KR102184816B1 - Dha 생합성 유전자군 다중발현 형질전환 들깨 - Google Patents
Dha 생합성 유전자군 다중발현 형질전환 들깨 Download PDFInfo
- Publication number
- KR102184816B1 KR102184816B1 KR1020190110316A KR20190110316A KR102184816B1 KR 102184816 B1 KR102184816 B1 KR 102184816B1 KR 1020190110316 A KR1020190110316 A KR 1020190110316A KR 20190110316 A KR20190110316 A KR 20190110316A KR 102184816 B1 KR102184816 B1 KR 102184816B1
- Authority
- KR
- South Korea
- Prior art keywords
- delta
- gene
- perilla
- seq
- desaturase
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Active
Links
- 230000009261 transgenic effect Effects 0.000 title claims abstract description 71
- 235000004347 Perilla Nutrition 0.000 title claims abstract description 61
- 244000124853 Perilla frutescens Species 0.000 title claims description 62
- 238000012269 metabolic engineering Methods 0.000 title description 3
- 230000006696 biosynthetic metabolic pathway Effects 0.000 title description 2
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims abstract description 101
- 108010058732 Fatty Acid Elongases Proteins 0.000 claims abstract description 54
- 101000912235 Rebecca salina Acyl-lipid (7-3)-desaturase Proteins 0.000 claims abstract description 36
- 101000877236 Siganus canaliculatus Acyl-CoA Delta-4 desaturase Proteins 0.000 claims abstract description 36
- 108010033653 omega-3 fatty acid desaturase Proteins 0.000 claims abstract description 27
- 108010073542 Delta-5 Fatty Acid Desaturase Proteins 0.000 claims abstract description 25
- 108010037138 Linoleoyl-CoA Desaturase Proteins 0.000 claims abstract description 24
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 claims abstract description 16
- 238000000034 method Methods 0.000 claims abstract description 15
- 241001161496 Berryteuthis magister Species 0.000 claims abstract description 14
- 241000252113 Muraenesox cinereus Species 0.000 claims abstract description 11
- 241000229722 Perilla <angiosperm> Species 0.000 claims abstract 15
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 claims description 105
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 claims description 75
- YZXBAPSDXZZRGB-DOFZRALJSA-N arachidonic acid Chemical compound CCCCC\C=C/C\C=C/C\C=C/C\C=C/CCCC(O)=O YZXBAPSDXZZRGB-DOFZRALJSA-N 0.000 claims description 72
- 241000238366 Cephalopoda Species 0.000 claims description 64
- 235000021342 arachidonic acid Nutrition 0.000 claims description 36
- 229940114079 arachidonic acid Drugs 0.000 claims description 36
- JAZBEHYOTPTENJ-JLNKQSITSA-N all-cis-5,8,11,14,17-icosapentaenoic acid Chemical compound CC\C=C/C\C=C/C\C=C/C\C=C/C\C=C/CCCC(O)=O JAZBEHYOTPTENJ-JLNKQSITSA-N 0.000 claims description 31
- 235000020673 eicosapentaenoic acid Nutrition 0.000 claims description 31
- 229960005135 eicosapentaenoic acid Drugs 0.000 claims description 31
- JAZBEHYOTPTENJ-UHFFFAOYSA-N eicosapentaenoic acid Natural products CCC=CCC=CCC=CCC=CCC=CCCCC(O)=O JAZBEHYOTPTENJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 31
- 102000036181 Fatty Acid Elongases Human genes 0.000 claims description 22
- IQLUYYHUNSSHIY-HZUMYPAESA-N eicosatetraenoic acid Chemical compound CCCCCCCCCCC\C=C\C=C\C=C\C=C\C(O)=O IQLUYYHUNSSHIY-HZUMYPAESA-N 0.000 claims description 20
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 claims description 19
- 239000002243 precursor Substances 0.000 claims description 19
- 235000004348 Perilla frutescens Nutrition 0.000 claims description 16
- 239000002253 acid Substances 0.000 claims description 16
- 230000001851 biosynthetic effect Effects 0.000 claims description 15
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 claims description 15
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 claims description 15
- FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 4-amino-1-[(2r)-6-amino-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-amino-3-phenylpropanoyl]amino]-3-phenylpropanoyl]amino]-4-methylpentanoyl]amino]hexanoyl]piperidine-4-carboxylic acid Chemical compound C([C@H](C(=O)N[C@H](CC(C)C)C(=O)N[C@H](CCCCN)C(=O)N1CCC(N)(CC1)C(O)=O)NC(=O)[C@H](N)CC=1C=CC=CC=1)C1=CC=CC=C1 FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 0.000 claims description 14
- 230000001965 increasing effect Effects 0.000 claims description 11
- 102100034542 Acyl-CoA (8-3)-desaturase Human genes 0.000 claims description 10
- 230000003570 biosynthesizing effect Effects 0.000 claims description 9
- 230000009466 transformation Effects 0.000 claims description 8
- YUFFSWGQGVEMMI-JLNKQSITSA-N (7Z,10Z,13Z,16Z,19Z)-docosapentaenoic acid Chemical compound CC\C=C/C\C=C/C\C=C/C\C=C/C\C=C/CCCCCC(O)=O YUFFSWGQGVEMMI-JLNKQSITSA-N 0.000 claims description 5
- 102000009114 Fatty acid desaturases Human genes 0.000 claims description 5
- 235000021294 Docosapentaenoic acid Nutrition 0.000 claims description 4
- 239000000203 mixture Substances 0.000 claims description 4
- 101710196023 Vicilin Proteins 0.000 claims description 3
- 241000196324 Embryophyta Species 0.000 abstract description 81
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 abstract description 25
- 238000011161 development Methods 0.000 abstract description 5
- OYHQOLUKZRVURQ-NTGFUMLPSA-N (9Z,12Z)-9,10,12,13-tetratritiooctadeca-9,12-dienoic acid Chemical compound C(CCCCCCC\C(=C(/C\C(=C(/CCCCC)\[3H])\[3H])\[3H])\[3H])(=O)O OYHQOLUKZRVURQ-NTGFUMLPSA-N 0.000 abstract 1
- 230000002194 synthesizing effect Effects 0.000 abstract 1
- MBMBGCFOFBJSGT-KUBAVDMBSA-N all-cis-docosa-4,7,10,13,16,19-hexaenoic acid Chemical compound CC\C=C/C\C=C/C\C=C/C\C=C/C\C=C/C\C=C/CCC(O)=O MBMBGCFOFBJSGT-KUBAVDMBSA-N 0.000 description 146
- 235000020669 docosahexaenoic acid Nutrition 0.000 description 83
- 229940090949 docosahexaenoic acid Drugs 0.000 description 73
- 229940088598 enzyme Drugs 0.000 description 73
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 33
- 240000004808 Saccharomyces cerevisiae Species 0.000 description 24
- DTOSIQBPPRVQHS-PDBXOOCHSA-N alpha-linolenic acid Chemical compound CC\C=C/C\C=C/C\C=C/CCCCCCCC(O)=O DTOSIQBPPRVQHS-PDBXOOCHSA-N 0.000 description 24
- 239000000194 fatty acid Substances 0.000 description 21
- 150000004665 fatty acids Chemical class 0.000 description 21
- 235000014113 dietary fatty acids Nutrition 0.000 description 20
- 229930195729 fatty acid Natural products 0.000 description 20
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 20
- 108010078791 Carrier Proteins Proteins 0.000 description 17
- 239000013598 vector Substances 0.000 description 16
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 13
- 235000020661 alpha-linolenic acid Nutrition 0.000 description 13
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 13
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 12
- 229960004488 linolenic acid Drugs 0.000 description 12
- DVSZKTAMJJTWFG-SKCDLICFSA-N (2e,4e,6e,8e,10e,12e)-docosa-2,4,6,8,10,12-hexaenoic acid Chemical compound CCCCCCCCC\C=C\C=C\C=C\C=C\C=C\C=C\C(O)=O DVSZKTAMJJTWFG-SKCDLICFSA-N 0.000 description 10
- GZJLLYHBALOKEX-UHFFFAOYSA-N 6-Ketone, O18-Me-Ussuriedine Natural products CC=CCC=CCC=CCC=CCC=CCC=CCCCC(O)=O GZJLLYHBALOKEX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 10
- KAUVQQXNCKESLC-UHFFFAOYSA-N docosahexaenoic acid (DHA) Natural products COC(=O)C(C)NOCC1=CC=CC=C1 KAUVQQXNCKESLC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 10
- 238000010586 diagram Methods 0.000 description 9
- IPCSVZSSVZVIGE-UHFFFAOYSA-N hexadecanoic acid Chemical compound CCCCCCCCCCCCCCCC(O)=O IPCSVZSSVZVIGE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 9
- 238000003780 insertion Methods 0.000 description 8
- 230000037431 insertion Effects 0.000 description 8
- 235000020664 gamma-linolenic acid Nutrition 0.000 description 7
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 7
- 102100034544 Acyl-CoA 6-desaturase Human genes 0.000 description 6
- 241000589158 Agrobacterium Species 0.000 description 6
- 230000006870 function Effects 0.000 description 6
- 230000012010 growth Effects 0.000 description 6
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 6
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 6
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 description 6
- 235000020660 omega-3 fatty acid Nutrition 0.000 description 6
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 6
- 239000000047 product Substances 0.000 description 6
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 6
- HOBAELRKJCKHQD-UHFFFAOYSA-N (8Z,11Z,14Z)-8,11,14-eicosatrienoic acid Natural products CCCCCC=CCC=CCC=CCCCCCCC(O)=O HOBAELRKJCKHQD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 235000021298 Dihomo-γ-linolenic acid Nutrition 0.000 description 5
- HOBAELRKJCKHQD-QNEBEIHSSA-N dihomo-γ-linolenic acid Chemical compound CCCCC\C=C/C\C=C/C\C=C/CCCCCCC(O)=O HOBAELRKJCKHQD-QNEBEIHSSA-N 0.000 description 5
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 5
- VZCCETWTMQHEPK-UHFFFAOYSA-N gamma-Linolensaeure Natural products CCCCCC=CCC=CCC=CCCCCC(O)=O VZCCETWTMQHEPK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- VZCCETWTMQHEPK-QNEBEIHSSA-N gamma-linolenic acid Chemical compound CCCCC\C=C/C\C=C/C\C=C/CCCCC(O)=O VZCCETWTMQHEPK-QNEBEIHSSA-N 0.000 description 5
- 229960002733 gamolenic acid Drugs 0.000 description 5
- 239000003921 oil Substances 0.000 description 5
- 235000019198 oils Nutrition 0.000 description 5
- 229940012843 omega-3 fatty acid Drugs 0.000 description 5
- 108091008146 restriction endonucleases Proteins 0.000 description 5
- WRIDQFICGBMAFQ-UHFFFAOYSA-N (E)-8-Octadecenoic acid Natural products CCCCCCCCCC=CCCCCCCC(O)=O WRIDQFICGBMAFQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- LQJBNNIYVWPHFW-UHFFFAOYSA-N 20:1omega9c fatty acid Natural products CCCCCCCCCCC=CCCCCCCCC(O)=O LQJBNNIYVWPHFW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- QSBYPNXLFMSGKH-UHFFFAOYSA-N 9-Heptadecensaeure Natural products CCCCCCCC=CCCCCCCCC(O)=O QSBYPNXLFMSGKH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 241001161493 Berryteuthis Species 0.000 description 4
- OPGOLNDOMSBSCW-CLNHMMGSSA-N Fursultiamine hydrochloride Chemical compound Cl.C1CCOC1CSSC(\CCO)=C(/C)N(C=O)CC1=CN=C(C)N=C1N OPGOLNDOMSBSCW-CLNHMMGSSA-N 0.000 description 4
- 239000005642 Oleic acid Substances 0.000 description 4
- ZQPPMHVWECSIRJ-UHFFFAOYSA-N Oleic acid Natural products CCCCCCCCC=CCCCCCCCC(O)=O ZQPPMHVWECSIRJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 235000021314 Palmitic acid Nutrition 0.000 description 4
- 241000233675 Thraustochytrium Species 0.000 description 4
- ISAKRJDGNUQOIC-UHFFFAOYSA-N Uracil Chemical compound O=C1C=CNC(=O)N1 ISAKRJDGNUQOIC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- HVYWMOMLDIMFJA-DPAQBDIFSA-N cholesterol Chemical compound C1C=C2C[C@@H](O)CC[C@]2(C)[C@@H]2[C@@H]1[C@@H]1CC[C@H]([C@H](C)CCCC(C)C)[C@@]1(C)CC2 HVYWMOMLDIMFJA-DPAQBDIFSA-N 0.000 description 4
- 210000000349 chromosome Anatomy 0.000 description 4
- 238000012790 confirmation Methods 0.000 description 4
- 230000018109 developmental process Effects 0.000 description 4
- 238000004817 gas chromatography Methods 0.000 description 4
- 238000012252 genetic analysis Methods 0.000 description 4
- 230000002363 herbicidal effect Effects 0.000 description 4
- 239000004009 herbicide Substances 0.000 description 4
- QXJSBBXBKPUZAA-UHFFFAOYSA-N isooleic acid Natural products CCCCCCCC=CCCCCCCCCC(O)=O QXJSBBXBKPUZAA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- WQEPLUUGTLDZJY-UHFFFAOYSA-N n-Pentadecanoic acid Natural products CCCCCCCCCCCCCCC(O)=O WQEPLUUGTLDZJY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 description 4
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 description 4
- ZQPPMHVWECSIRJ-KTKRTIGZSA-N oleic acid Chemical compound CCCCCCCC\C=C/CCCCCCCC(O)=O ZQPPMHVWECSIRJ-KTKRTIGZSA-N 0.000 description 4
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 4
- JIWBIWFOSCKQMA-UHFFFAOYSA-N stearidonic acid Natural products CCC=CCC=CCC=CCC=CCCCCC(O)=O JIWBIWFOSCKQMA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 102000004163 DNA-directed RNA polymerases Human genes 0.000 description 3
- 108090000626 DNA-directed RNA polymerases Proteins 0.000 description 3
- 235000021355 Stearic acid Nutrition 0.000 description 3
- 230000003321 amplification Effects 0.000 description 3
- 235000013305 food Nutrition 0.000 description 3
- 229930182830 galactose Natural products 0.000 description 3
- 229930027917 kanamycin Natural products 0.000 description 3
- 229960000318 kanamycin Drugs 0.000 description 3
- SBUJHOSQTJFQJX-NOAMYHISSA-N kanamycin Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CN)O[C@@H]1O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O[C@@H]2[C@@H]([C@@H](N)[C@H](O)[C@@H](CO)O2)O)[C@H](N)C[C@@H]1N SBUJHOSQTJFQJX-NOAMYHISSA-N 0.000 description 3
- 229930182823 kanamycin A Natural products 0.000 description 3
- 244000005700 microbiome Species 0.000 description 3
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 description 3
- QIQXTHQIDYTFRH-UHFFFAOYSA-N octadecanoic acid Chemical compound CCCCCCCCCCCCCCCCCC(O)=O QIQXTHQIDYTFRH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- OQCDKBAXFALNLD-UHFFFAOYSA-N octadecanoic acid Natural products CCCCCCCC(C)CCCCCCCCC(O)=O OQCDKBAXFALNLD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 239000006014 omega-3 oil Substances 0.000 description 3
- 235000020777 polyunsaturated fatty acids Nutrition 0.000 description 3
- 241000894007 species Species 0.000 description 3
- 239000008117 stearic acid Substances 0.000 description 3
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 3
- 238000013518 transcription Methods 0.000 description 3
- 230000035897 transcription Effects 0.000 description 3
- 230000001131 transforming effect Effects 0.000 description 3
- 235000021122 unsaturated fatty acids Nutrition 0.000 description 3
- 150000004670 unsaturated fatty acids Chemical class 0.000 description 3
- IAJOBQBIJHVGMQ-UHFFFAOYSA-N 2-amino-4-[hydroxy(methyl)phosphoryl]butanoic acid Chemical compound CP(O)(=O)CCC(N)C(O)=O IAJOBQBIJHVGMQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241000251468 Actinopterygii Species 0.000 description 2
- OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N Carbon Chemical group [C] OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108091026890 Coding region Proteins 0.000 description 2
- 102000053602 DNA Human genes 0.000 description 2
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 2
- 241000206765 Pavlova lutheri Species 0.000 description 2
- 244000046052 Phaseolus vulgaris Species 0.000 description 2
- MUPFEKGTMRGPLJ-RMMQSMQOSA-N Raffinose Natural products O(C[C@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H](O[C@@]2(CO)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H](CO)O2)O1)[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](CO)O1 MUPFEKGTMRGPLJ-RMMQSMQOSA-N 0.000 description 2
- 241000238371 Sepiidae Species 0.000 description 2
- 244000000231 Sesamum indicum Species 0.000 description 2
- 235000003434 Sesamum indicum Nutrition 0.000 description 2
- MUPFEKGTMRGPLJ-UHFFFAOYSA-N UNPD196149 Natural products OC1C(O)C(CO)OC1(CO)OC1C(O)C(O)C(O)C(COC2C(C(O)C(O)C(CO)O2)O)O1 MUPFEKGTMRGPLJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- XSQUKJJJFZCRTK-UHFFFAOYSA-N Urea Chemical compound NC(N)=O XSQUKJJJFZCRTK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000003115 biocidal effect Effects 0.000 description 2
- 230000003925 brain function Effects 0.000 description 2
- 239000004202 carbamide Substances 0.000 description 2
- 229960003669 carbenicillin Drugs 0.000 description 2
- FPPNZSSZRUTDAP-UWFZAAFLSA-N carbenicillin Chemical compound N([C@H]1[C@H]2SC([C@@H](N2C1=O)C(O)=O)(C)C)C(=O)C(C(O)=O)C1=CC=CC=C1 FPPNZSSZRUTDAP-UWFZAAFLSA-N 0.000 description 2
- 229910052799 carbon Inorganic materials 0.000 description 2
- 229960005091 chloramphenicol Drugs 0.000 description 2
- WIIZWVCIJKGZOK-RKDXNWHRSA-N chloramphenicol Chemical compound ClC(Cl)C(=O)N[C@H](CO)[C@H](O)C1=CC=C([N+]([O-])=O)C=C1 WIIZWVCIJKGZOK-RKDXNWHRSA-N 0.000 description 2
- 238000010835 comparative analysis Methods 0.000 description 2
- 230000007812 deficiency Effects 0.000 description 2
- CYQFCXCEBYINGO-IAGOWNOFSA-N delta1-THC Chemical compound C1=C(C)CC[C@H]2C(C)(C)OC3=CC(CCCCC)=CC(O)=C3[C@@H]21 CYQFCXCEBYINGO-IAGOWNOFSA-N 0.000 description 2
- 230000029087 digestion Effects 0.000 description 2
- -1 dioxin Chemical compound 0.000 description 2
- 235000021323 fish oil Nutrition 0.000 description 2
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 2
- 150000002632 lipids Chemical class 0.000 description 2
- 235000020667 long-chain omega-3 fatty acid Nutrition 0.000 description 2
- 239000000463 material Substances 0.000 description 2
- 230000010534 mechanism of action Effects 0.000 description 2
- 125000002496 methyl group Chemical group [H]C([H])([H])* 0.000 description 2
- 108010058731 nopaline synthase Proteins 0.000 description 2
- SECPZKHBENQXJG-FPLPWBNLSA-N palmitoleic acid Chemical compound CCCCCC\C=C/CCCCCCCC(O)=O SECPZKHBENQXJG-FPLPWBNLSA-N 0.000 description 2
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 2
- 210000001938 protoplast Anatomy 0.000 description 2
- MUPFEKGTMRGPLJ-ZQSKZDJDSA-N raffinose Chemical compound O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@]1(CO)O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO[C@@H]2[C@@H]([C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](CO)O2)O)O1 MUPFEKGTMRGPLJ-ZQSKZDJDSA-N 0.000 description 2
- UCSJYZPVAKXKNQ-HZYVHMACSA-N streptomycin Chemical compound CN[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](CO)O[C@H]1O[C@@H]1[C@](C=O)(O)[C@H](C)O[C@H]1O[C@@H]1[C@@H](NC(N)=N)[C@H](O)[C@@H](NC(N)=N)[C@H](O)[C@H]1O UCSJYZPVAKXKNQ-HZYVHMACSA-N 0.000 description 2
- 229940035893 uracil Drugs 0.000 description 2
- DJCQJZKZUCHHAL-UHFFFAOYSA-N (Z)-9-Pentadecensaeure Natural products CCCCCC=CCCCCCCCC(O)=O DJCQJZKZUCHHAL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- YZAZXIUFBCPZGB-QZOPMXJLSA-N (z)-octadec-9-enoic acid Chemical compound CCCCCCCC\C=C/CCCCCCCC(O)=O.CCCCCCCC\C=C/CCCCCCCC(O)=O YZAZXIUFBCPZGB-QZOPMXJLSA-N 0.000 description 1
- HGUFODBRKLSHSI-UHFFFAOYSA-N 2,3,7,8-tetrachloro-dibenzo-p-dioxin Chemical compound O1C2=CC(Cl)=C(Cl)C=C2OC2=C1C=C(Cl)C(Cl)=C2 HGUFODBRKLSHSI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102000007469 Actins Human genes 0.000 description 1
- 108010085238 Actins Proteins 0.000 description 1
- 241000589155 Agrobacterium tumefaciens Species 0.000 description 1
- 208000024827 Alzheimer disease Diseases 0.000 description 1
- 241000219194 Arabidopsis Species 0.000 description 1
- 235000017060 Arachis glabrata Nutrition 0.000 description 1
- 244000105624 Arachis hypogaea Species 0.000 description 1
- 235000010777 Arachis hypogaea Nutrition 0.000 description 1
- 235000018262 Arachis monticola Nutrition 0.000 description 1
- 108010006654 Bleomycin Proteins 0.000 description 1
- 240000002791 Brassica napus Species 0.000 description 1
- 235000004977 Brassica sinapistrum Nutrition 0.000 description 1
- OYPRJOBELJOOCE-UHFFFAOYSA-N Calcium Chemical compound [Ca] OYPRJOBELJOOCE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 244000060011 Cocos nucifera Species 0.000 description 1
- 235000013162 Cocos nucifera Nutrition 0.000 description 1
- 241000195493 Cryptophyta Species 0.000 description 1
- IMXSCCDUAFEIOE-UHFFFAOYSA-N D-Octopin Natural products OC(=O)C(C)NC(C(O)=O)CCCN=C(N)N IMXSCCDUAFEIOE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- IMXSCCDUAFEIOE-RITPCOANSA-N D-octopine Chemical compound [O-]C(=O)[C@@H](C)[NH2+][C@H](C([O-])=O)CCCNC(N)=[NH2+] IMXSCCDUAFEIOE-RITPCOANSA-N 0.000 description 1
- 240000003133 Elaeis guineensis Species 0.000 description 1
- 235000001950 Elaeis guineensis Nutrition 0.000 description 1
- YQYJSBFKSSDGFO-UHFFFAOYSA-N Epihygromycin Natural products OC1C(O)C(C(=O)C)OC1OC(C(=C1)O)=CC=C1C=C(C)C(=O)NC1C(O)C(O)C2OCOC2C1O YQYJSBFKSSDGFO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 208000034454 F12-related hereditary angioedema with normal C1Inh Diseases 0.000 description 1
- 229930182566 Gentamicin Natural products 0.000 description 1
- CEAZRRDELHUEMR-URQXQFDESA-N Gentamicin Chemical compound O1[C@H](C(C)NC)CC[C@@H](N)[C@H]1O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O[C@@H]2[C@@H]([C@@H](NC)[C@@](C)(O)CO2)O)[C@H](N)C[C@@H]1N CEAZRRDELHUEMR-URQXQFDESA-N 0.000 description 1
- 239000005562 Glyphosate Substances 0.000 description 1
- 244000020551 Helianthus annuus Species 0.000 description 1
- 235000003222 Helianthus annuus Nutrition 0.000 description 1
- 108010033040 Histones Proteins 0.000 description 1
- 206010020751 Hypersensitivity Diseases 0.000 description 1
- 241000252102 Muraenesox Species 0.000 description 1
- 229930193140 Neomycin Natural products 0.000 description 1
- 241000238413 Octopus Species 0.000 description 1
- 240000007594 Oryza sativa Species 0.000 description 1
- 235000007164 Oryza sativa Nutrition 0.000 description 1
- 238000010222 PCR analysis Methods 0.000 description 1
- 235000021319 Palmitoleic acid Nutrition 0.000 description 1
- 241000237509 Patinopecten sp. Species 0.000 description 1
- 235000010627 Phaseolus vulgaris Nutrition 0.000 description 1
- 239000002202 Polyethylene glycol Substances 0.000 description 1
- 241001274189 Pomatomus saltatrix Species 0.000 description 1
- 238000003559 RNA-seq method Methods 0.000 description 1
- 108020004511 Recombinant DNA Proteins 0.000 description 1
- 235000004443 Ricinus communis Nutrition 0.000 description 1
- 206010039966 Senile dementia Diseases 0.000 description 1
- 101710199394 TATA-box-binding protein 3 Proteins 0.000 description 1
- 239000004098 Tetracycline Substances 0.000 description 1
- 108090000848 Ubiquitin Proteins 0.000 description 1
- 102000044159 Ubiquitin Human genes 0.000 description 1
- UWHZIFQPPBDJPM-FPLPWBNLSA-M Vaccenic acid Natural products CCCCCC\C=C/CCCCCCCCCC([O-])=O UWHZIFQPPBDJPM-FPLPWBNLSA-M 0.000 description 1
- 210000001015 abdomen Anatomy 0.000 description 1
- 150000007513 acids Chemical class 0.000 description 1
- 208000026935 allergic disease Diseases 0.000 description 1
- 230000007815 allergy Effects 0.000 description 1
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 description 1
- 102000004139 alpha-Amylases Human genes 0.000 description 1
- 108090000637 alpha-Amylases Proteins 0.000 description 1
- 229940024171 alpha-amylase Drugs 0.000 description 1
- 229960000723 ampicillin Drugs 0.000 description 1
- AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N ampicillin Chemical compound C1([C@@H](N)C(=O)N[C@H]2[C@H]3SC([C@@H](N3C2=O)C(O)=O)(C)C)=CC=CC=C1 AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N 0.000 description 1
- 239000003242 anti bacterial agent Substances 0.000 description 1
- 230000000692 anti-sense effect Effects 0.000 description 1
- 101150103518 bar gene Proteins 0.000 description 1
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 1
- 229960001561 bleomycin Drugs 0.000 description 1
- OYVAGSVQBOHSSS-UAPAGMARSA-O bleomycin A2 Chemical compound N([C@H](C(=O)N[C@H](C)[C@@H](O)[C@H](C)C(=O)N[C@@H]([C@H](O)C)C(=O)NCCC=1SC=C(N=1)C=1SC=C(N=1)C(=O)NCCC[S+](C)C)[C@@H](O[C@H]1[C@H]([C@@H](O)[C@H](O)[C@H](CO)O1)O[C@@H]1[C@H]([C@@H](OC(N)=O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1)O)C=1N=CNC=1)C(=O)C1=NC([C@H](CC(N)=O)NC[C@H](N)C(N)=O)=NC(N)=C1C OYVAGSVQBOHSSS-UAPAGMARSA-O 0.000 description 1
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 1
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 1
- 238000009395 breeding Methods 0.000 description 1
- 230000001488 breeding effect Effects 0.000 description 1
- 229910052791 calcium Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000011575 calcium Substances 0.000 description 1
- 150000001721 carbon Chemical group 0.000 description 1
- 125000002915 carbonyl group Chemical group [*:2]C([*:1])=O 0.000 description 1
- 230000009084 cardiovascular function Effects 0.000 description 1
- 235000012000 cholesterol Nutrition 0.000 description 1
- SECPZKHBENQXJG-UHFFFAOYSA-N cis-palmitoleic acid Natural products CCCCCCC=CCCCCCCCC(O)=O SECPZKHBENQXJG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- UWHZIFQPPBDJPM-FPLPWBNLSA-N cis-vaccenic acid Chemical compound CCCCCC\C=C/CCCCCCCCCC(O)=O UWHZIFQPPBDJPM-FPLPWBNLSA-N 0.000 description 1
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 description 1
- 238000007796 conventional method Methods 0.000 description 1
- 239000002537 cosmetic Substances 0.000 description 1
- 239000008406 cosmetic ingredient Substances 0.000 description 1
- 238000009402 cross-breeding Methods 0.000 description 1
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 1
- 235000013399 edible fruits Nutrition 0.000 description 1
- 238000004520 electroporation Methods 0.000 description 1
- 239000003623 enhancer Substances 0.000 description 1
- 230000002708 enhancing effect Effects 0.000 description 1
- 238000001976 enzyme digestion Methods 0.000 description 1
- 210000003527 eukaryotic cell Anatomy 0.000 description 1
- 238000011156 evaluation Methods 0.000 description 1
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 1
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 description 1
- 235000019197 fats Nutrition 0.000 description 1
- 230000004136 fatty acid synthesis Effects 0.000 description 1
- 239000012467 final product Substances 0.000 description 1
- 235000013373 food additive Nutrition 0.000 description 1
- 239000002778 food additive Substances 0.000 description 1
- 235000013376 functional food Nutrition 0.000 description 1
- BRZYSWJRSDMWLG-CAXSIQPQSA-N geneticin Natural products O1C[C@@](O)(C)[C@H](NC)[C@@H](O)[C@H]1O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O[C@@H]2[C@@H]([C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](C(C)O)O2)N)[C@@H](N)C[C@H]1N BRZYSWJRSDMWLG-CAXSIQPQSA-N 0.000 description 1
- 229960002518 gentamicin Drugs 0.000 description 1
- IAJOBQBIJHVGMQ-BYPYZUCNSA-N glufosinate-P Chemical compound CP(O)(=O)CC[C@H](N)C(O)=O IAJOBQBIJHVGMQ-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 1
- XDDAORKBJWWYJS-UHFFFAOYSA-N glyphosate Chemical compound OC(=O)CNCP(O)(O)=O XDDAORKBJWWYJS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229940097068 glyphosate Drugs 0.000 description 1
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 1
- 230000007773 growth pattern Effects 0.000 description 1
- 230000036541 health Effects 0.000 description 1
- 208000019622 heart disease Diseases 0.000 description 1
- 230000004217 heart function Effects 0.000 description 1
- 229910001385 heavy metal Inorganic materials 0.000 description 1
- 208000016861 hereditary angioedema type 3 Diseases 0.000 description 1
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 1
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 description 1
- 230000000977 initiatory effect Effects 0.000 description 1
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 1
- 235000021332 kidney beans Nutrition 0.000 description 1
- RYZCLUQMCYZBJQ-UHFFFAOYSA-H lead(2+);dicarbonate;dihydroxide Chemical compound [OH-].[OH-].[Pb+2].[Pb+2].[Pb+2].[O-]C([O-])=O.[O-]C([O-])=O RYZCLUQMCYZBJQ-UHFFFAOYSA-H 0.000 description 1
- 230000013016 learning Effects 0.000 description 1
- KQQKGWQCNNTQJW-UHFFFAOYSA-N linolenic acid Natural products CC=CCCC=CCC=CCCCCCCCC(O)=O KQQKGWQCNNTQJW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000000944 linseed oil Substances 0.000 description 1
- 235000021388 linseed oil Nutrition 0.000 description 1
- 230000013011 mating Effects 0.000 description 1
- 230000001404 mediated effect Effects 0.000 description 1
- QSHDDOUJBYECFT-UHFFFAOYSA-N mercury Chemical compound [Hg] QSHDDOUJBYECFT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229910052753 mercury Inorganic materials 0.000 description 1
- 238000000520 microinjection Methods 0.000 description 1
- 229960004927 neomycin Drugs 0.000 description 1
- 238000010899 nucleation Methods 0.000 description 1
- 235000021313 oleic acid Nutrition 0.000 description 1
- 239000002245 particle Substances 0.000 description 1
- 235000020232 peanut Nutrition 0.000 description 1
- 239000002957 persistent organic pollutant Substances 0.000 description 1
- 230000008488 polyadenylation Effects 0.000 description 1
- 229920001223 polyethylene glycol Polymers 0.000 description 1
- 230000008569 process Effects 0.000 description 1
- 230000006798 recombination Effects 0.000 description 1
- 238000005215 recombination Methods 0.000 description 1
- 235000009566 rice Nutrition 0.000 description 1
- 235000020637 scallop Nutrition 0.000 description 1
- 210000004894 snout Anatomy 0.000 description 1
- 229960005322 streptomycin Drugs 0.000 description 1
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 1
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 1
- 229960002180 tetracycline Drugs 0.000 description 1
- 229930101283 tetracycline Natural products 0.000 description 1
- 235000019364 tetracycline Nutrition 0.000 description 1
- 150000003522 tetracyclines Chemical class 0.000 description 1
- 230000001988 toxicity Effects 0.000 description 1
- 231100000419 toxicity Toxicity 0.000 description 1
- 238000010361 transduction Methods 0.000 description 1
- 230000026683 transduction Effects 0.000 description 1
- 238000011144 upstream manufacturing Methods 0.000 description 1
- 230000017260 vegetative to reproductive phase transition of meristem Effects 0.000 description 1
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
Images
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
- C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
- C12N15/8241—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology
- C12N15/8242—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with non-agronomic quality (output) traits, e.g. for industrial processing; Value added, non-agronomic traits
- C12N15/8243—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with non-agronomic quality (output) traits, e.g. for industrial processing; Value added, non-agronomic traits involving biosynthetic or metabolic pathways, i.e. metabolic engineering, e.g. nicotine, caffeine
- C12N15/8247—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with non-agronomic quality (output) traits, e.g. for industrial processing; Value added, non-agronomic traits involving biosynthetic or metabolic pathways, i.e. metabolic engineering, e.g. nicotine, caffeine involving modified lipid metabolism, e.g. seed oil composition
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
- A01H—NEW PLANTS OR NON-TRANSGENIC PROCESSES FOR OBTAINING THEM; PLANT REPRODUCTION BY TISSUE CULTURE TECHNIQUES
- A01H1/00—Processes for modifying genotypes ; Plants characterised by associated natural traits
- A01H1/02—Methods or apparatus for hybridisation; Artificial pollination ; Fertility
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
- A01H—NEW PLANTS OR NON-TRANSGENIC PROCESSES FOR OBTAINING THEM; PLANT REPRODUCTION BY TISSUE CULTURE TECHNIQUES
- A01H1/00—Processes for modifying genotypes ; Plants characterised by associated natural traits
- A01H1/04—Processes of selection involving genotypic or phenotypic markers; Methods of using phenotypic markers for selection
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
- A01H—NEW PLANTS OR NON-TRANSGENIC PROCESSES FOR OBTAINING THEM; PLANT REPRODUCTION BY TISSUE CULTURE TECHNIQUES
- A01H5/00—Angiosperms, i.e. flowering plants, characterised by their plant parts; Angiosperms characterised otherwise than by their botanic taxonomy
- A01H5/10—Seeds
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
- A01H—NEW PLANTS OR NON-TRANSGENIC PROCESSES FOR OBTAINING THEM; PLANT REPRODUCTION BY TISSUE CULTURE TECHNIQUES
- A01H6/00—Angiosperms, i.e. flowering plants, characterised by their botanic taxonomy
- A01H6/66—Pedaliaceae, e.g. sesame
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
- C12N15/52—Genes encoding for enzymes or proenzymes
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/0004—Oxidoreductases (1.)
- C12N9/0071—Oxidoreductases (1.) acting on paired donors with incorporation of molecular oxygen (1.14)
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/93—Ligases (6)
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Y—ENZYMES
- C12Y114/00—Oxidoreductases acting on paired donors, with incorporation or reduction of molecular oxygen (1.14)
- C12Y114/19—Oxidoreductases acting on paired donors, with incorporation or reduction of molecular oxygen (1.14) with oxidation of a pair of donors resulting in the reduction of molecular oxygen to two molecules of water (1.14.19)
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Y—ENZYMES
- C12Y114/00—Oxidoreductases acting on paired donors, with incorporation or reduction of molecular oxygen (1.14)
- C12Y114/19—Oxidoreductases acting on paired donors, with incorporation or reduction of molecular oxygen (1.14) with oxidation of a pair of donors resulting in the reduction of molecular oxygen to two molecules of water (1.14.19)
- C12Y114/19003—Linoleoyl-CoA desaturase (1.14.19.3)
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Y—ENZYMES
- C12Y602/00—Ligases forming carbon-sulfur bonds (6.2)
- C12Y602/01—Acid-Thiol Ligases (6.2.1)
- C12Y602/01003—Long-chain-fatty-acid-CoA ligase (6.2.1.3)
Landscapes
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Zoology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Environmental Sciences (AREA)
- Botany (AREA)
- Developmental Biology & Embryology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Physiology (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Natural Medicines & Medicinal Plants (AREA)
- Nutrition Science (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Oil, Petroleum & Natural Gas (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
Abstract
본 발명은 갈고리 흰오징어(berryteuthis magister) 유래 델타 4 불포화효소 유전자, 지방산 연장효소 유전자, 델타 5 불포화효소 유전자 및 오메가 3 불포화효소 유전자와 갯장어(Muraenesox cinereus) 유래 델타 6 불포화효소 유전자를 동시에 발현하여 DHA를 생합성하는 형질전환 식물체의 제조방법, 상기 방법으로 제조된 형질전환 식물체 및 이의 종자에 관한 것으로, 본 발명의 DHA 생합성 유전자 5종을 리놀레산을 함유하는 들깨 등의 유지식물에서 동시에 발현시키는 경우, 식물에서 DHA를 생성할 수 있다. 따라서 고기능성 들깨 등의 유지식물의 품종 개발에 유용하게 활용할 수 있다.
Description
본 발명은 갈고리 흰오징어(berryteuthis magister) 유래 델타 4 불포화효소 유전자, 지방산 연장효소 유전자, 델타 5 불포화효소 유전자, 및 오메가 3 불포화효소 유전자와 갯장어(Muraenesox cinereus) 유래 델타 6 불포화효소 유전자를 동시에 발현하여 DHA를 생합성하는 형질전환 식물체의 제조방법, 상기 방법으로 제조된 형질전환 식물체 및 이의 종자에 관한 것이다.
장쇄형 불포화 지방산(polyunsaturated fatty acids, PUFAs)는 오메가-3, 오메가-6 로 크게 구분된다. PUFAs는 한쪽 말단이 카르보닐(carboxyl)기 또 다른 말단은 메틸(methyl)기로 이루어진 탄소원자로 연결된 긴 사슬로 구성되어있다. 오메가-3 지방산은 methyl기 말단으로부터 3번째 탄소위치에 이중결합이 있는 지방산으로써, 때때로 “n-3s”로 표시되며, 생선류의 기름과 아마씨 기름에 포함되어 있다. 영양학적으로 중요한 오메가-3 지방산은 알파-리놀렌산(alpha-linolenic acid, ALA), 에이코사펜타엔산(eicosapentaenoic acid, EPA), 도코사헥사엔산(docosahexaenoic acid, DHA) 등이 있다.
장쇄형 오메가3 지방산은 콜레스테롤을 제거시켜서 심혈관계 기능을 개선한다. 특히 DHA는 뇌 기능 강화와 기억력 증진을 통한 영유아의 뇌 기능 성장 발달과 학습기능을 향상시키고, 혈중 콜레스테롤을 낮추며, 심장의 기능을 정상화시켜 심장질환의 위험을 낮추는 것으로 알려져 있다. 또한, 노인성 치매 예방 및 치료효과가 있는 것으로 알려져 있다. 따라서 식품 첨가제, 화장품 원료 및 의약품 시장에서 큰 시장을 형성하고 있으며, 글로벌 시장규모(‘12, 254억불) 및 수요 증가 추세로 많은 거대 다국적기업들의 개발 타깃이 되고 있다.
DHA는 주로 참치와 같은 등 푸른 생선으로부터 생산하고 있으나, 다량의 DHA를 식품에 첨가하게 되면 물고기 특유의 비린내 때문에 상품성에 문제가 되며, 어유를 통한 DHA 등 기능성 지질의 섭취는 해양환경 오염으로 인한 메칠 수은 같은 중금속, 다이옥신 등 유기 오염물질들로 인해 유아나 수유기의 산모에게는 섭취가 제한되는 단점이 있다.
해양 조류를 통해서도 DHA 생산이 가능하나, 낮은 성장률로 인해 DHA의 대량 생산을 위해서는 고가의 장비를 필요로 한다. 최근 이러한 문제점들을 해결하고 저비용 고효율의 DHA를 생산하고자 식물 종자에서의 발현 시스템을 이용한 PUFA 생산에 대한 관심이 높아지고 있다.
본 발명의 해결하고자 하는 과제는 (a) 서열번호1의 갈고리 흰오징어(berryteuthis magister) 유래 델타 4 불포화효소(Delta 4 Desaturase) 유전자 및 서열번호2의 갈고리 흰오징어 유래 지방산 연장효소(fatty acid elongase) 유전자를 포함하는 pClean A 운반체로 형질전환된 pClean A 형질전환 식물체를 제조하는 단계, (b) 서열번호3의 갈고리 흰오징어 유래 델타 5 불포화효소(Delta 5 desaturase) 유전자, 서열번호4의 갈고리 흰오징어 유래 오메가 3 불포화효소 유전자(ω3 desaturase) 및 서열번호5의 갯장어(Muraenesox cinereus) 유래 델타 6 불포화효소(delta 6 desaturase) 유전자를 포함하는 pClean B 운반체로 형질전환된 pClean B 형질전환 식물체를 제조하는 단계, 및 (c) 상기 pClean A 형질전환 식물체와 상기 pClean B 형질전환 식물체를 교배하여 델타 4 불포화효소, 지방산 연장효소, 델타 5 불포화효소, 오메가 3 불포화효소 및 델타 6 불포화효소 유전자 5종을 동시에 발현하는 형질전환 식물체를 선발하는 단계를 포함하는 DHA를 생합성하는 형질전환 식물체의 제조방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 과제는 상기 제조방법으로 제조된 DHA를 생합성하는 형질전환 식물체를 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 과제는 상기 형질전환 식물체의 종자를 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 과제는 (a) 서열번호1의 갈고리 흰오징어(berryteuthis magister) 유래 델타 4 불포화효소(Delta 4 Desaturase) 유전자 및 서열번호2의 갈고리 흰오징어 유래 지방산 연장효소(fatty acid elongase) 유전자를 포함하는 pClean A 운반체 및 (b) 서열번호3의 갈고리 흰오징어 유래 델타 5 불포화효소(Delta 5 desaturase) 유전자, 서열번호4의 갈고리 흰오징어 유래 오메가 3 불포화효소(ω3 desaturase) 유전자 및 서열번호5의 갯장어(Muraenesox cinereus) 유래 델타 6 불포화효소(delta 6 desaturase) 유전자를 포함하는 pClean B 운반체를 포함하는 DHA의 생합성 유전자의 발현을 증가시키기 위한 식물체의 형질전환용 조성물을 제공하는 것이다.
상기의 과제를 해결하기 위해 본 발명은 하나의 양태로 (a) 서열번호1의 갈고리 흰오징어(berryteuthis magister) 유래 델타 4 불포화효소(Delta 4 Desaturase) 유전자및 서열번호2의 갈고리 흰오징어 유래 지방산 연장효소(fatty acid elongase) 유전자를 포함하는 pClean A 운반체로 형질전환된 pClean A 형질전환 식물체를 제조하는 단계, (b) 서열번호3의 갈고리 흰오징어 유래 델타 5 불포화효소(Delta 5 desaturase) 유전자, 서열번호4의 갈고리 흰오징어 유래 오메가 3 불포화효소(ω3 desaturase) 유전자 및 서열번호5의 갯장어(Muraenesox cinereus) 유래 델타 6 불포화효소(delta 6 desaturase) 유전자를 포함하는 pClean B 운반체로 형질전환된 pClean B 형질전환 식물체를 제조하는 단계, 및 (c) 상기 pClean A 형질전환 식물체와 상기 pClean B 형질전환 식물체를 교배하여 델타 4 불포화효소, 지방산 연장효소, 델타 5 불포화효소, 오메가 3 불포화효소 및 델타 6 불포화효소 유전자 5종을 동시에 발현하는 형질전환 식물체를 선발하는 단계를 포함하는 DHA를 생합성하는 형질전환 식물체의 제조방법을 제공한다.
본 발명에서 “델타 4 불포화효소(Delta 4 Desaturase) 유전자”는 델타 4 불포화효소를 코딩하는 유전자로, 서열번호1의 염기서열로 이루어지며, 갈고리 흰오징어에서 분리된 것을 특징으로 한다.
본 발명에서 “지방산 연장효소(fatty acid elongase) 유전자”는 지방산 연장효소를 코딩하는 유전자로, 서열번호2의 염기서열로 이루어지며, 갈고리 흰오징어에서 분리된 것을 특징으로 한다.
본 발명에서 “델타 5 불포화효소(Delta 5 desaturase) 유전자”는 델타 5 불포화효소를 코딩하는 유전자로, 서열번호3의 염기서열로 이루어지며, 갈고리 흰오징어에서 분리된 것을 특징으로 한다.
본 발명에서 “오메가 3 불포화효소(ω3 desaturase) 유전자”는 오메가 3 불포화효소(ω3 desaturase)를 코딩하는 유전자로, 서열번호4의 염기서열로 이루어지며, 갈고리 흰오징어에서 분리된 것을 특징으로 한다.
본 발명에서 “갈고리 흰오징어(schoolmaster gonate squid; Berryteuthis magister)”는 동해 심해 해역(독도 인근)인 600m 이하의 깊은 수심에서 대량 서식하는 두족류로, 심해 자원 및 식용으로의 이용 가능성으로 주목받고 있는 어종이다.
본 발명에서 “델타 6 불포화효소(delta 6 desaturase) 유전자”는 델타 6 불포화효소(delta 6 desaturase)를 코딩하는 유전자로, 서열번호5의 염기서열로 이루어지며, 갯장어(Muraenesox cinereus)에서 분리된 것을 특징으로 한다.
본 발명에서 “갯장어(Muraenesox cinereus)”는 몸이 뱀장어처럼 길고 약 120-200cm이다. 주둥이는 길고 입은 몹시 크며 앞쪽에 날카로운 송곳니가 있다. 위턱이 아래턱보다 약간 앞쪽으로 튀어나와 있고, 양쪽에는 2~3줄로 된 이빨이 있다. 앞쪽에는 억세고 긴 송곳니가 있다. 배지느러미는 없고 몸빛은 등쪽이 회갈색, 배쪽은 은백색인데, 등지느러미와 뒷지느러미의 끝이 검다. 수심 20-50m의 모래 바닥과 암초가 있는 곳에 살지만, 때로는 깊은 바다로 이동하기도 한다.
본 발명에서 “운반체”는 세포 내로 전달하는 DNA 단편(들), 핵산 분자를 지칭할 때 사용된다. 용어 "벡터"는 흔히 "운반체"와 호환하여 사용된다. 벡터는 DNA를 복제시키고, 숙주세포에서 독립적으로 재생산될 수 있다. 본 발명에서 “발현 벡터”는 목적한 코딩 서열과, 특정 숙주 생물에서 작동가능하게 연결된 코딩 서열을 발현하는데 필수적인 적정 핵산 서열을 포함하는 재조합 DNA 분자를 의미한다. 진핵세포에서 이용 가능한 프로모터, 인핸서, 종결신호 및 폴리아데닐레이션 신호는 공지되어 있다.
본 발명에서 “재조합”은 세포가 이종의 핵산을 복제하거나, 상기 핵산을 발현하거나 또는 펩티드, 이종의 펩티드 또는 이종의 핵산에 의해 암호된 단백질을 발현하는 세포를 지칭하는 것이다. 재조합 세포는 상기 세포의 천연 형태에서는 발견되지 않는 유전자 또는 유전자 절편을, 센스 또는 안티센스 형태 중 하나로 발현할 수 있다. 또한 재조합 세포는 천연 상태의 세포에서 발견되는 유전자를 발현할 수 있으며, 그러나 상기 유전자는 변형된 것으로서 인위적인 수단에 의해 세포 내 재도입된 것이다.
본 발명의 “벡터”는 선택성 마커로서, 통상의 기술분야에서 통상적으로 이용되는 항생제 내성 유전자를 포함할 수 있으며, 예를 들어 암피실린, 겐타마이신, 카베니실린, 클로람페니콜, 스트렙토마이신, 카나마이신, 게네티신, 네오마이신 및 테트라사이클린에 대한 내성 유전자가 있다.
상기 선택성 마커는 통상적으로 화학적인 방법으로 선택될 수 있는 특성을 갖는 핵산 서열로, 형질전환된 세포를 비형질전환 세포로부터 구별할 수 있는 모든 유전자가 이에 해당된다. 그 예로는 글리포세이트(glyphosate), 글루포시네이트암모늄(glufosinate ammonium) 또는 포스피노트리신(phosphinothricin)과 같은 제초제 저항성 유전자, 카나마이신(kanamycin), G418, 블레오마이신(Bleomycin), 하이그로마이신(hygromycin), 클로람페니콜(chloramphenicol)과 같은 항생제 내성 유전자가 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명의 벡터는 바람직하게 하나의 선택성 마커를 포함할 수 있으며, 구체적으로 상기 선택성 마커는 카나마이신 내성 유전자일 수 있다.
본 발명에서 “프로모터”란 구조 유전자로부터의 DNA 업스트림의 영역을 의미하며 전사를 개시하기 위하여 RNA 폴리머라아제가 결합하는 DNA 분자를 말한다. “식물 프로모터”는 식물 세포에서 전사를 개시할 수 있는 프로모터이다.
본 발명의 프로모터는 vicillin, CaMV 35S, 액틴, 유비퀴틴, pEMU, MAS 또는 히스톤 프로모터 일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 재조합 벡터에서, 통상의 터미네이터를 사용할 수 있으며, 그 예로는 노팔린 신타아제(NOS), 벼 α 아밀라아제 RAmy1 A 터미네이터, 파세올린(phaseoline) 터미네이터 및 아그로박테리움 투메파시엔스(Agrobacterium tumefaciens)의 옥토파인(Octopine) 유전자의 터미네이터 등이 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. 터미네이터에 의해 식물체에서의 전사의 확실성 및 효율을 증가시킬 수 있다.
본 발명에 있어서 식물체의 형질전환은 유전자를 식물체에 전이시키는 임의의 방법을 의미한다. 본 발명에 있어서 식물체의 형질전환은 아그로박테리움을 이용한 통상의 방법에 의해 달성할 수 있다. 예컨대, 본 발명에 따른 pClean A 또는 pClean B 운반체를 아그로박테리움 속 미생물에 형질전환시킨 다음, 상기 형질전환된 아그로박테리움 속 미생물을 대상 식물의 조직(하이포코틸 절단면)에 감염시켜 형질전환된 식물체를 확보할 수 있었다. 이외에도 원형질체에 대한 칼슘/폴리에틸렌 글리콜 방법, 원형질체의 전기천공법, 식물 요소로의 현미주사법, 각종 식물 요소의 (DNA 또는 RNA-코팅된) 입자 충격법 등의 방법을 이용할 수 있으며, 당업자에 의해 적절하게 선택될 수 있다.
본 발명에 따른 바람직한 방법은 아그로박테리움 매개된 형질전환을 포함한다.
본 발명에서 “pClean A 운반체”는 서열번호1의 갈고리 흰오징어(berryteuthis magister) 유래 델타 4 불포화효소(Delta 4 Desaturase) 유전자 및 서열번호2의 갈고리 흰오징어 유래 지방산 연장효소(fatty acid elongase) 유전자를 포함하며, “pClean A 형질전환 식물체”는 상기 pClean A운반체로 형질전환된 식물체로, 서열번호1의 갈고리 흰오징어(berryteuthis magister) 유래 델타 4 불포화효소(Delta 4 Desaturase) 유전자 및 서열번호2의 갈고리 흰오징어 유래 지방산 연장효소(fatty acid elongase) 유전자가 발현되는 것을 특징으로 한다.
본 발명에서 “pClean B 운반체”는 서열번호3의 갈고리 흰오징어 유래 델타 5 불포화효소(Delta 5 desaturase) 유전자, 서열번호4의 갈고리 흰오징어 유래 오메가 3 불포화효소(ω3 desaturase) 유전자 및 서열번호5의 갯장어(Muraenesox cinereus) 유래 델타 6 불포화효소(delta 6 desaturase) 유전자를 포함하며, “pClean B 형질전환 식물체”는 상기 pClean B 운반체로 형질전환된 식물체로, 서열번호3의 갈고리 흰오징어 유래 델타 5 불포화효소(Delta 5 desaturase) 유전자, 서열번호4의 갈고리 흰오징어 유래 오메가 3 불포화효소(ω3 desaturase) 유전자 및 서열번호5의 갯장어(Muraenesox cinereus) 유래 델타 6 불포화효소(delta 6 desaturase) 유전자가 발현되는 것을 특징으로 한다.
일반적으로 식물체는 장쇄형 불포화 지방산(PUFAs)을 생합성 하지 못하는 것으로 알려져 있다. 따라서 DHA 생합성 전구물질인 알파-리놀렌산(Alpha-linolenic acid, ALA, C18;3, n3)를 다량 포함하고 있는 식물체인 들깨(ALA 함량이 62 내지 65%)에서 DHA를 생합성하기 위해서 DHA 생합성 유전자 5종이 동시에 다중 발현되어야 한다. 구체적으로 DHA 생합성 유전자인 델타 4 불포화효소(Delta 4 Desaturase), 지방산 연장효소(fatty acid elongase), 델타 5 불포화효소(Delta 5 desaturase), 오메가 3 불포화효소(ω3 desaturase) 및 델타 6 불포화효소(delta 6 desaturase)의 유전자 5종이 동시에 다중 발현되어야 한다.
본 발명에서 “DHA 생합성 유전자”는 도코사헥산엔산(docosahexaenoic acid, DHA) 또는 이의 전구체인 스테아리도닌산(stearidonic acid, SDA), 에이코사테트라에노산(eicosatetraenoic acid, ETA), 에이코사펜타에노산(eicosapentaenoic acid, EPA) 또는 도코사펜타에산(docosapetaenoic acid, DPA)를 생합성하는데 관여하는 유전자로, 델타 4 불포화효소, 지방산 연장효소, 델타 5 불포화효소, 오메가 3 불포화효소 유전자 및 델타 6 불포화효소 유전자를 포함한다.
구체적으로 식물체에 포함된 리놀렌산(Linolenic acid, LA, C8;2 n6)는 오메가 3 불포화효소에 의해 오메가 3 지방산의 일종인 알파-리놀렌산(Alpha-linolenic acid, ALA, C18;3, n3)로 전환된고, 상기 ALA를 델타 6 불포화효소가 스테아리도닌산(stearidonic acid, SDA)으로 전환시키며, 상기 SDA는 지방산 연장효소에 의해 에이코사테트라에노산(eicosatetraenoic acid, ETA)로 전환된다. 상기 ETA는 델타 5 불포화효소에 의해 에이코사펜타에노산(eicosapentaenoic acid, EPA)로 전환되며, 상기 EPA는 지방산 연장효소에 의해 도코사펜타에산(docosapetaenoic acid, DPA)로 전환되고, 상기 DPA는 델타 4 불포화효소에 의해 도코사헥산엔산(docosahexaenoic acid, DHA)로 전환된다.
또한, 식물에 포함된 감마리놀렌산(γ-linolenic acid, GLA)이 지방산 연장효소에 의해 디호모감마리놀렌산(Dihomo-γ-linolenic acid, DGLA)으로 전환되며, 상기 DGLA가 델타 5 불포화효소에 의해 아라키도닌산(arachidonic acid, ARA),으로 전환된다.
델타 4 불포화효소 유전자 및 지방산 연장효소 유전자를 발현하는 pClean A 형질전환 식물체와 델타 5 불포화효소 유전자, 오메가 3 불포화효소 유전자 및 델타 6 불포화효소 유전자를 발현하는 pClean B 형질전환 식물체를 교배 육종하면, 상기 델타 4 불포화효소, 지방산 연장효소, 델타 5 불포화효소, 오메가 3 불포화효소 및 델타 6 불포화효소 유전자 5종을 동시에 다중 발현하는 형질전환 식물체를 제조할 수 있으며, 상기 유전자 5종을 동시에 다중 발현하는 형질전환체는 DHA 및 이들 전구체를 생합성할 수 있다.
따라서 본 발명의 형질전환 식물체의 제조방법은 상기 pClean A 형질전환 식물체와 상기 pClean B 형질전환 식물체를 교배하여 델타 4 불포화효소, 지방산 연장효소, 델타 5 불포화효소, 오메가 3 불포화효소 및 델타 6 불포화효소 유전자 5종을 동시에 발현하는 형질전환 식물체를 선발하는 것을 특징으로 한다.
본 발명의 제조방법에 의해 제조된 형질전환 식물체는 델타 4 불포화효소, 지방산 연장효소, 델타 5 불포화효소, 오메가 3 불포화효소 및 델타 6 불포화효소의 발현을 통해 도코사헥산엔산(docosahexaenoic acid, DHA)의 전구체인 스테아리도닌산(stearidonic acid, SDA), 에이코사테트라에노산(eicosatetraenoic acid, ETA), 에이코사펜타에노산(eicosapentaenoic acid, EPA), 및 도코사펜타에산(docosapetaenoic acid, DPA)를 생합성할 수 있으며, 최종산물인 도코사헥산엔산(docosahexaenoic acid, DHA)을 생합성하는 것을 특징으로 한다.
또한, 본 발명의 제조방법에 의해 제조된 형질전환 식물체는 지방산 연장효소 및 델타 5 불포화효소의 발현에 의해 아라키도닌산(arachidonic acid, ARA)를 생합성할 수 있다.
본 발명의 실시예에서 갈고리 흰오징어에서 서열번호1의 델타 4 불포화효소 유전자, 서열번호2의 지방산 연장효소 유전자, 서열번호3의 델타 5 불포화효소 유전자 및 서열번호4의 오메가 3 불포화효소 유전자를 분리하였으며, 효모 시스템을 이용하여 델타 4 불포화효소, 지방산 연장효소, 델타 5 불포화효소의 기능을 확인하였다.
구체적으로 갈고리 흰오징어에서 분리된 서열번호1의 델타 4 불포화효소 유전자로 형질전환한 효모에서 DPA의 DHA로의 전환비율이 61.98%로 Thraustochytrium sp(4.5% 및 21%) 및 Pavlova lutheri(44%)에서 분리된 델타 4 불포화효소 유전자와 비교하여 DPA의 DHA로의 전환비율이 우수하여 DHA 생합성에 갈고리 흰오징어 유래 델타 4 불포화효소 유전자가 우수한 효과를 가짐을 확인하였다.
또한, 갈고리 흰오징어에서 분리된 서열번호 2의 지방산 연장효소 유전자로 형질전환한 효모 시스템에서, 팔미트산(Palmictic acid)은 스테아르산(Stearic acid)으로 16.8%의 전환비율을 나타냈으며, 올레산(Oleic acid)은 Eisosenoic acid로 23.6%의 전환비율을 나타냈고, GLA의 DGLA로의 전환비율이 53.67%로 측정되어 각 기질에 대한 전환비율이 우수함을 확인하였다.
또한, 갈고리 흰오징어에서 분리된 서열번호3의 델타 5 불포화효소 유전자로 형질전환한 효모에서 DGLA의 ARA로의 전환비율이 14.5%로 우수함을 확인하였다.
도 1a에 도시된 바와 같이 상기 델타 4 불포화효소, 델타 5 불포화효소 및 지방산 연장효소 유전자가 DHA 및 DHA의 전구체(SDA, ETA, EPA, EPA 및 DPA)의 생합성에 관여하며, 효모시스템에서 델타 4 불포화효소, 델타 5 불포화효소 또는 지방산 연장효소의 각 기질에 대한 전환비율이 우수함을 확인하였는바, 본 발명의 형질전환 식물체는 갈고리 흰오징어 유래 델타 4 불포화효소, 델타 5 불포화효소 및 지방산 연장효소 유전자의 발현에 의해 DHA 또는 DHA 전구체를 생합성할 수 있으며, DHA 또는 DHA 전구체의 생합성 효율이 우수할 수 있다.
또한, 효모시스템에서 갈고리 흰오징어 유래 지방산 연장효소가 GLA를 DGLA로 전환시킴을 확인하였으며, 갈고리 흰오징어 유래 델타 5 불포화효소가 DGLA를 ARA로 전환시킴을 확인하였고 각 기질에 대한 각 효소의 전환 효율이 우수함을 확인하였는바, 본 발명의 형질전환 식물체는 갈고리 흰오징어 유래 델타 5 불포화효소 및 지방산 연장효소 유전자 발현에 의해 ARA 또는 ARA의 전구체인 DGLA를 생합성할 수 있으며, ARA 또는 DGLA 생합성 효율이 우수할 수 있다.
본 발명의 다른 실시예에서 DHA 생합성 유전자 5종(갈고리흰오징어 유래 델타 4 불포화효소 유전자, 지방산 연장효소 유전자, 델타 5 불포화효소 유전자 및 오메가 3 불포화효소 유전자와 갯장어(Muraenesox cinereus) 유래 델타 6 불포화효소 유전자)을 동시에 발현하여 DHA를 생합성하는 형질전환 식물체를 제조하기 위해 재조합 벡터를 제조하였다. 상기 5종의 유전자를 동시에 발현하는 재조합 벡터를 제조하는 것은 클로닝이 불가능하여, 델타 4 불포화효소 유전자와 지방산 연장효소 유전자를 발현시키는 pClean A 운반체와 델타 5 불포화효소 유전자, 델타 6 불포화효소 유전자 및 오메가 3 불포화효소 유전자를 발현시키는 pClean B 운반체를 제조하였다. 다음으로, pClean A 운반체 또는 pClean B 운반체로 들깨를 형질전환시킨 후, pClean A 운반체로 형질전환된 들깨와 pClean B 운반체로 형질전환된 들깨를 교배하고 DHA 생합성 유전자 5종을 동시에 발현하는 들깨 개체를 선별하였으며, 선별된 들깨의 종자에서 DHA, DHA 전구체(ETA, EPA 및 DPA) 및 ARA의 함량을 분석하고 야생형 들깨와 비교분석하였다.
본 발명의 제조방법에 DHA 생합성 유전자 5종을 동시에 발현하는 형질전환 들깨는 야생형 들깨와 비교하여 DHA 및 DHA 전구체(SDA, ETA, EPA 및 DPA)의 함량이 증가할 수 있고, 또한, ARA와 이의 전구체인 DGLA의 함량이 증가할 수 있다.
종래에 알려진 미생물 유래 DHA 생합성 유전자의 경우, 효율이 높음에도 불구하고, 알러지 또는 독성 문제로 인해 형질전환 식물체의 실용화를 위한 안정성 평가 시 문제가 발생한다. 반면, 본 발명의 DHA 생합성 유전자는 식용 가능한 고등생물종인 오징어 또는 갯장어에서 분리된 유전자를 이용하여 형질전환 식물체에 대한 안정성(식품안정성) 평가 시 유리한 장점이 있다.
또한, 본 발명의 불포화효소(델타 4 불포화효소, 델타 5 불포화효소 또는 델타 6 불포화효소)는 고등생물종 유래 불포화효소 중에서 효소의 기질 전환비율이 가장 높다.
따라서 본 발명의 제조방법에 의해 제조된 형질전환 식물체는 실용화에 따른 안정성 평가에 유리하며, 동시에 DHA 및 DHA 전구체의 생합성 효율이 우수할 수 있다.
본 발명의 다른 양태로 상기 제조방법으로 제조된 DHA를 생합성하는 형질전환 식물체를 제공한다.
본 발명에서 DHA 생합성 유전자에 대한 설명은 전술한 바와 같다.
본 발명의 실시예에서 각 유전자의 형질도입시 각 유전자에 종자 특이적 발현을 위해 종자 특이적 프로모터인 vicillin promoter를 사용하였다.
따라서 상기 델타 4 불포화효소(Delta 4 Desaturase), 지방산 연장효소(fatty acid elongase), 델타 5 불포화효소(Delta 5 desaturase), 오메가 3 불포화효소(ω3 desaturase) 및 델타 6 불포화효소(delta 6 desaturase) 유전자가 종자 특이적으로 발현될 수 있다.
본 발명의 형질전환 식물체는 전술한 바와 같이 오메가 3 지방산 생합성에 관여하는 유전자인 델타 4 불포화효소, 지방산 연장효소, 델타 5 불포화효소, 오메가 3 불포화효소 및 델타 6 불포화효소의 유전자 발현이 증가되어, 도코사헥산엔산(docosahexaenoic acid, DHA)의 전구체인 스테아리도닌산(stearidonic acid, SDA), 에이코사펜타에노산(eicosapentaenoic acid, EPA), 에이코사테트라에노산(eicosatetraenoic acid, ETA) 및 도코사펜타에산(docosapetaenoic acid, DPA)을 생합성하며, DPA를 이용하여 도코사헥산엔산(docosahexaenoic acid, DHA)을 생합성하며, 디호모감마리놀렌산(Dihomo-γ-linolenic acid, DGLA) 또는 아라키도닌산(arachidonic acid, ARA)를 생합성할 수 있다.
따라서 본 발명의 형질전환 식물체는 야생형 식물체과 비교하여 도코사헥산엔산(docosahexaenoic acid, DHA)의 함량이 증가된 것을 특징으로 한다.
또한, 에이코사테트라에노산(eicosatetraenoic acid, ETA), 에이코사펜타에노산(eicosapentaenoic acid, EPA) 및 도코사펜타에산(docosapetaenoic acid, DPA)로 이루어진 군에서 선택되는 DHA의 전구체 또는 아라키도닌산(arachidonic acid, ARA)의 함량이 동시에 증가된 것일 수 있다.
본 발명에서 상기 식물체는 애기장대 또는 유지식물일 수 있다. 구체적으로 상기 식물체는 유지식물이며, 상기 유지식물은 깨, 참깨, 유채, 해바라기, 아주까리, 땅콩, 콩, 코코야자 및 기름야자로 이루어진 군에서 선택되는 것일 수 있다.
본 발명의 실시예에서 DHA의 전구물질인 알파 리놀렌산(Alpha-linolenic acid, ALA, C18:3)가 60% 이상 함유되어 있는 들깨(Perilla frutescens)를 이용하여 형질전환 식물체를 제조하였다.
따라서 본 발명의 식물체는 알파 리놀렌산의 함량이 높은 식물체일 수 있으며, 바람직하게는 들깨(Perilla frutescens)일 수 있다.
본 발명의 다른 양태로 상기 형질전환 식물체의 종자를 제공한다.
본 발명의 “종자”는 식물체의 열매 또는 씨앗으로, 야생형 식물체과 비교하여 오메가 3 지방산 합성 반응의 최종물질인 도코사헥산엔산(docosahexaenoic acid, DHA)의 함량이 우수할 수 있다. 또한 본 발명의 종자는 야생형 식물체와 비교하여 스테아리도닌산(stearidonic acid, SDA), 에이코사테트라에노산(eicosatetraenoic acid, ETA), 에이코사펜타에노산(eicosapentaenoic acid, EPA), 및 도코사펜타에산(docosapetaenoic acid, DPA) 로 이루어진 군에서 선택되는 DHA의 전구체의 함량이 증가된 것일 수 있다. 또한 디호모감마리놀렌산(Dihomo-γ-linolenic acid, DGLA) 또는 아라키도닌산(arachidonic acid, ARA)의 함량이 증가된 것일 수 있다.
따라서 상기 종자에서 추출물에서 야생형 식물체의 추출물에 함유되지 않은 DHA 함량이 우수할 수 있으며, 구체적으로 상기 종자를 추출한 오일에 DHA의 함량이 높을 수 있다.
따라서 상기 종자 및 이의 오일은 DHA를 다량 포함하여 건강기능성 식품, 화장품 및 의약품 소재로 활용할 수 있다.
본 발명의 또 다른 양태로 (a) 서열번호1의 갈고리 흰오징어(berryteuthis magister) 유래 델타 4 불포화효소(Delta 4 Desaturase) 유전자 및 서열번호2의 갈고리 흰오징어 유래 지방산 연장효소(fatty acid elongase) 유전자를 포함하는 pClean A 운반체 및 (b) 서열번호3의 갈고리 흰오징어 유래 델타 5 불포화효소(Delta 5 desaturase) 유전자, 서열번호4의 갈고리 흰오징어 유래 오메가 3 불포화효소(ω3 desaturase) 유전자 및 서열번호5의 갯장어(Muraenesox cinereus) 유래 델타 6 불포화효소(delta 6 desaturase) 유전자를 포함하는 pClean B 운반체를 포함하는 DHA의 생합성 유전자의 발현을 증가시키기 위한 식물체의 형질전환용 조성물을 제공한다.
본 발명에서 DHA 생합성 유전자에 대한 설명은 전술한 바와 같다.
본 발명에서 상기 pClean A 운반체 또는 pClean B 운반체는 비실린 프로모터 및 nos 터미네이터 사이에 상기 서열번호1의 염기서열로 이루어진 유전자, 서열번호2의 염기서열로 이루어진 유전자, 서열번호3의 염기서열로 이루어진 유전자, 서열번호4로 이루어진 유전자 및 서열번호5로 이루어진 유전자를 각각 포함할 수 있다.
본 발명의 제조방법에 의해 제조된 형질전환 식물체는 DHA 생합성에 관여하는 유전자 5종을 동시에 발현시켜 DNA를 생산하는 유지작물의 육종개발에 이용할 수 있다.
도 1a은 장쇄형 오메가 지방산의 생합성 모식도를 나타낸 것이다.
도 1b는 지방산 연장효소의 작용기작을 나타낸 모식도이다.
도 2는 갈고리 흰오징어 유래의 델타-4 불포화효소 유전자 염기서열 및 유전자 분리를 PCR로 확인한 결과를 나타낸 것이다.
도 3은 갈고리 흰오징어 유래의 지방산 연장효소 유전자 염기서열 및 유전자 분리를 PCR로 확인한 결과를 나타낸 것이다
도 4는 갈고리 흰오징어 유래의 델타-5 불포화효소 유전자 염기서열 및 유전
자 분리를 PCR로 확인한 결과를 나타낸 것이다.
도 5는 갈고리 흰오징어 유래의 오메가 3 불포화효소 유전자 염기서열 및 유전자 분리를 PCR로 확인한 결과를 나타낸 것이다.
도 6은 pYES 및 pYES-BmD4DES 형질전환 효모의 기질 DPA(22:5)에 대한 DHA(22:6)로의 전환을 분석한 지방산 가스크로마토그래피 결과를 나타낸 것이다.
도 7은 pYES 및 pYES-BmD4DES 형질전환 효모의 기질 DPA(22:5)에 대한 DHA(22:6)로의 전환비율을 분석한 것이다.
도 8은 pYES 및 pYES-BmFAE 형질전환 효모의 기질 팔미트산(Palmictic acid)의 스테아르산(Stearic acid)으로의 전환비율 및 올레산(Oleic acid)의 Eisosenoic acid로의 전환비율을 분석한 것이다.
도 9는 pYES 및 pYES-BmFAE 형질전환 효모의 기질 GLA의 DGLA로의 전환비율을 분석한 것이다.
도 10은 pYES 및 pYES-sg5DES 형질전환 효모의 기질 DGLA(20:3)에 대한 ARA(20:4)로의 전환을 분석한 지방산 가스크로마토그램이다.
도 11은 pYES 및 pYES-sg5DES 형질전환 효모의 기질 DGLA(20:3)에 대한 ARA(20:4)로의 전환비율을 분석한 것이다.
도 12는 DHA 생산 들깨의 제작을 위한 체계도이다.
도 13은 본 발명의 실시예에 따른 빈 Clean vecter의 모식도이다.
도 14는 pClean A 운반체의 모식도(A)이다. pClean A는 종자 특이적 프로모터에 의해 발현되는 델타-4 불포화효소 유전자 및 지방산 연장효소 유전자를 포함하고 있다. (B) 제한효소를 이용하여 pClean A 내에 삽입된 유전자(델타-4 불포화효소, 지방산 연장효소)를 확인한 결과이다.
도 15는 선발마커인 제초제 저항성 단백질을 이용하여 pClean A 운반체로 형질전환된 개체를 선별한 것이다.
도 16은 들깨의 형질전환 및 PPT 선발 배지에서 재분화 과정이다.
도 17은 pCleanB 운반체의 모식도이다. pClean B는 종자 특이적 프로모터에 의해 발현되는 오메가 3 불포화효소 유전자, 델타-5 불포화효소 유전자 및 델타 6 불포화효소 유전자를 포함하고 있다.
도 18은 선발마커인 제초제 저항성 단백질을 이용하여 pClean B가 형질전환된 개체를 선별한 것이다.
도 19는 pClean B 형질전환된 들깨를 순화하는 것이다.
도 20은 pClean A 형질전환 들깨(T0) 세대에서 bar, 델타-4 불포화효소(D4DES) 및 지방산 연장효소(FAE) 유전자를 PCR 분석한 결과이다.
도 21은 들깨 형질전환 유전체 삽입부위를 확인하기 위한 Flanking 분석 체계도이다. 4종의 제한효소(HincⅡ(H2), HaeⅢ(H3), Mspl(M), Rsal(R)을 사용하였으며, RB1 및 A1 프라이머와 RB2 및 A2 프라이머 세트로 PCR을 수행하였다.
도 22 내지 도 26는 pClean A 형질전환체의 유전자 삽입부위를 분석하기 위해 Flanking 분석한 것이다.
도 22는 각 제한효소 절단 후 PCR을 통해 유전자 삽입부위의 증폭을 겔(gel)상에서 확인한 결과이며, 도 23은 삽입 부위의 염기서열을 나타낸다. Hae III제한효소로 절단 후 LB와 A-2 primer를 이용한 증폭에서 major one band를 확인할 수 있었으며, Msp I 제한효소로 절단 후 RB-cam3300 A-1 및 A-2 primer를 이용한 증폭에서 major band를 확인하여 염색체상의 삽입부위를 확인하는 데 이용하였다.
도 24 내지 도 26은 도 23에서 확인한 삽입부위 염기서열을 이용하여 야생형 들깨 유전체 해독정보와 비교 분석한 결과이며, 들깨의 3번 염색체상의 TO50 copia-like retrotransposon trverse transcriptase psedogene, partial sequence 부위 삽입되었음을 확인하였다.
도 27는 pClean A 운반체로 형질전환된 들깨(T1세대)에 대한 유전분석 결과이다(bar stirp 및 Bar PCR). 유전분석 결과 T1세대도 3:1의 분리 비를 보여 들깨 3번 염색체상의 one copy로 삽입되었다고 추정할 수 있다.
도 28는 유전자의 후대고정을 위하여 T1세대를 생육하고 암막시설을 이용하여 단일조건 하에서 개화를 유도하고 채종을 하는 사진이다. 들깨생육에 큰 영항을 미치는 구조유전자에 삽입되지 않았으므로 생육의 표현형은 야생형(wild type)과 큰 차이를 보이지 않았다.
도 1b는 지방산 연장효소의 작용기작을 나타낸 모식도이다.
도 2는 갈고리 흰오징어 유래의 델타-4 불포화효소 유전자 염기서열 및 유전자 분리를 PCR로 확인한 결과를 나타낸 것이다.
도 3은 갈고리 흰오징어 유래의 지방산 연장효소 유전자 염기서열 및 유전자 분리를 PCR로 확인한 결과를 나타낸 것이다
도 4는 갈고리 흰오징어 유래의 델타-5 불포화효소 유전자 염기서열 및 유전
자 분리를 PCR로 확인한 결과를 나타낸 것이다.
도 5는 갈고리 흰오징어 유래의 오메가 3 불포화효소 유전자 염기서열 및 유전자 분리를 PCR로 확인한 결과를 나타낸 것이다.
도 6은 pYES 및 pYES-BmD4DES 형질전환 효모의 기질 DPA(22:5)에 대한 DHA(22:6)로의 전환을 분석한 지방산 가스크로마토그래피 결과를 나타낸 것이다.
도 7은 pYES 및 pYES-BmD4DES 형질전환 효모의 기질 DPA(22:5)에 대한 DHA(22:6)로의 전환비율을 분석한 것이다.
도 8은 pYES 및 pYES-BmFAE 형질전환 효모의 기질 팔미트산(Palmictic acid)의 스테아르산(Stearic acid)으로의 전환비율 및 올레산(Oleic acid)의 Eisosenoic acid로의 전환비율을 분석한 것이다.
도 9는 pYES 및 pYES-BmFAE 형질전환 효모의 기질 GLA의 DGLA로의 전환비율을 분석한 것이다.
도 10은 pYES 및 pYES-sg5DES 형질전환 효모의 기질 DGLA(20:3)에 대한 ARA(20:4)로의 전환을 분석한 지방산 가스크로마토그램이다.
도 11은 pYES 및 pYES-sg5DES 형질전환 효모의 기질 DGLA(20:3)에 대한 ARA(20:4)로의 전환비율을 분석한 것이다.
도 12는 DHA 생산 들깨의 제작을 위한 체계도이다.
도 13은 본 발명의 실시예에 따른 빈 Clean vecter의 모식도이다.
도 14는 pClean A 운반체의 모식도(A)이다. pClean A는 종자 특이적 프로모터에 의해 발현되는 델타-4 불포화효소 유전자 및 지방산 연장효소 유전자를 포함하고 있다. (B) 제한효소를 이용하여 pClean A 내에 삽입된 유전자(델타-4 불포화효소, 지방산 연장효소)를 확인한 결과이다.
도 15는 선발마커인 제초제 저항성 단백질을 이용하여 pClean A 운반체로 형질전환된 개체를 선별한 것이다.
도 16은 들깨의 형질전환 및 PPT 선발 배지에서 재분화 과정이다.
도 17은 pCleanB 운반체의 모식도이다. pClean B는 종자 특이적 프로모터에 의해 발현되는 오메가 3 불포화효소 유전자, 델타-5 불포화효소 유전자 및 델타 6 불포화효소 유전자를 포함하고 있다.
도 18은 선발마커인 제초제 저항성 단백질을 이용하여 pClean B가 형질전환된 개체를 선별한 것이다.
도 19는 pClean B 형질전환된 들깨를 순화하는 것이다.
도 20은 pClean A 형질전환 들깨(T0) 세대에서 bar, 델타-4 불포화효소(D4DES) 및 지방산 연장효소(FAE) 유전자를 PCR 분석한 결과이다.
도 21은 들깨 형질전환 유전체 삽입부위를 확인하기 위한 Flanking 분석 체계도이다. 4종의 제한효소(HincⅡ(H2), HaeⅢ(H3), Mspl(M), Rsal(R)을 사용하였으며, RB1 및 A1 프라이머와 RB2 및 A2 프라이머 세트로 PCR을 수행하였다.
도 22 내지 도 26는 pClean A 형질전환체의 유전자 삽입부위를 분석하기 위해 Flanking 분석한 것이다.
도 22는 각 제한효소 절단 후 PCR을 통해 유전자 삽입부위의 증폭을 겔(gel)상에서 확인한 결과이며, 도 23은 삽입 부위의 염기서열을 나타낸다. Hae III제한효소로 절단 후 LB와 A-2 primer를 이용한 증폭에서 major one band를 확인할 수 있었으며, Msp I 제한효소로 절단 후 RB-cam3300 A-1 및 A-2 primer를 이용한 증폭에서 major band를 확인하여 염색체상의 삽입부위를 확인하는 데 이용하였다.
도 24 내지 도 26은 도 23에서 확인한 삽입부위 염기서열을 이용하여 야생형 들깨 유전체 해독정보와 비교 분석한 결과이며, 들깨의 3번 염색체상의 TO50 copia-like retrotransposon trverse transcriptase psedogene, partial sequence 부위 삽입되었음을 확인하였다.
도 27는 pClean A 운반체로 형질전환된 들깨(T1세대)에 대한 유전분석 결과이다(bar stirp 및 Bar PCR). 유전분석 결과 T1세대도 3:1의 분리 비를 보여 들깨 3번 염색체상의 one copy로 삽입되었다고 추정할 수 있다.
도 28는 유전자의 후대고정을 위하여 T1세대를 생육하고 암막시설을 이용하여 단일조건 하에서 개화를 유도하고 채종을 하는 사진이다. 들깨생육에 큰 영항을 미치는 구조유전자에 삽입되지 않았으므로 생육의 표현형은 야생형(wild type)과 큰 차이를 보이지 않았다.
이하, 실시예를 통하여 본 발명의 구성 및 효과를 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 예시하기 위한 것일 뿐, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 한정되는 것은 아니다.
<실시예1> 갈고리 흰오징어 유래 DHA 생합성 유전자의 분리
표 1은 해양생물(살오징어, 갈고리 흰오징어, 도화새우, 칠성 갈치, 도루묵, 눈큰 낙지 및 기름가자미)에서 지방산 9종(palmic acid, palmit oleic acid, steaic acid, oleic acid, cis-vaccenic acid, archidonic acid, EPA, DPA 및 DHA)의 함량을 비교한 것이다. 표 1에서 갈고리 흰오징어의 DHA 함량이 가장 우수함을 확인하였다.
따라서 갈고리 흰오징어(Berryteuthis magister)에서 DHA 생합성 유전자를 분리하고자, 안구조직으로부터 총 RNA(total RNA)를 분리하여 cDNA를 합성하고, RNA 시퀀싱을 실시하였다. 1억 2000만개 이상의 유전자 단편을 해독하였고, 총 해독 정보량은 124억 bp 로서, 신규 유전자를 발굴하기에 충분한 양을 해독하였다.
DHA 생합성 효소 유전자군을 확보하기 위해 오징어와 같은 두족류에 해당하는 문어에서 유래된 델타 4 불포화효소(Delta 4 Desaturase), 지방산 연장효소(fatty acid elongase), 델타 5 불포화효소(Delta 5 desaturase), 오메가 3 불포화효소(ω3 desaturase)의 유전자 및 아미노산 서열을 참조(reference)하여 유전자와 단백질 수준에서 비교 분석하여 4종의 유전자를 분리하였다.
구체적으로 갈고리 흰오징어 유래 963 bp 크기의 신규 델타-4 불포화효소 유전자(D4DES), 888 bp 크기의 신규 지방산 연장효소 유전자(FAE), 1,338 bp 크기의 신규 델타-5 불포화효소 유전자(D5DES) 및 1,134 bp 크기의 신규 오메가 3 불포화효소(ω3 desaturase) 유전자를 분리하였다(도 2 내지 도 5, 표 1)
| 유전자 명칭 | 염기서열 |
| BmD4DES 서열번호1 |
ATGGGAGCTAAAGTGACCCGAACAGATTTTGAGTGGAGTTATACCCAGGAACCTCATGCCACCCGGAGGAAAGAAATCATGGCGAAATATCCTCAAGTGAAGAAGCTGTTTGGTCCTGATTATAAAACCAAGTACATTGTGGTGGTGCTGGTGCTAGTGCAGATGATGGCCATGTTTATAGTGAAGGACTGGTCTTGGCCAAACATGCTCATTCTCGCCTACTGCTTCGGTGGGGTCATTAACCACTCACTGTCTCTCGCTATCCACGAAATCTCCCACAATCTCGCCTTCGGAACGAGACACCTACTCGCAAACCGGATCCTGGGCATGGTCGCCAACCTTCCGCTCGGAGTCCCCGTATCCATCACGTTCAGAAAATACCACCTGGAGCACCACCGATACCAAGGGGACGAAGAGAAAGACGTAGACATCCCGAGTAAAATAGAAGCCGTTCTTTTCACTCGTACGGTGACGAAATTCATTTGGGTCATTTTGCAGCCCCTGTTTTATAGCATCAGGCCCTTCTTCATGCGTCCGAAACCATTGGAAATGTTGGAATTGATCAACATCATCGCCAATTTCTCCTTTGATTTCATCGTCTTTTATTTATTCGGTGCCAAACCCCTTCTCTATATGATAAGTGGTACGCTGCTTGCCACAGGACTACATCCGATGGCTGGTCACTTTATCTCTGAGCATTATATGTTTAAAAAAGGCTACGAGACCTACTCGTACTATGGTATCCTGAACTACATCACATTTAATGTTGGTTATCACAATGAACATCATGATTTCCCCTTCGTTGCTGGAACCAACCTGCCAGCGCTGAAAAAGATGGCACCAGAATATTATGACGATCTCCCATGCCATACATCGTGGGTGAAGGTCATCTGGGATTTCATCACGGACCCTGACATTGGCCCTTATGCCAGGGTGAAGCGTCCAGCGTCCAAGGCGGCATAA |
| BmFAE 서열번호2 |
ATGGCGAACGTTATACAAGCCATCATGCAAAAGATTGACTATACAGAGCATTCTATGTCAGATCCTCGAACAAAAGATTGGTTTCTTATAGAGAACAACCCTATAAGAGTATGGTGCCTCACTGCCTTATACATTCTATTTGTTATATATGGACCAAAATTCATGCAAAAACGGAGACCCTATGACTTACGGATCTTTATGATGCTCTACAATCTTTCAATGGTCGTCTTATCTTTATATATGTTTGTTGAGATTATATTGAGTACACAAGCCTTGGATTACAAAGTTGTTTGTTCAGCTTATTCAAAAAAGAGTATCCAGAACCCAAAAGAGATGAGGTTGGCTAAAGTTCTGTGGTGGTATTTCTTTTCCAAAGCCCTTGAACTCATGGATACAGTTCTGATGATCCTACGAAAGAAACATGATCAAGTATCTTTCCTGCATGTCTTTCATCATGCGACCATGTTGAATATTTGGTGGTGGGTCATGATGTTTATCCCTGGAGGACAATCCTGGTTTGGTGCATGTCTAAACTGCTTCATCCATGTTGTTATGTACAGCTATTATGGCCTATCTGCAGTCCCTTCACTCCGTGGAAAATTATGGTGGAAAAAGTATATTACCAGATTGCAATTGATCCAGTTCTGCATCACATTTGTGCACTCAGCCAATTCTATGCGAGTCCAATGTGAGTTTCCTCATTGGGGCGAGTGTTTGTTAACAGGCTACATGGTCTTCATGGTCATTCTCTTCAGCAATTTCTACATTCAGGCATACATTAAAGGCAGGCGGAACCCCAAATTGCAACAAGAACAATCGCAGAAGCAAAAGAAAAAACAAAATGCGCAAAATGGCAACATGAACGGCACAGTCAAGAAAACCCATTAA |
| BmD5DES 서열번호3 |
ATGGGTAAAGGAGGAGAGAATTCTACTTCTACCCAAAAAGAAGAAAAGGCCAATTCATCTCACAATTTCTACTCCTGGGAAGAAATCCAGAAGCACAACCATAAAGAGGACCGCTGGCTTGTGATCAACAGACAAGTCTACAATATTACAAACTGGGTTCGACGCCATCCAGGAGGAAGTAGAGTCATTGGTCATTATGCCGGACAAGATGCTACGGAAGCGTTTCGAGCTTTCCACAATGACCTGAACCACGTCCAAAAATATTTGAAGCCTTTACACATTGGCTCCGTGTGTGTTGATGAATTTCAAATATCTGAAATCAAAACGGATTTTGAAGACTTACGGAATATAGCAATAAAACTGGGACTATTTGAGCCCAGCTATTGGTTCTTCACCTTGAACATTTTACATGTCCTTGTGTTTGAAGTCTTAGCATATCTCACCTTCAGATACTTTGGAACAGGATGGATGGCATACATTCTATCTGTTATGTGTTACTCAATAGTGCAAGCTCAAACTGGATGGATACAACATGACTTTGGGCATTTGTCAGTGTTCAAACATTCAAAATGGGACCATCTCTTTCATTATATTACTATGGGTTTCATCAAAGGTGCCTCTCCATCATGGTGGAGCCATATGCACTACCAACATCATGCCAAGCCAAATGTGATGGACAAAGACCCTGATATACGGATTGAAGATTACTTTGTAATAGGAAACACTATGCCTGTTGAGGTTGCTAAAAAGAGTAAGAAAAGCATGCCATATAACTGGCAACACAAATATTTCTTTATTCTTGGTCCACCACTTCTGTTCCCGGTTTACTTCCAGTATGCTCTCATGCGGTATTCTATTACAAGACGAGCTTATCTTGACATCGCATGGATGACTGCCTTCTTTGCTAAACTTTTTTATTTATATACACCATACTTAGGAGTCTGGGGCGTATTGGCTTATTATTTTGTTGTCAGATGTGTTGAGAGCCACTGGTTTACATGGGTTAGCCAGTCCAATCATATCCCAATGGATGTGGAGCATGATACAGCCCGGCCATGGCTTCCCCTGCAACTTCATGCCACGTGTGACATTGAAAAGTCCTTCTTCAATGACTGGTTCACGGGACATCTTAACTTTCAAATTGAACATCACTTGTTCCCAACAATGCCAAGACATAATCTCTACAAAATTGCTCCTATGGTGAAATCATTATGTGAAAAACATGGTCTAAAGTATCAAGTGAAGCCACTTTGGAGAGCATTTGTCGATGTTGTAAGATCACTGAAACATTCTGGTGAAATTTGGTATGCAGCCTATCATGCTTATCATATTATGTAA |
| BmW3fad 서열번호4 |
ATGGTGCTGGAAATTGATAGTGATGGACCGATGCCTCTGGAAGAAACGGATAACTCCGAGGTGGAAACCACGGGTAACCCCGAGTCAGAACCCGCGGAGGAACTCAATAAGCTGGGCGTGCCGACCGATCTGCCGACTATCACTCAAATCAAGCAGACCATCCCAGCCCGCTGCTTTGACCCCAGAGTACCCCAGTCCATGTACTACGTGTTCAGAGATGTGATCAGTATGGCTGTCTTGTATGCTATGAGTGAATGGTGTCTGAACAACCTACCTAGTTCGGCTGTGATGGTGCACTTTCCTTTCTACTGGTTCCTGCAAGGGACAATGTATACGGGCATCTTTGTCCTCGGCCACGACTGCGGACATGGTTCCTTCTCGCATCACGGTTTCTTCAACGACGTTATGGGGACCCTACTGCACTCTTTTCTCCTGTGCCCCTACTACACGTGGAAACTGTCCCACAAGAACCATCACAAAAACACGGGTAACATAGACAGGGACGAAGTGTATTATCCGGTCAAGAAGAAGTACAGAGGTGACCAGAAAAACCTTCTCCCTGGCTTTGGGCTTGGTCTTGGATGGTTCGGCTATCTGGTACGTGGTTACAAGCCGCGCCAGGTGGGTCACTTTAACCCTTTTCACTACATGTTCCAGAATCACGTTTTGGCGGTCCTCATTACCTTCGCGTCCGATTTTGCGATGATCTACTTTCTCTATCTGTTCTACCAGGCGCAGGGTTTCTTACTGCTCGTTCACCATTACATCATTCCCCTGTTTGTTTTCTCTACATATATGGTGGTCTTCACGTTCTTGCATCACCATGACATCAATATCCCCTGGTATTCAGATGAGAAGTGGTCGTACATTAAGGGACAACTTTCCTCGATCGATCGTGACTATGGTTGGGTGCACGGCCTGACCCACGATATTGGCACTCATCAAATCCACCATCTCTTTAGCAAGGTGCCGCACTACCATTTGCAAGAGGCCACAAGACATTTCCGAAAGAGATTCCCACATTTGGTGCGATACTACAACGACCCCATTCTGCCGACTTTCTGGAGTTTATTCAAAAAGTATTCTTCTCAGTCTATAATAAAGAACGATACAAAAATTCATGTTTATAGATAA |
표 2에서 BmD4DES는 갈고리 흰오징어(Berryteuthis magister) 유래 델타 4 불포화효소 유전자이고, BmFAE는 갈고리 흰오징어 유래 지방산 연장효소 유전자이고, BmD5DES는 갈고리 흰오징어 유래 델타 5 불포화 유전이이고, BmW3fad는 갈고리 흰오징어 유래 오메가 3 불포화효소 유전자이다.
<실시예2> 갈고리 흰오징어 유래 DHA 합성 유전자의 기능 확인
실시예1에서 분리된 갈고리 흰오징어 유래 DHA 합성 관련 유전자 4종 중 3종, 델타-4 불포화효소 유전자(D4DES), 지방산 연장효소 유전자(FAE), 델타-5 불포화효소 유전자(D5DES)를 효모 시스템을 이용하여 유전자의 기능을 확인하였다.
2.1 델타-4 불포화효소 유전자 발현에 의한 불포화 지방산 합성 확인
델타-4 불포화효소 유전자(BmD4DES)가 삽입된 효모(pYES2-BmD4DES)를 이용하여 유전자의 기능을 확인하기 위하여 우라실 결핍 및 라피노스/갈락토스를 첨가한 배지에 형질전환 효모를 28℃에서 종균 배양하였다. 종균 배양한 효모를 새로운 배지에 최종농도 OD600=0.4가 되도록 접종하고 기질 DPA(Docosapentaenoic acid, 22:5)를 최종농도 0.5 mM 되게 넣어주고, 배양은 20℃에서 3일간, 15℃에서 3일간 배양하여 유전자의 발현을 통한 기질의 새로운 산물로의 전환을 유도하였다. 대조구는 pYES2 운반체만 형질전환된 효모를 이용하였다.
델타-4 불포화효소 유전자 산물의 활성을 통해 기질인 DPA (Docosapentaenoic acid, 22:5)으로부터 BmD4DES 효소에 의해 또 하나의 이중결합이 생긴 새로운 산물인 DHA(Docosahexaenoic acid, 22:6)로 성공적으로 전환되는지의 여부를 확인하기 위하여 가스크로마토그래피 분석을 하였다.
그 결과, 전환비율이 61.98% 임을 확인하였다. 전환비율은 ([생성량]/[기질 양+생성량])*100의 공식에 의해 계산했다. 그러므로 갈고리 흰오징어로부터 분리된 델타-4 불포화효소 유전자는 DPA로부터 DHA를 합성하는데 관여함을 확인하였다. 또한 이러한 결과는 기존에 알려진 델타-4 불포화효소의 DHA 전환률과 비교할 때 현저히 우수함을 확인하였다(도 6, 도 7, 표 3)
| Source | 전환비율(DPA→DHA) | 비 고 |
| Berryteuthis magister | 61.98% | This work |
| Thraustochytrium sp | 4.5% | Qiu et al(2001) J Biol Chem |
| Thraustochytrium sp | 21% | Senger et al(2017) Lipids |
| Pavlova lutheri | 44% | Sanger et al (2017) Lipids |
2.2 지방산 연장효소 유전자 형질전환 효모의 탄소 사슬 연장 확인
갈고리 흰오징어 안구조직으로부터 얻은 지방산 연장효소 활성을 확인하기 위하여 피딩 테스트(feeding test)를 하였다. pYES2-BmFAE와 대조군 pYES2을 포함하는 효모 형질전환체를 2% 갈락토오스를 함유하는 배양액에 팔미트산(Palmitic acid), 올레산(Oleic acid) 또는 감마리놀렌산(γ-linolenic acid, GLA)를 기질로 첨가하여 지방산 연장효소 유전자 발현에 의한 첨가된 지방산의 사슬연장을 분석하였다.
그 결과, 팔미트산(Palmictic acid)은 스테아르산(Stearic acid)으로 16.8%의 전환비율을 나타냈으며, 올레산(Oleic acid)은 Eisosenoic acid로 23.6%의 전환비율을 나타냈고, GLA는 DGLA로 53.67%의 높은 전환비율을 나타냈다(도 8, 도 9).
2.3 델타 5 불포화효소 유전자 발현에 의한 고도불포화지방산 합성 확인
델타-5 불포화효소 유전자가 삽입된 효모(pYES2-BmD5DES)를 이용하여 유전자의 기능을 확인하기 위하여 우라실 결핍 및 라피노스/갈락토스를 첨가한 배지에 형질전환 효모를 28℃에서 종균 배양하였다.종균 배양한 효모를 새로운 배지에 최종농도 OD600=0.4가 되도록 접종하고 기질 DGLA(Dihomo-γ-linolenic acid)를 최종농도 0.5 mM 되게 넣어주고, 배양은 20℃에서 3일간, 15℃에서 3일간 배양하여 유전자의 발현을 통한 기질의 새로운 산물로의 전환을 유도하였다. 대조구는 pYES2 운반체만 형질전환된 효모를 이용하였다. 델타-5 불포화효소 유전자 산물의 활성을 통해 기질인 DGLA(Dihomo-γ-linolenic acid)로부터 BmD5DES 효소에 의해 또 하나의 이중결합이 생긴 새로운 산물인 아라키도닌산(arachidonic acid, ARA)으로 성공적으로 전환되는지의 여부를 확인하기 위하여 가스크로마토그래피 분석을 하였다.
그 결과, DGLA의 아라키도닌산(arachidonic acid, ARA)으로의 전환률이 14.5% 임을 확인하였다.
그러므로 갈고리 흰오징어로부터 분리된 델타-5 불포화효소 유전자는 DGLA(Dihomo-γ-linolenic acid)로부터 아리키돈산(ARA)을 합성하는데 관여함을 확인하였다. 또한 이러한 결과는 기존에 알려진 미세조류 유래의 델타-5 불포화효소의 아라키도닌산(arachidonic acid, ARA) 전환률과 비교할 때 현저히 우수함을 확인하였다(도 10, 도 11, 표 4).
| Source | 전환비율(DGLA→ARA) | 비 고 |
| Berryteuthis magister | 14.5% | This work |
| Thraustochytrium sp | 7.3% | Qiu et al(2005) Nature biotech |
도 1a은 장쇄형 오메가 3 지방산의 생합성 모식도이다. 도 1a을 참고하면, 델타 4 불포화효소 유전자(BmD4DES), 지방산 연장효소 유전자(BmFAE) 및 델타 5 불포화효소 유전자(BmD5DES)가 DHA 또는 이의 전구체의 합성에 관여하며, 상기 실험에서 갈고리 흰오징어에서 분리된 신규한 델타-4 불포화효소 유전자(BmD4DES), 지방산 연장효소 유전자(BmFAE) 및 델타-5 불포화효소 유전자(BmD5DES)가 각 기질에 대한 전환비율이 우수함을 확인하였는바, DHA를 포함하는 오메가 3 지방산 또는 불포화 지방산을 생성하기 위한 대사 공학기술에 적용할 수 있음을 확인하였다.
도 1b는 지방산 연장효소의 작용기작을 나타낸 모식도이다. 도 1b에서 지방산 연장효소가 GLA를 DGLA로 전환시키며, SDA를 ETA로 전환시키고, EPA를 DPA로 전환시킴을 보여준다.
<실시예3> 형질전환 들깨의 제조-벡터를 이용한 형질전환 들깨 제조
식물체에서는 DHA의 합성이 불가능하며, 도 1a을 참고하면 DHA를 식물체에서 생산하기 위해서는 DHA 생합성에 관여하는 유전자 5종(델타 4 불포화효소, 지방산 연장효소, 델타 5 불포화효소, 델타 6 불포화효소 및 오메가 3 불포화효소)이 필요하다.
따라서 식물체에서 상기 5종의 유전자를 발현시켜 DHA를 생합성하기 위해 실시예1에서 분리한 갈고리 흰오징어 유래 유전자 4종(델타 4 불포화효소, 지방산 연장효소, 델타 5 불포화효소 및 오메가 3 불포화효소)과 표 4의 갯장어 유래 델타 6 불포화효소 유전자를 이용하여 형질전환 식물체를 제조하였다.
| 유전자 명칭 | 염기서열 |
| McD6DES 서열번호5 |
ATGGGGGGCGGAGGTCAACAGACGGAGTCGGAATCGAGCTGTGGGCGAGGAGGCGGCGTTTTCACCTGGGAAGAGGTGCAGCGGCATTCCCACAAGGGGGACCAGTGGTTGGTAATCGACAGAAAGGTGTGCAACATCACCGACTGGGTGAAAAGACATCCAGGCGGCGCCCGTGTCATCAGCCACTATGCCGGGGAGGACGCCACGGATGCTTTTGCTGCATTCCATCCAGAGCCTGACTTTGTGCGCAAGTTTCTGAAGCCACTGCTGATTGGTGAGCTTGCAACCTCTGAGCCCAACCAGGACCGGGACAAAAATTCTGTGTTGACACAGGCTTTCCGCGAACTGCGCGAGGAGGTAGAGAGGGAGGGCCTCTTCAGGACTCAGCCGCTGTTCTTTTGCCTCCACCTGGGGCATATTCTTCTCCTGGAGGCCCTGGCTTACTTGCTGATTTGGGTGTATGGAACAGGCTGGCTCCAGACCCTGCTGTGTGCAGTAATACTGGCCACCTCACAGTCTCAGGCCGGATGGCTCCAGCATGACTTCGGCCACCTTTCCGTCTTCAAAAAGTCCCGCTGGAACCACCTGCTGCACAAGTTTGTCATCGGACACCTTAAGGGTGCTTCGGCTAACTGGTGGAACCATCGGCATTTCCAGCACCATGCAAAACCCAACATCTTCAGTAAAGACCCTGATGTCAACATGCTCCACACCTTTGTGCTAGGAAAGACCCAGCCAGTGGAGTATGGAATAAAGAAGATCAAGTACATGCCTTACAACCACCAGCACCAGTACTTCTTCCTCATTGGACCTCCTATGCTTATCCCAGTGTATTTCCACATCCAGATCATGCAAACCATGTTCTTTCGACGTGATTGGGTGGACCTCGTCTGGTCAATGAGCTACTACCTGCGCTACTTCACCTGCTACACGCCCTTTTACGGAGTTTTTGGAGCTGTGGCGCTCATCAGCTTCGTTAGGTTTCTGGAGAGCCACTGGTTTGTGTGGGTGACCCAAATGAACCACATTCCCATGGACATTGACCACGAGAAGCACGAGGATTGGCTGACCATGCAGCTGAAGGCCACCTGCAACATTGAGCAGTCATTCTTCAACGACTGGTTCAGCGGACACCTCAACTTCCAAATCGAACACCATCTGTTTCCCACAATGCCCCGGCACAACTACTGCCGCGTGGCCCCTCTGGTGCGCAAGGTGTGTGAGAAGCATGGCGTCACCTACCAGGAGAAGACCCTGTGGAGCGGCTTCAGAGACGTGGTCAGCTCTCTACGGGAGTCTGGAGACCTGTGGCTGGATGCGTATCTCCATAAATAATTCAAACATTTGGCAATAAAGTTTCTTAAGATTGAA |
표 5의 McD6DES는 갯장어(Muraenesox cinereus) 유래 델타 6 불포화효소 유전자이다.
실시예2에서 갈고리 흰오징어 유래 델타 4 불포화효소, 지방산 연장효소, 델타 5 불포화효소 유전자가 효모 시스템에서 각 기질의 전환비율이 우수함을 확인하였는바, 상기 델타 4 불포화효소, 지방산 연장효소, 델타 5 불포화효소 유전자로 형질전환된 식물체(들깨)는 DHA 또는 이의 전구체의 생합성 효율이 우수할 수 있다. 또한 DGLA 또는 ARA 생합성 효율이 우수할 수 있다.
하나의 벡터를 이용하여 상기 5종의 유전자를 동시에 발현하는 재조합 벡터를 제조하는 것은 클로닝이 불가능하여, 델타 4 불포화효소 유전자(delta 4 desaturase)와 지방산 연장효소(fatty acid elongase) 유전자의 2종의 유전자를 발현시키는 pClean A 운반체와 델타 5 불포화효소(delta 5 desaturase), 델타 6 불포화효소(delta 6 desaturase) 및 오메가3 불포화효소(ω3 desaturase)의 3종의 유전자를 발현시키는 pClean B 운반체를 제조하였다. 각 벡터로 들깨를 형질전환시킨 후, pClean A 운반체로 형질전환된 들깨와 pClean B 운반체로 형질전환된 들깨를 교배하여 상기 5종의 유전자를 동시에 발현하는 들깨를 제조하였다(도 12).
이 때, 기본 운반체(Clean vector)는 식물체 선발인자로 제초제 저항성 Bar 유전자를 포함하고 있으며, 또한 각 유전자의 종자 특이적 발현을 위해 강낭콩 유래 vicillin 프로모터(표 6)를 사용하였다(도 13).
| 프로모터 명칭 | 염기서열 |
| vicilin 프로모터 서열번호 6 |
AAAAACATAAATACTAGAATTAGTATTTATATTTATGAACATATATATCAAAATTAATATTAATAAAAGTTGACAATTCCTAAAATAAATTATATTTTATATTTATTAAATATTATTATTAATTAAAATATTTGACTACTATTTTAATTTTAATAAACATTTAAGCTACAATATCATTAAAAGATATTATCTTCAATTTTTATATATAAAAAAAAATGTTAGAGAGGAAACATTTCCCTCACAAAATTCATTACAATGACATCTTGCACATTTTTGATGGAATTTGTGAGGAAAATGTTAAAGATAGATAAAATTCATCTCAAAGCTCTTCACAAAATTTACTTTTATCATATATTTAGGGAGTTTGTGAGGGATTATTTGTGACTGAATATTTTCATAACAAATTTCATCGCTAATGTTCATCCATTTAATTTTTTTTATTTGTAGTAAAAATACTATTCTCTCTCTTCCATTTATTATATTTTTTAAAACTTTGTGAAATGATCAACTATGACAATTATTTTGGGACGGAGTGAGTATCATGGTTTTGATCGTGTCTAATTTCTTAACTGTTCTTGGACTTAAAAAACATTTAAATTTTTTTAGGAACAGTTTTACAAACTCATTTGTTATTGGACACAGATAACATTTAAAAATTTTAATTCACAATTTTAACAATTATAAAATTTTTATTAATATTAATTATAATGTGTAGATAAATGATAGAAAGATTTTGGTGTGATAAAACATATTAATAATAATATTAAATAATATAGTTTTAAAGTTTTTATTAAAAAATAATTGTATGTTATCCTTAATACTCCATCTTCTCTTTACTAATAATGCCCTGAGAATACGGATATATTTGGACATGACAAATATAACCGTTTTAATAATTTATCGTCTTTGTGATGGAGAATTATGTAACTATATTTTTTTTAATTGAGGATTGTAATAAAAGTAGATTATAATATATATTATATTTTTTCTTTTTTAATATATTAAATAAAGTATAGTATATGTAAAGTAAACGGATAAATAATAGATAAATAATTAAATGACATATATCTACAATTACATTTTTATATATTAAGTATATTATAGTATATATCAAGTAGACGGATAAATAATAGATAGATAATTAAATGACGTATATGTAGAATTACATTTTTCACATGACAAGTACAAACCTATGCACTTCTAAGTGCAAGTTTATGGAGTTATTTGCATGTCTTAGAGCTGGAGCTTGTGTTGTAGGATACAACACTTGTTAAAATTCTCTAGTCAATTCATTAATTCATATACACATGGCCGAAGACAATAATAAAGCATCCTCCTTTTCCATAAGAATGTCCAAATTCATCAAATTCAAACAAAACTCCACCACCCAAGTAATGTTCTTTTCATTTTGCCACTTCAATTTTGTACATTTTAACACACGTCCATATGCATGGCACAACATGGCCAACTGTTGGTGCATGTTAATTATATAGTTTTATTTTTTATATCTATAAATACACTCATCTCACTGTACTTTATTCATC |
3.1 pClean A 운반체의 형질전환 들깨의 제조
구체적으로 갈고리 흰오징어 유래 델타 4 불포화효소 유전자(delta 4 desaturase, 서열번호1)와 지방산 연장효소 유전자(fatty acid elongase 서열번호2) 유전자를 각각 종자특이 발현 강낭콩 유래 vicillin 프로모터(서열번호6)와 nos 터미네이터(terminator, 표 7) 사이에 삽입하여 pClean A 벡터를 제조하였다(도 14).
| 유전자 명칭 | 염기서열 |
| nos 터미네이터 서열번호 7 |
GATCTAGTAACATAGATGACACCGCGCGCGATAATTTATCCTAGTTTGCGCGCTATATTTTGTTTTCTATTCGCGCGTATTAAATGTATAATTGCGGGACTCTAATCATAAAAACCCATCTCATAAATAACGTCATGCATTACATGTTAATTATTACATGCTTAACGTAATTCAACAGAAATTATATGATAATCATCGCAAGACCGGCAACAGGATTCAATCTTAAGAAACTTTATTGCCAAATGTTTGAA |
완성된 pClean A 벡터를 들깨에 형질전환 시키기 위해 아그로박테리움(Agrobacterium) 균주(LBA4404)에 도입하였다. 벡터가 도입된 Agrobacterium를 들깨(품종: 엽실)의 배축(hypocotyl)의 절단면에 감염시켜 형질전환하고 재분화배지(BAP 3mg/L, 카르베니실린(Carbenicillin 250mg/L)에서 PPT 1.2mg/L 농도로 선발하여 pClean A 형질전환 들깨 개체 6개를 확보하였다(도 15, 도 16). 일정 크기로 성장한 재분화 개체들은 포트(pot)에 이식하고 순화상자에서 1주일간 순화 시켰다.
3.2 pClean B 운반체의 형질전환 들깨의 제조
갈고리 흰오징어 유래 델타 5 불포화효소 유전자(delta 5 desaturase, 서열번호3), 갯장어 유래 델타 6 불포화효소 유전자(delta 6 desaturase, 서열번호4) 및 갈고리 흰오징어 유래 오메가3 불포화효소 유전자(ω3 desaturase, 서열번호 5)를 각각 종자특이 발현 vicillin 프로모터와 nos 터미네이터 사이에 삽입하여 pClean B를 구축하였다(도 17).
상기 pClean B 운반체를 pClean A의 형질전환 들깨와 동일한 방법으로 들깨에 형질도입하고, pClean B 형질전환 들깨 개체를 3개를 확보하였고(도 18), 일정 크기로 성장한 재분화 개체들은 포트(pot)에 이식하고 순화상자에서 1주일간 순화 시켰다(도 19).
3.3 형질전환 들깨(T0세대)의 유전분석
pClean A 벡터로 형질전환된 T0 세대의 들깨의 유전자를 분석한 결과이다. 분석결과, pClean A 형질전환된 Bar, D4DES 및 FAE의 유전자가 발현됨을 확인할 수 있다(도 20).
다음으로 flanking 분석을 통해 들깨 게놈상에서 유전자의 삽입 부위를 확인하였다(도 21 내지 도 23).
분석결과, pClean A 유전자의 삽입부위는 들깨의 3번 염색체(chromosome)상의 TO50 copia-like retrotransposon trverse transcriptase psedogene, partial sequence에 해당하였다(도 24 내지 26). 작물 생육에 영향을 미치는 중요한 구조유전자 부위가 아니었으며, 따라서 T0, T1세대에 걸쳐 정상적인 생육 양상을 보였다(도 28).
3.4 형질전환 들깨(T1세대)의 유전분석
Flanking 분석 결과에서 예측할 수 있듯이 형질전환 들깨 T1세대에 대한 bar strip 분석결과, 약 3:1의 분리비를 보여 1 copy가 삽입됨을 확인하였고(도 27) 후대 육성 및 고정을 진행하였다(도 28).
<실시예4> 형질전환 들깨의 제조-2(교배를 통한 형질전환 들깨의 제조)
pClean A 형질전환 들깨와 pClean B 형질전환 들깨를 교배 육종하였다(도14). 교배된 후대 들깨의 유전자를 분석하여 델타 4 불포화효소(delta 4 desaturase), 지방산 연장효소(fatty acid elongase), 델타 5 불포화효소(delta 5 desaturase), 델타 6 불포화효소(delta 6 desaturase) 및 오메가 3 불포화효소(ω3 desaturase)의 5종의 유전자를 동시에 다중 발현하는 들깨를 분리하고 확보하였다.
또한, 5종의 유전자가 모두 발현되는 형질전환 들깨 종자와 야생형 들깨 종자(대조구)에서 아라키도닌산(arachidonic acid, ARA), 에이코사테트라에노산(eicosatetraenoic acid, ETA), 에이코사펜타에노산(eicosapentaenoic acid, EPA), 도코사펜타에산(docosapetaenoic acid, DPA) 및 도코사헥산엔산(docosahexaenoic acid, DHA)의 함량을 비교 분석하기 위해 가스크로마토그래피를 수행하였다.
<110> REPUBLIC OF KOREA(MANAGEMENT : RURAL DEVELOPMENT ADMINISTRATION)
<120> Metabolic engineering of the DHA biosynthetic pathway into
transgenic perilla
<130> DP20190251
<160> 7
<170> KoPatentIn 3.0
<210> 1
<211> 963
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Berryteuthis magister_delta4-desaturase
<400> 1
atgggagcta aagtgacccg aacagatttt gagtggagtt atacccagga acctcatgcc 60
acccggagga aagaaatcat ggcgaaatat cctcaagtga agaagctgtt tggtcctgat 120
tataaaacca agtacattgt ggtggtgctg gtgctagtgc agatgatggc catgtttata 180
gtgaaggact ggtcttggcc aaacatgctc attctcgcct actgcttcgg tggggtcatt 240
aaccactcac tgtctctcgc tatccacgaa atctcccaca atctcgcctt cggaacgaga 300
cacctactcg caaaccggat cctgggcatg gtcgccaacc ttccgctcgg agtccccgta 360
tccatcacgt tcagaaaata ccacctggag caccaccgat accaagggga cgaagagaaa 420
gacgtagaca tcccgagtaa aatagaagcc gttcttttca ctcgtacggt gacgaaattc 480
atttgggtca ttttgcagcc cctgttttat agcatcaggc ccttcttcat gcgtccgaaa 540
ccattggaaa tgttggaatt gatcaacatc atcgccaatt tctcctttga tttcatcgtc 600
ttttatttat tcggtgccaa accccttctc tatatgataa gtggtacgct gcttgccaca 660
ggactacatc cgatggctgg tcactttatc tctgagcatt atatgtttaa aaaaggctac 720
gagacctact cgtactatgg tatcctgaac tacatcacat ttaatgttgg ttatcacaat 780
gaacatcatg atttcccctt cgttgctgga accaacctgc cagcgctgaa aaagatggca 840
ccagaatatt atgacgatct cccatgccat acatcgtggg tgaaggtcat ctgggatttc 900
atcacggacc ctgacattgg cccttatgcc agggtgaagc gtccagcgtc caaggcggca 960
taa 963
<210> 2
<211> 888
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Berryteuthis magister_fatty acid elongase
<400> 2
atggcgaacg ttatacaagc catcatgcaa aagattgact atacagagca ttctatgtca 60
gatcctcgaa caaaagattg gtttcttata gagaacaacc ctataagagt atggtgcctc 120
actgccttat acattctatt tgttatatat ggaccaaaat tcatgcaaaa acggagaccc 180
tatgacttac ggatctttat gatgctctac aatctttcaa tggtcgtctt atctttatat 240
atgtttgttg agattatatt gagtacacaa gccttggatt acaaagttgt ttgttcagct 300
tattcaaaaa agagtatcca gaacccaaaa gagatgaggt tggctaaagt tctgtggtgg 360
tatttctttt ccaaagccct tgaactcatg gatacagttc tgatgatcct acgaaagaaa 420
catgatcaag tatctttcct gcatgtcttt catcatgcga ccatgttgaa tatttggtgg 480
tgggtcatga tgtttatccc tggaggacaa tcctggtttg gtgcatgtct aaactgcttc 540
atccatgttg ttatgtacag ctattatggc ctatctgcag tcccttcact ccgtggaaaa 600
ttatggtgga aaaagtatat taccagattg caattgatcc agttctgcat cacatttgtg 660
cactcagcca attctatgcg agtccaatgt gagtttcctc attggggcga gtgtttgtta 720
acaggctaca tggtcttcat ggtcattctc ttcagcaatt tctacattca ggcatacatt 780
aaaggcaggc ggaaccccaa attgcaacaa gaacaatcgc agaagcaaaa gaaaaaacaa 840
aatgcgcaaa atggcaacat gaacggcaca gtcaagaaaa cccattaa 888
<210> 3
<211> 1338
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Berryteuthis magister_delta-5 desaturase
<400> 3
atgggtaaag gaggagagaa ttctacttct acccaaaaag aagaaaaggc caattcatct 60
cacaatttct actcctggga agaaatccag aagcacaacc ataaagagga ccgctggctt 120
gtgatcaaca gacaagtcta caatattaca aactgggttc gacgccatcc aggaggaagt 180
agagtcattg gtcattatgc cggacaagat gctacggaag cgtttcgagc tttccacaat 240
gacctgaacc acgtccaaaa atatttgaag cctttacaca ttggctccgt gtgtgttgat 300
gaatttcaaa tatctgaaat caaaacggat tttgaagact tacggaatat agcaataaaa 360
ctgggactat ttgagcccag ctattggttc ttcaccttga acattttaca tgtccttgtg 420
tttgaagtct tagcatatct caccttcaga tactttggaa caggatggat ggcatacatt 480
ctatctgtta tgtgttactc aatagtgcaa gctcaaactg gatggataca acatgacttt 540
gggcatttgt cagtgttcaa acattcaaaa tgggaccatc tctttcatta tattactatg 600
ggtttcatca aaggtgcctc tccatcatgg tggagccata tgcactacca acatcatgcc 660
aagccaaatg tgatggacaa agaccctgat atacggattg aagattactt tgtaatagga 720
aacactatgc ctgttgaggt tgctaaaaag agtaagaaaa gcatgccata taactggcaa 780
cacaaatatt tctttattct tggtccacca cttctgttcc cggtttactt ccagtatgct 840
ctcatgcggt attctattac aagacgagct tatcttgaca tcgcatggat gactgccttc 900
tttgctaaac ttttttattt atatacacca tacttaggag tctggggcgt attggcttat 960
tattttgttg tcagatgtgt tgagagccac tggtttacat gggttagcca gtccaatcat 1020
atcccaatgg atgtggagca tgatacagcc cggccatggc ttcccctgca acttcatgcc 1080
acgtgtgaca ttgaaaagtc cttcttcaat gactggttca cgggacatct taactttcaa 1140
attgaacatc acttgttccc aacaatgcca agacataatc tctacaaaat tgctcctatg 1200
gtgaaatcat tatgtgaaaa acatggtcta aagtatcaag tgaagccact ttggagagca 1260
tttgtcgatg ttgtaagatc actgaaacat tctggtgaaa tttggtatgc agcctatcat 1320
gcttatcata ttatgtaa 1338
<210> 4
<211> 1134
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Berryteuthis magister_omega-3 desaturase
<400> 4
atggtgctgg aaattgatag tgatggaccg atgcctctgg aagaaacgga taactccgag 60
gtggaaacca cgggtaaccc cgagtcagaa cccgcggagg aactcaataa gctgggcgtg 120
ccgaccgatc tgccgactat cactcaaatc aagcagacca tcccagcccg ctgctttgac 180
cccagagtac cccagtccat gtactacgtg ttcagagatg tgatcagtat ggctgtcttg 240
tatgctatga gtgaatggtg tctgaacaac ctacctagtt cggctgtgat ggtgcacttt 300
cctttctact ggttcctgca agggacaatg tatacgggca tctttgtcct cggccacgac 360
tgcggacatg gttccttctc gcatcacggt ttcttcaacg acgttatggg gaccctactg 420
cactcttttc tcctgtgccc ctactacacg tggaaactgt cccacaagaa ccatcacaaa 480
aacacgggta acatagacag ggacgaagtg tattatccgg tcaagaagaa gtacagaggt 540
gaccagaaaa accttctccc tggctttggg cttggtcttg gatggttcgg ctatctggta 600
cgtggttaca agccgcgcca ggtgggtcac tttaaccctt ttcactacat gttccagaat 660
cacgttttgg cggtcctcat taccttcgcg tccgattttg cgatgatcta ctttctctat 720
ctgttctacc aggcgcaggg tttcttactg ctcgttcacc attacatcat tcccctgttt 780
gttttctcta catatatggt ggtcttcacg ttcttgcatc accatgacat caatatcccc 840
tggtattcag atgagaagtg gtcgtacatt aagggacaac tttcctcgat cgatcgtgac 900
tatggttggg tgcacggcct gacccacgat attggcactc atcaaatcca ccatctcttt 960
agcaaggtgc cgcactacca tttgcaagag gccacaagac atttccgaaa gagattccca 1020
catttggtgc gatactacaa cgaccccatt ctgccgactt tctggagttt attcaaaaag 1080
tattcttctc agtctataat aaagaacgat acaaaaattc atgtttatag ataa 1134
<210> 5
<211> 1371
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Muraenesox cinereus_delta-6 desaturase
<400> 5
atggggggcg gaggtcaaca gacggagtcg gaatcgagct gtgggcgagg aggcggcgtt 60
ttcacctggg aagaggtgca gcggcattcc cacaaggggg accagtggtt ggtaatcgac 120
agaaaggtgt gcaacatcac cgactgggtg aaaagacatc caggcggcgc ccgtgtcatc 180
agccactatg ccggggagga cgccacggat gcttttgctg cattccatcc agagcctgac 240
tttgtgcgca agtttctgaa gccactgctg attggtgagc ttgcaacctc tgagcccaac 300
caggaccggg acaaaaattc tgtgttgaca caggctttcc gcgaactgcg cgaggaggta 360
gagagggagg gcctcttcag gactcagccg ctgttctttt gcctccacct ggggcatatt 420
cttctcctgg aggccctggc ttacttgctg atttgggtgt atggaacagg ctggctccag 480
accctgctgt gtgcagtaat actggccacc tcacagtctc aggccggatg gctccagcat 540
gacttcggcc acctttccgt cttcaaaaag tcccgctgga accacctgct gcacaagttt 600
gtcatcggac accttaaggg tgcttcggct aactggtgga accatcggca tttccagcac 660
catgcaaaac ccaacatctt cagtaaagac cctgatgtca acatgctcca cacctttgtg 720
ctaggaaaga cccagccagt ggagtatgga ataaagaaga tcaagtacat gccttacaac 780
caccagcacc agtacttctt cctcattgga cctcctatgc ttatcccagt gtatttccac 840
atccagatca tgcaaaccat gttctttcga cgtgattggg tggacctcgt ctggtcaatg 900
agctactacc tgcgctactt cacctgctac acgccctttt acggagtttt tggagctgtg 960
gcgctcatca gcttcgttag gtttctggag agccactggt ttgtgtgggt gacccaaatg 1020
aaccacattc ccatggacat tgaccacgag aagcacgagg attggctgac catgcagctg 1080
aaggccacct gcaacattga gcagtcattc ttcaacgact ggttcagcgg acacctcaac 1140
ttccaaatcg aacaccatct gtttcccaca atgccccggc acaactactg ccgcgtggcc 1200
cctctggtgc gcaaggtgtg tgagaagcat ggcgtcacct accaggagaa gaccctgtgg 1260
agcggcttca gagacgtggt cagctctcta cgggagtctg gagacctgtg gctggatgcg 1320
tatctccata aataattcaa acatttggca ataaagtttc ttaagattga a 1371
<210> 6
<211> 1544
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Pea_vicilin promoter
<400> 6
aaaaacataa atactagaat tagtatttat atttatgaac atatatatca aaattaatat 60
taataaaagt tgacaattcc taaaataaat tatattttat atttattaaa tattattatt 120
aattaaaata tttgactact attttaattt taataaacat ttaagctaca atatcattaa 180
aagatattat cttcaatttt tatatataaa aaaaaatgtt agagaggaaa catttccctc 240
acaaaattca ttacaatgac atcttgcaca tttttgatgg aatttgtgag gaaaatgtta 300
aagatagata aaattcatct caaagctctt cacaaaattt acttttatca tatatttagg 360
gagtttgtga gggattattt gtgactgaat attttcataa caaatttcat cgctaatgtt 420
catccattta atttttttta tttgtagtaa aaatactatt ctctctcttc catttattat 480
attttttaaa actttgtgaa atgatcaact atgacaatta ttttgggacg gagtgagtat 540
catggttttg atcgtgtcta atttcttaac tgttcttgga cttaaaaaac atttaaattt 600
ttttaggaac agttttacaa actcatttgt tattggacac agataacatt taaaaatttt 660
aattcacaat tttaacaatt ataaaatttt tattaatatt aattataatg tgtagataaa 720
tgatagaaag attttggtgt gataaaacat attaataata atattaaata atatagtttt 780
aaagttttta ttaaaaaata attgtatgtt atccttaata ctccatcttc tctttactaa 840
taatgccctg agaatacgga tatatttgga catgacaaat ataaccgttt taataattta 900
tcgtctttgt gatggagaat tatgtaacta tatttttttt aattgaggat tgtaataaaa 960
gtagattata atatatatta tattttttct tttttaatat attaaataaa gtatagtata 1020
tgtaaagtaa acggataaat aatagataaa taattaaatg acatatatct acaattacat 1080
ttttatatat taagtatatt atagtatata tcaagtagac ggataaataa tagatagata 1140
attaaatgac gtatatgtag aattacattt ttcacatgac aagtacaaac ctatgcactt 1200
ctaagtgcaa gtttatggag ttatttgcat gtcttagagc tggagcttgt gttgtaggat 1260
acaacacttg ttaaaattct ctagtcaatt cattaattca tatacacatg gccgaagaca 1320
ataataaagc atcctccttt tccataagaa tgtccaaatt catcaaattc aaacaaaact 1380
ccaccaccca agtaatgttc ttttcatttt gccacttcaa ttttgtacat tttaacacac 1440
gtccatatgc atggcacaac atggccaact gttggtgcat gttaattata tagttttatt 1500
ttttatatct ataaatacac tcatctcact gtactttatt catc 1544
<210> 7
<211> 251
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> nos terminator
<400> 7
gatctagtaa catagatgac accgcgcgcg ataatttatc ctagtttgcg cgctatattt 60
tgttttctat tcgcgcgtat taaatgtata attgcgggac tctaatcata aaaacccatc 120
tcataaataa cgtcatgcat tacatgttaa ttattacatg cttaacgtaa ttcaacagaa 180
attatatgat aatcatcgca agaccggcaa caggattcaa tcttaagaaa ctttattgcc 240
aaatgtttga a 251
Claims (10)
- (a) 서열번호1의 갈고리 흰오징어(berryteuthis magister) 유래 델타 4 불포화효소(Delta 4 Desaturase) 유전자 및 서열번호2의 갈고리 흰오징어 유래 지방산 연장효소(fatty acid elongase) 유전자를 포함하는 pClean A 운반체로 형질전환된 pClean A 형질전환 들깨(Perilla frutescens)를 제조하는 단계;
(b) 서열번호3의 갈고리 흰오징어 유래 델타 5 불포화효소(Delta 5 desaturase) 유전자, 서열번호4의 갈고리 흰오징어 유래 오메가 3 불포화효소(ω3 desaturase) 유전자 및 서열번호5의 갯장어(Muraenesox cinereus) 유래 델타 6 불포화효소(delta 6 desaturase) 유전자를 포함하는 pClean B 운반체로 형질전환된 pClean B 형질전환 들깨(Perilla frutescens)를 제조하는 단계:
(c) 상기 pClean A 형질전환 들깨(Perilla frutescens)와 상기 pClean B 형질전환 들깨(Perilla frutescens)를 교배하여 델타 4 불포화효소, 지방산 연장효소, 델타 5 불포화효소, 오메가 3 불포화효소 유전자 및 델타 6 불포화효소 유전자 5종을 동시에 발현하는 형질전환 들깨(Perilla frutescens)를 선발하는 단계를 포함하는,
DHA를 생합성하는 형질전환 들깨(Perilla frutescens)의 제조방법. - 제 1항의 제조방법에 의해 제조된 DHA를 생합성하는 형질전환 들깨(Perilla frutescens).
- 제 2항에서,
상기 들깨(Perilla frutescens)는 야생형 들깨(Perilla frutescens)와 비교하여 에이코사테트라에노산(eicosatetraenoic acid, ETA), 에이코사펜타에노산(eicosapentaenoic acid, EPA) 및 도코사펜타에산(docosapetaenoic acid, DPA)로 이루어진 군에서 선택되는 DHA 전구체 또는 아라키도닌산(arachidonic acid, ARA)의 함량이 동시에 증가된 것을 특징으로 하는,
형질전환 들깨(Perilla frutescens). - 삭제
- 삭제
- 삭제
- 제 2항에서,
상기 델타 4 불포화효소(Delta 4 Desaturase), 지방산 연장효소(fatty acid elongase), 델타 5 불포화효소(Delta 5 desaturase), 오메가 3 불포화효소(ω3 desaturase) 및 델타 6 불포화효소(delta 6 desaturase) 유전자가 종자 특이적으로 발현되는 것을 특징으로 하는,
형질전환 들깨(Perilla frutescens). - 제 2항, 3항 및 7항 중 어느 한 항의 형질전환 들깨(Perilla frutescens)의 종자.
- (a) 서열번호1의 갈고리 흰오징어(berryteuthis magister) 유래 델타 4 불포화효소(Delta 4 Desaturase) 유전자 및 서열번호2의 갈고리 흰오징어 유래 지방산 연장효소(fatty acid elongase) 유전자를 포함하는 pClean A 운반체 및
(b) 서열번호3의 갈고리 흰오징어 유래 델타 5 불포화효소(Delta 5 desaturase) 유전자, 서열번호4의 갈고리 흰오징어 유래 오메가 3 불포화효소(ω3 desaturase) 유전자 및 서열번호5의 갯장어(Muraenesox cinereus) 유래 델타 6 불포화효소(delta 6 desaturase) 유전자를 포함하는 pClean B 운반체를 포함하는,
DHA의 생합성 유전자 발현을 증가시키기 위한 들깨(Perilla frutescens)의 형질전환용 조성물 - 제 9항에서,
상기 pClean A 운반체 또는 pClean B 운반체는 비실린 프로모터 및 nos 터미네이터 사이에 상기 서열번호1의 염기서열로 이루어진 유전자, 서열번호2의 염기서열로 이루어진 유전자, 서열번호3의 염기서열로 이루어진 유전자, 서열번호4로 이루어진 유전자 및 서열번호5로 이루어진 유전자를 각각 포함하는 것을 특징으로 하는,
들깨(Perilla frutescens)의 형질전환용 조성물.
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| KR1020190110316A KR102184816B1 (ko) | 2019-09-05 | 2019-09-05 | Dha 생합성 유전자군 다중발현 형질전환 들깨 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| KR1020190110316A KR102184816B1 (ko) | 2019-09-05 | 2019-09-05 | Dha 생합성 유전자군 다중발현 형질전환 들깨 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| KR102184816B1 true KR102184816B1 (ko) | 2020-12-01 |
Family
ID=73790687
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| KR1020190110316A Active KR102184816B1 (ko) | 2019-09-05 | 2019-09-05 | Dha 생합성 유전자군 다중발현 형질전환 들깨 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| KR (1) | KR102184816B1 (ko) |
Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| KR102017765B1 (ko) | 2017-11-27 | 2019-09-03 | 인하대학교 산학협력단 | 형질전환 벼 세포 배양에서 자가소화 억제제 처리를 통한 재조합 인간 산 알파-글루코시다제 생산성 증대용 조성물 |
-
2019
- 2019-09-05 KR KR1020190110316A patent/KR102184816B1/ko active Active
Patent Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| KR102017765B1 (ko) | 2017-11-27 | 2019-09-03 | 인하대학교 산학협력단 | 형질전환 벼 세포 배양에서 자가소화 억제제 처리를 통한 재조합 인간 산 알파-글루코시다제 생산성 증대용 조성물 |
Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| Noemi Ruiz-Lopez 등. Journal of Experimental Botany. Vol. 63, No. 7, 페이지 2397-2410 (2012.01.30.) * |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| US12006504B2 (en) | Production of DHA and other LC PUFAs in plants | |
| CN104024403B (zh) | 植物中dha和其它lc‑pufa的生成 | |
| CA2535310C (en) | Fatty acid desaturases from primula | |
| CN103756972B (zh) | 来自半片藻属的脂肪酸脱饱和酶的利用 | |
| US20220042028A1 (en) | Production of dha and other lc pufas in plants | |
| KR102184816B1 (ko) | Dha 생합성 유전자군 다중발현 형질전환 들깨 | |
| TW200520679A (en) | Arachidonic acid-containing plants and use of the plants | |
| CN109477079A (zh) | 增加微藻中ω-3多不饱和脂肪酸产量的方法 | |
| CN101921784B (zh) | 具有δ6脂肪酸脱氢酶功能的基因及其应用 | |
| HK1179652B (en) | Production of dha and other lc-pufas in plants | |
| HK1200188B (en) | Production of dha and other lc-pufas in plants |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PA0109 | Patent application |
Patent event code: PA01091R01D Comment text: Patent Application Patent event date: 20190905 |
|
| PA0201 | Request for examination | ||
| PE0902 | Notice of grounds for rejection |
Comment text: Notification of reason for refusal Patent event date: 20200421 Patent event code: PE09021S01D |
|
| PE0701 | Decision of registration |
Patent event code: PE07011S01D Comment text: Decision to Grant Registration Patent event date: 20200830 |
|
| GRNT | Written decision to grant | ||
| PR0702 | Registration of establishment of national patent |
Patent event code: PR07021E01D Comment text: Registration of Establishment of National Patent Patent event date: 20201124 |
|
| PR1002 | Payment of registration fee |
Payment date: 20201124 End annual number: 20 Start annual number: 1 |
|
| PG1601 | Publication of registration |