KR102201035B1

KR102201035B1 - 난배양성 미생물의 분리 및 배양 방법

Info

Publication number: KR102201035B1
Application number: KR1020190071474A
Authority: KR
Inventors: 김광; 최혜진; 홍승표
Original assignee: 주식회사 퓨처앤텍
Priority date: 2019-06-17
Filing date: 2019-06-17
Publication date: 2021-01-11
Anticipated expiration: 2039-06-17
Also published as: KR20200143872A

Abstract

본 발명은 난배양성 미생물의 분리 및 배양 방법에 관한 것으로, 기존에 분리는 되었으나 배양이 어렵거나 또는 난배양성 신규 미생물들을 탐색, 분리 또는 배양할 수 있으므로, 이로써 향후 무수히 많은 난배양성 미생물들의 탐색 및 분리 기술에 일조할 수 있다.

Description

난배양성 미생물의 분리 및 배양 방법{Method for isolating and culturing microorganism difficult to culture}

본 발명은 난배양성 미생물의 분리 및 배양 방법에 관한 것이다.

미생물의 생리학적 특성을 파악하여 생태학적 지위와 기능을 이해하고, 더 나아가서 이들의 특성을 활용하고 산업적으로 이용하기 위해서는 환경으로부터 미생물을 분리, 배양하는 것이 필수적이다. 하지만 환경에 존재하는 대부분의 미생물은 일반적으로 사용되고 있는 실험실 배양 방법으로 배양되지 않는다. "환경에 존재하는 미생물 중에 1% 정도 밖에는 배양되지 않는다"라고 하는 'great plate count anomaly' 이론은 배양되는 C.F.U.(Colony Forming Unit)와 직접 계수했을 때의 미생물 수에 큰 차이가 있음을 파악함으로써 밝혀졌으며, 이어지는 연구에서는 해수, 민물, 저질토 및 토양 등의 환경에서 총 세균 수에 비해 배양할 수 있는 미생물은 0.1, 0.25, 0.25 및 0.3%에 불구하다는 것을 알아내었다.

최근 급속도로 발전하고 있는 클로닝(cloning), DGGE(Denaturing Gradient Gel Electrophoresis), FISH(fluorescent in situ hybridization), 파이로시퀀싱(pyrosequencing) 등의 분자생물학적인 방법들은 환경에 무수히 많은 난배양성 미생물이 존재한다는 것을 다시 한번 확인시켜줌과 동시에, 배양 방법을 대신하여 환경의 미생물 다양성을 파악하기 위한 주요 기술로 자리 잡았다. 하지만 각각의 미생물 개체를 연구하고 그것을 상업적으로 이용하기 위해서는 미생물을 순수분리하고 단독배양법을 확보하는 것이 필수적이다.

일반적으로 미생물이 존재하는 특정 서식지에는 다양한 미생물들이 시간 차이를 두고 성장과 사멸을 하고 있으며 또한 서로 공존하며 상호 공생 또는 경쟁관계를 통하여 생존하면서 하나의 거대한 집단공동체를 형성하고 있다. 따라서 집단공동체 내 각각의 미생물 개체의 성장과 사멸 기전과 주위에 존재하는 다른 미생물과의 상호 공생 또는 경쟁관계를 이해하지 못하는 상태에서는 인공적인 배양조건으로 이들 미생물을 배양하고 순수분리 할 수 없다는 점은 이미 잘 알려진 사실이다.

지구상에 존재하는 미생물의 0.5~1%에 해당하는 순수배양 가능한 미생물들의 배양조건을 잘 알고 있음에도 불구하고 나머지 99% 이상에 해당하는 대부분의 미생물을 실험실의 인공적인 조건에서 배양하지 못하는 이유는 앞서 설명한 이유와 더불어 온도 또는 배양용기의 산소포화도 등 배양조건의 차이로 인한 것과 주위에 존재하는 미생물과 상호작용을 하며 외부 환경으로부터 받아들이는 성장에 필요한 필수성분의 부재를 들 수 있다. 또한, 미생물을 배양하는 배지에 의한 영향이 있을 수 있다. 일반적으로 미생물 배양을 위해 실험실에서 널리 사용되는 배지는 자연환경과 비교해 매우 고농도의 영양분을 제공하고 있으며, 이러한 고영양분의 배지에 빈영양 상태의 환경에 존재하던 미생물을 접종할 경우 성장이 억제되는 요인으로 작용한다. 다음으로 성장속도가 빠른 미생물들에 의해 성장속도가 느린 미생물들의 성장이 영향을 받을 수 있다. 일반적으로 고체 배지에서 콜로니를 형성하며 먼저 성장하는 미생물은 타감작용(allelopathy)으로 인해 늦게 성장하는 미생물의 성장을 억제할 수 있다. 또한 바이오필름(biofilm)을 형성하며 넒은 범위로 자라는 미생물은 배지에서 우점하면서 다른 종들의 성장을 방해할 수도 있다. 마지막으로 실험실의 짧은 배양 기간이 성장이 느린 미생물을 분리할 수 있는 기회를 놓치게 할 수 있다. 일반적으로 자연환경에 존재하는 수많은 미생물은 성장이 느린 K-전략생물(K-strategist)에 해당하는 것으로 알려져 있다. 이러한 저속성장은 대부분 성장에 필요한 필수성분의 부재와 배양조건의 차이로 인한 경우가 많아 인공적인 배양조건에서는 배양 및 순수분리를 하지 못하는 결정적인 요인이 될 수 있다. 요약 정리하면, 미생물이 성장하는데 큰 영향을 주는 온도, pH, 습도, 공기 조성, 염분도 및 햇빛 등의 환경 요소가 서식지의 환경 조건과 다름으로 인해 순수 분리 배양에 실패 할 수 있다. 또한 이러한 기본적인 환경요소 외에도 생물끼리 주고 받는 신호물질, 대사물질, 영양분 등 환경에 존재하는 대사 및 생합성물질은 난배양 미생물의 성장에 필수요소로 작용하여 순수배양에 중요한 영향을 미치는 것으로 밝혀졌다. 따라서 이런 요소가 부재된 실험실 배양 환경에서는 실제 환경에 존재하는 수많은 상호공생 미생물들이 성장하지 못할 수 있다.

위에서 언급한 문제들을 해결하기 위해서 다양한 배양 방법의 개발이 이루어져 왔다. 배지의 문제점을 해결하기 위해 빈영양 배지와 새로운 겔화제(gelling agent)를 포함하는 배지를 사용하는 방법, 빠르게 성장하는 미생물에 의한 타감작용을 억제하기 위한 단세포 배양 방법, 느리게 성장하는 미생물의 배양률을 높이기 위한 배양 기간을 늘리는 방법, 그리고 배양성을 증진시킬 수 있는 첨가물질을 추가하는 방법 등이 개발되어 미생물 배양률을 향상시켰지만 환경에 존재하는 대부분의 미생물들의 상당 수가 여전히 현존하는 배양법으로는 배양되지 않는 것으로 알려져 있다.

한편, 한국등록특허 제1563054호에는 '미생물의 현장 배양장치 및 이를 이용한 미생물 분리방법'에 대해 개시하고 있으며, 한국등록특허 제1151297호에는 '선택적 개폐가 가능한 미생물 배양용기 및 보습 첨가제를 포함하는 신규한 미생물 배양 배지의 제조 방법'에 대해 개시하고 있다. 하지만, 본 발명의 '난배양성 미생물의 분리 및 배양 방법'에 대해서는 아직까지 개시된 바가 없다.

본 발명은 상기와 같은 요구에 의해 도출된 것으로서, 본 발명자들은 임상 검체로부터 일반적인 배양법으로 분리한 세균의 세포 추출액(용해물)을 첨가한 배지에 상기 임상 검체를 접종하여 배양한 후 난배양성 미생물을 분리하고, 분리된 난배양성 미생물의 세포 용해물을 추가로 혼합첨가한 배지에 상기 임상 검체를 재접종하여 배양하였을 경우에, 지금까지 알려지지 않은 난배양성 신규 미생물을 분리할 수 있다는 것을 확인함으로써, 본 발명을 완성하였다.

상기 과제를 해결하기 위하여, 본 발명은 검체를 2종 이상의 세포 용해물이 포함된 배지에 접종하여 배양하는 단계를 포함하는 검체 내의 난배양성 미생물을 분리하는 방법을 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 방법에 의해 분리된, 기탁번호가 KCTC18773P인 아시니박테리움 두오데니(Asinibacterium duodeni) FT-ECCT 186 균주를 제공한다.

본 발명은 난배양성 미생물을 분리하는 방법을 제공함으로써, 기존에 분리는 되었으나 배양이 어렵거나 또는 난배양성 신규 미생물들을 탐색, 분리 또는 배양할 수 있으므로, 이로써 향후 무수히 많은 난배양성 미생물들의 탐색 및 분리 기술에 일조할 수 있다.

도 1은 임상 검체로부터 분리한 대장균(Escherichia coli) sFT001-0006 추출액을 첨가한 배지에서 자란 콜로니를 선별한 후, 선별한 콜로니를 대장균 sFT001-0006 추출액을 첨가한 배지에 재접종하여 대장균 sFT001-0006 추출액을 첨가한 배지에서는 농축배양 되어지는 콜로니인지 확인하는 과정을 나타낸 것이다. E-/E-는 대조군(Blank)으로서 대장균 sFT001-0006 추출액을 첨가하지 않은 배지에서 자란 콜로니를 나타내며, E+/E- 및 E+/E+는 대장균 sFT001-0006 추출액을 첨가한 배지에서 자란 콜로니를 대장균 sFT001-0006 추출액을 첨가하지 않은 배지(E+/E-) 및 대장균 sFT001-0006 추출액을 첨가한 배지(E+/E+)에 각각 접종하여 대장균 sFT001-0006 추출액을 첨가하지 않은 배지(Blank)에서는 관찰되지 않지만 대장균 sFT001-0006 추출액 첨가 배지에서는 관찰되는 콜로니를 나타낸 것이다.
도 2는 임상 검체로부터 분리한 대장균(Escherichia coli) sFT001-0006 추출액 및 클로스트리디움 테르티움(Clostridium tertium) sFT001-0168 추출액의 혼합물을 첨가한 배지에서만 특이적으로 자란 콜로니를 선별하여 이에 해당하는 균주의 16S rDNA 염기서열을 분석하여 확인한 아시니박테리움 두오데니(Asinibacterium duodeni) sFT001-0186의 계통도를 나타낸 것이다.
도 3은 본 발명의 검체 내의 난배양성 미생물을 분리하는 방법의 과정을 나타낸 모식이다.

본 발명의 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 검체를 2종 이상의 세포 용해물이 포함된 배지에 접종하여 배양하는 단계를 포함하는 검체 내의 난배양성 미생물을 분리하는 방법을 제공한다.

본 발명의 검체 내의 난배양성 미생물을 분리하는 방법은 바람직하게는,

(a) 검체를 액체 선택배지에 접종하고 배양하여 배양물을 준비하는 단계;

(b) 상기 (a) 단계의 배양물을 희석하여 고체 선택배지에 재접종한 후 배양하여 하나 이상의 균주를 분리하는 단계;

(c) 상기 (b) 단계에서 분리한 각각의 균주를 액체 선택배지에서 배양한 후 각각의 세포 용해물(lysate)을 준비하는 단계;

(d) 상기 (c) 단계에서 준비한 각 세포 용해물이 포함된 고체 선택배지를 제조하는 단계;

(e) 상기 (d) 단계에서 제조한 세포 용해물이 포함된 고체 선택배지에 (a) 단계의 배양물을 희석하여 접종한 후 배양하여, 상기 (c) 단계의 세포 용해물 미포함 고체 선택배지에서 자란 콜로니와 구별되는 콜로니를 선별하는 단계; 및

(f) 상기 (e) 단계에서 선별된 콜로니를 배양하여 이의 세포 용해물을 준비한 후, 단독으로 또는 상기 (c) 단계의 세포 용해물과 혼합하여 (d) 내지 (e) 단계를 추가로 반복하는 단계;를 포함하는, 검체 내의 난배양성 미생물을 분리하는 방법을 제공한다.

본 발명의 검체 내의 난배양성 미생물을 분리하는 방법에서, 상기 검체는 임상 시료 또는 환경 시료로부터 습득되는 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 또한, 상기 임상 시료는 위, 십이지장, 소장 및 대장의 조직 시료 또는 내용물일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

또한, 상기 선택배지는 미생물 배양에 이용되는 합성배지일 수 있고, 검체의 출처를 고려하여 당업계에 공지된 합성배지를 적절하게 선택하여 사용할 수 있다. 본 발명의 일 구현 예에 따른 선택배지는, 바람직하게는 PEPN(phosphate-yeast-peptone-sodium nitrate) 배지일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 상기 PEPN 배지는 K₂HPO₄ 6 g/L, KH₂PO₄ 2 g/L, 박토-트립톤(bacto-tryptone) 5 g/L, NaNO₃ 2.55 g/L 및 효모 추출물(yeast extract) 10 g/L로 이루어져 있다.

또한, 상기 (a) 단계의 배양 조건은 특정온도와 산소포화도를 정하여 정치 또는 진탕 배양하는 것일 수 있으며, 바람직하게는 30~38℃에서 호기적 또는 혐기적 조건으로 18~28시간 동안 배양하는 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

또한, 상기 (b) 및 (e) 단계의 배양 조건은 30~38℃에서 호기적 또는 혐기적 조건으로 18~28시간 동안 배양하는 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

또한, 본 발명의 일 구현 예에 따른 방법에 있어서, 상기 (b) 단계에서 분리된 균주는 대장균(Escherichia coli), 바실러스 세레우스(Bacillus cereus), 엔테로코커스 히래(Enterococcus hirae) 및 엔테로코커스 락티스(Enterococcus lactis)로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

또한, 상기 (c) 단계의 세포 용해물은 상기 (b) 단계에서 분리한 균주에 초음파 처리한 후 원심분리하여 상등액을 회수한 다음 0.22μm의 멤브레인 필터를 이용하여 여과함으로써 수득되는 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

또한, 상기 (c) 단계의 세포 용해물은 0.22μm의 멤브레인 필터를 이용하여 살아있는 균을 제거한 무균 용해물일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

또한, 상기 (f) 단계 이후에, (f) 단계에서 최종 선별한 콜로니에 해당하는 균주의 16S rDNA 염기서열을 분석하여 분리 및 동정하는 단계를 추가로 수행할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

본 발명의 일 구현예에 따른 방법에 있어서, 상기 난배양성 미생물은 클로스트리디움 테르티움(Clostridium tertium) 또는 아시니박테리움 두오데니(Asinibacterium duodeni)일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

본 발명은 상기 난배양성 미생물의 세포 용해물이 포함된 미생물 세포 용해물 조합을 이용함으로써 세포 용해물 요구성 난배양성 미생물을 배양할 수 있는 특징이 있다.

대장균의 세포 용해물을 PEPN 배지와 혼합하여 제조한 후 검체를 배양하였을 경우, 클로스트리디움 테르티움이 분리·동정되었으며, 대장균의 세포 용해물 및 클로스트리디움 테르티움의 세포 용해물을 PEPN 배지와 혼합하여 제조한 후 검체를 배양하였을 경우, 아시니박테리움 두오데니가 분리·동정되었다.

이하, 본 발명의 실시 예에 의해 상세히 설명한다. 단, 하기 실시 예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시 예에 한정되는 것은 아니다.

실시예 1. 1차 세균 추출액으로 사용할 균주의 분리 및 선별

임상 검체로부터 난배양성 미생물을 분리하기 위하여, 소의 위, 십이지장, 소장 및 대장 유래 검체를 PEPN(phosphate-yeast-peptone-sodium nitrate; K₂HPO₄ 6 g/L, KH₂PO₄ 2 g/L, 박토-트립톤 5 g/L, NaNO₃ 2.55 g/L 및 효모 추출물 10 g/L) 액체 배지에 각각 접종하여 37℃에서 혐기적 조건으로 24시간 동안 농축배양(enrichment culture)하였다. 획득한 각 농축배양물을 희석하여 PEPN 아가 배지에 도말하고 24시간 동안 호기적 또는 혐기적 조건에서 배양한 후, 자란 콜로니를 선별하고 이를 대상으로 16S rDNA 유전자 시퀀싱 분석을 수행하였다. 그 결과, 하기 표 1에 개시한 바와 같이 각 검체로부터 16S rDNA 서열 상동성이 99.6% 이상에 이르는 이미 알려진 다양한 미생물을 분리하였으며, 하기 실시 예에 사용할 1차 세균 추출액의 대상으로 바실러스 세레우스(Bacillus cereus) sFT001-005, 대장균(Escherichia coli) sFT001-006, 엔테로코커스 히래(Enterococcus hirae) sFT001-007 및 엔테로코커스 락티스(Enterococcus lactis) sFT001-011을 선발하였다. 상기 4종의 미생물을 37℃에서 호기적 조건으로 24시간 동안 배양한 후, 4,000 rpm으로 10분 동안 원심분리하여 회수한 균체를 PBS 버퍼에 녹인 후 초음파처리하고 다시 원심분리하여 상등액을 회수한 다음 0.22μm 멤브레인 필터로 여과함으로써 상기 4종의 세균 추출액을 수득하였다. 각 세균 추출액은 BCA 단백질 분석을 통해 전체 단백질 양으로 표준화하는 방법으로 정량하였다.

각 검체로부터 분리된 미생물의 16S rDNA 유전자 시퀀싱 분석 결과

Sample #	Sample source	Strain	Score(Bits)	Identities(%)
sFT001-0005	Stomach	Bacillus cereus	2563	1430/1435 (99.6%)
sFT001-0006	Duodenum	Escherichia coli	2562	1432/1436 (99.7%)
sFT001-0007	SI(small intestine)	Enterococcus hirae	2576	1439/1442 (99.7%)
sFT001-0008	SI	Bacillus licheniformis	2589	1439/1441 (99.8%)
sFT001-0009	SI	Enterococcus hirae	2598	1447/1449 (99.8%)
sFT001-0010	SI	Enterococcus hirae	2594	1446/1449 (99.7%)
sFT001-0011	LI(large intestine)	Enterococcus lactis	2607	1449/1450 (99.9%)
sFT001-0012	LI	Enterococcus hirae	2594	1446/1449 (99.7%)

실시예 2. 검체 유래 1차 세균 추출액을 이용한 검체로부터 난배양성 미생물의 분리 및 배양

장내에 존재하는 난배양성 미생물을 농축배양하고 순수분리하기 위하여, 상기 4종의 세균(바실러스 세레우스, 대장균, 엔테로코커스 히래 및 엔테로코커스 락티스) 추출액을 전체 단백질 농도 기준으로 최종 100 ㎍/mL의 농도가 되도록 각각 첨가한 PEPN 아가 배지에 십이지장 및 소장 검체의 농축배양물(10^-4cell/mL)을 각각 도말하여 37℃에서 혐기적 조건으로 24시간 동안 배양한 후, 균주를 분리하였다. 대조군(Blank)으로 세균 추출액을 첨가하지 않은 배지(E-/E-)를 사용하였다. 상기 4종의 세균 추출액 첨가한 배지에서 자란 콜로니를 선별한 후, 이에 해당하는 균주들이 상기 4종의 세균 추출액을 첨가한 배지에서만 특이적으로 자라는 균주인지 확인하기 위해, 세균 추출액을 첨가한 배지로부터 분리한 균주들을 세균 추출액이 포함되지 않은 배지(E+/E-) 및 세균 추출액이 포함된 배지(E+/E+)에 각각 접종하여, 세균 추출액이 포함되지 않은 배지(Blank)에서 자란 콜로니와 다른 형상으로 자라나는 콜로니를 선별하였다(도 1). 배양 결과, 대장균 또는 엔테로코커스 락티스 추출액을 첨가한 배지에서 특이적으로 자라는 콜로니들이 확인되어 해당 균주들을 선별하였고, 이에 대한 16S rDNA 유전자 서열 분석 결과, 하기 표 2에 개시한 바와 같이 16S rDNA 서열 상동성이 98.8% 이상에 해당하는 클로스트리디움 테르티움(Clostridium tertium) 종의 균주들이 다수 분리되었으며 그 중 계통수 분석결과에서 기존의 알려진 균주와 가장 멀리 떨어져 있는 미생물인 클로스트리디움 테르티움(Clostridium tertium) sFT001-0168을 대장균 추출액과 혼합하여 또 다른 난배양성 미생물을 분리하기 위해 사용할 세균으로 선택하였다. 클로스트리디움 테르티움 추출액 sFT001-0168의 제조 방법은 100 ㎍/mL의 대장균 sFT001-0006 세포추출액이 포함된 PEPN 액체배지에 클로스트리디움 테르티움 sFT001-0168을 접종하고 37℃에서 혐기적 조건으로 24시간 동안 배양한 후, 4,000 rpm으로 10분 동안 원심분리하여 회수한 균체를 PBS buffer에 녹인 후 초음파처리하고 다시 원심분리하여 상등액을 회수한 다음 여과함으로써 sFT001-0168 추출액을 수득하여 사용하였다.

실시예 3. 대장균 추출액 및 클로스트리디움 테르티움 추출액의 혼합물을 이용한 난배양성 신규 미생물의 분리 및 배양

상기 실시예 1 및 2에서 획득한 대장균 추출액 및 클로스트리디움 테르티움 추출액을 배합한 조합물을 첨가한 PEPN 아가 배지에 십이지장의 농축배양물(10^-4cell/mL)을 도말하여 37℃에서 혐기적 조건으로 24시간 동안 배양한 후, 자란 콜로니를 분리하였다. 그 결과, 대장균 추출액 및 클로스트리디움 테르티움 추출액의 조합물을 첨가한 배지에서만 특이적으로 자라는 콜로니들을 선별하였고, 이에 해당하는 균주들을 대상으로 16S rDNA 유전자 서열 분석 결과, 하기 표 3에 개시한 바와 같이 염기서열 상동성이 97%대로 낮은 신규 난배양성 미생물 군으로 분리할 수 있었으며, 분리균주 sFT001-0186의 16S rDNA 염기서열(서열번호 1)을 토대로 계통수(phylogenetic tree)를 작성한 결과, 아시니박테리움 락티스(Asinibacterium lactis)와 가장 가까운 근연관계로 확인되었다(도 2). 본 발명에서는 이를 아시니박테리움 두오데니(Asinibacterium duodeni) FT-ECCT 186으로 명명하였고 2019년 05월 16일 한국생명공학연구원(KCTC)에 기탁하여 기탁번호 KCTC18773P를 부여받았다. 따라서 도 3에 개시한 바와 같이 본 발명의 방법을 통해 검체로부터 분리한 미생물 추출액 단독 또는 추출액을 이용하여 분리한 난배양성 미생물 등 서로 다른 미생물 추출액의 조합을 통하여 미생물 추출액 조합물을 배지에 첨가함으로써 상기 동일한 검체로부터 난배양성 또는 미동정 신규 미생물을 분리할 수 있다는 것을 확인하였다.

한국생명공학연구원

KCTC18773P

20190516

<110> Future and Tech co. <120> Method for isolating and culturing microorganism difficult to culture <130> PN19192 <160> 1 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 1506 <212> DNA <213> Asinibacterium duodeni <400> 1 actagtgatt agagtttgat cctggctcag gatgaacgct agcggcaggc ttaatacatg 60 caagtcgagg ggcagcagct ttatagcaat atagaggctg gcgaccggca aacgggtgcg 120 gaacacgtac acaaccttcc tttaagaggg ggatagccca tagaaatgtg gattaatacc 180 ccgtaacata tcggtgtggc atcacactgt tattatagtt tcgacgcttg aagatgggtg 240 tgcggctgat taggtagttg gcggggtaaa ggccccccaa gccttcgatc agtagctgat 300 gtgagagcat gatcagccac acgggcactg agacacgggc ccgactccta cgggaggcag 360 cagtaaggaa tattggtcaa tggacgcaag tctgaaccag ccatgccgcg tgaaggatga 420 aggtcctctg gattgtaaac ttcttttata gggggcgaaa aaagggaatt ctttctcact 480 tgacagtacc ctatgaataa gcaccggcta actccgtgcc agcagccgcg gtaatacgga 540 gggtgcaagc gttatccgga ttcactgggt ttaaagggtg cgtaggcgga taggtaagtc 600 agaggtgaaa tcctggagct taactccaga actgcctttg atactatcta tcttgaatat 660 ggtggaggta agcggaatat gtcatgtagc ggtgaaatgc atagatatga catagaacac 720 ctattgcgag ggcagcttac tacgcctata ttgacgctga ggcacgaaag cgtggggatc 780 aaacaggatt agataccctg gtagtccacg ccctaaacga tgactactcg acgtacgcga 840 tacacagtat gcgtctgagc gaaagcatta agtaatccac ctgggaagta cgaccgcaag 900 gttgaaactc aaaggaattg gcgggggtcc gcacaagcgg tggagcatgt ggtttaattc 960 gatgatgcgc gaggaacctt acctgggcta gaatgcagtc tgaccgtggg tgaaagctca 1020 tttcgtagca atacgcagat tgtaaggtgc tgcatggctg tcgtcagctc gtgccgtgag 1080 gtgttgggtt aagtcccgca acgagcgcaa cccctatcat tagttgccaa caggtaaagc 1140 tgggaactct agtgaaactg ccgtcgtaag acgcgaggaa ggaggggatg atgtcaagtc 1200 atcatggcct ttatgcccag ggctacacac gtgctacaat ggggtggaca aagggctgca 1260 acacagtgat gtgaagcgaa tcccaaaaac cacttctcag ttcagatcgg agtctgcaac 1320 tcgactccgt gaagctggaa tcgctagtaa tcgtatatca gcaatgatac ggtgaatacg 1380 ttcccggacc ttgcacacac cgcccgtcaa gccacgggag ccgggtgtac ctaaagtcgg 1440 taaccgcaag gatctgccta gggtaaaatc ggtgactggg gctaagtcgt aacaaggtag 1500 ccaatc 1506

Claims

(a) 검체를 액체 선택배지에 접종하고 배양하여 배양물을 준비하는 단계;
(b) 상기 (a) 단계의 배양물을 희석하여 고체 선택배지에 재접종한 후 배양하여 하나 이상의 균주를 분리하는 단계;
(c) 상기 (b) 단계에서 분리한 각각의 균주를 액체 선택배지에서 배양한 후 각각의 세포 용해물(lysate)을 준비하는 단계;
(d) 상기 (c) 단계에서 준비한 각 세포 용해물이 포함된 고체 선택배지를 제조하는 단계;
(e) 상기 (d) 단계에서 제조한 세포 용해물이 포함된 고체 선택배지에 (a) 단계의 배양물을 희석하여 접종한 후 배양하여, 상기 (c) 단계의 세포 용해물 미포함 고체 선택배지에서 자란 콜로니와 구별되는 콜로니를 선별하는 단계; 및
(f) 상기 (e) 단계에서 선별된 콜로니를 배양하여 이의 세포 용해물을 준비한 후, 단독으로 또는 상기 (c) 단계의 세포 용해물과 혼합하여 (d) 내지 (e) 단계를 추가로 반복하는 단계;를 포함하는, 검체 내의 난배양성 미생물을 분리하는 방법.
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제1항에 있어서, 상기 검체는 임상 시료 또는 환경 시료로부터 습득되는 것을 특징으로 하는 검체 내의 난배양성 미생물을 분리하는 방법.
제1항에 있어서, 상기 (b) 단계에서 분리된 균주는 대장균(Escherichia coli), 바실러스 세레우스(Bacillus cereus), 엔테로코커스 히래(Enterococcus hirae) 및 엔테로코커스 락티스(Enterococcus lactis)로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상인 것을 특징으로 하는 검체 내의 난배양성 미생물을 분리하는 방법.
제1항에 있어서, 상기 (f) 단계 이후에, (f) 단계에서 최종 선별한 콜로니에 해당하는 균주의 16S rDNA 염기서열을 분석하여 동정하는 단계를 추가로 수행하는 것을 특징으로 하는 검체 내의 난배양성 미생물을 분리하는 방법.
제1항, 제3항 내지 제5항 중 어느 한 항의 방법에 의해 분리된, 기탁번호가 KCTC18773P인 아시니박테리움 두오데니(Asinibacterium duodeni) FT-ECCT 186 균주.