzales et al. (2010), Applied and environmental Microbiology 76 670-679]에 따라 모니터링하였다.
결과
결과를 하기 표 4에 보고한다.
Figure 112017018861512-pct00005
이들 결과는 고려된 배양 변수들이 또한 아세토인 생산에 영향을 미칠 수 있음을 보여준다.
d) 아세토인을 생산하는 재조합 효모의 추가예
이하에 기술된 바와 같이, 추가의 재조합 효모들을 제조하였다.
YA1573-4 : MAT-a, his3, leu2, pdc1::[-ALS.Bs-tTDH2, pENO2-ALD.Ll-tCYC1, HIS5.Sp], pdc6::[pADH1-ALS.Pp-tDPI1, pTDH3-ALD.Ea-tMET25, pTEF2-TRP1.Sc-tADH1,pGMP1-BDH.Sc-tENO2], trp1, ura3::[pENO2-NOXE.Ll-tPGK1, URA3]x12.
YA1609-4 : MAT-a, his3, leu2, pdc1::[-ALS.Bs-tTDH2, pENO2-ALD.Ll-tCYC1, HIS5.Sp], pdc6::[pADH1-ALS.Pp-tTPI1, pTDH3-ALD.Ea-tMET25, LEU2.Kl], trp1, ura3::[pENO2-NOXE.Ll-tPGK1, URA3]x12
YA1661-2 : MAT-a, his3, leu2, pdc1::[-ALS.Bs-tTDH2, pENO2-ALD.Ll-tCYC1, HIS5.Sp], pdc6::[pADH1-ALS.Pp-tTPI1, pTDH3-ALD.Ea-tMET25, pENO2-NOXE.Spn-tPGK1], trp1, ura3::[pENO2-NOXE.Ll-tPGK1, URA3]x12.
이들 재조합 효모는 항상 그들의 천연 내생성 BHH 활성을 가짐을 주목한다.
이들 균주를 상기 기술된 바와 동일한 조건 하에 16% 포도당 YPA(효모 추출물 1%, 박토 펩톤 2%, 아데닌 0.1 mM, 포도당 8%)에서 아세토인 생산에 대해 검정하였다.
에탄올 및 아세토인 생산은 표준 방법 및 문헌 [Gonzales et al. (2010), Applied and environmental Microbiology 76 670-679]에 따라 모니터링하였다.
결과
결과를 하기 표 5에 보고한다.
Figure 112017018861512-pct00006
표 5의 이들 결과는 재조합 효모에서의 NOXE를 코딩하는 다수 핵산의 존재가, NOXE를 코딩하는 단일 핵산으로 형질전환된 재조합 효모와 비교하여 아세토인의 축적 증가를 초래함을 보여준다.
e) 2,3-BDO로의 아세토인의 누출 방지
다음의 내생성 bdh1, bdh2, adh1, adh3 및/또는 adh4 유전자 중 적어도 하나의 유전자(들)를 불활성화시킬 수 있다. 일부 균주에서, 영양요구성 마커를 재도입시켜 그들을 자가영양성이 되게 하였다. 그들 모두는 YA1660 와 동일한 프로모터 및 종결인자를 갖는다:
YA1660-2 , YA1660-3, YA1660-4, 및 YA1711-16C: MAT-a, his3, leu2, pdc1::[-ALS.Bs-tTDH2, pENO2-ALD.Ll-tCYC1, HIS5.Sp], pdc6::[pADH1-ALS.Pp-tTPI1, pTDH3-ALD.Ea-tMET25, pENO2-NOXE.Spn-tPGK1, LEU2.Kl], trp1, ura3::[pENO2-NOXE.Ll-tPGK1, URA3]x12.
YA1711-45c : Mat-α, his3, leu2, pdc1::[-ALS.Bs-tTDH2, pENO2-ALD.Ll-tCYC1, HIS5.Sp], pdc6::[pADH1-ALS.Pp-tTPI1, pTDH3-ALD.Ea-tMET25, pENO2-NOXE.Spn-tPGK1, LEU2.Kl], trp1, ura3::[pENO2-NOXE.Ll-tPGK1, URA3]x12.
YA1711-13A , YA1711-16B: Mat-α, bdh1::LEU2.Kl, bdh2::HIS5.Sp, his3, leu2, pdc1::[ALS.Bs-ALD.Ll-HIS5.Sp], pdc6::[ALS.Pp-ALD.Ea-NOXE.Spn-LEU2.Kl], trp1, ura3::[NOXE.Ll-URA3]x12.
YA1711-19A 및 YA1711-46A: Mat-α, bdh1::LEU2.Kl, bdh2::HIS5.Sp, his3, leu2, pdc1::[ALS.Bs-ALD.Ll-HIS5.Sp], pdc6::[ALS.Pp-ALD.Ea-NOXE.Spn-LEU2.Kl], trp1, ura3::[NOXE.Ll-URA3]x12.
YA1822-1 및 YA1822-2: Mat-α, bdh1::LEU2.Kl, bdh2::HIS5.Sp, his3, leu2, pdc1::[ALS.Bs-ALD.Ll-HIS5.Sp], pdc6::[ALS.Pp-ALD.Ea-NOXE.Spn-LEU2.Kl], trp1::TRP1, ura3::[NOXE.Ll-URA3]x12.
YA 1870-10A : Mat-a, adh3::TRP1.Kl, bdh1::LEU2.Kl, bdh2::HIS5.Sp, his3, leu2, pdc1::[ALS.Bs-ALD.Ll-HIS5.Sp], pdc6::[ALS.Pp-ALD.Ea-NOXE.Spn-LEU2.Kl], trp1, ura3::[NOXE.Ll-URA3]x12.
YA 1870-11B : Mat-α, adh3::TRP1.Kl, bdh1::LEU2.Kl, bdh2::HIS5.Sp, his3, leu2, pdc1::[ALS.Bs-ALD.Ll-HIS5.Sp], pdc6::[ALS.Pp-ALD.Ea-NOXE.Spn-LEU2.Kl], trp1, ura3::[NOXE.Ll-URA3]x12.
YA1870-10B : Mat-α, adh1::TRP1.Kl, bdh1::LEU2.Kl, bdh2::HIS5.Sp, his3, leu2, pdc1::[ALS.Bs-ALD.Ll-HIS5.Sp], pdc6::[ALS.Pp-ALD.Ea-NOXE.Spn-LEU2.Kl], trp1, ura3::[NOXE.Ll-URA3]x12.
YA1870-11A : Mat-α, adh1::TRP1.Kl, bdh1::LEU2.Kl, bdh2::HIS5.Sp, his3, leu2, pdc1::[ALS.Bs-ALD.Ll-HIS5.Sp], pdc6::[ALS.Pp-ALD.Ea-NOXE.Spn-LEU2.Kl], trp1, ura3::[NOXE.Ll-URA3]x12.
YA1870-2A 및 YA1870-3D: Mat-a, adh1::TRP1.Kl, adh3::TRP1.Kl, bdh1::LEU2.Kl, bdh2::HIS5.Sp, his3, leu2, pdc1::[ALS.Bs-ALD.Ll-HIS5.Sp-loxP], pdc6::[ALS.Pp-ALD.Ea-NOXE.Spn-LEU2.Kl-loxP], trp1, ura3::[NOXE.Ll-URA3]x12
상기에 기술된 모든 균주를 비롯하여 YA1609-4 및 YA1661-2와 이들 균주의 이배체 조합은 개선된 아세토인 수율을 갖는 균주라고 고려될 것이다.
f) 2,3-BDO로의 아세토인 누출 예방을 보여주는 추가예
균주 YA1711-19A를 효모 추출물 2%, 수크로스 10% 중에 3 ℓ 발효배양기에서 0 내지 24시간 동안 성장시킨 후, 600 g의 포도당을 서서히 부가하였다(20시간 동안 30 g/ℓ).
Figure 112017018861512-pct00007
모두 외생성 ALS, ALD 및 NOXE가 도입된 균주로 이루어진 하기 균주들을 효모 추출물 2% 및 수크로스 30% 중에 30℃에서 24시간 및 48시간 동안 진탕하면서 500 mL 삼각 플라스크에서 항온반응시켰다:
Figure 112017018861512-pct00008
서열 목록
서열번호 1 (=ADN ALS.Bs)
Figure 112017018861512-pct00009
Figure 112017018861512-pct00010
서열번호 2 (= 아미노산 ALS.Bs)
Figure 112017018861512-pct00011
서열번호 3 (= ADN ALS.Nt)
Figure 112017018861512-pct00012
Figure 112017018861512-pct00013
서열번호 4 (= 아미노산 ALS.Nt)
Figure 112017018861512-pct00014
Figure 112017018861512-pct00015
서열번호 5 (= ADN ALS.Pp)
Figure 112017018861512-pct00016
Figure 112017018861512-pct00017
서열번호 6 (= 아미노산 ALS.Pp)
Figure 112017018861512-pct00018
서열번호 7 (= ADN ALD.Bb)
Figure 112017018861512-pct00019
Figure 112017018861512-pct00020
서열번호 8 (= 아미노산 ALD.Bb)
Figure 112017018861512-pct00021
서열번호 9 (= ADN ALD.Ea)
Figure 112017018861512-pct00022
Figure 112017018861512-pct00023
서열번호 10 (= 아미노산 ALD.Ea)
Figure 112017018861512-pct00024
서열번호 11 (= ADN ALD.Ll)
Figure 112017018861512-pct00025
서열번호 12 (= 아미노산 ALD.Ll)
Figure 112017018861512-pct00026
Figure 112017018861512-pct00027
서열번호 13 (= ADN NOXE.Ll)
Figure 112017018861512-pct00028
서열번호 14 (= 아미노산 NOXE.Ll)
Figure 112017018861512-pct00029
서열번호 15 (= ADN NOXE.spn)
Figure 112017018861512-pct00030
Figure 112017018861512-pct00031
서열번호 16 (= 아미노산 NOXE.spn)
Figure 112017018861512-pct00032
서열번호 17 (= ADN NOXE.Ef)
Figure 112017018861512-pct00033
Figure 112017018861512-pct00034
서열번호 18 (= 아미노산 NOXE.Ef)
Figure 112017018861512-pct00035
서열번호 19 (= ADN NOXE.Lb)
Figure 112017018861512-pct00036
Figure 112017018861512-pct00037
서열번호 20 (= 아미노산 NOXE.Lb)
Figure 112017018861512-pct00038
서열번호 21 (= pENO2)
Figure 112017018861512-pct00039
서열번호 22 (= pTEF2.Kl)
Figure 112017018861512-pct00040
서열번호 23 (= pTEF3)
Figure 112017018861512-pct00041
Figure 112017018861512-pct00042
서열번호 24 (= pADH1)
Figure 112017018861512-pct00043
서열번호 25 (= pGPM1)
Figure 112017018861512-pct00044
Figure 112017018861512-pct00045
서열번호 26 (= pFBA1)
Figure 112017018861512-pct00046
서열번호 27 (= pPDC1)
Figure 112017018861512-pct00047
서열번호 28 (= pPGK1)
Figure 112017018861512-pct00048
서열번호 29 (= pRPLA1)
Figure 112017018861512-pct00049
서열번호 30 (=pTEF1)
Figure 112017018861512-pct00050
서열번호 31 (= pTDH3)
Figure 112017018861512-pct00051
서열번호 32 (= tTHD2)
Figure 112017018861512-pct00052
서열번호 33 (= tCYC1)
Figure 112017018861512-pct00053
서열번호 34 (= tTDH3)
Figure 112017018861512-pct00054
서열번호 35 (= tADH1)
Figure 112017018861512-pct00055
서열번호 36 (= tTPI1)
Figure 112017018861512-pct00056
서열번호 37 (= tMET25)
Figure 112017018861512-pct00057
서열번호 38 (= tENO2)
Figure 112017018861512-pct00058
서열번호 39 (= tMET3)
Figure 112017018861512-pct00059
서열번호 40 (= tPGK1)
Figure 112017018861512-pct00060
서열번호 41 (= pPYK1)
Figure 112017018861512-pct00061
서열번호 42 (= pTPI1)
Figure 112017018861512-pct00062
서열번호 43 (= tDIT1)
Figure 112017018861512-pct00063
Figure 112017018861512-pct00064
서열번호 44 (= loxP)
Figure 112017018861512-pct00065
서열번호 45 (= 핵산 HAA-1)
Figure 112017018861512-pct00066
Figure 112017018861512-pct00067
서열번호 46 (= 아미노산 HAA-1)
Figure 112017018861512-pct00068
Figure 112017018861512-pct00069
서열번호 47 (= 핵산 LEU2.Kl)
Figure 112017018861512-pct00070
서열번호 48 (= 아미노산 LEU2.Kl)
Figure 112017018861512-pct00071
서열번호 49 (= 핵산 His 5)
Figure 112017018861512-pct00072
서열번호 50 (= 아미노산 His 5)
Figure 112017018861512-pct00073
서열번호 51 (= 핵산 Trp1 kl)
Figure 112017018861512-pct00074
Figure 112017018861512-pct00075
서열번호 52 (= 아미노산 Trp1 Kl)
Figure 112017018861512-pct00076
<110> Alderys <120> Method for producing acetoin <130> PR73134/KLP/GGJ/gg <150> EP14306205.7 <151> 2014-07-25 <160> 52 <170> BiSSAP 1.3 <210> 1 <211> 1716 <212> DNA <213> Bacillus subtilis <400> 1 atgtctacca aagcaacaaa agagcaaaag agccttgtga agaatagagg tgcagaactt 60 gtcgttgatt gcttggtaga acagggagtc actcacgttt tcgggatacc cggcgctaaa 120 atcgacgccg tgtttgacgc tttacaggat aagggaccag agatcattgt tgctagacat 180 gaacagaatg cagcgttcat ggctcaagct gtaggtagac ttactgggaa acccggtgtg 240 gttttggtta ctagtggacc aggtgcatca aatctagcaa caggtttgtt aacagcgaat 300 acagagggag atcctgttgt tgcattagca ggaaacgtta tcagagcgga tagactgaaa 360 agaacccatc aatcattgga taatgctgca ttatttcagc caattacgaa atattccgtc 420 gaagtacagg atgtgaagaa catacctgaa gctgtaacta atgcgtttcg tatagcttct 480 gctggtcaag ctggtgcagc ttttgtttcg tttccgcaag acgttgtcaa cgaggttacg 540 aacactaaga atgtgagagc agtagcagcc ccaaaattag gaccagctgc tgatgatgct 600 atatcagctg ctattgctaa gattcagaca gccaaactac ctgttgtctt agtaggtatg 660 aaaggtggca ggccagaagc aatcaaggca gttagaaaac tgttgaagaa ggttcaattg 720 ccgtttgtgg aaacctatca agccgcaggg actttgtcta gggatctaga agatcaatac 780 ttcggtagaa tagggttgtt cagaaatcaa cctggcgact tgttactgga acaagccgat 840 gtcgtgctta caattggtta cgatccgatt gaatatgacc ccaaattttg gaatattaat 900 ggtgatagga ctattatcca cttagacgag attattgccg atattgacca tgcttatcaa 960 cctgatctgg aactgatagg tgatattcca agtactatca accatataga gcatgatgcc 1020 gtcaaagtgg aatttgccga aagagaacag aagatcctat ccgatctaaa gcagtacatg 1080 catgaaggcg aacaagttcc agcagattgg aaatccgata gagcacatcc attggaaatt 1140 gtcaaagaat tgagaaatgc agttgatgac catgttacag ttacttgtga cataggtagt 1200 cacgctattt ggatgtctag gtacttcaga tcttatgagc cattaacgtt gatgatatcc 1260 aatggcatgc aaacccttgg agtcgcttta ccatgggcca ttggtgcgtc gttagtaaag 1320 ccaggagaga aagtcgtttc tgtgtcaggt gatggtggtt tcttgttctc tgccatggaa 1380 ttggaaaccg ccgttcgttt gaaagcccct atagtacaca tcgtgtggaa tgattcgacc 1440 tatgacatgg tcgcgtttca acaattgaag aagtacaacc gtacttcagc tgttgatttc 1500 ggcaacattg acattgtgaa gtacgcggaa agctttggcg ccacaggcct aagagtcgaa 1560 tcacctgatc aattagcaga tgtacttagg caagggatga acgctgaagg acctgtaatt 1620 atcgacgtac ctgttgacta tagcgacaac atcaatttag ccagtgataa attacccaaa 1680 gagtttggtg agctaatgaa aacgaaagct ttgtaa 1716 <210> 2 <211> 571 <212> PRT <213> Bacillus subtilis <400> 2 Met Ser Thr Lys Ala Thr Lys Glu Gln Lys Ser Leu Val Lys Asn Arg 1 5 10 15 Gly Ala Glu Leu Val Val Asp Cys Leu Val Glu Gln Gly Val Thr His 20 25 30 Val Phe Gly Ile Pro Gly Ala Lys Ile Asp Ala Val Phe Asp Ala Leu 35 40 45 Gln Asp Lys Gly Pro Glu Ile Ile Val Ala Arg His Glu Gln Asn Ala 50 55 60 Ala Phe Met Ala Gln Ala Val Gly Arg Leu Thr Gly Lys Pro Gly Val 65 70 75 80 Val Leu Val Thr Ser Gly Pro Gly Ala Ser Asn Leu Ala Thr Gly Leu 85 90 95 Leu Thr Ala Asn Thr Glu Gly Asp Pro Val Val Ala Leu Ala Gly Asn 100 105 110 Val Ile Arg Ala Asp Arg Leu Lys Arg Thr His Gln Ser Leu Asp Asn 115 120 125 Ala Ala Leu Phe Gln Pro Ile Thr Lys Tyr Ser Val Glu Val Gln Asp 130 135 140 Val Lys Asn Ile Pro Glu Ala Val Thr Asn Ala Phe Arg Ile Ala Ser 145 150 155 160 Ala Gly Gln Ala Gly Ala Ala Phe Val Ser Phe Pro Gln Asp Val Val 165 170 175 Asn Glu Val Thr Asn Thr Lys Asn Val Arg Ala Val Ala Ala Pro Lys 180 185 190 Leu Gly Pro Ala Ala Asp Asp Ala Ile Ser Ala Ala Ile Ala Lys Ile 195 200 205 Gln Thr Ala Lys Leu Pro Val Val Leu Val Gly Met Lys Gly Gly Arg 210 215 220 Pro Glu Ala Ile Lys Ala Val Arg Lys Leu Leu Lys Lys Val Gln Leu 225 230 235 240 Pro Phe Val Glu Thr Tyr Gln Ala Ala Gly Thr Leu Ser Arg Asp Leu 245 250 255 Glu Asp Gln Tyr Phe Gly Arg Ile Gly Leu Phe Arg Asn Gln Pro Gly 260 265 270 Asp Leu Leu Leu Glu Gln Ala Asp Val Val Leu Thr Ile Gly Tyr Asp 275 280 285 Pro Ile Glu Tyr Asp Pro Lys Phe Trp Asn Ile Asn Gly Asp Arg Thr 290 295 300 Ile Ile His Leu Asp Glu Ile Ile Ala Asp Ile Asp His Ala Tyr Gln 305 310 315 320 Pro Asp Leu Glu Leu Ile Gly Asp Ile Pro Ser Thr Ile Asn His Ile 325 330 335 Glu His Asp Ala Val Lys Val Glu Phe Ala Glu Arg Glu Gln Lys Ile 340 345 350 Leu Ser Asp Leu Lys Gln Tyr Met His Glu Gly Glu Gln Val Pro Ala 355 360 365 Asp Trp Lys Ser Asp Arg Ala His Pro Leu Glu Ile Val Lys Glu Leu 370 375 380 Arg Asn Ala Val Asp Asp His Val Thr Val Thr Cys Asp Ile Gly Ser 385 390 395 400 His Ala Ile Trp Met Ser Arg Tyr Phe Arg Ser Tyr Glu Pro Leu Thr 405 410 415 Leu Met Ile Ser Asn Gly Met Gln Thr Leu Gly Val Ala Leu Pro Trp 420 425 430 Ala Ile Gly Ala Ser Leu Val Lys Pro Gly Glu Lys Val Val Ser Val 435 440 445 Ser Gly Asp Gly Gly Phe Leu Phe Ser Ala Met Glu Leu Glu Thr Ala 450 455 460 Val Arg Leu Lys Ala Pro Ile Val His Ile Val Trp Asn Asp Ser Thr 465 470 475 480 Tyr Asp Met Val Ala Phe Gln Gln Leu Lys Lys Tyr Asn Arg Thr Ser 485 490 495 Ala Val Asp Phe Gly Asn Ile Asp Ile Val Lys Tyr Ala Glu Ser Phe 500 505 510 Gly Ala Thr Gly Leu Arg Val Glu Ser Pro Asp Gln Leu Ala Asp Val 515 520 525 Leu Arg Gln Gly Met Asn Ala Glu Gly Pro Val Ile Ile Asp Val Pro 530 535 540 Val Asp Tyr Ser Asp Asn Ile Asn Leu Ala Ser Asp Lys Leu Pro Lys 545 550 555 560 Glu Phe Gly Glu Leu Met Lys Thr Lys Ala Leu 565 570 <210> 3 <211> 1995 <212> DNA <213> Nicotiana tabacum <400> 3 atggctgctg ctgcagctgc tccatctcca tctttttcta aaaccttgtc ctcctcctct 60 tccaaatctt ctactttgtt gccaagatct actttcccat ttccacatca tccacataag 120 actactccac caccattgca tttgactcca actcatattc actcccaaag aagaagattc 180 accatctcca acgttatttc taccacccaa aaggtttctg aaactcaaaa ggctgaaacc 240 ttcgtttcta gatttgctcc agatgaacct agaaagggtt ctgatgtttt ggttgaagct 300 ttggaaagag aaggtgttac cgatgttttt gcttatccag gtggtgcttc tatggaaatt 360 catcaagctt tgaccagatc ctccatcatt agaaatgttt tgccaagaca tgaacaaggt 420 ggtgttttcg ctgctgaagg ttatgctaga gctactggtt ttccaggtgt atgtattgct 480 acttctggtc caggtgctac taatttggtt tctggtttgg ctgatgcttt gttggattct 540 gttccaatcg ttgctattac tggtcaagtt ccaagaagaa tgattggtac agatgctttc 600 caagaaaccc caattgtcga agttactaga tctattacca agcacaacta cttggttatg 660 gacgttgaag atatcccaag agttgttaga gaagcatttt tcttggctag atctggtaga 720 ccaggtccag ttttgattga tgttccaaag gatatccaac aacaattggt tatcccagat 780 tgggaccaac ctatgagatt gccaggttat atgtctagat tgccaaagtt gccaaacgaa 840 atgttgttag aacaaatcgt cagattgatc tccgaatcta aaaagccagt cttgtatgtt 900 ggtggtggtt gttctcaatc tagtgaagaa ttgagaagat tcgtcgaatt gaccggtatt 960 ccagttgctt ctacattgat gggtttgggt gcttttccaa ctggtgatga attgtctttg 1020 tctatgttgg gtatgcacgg tactgtttat gctaattacg ctgttgattc ctccgatttg 1080 ttgttagctt ttggtgttag attcgatgat agagtcactg gtaagttgga agcttttgct 1140 tctagagcta agatcgttca tatcgacatt gattccgctg aaatcggtaa aaacaagcaa 1200 ccacatgttt ctatttgcgc cgatattaag ttggcattgc aaggtttgaa cagtatcttg 1260 gaatccaaag aaggtaaatt gaagttggac ttctctgctt ggagacaaga attgacagtt 1320 caaaaggtta agtacccatt gaacttcaag actttcggtg atgctattcc accacaatac 1380 gctattcaag ttttggatga attgaccaac ggttccgcta ttatttcaac tggtgttggt 1440 caacatcaaa tgtgggctgc tcaatattac aagtacagaa aacctagaca atggttgact 1500 tctggtggtt taggtgctat gggttttggt ttgccagctg ctattggtgc tgctgttggt 1560 agacctgatg aagttgttgt agatattgat ggtgacggtt ccttcattat gaacgtccaa 1620 gaattggcta ccatcaaggt tgaaaatttg ccagtcaaga tcatgttatt gaacaatcaa 1680 cacttgggta tggtcgtcca atgggaagat agattttaca aagctaatag agcccacacc 1740 tacttgggta atccatctaa tgaagctgaa atcttcccaa acatgttgaa gtttgctgaa 1800 gcttgtggtg ttccagctgc aagagttact catagagatg atttgagagc tgccatccaa 1860 aagatgttgg atactccagg tccatacttg ttggatgtta ttgtcccaca tcaagaacat 1920 gtcttgccaa tgattccatc tggtggtgcc tttaaagatg ttattactga aggtgacggt 1980 agatcctctt actga 1995 <210> 4 <211> 664 <212> PRT <213> Nicotiana tabacum <400> 4 Met Ala Ala Ala Ala Ala Ala Pro Ser Pro Ser Phe Ser Lys Thr Leu 1 5 10 15 Ser Ser Ser Ser Ser Lys Ser Ser Thr Leu Leu Pro Arg Ser Thr Phe 20 25 30 Pro Phe Pro His His Pro His Lys Thr Thr Pro Pro Pro Leu His Leu 35 40 45 Thr Pro Thr His Ile His Ser Gln Arg Arg Arg Phe Thr Ile Ser Asn 50 55 60 Val Ile Ser Thr Thr Gln Lys Val Ser Glu Thr Gln Lys Ala Glu Thr 65 70 75 80 Phe Val Ser Arg Phe Ala Pro Asp Glu Pro Arg Lys Gly Ser Asp Val 85 90 95 Leu Val Glu Ala Leu Glu Arg Glu Gly Val Thr Asp Val Phe Ala Tyr 100 105 110 Pro Gly Gly Ala Ser Met Glu Ile His Gln Ala Leu Thr Arg Ser Ser 115 120 125 Ile Ile Arg Asn Val Leu Pro Arg His Glu Gln Gly Gly Val Phe Ala 130 135 140 Ala Glu Gly Tyr Ala Arg Ala Thr Gly Phe Pro Gly Val Cys Ile Ala 145 150 155 160 Thr Ser Gly Pro Gly Ala Thr Asn Leu Val Ser Gly Leu Ala Asp Ala 165 170 175 Leu Leu Asp Ser Val Pro Ile Val Ala Ile Thr Gly Gln Val Pro Arg 180 185 190 Arg Met Ile Gly Thr Asp Ala Phe Gln Glu Thr Pro Ile Val Glu Val 195 200 205 Thr Arg Ser Ile Thr Lys His Asn Tyr Leu Val Met Asp Val Glu Asp 210 215 220 Ile Pro Arg Val Val Arg Glu Ala Phe Phe Leu Ala Arg Ser Gly Arg 225 230 235 240 Pro Gly Pro Val Leu Ile Asp Val Pro Lys Asp Ile Gln Gln Gln Leu 245 250 255 Val Ile Pro Asp Trp Asp Gln Pro Met Arg Leu Pro Gly Tyr Met Ser 260 265 270 Arg Leu Pro Lys Leu Pro Asn Glu Met Leu Leu Glu Gln Ile Val Arg 275 280 285 Leu Ile Ser Glu Ser Lys Lys Pro Val Leu Tyr Val Gly Gly Gly Cys 290 295 300 Ser Gln Ser Ser Glu Glu Leu Arg Arg Phe Val Glu Leu Thr Gly Ile 305 310 315 320 Pro Val Ala Ser Thr Leu Met Gly Leu Gly Ala Phe Pro Thr Gly Asp 325 330 335 Glu Leu Ser Leu Ser Met Leu Gly Met His Gly Thr Val Tyr Ala Asn 340 345 350 Tyr Ala Val Asp Ser Ser Asp Leu Leu Leu Ala Phe Gly Val Arg Phe 355 360 365 Asp Asp Arg Val Thr Gly Lys Leu Glu Ala Phe Ala Ser Arg Ala Lys 370 375 380 Ile Val His Ile Asp Ile Asp Ser Ala Glu Ile Gly Lys Asn Lys Gln 385 390 395 400 Pro His Val Ser Ile Cys Ala Asp Ile Lys Leu Ala Leu Gln Gly Leu 405 410 415 Asn Ser Ile Leu Glu Ser Lys Glu Gly Lys Leu Lys Leu Asp Phe Ser 420 425 430 Ala Trp Arg Gln Glu Leu Thr Val Gln Lys Val Lys Tyr Pro Leu Asn 435 440 445 Phe Lys Thr Phe Gly Asp Ala Ile Pro Pro Gln Tyr Ala Ile Gln Val 450 455 460 Leu Asp Glu Leu Thr Asn Gly Ser Ala Ile Ile Ser Thr Gly Val Gly 465 470 475 480 Gln His Gln Met Trp Ala Ala Gln Tyr Tyr Lys Tyr Arg Lys Pro Arg 485 490 495 Gln Trp Leu Thr Ser Gly Gly Leu Gly Ala Met Gly Phe Gly Leu Pro 500 505 510 Ala Ala Ile Gly Ala Ala Val Gly Arg Pro Asp Glu Val Val Val Asp 515 520 525 Ile Asp Gly Asp Gly Ser Phe Ile Met Asn Val Gln Glu Leu Ala Thr 530 535 540 Ile Lys Val Glu Asn Leu Pro Val Lys Ile Met Leu Leu Asn Asn Gln 545 550 555 560 His Leu Gly Met Val Val Gln Trp Glu Asp Arg Phe Tyr Lys Ala Asn 565 570 575 Arg Ala His Thr Tyr Leu Gly Asn Pro Ser Asn Glu Ala Glu Ile Phe 580 585 590 Pro Asn Met Leu Lys Phe Ala Glu Ala Cys Gly Val Pro Ala Ala Arg 595 600 605 Val Thr His Arg Asp Asp Leu Arg Ala Ala Ile Gln Lys Met Leu Asp 610 615 620 Thr Pro Gly Pro Tyr Leu Leu Asp Val Ile Val Pro His Gln Glu His 625 630 635 640 Val Leu Pro Met Ile Pro Ser Gly Gly Ala Phe Lys Asp Val Ile Thr 645 650 655 Glu Gly Asp Gly Arg Ser Ser Tyr 660 <210> 5 <211> 1746 <212> DNA <213> Paenibacillus polymyxa <400> 5 atgtccgcac aaatacctga agttagaagt acaaatgaat tgagagaaaa atggatgaag 60 cctgaagtaa tcactggttc cgaaatattg ttaagatcat tgttattgga aggtgtcgat 120 tgtgtatttg gttatccagg tggtgctgtc ttgtacatct atgatgcaat gtacggtttt 180 aaagacttca agcatgtttt aaccagacac gaacaaggtg ctatacatgc tgcagatggt 240 tatgccagag cttccggtaa agtaggtgtt tgcatcgcaa caagtggtcc aggtgccacc 300 aatttggtta ctggtatcgc aacagccttt atggattctg ttcctttggt tgtcattact 360 ggtaacgtca tttcttcatt aatcggtaca gatgcattcc aagaagccga cataactggt 420 atcacaatgc caataactaa gcactcatat ttggttagag atgtcgaaga cttgcctaga 480 ataatccatg aagcatttca catagcaaat acaggtagaa agggtccagt tttgatagat 540 atccctaaag acatatccgc cgctcaaacc ttattcgtac cacaaaccgg tcctgttact 600 atgagaggtt acaacccaaa ggttttgcct aacaagatac aattggataa attgacacaa 660 gccatctccg aagctgaaag accattcatt ttggcaggtg gtggtgtagt ttatagtggt 720 ggtcatgaag ccttatacga atttgttaga aagactgaaa tccctatcac tacaacctta 780 ttgggtttag gtggtttccc atcaggtcat gaattgtgga ctggtatgcc tggtatgcac 840 ggtacataca cctccaatca agcaatacaa caatctgatt tgttgatctg tattggtgct 900 agatttgatg acagagttac tggtaaattg gatggtttcg caccacaagc caaaattgta 960 catatagata tcgaccctgc agaaataggt aaaaatgttg cagccgatat tccaatagta 1020 ggtgacgtta aggctgtctt agaattattg aaccaagatg ttaagagagc cgatagagct 1080 gacgcatgga gagcacaaat ccaacattgg aagaacgaaa agccatattc ctacaaggat 1140 agtgaaacag ttttgaaacc tcaatgggtc gtagaattat tggatgaaac tacaaagggt 1200 ggtgctattg tcaccactga cgtaggtcaa caccaaatgt gggctgcaca atactacaag 1260 tttaatcaac caagatcatg ggttacatca ggtggtttag gtactatggg ttttggtttc 1320 ccatctgcta ttggtgcaca aatggccaat cctgatagat tggttatctc tattaacggt 1380 gacggtggta tgcaaatgtg ttcacaagaa ttagctattt gcgctattaa taacatccca 1440 gtaaagatcg ttatcattaa taaccaagtt ttgggtatgg tcagacaatg gcaagaattg 1500 atctataaca acagatactc tcatattgat ttggctggtt cacctgactt tgtcaaattg 1560 gccgaagcct atggtgtaaa gggtttaaga gcaaccaata aggaagaagc cagaagagct 1620 tggcaagaag cattggatac tccaggtcct gttgtcgtag aatttgttgt ctctaaagaa 1680 gaaaacgttt atccaatggt tacacaaggt tccacaatag accaaatgtt gatgggtgac 1740 gaatga 1746 <210> 6 <211> 581 <212> PRT <213> Paenibacillus polymyxa <400> 6 Met Ser Ala Gln Ile Pro Glu Val Arg Ser Thr Asn Glu Leu Arg Glu 1 5 10 15 Lys Trp Met Lys Pro Glu Val Ile Thr Gly Ser Glu Ile Leu Leu Arg 20 25 30 Ser Leu Leu Leu Glu Gly Val Asp Cys Val Phe Gly Tyr Pro Gly Gly 35 40 45 Ala Val Leu Tyr Ile Tyr Asp Ala Met Tyr Gly Phe Lys Asp Phe Lys 50 55 60 His Val Leu Thr Arg His Glu Gln Gly Ala Ile His Ala Ala Asp Gly 65 70 75 80 Tyr Ala Arg Ala Ser Gly Lys Val Gly Val Cys Ile Ala Thr Ser Gly 85 90 95 Pro Gly Ala Thr Asn Leu Val Thr Gly Ile Ala Thr Ala Phe Met Asp 100 105 110 Ser Val Pro Leu Val Val Ile Thr Gly Asn Val Ile Ser Ser Leu Ile 115 120 125 Gly Thr Asp Ala Phe Gln Glu Ala Asp Ile Thr Gly Ile Thr Met Pro 130 135 140 Ile Thr Lys His Ser Tyr Leu Val Arg Asp Val Glu Asp Leu Pro Arg 145 150 155 160 Ile Ile His Glu Ala Phe His Ile Ala Asn Thr Gly Arg Lys Gly Pro 165 170 175 Val Leu Ile Asp Ile Pro Lys Asp Ile Ser Ala Ala Gln Thr Leu Phe 180 185 190 Val Pro Gln Thr Gly Pro Val Thr Met Arg Gly Tyr Asn Pro Lys Val 195 200 205 Leu Pro Asn Lys Ile Gln Leu Asp Lys Leu Thr Gln Ala Ile Ser Glu 210 215 220 Ala Glu Arg Pro Phe Ile Leu Ala Gly Gly Gly Val Val Tyr Ser Gly 225 230 235 240 Gly His Glu Ala 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Leu Val Ile Ser Ile Asn Gly Asp Gly Gly Met 450 455 460 Gln Met Cys Ser Gln Glu Leu Ala Ile Cys Ala Ile Asn Asn Ile Pro 465 470 475 480 Val Lys Ile Val Ile Ile Asn Asn Gln Val Leu Gly Met Val Arg Gln 485 490 495 Trp Gln Glu Leu Ile Tyr Asn Asn Arg Tyr Ser His Ile Asp Leu Ala 500 505 510 Gly Ser Pro Asp Phe Val Lys Leu Ala Glu Ala Tyr Gly Val Lys Gly 515 520 525 Leu Arg Ala Thr Asn Lys Glu Glu Ala Arg Arg Ala Trp Gln Glu Ala 530 535 540 Leu Asp Thr Pro Gly Pro Val Val Val Glu Phe Val Val Ser Lys Glu 545 550 555 560 Glu Asn Val Tyr Pro Met Val Thr Gln Gly Ser Thr Ile Asp Gln Met 565 570 575 Leu Met Gly Asp Glu 580 <210> 7 <211> 860 <212> DNA <213> Brevibacillus brevis <400> 7 atgggtaaga agaacattat tacctctatc acctccttgg ctttggttgc tggtttgtct 60 ttgactgctt ttgctgctac tactgctact gttccagctc caccagctaa acaagaatct 120 aaaccagctg ttgctgctaa tccagctcct aagaatgttt tgttccaata ctctaccatc 180 aacgccttga tgttgggtca atttgaaggt gatttgacct tgaaggactt gaagttgaga 240 ggtgatatgg gtttgggtac tatcaatgat ttggacggtg aaatgatcca aatgggtact 300 aagttctacc aaatcgattc taccggtaag ttgtctgaat tgccagaatc tgttaagact 360 ccattcgctg ttactactca cttcgaacct aaagaaaaga ctaccttgac caacgtccaa 420 gactacaatc aattgaccaa gatgttggaa gaaaagttcg aaaacaagaa cgttttctac 480 gccgttaagt tgactggtac tttcaaaatg gttaaggcta gaaccgttcc taagcaaact 540 agaccatatc cacaattgac tgaagtcacc aagaagcaat ccgaatttga attcaagaac 600 gtcaagggta ctttgatcgg tttttacact ccaaattatg ctgctgcttt gaacgttcca 660 ggttttcact tgcatttcat taccgaagat aagacctctg gtggtcatgt tttgaacttg 720 caatttgata acgccaactt ggaaatctcc ccaatccatg aatttgatgt tcaattgcca 780 cacaccgatg atttcgctca ttctgatttg actcaagtta ctacctccca agttcatcaa 840 gctgaatctg aaagaaagta 860 <210> 8 <211> 286 <212> PRT <213> Brevibacillus brevis <400> 8 Met Gly Lys Lys Asn Ile Ile Thr Ser Ile Thr Ser Leu Ala Leu Val 1 5 10 15 Ala Gly Leu Ser Leu Thr Ala Phe Ala Ala Thr Thr Ala Thr Val Pro 20 25 30 Ala Pro Pro Ala Lys Gln Glu Ser Lys Pro Ala Val Ala Ala Asn Pro 35 40 45 Ala Pro Lys Asn Val Leu 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tcca 354 <210> 36 <211> 299 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> tTPI1 <400> 36 gattaatata attatataaa aatattatct tcttttcttt atatctagtg ttatgtaaaa 60 taaattgatg actacggaaa gcttttttat attgtttctt tttcattctg agccacttaa 120 atttcgtgaa tgttcttgta agggacggta gatttacaag tgatacaaca aaaagcaagg 180 cgctttttct aataaaaaga agaaaagcat ttaacaattg aacacctcta tatcaacgaa 240 gaatattact ttgtctctaa atccttgtaa aatgtgtacg atctctatat gggttactc 299 <210> 37 <211> 299 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> tMET25 <400> 37 gtgtgcgtaa tgagttgtaa aattatgtat aaacctactt tctctcacaa gtactatact 60 tttataaaac gaactttatt gaaatgaata tccttttttt cccttgttac atgtcgtgac 120 tcgtactttg aacctaaatt gttctaacat caaagaacag tgttaattcg cagtcgagaa 180 gaaaaatatg gtgaacaaga ctcatctact tcatgagact actttacgcc tcctataaag 240 ctgtcacact ggataaattt attgtaggac caagttacaa aagaggatga tggaggttt 299 <210> 38 <211> 305 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> tENO2 <400> 38 ggatcctaaa gtgcttttaa ctaagaatta ttagtctttt 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attattaaga tttttattaa aaaaaaattc gctcctcttt 180 taatgccttt atgcagtttt tttttcccat tcgatatttc tatgttcggg ttcagcgtat 240 tttaagttta ataactcgaa aattctgcgt tcgttaaagc tttcgagaag gatattattt 300 a 301 <210> 41 <211> 700 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> pPYK1 <400> 41 aaaaggaaag attattgaaa gagaaagaaa gaaaaaaaaa aaatgtacac ccagacatcg 60 ggcttccaca atttcggctc tattgttttc catctctcgc aacggcggga ttcctctatg 120 gcgtgtgatg tctgtatctg ttacttaatc cagaaactgg cacttgaccc aactctgcca 180 cgtgggtcgt tttgccatcg acagattggg agattttcat agtagaattc agcatgatag 240 ctacgtaaat gtgttccgca ccgtcacaaa gtgttttcta ctgttctttc ttctttcgtt 300 cattcagttg agttgagtga gtgctttgtt caatggatct tagctaaaat gcatattttt 360 tctcttggta aatgaatgct tgtgatgtct tccaagtgat ttcctttcct tcccatatga 420 tgctaggtac ctttagtgtc ttcctaaaaa aaaaaaaagg ctcgccatca aaacgatatt 480 cgttggcttt tttttctgaa ttataaatac tctttggtaa cttttcattt ccaagaacct 540 cttttttcca gttatatcat ggtccccttt caaagttatt ctctactctt tttcatattc 600 attctttttc atcctttggt tttttattct taacttgttt attattctct cttgtttcta 660 tttacaagac accaatcaaa acaaataaaa catcatcaca 700 <210> 42 <211> 500 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> pTPI1 <400> 42 atttaaactg tgaggacctt aatacattca gacacttctg cggtatcacc ctacttattc 60 ccttcgagat tatatctagg aacccatcag gttggtggaa gattacccgt tctaagactt 120 ttcagcttcc tctattgatg ttacacctgg acaccccttt tctggcatcc agtttttaat 180 cttcagtggc atgtgagatt ctccgaaatt aattaaagca atcacacaat tctctcggat 240 accacctcgg ttgaaactga caggtggttt gttacgcatg ctaatgcaaa ggagcctata 300 tacctttggc tcggctgctg taacagggaa tataaagggc agcataattt aggagtttag 360 tgaacttgca acatttacta ttttcccttc ttacgtaaat atttttcttt ttaattctaa 420 atcaatcttt ttcaattttt tgtttgtatt cttttcttgc ttaaatctat aactacaaaa 480 aacacataca taaactaaaa 500 <210> 43 <211> 300 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> tDIT1 <400> 43 taaagtaaga gcgctacatt ggtctacctt tttgttcttt tacttaaaca ttagttagtt 60 cgttttcttt ttctcatttt tttatgtttc ccccccaaag ttctgatttt ataatatttt 120 atttcacaca attccattta acagaggggg aatagattct ttagcttaga aaattagtga 180 tcaatatata tttgcctttc ttttcatctt ttcagtgata ttaatggttt cgagacactg 240 caatggccct agttgtctaa gaggatagat gttactgtca aagatgatat tttgaatttc 300 300 <210> 44 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> loxP <400> 44 ataacttcgt ataatgtatg ctatacgaag tta 33 <210> 45 <211> 2085 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> nucleic acid HAA-1 <400> 45 atggtcttga taaatggcat aaagtatgcc tgtgagaggt gcataagagg ccatagagta 60 acaacatgca atcatacaga tcaaccgctt atgatgatca aacccaaagg tagaccttcc 120 actacatgcg actattgtaa acaacttcga aaaaacaaga atgcaaatcc tgaaggtgtt 180 tgcacgtgtg gccggctaga gaagaaaaaa ctggcacaga aagccaaaga agaagcaaga 240 gctaaagcca aagaaaaaca aagaaaacag tgtacctgcg ggactgatga ggtttgcaaa 300 tatcatgctc aaaagagaca tctaagaaag tccccttcaa gttctcaaaa gaaaggaaga 360 tccatttctc gttctcaacc aatgtttgaa agggtattgt cttctacttc acttgacagc 420 aatatgttat ccggccacgg agcactatca gatacctcta gcatactgac gagcacattt 480 ttagacagtg agccgggtgt tggtaaaatt tcaaaagatt accatcatgt cccttcattg 540 gcctccattt catccttaca atcctcgcaa tcgttagatc aaaatttcag tataccacaa 600 agcccgccgt tatcttcaat gtcatttaat tttctcacgg gaaatatcaa tgaaaccaac 660 caaaatcaca gtaatcatca gcattcaaaa tcaggcaata actggcaaga tagttcggta 720 agcttgccag cgaaagctga ttcacgtctt aacatgatgg ataaaaacaa ctctgtgggt 780 cttgacctat taggccattc aaaacgaata tcgccgatat caaactctcg tgtgggcgaa 840 gttagcgttc cgctagaaga atatattcct tctgacattg atggggttgg aagagttact 900 gataaaagct ctttggtcta cgattggcca tttgatgaaa gtattgagag aaatttcagt 960 acaaccgcaa ccgctgcaac tggtgaaagt aagttcgaca ttaacgacaa ctgtaataga 1020 attaatagca aaagttatag taagactaat agtatgaatg gaaacggtat gaacaatagc 1080 aataataata atatcaacag taatggcaac gacaagaaca ataacaactc ttctagacaa 1140 gaacatcaag gaaatggact atttgacatg tttacagatt catcgtcgat ttcaacgctt 1200 tcccgtgcaa acttattatt gcaagaaaaa attggttcgc aagaaaactc tgtcaaacaa 1260 gaaaactatt cgaaaaatcc tcaacttcgt catcaattaa cttccagaag tagatcattt 1320 attcatcatc cggcaaacga gtatttgaag aatacttttg gaaattcaca tagtaatgac 1380 atcggaaagg gagttgaagt gctatctttg acaccgagtt ttatggatat tcccgaaaaa 1440 gaaagagaaa cggaaagatc gccatcatcc aattacatta ctgacagacc tttcactcga 1500 aaacctagat cttctagcat tgacgtaaac cataggtatc cacctatggc accaacaacc 1560 gtagcgacat ctcccggtgc attgaacaat gccgtagcaa gcaatctcga cgatcaactg 1620 agtttaacat cactaaactc tcagccatca tcgatagcaa atatgatgat ggacccttca 1680 aacctagctg agcaaagttc tattcattca gttcctcagt caataaactc tccgagaatg 1740 cctaaaactg gaagtcgcca agacaagaac attcacacta agaaggaaga aagaaatccg 1800 ctaaataaca tacacgatct gtcacaattg gaaaatgtac cagacgagat gaaccaaatg 1860 ttctccccac cattaaaaag tatgaataga ccggatgcca taagggaaaa ttcatctagt 1920 agtaatttca taatccaagg aaatagcatg atctctacgc cttccggaag gaatgacctt 1980 ccagatacct ctccaatgag tagtattcaa acagcgtcac caccaagtca attactgacc 2040 gatcaaggat ttgcggattt ggataatttc atgtcttcgt tatga 2085 <210> 46 <211> 694 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> amino acid HAA-1 <400> 46 Met Val Leu Ile Asn Gly Ile Lys Tyr Ala Cys Glu Arg Cys Ile Arg 1 5 10 15 Gly His Arg Val Thr Thr Cys Asn His Thr Asp Gln Pro Leu Met Met 20 25 30 Ile Lys Pro Lys Gly Arg Pro Ser Thr Thr Cys Asp Tyr Cys Lys Gln 35 40 45 Leu Arg Lys Asn Lys Asn Ala Asn Pro Glu Gly Val Cys Thr Cys Gly 50 55 60 Arg Leu Glu Lys Lys Lys Leu Ala Gln Lys Ala Lys Glu Glu Ala Arg 65 70 75 80 Ala Lys Ala Lys Glu Lys Gln Arg Lys Gln Cys Thr Cys Gly Thr Asp 85 90 95 Glu Val Cys Lys Tyr His Ala Gln Lys Arg His Leu Arg Lys Ser Pro 100 105 110 Ser Ser Ser Gln Lys Lys Gly Arg Ser Ile Ser Arg Ser Gln Pro Met 115 120 125 Phe Glu Arg Val Leu Ser Ser Thr Ser Leu Asp Ser Asn Met Leu Ser 130 135 140 Gly His Gly Ala Leu Ser Asp Thr Ser Ser Ile Leu Thr Ser Thr Phe 145 150 155 160 Leu Asp Ser Glu Pro Gly Val Gly Lys Ile Ser Lys Asp Tyr His His 165 170 175 Val Pro Ser Leu Ala Ser Ile Ser Ser Leu Gln Ser Ser Gln Ser Leu 180 185 190 Asp Gln Asn Phe Ser Ile Pro Gln Ser Pro Pro Leu Ser Ser Met Ser 195 200 205 Phe Asn Phe Leu Thr Gly Asn Ile Asn Glu Thr Asn Gln Asn His Ser 210 215 220 Asn His Gln His Ser Lys Ser Gly Asn Asn Trp Gln Asp Ser Ser Val 225 230 235 240 Ser Leu Pro Ala Lys Ala Asp Ser Arg Leu Asn Met Met Asp Lys Asn 245 250 255 Asn Ser Val Gly Leu Asp Leu Leu Gly His Ser Lys Arg Ile Ser Pro 260 265 270 Ile Ser Asn Ser Arg Val Gly Glu Val Ser Val Pro Leu Glu Glu Tyr 275 280 285 Ile Pro Ser Asp Ile Asp Gly Val Gly Arg Val Thr Asp Lys Ser Ser 290 295 300 Leu Val Tyr Asp Trp Pro Phe Asp Glu Ser Ile Glu Arg Asn Phe Ser 305 310 315 320 Thr Thr Ala Thr Ala Ala Thr Gly Glu Ser Lys Phe Asp Ile Asn Asp 325 330 335 Asn Cys Asn Arg Ile Asn Ser Lys Ser Tyr Ser Lys Thr Asn Ser Met 340 345 350 Asn Gly Asn Gly Met Asn Asn Ser Asn Asn Asn Asn Ile Asn Ser Asn 355 360 365 Gly Asn Asp Lys Asn Asn Asn Asn Ser Ser Arg Gln Glu His Gln Gly 370 375 380 Asn Gly Leu Phe Asp Met Phe Thr Asp Ser Ser Ser Ile Ser Thr Leu 385 390 395 400 Ser Arg Ala Asn Leu Leu Leu Gln Glu Lys Ile Gly Ser Gln Glu Asn 405 410 415 Ser Val Lys Gln Glu Asn Tyr Ser Lys Asn Pro Gln Leu Arg His Gln 420 425 430 Leu Thr Ser Arg Ser Arg Ser Phe Ile His His Pro Ala Asn Glu Tyr 435 440 445 Leu Lys Asn Thr Phe Gly Asn Ser His Ser Asn Asp Ile Gly Lys Gly 450 455 460 Val Glu Val Leu Ser Leu Thr Pro Ser Phe Met Asp Ile Pro Glu Lys 465 470 475 480 Glu Arg Glu Thr Glu Arg Ser Pro Ser Ser Asn Tyr Ile Thr Asp Arg 485 490 495 Pro Phe Thr Arg Lys Pro Arg Ser Ser Ser Ile Asp Val Asn His Arg 500 505 510 Tyr Pro Pro Met Ala Pro Thr Thr Val Ala Thr Ser Pro Gly Ala Leu 515 520 525 Asn Asn Ala Val Ala Ser Asn Leu Asp Asp Gln Leu Ser Leu Thr Ser 530 535 540 Leu Asn Ser Gln Pro Ser Ser Ile Ala Asn Met Met Met Asp Pro Ser 545 550 555 560 Asn Leu Ala Glu Gln Ser Ser Ile His Ser Val Pro Gln Ser Ile Asn 565 570 575 Ser Pro Arg Met Pro Lys Thr Gly Ser Arg Gln Asp Lys Asn Ile His 580 585 590 Thr Lys Lys Glu Glu Arg Asn Pro Leu Asn Asn Ile His Asp Leu Ser 595 600 605 Gln Leu Glu Asn Val Pro Asp Glu Met Asn Gln Met Phe Ser Pro Pro 610 615 620 Leu Lys Ser Met Asn Arg Pro Asp Ala Ile Arg Glu Asn Ser Ser Ser 625 630 635 640 Ser Asn Phe Ile Ile Gln Gly Asn Ser Met Ile Ser Thr Pro Ser Gly 645 650 655 Arg Asn Asp Leu Pro Asp Thr Ser Pro Met Ser Ser Ile Gln Thr Ala 660 665 670 Ser Pro Pro Ser Gln Leu Leu Thr Asp Gln Gly Phe Ala Asp Leu Asp 675 680 685 Asn Phe Met Ser Ser Leu 690 <210> 47 <211> 1089 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> nucleic acids LEU2.Kl <400> 47 atgtctaaga atatcgttgt cctaccgggt gatcacgtcg gtaaagaagt tactgacgaa 60 gctattaagg tcttgaatgc cattgctgaa gtccgtccag aaattaagtt caatttccaa 120 catcacttga tcgggggtgc tgccatcgat gccactggca ctcctttacc agatgaagct 180 ctagaagcct ctaagaaagc cgatgctgtc ttactaggtg ctgttggtgg tccaaaatgg 240 ggtacgggcg cagttagacc agaacaaggt ctattgaaga tcagaaagga attgggtcta 300 tacgccaact tgagaccatg taactttgct tctgattctt tactagatct ttctcctttg 360 aagcctgaat atgcaaaggg taccgatttc gtcgtcgtta gagaattggt tggtggtatc 420 tactttggtg aaagaaaaga agatgaaggt gacggagttg cttgggactc tgagaaatac 480 agtgttcctg aagttcaaag aattacaaga atggctgctt tcttggcatt gcaacaaaac 540 ccaccattac caatctggtc tcttgacaag gctaacgtgc ttgcctcttc cagattgtgg 600 agaaagactg ttgaagaaac catcaagact gagttcccac aattaactgt tcagcaccaa 660 ttgatcgact ctgctgctat gattttggtt aaatcaccaa ctaagctaaa cggtgttgtt 720 attaccaaca acatgtttgg tgatattatc tccgatgaag cctctgttat tccaggttct 780 ttgggtttat taccttctgc atctctagct tccctacctg acactaacaa ggcattcggt 840 ttgtacgaac catgtcatgg ttctgcccca gatttaccag caaacaaggt taacccaatt 900 gctaccatct tatctgcagc tatgatgttg aagttatcct tggatttggt tgaagaaggt 960 agggctcttg aagaagctgt tagaaatgtc ttggatgcag gtgtcagaac cggtgacctt 1020 ggtggttcta actctaccac tgaggttggc gatgctatcg ccaaggctgt caaggaaatc 1080 ttggcttaa 1089 <210> 48 <211> 362 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> amino acid LEU2.Kl <400> 48 Met Ser Lys Asn Ile Val Val Leu Pro Gly Asp His Val Gly Lys Glu 1 5 10 15 Val Thr Asp Glu Ala Ile Lys Val Leu Asn Ala Ile Ala Glu Val Arg 20 25 30 Pro Glu Ile Lys Phe Asn Phe Gln His His Leu Ile Gly Gly Ala Ala 35 40 45 Ile Asp Ala Thr Gly Thr Pro Leu Pro Asp Glu Ala Leu Glu Ala Ser 50 55 60 Lys Lys Ala Asp Ala Val Leu Leu Gly Ala Val Gly Gly Pro Lys Trp 65 70 75 80 Gly Thr Gly Ala Val Arg Pro Glu Gln Gly Leu Leu Lys Ile Arg Lys 85 90 95 Glu Leu Gly Leu Tyr Ala Asn Leu Arg Pro Cys Asn Phe Ala Ser Asp 100 105 110 Ser Leu Leu Asp Leu Ser Pro Leu Lys Pro Glu Tyr Ala Lys Gly Thr 115 120 125 Asp Phe Val Val Val Arg Glu Leu Val Gly Gly Ile Tyr Phe Gly Glu 130 135 140 Arg Lys Glu Asp Glu Gly Asp Gly Val Ala Trp Asp Ser Glu Lys Tyr 145 150 155 160 Ser Val Pro Glu Val Gln Arg Ile Thr Arg Met Ala Ala Phe Leu Ala 165 170 175 Leu Gln Gln Asn Pro Pro Leu Pro Ile Trp Ser Leu Asp Lys Ala Asn 180 185 190 Val Leu Ala Ser Ser Arg Leu Trp Arg Lys Thr Val Glu Glu Thr Ile 195 200 205 Lys Thr Glu Phe Pro Gln Leu Thr Val Gln His Gln Leu Ile Asp Ser 210 215 220 Ala Ala Met Ile Leu Val Lys Ser Pro Thr Lys Leu Asn Gly Val Val 225 230 235 240 Ile Thr Asn Asn Met Phe Gly Asp Ile Ile Ser Asp Glu Ala Ser Val 245 250 255 Ile Pro Gly Ser Leu Gly Leu Leu Pro Ser Ala Ser Leu Ala Ser Leu 260 265 270 Pro Asp Thr Asn Lys Ala Phe Gly Leu Tyr Glu Pro Cys His Gly Ser 275 280 285 Ala Pro Asp Leu Pro Ala Asn Lys Val Asn Pro Ile Ala Thr Ile Leu 290 295 300 Ser Ala Ala Met Met Leu Lys Leu Ser Leu Asp Leu Val Glu Glu Gly 305 310 315 320 Arg Ala Leu Glu Glu Ala Val Arg Asn Val Leu Asp Ala Gly Val Arg 325 330 335 Thr Gly Asp Leu Gly Gly Ser Asn Ser Thr Thr Glu Val Gly Asp Ala 340 345 350 Ile Ala Lys Ala Val Lys Glu Ile Leu Ala 355 360 <210> 49 <211> 654 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> nucleic acid His 5 <400> 49 atgggtagga gggcttttgt agaaagaaat acgaacgaaa cgaaaatcag cgttgccatc 60 gctttggaca aagctccctt acctgaagag tcgaatttta ttgatgaact tataacttcc 120 aagcatgcaa accaaaaggg agaacaagta atccaagtag acacgggaat tggattcttg 180 gatcacatgt atcatgcact ggctaaacat gcaggctgga gcttacgact ttactcaaga 240 ggtgatttaa tcatcgatga tcatcacact gcagaagata ctgctattgc acttggtatt 300 gcattcaagc aggctatggg taactttgcc ggcgttaaaa gatttggaca tgcttattgt 360 ccacttgacg aagctctttc tagaagcgta gttgacttgt cgggacggcc ctatgctgtt 420 atcgatttgg gattaaagcg tgaaaaggtt ggggaattgt cctgtgaaat gatccctcac 480 ttactatatt ccttttcggt agcagctgga attactttgc atgttacctg cttatatggt 540 agtaatgacc atcatcgtgc tgaaagcgct tttaaatctc tggctgttgc catgcgcgcg 600 gctactagtc ttactggaag ttctgaagtc ccaagcacga agggagtgtt gtaa 654 <210> 50 <211> 217 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> amino acid His 5 <400> 50 Met Gly Arg Arg Ala Phe Val Glu Arg Asn Thr Asn Glu Thr Lys Ile 1 5 10 15 Ser Val Ala Ile Ala Leu Asp Lys Ala Pro Leu Pro Glu Glu Ser Asn 20 25 30 Phe Ile Asp Glu Leu Ile Thr Ser Lys His Ala Asn Gln Lys Gly Glu 35 40 45 Gln Val Ile Gln Val Asp Thr Gly Ile Gly Phe Leu Asp His Met Tyr 50 55 60 His Ala Leu Ala Lys His Ala Gly Trp Ser Leu Arg Leu Tyr Ser Arg 65 70 75 80 Gly Asp Leu Ile Ile Asp Asp His His Thr Ala Glu Asp Thr Ala Ile 85 90 95 Ala Leu Gly Ile Ala Phe Lys Gln Ala Met Gly Asn Phe Ala Gly Val 100 105 110 Lys Arg Phe Gly His Ala Tyr Cys Pro Leu Asp Glu Ala Leu Ser Arg 115 120 125 Ser Val Val Asp Leu Ser Gly Arg Pro Tyr Ala Val Ile Asp Leu Gly 130 135 140 Leu Lys Arg Glu Lys Val Gly Glu Leu Ser Cys Glu Met Ile Pro His 145 150 155 160 Leu Leu Tyr Ser Phe Ser Val Ala Ala Gly Ile Thr Leu His Val Thr 165 170 175 Cys Leu Tyr Gly Ser Asn Asp His His Arg Ala Glu Ser Ala Phe Lys 180 185 190 Ser Leu Ala Val Ala Met Arg Ala Ala Thr Ser Leu Thr Gly Ser Ser 195 200 205 Glu Val Pro Ser Thr Lys Gly Val Leu 210 215 <210> 51 <211> 633 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> nucleic acid Trp1 kl <400> 51 atgctcgtta aagtgtgtgg tttgcaaacc gttgaagctg caaagactgc tgtggatgat 60 ggtgctgatt acttaggtat catttgtgtt cccggtagga aaagaaccat tgactcatct 120 gttgcgaaag gtatttcaac tgcagttcac caacaagaga acgtgaaagg tactaaacta 180 gtcggggtgt ttagaaatca gtccgttgat gatgtccttc aactgtacca cgaatataat 240 ctagatgtga tacaattaca tggagatgaa gatattaaag aatacagatc tttgatccca 300 tcttcaattc caatcattaa gaggttccag ttcccacagg attgtgaatt actactggac 360 ctgtatgaac acgtagacaa tgtgctgacg ttgttcgatt ctggtgaagg tggcactggt 420 gagaaattga attggagtgc aatttccagt tggtctgcaa gtcatcccga gataaaattc 480 attatcgctg gtggattgaa tcctgataac gtttctgttg ccattaatat gttaccaaat 540 gcgatcggtg tcgatgtaag tggaggagta gagactgatg gtatcaagga tttagaaaag 600 gtaaagctat tcatccagca ggcctctcaa tag 633 <210> 52 <211> 210 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> amino acid Trp1 Kl <400> 52 Met Leu Val Lys Val Cys Gly Leu Gln Thr Val Glu Ala Ala Lys Thr 1 5 10 15 Ala Val Asp Asp Gly Ala Asp Tyr Leu Gly Ile Ile Cys Val Pro Gly 20 25 30 Arg Lys Arg Thr Ile Asp Ser Ser Val Ala Lys Gly Ile Ser Thr Ala 35 40 45 Val His Gln Gln Glu Asn Val Lys Gly Thr Lys Leu Val Gly Val Phe 50 55 60 Arg Asn Gln Ser Val Asp Asp Val Leu Gln Leu Tyr His Glu Tyr Asn 65 70 75 80 Leu Asp Val Ile Gln Leu His Gly Asp Glu Asp Ile Lys Glu Tyr Arg 85 90 95 Ser Leu Ile Pro Ser Ser Ile Pro Ile Ile Lys Arg Phe Gln Phe Pro 100 105 110 Gln Asp Cys Glu Leu Leu Leu Asp Leu Tyr Glu His Val Asp Asn Val 115 120 125 Leu Thr Leu Phe Asp Ser Gly Glu Gly Gly Thr Gly Glu Lys Leu Asn 130 135 140 Trp Ser Ala Ile Ser Ser Trp Ser Ala Ser His Pro Glu Ile Lys Phe 145 150 155 160 Ile Ile Ala Gly Gly Leu Asn Pro Asp Asn Val Ser Val Ala Ile Asn 165 170 175 Met Leu Pro Asn Ala Ile Gly Val Asp Val Ser Gly Gly Val Glu Thr 180 185 190 Asp Gly Ile Lys Asp Leu Glu Lys Val Lys Leu Phe Ile Gln Gln Ala 195 200 205 Ser Gln 210

Claims (25)

  1. 감소된 피루베이트 디카복실라제 활성을 갖고, 사카로마이세스 세레비지아 (Saccharomyces cerevisiae) 종에 속하는 재조합 효모로서, 이의 게놈에
    아세토락테이트 신타제를 코딩하는 핵산(ALS) 1 이상,
    아세토락테이트 디카복실라제를 코딩하는 핵산(ALD) 1 이상, 및
    NADH 옥시다제를 코딩하는 핵산(NOXE)의 1 이상의 카피
    가 삽입된 것인 재조합 효모.
  2. 제1항에 있어서, 상기 재조합 효모는 하기 식을 포함하는 군에서 선택된 하나 이상의 DNA 구성체를 포함하는 재조합 효모:
    (I) 하기를 포함하는 DNA 구성체:
    [유전자 1]x1을 포함하는 제1 DNA 하위-구성체 및
    [유전자 2]x2를 포함하는 제2 DNA 하위-구성체 및
    [유전자 3]x3을 포함하는 제3 DNA 하위-구성체,
    (II) 하기를 포함하는 DNA 구성체:
    [유전자 1]x1-[유전자 2]x2를 포함하는 제1 DNA 하위-구성체 및
    [유전자 3]x3을 포함하는 제2 DNA 하위-구성체,
    (IIa) 하기를 포함하는 DNA 구성체:
    [prom5y1-유전자 1-term5]x5-[prom1-유전자 1-term1]x1-[prom2-유전자 2-term2z1]x2를 포함하는 제1 DNA 하위-구성체 및
    [prom3y2-유전자 3-term3]x3을 포함하는 제2 DNA 하위-구성체, 및
    (IIb) 하기를 포함하는 DNA 구성체:
    [prom5y1-ALS-term5]x5-[prom1-ALS-term1]x1-[prom2-ALD-term2z1]x2를 포함하는 제1 DNA 하위-구성체 및
    [prom3y2-NOXE-term3z2]x3을 포함하는 제2 DNA 하위-구성체, 및
    (III) [유전자 1]x1-[유전자 2]x2-[유전자 3]x3을 포함하는 DNA 하위-구성체
    (상기 식에서,
    "유전자 1"은 ALS, ALD 또는 NOXE를 포함하는 군에서 선택된 핵산이고;
    "유전자 2"는 ALS, ALD 또는 NOXE를 포함하는 군에서 선택되지만 유전자 1과 상이한 핵산이고;
    "유전자 3"은 ALS, ALD 또는 NOXE를 포함하는 군에서 선택되지만 유전자 1 및 2와 상이한 핵산이고;
    "x1", "x2" 및 "x3"은 각각 1 내지 50 범위의 정수를 나타내고,
    "x5"는 0 또는 1과 동일한 정수를 나타내고;
    "y1", "y2", "z1" 및 "z2"는 0 또는 1과 동일한 정수를 나타내고;
    "prom 1"은 유전자 1을 코딩하는 서열의 발현을 제어하는 조절 서열이고;
    "prom 2"는 유전자 2를 코딩하는 서열의 발현을 제어하는 조절 서열이고;
    "prom 3"은 유전자 3을 코딩하는 서열의 발현을 제어하는 조절 서열이고;
    "prom5"는 유전자 1의 발현을 제어하는 조절 서열로서, 상기 prom5는 prom1과 동일하거나 또는 상이하고;
    "term1"은 유전자 1을 코딩하는 서열의 발현을 종결시키는 전사 종결인자 서열이고;
    "term2"는 유전자 2를 코딩하는 서열의 발현을 종결시키는 전사 종결인자 서열이고;
    "term3"은 유전자 3을 코딩하는 서열의 발현을 종결시키는 전사 종결인자 서열이고;
    "term5"는 유전자 1의 발현을 종결시키는 전사 종결인자 서열로서, 상기 term5는 term1과 동일하거나 또는 상이하다.)
  3. 제2항에 있어서, 상기 재조합 효모는 적어도 하나의 식 (II)의 DNA 구성체를 포함하고, 이때 유전자 3은 NADH 옥시다제를 코딩하는 핵산인 재조합 효모.
  4. 제2항에 있어서, 상기 재조합 효모는 적어도 하나의 식 (IIa)의 DNA 구성체(들)를 포함하는 재조합 효모.
  5. 제2항에 있어서, 상기 재조합 효모는 적어도 하나의 식 (IIb)의 DNA 구성체(들)를 포함하는 재조합 효모.
  6. 제2항에 있어서, 재조합 효모는 적어도 2개의 식 (II), (IIa) 또는 (IIb)의 DNA 구성체를 포함하는 재조합 효모.
  7. 제2항에 있어서, 상기 재조합 효모는 적어도 1개의 식 (IIb)를 갖는 DNA 구성체, 및 제 2 DNA 하위-구성체가 부재하는 적어도 1개의 식 (IIb)를 갖는 DNA 구성체를 포함하는 재조합 효모.
  8. 제2항에 있어서, 적어도 NOXE 유전자(들)을 포함하는 식 (I) 내지 (IIb)를 포함하는 군으로부터 선택되는 DNA 구성체(들)이 상기 재조합 효모의 내생 URA3 유전자 내에 삽입되는 재조합 효모.
  9. 제1항에 있어서, 피루베이트 디카복실라제 활성은 적어도 하나의 pdc 유전자의 파괴에 의해 감소되는 재조합 효모.
  10. 제9항에 있어서, 피루베이트 디카복실라제 활성은 식 (I) 내지 (III)을 포함하는 군에서 선택된 적어도 하나의 DNA 구성체(들)의 삽입에 의해 감소되는 재조합 효모.
  11. 제1항에 있어서, 피루베이트 디카복실라제 활성은 적어도 2개의 pdc 유전자의 파괴에 의해 감소되는 재조합 효모.
  12. 아세토인을 생산하기 위한 방법으로서, 상기 방법은
    (a) 적절한 배양 배지에서 제1항에 정의된 바와 같은 재조합 효모를 배양하는 단계; 및
    (c) 아세토인을 회수하는 단계
    를 포함하는 생산 방법.
  13. 제12항에 있어서, 상기 배양 배지는 탄소 공급원을 포함하는 생산 방법.
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