KR102184059B1 - 발현 벡터 구성, 신규한 생산 세포 생성 방법 및 폴리펩티드의 재조합 생산을 위한 그의 용도 - Google Patents
발현 벡터 구성, 신규한 생산 세포 생성 방법 및 폴리펩티드의 재조합 생산을 위한 그의 용도 Download PDFInfo
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Abstract
하기를 포함하는 발현 벡터가 본원에서 보고된다:
- 항체 경쇄 발현 카세트,
- 항체 중쇄 발현 카세트, 및
- 선별 마커 발현 카세트,
여기에서 발현 카세트는 단방향 배열되어 있고,
여기에서 발현 카세트는 5' 에서 3' 서열의 항체 중쇄 발현 카세트, 항체 경쇄 발현 카세트 및 선별 마커 발현 카세트로 배열되어 있음.
또한 항체 생산 세포의 생성 방법 및 항체의 재조합 생산을 위한 이러한 세포의 용도가 본원에서 보고된다.
- 항체 경쇄 발현 카세트,
- 항체 중쇄 발현 카세트, 및
- 선별 마커 발현 카세트,
여기에서 발현 카세트는 단방향 배열되어 있고,
여기에서 발현 카세트는 5' 에서 3' 서열의 항체 중쇄 발현 카세트, 항체 경쇄 발현 카세트 및 선별 마커 발현 카세트로 배열되어 있음.
또한 항체 생산 세포의 생성 방법 및 항체의 재조합 생산을 위한 이러한 세포의 용도가 본원에서 보고된다.
Description
신규한 벡터 구성, 생산 세포주의 신규한 생성 방법, 예컨대 신규한 트랜스펙션 또는 선별 방법, 뿐만 아니라 관심의 폴리펩티드의 재조합 생산을 위한 이들 발현 벡터 및 생산 세포주의 용도가 본원에서 보고된다.
유전자의 전사 수준은 유전자의 발현 수준에 큰 영향을 미칠 수 있고, 그러므로 세포의 생산성을 결정한다. 유전자의 전사 수준은 주로 하기 3 가지 벡터 엘리먼트의 영향을 받는다: 프로모터, polyA 신호 서열 및 (존재하는 경우) 전사 종료자.
항체 중쇄 인코딩 핵산은 일반적으로 리더 서열 (신호 서열) (약 57 bp/19 aa) (이는 단백질의 성숙시 제거됨), 가변 영역, VH (약 350 bp/115 aa), 및 불변 영역, CH (약 990 bp/330 aa) 를 포함한다. 항체 경쇄 인코딩 핵산은 일반적으로 리더 서열 (약 66 bp/22 aa) (이는 단백질의 성숙시 제거됨), 가변 영역, VK 또는 VL (약 350 bp/115 aa), 및 불변 영역, CK 또는 CL (약 321 bp/107 aa) 로 구성된다.
진핵 세포에서의 항체의 재조합 생산은 발현 시스템의 창조를 수반한다 (McCafferty, J. 등, (eds.), Antibody Engineering, A Practical Approach, IRL Press (1997) 참조). 항체 발현 시스템의 개발을 위해 측면에 프로모터 및 폴리-아데닐화 (polyA) 영역이 있는 경쇄 인코딩 핵산을 포함하는 발현 카세트가 창조된다. 또한, 측면에 프로모터 및 polyA 영역이 있는 중쇄 인코딩 핵산을 포함하는 중쇄 발현 카세트가 창조된다. 중쇄 발현 카세트는 경쇄 발현 카세트와 조합되어 중쇄 및 경쇄 발현 카세트 둘다를 함유하는 단일 벡터로 통합되거나 또는 2 개의 별개의 벡터로 통합될 수 있다.
면역글로불린 DNA 카세트 분자, 모노바디 구축물 (monobody constructs), 생산 방법, 및 그의 사용 방법이 US 7,053,202 에서 보고된다. US 5,168,062 에서 인간 사이토메갈로바이러스 조기 발현 (immediate-early) 프로모터-조절성 DNA 서열을 함유하는 트랜스퍼 벡터 (transfer vector) 및 미생물이 보고된다. 인간 폴리펩티드 사슬 신장 인자-1α (human polypeptide chain elongation factor-1α) 에 대한 프로모터 영역을 함유하는 DNA 조각, 그것의 염기 서열, 및 광범위한 고발현능 숙주 세포에 적용가능한 상기 DNA 조각을 함유하는 발현 플라스미드가 US 5,225,348 에서 보고된다. US 5,266,491 에서 SV40 복제 기점 및 인간 폴리펩티드 사슬 신장 인자-1α 유전자에 대한 프로모터 영역을 함유하는 DNA 조각을 함유하는 발현 플라스미드가 보고된다. 재조합 DNA 화합물 및 폴리펩티드 예컨대 tPA 의 발현이 US 5,122,458 에서 보고된다. US 7,422,874 에서 동물 세포용 발현 벡터가 보고된다.
Kim, D. 등은 전사 종료 영역이 조작된 개선된 포유류 세포 발현 시스템을 보고한다 (Biotechnol. Prog. 19 (2003) 1620-1622). 세포성 mRNA 의 9-nt 분절은 내부 리보솜 진입 자리 (IRES) 로서 기능할 수 있고, 연결된 복수의 카피로 존재할 때 IRES 활성을 크게 향상시킨다고 Chappell, S.A. 등이 보고한다 (Proc. Natl. Acad. Sci. USA 97 (2000) 1536-1541. Corish, P. 및 Tyler-Smith, C. 는 포유류 세포에서의 녹색 형광 단백질 반감기의 감소를 보고한다 (Prot. Eng. 12 (1999) 1035-1040). 트랜스펙션된 포유류 세포에서의 인핸서 엘리먼트의 단리 및 분석을 위해 디자인된 신규한 GFPneo 벡터를 Primig, M. 등이 보고한다 (Gene 215 (1998) 181-189). Ng, S.K. 등은 CHO-DG44 에서의 개선된 재조합 단백질 생산성을 위한 선별 마커에 대한 불안정화 서열의 적용을 보고한다 (Metabol. Eng. 9 (2007) 304-316).
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항체를 재조합 생산하는 경우 경쇄 발현 카세트의 앞의 중쇄 발현 카세트의 위치 (HC-LC (5'-3')) 가 역순 (LC-HC (5'-3')) 에 비해 더 나은 발현 결과를 제공하는 것으로 밝혀졌다. 또한 항체 사슬 발현 카세트 둘다 뒤의 선별 마커의 위치 (HC-LC-SM (5'-3')) 가 제 1 항체 사슬 앞의 양방향 위치 (SM (3'-5')-HC-LC (5'-3')) 에 비해 더 나은 발현 결과를 제공하는 것으로 밝혀졌다.
안정적 트랜스펙션의 경우 1) 항체 중쇄, 2) 항체 경쇄 및 3) 선별 마커의 열 배열이 최적인 것으로 밝혀졌다. 그러나 hEF1α 프로모터는 hCMV 프로모터보다 안정적 푸울에서는 명백히 우수하지만, 단일 클론 수준에서는 명백한 반대 효과가 관찰되었다. 여기에서, 인간 사이토메갈로바이러스 조기 발현 프로모터/인핸서 (hCMV) 는 최고 생산성으로 클론을 생성했다. 더욱이, hCMV 를 bGH polyA 신호 및 인간 가스트린 유전자 (hGT) 의 종료자 서열과 조합시킴으로써 hCMV 의 성능이 추가로 개선될 수 있으며, 이에 따라 생산성 및 발현 안정성이 둘다 증가된다.
프로모터, 구조 유전자 및 polyA 신호 서열 및 임의로 종료자 서열을 각각 포함하는 항체 중쇄 발현 카세트 및 항체 경쇄 발현 카세트를 포함하는 발현 벡터의 사용으로, 1) 프로모터가 인간 사이토메갈로바이러스 프로모터 (hCMV) 이고, polyA 신호 서열이 소 성장 호르몬 polyA 신호 서열 (bGH polyA) 이고, 종료자 서열이 인간 가스트린 유전자 전사 종료자 서열 (hGT) 인 경우, 또는 2) 프로모터가 인간 신장 인자 1 알파 프로모터 (EF1alpha) 이고, polyA 신호 서열이 소 성장 호르몬 polyA 신호 서열 (bGH polyA) 이고, 종료자 서열이 부재하는 경우, 트랜스펙션 후에 더 많은 수의 항체 생산/분비 세포 클론이 초래되는 것으로 밝혀졌다.
위에 개설된 발현 벡터를 사용함으로써 트랜스펙션 후에 더 많은 수의 항체 생산/분비 세포가 수득될 수 있고, 이에 따라 대규모 재조합 항체 생산에 적합한 고 생산자 세포를 식별하는데 필요한 노력이 감소된다.
본원에서 보고되는 하나의 양상은 하기를 포함하는 발현 벡터이다:
- 항체 경쇄 발현 카세트,
- 항체 중쇄 발현 카세트, 및
- 선별 마커 발현 카세트,
여기에서 발현 카세트는 단방향 배열되어 있고,
여기에서 발현 카세트는 5' 에서 3' 서열의 항체 중쇄 발현 카세트, 항체 경쇄 발현 카세트 및 선별 마커 발현 카세트로 배열되어 있음.
하나의 구현예에서 항체 경쇄 발현 카세트 및/또는 항체 중쇄 발현 카세트 및/또는 선별 마커 카세트는 서로 독립적으로 인간 신장 인자 1 알파 프로모터, 인간 CMV 프로모터, 및 SV40 프로모터로부터 선택되는 프로모터를 포함한다.
하나의 구현예에서 1, 2, 또는 모든 3 개의 발현 카세트는 인간 신장 인자 1 알파 프로모터를 포함한다. 하나의 구현예에서 항체 경쇄 발현 카세트 및/또는 항체 중쇄 발현 카세트 및/또는 선별 마커 카세트는 서로 독립적으로 인간 신장 인자 1 알파 프로모터를 포함한다. 하나의 구현예에서 발현 카세트는 종료자 서열을 포함하지 않으며, 즉 발현 카세트에는 종료자 서열이 없다. 하나의 구현예에서 종료자 서열은 인간 가스트린 유전자 전사 종료자 서열 (hGT) 이다.
하나의 구현예에서 1, 2, 또는 모든 3 개의 발현 카세트는 인간 CMV 프로모터를 포함한다. 하나의 구현예에서 항체 경쇄 발현 카세트 및/또는 항체 중쇄 발현 카세트 및/또는 선별 마커 카세트는 서로 독립적으로 인간 CMV 프로모터를 포함한다.
하나의 구현예에서 1, 2, 또는 3 개의 발현 카세트는 소 성장 호르몬 polyA 신호 서열을 포함한다. 하나의 구현예에서 항체 경쇄 발현 카세트 및/또는 항체 중쇄 발현 카세트 및/또는 선별 마커 카세트는 서로 독립적으로 소 성장 호르몬 polyA 신호 서열을 포함한다.
하나의 구현예에서 항체 경쇄 발현 카세트 및/또는 항체 중쇄 발현 카세트 및/또는 선별 마커 카세트는 서로 독립적으로 소 성장 호르몬 polyA 신호 서열 및 SV40 polyA 신호 서열로부터 선택되는 polyA 신호 서열을 포함한다.
하나의 구현예에서 1, 2, 또는 모든 3 개의 발현 카세트는 polyA 신호 서열 뒤에 인간 가스트린 종료자 서열을 포함하며, 단, 발현 카세트는 인간 신장 인자 1 알파 프로모터를 포함하지 않는다. 하나의 구현예에서 항체 경쇄 발현 카세트 및/또는 항체 중쇄 발현 카세트 및/또는 선별 마커 카세트는 서로 독립적으로 polyA 신호 서열 뒤에 인간 가스트린 종료자 서열을 포함한다.
하나의 구현예에서 항체 경쇄 발현 카세트 및/또는 항체 중쇄 발현 카세트 및/또는 선별 마커 카세트는 서로 독립적으로 5' 에서 3' 방향으로 소 성장 호르몬 polyA 신호 서열 및 인간 가스트린 종료자 서열을 포함하며, 단, 발현 카세트는 인간 신장 인자 1 알파 프로모터를 포함하지 않는다.
하나의 구현예에서 1, 2, 또는 모든 3 개의 발현 카세트의 프로모터는 Intron A 를 포함한다.
하나의 구현예에서 1, 2, 또는 모든 3 개의 발현 카세트는 SV40 polyA 신호 서열을 포함한다.
하나의 구현예에서 1, 2, 또는 모든 3 개의 발현 카세트는 SV40 프로모터를 포함한다.
하나의 구현예에서 항체 경쇄 인코딩 핵산 및/또는 항체 중쇄 인코딩 핵산은 하나 이상의 인트론을 포함한다.
하나의 구현예에서 항체 경쇄 인코딩 핵산 및/또는 항체 중쇄 인코딩 핵산은 cDNA 이다.
본원에서 보고되는 하나의 양상은 항체의 재조합 생산을 위한, 본원에서 보고되는 발현 벡터의 용도이다.
본원에서 보고되는 하나의 양상은 안정적 세포주의 생성을 위한, 본원에서 보고되는 발현 벡터의 용도이다.
본원에서 보고되는 하나의 양상은 생산 세포주의 생성을 위한, 본원에서 보고되는 발현 벡터의 용도이다.
본원에서 보고되는 하나의 양상은 안정적 세포주의 생성을 위한, 인간 신장 인자 1 알파 프로모터를 포함하는 하나 이상의 발현 카세트를 포함하는 본원에서 보고되는 발현 벡터의 용도이다.
본원에서 보고되는 하나의 양상은 생산 세포주의 생성을 위한, 인간 신장 인자 1 알파 프로모터를 포함하는 하나 이상의 발현 카세트를 포함하는 본원에서 보고되는 발현 벡터의 용도이다.
본원에서 보고되는 하나의 양상은 항체의 재조합 생산을 위한, 인간 신장 인자 1 알파 프로모터를 포함하는 하나 이상의 발현 카세트를 포함하는 본원에서 보고되는 발현 벡터의 용도이다.
본원에서 보고되는 하나의 양상은 생산 세포주의 생성을 위한, 인간 CMV 프로모터를 포함하는 하나 이상의 발현 카세트를 포함하는 본원에서 보고되는 발현 벡터의 용도이다.
본원에서 보고되는 하나의 양상은 안정적 세포주의 생성을 위한, 인간 CMV 프로모터를 포함하는 하나 이상의 발현 카세트를 포함하는 본원에서 보고되는 발현 벡터의 용도이다.
본원에서 보고되는 하나의 양상은 항체의 생산을 위한, 인간 CMV 프로모터를 포함하는 하나 이상의 발현 카세트를 포함하는 본원에서 보고되는 발현 벡터의 용도이다.
본원에서 보고되는 하나의 양상은 발현 벡터가 트랜스펙션 전에 원핵생물 복제 기점 내의 절단에 의해 선형화되는 것을 특징으로 하는, 발현 벡터로 진핵 세포를 트랜스펙션하는 방법이다.
하나의 구현예에서 원핵생물 복제 기점은 하나의 항체 경쇄 발현 카세트와 하나의 항체 중쇄 발현 카세트 사이에 있다.
본원에서 보고되는 하나의 양상은 항체의 재조합 생산을 위한 진핵 세포의 생성을 위한, 본원에서 보고되는 방법의 용도이다.
본원에서 보고되는 하나의 양상은 트랜스펙션 후 약 24 시간에 처음으로 배양 배지에 선별제가 첨가되는 것을 특징으로 하는, 항체 인코딩 핵산을 포함하는 진핵 세포의 선별 방법이다.
본원에서 보고되는 하나의 양상은 항체의 재조합 생산을 위한 진핵 세포의 생성을 위한, 본원에서 보고되는 방법의 용도이다.
본원에서 보고되는 하나의 양상은 항체의 재조합 생산을 위한, 본원에서 보고되는 방법으로 선별된 세포의 용도이다.
본원에서 보고되는 하나의 양상은 하기 단계를 포함하는 항체의 생산 방법이다:
- 본원에서 보고되는 발현 벡터를 포함하는 진핵 세포를 배양하는 단계, 및
- 세포 또는 배양 배지로부터 항체를 회수하는 단계.
본원에서 보고되는 하나의 양상은 하기 단계를 포함하는 항체의 생산 방법이다:
- 트랜스펙션 전에 원핵생물 복제 기점 내의 절단에 의해 선형화된 발현 벡터로 트랜스펙션하여 수득된 진핵 세포를 배양하는 단계, 및
- 세포 또는 배양 배지로부터 항체를 회수하는 단계.
본원에서 보고되는 하나의 양상은 하기 단계를 포함하는 항체의 생산 방법이다:
- 트랜스펙션 후 약 24 시간에 배양물에 선별제를 첨가하여 선별된 진핵 세포를 배양하는 단계, 및
- 세포 또는 배양 배지로부터 항체를 회수하는 단계.
본원에서 보고되는 하나의 양상은 발현 벡터로 진핵 세포를 트랜스펙션하기 전에 발현 벡터로부터 원핵생물 핵산 서열이 제거되는 것을 특징으로 하는, 원핵생물 및 진핵생물 핵산 서열을 포함하는 발현 벡터로 진핵 세포를 트랜스펙션하는 방법이다.
본원에서 보고되는 하나의 양상은 진핵 세포의 트랜스펙션을 위한, 원핵생물 핵산 서열을 포함하지 않는 선형화된 발현 벡터의 용도이다.
본원에서 보고되는 하나의 양상은 항체의 재조합 생산을 위한 진핵 세포의 생성을 위한, 오직 진핵생물 핵산 서열만을 포함하는 발현 벡터의 용도이다.
본원에서 보고되는 모든 양상의 하나의 구현예에서 항체는 이중특이적 항체이다.
하나의 구현예에서 이중특이적 항체는 제 1 항원 또는 항원 상의 제 1 에피토프에 특이적으로 결합하는 제 1 결합 특이성 또는 결합 자리를 갖고, 이중특이적 항체는 제 2 항원 또는 항원 상의 제 2 에피토프에 특이적으로 결합하는 제 2 결합 특이성 또는 결합 자리를 갖는다.
하나의 구현예에서 발현 벡터는 하기를 포함한다:
- 5' 에서 3' 방향으로 프로모터, 제 1 항체 경쇄 인코딩 핵산, polyA 신호 서열, 및 임의로 종료자 서열을 포함하는 제 1 발현 카세트,
- 5' 에서 3' 방향으로 프로모터, 제 2 항체 경쇄 인코딩 핵산, polyA 신호 서열, 및 임의로 종료자 서열을 포함하는 제 2 발현 카세트,
- 5' 에서 3' 방향으로 프로모터, 제 1 항체 중쇄 인코딩 핵산, polyA 신호 서열, 및 임의로 종료자 서열을 포함하는 제 3 발현 카세트,
- 5' 에서 3' 방향으로 프로모터, 제 2 항체 중쇄 인코딩 핵산, polyA 신호 서열, 및 임의로 종료자 서열을 포함하는 제 4 발현 카세트,
또는
- 5' 에서 3' 방향으로 프로모터, 항체 경쇄 인코딩 핵산, polyA 신호 서열, 및 임의로 종료자 서열을 포함하는 제 1 발현 카세트,
- 5' 에서 3' 방향으로 프로모터, 제 1 항체 중쇄 인코딩 핵산, polyA 신호 서열, 및 임의로 종료자 서열을 포함하는 제 2 발현 카세트, 및
- 5' 에서 3' 방향으로 프로모터, 제 2 항체 중쇄 인코딩 핵산, polyA 신호 서열, 및 임의로 종료자 서열을 포함하는 제 3 발현 카세트,
여기에서 항체 경쇄는 항체 중쇄 둘다에 대한 공통 경쇄임.
본원에서 보고되는 모든 양상의 하나의 구현예에서 발현 벡터는 하기를 포함한다:
- 항체 경쇄 발현 카세트,
- 제 1 항체 중쇄 발현 카세트,
- 제 2 항체 중쇄 발현 카세트, 및
- 선별 마커 발현 카세트,
여기에서 항체 중쇄 발현 카세트, 항체 경쇄 발현 카세트, 및 선별 마커 발현 카세트 중 하나 이상은 단방향 배열되어 있고,
여기에서 단방향 발현 카세트는 5' 에서 3' 서열의 항체 중쇄 발현 카세트, 항체 경쇄 발현 카세트 및 선별 마커 발현 카세트로 배열되어 있음.
본원에서 보고되는 모든 양상의 하나의 구현예에서 발현 벡터는 하기를 포함한다:
- 제 1 항체 경쇄 발현 카세트,
- 제 2 항체 경쇄 발현 카세트,
- 제 1 항체 중쇄 발현 카세트,
- 제 2 항체 중쇄 발현 카세트, 및
- 선별 마커 발현 카세트,
여기에서 항체 중쇄 발현 카세트 중 하나, 항체 경쇄 발현 카세트 중 하나, 및 선별 마커 발현 카세트는 단방향 배열되어 있고,
여기에서 단방향 발현 카세트는 5' 에서 3' 서열의 항체 중쇄 발현 카세트, 항체 경쇄 발현 카세트 및 선별 마커 발현 카세트로 배열되어 있음.
하나의 구현예에서 항체 중쇄 발현 카세트 중 하나는 홀 돌연변이를 포함하는 항체 중쇄를 인코딩한다.
하나의 구현예에서 항체 중쇄 발현 카세트 중 하나는 놉 돌연변이를 포함하는 항체 중쇄를 인코딩한다.
하나의 구현예에서 항체 경쇄 발현 카세트 중 하나는 항체 경쇄 가변 도메인 및 불변 도메인으로서 항체 중쇄 CH1 도메인을 포함하는 항체 경쇄를 인코딩하고/거나, 항체 경쇄 발현 카세트 중 하나는 항체 경쇄 가변 도메인 및 불변 도메인으로서 항체 경쇄 CL 도메인을 포함하는 항체 경쇄를 인코딩한다.
하나의 구현예에서 항체 중쇄 발현 카세트 중 하나는 제 1 불변 도메인으로서 항체 경쇄 불변 도메인 (CL) 을 포함하는 항체 중쇄를 인코딩하고/거나, 항체 중쇄 발현 카세트 중 하나는 제 1 불변 도메인으로서 항체 중쇄 CH1 도메인을 포함하는 항체 중쇄를 인코딩한다.
하나의 구현예에서 hCMV 프로모터는 SEQ ID NO: 01 의 서열을 갖는다. 이는 Intron A 를 포함하지 않고 5'UTR 을 포함하지 않는 hCMV 프로모터이다.
하나의 구현예에서 hCMV 프로모터는 SEQ ID NO: 02 의 서열을 갖는다. 이는 Intron A 를 포함하지 않고 5'UTR 을 포함하는 hCMV 프로모터이다.
하나의 구현예에서 hCMV 프로모터는 SEQ ID NO: 03 의 서열을 갖는다. 이는 Intron A 를 포함하는 전장 hCMV 프로모터이다.
하나의 구현예에서 인간 신장 인자 1 알파 프로모터는 SEQ ID NO: 04 의 서열을 갖는다. 이는 Intron A 를 포함하지 않는 hEF1alpha 프로모터이다.
하나의 구현예에서 인간 신장 인자 1 알파 프로모터는 SEQ ID NO: 05 의 서열을 갖는다. 이는 Intron A 를 포함하는 hEF1alpha 프로모터이다.
하나의 구현예에서 인간 신장 인자 1 알파 프로모터는 SEQ ID NO: 06 의 서열을 갖는다. 이는 Intron A 를 포함하고 5'UTR 을 포함하는 짧은 hEF1alpha 프로모터이다.
하나의 구현예에서 랫트 CMV 프로모터는 SEQ ID NO: 07 의 서열을 갖는다.
하나의 구현예에서 SV40 polyA 신호 서열은 SEQ ID NO: 08 의 서열을 갖는다.
하나의 구현예에서 소 성장 호르몬 polyA 신호 서열은 SEQ ID NO: 09 의 서열을 갖는다.
하나의 구현예에서 인간 가스트린 종료자는 SEQ ID NO: 10 의 서열을 갖는다.
하나의 구현예에서 SV40 프로모터는 SEQ ID NO: 11 의 서열을 갖는다.
하나의 구현예에서 오르니틴 데카르복실라제의 PEST 서열은 SEQ ID NO: 12 의 서열에 의해 인코딩된다.
하나의 구현예에서 GFP 서열은 SEQ ID NO: 13 의 서열에 의해 인코딩된다.
하나의 구현예에서 네오마이신 선별 마커는 SEQ ID NO: 14 의 서열을 갖는다.
하나의 구현예에서 GFP-PEST-NEO 융합 폴리펩티드는 SEQ ID NO: 15 의 서열에 의해 인코딩된다.
하나의 구현예에서 EMCV-IRES 는 SEQ ID NO: 16 의 서열을 갖는다.
하나의 구현예에서 EV71-IRES 는 SEQ ID NO: 17 의 서열을 갖는다.
도 1 일시적 트랜스펙션, 안정적 푸울 및 단일 클론 수준에서 시험된 상이한 벡터 디자인에 대한 도식적 개요. 벡터 p5158, p5137, p5156 및 p5159 는 경쇄 (LC) 및 중쇄 (HC) 각각의 위치 및/또는 선별 마커 (SM) 의 위치에서 다르다.
도 2 일시적 트랜스펙션된 CHO-K1 세포에서 벡터 p5137, p5156, p5158 및 p5159 의 생산성. ELISA 에 의해 측정된 트랜스펙션 후 제 5 일의 각각의 벡터의 8 회의 독립적 트랜스펙션의 평균 생산성이 제시되어 있다.
도 3 회분식 분석에서 벡터 p5137, p5156, p5158 및 p5159 로 생성된 안정적 푸울의 생산성. 제 7 일의 각각의 벡터의 3 개 푸울의 평균 생산성이 제시되어 있다.
도 4 발현 벡터 p5068 의 벡터 디자인 및 벡터 px6068 의 벡터 디자인의 도식적 개요. LC (경쇄), HC (중쇄), SM (선별 마커 (SV40 프로모터에 의해 추진됨)) 및 ori (복제 기점) 이 나타나 있다.
도 5 일시적 트랜스펙션된 CHO-K1 세포에서 벡터 p5068 및 px6068 의 생산성. ELISA 에 의해 측정된 트랜스펙션 후 제 7 일의 각각의 벡터의 8 회의 독립적 트랜스펙션의 평균 생산성이 제시되어 있다.
도 6 제한 효소 SgrAI 또는 제한 효소 BssHII 로 선형화된 벡터 px6068 로 생성된 안정적 푸울의 생산성. 제 7 일의 회분식 분석에서 각각의 벡터의 2 개 푸울의 평균 생산성이 제시되어 있다.
도 7 트랜스펙션 후 선별 시작 시점에 대한 안정적 세포 푸울의 IgG 역가의 의존성.
도 8 (A) 안정적 세포 클론의 생성을 위한 선별 시간; (B) 푸울의 생산성; (C) 단일 클론의 생산성; (D) 생존 세포 밀도 회복의 시간 경과; (E) 배양 4, 7 및 10 일 후 생존 세포 밀도; 벡터 제제 A - 선형화된 전체 벡터, 벡터 제제 B - 원핵생물 벡터 엘리먼트의 절단, 벡터 제제 C - 원핵생물 벡터 엘리먼트의 절단 및 제거.
도 9 뉴클레오펙션을 사용한 일시적 트랜스펙션에서 벡터 px9001-px9011 의 생산성: 트랜스펙션 후 제 6 일의 각각의 벡터의 8 회의 독립적 트랜스펙션의 평균 생산성이 제시되어 있다; 값은 레퍼런스 px9001 의 값 (100 % 로 설정됨) 으로 정규화되어 있다.
도 10 제 10 일의 회분식 분석에서 벡터 px9001-px9007 로 생성된 안정적 푸울의 생산 역가의 개요. 각각의 벡터의 2 (px9001 및 px9002) 내지 3 회의 독립적 트랜스펙션의 평균이 제시되어 있다.
도 2 일시적 트랜스펙션된 CHO-K1 세포에서 벡터 p5137, p5156, p5158 및 p5159 의 생산성. ELISA 에 의해 측정된 트랜스펙션 후 제 5 일의 각각의 벡터의 8 회의 독립적 트랜스펙션의 평균 생산성이 제시되어 있다.
도 3 회분식 분석에서 벡터 p5137, p5156, p5158 및 p5159 로 생성된 안정적 푸울의 생산성. 제 7 일의 각각의 벡터의 3 개 푸울의 평균 생산성이 제시되어 있다.
도 4 발현 벡터 p5068 의 벡터 디자인 및 벡터 px6068 의 벡터 디자인의 도식적 개요. LC (경쇄), HC (중쇄), SM (선별 마커 (SV40 프로모터에 의해 추진됨)) 및 ori (복제 기점) 이 나타나 있다.
도 5 일시적 트랜스펙션된 CHO-K1 세포에서 벡터 p5068 및 px6068 의 생산성. ELISA 에 의해 측정된 트랜스펙션 후 제 7 일의 각각의 벡터의 8 회의 독립적 트랜스펙션의 평균 생산성이 제시되어 있다.
도 6 제한 효소 SgrAI 또는 제한 효소 BssHII 로 선형화된 벡터 px6068 로 생성된 안정적 푸울의 생산성. 제 7 일의 회분식 분석에서 각각의 벡터의 2 개 푸울의 평균 생산성이 제시되어 있다.
도 7 트랜스펙션 후 선별 시작 시점에 대한 안정적 세포 푸울의 IgG 역가의 의존성.
도 8 (A) 안정적 세포 클론의 생성을 위한 선별 시간; (B) 푸울의 생산성; (C) 단일 클론의 생산성; (D) 생존 세포 밀도 회복의 시간 경과; (E) 배양 4, 7 및 10 일 후 생존 세포 밀도; 벡터 제제 A - 선형화된 전체 벡터, 벡터 제제 B - 원핵생물 벡터 엘리먼트의 절단, 벡터 제제 C - 원핵생물 벡터 엘리먼트의 절단 및 제거.
도 9 뉴클레오펙션을 사용한 일시적 트랜스펙션에서 벡터 px9001-px9011 의 생산성: 트랜스펙션 후 제 6 일의 각각의 벡터의 8 회의 독립적 트랜스펙션의 평균 생산성이 제시되어 있다; 값은 레퍼런스 px9001 의 값 (100 % 로 설정됨) 으로 정규화되어 있다.
도 10 제 10 일의 회분식 분석에서 벡터 px9001-px9007 로 생성된 안정적 푸울의 생산 역가의 개요. 각각의 벡터의 2 (px9001 및 px9002) 내지 3 회의 독립적 트랜스펙션의 평균이 제시되어 있다.
발명의 상세한 설명
I. 일반적 양상
당업자에게 알려진 바와 같이 재조합 DNA 기술의 사용은 핵산 및/또는 폴리펩티드의 수많은 유도체의 생성을 가능케 한다. 그러한 유도체는, 예를 들어, 하나의 개별 또는 여러 위치에서 치환, 변경, 교환, 결실, 또는 삽입에 의해 수식될 수 있다. 수식 또는 유도체화는, 예를 들어, 자리 지정 돌연변이유발을 이용하여 수행될 수 있다. 그러한 수식은 당업자에 의해 용이하게 수행될 수 있다 (예를 들어 Sambrook, J. 등, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York, USA (1999) 참조). 재조합 기술의 사용은 당업자가 다양한 숙주 세포를 이종 핵산(들)로 형질전환하는 것을 가능케 한다. 상이한 세포의 전사 및 번역, 즉 발현, 기구는 동일한 엘리먼트를 사용하지만, 상이한 종에 속하는 세포는 특히 소위 코돈 사용법이 상이할 수 있다. 그에 따라 동일한 폴리펩티드 (아미노산 서열에 관하여) 가 상이한 핵산(들)에 의해 인코딩될 수 있다. 또한, 유전자 코드의 축퇴로 인해, 상이한 핵산이 동일한 폴리펩티드를 인코딩할 수 있다.
재조합 DNA 기술의 사용은 핵산 및/또는 폴리펩티드의 수많은 유도체의 생성을 가능케 한다. 그러한 유도체는, 예를 들어, 하나의 개별 또는 여러 위치에서 치환, 변경, 교환, 결실, 또는 삽입에 의해 수식될 수 있다. 수식 또는 유도체화는, 예를 들어, 자리 지정 돌연변이유발을 이용하여 수행될 수 있다. 그러한 수식은 당업자에 의해 용이하게 수행될 수 있다 (예를 들어 Sambrook, J. 등, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York, USA (1999); Hames, B.D., and Higgins, S.J., Nucleic acid hybridization - a practical approach, IRL Press, Oxford, England (1985) 참조).
재조합 기술의 사용은 당업자가 다양한 숙주 세포를 이종 핵산(들)로 형질전환하는 것을 가능케 한다. 상이한 세포의 전사 및 번역, 즉 발현, 기구는 동일한 엘리먼트를 사용하지만, 상이한 종에 속하는 세포는 특히 소위 코돈 사용법이 상이할 수 있다. 그에 따라 동일한 폴리펩티드 (아미노산 서열에 관하여) 가 상이한 핵산(들)에 의해 인코딩될 수 있다. 또한, 유전자 코드의 축퇴로 인해, 상이한 핵산이 동일한 폴리펩티드를 인코딩할 수 있다.
정의
"친화도 성숙된" 항체는, 변경을 보유하지 않는 부모 항체와 비교되게, 하나 이상의 과가변 영역 (HVR) 내에 항원에 대한 항체의 친화도에 개선을 초래하는 하나 이상의 변경을 보유하는 항체를 언급한다.
본원에서 용어 "항체" 는 가장 넓은 의미로 사용되며, 모노클로날 항체, 폴리클로날 항체, 및 다중특이적 항체 (예를 들어, 이중특이적 항체) 를 포함하나 이에 제한되지 않는 다양한 항체 구조를 포괄한다.
"항체 조각" 은 온전한 (intact) 항체가 결합하는 항원에 결합하는 온전한 항체의 일부를 포함하는 온전한 항체 이외의 다른 분자를 언급한다. 항체 조각의 예는 Fv, Fab, Fab', Fab'-SH, F(ab')2; 다이아바디 (diabody); 선형 항체; 단일 사슬 항체 분자 (예를 들어 scFv); 및 항체 조각으로부터 형성된 다중특이적 항체를 포함하나 이에 제한되는 것은 아니다.
용어 "키메라" 항체는 중쇄 및/또는 경쇄의 일부는 특정 출처 또는 종에서 유래하지만, 중쇄 및/또는 경쇄의 나머지는 상이한 출처 또는 종에서 유래하는 항체를 언급한다.
항체의 "클래스" 는 그것의 중쇄가 보유하는 불변 도메인 또는 불변 영역의 유형을 언급한다. 항체의 5 개의 주요 클래스 IgA, IgD, IgE, IgG 및 IgM 이 존재하고, 이들 중 여럿은 서브클래스 (아이소타입), 예를 들어, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1 및 IgA2 로 추가로 분류될 수 있다. 면역글로불린의 상이한 클래스에 상응하는 중쇄 불변 도메인은 각각 α, δ, ε, γ 및 μ 로 호칭된다.
본원에서 사용되는 용어 "발현" 은 세포 내에서 일어나는 전사 및/또는 번역 과정을 언급한다. 세포 내에서 관심의 핵산 서열의 전사의 수준은 세포 내에 존재하는 상응하는 mRNA 의 양에 기초하여 측정될 수 있다. 예를 들어, 관심의 서열로부터 전사된 mRNA 는 RT-PCR 에 의해 또는 노던 혼성화 (Northern hybridization) 에 의해 정량화될 수 있다 (상기 Sambrook 등, 1999 참조). 관심의 핵산에 의해 인코딩되는 폴리펩티드는 다양한 방법에 의해, 예를 들어 ELISA 에 의해, 폴리펩티드의 생물학적 활성에 대해 검정함으로써, 또는 그러한 활성으로부터 독립적인 검정, 예컨대 폴리펩티드를 인식하고 결합하는 면역글로불린을 사용하는 웨스턴 블롯팅 (Western blotting) 또는 방사선면역검정법을 이용함으로써 정량화될 수 있다 (상기 Sambrook 등, 1999 참조).
"발현 카세트" 는, 세포 내에서 적어도 함유된 핵산의 발현을 위한, 필수적 조절 엘리먼트, 예컨대 프로모터 및 폴리아데닐화 자리를 함유하는 구축물을 언급한다.
"발현 벡터" 는 숙주 세포 내에서 포함된 구조 유전자(들)의 발현을 위한 모든 요구되는 엘리먼트를 제공하는 핵산이다. 전형적으로, 발현 플라스미드는, 복제 기점, 및 선별 마커를 포함하는, 예를 들어 대장균 (E. coli) 에 대한, 원핵생물 플라스미드 증식 유닛, 진핵생물 선별 마커, 및 프로모터, 구조 유전자, 및 폴리아데닐화 신호를 포함하는 전사 종료자를 각각 포함하는 관심의 구조 유전자(들)의 발현을 위한 하나 이상의 발현 카세트를 포함한다. 유전자 발현은 보통 프로모터의 제어 하에 놓여지고, 그러한 구조 유전자는 프로모터에 "작동가능하게 연결되어 있다" 고 말해진다. 유사하게, 조절 엘리먼트가 코어 프로모터의 활성을 조정하는 경우 조절 엘리먼트 및 코어 프로모터는 작동가능하게 연결되어 있다.
본원에서 용어 "Fc-영역" 은 불변 영역의 일부 이상을 함유하는 면역글로불린 중쇄의 C-말단 영역을 정의하는데 사용된다. 그 용어는 천연 서열 Fc-영역 및 변이체 Fc-영역을 포함한다. 하나의 구현예에서, 인간 IgG 중쇄 Fc-영역은 Cys226 에서부터, 또는 Pro230 에서부터, 중쇄의 카르복시-말단까지 이른다. 그러나, Fc-영역의 C-말단 라이신 (Lys447) 은 존재하거나 존재하지 않을 수 있다. 본원에서 다르게 명시되지 않으면, Fc-영역 또는 불변 영역 내의 아미노산 잔기의 번호지정은 Kabat, E.A. 등, Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th ed., Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD (1991), NIH Publication 91-3242 에 기재된, EU 인덱스로도 호칭되는, EU 번호지정 시스템에 따른다.
"Fc-영역" 은 잘 알려져 있는 용어이고, 항체 중쇄의 파파인 절단에 기초하여 정의된다. 본원에서 보고되는 복합체는 하나의 구현예에서 항체 중쇄 힌지 영역 폴리펩티드로서 인간 Fc-영역 또는 인간 기원의 Fc-영역을 포함할 수 있다. 추가 구현예에서 Fc-영역은 Fcγ 수용체 (예를 들어 FcγRIIIa) 결합 및/또는 C1q 결합이 탐지될 수 없게 하는 방식으로 수식되는, 서브클래스 IgG4 의 인간 항체의 Fc-영역 또는 서브클래스 IgG1, IgG2, 또는 IgG3 의 인간 항체의 Fc-영역이다. 하나의 구현예에서 Fc-영역은 인간 Fc-영역, 특히 인간 IgG4 서브클래스에서 유래하는 또는 인간 IgG1 서브클래스에서 유래하는 돌연변이된 Fc-영역이다. 하나의 구현예에서 Fc-영역은 인간 IgG1 서브클래스에서 유래하며, 돌연변이 L234A 및 L235A 를 포함한다. IgG4 는 감소된 Fcγ 수용체 (FcγRIIIa) 결합을 보이지만, 다른 IgG 서브클래스의 항체는 강한 결합을 보인다. 그러나 Pro238, Asp265, Asp270, Asn297 (Fc 탄수화물의 소실), Pro329, Leu234, Leu235, Gly236, Gly237, Ile253, Ser254, Lys288, Thr307, Gln311, Asn434, 또는/및 His435 는 변경되는 경우 또한 감소된 Fcγ 수용체 결합을 제공하는 잔기이다 (Shields, R.L. 등, J. Biol. Chem. 276 (2001) 6591-6604; Lund, J. 등, FASEB J. 9 (1995) 115-119; Morgan, A. 등, Immunology 86 (1995) 319-324; EP 0 307 434). 하나의 구현예에서 본원에서 보고되는 하나의 양상에서 발현되는 항체는 L234, L235, 및/또는 D265 에서 돌연변이를 갖고/거나 PVA236 돌연변이를 함유하는, IgG4 서브클래스의 또는 IgG1 또는 IgG2 서브클래스의 Fcγ 수용체 결합에 관한 것이다. 하나의 구현예에서 돌연변이는 S228P, L234A, L235A, L235E, 및/또는 PVA236 이다 (PVA236 은 IgG1 의 아미노산 위치 233 에서 236 까지의 아미노산 서열 ELLG (1 글자 아미노산 코드로 제공됨) 또는 IgG4 의 EFLG 가 PVA 로 대체된 것을 나타냄). 하나의 구현예에서 돌연변이는 IgG4 의 S228P, 및 IgG1 의 L234A 및 L235A 이다. 항체의 Fc-영역은 ADCC (항체-의존성 세포-매개 세포독성) 및 CDC (보체-의존성 세포독성) 에 직접 관여한다. Fcγ 수용체 및/또는 보체 인자 C1q 에 결합하지 않는 복합체는 항체-의존성 세포성 세포독성 (ADCC) 및/또는 보체 의존성 세포독성 (CDC) 을 유발하지 않는다. 놉 수식은 항체의 CH3 도메인 내의 돌연변이 T366W 를 나타낸다 (Kabat 에 따른 번호지정). 홀-수식은 항체의 CH3 도메인 내의 돌연변이 T366S, L368A 및 Y407V 를 나타낸다. 놉 및 홀 수식에 더하여 하나의 CH3 도메인 내에 돌연변이 S354C 및 다른 CH3 도메인 내에 돌연변이 Y349C 가 존재할 수 있다.
용어 "골격" 또는 "FR" 은 과가변 영역 (HVR) 잔기 이외의 가변 도메인 잔기를 언급한다. 가변 도메인의 FR 은 일반적으로 4 개의 FR 도메인: FR1, FR2, FR3, 및 FR4 로 이루어진다. 따라서, HVR 및 FR 서열은 일반적으로 VH (또는 VL) 에서 다음 서열로 나타난다: FR1-H1(L1)-FR2-H2(L2)-FR3-H3(L3)-FR4.
용어 "전장 항체", "온전한 항체", 및 "전체 항체" 는 본원에서 천연 항체 구조와 실질적으로 유사한 구조를 갖거나 또는 본원에 정의된 Fc 영역을 함유하는 중쇄를 갖는 항체를 언급할 때 호환되게 사용된다.
"유전자" 는 예를 들어 펩티드, 폴리펩티드, 또는 단백질의 발현에 영향을 미칠 수 있는 염색체 또는 플라스미드의 분절인 핵산을 나타낸다. 코딩 영역, 즉 구조 유전자 외에, 유전자는 기타 기능적 엘리먼트 예를 들어 신호 서열, 프로모터(들), 인트론, 및/또는 종료자를 포함한다.
용어 "숙주 세포", "숙주 세포주", 및 "숙주 세포 배양물" 은 호환되게 사용되고, 외인성 핵산이 내부에 도입된 세포를 언급하며, 그러한 세포의 자손을 포함한다. 숙주 세포는 "형질전환체" 및 "형질전환된 세포" 를 포함하며, 1차 형질전환된 세포 및 계대수에 관계없이 그로부터 유래된 자손을 포함한다. 자손은 부모 세포와 핵산 내용에서 완전히 일치하지 않을 수 있으며, 돌연변이를 함유할 수 있다. 원래의 형질전환된 세포에서 스크리닝 또는 선별된 바와 동일한 기능 또는 생물학적 활성을 갖는 돌연변이체 자손이 여기에 포함된다.
"인간 항체" 는 인간 또는 인간 세포에 의해 생성되거나 또는 인간 항체 레퍼토리 또는 기타 인간 항체-인코딩 서열을 이용하는 비-인간 출처에서 유래하는 항체의 아미노산 서열에 상응하는 아미노산 서열을 보유하는 것이다. 인간 항체의 이러한 정의는 구체적으로 비-인간 항원-결합 잔기를 포함하는 인간화 항체를 배제한다.
"인간화" 항체는 비-인간 HVR 로부터의 아미노산 잔기 및 인간 FR 로부터의 아미노산 잔기를 포함하는 키메라 항체를 언급한다. 특정 구현예에서, 인간화 항체는 실질적으로 모든 하나 이상, 전형적으로 2 개의, 가변 도메인을 포함할 것이며, 이때 모든 또는 실질적으로 모든 HVR (예를 들어, CDR) 은 비-인간 항체의 HVR 에 해당하고, 모든 또는 실질적으로 모든 FR 은 인간 항체의 FR 에 해당한다. 인간화 항체는 인간 항체에서 유래하는 항체 불변 영역의 일부 이상을 임의로 포함할 수 있다. 항체, 예를 들어, 비-인간 항체의 "인간화 형태" 는 인간화를 겪은 항체를 언급한다.
본원에서 사용되는 용어 "과가변 영역" 또는 "HVR" 은 서열에서 과가변이고/거나 구조적으로 한정된 루프 ("과가변 루프") 를 형성하는 항체 가변 도메인의 영역을 각각 언급한다. 일반적으로, 천연 4-사슬 항체는 6 개의 HVR 을 포함한다; VH 에 3 개 (H1, H2, H3), 및 VL 에 3 개 (L1, L2, L3). HVR 은 일반적으로 과가변 루프로부터의 및/또는 "상보성 결정 영역 영역" (CDR) 으로부터의 아미노산 잔기를 포함하며, 후자는 최고 서열 가변성을 갖고/거나 항원 인식에 관여한다. 예시적 과가변 루프는 아미노산 잔기 26-32 (L1), 50-52 (L2), 91-96 (L3), 26-32 (H1), 53-55 (H2), 및 96-101 (H3) 에서 발생한다 (Chothia, C. and Lesk, A.M., J. Mol. Biol. 196 (1987) 901-917). 예시적 CDR (CDR-L1, CDR-L2, CDR-L3, CDR-H1, CDR-H2, 및 CDR-H3) 은 L1 의 아미노산 잔기 24-34, L2 의 50-56, L3 의 89-97, H1 의 31-35B, H2 의 50-65, 및 H3 의 95-102 에서 발생한다 (Kabat, E.A. 등, Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD (1991), NIH Publication 91-3242). VH 에서의 CDR1 을 제외하고, CDR 은 과가변 루프를 형성하는 아미노산 잔기를 일반적으로 포함한다. CDR 은 항원과 접촉하는 잔기인 "특이성 결정 잔기", 또는 "SDR" 을 또한 포함한다. SDR 은 단축된-CDR, 또는 a-CDR 로 호칭되는 CDR 의 영역 내에 함유되어 있다. 예시적 a-CDR (a-CDR-L1, a-CDR-L2, a-CDR-L3, a-CDR-H1, a-CDR-H2, 및 a-CDR-H3) 은 L1 의 아미노산 잔기 31-34, L2 의 50-55, L3 의 89-96, H1 의 31-35B, H2 의 50-58, 및 H3 의 95-102 에서 발생한다 (Almagro, J.C. and Fransson, J., Front. Biosci. 13 (2008) 1619-1633). 다르게 언급되지 않으면, HVR 잔기 및 가변 도메인 내의 기타 잔기 (예를 들어, FR 잔기) 는 본원에서 상기 Kabat 등에 따라 번호지정된다.
"내부 리보솜 진입 자리" 또는 "IRES" 는 IRES 의 5' 에 있는 유전자로부터 독립적인 번역 개시를 기능적으로 촉진하고 동물 세포 내에서 단일 전사물로부터 2 개의 시스트론 (오픈 리딩 프레임) 이 번역되는 것을 허용하는 서열을 기술한다. IRES 는 그것의 바로 하류 (하류는 본원에서 3' 와 호환되게 사용됨) 에 있는 오픈 리딩 프레임의 번역을 위한 독립적 리보솜 진입 자리를 제공한다. 다시스트론성, 즉 mRNA 로부터 순차적으로 번역되는 여러 개의 상이한 폴리펩티드를 인코딩할 수 있는 박테리아 mRNA 와는 달리, 동물 세포의 대부분의 mRNA 는 단일시스트론성이고 오직 하나의 단백질의 합성에 대해 코딩한다. 진핵 세포 내의 다시스트론성 전사물의 경우, 번역은 5' 끝 번역 개시 자리로부터 개시하여 제 1 종료 코돈에서 종료할 것이고, 전사물은 리보솜으로부터 방출되어, mRNA 내의 첫번째 인코딩된 폴리펩티드만의 번역을 초래할 것이다. 진핵 세포에서, 전사물 내의 두번째 또는 후속 오픈 리딩 프레임에 작동가능하게 연결된 IRES 를 갖는 다시스트론성 전사물은 하류 오픈 리딩 프레임의 순차적 번역을 허용하여 동일한 전사물에 의해 인코딩되는 둘 이상의 폴리펩티드를 생성한다. 벡터 구축에서 IRES 엘리먼트의 사용은 이전에 기재된 바 있으며, 예를 들어, Pelletier, J. 등, Nature 334 (1988) 320-325; Jang, S.K. 등, J. Virol. 63 (1989) 1651-1660; Davies, M.V. 등, J. Virol. 66 (1992) 1924-1932; Adam, M.A. 등, J. Virol. 65 (1991) 4985-4990; Morgan, R.A. 등 Nucl. Acids Res. 20 (1992) 1293-1299; Sugimoto, Y. 등, Biotechnology 12 (1994) 694-698; Ramesh, N. 등, Nucl. Acids Res. 24 (1996) 2697-2700; 및 Mosser, D.D. 등, BioTechniques 22 (1997) 150-152) 을 참조한다.
본원에 사용되는 용어 "모노클로날 항체" 는 실질적으로 동종인 항체의 집단으로부터 수득된 항체를 언급하며, 즉, 집단을 구성하는 개별 항체들은 동일하고/거나 동일한 에피토프에 결합하며, 예를 들어, 자연 발생적 돌연변이를 함유하거나 또는 모노클로날 항체 제제의 생성 동안 발생하는 일반적으로 소량으로 존재하는 가능한 변이체 항체는 제외한다. 전형적으로 상이한 결정인자 (에피토프) 를 향하는 상이한 항체를 포함하는 폴리클로날 항체 제제와 대조적으로, 모노클로날 항체 제제의 각각의 모노클로날 항체는 항원 상의 단일 결정인자를 향한다. 따라서, "모노클로날" 이란 수식어는 실질적으로 동종인 항체의 집단으로부터 수득되는 항체의 특질을 나타내고, 임의의 특정 방법에 의한 항체의 생성을 요구하는 것으로 해석되지 않는다. 예를 들어, 본 발명에 따라 사용되는 모노클로날 항체는, 하이브리도마 방법, 재조합 DNA 방법, 파지-표시 방법, 및 인간 면역글로불린 유전자좌의 전부 또는 일부를 함유하는 트랜스제닉 (transgenic) 동물을 이용하는 방법을 포함하나 이에 제한되지 않는 다양한 기술에 의해 제조될 수 있으며, 모노클로날 항체를 제조하기 위한 상기 방법 및 기타 예시적 방법들은 본원에 기재되어 있다.
본원에서 사용되는 "핵산" 은 개별 뉴클레오티드 (또한 염기로 호칭됨) a, c, g, 및 t (또는 RNA 에서 u) 로 이루어지는 중합체성 분자, 예를 들어 DNA, RNA, 또는 그의 변형물을 언급한다. 이러한 폴리뉴클레오티드 분자는 자연 발생적 폴리뉴클레오티드 분자 또는 합성 폴리뉴클레오티드 분자 또는 하나 이상의 자연 발생적 폴리뉴클레오티드 분자와 하나 이상의 합성 폴리뉴클레오티드 분자의 조합일 수 있다. 또한 이러한 정의에 포함되는 것은 하나 이상의 뉴클레오티드가 변화된 (예를 들어 돌연변이유발에 의해), 결실된, 또는 부가된 자연 발생적 폴리뉴클레오티드 분자이다. 핵산은 단리되거나, 또다른 핵산 내에, 예를 들어 발현 카세트, 플라스미드, 또는 숙주 세포의 염색체 내에 편입될 수 있다. 핵산은 마찬가지로 개별 뉴클레오티드로 이루어지는 그것의 핵산 서열에 의해 특징지어진다.
예를 들어 폴리펩티드의, 아미노산 서열을 이러한 아미노산 서열을 인코딩하는 상응하는 핵산 서열로 전환하는 절차 및 방법은 당업자에게 잘 알려져 있다. 그러므로, 핵산은 개별 뉴클레오티드로 이루어지는 그것의 핵산 서열에 의해 그리고 마찬가지로 그에 의해 인코딩되는 폴리펩티드의 아미노산 서열에 의해 특징지어진다.
본원에서 사용되는 "핵산" 은 또한 재조합 생산될 수 있는 폴리펩티드를 인코딩하는 자연 발생적 또는 일부 또는 완전 비-자연 발생적 핵산을 언급한다. 핵산은 화학적 방법에 의해 단리 또는 합성되는 DNA-조각으로 구성될 수 있다. 핵산은 또다른 핵산 내에, 예를 들어 발현 플라스미드 또는 진핵생물 숙주 세포의 게놈/염색체 내에 편입될 수 있다. 플라스미드는 셔틀 및 발현 플라스미드를 포함한다. 전형적으로, 플라스미드는 각각 원핵생물 내에서 플라스미드의 복제 및 선별을 위한, 복제 기점 (예를 들어 ColE1 복제 기점) 및 선별 마커 (예를 들어 암피실린 또는 테트라사이클린 저항성 유전자) 를 포함하는 원핵생물 증식 유닛을 또한 포함할 것이다.
"작동가능하게 연결된" 은 둘 이상의 구성요소의 병렬배치를 언급하며, 여기서 그렇게 기술된 성분들은 그들이 의도된 방식으로 기능할 수 있게 하는 관계에 있다. 예를 들어, 프로모터 및/또는 인핸서가 시스 위치에서 연결된 서열의 전사를 제어 또는 조정하는 작용을 하는 경우 프로모터 및/또는 인핸서는 코딩 서열에 작동가능하게 연결되어 있다. 일반적으로, 그러나 비필수적으로, "작동가능하게 연결된" DNA 서열은 인접해 있고, 2 개의 단백질 인코딩 영역 예컨대 분비형 리더 및 폴리펩티드를 연결할 필요가 있는 경우, 인접해 있고 (리딩) 프레임 내에 있다. 그러나, 작동가능하게 연결된 프로모터는 일반적으로 코딩 서열의 상류에 위치하지만, 그것과 반드시 인접해 있을 필요는 없다. 인핸서는 인접해 있을 필요가 없다. 인핸서가 코딩 서열을 전사를 증가시키는 경우 인핸서는 코딩 서열에 작동가능하게 연결되어 있다. 작동가능하게 연결된 인핸서는 코딩 서열의 상류에, 내부에 또는 하류에 그리고 프로모터로부터 상당히 먼 곳에 위치할 수 있다. 폴리아데닐화 자리가 코딩 서열의 하류 말단에 위치하여 코딩 서열을 통해 폴리아데닐화 서열까지 진행하는 경우 폴리아데닐화 자리는 코딩 서열에 작동가능하게 연결되어 있다. 번역 종료 코돈이 코딩 서열의 하류 말단 (3' 말단) 에 위치하여 번역이 코딩 서열을 통해 종료 코돈까지 진행하고 거기에서 종료하는 경우 번역 종료 코돈은 엑손 핵산 서열에 작동가능하게 연결되어 있다. 연결은 당업계에 공지된 재조합 방법에 의해, 예를 들어, PCR 기법을 사용하여 및/또는 편리한 제한 자리에서의 결찰에 의해 달성된다. 편리한 제한 자리가 존재하지 않는 경우, 통상의 관습에 따라 합성 올리고뉴클레오티드 어댑터 또는 링커가 사용된다.
"다시스트론성 전사 유닛" 은 1 개 초과의 구조 유전자가 동일한 프로모터의 제어 하에 놓인 전사 유닛이다.
본원에서 사용되는 용어 "폴리아데닐화 신호" (polyA 신호) 는 특정 핵산 서열 분절의 일차 전사물의 절단 및 폴리아데닐화를 유도하는데 사용되는 핵산 서열을 나타낸다. 폴리아데닐화 신호를 포함하는 3' 비번역 영역은 SV40 에서 유래하는 폴리아데닐화 신호를 포함하는 3' 비번역 영역, 소 성장 호르몬 (bGH) 에 대한 유전자, 면역글로불린 유전자, 및 티미딘 키나제 유전자 (tk, 예를 들어 단순 포진 티미딘 키나제 폴리아데닐화 신호) 로 이루어지는 군으로부터 선별될 수 있다.
"프로모터" 는 그것이 작동가능하게 연결되어 있는 유전자/구조 유전자 또는 핵산 서열의 전사를 제어하는 폴리뉴클레오티드 서열을 언급한다. 프로모터는 RNA 폴리머라제 결합 및 전사 개시를 위한 신호를 포함한다. 사용되는 프로모터는 선택된 서열의 발현이 고려되는 숙주 세포의 세포 유형에서 기능을 발휘할 것이다. 여러가지 상이한 출처로부터의 구성성 (constitutive), 유도성 (inducible) 및 억제성 (repressible) 프로모터를 포함하는 다수의 프로모터가 당업계에 잘 공지되어 있고 (진뱅크 (BenBank) 와 같은 데이터베이스에서 확인할 수 있고), 클로닝된 폴리뉴클레오티드로서, 또는 클로닝된 폴리뉴클레오티드 내에 존재하는 엘리먼트로서 입수가능하다 (예를 들어, ATCC 와 같은 기탁기관 뿐만 아니라 다른 상업적 또는 개별 공급처로부터).
"프로모터"는 구조 유전자의 전사를 유도하는 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 전형적으로, 프로모터는 구조 유전자의 전사 시작 자리에 인접한, 유전자의 5' 비-코딩 또는 비번역 영역에 위치한다. 전사의 개시에서 기능을 발휘하는 프로모터 내의 서열 엘리먼트는 종종 공통 뉴클레오티드 서열을 특징으로 한다. 이들 프로모터 엘리먼트는 RNA 폴리머라제 결합 자리, TATA 서열, CAAT 서열, 분화-특이적 엘리먼트 (DSE; McGehee, R.E. 등, Mol. Endocrinol. 7 (1993) 551), 시클릭 AMP 응답 엘리먼트 (CRE), 혈청 응답 엘리먼트 (SRE; Treisman, R., Seminars in Cancer Biol. 1 (1990) 47), 글루코코티코이드 응답 엘리먼트 (GRE), 및 기타 전사 인자, 예컨대 CRE/ATF (O'Reilly, M.A. 등, J. Biol. Chem. 267 (1992) 19938), AP2 (Ye, J. 등, J. Biol. Chem. 269 (1994) 25728), SP1, cAMP 응답 엘리먼트 결합 단백질 (CREB; Loeken, M.R., Gene Expr. 3 (1993) 253) 및 옥타머 인자 (일반적으로, Watson et al., (eds.), Molecular Biology of the Gene, 4th ed. (The Benjamin/Cummings Publishing Company, Inc. (1987)), 및 Lemaigre, F.P. and Rousseau, G.G., Biochem. J. 303 (1994) 1-14 참조) 에 대한 결합 자리를 포함한다. 프로모터가 유도성 프로모터인 경우, 전사 속도는 유도제에 응답하여 증가한다. 대조적으로, 프로모터가 구성성 프로모터인 경우 전사 속도는 유도제에 의해 조절되지 않는다. 억제성 프로모터도 공지되어 있다. 예를 들어, c-fos 프로모터는 성장 호르몬이 세포 표면 위의 그것의 수용체에 결합되었을 때 특이적으로 활성화된다. 테트라사이클린 (tet) 에 의해 조절되는 발현은 예를 들어, CMV 프로모터에 이어서 2 개의 Tet-오퍼레이터 (operator) 자리로 이루어지는 인공 하이브리드 프로모터에 의해 달성될 수 있다. Tet-리프레서는 2 개의 Tet-오퍼레이터 자리에 결합하여 전사를 차단한다. 유도제인 테트라사이클린을 첨가하였을 때, Tet-리프레서가 Tet-오퍼레이터 자리로부터 방출되고 전사가 진행된다 (Gossen, M. and Bujard, H., PNAS 89 (1992) 5547-5551). 메탈로티오네인 및 열 충격 프로모터를 포함하는 다른 유도성 프로모터에 대해서는 예를 들어, 상기 Sambrook 등의 문헌 및 Gossen 등, Curr. Opin. Biotech. 5 (1994) 516-520 을 참조한다. 진핵생물 프로모터 중에서 고도 발현을 위한 강력한 프로모터로서 확인된 진핵생물 프로모터는 SV40 조기 프로모터, 아데노바이러스 주요 후기 프로모터, 마우스 메탈로티오네인-I 프로모터, 라우스 육종 바이러스 장말단 반복부, 차이니스 햄스터 연장 인자 1 알파 (CHEF-1, 예를 들어, US 5,888,809 참조), 인간 EF-1 알파, 유비퀴틴 및 인간 사이토메갈로바이러스 즉시 조기 프로모터 (CMV IE) 이다.
"프로모터" 는 구성성 또는 유도성일 수 있다. 프로모터만을 사용하였을 때 얻어지는 발현 수준을 증가시키기 위해 프로모터와 함께 인핸서 (enhancer) (즉, 프로모터에 작용하여 전사를 증가시키는 시스-작용 DNA 엘리먼트) 가 작용할 필요가 있을 수 있고, 상기 인핸서는 전사 조절 엘리먼트로서 포함될 수 있다. 종종, 프로모터를 포함하는 폴리뉴클레오티드 분절은 인핸서 서열도 포함할 것이다 (예를 들어, CMV 또는 SV40).
본 출원에서 사용되는 용어 "안정적으로 형질전환된", "안정적으로 트랜스펙션된", 또는 "안정적" 은 외인성 핵산이 숙주 세포 게놈/염색체 내로 유전가능하게 안정적으로 편입됨을 나타낸다. 안정적으로 트랜스펙션된 세포는 선별적 성장 조건 하의, 즉 하나 이상의 선별 마커의 존재 하의 세포 선별 과정 후에 수득된다.
"구조 유전자" 는 신호 서열이 없는 유전자의 영역, 즉 코딩 영역을 나타낸다.
용어 "전사 종료자" 는 RNA 폴리머라제에게 mRNA 합성 종료 신호를 제공하는 50-750 염기쌍 길이의 DNA 서열을 나타낸다. 특히 강력한 프로모터를 사용하는 경우 RNA 폴리머라제가 통과해서 해독하는 것을 방지하기 위해 발현 카세트의 3' 말단에 매우 효율적인 (강력한) 종료자가 권장된다. 비효율적인 전사 종료자는 오페론-유사 mRNA 의 형성을 초래할 수 있으며, 이는 원치 않는, 예를 들어 플라스미드-코딩된, 유전자 발현의 원인이 될 수 있다.
본 발명의 범위 내에서, 트랜스펙션된 세포는 당업계에 공지된 실질적으로 임의의 종류의 트랜스펙션 방법으로 수득될 수 있다. 예를 들어, 핵산은 전기천공법 또는 미세주입법을 이용하여 세포 내로 도입될 수 있다. 대안적으로, 리포펙션 시약 예컨대 FuGENE 6 (Roche Diagnostics GmbH, Germany), X-tremeGENE (Roche Diagnostics GmbH, Germany), 및 LipofectAmine (Invitrogen Corp., USA) 이 사용될 수 있다. 더욱 대안적으로, 핵산은 레트로바이러스, 렌티바이러스, 아데노바이러스, 또는 아데노-연관 바이러스에 기초하는 적당한 바이러스 벡터 시스템에 의해 세포 내로 도입될 수 있다 (Singer, O., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 101 (2004) 5313-5314).
본 출원에서 사용되는 용어 "일시적 트랜스펙션" 은 세포 내에 도입된 핵산이 세포의 게놈 또는 염색체 DNA 내로 편입되지 않는 과정을 나타낸다. 그것은 실제로 세포 내에서 염색체외 엘리먼트로서, 예를 들어 에피솜으로서 유지된다. 에피솜의 핵산의 전사 과정은 영향을 받지 않고, 예를 들어 에피솜의 핵산에 의해 인코딩되는 단백질이 생산된다. 일시적 트랜스펙션은 "일시적 트랜스펙션된" 세포를 초래한다.
용어 "가변 영역" 또는 "가변 도메인" 은 항체를 항원에 결합시키는데 관여하는 항체 중쇄 또는 경쇄의 도메인을 언급한다. 천연 항체의 중쇄 및 경쇄 가변 도메인 (각각 VH 및 VL) 은 일반적으로 유사한 구조를 가지며, 각각의 도메인은 4 개의 보존된 골격 영역 (FR) 및 3 개의 과가변 영역 (HVR) 을 포함한다 (예를 들어, Kindt, T.J. 등, Kuby Immunology, 6th ed., W.H. Freeman and Co., N.Y.(2007), 페이지 91 참조). 단일 VH 또는 VL 도메인은 항원-결합 특이성을 제공하기에 충분할 수 있다. 게다가, 각각 상보성 VL 또는 VH 도메인 라이브러리를 스크리닝하기 위해 항원에 결합하는 항체로부터의 VH 또는 VL 도메인을 사용하여 특정 항원에 결합하는 항체가 단리될 수 있다 (예를 들어, Portolano, S. 등, J. Immunol. 150 (1993) 880-887; Clackson, T. 등, Nature 352 (1991) 624-628 참조).
본원에서 사용되는 용어 "벡터" 는 그것이 연결되는 또다른 핵산을 증식시킬 수 있는 핵산 분자를 언급한다. 상기 용어는 자가-복제 핵산 구조로서의 벡터 뿐만 아니라, 그것이 도입된 숙주 세포의 게놈 내로 편입된 벡터를 포함한다. 특정 벡터는 그것이 작동가능하게 연결되어 있는 핵산의 발현을 유도할 수 있다. 그러한 벡터는 본원에서 "발현 벡터" 로 언급된다.
항체
재조합 모노클로날 항체의 생산을 위한 방법 및 조성물이 본원에서 제공된다. 항체는 단일특이적 항체, 다중특이적 항체 (예를 들어, 이중특이적 항체), 항체 조작, 1 가 항체, 다가 항체 (예를 들어 2 가 항체) 와 같은 다양한 구조를 가질 수 있으나 이에 제한되지는 않는다.
특정 구현예에서, 항체는 항체 조각이다. 항체 조각은 Fab, Fab', Fab'-SH, F(ab')2, Fv, 및 scFv 조각, 및 기타 하기 조각들을 포함하나 이에 제한되지 않는다. 특정 항체 조각의 리뷰에 대해, Hudson, P.J. 등, Nat. Med. 9 (2003) 129-134 를 참조한다. scFv 조각의 리뷰에 대해, 예를 들어 Plueckthun, A., In: The Pharmacology of Monoclonal Antibodies, Vol. 113, Rosenburg and Moore (eds.), Springer-Verlag, New York (1994), pp. 269-315 를 참조한다; 또한 WO 1993/16185; 및 US 5,571,894 및 US 5,587,458 을 참조한다. 구제 (salvage) 수용체 결합 에피토프 잔기를 포함하고 증가된 생체내 반감기를 갖는 Fab 및 F(ab')2 조각의 논의에 대해 US 5,869,046 을 참조한다.
다이아바디는 2 가 또는 이중특이성일 수 있는 2 개의 항원-결합 자리를 갖는 항체 조각이다 (예를 들어, EP 0 404 097; WO 1993/01161; Hudson, P.J. 등, Nat. Med. 9 (2003) 129-134; 및 Holliger, P. 등, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90 (1993) 6444-6448 참조). 트리아바디 (triabody) 및 테트라바디 (tetrabody) 가 또한 Hudson, P.J. 등, Nat. Med. 9 (2003) 129-134) 에서 기재된다.
단일-도메인 항체는 항체의 중쇄 가변 도메인 전부 또는 일부 또는 경쇄 가변 도메인 전부 또는 일부를 포함하는 항체 조각이다. 특정 구현예에서, 단일-도메인 항체는 인간 단일-도메인 항체이다 (Domantis, Inc., Waltham, MA; 예를 들어, US 6,248,516 참조).
항체 조각은 본원에서 기술된 온전한 항체의 단백질가수분해 소화 뿐만 아니라 재조합 숙주 세포 (예를 들어 대장균 또는 파지) 에 의한 생산을 포함하나 이에 제한되지 않는 다양한 기술에 의해 제조될 수 있다.
특정 구현예에서, 항체는 키메라 항체이다. 특정 키메라 항체가, 예를 들어, US 4,816,567; 및 Morrison, S.L. 등, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81 (1984) 6851-6855 에 기재되어 있다. 하나의 예에서, 키메라 항체는 비-인간 가변 영역 (예를 들어, 마우스, 랫트, 햄스터, 토끼, 또는 비-인간 영장류, 예컨대 원숭이에서 유래하는 가변 영역) 및 인간 불변 영역을 포함한다. 추가의 예에서, 키메라 항체는 클래스 또는 서브클래스가 부모 항체의 클래스 또는 서브클래스로부터 변화된 "클래스 전환된" 항체이다. 키메라 항체는 그의 항원-결합 조각을 포함한다.
특정 구현예에서, 키메라 항체는 인간화 항체이다. 전형적으로, 비-인간 항체는 인간화되어 인간에 대한 면역원성은 감소되지만, 여전히 부모 비-인간 항체의 특이성 및 친화도를 보유한다. 일반적으로, 인간화 항체는 내부의 HVR, 예를 들어, CDR (또는 그의 일부) 은 비-인간 항체에서 유래하고, FR (또는 그의 일부) 은 인간 항체 서열에서 유래하는 하나 이상의 가변 도메인을 포함한다. 인간화 항체는 임의로 인간 불변 영역의 일부 이상을 또한 포함할 것이다. 일부 구현예에서, 예를 들어, 항체 특이성 또는 친화성을 회복 또는 개선하도록, 인간화 항체 내의 일부 FR 잔기가 비-인간 항체 (예를 들어, HVR 잔기가 유래된 항체) 로부터의 상응하는 잔기로 치환된다.
인간화 항체 및 그의 제조 방법이, 예를 들어, Almagro, J.C. and Fransson, J., Front. Biosci. 13 (2008) 1619-1633 에서 리뷰되어 있고, 또한 예를 들어, Riechmann, I. 등, Nature 332 (1988) 323-329; Queen, C. 등, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86 (1989) 10029-10033; US 5,821,337, US 7,527,791, US 6,982,321, 및 US 7,087,409; Kashmiri, S.V. 등, Methods 36 (2005) 25-34 (SDR (a-CDR) 그래프팅을 기재함); Padlan, E.A., Mol. Immunol. 28 (1991) 489-498 ("재포장 (resurfacing)" 을 기재함); Dall'Acqua, W.F. 등, Methods 36 (2005) 43-60 ("FR 셔플링" 을 기재함); 및 Osbourn, J. 등, Methods 36 (2005) 61-68 및 Klimka, A. 등, Br. J. Cancer 83 (2000) 252-260 (FR 셔플링에 대한 "인도되는 선별 (guided selection)" 접근을 기재함) 에 기재되어 있다.
인간화에 사용될 수 있는 인간 골격 영역은 하기를 포함하나 이에 제한되는 것은 아니다: "최적-적합 (best-fit)" 방법을 사용하여 선별된 골격 영역 (예를 들어, Sims, M.J. 등, J. Immunol. 151 (1993) 2296-2308 참조); 경쇄 또는 중쇄 가변 영역의 특정 서브그룹의 인간 항체의 공통 서열에서 유래하는 골격 영역 (예를 들어, Carter, P. 등, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89 (1992) 4285-4289; 및 Presta, L.G. 등, J. Immunol. 151 (1993) 2623-2632 참조); 인간 성숙 (체세포 돌연변이된) 골격 영역 또는 인간 생식선 골격 영역 (예를 들어, Almagro, J.C. and Fransson, J., Front. Biosci. 13 (2008) 1619-1633 참조); 및 스크리닝 FR 라이브러리에서 유래하는 골격 영역 (예를 들어, Baca, M. 등, J. Biol. Chem. 272 (1997) 10678-10684 및 Rosok, M.J. 등, J. Biol. Chem. 271 (1996) 22611-22618 참조).
특정 구현예에서 항체는 인간 항체이다. 인간 항체는 당해 분야에 공지된 다양한 기술을 사용하여 생산될 수 있다. 인간 항체는 van Dijk, M.A. and van de Winkel, J.G., Curr. Opin. Pharmacol. 5 (2001) 368-374 및 Lonberg, N., Curr. Opin. Immunol. 20 (2008) 450-459 에 일반적으로 기술되어 있다.
인간 항체는 항원 공격에 응답하여 온전한 인간 항체 또는 인간 가변 영역을 갖는 온전한 항체를 생산하도록 변형된 트랜스제닉 동물에게 면역원을 투여함으로써 제조될 수 있다. 그러한 동물은 전형적으로 인간 면역글로불린 유전자좌의 전부 또는 일부를 함유하며, 이러한 인간 면역글로불린 유전자좌는 내인성 면역글로불린 유전자좌를 대신하거나, 염색체외에 존재하거나, 동물의 염색체 내로 무작위로 편입되어 있다. 그러한 트랜스제닉 마우스에서, 내인성 면역글로불린 유전자좌는 일반적으로 불활성화되었다. 트랜스제닉 동물로부터 인간 항체를 수득하기 위한 방법의 리뷰에 대해, Lonberg, N., Nat. Biotech. 23 (2005) 1117-1125 및 또한, 예를 들어, US 6,075,181 및 US 6,150,584 (XENOMOUSE™ 기술을 기재함); US 5,770,429 (HuMab® 기술을 기재함); US 7,041,870 (K-M MOUSE® 기술을 기재함), 및 US 2007/0061900 (VelociMouse® 기술을 기재함) 을 참조한다. 그러한 동물에 의해 생성된 온전한 항체로부터의 인간 가변 영역은, 예를 들어, 상이한 인간 불변 영역과 조합함으로써 추가로 수식될 수 있다.
인간 항체는 또한 하이브리도마-기반 방법에 의해 제조될 수 있다. 인간 모노클로날 항체의 생산을 위한 인간 미엘로마 및 마우스-인간 헤테로미엘로마 세포주가 기재된 바 있다 (예를 들어, Kozbor, D., J. Immunol. 133 (1984) 3001-3005; Brodeur, B.R. 등, Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications, Marcel Dekker, Inc., New York (1987), pp. 51-63; 및 Boerner, P. 등, J. Immunol. 147 (1991) 86-95 참조). 인간 B-세포 하이브리도마 기술에 의해 생성된 인간 항체도 또한 Li, J. 등, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 103 (2006) 3557-3562 에 기술되어 있다. 부가적 방법은, 예를 들어, US 7,189,826 (하이브리도마 세포주로부터의 모노클로날 인간 IgM 항체의 제조를 기재함) 및 Ni, J., Xiandai Mianyixue 26 (2006) 265-268 (인간-인간 하이브리도마를 기재함) 에 기재된 것들을 포함한다. 인간 하이브리도마 기술 (Trioma technology) 은 또한 Vollmers, H.P. and Brandlein, S., Histology and Histopathology 20 (2005) 927-937 및 Vollmers, H.P. and Brandlein, S., Methods and Findings in Experimental and Clinical Pharmacology 27 (2005) 185-191 에 기재되어 있다.
인간 항체는 또한 인간-유래 파지 표시 라이브러리로부터 선별된 Fv 클론 가변 도메인 서열을 단리함으로써 생성될 수 있다. 그러한 가변 도메인 서열은 그 후 원하는 인간 불변 도메인과 조합될 수 있다. 항체 라이브러리로부터 인간 항체를 선별하기 위한 기술이 아래 기재되어 있다.
항체는 원하는 활성 또는 활성들을 갖는 항체에 대한 조합 라이브러리를 스크리닝하여 단리될 수 있다. 예를 들어, 파지 표시 라이브러리를 생성하고 상기 라이브러리를 원하는 결합 특성을 보유하는 항체에 대해 스크리닝하기 위한 다양한 방법이 당해 분야에 공지되어 있다. 상기 방법은, 예를 들어, Hoogenboom, H.R. 등, Methods Mol. Biol. 178 (2002) 1-37 에서 리뷰되어 있고, 또한 예를 들어, McCafferty, J. 등, Nature 348 (1990) 552-554; Clackson, T. 등, Nature 352 (1991) 624-628; Marks, J.D. 등, J. Mol. Biol. 222 (1992) 581-597; Marks, J.D. and Bradbury, A., Methods in Molecular Biology 248 (2003) 161-175; Sidhu, S.S. 등, J. Mol. Biol. 338 (2004) 299-310; Lee, C.V. 등, J. Mol. Biol. 340 (2004) 1073-1093; Fellouse, F.A., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 101 (2004) 12467-12472; 및 Lee, C.V. 등, J. Immunol. Methods 284 (2004) 119-132 에 기재되어 있다.
특정 파지 표시 방법에서, VH 및 VL 유전자의 레퍼토리가 폴리머라제 연쇄 반응 (PCR) 에 의해 별도로 클로닝되고, 파지 라이브러리에서 무작위로 재조합되고, 이것이 그 후 Winter, G. 등, Ann. Rev. Immunol. 12 (1994) 433-455 에 기재된 바와 같이 항원-결합 파지에 대해 스크리닝될 수 있다. 파지는 전형적으로 항체 조각을 단일-사슬 Fv (scFv) 조각으로서 또는 Fab 조각으로서 표시한다. 면역화된 공급원으로부터 얻은 라이브러리는 하이브리도마를 구축할 필요 없이 면역원에 대한 높은-친화도 항체를 제공한다. 대안적으로, Griffiths, A.D. 등, EMBO J. 12 (1993) 725-734 에 기재된 바와 같이 나이브 (naive) 레퍼토리를 클로닝하여 (예를 들어, 인간으로부터) 임의의 면역화 없이 광범위한 비-자가 및 또한 자가 항원에 대한 항체의 단일 공급원을 제공할 수 있다. 마지막으로, Hoogenboom, H.R. and Winter, G., J. Mol. Biol. 227 (1992) 381-388 에 기재된 바와 같이 나이브 라이브러리는 또한 줄기 세포로부터 재배열되지 않은 V-유전자 분절을 클로닝하고, 고도 가변 CDR3 영역을 인코딩하고 시험관내 재배열을 달성하기 위해 랜덤 서열을 함유하는 PCR 프라이머를 사용함으로써, 합성적으로 제조될 수 있다. 인간 항체 파지 라이브러리를 기재하는 특허 공개공보는, 예를 들어, US 5,750,373, 및 US 2005/0079574, US 2005/0119455, US 2005/0266000, US 2007/0117126, US 2007/0160598, US 2007/0237764, US 2007/0292936, 및 US 2009/0002360 을 포함한다.
인간 항체 라이브러리로부터 단리된 항체 또는 항체 조각은 본원에서 인간 항체 또는 인간 항체 조각으로 간주된다.
특정 구현예에서, 본원에서 제공되는 항체는 다중특이적 항체, 예를 들어 이중특이적 항체이다. 다중특이적 항체는 2 개 이상의 상이한 자리에 대해 결합 특이성을 갖는 모노클로날 항체이다. 특정 구현예에서, 결합 특이성 중 하나는 제 1 항원에 대한 것이고, 다른 하나는 상이한 제 2 항원에 대한 것이다. 특정 구현예에서, 이중특이적 항체는 동일한 항원의 2 개의 상이한 에피토프에 결합할 수 있다. 이중특이적 항체는 또한 항원을 발현하는 세포로 세포독성제를 국소화시키는데 사용될 수 있다. 이중특이적 항체는 전장 항체 또는 항체 조각으로서 제조될 수 있다.
다중특이적 항체를 제조하기 위한 기술은 상이한 특이성을 갖는 2 개의 면역글로불린 중쇄-경쇄 쌍의 재조합 동시-발현 (Milstein, C. and Cuello, A.C., Nature 305 (1983) 537-540, WO 93/08829, 및 Traunecker, A. 등, EMBO J. 10 (1991) 3655-3659 참조), 및 "놉-인-홀 (knob-in-hole)" 조작 (예를 들어, US 5,731,168 참조) 을 포함하나, 이에 제한되는 것은 아니다. 다중특이적 항체는 또한, 항체 Fc-이종이합체 분자를 제조하기 위한 정전 스티어링 (steering) 효과를 조작하고 (WO 2009/089004); 2 개 이상의 항체 또는 조각을 가교결합시키고 (예를 들어, US 4,676,980, 및 Brennan, M. 등, Science 229 (1985) 81-83 참조); 류신 지퍼를 사용하여 이중특이적 항체를 생성하고 (예를 들어, Kostelny, S.A. 등, J. Immunol. 148 (1992) 1547-1553 참조); 이중특이적 항체 조각을 제조하기 위한 "다이아바디" 기술을 사용하고 (예를 들어, Holliger, P. 등, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90 (1993) 6444-6448 참조); 단일-사슬 Fv (sFv) 이합체를 사용하고 (예를 들어 Gruber, M. 등, J. Immunol. 152 (1994) 5368-5374 참조); 예를 들어, Tutt, A. 등, J. Immunol. 147 (1991) 60-69 에 기재된 바와 같이 삼중특이적 항체를 제조함으로써 제조될 수 있다.
"옥토퍼스 (Octopus) 항체" 를 포함하여, 3 개 이상의 기능성 항원 결합 자리를 갖는 조작된 항체도 또한 본원에 포함된다 (예를 들어 US 2006/0025576 참조).
항체는 제 1 항원 뿐만 아니라 또다른, 상이한 항원에 결합하는 항원 결합 자리를 포함하는 "이중 작용 Fab (Dual Acting Fab)" 또는 "DAF" 일 수 있다 (예를 들어, US 2008/0069820 참조).
항체 또는 조각은 또한 WO 2009/080251, WO 2009/080252, WO 2009/080253, WO 2009/080254, WO 2010/112193, WO 2010/115589, WO 2010/136172, WO 2010/145792, 또는 WO 2010/145793 에 기재된 바와 같은 다중특이적 항체일 수 있다.
방법
특정 구현예에서, 본원에 제공된 방법은 항체가 글리코실화되는 정도를 변경, 즉 증가 또는 감소시키는데 사용된다.
항체가 Fc-영역을 포함하는 경우, 그에 부착된 탄수화물이 변경될 수 있다. 포유류 세포에 의해 생산된 천연 항체는 전형적으로, 일반적으로 Fc-영역의 CH2 도메인의 Asn297 에 N-연결에 의해 부착되어 있는 분지형 바이안테너리 (biantennary) 올리고당을 포함한다 (예를 들어, Wright, A. and Morrison, S.L., TIBTECH 15 (1997) 26-32 참조). 올리고당은 다양한 탄수화물, 예를 들어, 만노스, N-아세틸 글루코사민 (GlcNAc), 갈락토스, 및 시알산, 뿐만 아니라, 바이안테너리 올리고당 구조의 "줄기" 내의 GlcNAc 에 부착된 푸코스를 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 발명의 항체 중 올리고당의 수식은 특정 개선된 특성을 갖는 항체 변이체를 창조하기 위해 수행될 수 있다
하나의 구현예에서, 본원에 제공된 방법은 Fc-영역에 (직접적으로 또는 간접적으로) 부착된 푸코스를 결여하는 탄수화물 구조를 갖는 항체의 생산을 초래한다. 예를 들어, 그러한 항체 중 푸코스의 양은 1 % ~ 80 %, 1 % ~ 65 %, 5 % ~ 65 % 또는 20 % ~ 40 % 일 수 있다. 푸코스의 양은, 예를 들어 WO 2008/077546 에 기재된 바와 같이, MALDI-TOF 질량 분광분석법에 의해 측정되는 Asn 297 에 부착된 모든 당구조 (예를 들어 복합, 하이브리드 및 하이 만노스 구조) 의 합계에 대한 Asn297 에서의 당 사슬 내의 푸코스의 평균 양을 계산함으로써 결정된다. Asn297 은 Fc-영역 내의 위치 297 (Fc-영역 잔기의 Kabat 에 따른 EU 번호지정) 주위에 위치하는 아스파라긴 잔기를 나타낸다; 그러나, Asn297 은 또한 항체 내의 작은 서열 변이로 인해 위치 297 의 상류 또는 하류의 약 ±3 아미노산, 즉, 위치 294 와 300 사이에 위치할 수도 있다. 그러한 푸코실화 변이체는 개선된 ADCC 기능을 가질 수 있다 (예를 들어, US 2003/0157108; US 2004/0093621 참조). "탈푸코실화" 또는 "푸코스-결핍" 항체 변이체에 관한 문헌의 예는 하기를 포함한다: US 2003/0157108; WO 2000/61739; WO 2001/29246; US 2003/0115614; US 2002/0164328; US 2004/0093621; US 2004/0132140; US 2004/0110704; US 2004/0110282; US 2004/0109865; WO 2003/085119; WO 2003/084570; WO 2005/035586; WO 2005/035778; WO2005/053742; WO2002/031140; Okazaki, A. 등, J. Mol. Biol. 336 (2004) 1239-1249; Yamane-Ohnuki, N. 등, Biotech. Bioeng. 87 (2004) 614-622. 탈푸코실화 항체를 생성할 수 있는 세포주의 예는 단백질 푸코실화가 결핍된 Lec13 CHO 세포 (Ripka, J. 등, Arch. Biochem. Biophys. 249 (1986) 533-545; US 2003/0157108; 및 WO 2004/056312, 특히 실시예 11 에서), 및 녹아웃 세포주, 예컨대 알파-1,6-푸코실트랜스퍼라제 유전자, FUT8, 녹아웃 CHO 세포 (예를 들어, Yamane-Ohnuki, N. 등, Biotech. Bioeng. 87 (2004) 614-622; Kanda, Y. 등, Biotechnol. Bioeng. 94 (2006) 680-688; 및 WO 2003/085107 참조) 를 포함한다.
특정 구현예에서, 제공된 방법은, 예를 들어, 항체의 Fc-영역에 부착된 바이안테너리 올리고당이 GlcNAc 에 의해 이등분되어 있는, 이등분된 올리고당을 갖는 항체를 생산하는데 사용될 수 있다. 그러한 항체 변이체는 감소된 푸코실화 및/또는 개선된 ADCC 기능을 가질 수 있다. 그러한 항체 변이체의 예는, 예를 들어, WO 2003/011878; US 6,602,684; 및 US 2005/0123546 에 기재되어 있다. Fc-영역에 부착된 올리고당 내에 하나 이상의 갈락토스 잔기를 포함하는 항체 변이체가 또한 생산될 수 있다. 그러한 항체 변이체는 개선된 CDC 기능을 가질 수 있다. 그러한 항체 변이체는, 예를 들어, WO 1997/30087; WO 1998/58964; 및 WO 1999/22764 에 기재되어 있다.
항체는, 예를 들어, US 4,816,567 에 기재된 바와 같은, 재조합 방법 및 조성물을 사용하여 생산될 수 있다. 핵산은 항체의 VL 를 포함하는 아미노산 서열 및/또는 항체의 VH 를 포함하는 아미노산 서열 (예를 들어, 항체의 경쇄 및/또는 중쇄) 을 인코딩할 수 있다. 추가의 구현예에서, 그러한 핵산을 포함하는 하나 이상의 벡터 (예를 들어, 발현 벡터) 가 제공된다. 추가의 구현예에서, 그러한 핵산을 포함하는 숙주 세포가 제공된다. 하나의 그러한 구현예에서, 숙주 세포는 하기를 포함한다 (예를 들어, 하기로 형질전환되었다): (1) 항체의 VL 을 포함하는 아미노산 서열 및 항체의 VH 를 포함하는 아미노산 서열을 인코딩하는 핵산을 포함하는 벡터, 또는 (2) 항체의 VL 을 포함하는 아미노산 서열을 인코딩하는 핵산을 포함하는 제 1 벡터 및 항체의 VH 를 포함하는 아미노산 서열을 인코딩하는 핵산을 포함하는 제 2 벡터. 하나의 구현예에서, 숙주 세포는 진핵, 예를 들어 차이니스 햄스터 난소 (CHO) 세포 또는 림프양 세포 (예를 들어, Y0, NS0, Sp2/0) 또는 인간 배아 신장 세포 (HEK293) 이다. 하나의 구현예에서, 위에 제공된 바와 같은, 항체를 인코딩하는 핵산을 포함하는 숙주 세포를 배양하고, 임의로 숙주 세포 (또는 숙주 세포 배양 배지) 로부터 항체를 회수하는 것을 포함하는 항체 제조 방법이 제공된다.
항체의 재조합 생산을 위해, 항체를 인코딩하는 핵산이 단리되고, 숙주 세포에서의 후속 클로닝 및/또는 발현을 위해 하나 이상의 벡터 내로 삽입된다. 그러한 핵산은 종래의 절차를 사용하여 (예를 들어, 항체의 중쇄 및 경쇄를 인코딩하는 유전자에 특이적으로 결합할 수 있는 올리고뉴클레오티드 프로브를 사용하여) 용이하게 단리 및 서열분석될 수 있다.
항체-인코딩 벡터의 클로닝 또는 발현에 적합한 숙주 세포는 본원에 기재된 원핵 또는 진핵 세포를 포함한다. 예를 들어, 항체는, 특히 글리코실화 및 Fc-영역 효과기 기능이 필요하지 않을 때, 박테리아에서 생산될 수 있다. 박테리아에서의 항체 조각 및 폴리펩티드의 발현에 대해, 예를 들어, US 5,648,237, US 5,789,199, 및 US 5,840,523 참조; 또한 대장균에서의 항체 조각의 발현을 기재하는 Charlton, K.A., In: Methods in Molecular Biology, Vol. 248, Lo, B.K.C.(ed.), Humana Press, Totowa, NJ (2003), pp. 245-254 참조. 발현 후, 항체는 가용성 분획 중 박테리아 세포 페이스트로부터 단리될 수 있고, 추가로 정제될 수 있다.
원핵생물 외에도, 진핵 미생물 예컨대 사상 진균 또는 효모가 항체-인코딩 벡터에 적합한 클로닝 또는 발현 숙주이며, 글리코실화 경로가 "인간화" 되어 일부 또는 완전 인간 글리코실화 패턴을 갖는 항체의 생성을 초래하는 진균 및 효모 균주를 포함한다 (Gerngross, T.U., Nat. Biotech. 22 (2004) 1409-1414; 및 Li, H. 등, Nat. Biotech. 24 (2006) 210-215 참조).
글리코실화된 항체의 발현에 적합한 숙주 세포는 또한 다세포 유기체 (무척추동물 및 척추동물) 에서 유래한다. 무척추동물 세포의 예는 식물 및 곤충 세포를 포함한다. 특히 스포도프테라 프루기페르다 (Spodoptera frugiperda) 세포의 트랜스펙션을 위해, 곤충 세포와 함께 사용될 수 있는 수많은 바큘로바이러스 균주가 동정되었다.
식물 세포 배양물이 또한 숙주로서 이용될 수 있다 (예를 들어, US 5,959,177, US 6,040,498, US 6,420,548, US 7,125,978, 및 US 6,417,429 (트랜스제닉 식물에서의 항체 생성을 위한 PLANTIBODIES™ 기술을 기재함) 참조).
척추동물 세포가 또한 숙주로서 사용될 수 있다. 예를 들어, 현탁액에서 성장하도록 적응시킨 포유류 세포주가 유용할 것이다. 유용한 포유류 숙주 세포주의 기타 예는 SV40 (COS-7) 로 형질전환된 원숭이 신장 CV1 라인; 인간 배아 신장 라인 (예를 들어, Graham, F.L. 등, J. Gen Virol. 36 (1977) 59-74 에 기재된 293 또는 293 세포); 베이비 햄스터 신장 세포 (BHK); 마우스 세르톨리 세포 (예를 들어, Mather, J.P., Biol. Reprod. 23 (1980) 243-252 에 기재된 TM4 세포); 원숭이 신장 세포 (CV1); 아프리카 녹색 원숭이 신장 세포 (VERO-76); 인간 경부암 세포 (HELA); 개 신장 세포 (MDCK; 버팔로 랫트 간 세포 (BRL 3A); 인간 폐 세포 (W138); 인간 간 세포 (Hep G2); 마우스 유방암 (MMT 060562); 예를 들어, Mather, J.P. 등, Annals N.Y. Acad. Sci. 383 (1982) 44-68 에 기재된 TRI 세포; MRC 5 세포; 및 FS4 세포이다. 기타 유용한 포유류 숙주 세포주는 차이니스 햄스터 난소 (CHO) 세포, 예를 들어 DHFR 음성 (DHFR(-)) CHO 세포 (Urlaub, G. 등, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77 (1980) 4216-4220); 및 골수종 세포주 예컨대 Y0, NS0 및 Sp2/0 를 포함한다. 항체 생성에 적합한 특정 포유류 숙주 세포주의 리뷰에 대해, 예를 들어, Yazaki, P. and Wu, A.M., Methods in Molecular Biology, Vol. 248, Lo, B.K.C.(ed.), Humana Press, Totowa, NJ (2004), pp. 255-268 을 참조한다.
II. 발명의 구체적 양상
벡터 구성에 따라 안정적 트랜스펙션에서 벡터 디자인에 따라 발현 벡터의 성능이 상이한 것으로 밝혀졌다.
안정적 트랜스펙션에 관한 벡터 구성의 성능에 하기 여러 요소가 기여할 수 있다고 밝혀졌으나 이 이론에 구속되지 않는다: 1) 각각의 벡터 디자인에 의존적이고 특이적이고, 일시적 시스템에는 존재하지 않는, 숙주 게놈에 편입된 벡터 카피 사이의 전사 간섭 현상, 2) 각각의 벡터 구성에 의존적이고, 안정적 시스템에서 중요한 역할을 하는, 선별 과정 및 선별 스트린전시 (stringency) 의 영향 및 3) 최적 LC 대 HC 폴리펩티드 비율.
그러나, 안정적 트랜스펙션의 경우, LC 및 HC 의 양방향 발현은 열 구성 HC-LC-SM 에서보다 나쁜 것으로 밝혀졌다. 하기 이론에 구속되지 않으면서 1) LC, HC 및 SM 에 대한 발현 카세트의 수렴 구성은 편입된 벡터 카피 사이의 전사 간섭 현상을 감소시킬 수 있고, 2) LC 의 상류에 있는 HC 는 안정적 트랜스펙션에 (더욱) 최적인 LC 대 HC 폴리펩티드 비율을 명백히 용이하게 하고, 3) 선별 마커의 하류 위치는 선별 스트린전시를 명백히 증가시킨다. 더욱이, IgG 생산 세포의 백분율 및 세포주의 생산성이 증가하는 것으로 밝혀졌다. 항체 발현 카세트의 상류에 양방향으로 선별 마커를 함유하는 벡터에 대한 선별 압력의 농도를 증가시켜도 안정적 푸울 또는 클론의 생산성은 증가하지 않았지만 선별 스트린전시는 명백히 증가했다 (데이타는 제시되지 않음).
hEF1α 프로모터는 많은 수의 고-생산 및 매우 적은 수의 비- 또는 저-생산 클론을 생성하는 것으로 밝혀졌다. 그러나, 유가식 (fed-batch) 분석에서 hEF1α 프로모터의 상위 개별 클론에 대한 생산 역가는 hCMV 프로모터의 클론에 대한 생산 역가보다 낮았다. 그러나 hCMV 프로모터에 대한 최고 클론의 전체 수는 비교적 적고, 그들의 식별은 통상적으로 큰 스크리닝 노력을 요구한다.
hGT 의 사용은 안정적 트랜스펙션에서 SV40 또는 bGH polyA 신호와 조합될 때 hCMV 프로모터를 함유하는 벡터에 대한 생산성을 유의하게 증가시키는 것으로 밝혀졌다. 그러나, hEf1α 프로모터를 함유하는 벡터의 경우, bGH polyA 신호와 조합될 때 생산 역가에 대한 그것의 효과는 미미했다. 따라서, 벡터 성능에 대한 hGT 의 영향은 사용되는 프로모터에 의존적인 것으로 밝혀졌다.
완전히 제어되는 대규모 발효에서 최종 평가에 적절한 클론의 선택은 통상적으로 셰이크 (shake) 플라스크 내에서의 회분식 (batch) 또는 유가식 (fed-batch) 분석에 기초한다. 회분식 및 유가식 분석 사이에 일부 발현 벡터 또는 엘리먼트의 성능 및 순위 차이가 존재하는 것으로 밝혀졌다. SV40 을 bGH polyA 신호로 대체하는 경우 hCMV 프로모터를 함유하는 벡터에 대한 생산성은 회분식 분석에서는 증가했지만 유가식 분석에서는 증가하지 않았다. hGT 는 클론의 생산 역가에 대해 회분식 분석에서는 유의한 영향을 미치지 않았지만 유가식 분석에서는 유의한 영향을 미쳤다. 회분식 및 유가식 사이의 벡터 성능의 절대 차이는 부분적으로 달랐다. 선별 마커의 위치 또는 프로모터 (hEf1α 또는 hCMV 프로모터) 가 상이한 벡터 사이의 차이는 회분식 분석에서는 다소 현저했으나 유가식 분석에서는 매우 명백했다. 발현 수준 및 구체적 생산율은 회분식에서보다 유가식에서 더 높다.
절대 생산 역가의 수준 뿐만 아니라, 상이한 벡터 및 클론 사이의 순위에서, 대부분의 클론에 대해 2L 발효와 유가식 분석의 성능에서 양호한 상관관계가 밝혀졌다.
선별 마커의 하류 위치는 항체 발현 카세트 상류의 선별 마커의 양방향 위치에 비해 생산성 손실을 약간 감소시키는 것으로 밝혀졌다. 이론에 구속되지 않으면서, 이는 증가된 선별 스트린전시 및 이에 따른 더 높은 mRNA 수준으로 인한 것이거나, 개선된 LC 대 HC mRNA 또는 폴리펩티드 비율에 의한 것일 수 있다. 2 가지 인자 모두 생산성 변화에 대한 더 높은 톨러런스 (tolerance) 를 초래할 수 있다.
bGH polyA 신호는 SV40 polyA 신호에 비해 클론에서 항체 발현의 안정성을 유의하게 감소시켰다. 그러나, bGH polyA 신호의 하류에 hGT 를 삽입하는 경우 발현 안정성이 명백히 증가했다. 안정성에 대한 hGT 의 양성 효과는 선별 압력의 부재시에 가장 명백했다. 안정적 푸울의 안정성 분석으로 세포가 hCMV 로 생성된 경우에는 생산성을 신속히 상실했으나 hEf1α 프로모터로 생성된 경우에는 그렇지 않은 것으로 밝혀졌다. 명백히, hGT 는 hEf1α 프로모터 함유 벡터에 대한 클론의 생산성은 감소시켰지만 그것의 안정성은 약간 증가시켰다.
선별 과정 후에 클론의 적은 일부만이 항체를 유의하게 생산했다. 그러나, 구성 및/또는 엘리먼트에서의 벡터 수식은 IgG 생산 대 비-생산 클론 비율을 유의하게 증가시켰다. 상이한 벡터 구성 및 이에 따른 선별 스트린전시를 결정하는 선별 마커의 상이한 발현 수준도 IgG 생산 세포의 백분율에 명백한 영향을 미친다. 스크리닝 과정의 데이타에 기초하는 통계 시뮬레이션으로 일부 발현 벡터가 스크리닝 과정 동안 작업 부하를 상당히 감소시킬 수 있는 잠재력을 또한 보유함이 입증되었다. 이 사실은 생물약제 회사의 비용에 큰 영향을 미친다.
발현 카세트 구성
항체의 경쇄 및 중쇄 및/또는 선별 마커의 위치가 상이한 4 가지 상이한 벡터가 생산성에 대해 시험되었다 (세부사항에 대해 도 1 참조).
벡터 p5137, p5156, p5158 및 p5159 는 일시적 트랜스펙션 및 안정적 푸울의 회분식 분석에서 시험되었다. 벡터 p5137 및 p5156 은 또한 안정적 단일 클론의 회분식 분석에서 시험되었다.
벡터 p5137, p5156, p5158 및 p5159 는 CHO-K1 세포에 일시적 트랜스펙션되었고, 트랜스펙션 후 제 5 일에 ELISA 에 의해 생산성이 확인되었다 (도 2).
일시적 트랜스펙션에서 항체 경쇄 앞의 중쇄 위치는 역순에 비해 더 나은 발현 결과를 제공하는 것으로 밝혀졌다. 이에 따라, 더 높은 생산성이 수득될 수 있다: 벡터 p5137 - 11.6 ㎍/㎖; 벡터 p5156 - 7.1 ㎍/㎖; 벡터 p5159 - 8.0 ㎍/㎖; 벡터 p5158 - 4.2 ㎍/㎖.
항체 사슬 둘다 뒤의 선별 마커의 위치는 제 1 항체 사슬 앞의 양방향 위치에 비해 더 나은 발현 결과를 제공하는 것으로 밝혀졌다. 이에 따라, 더 높은 생산성이 수득될 수 있다.
벡터 p5137, p5156, p5158 및 p5159 는 CHO-K1 세포에 뉴클레오펙션에 의해 트랜스펙션되었고, 안정적 푸울이 선별되었다. 안정적 푸울의 생산성이 회분식 분석에서 확인되었다.
항체 사슬 둘다 뒤의 선별 마커의 위치 (5'-3' 방향) 는 제 1 항체 사슬 앞의 양방향 위치 (3'-5' 방향) 에 비해 더 나은 발현 결과를 제공하는 것으로 밝혀졌다. 이에 따라, 더 높은 생산성이 수득될 수 있다: 벡터 p5156 - 18.0 ㎍/㎖; 벡터 p5158 - 9.1 ㎍/㎖; 벡터 p5137 - 15.6 ㎍/㎖; 벡터 p5159 - 5.7 ㎍/㎖ (도 3).
벡터 p5137 및 p5156 은 CHO-K1 세포 내로 뉴클레오펙션에 의해 트랜스펙션되었다. 안정적 트랜스펙션된 세포가 선별되고, 상위 15 클론의 생산성이 회분식 분석에서 분석되었다.
벡터 p5137 및 벡터 p5156 으로 생성된 상위 15 클론의 평균 생산성은, 각각, 벡터 p5137 은 159 ㎍/㎖, 벡터 p5156 은 141 ㎍/㎖ 였다. 회분식 분석에서 각각의 벡터의 상위 15 클론의 생산성 분포는 매우 유사하다. 회분식 분석에서 클론의 생산성은 약 50 ㎍/㎖ ~ 300 ㎍/㎖ 로 다양하다 (한 가지 예외: 벡터 p5137 로 생성된 최고 클론은 생산성이 450 ㎍/㎖ 초과임).
일시적 트랜스펙션 및 안정적 푸울의 회분식 분석 둘다에서 항체 사슬 둘다 뒤의 선별 마커의 위치 (5'-3' 방향) 는 제 1 항체 사슬 앞의 선별 마커의 양방향 3'-5' 위치보다 유의하게 더 높은 생산성을 초래한다.
일시적 트랜스펙션에서 항체 경쇄 앞의 항체 중쇄의 위치 (둘다 5'-3' 방향) 는 역순에 비해 더 나은 발현을 제공하는 것으로 밝혀졌다.
항체 경쇄 및 중쇄의 위치/순서는 안정적 푸울 및 단일 클론의 생산성에 유의한 영향을 미치지 않는 것으로 밝혀졌다. 약간 과잉량의 경쇄가 발현되어야 한다. 이에 따라, 일련의 항체 사슬 발현 카세트는 이러한 요건을 만족시키도록 배열된다.
선별 마커 발현 카세트 앞의/뒤의 항체 사슬 발현 카세트 (임의의 순서) (모두 5'-3' 방향) 가 특히 적합한 것으로 밝혀졌다.
2 개의 유전자가 차례로 발현되는 경우 일반적으로 제 2 유전자는 더 낮은 비율로 발현된다. 제 2 전사 유닛을 통한 RNA 폴리머라제의 번역은 제 2 전사 유닛의 프로모터에서의 전사 개시에 부정적 영향을 미친다.
벡터 px6068 에서 항체 경쇄 및 중쇄의 발현 카세트는 양방향 배열되었다 (도 4).
프로모터 경쟁 또는 간섭 (2 개의 프로모터의 근접성으로 인한 비효율적 전사 개시, 즉 전사 인자 및 RNA 폴리머라제의 프로모터 접근의 입체 장애, 전사 기구 자원의 감소된 이용가능성) 을 방지하기 위해 항체 경쇄 및 중쇄의 발현을 추진하는 2 개의 짧은 hCMV 프로모터가 영역 분리되었다 (puc 복제 기점에 의해).
벡터 p5068 및 px6068 은 CHO-K1 세포에 뉴클레오펙션에 의해 일시적 트랜스펙션되었다.
일시적 트랜스펙션에서 벡터 px6068 은 발현 벡터 p5068 에 비해 증가된 생산성을 보였다: 벡터 px6068 은 9.0 ㎍/㎖, 벡터 p5068 은 4.5 ㎍/㎖ (도 5).
일시적 트랜스펙션에서 항체 경쇄 및 중쇄의 양방향 및 분리된 위치는 경쇄 및 중쇄의 등을 맞댄 (back to back) 위치에 비해 개선된 항체 발현을 제공하는 것으로 밝혀졌다.
벡터 p5068 및 px6068 은 CHO-K1 세포 내로 뉴클레오펙션에 의해 트랜스펙션되고, 안정적 푸울이 선별되었다. 안정적 푸울의 생산성이 회분식 분석에서 확인되었다.
안정적 푸울의 회분식 분석으로 안정적 푸울에서 벡터 p5068 및 px6068 의 생산성이 유사한 것으로 밝혀졌다: 벡터 p5068 은 12.5 ㎍/㎖; 벡터 px6068 은 12.5 ㎍/㎖.
트랜스펙션 프로토콜
안정적 트랜스펙션을 위해 발현 벡터의 백본을 절단하는 효소에 의한 제한 소화로 벡터가 선형화된다. 벡터 px6068 의 경우 2 개의 제한 자리가 가능했다:
1. 경쇄 및 선별 마커의 전사 유닛 사이 (SgrAI);
2. 경쇄 및 중쇄의 hCMV 프로모터 사이의 puc 기점 (BssHII).
SgrAI 또는 BssHII 에 의한 제한 소화로 선형화된 벡터 px6068 은 CHO-K1 세포 내로 뉴클레오펙션에 의해 트랜스펙션되고, 안정적 푸울이 선별되었다. 안정적 푸울의 생산성이 회분식 분석에서 확인되었다.
안정적 푸울의 회분식 분석에서 발현 벡터 내의 선형화 자리의 위치는 벡터의 생산성에 명백한 영향을 미치는 것으로 밝혀졌다.
제한 효소 BssHII 로 선형화된 벡터 px6068 로 생성된 푸울은 제한 효소 SgrAI 로 선형화된 벡터 px6068 로 생성된 안정적 푸울에 비해 더 높은 생산성을 보인다: 1st 실험: 제한 효소 BssHII 로 선형화된 벡터 px6068 은 6.4 ㎍/㎖, 제한 효소 SgrAI 로 선형화된 벡터 px6068 은 2.8 ㎍/㎖; 2nd 실험: 제한 효소 BssHII 로 선형화된 벡터 px6068 은 12.5 ㎍/㎖, 제한 효소 SgrAI 로 선형화된 벡터 px6068 은 9.6 ㎍/㎖ (도 6 참조).
선별 압력의 시작 시점
안정적 세포 클론의 생성을 위해, 트랜스펙션 후 상이한 시점에, 즉 0 시간, 4 시간, 8 시간, 24 시간, 및 48 시간에 선별 압력이 가해졌다.
트랜스펙션 후 24 시간에 선별 압력의 부가는 선별제의 농도와 무관하게 배양 상청액 중 최고 항체 역가를 초래하는 것으로 밝혀졌다 (도 7 참조).
세포주의 성능에 대한 벡터 백본의 영향
일반적으로 발현 벡터는 진핵 세포 내로 트랜스펙션하기 전에 선형화된다. 부가적으로 발현 벡터는 원핵 세포 내에서의 발현 벡터의 증폭에 필요한 원핵생물 서열을 포함한다.
진핵 세포 내로 트랜스펙션하기 전에 선형화된 발현 벡터로부터 원핵생물 엘리먼트를 제거하면 하기가 초래되는 것으로 밝혀졌다:
- 안정적 세포 클론의 생성에 필요한 선별 시간의 감소 (도 8a),
- 푸울 (도 8b) 및 단일 클론 (도 8c) 의 증가된 생산성,
- 가속된 회수 (도 8d), 및
- 개선된 세포 성장 (도 8e).
벡터 엘리먼트 및 발현 카세트 배향
여러 상이한 전사 관련 유전 엘리먼트 및 그의 조합이 레퍼런스 유전 엘리먼트 조합과 비교되었다. 비교 일시적 실험에 기초하여 하기 결과가 수득되었다 (하기 표 참조, 양방향 벡터 구성, SM (3'-5')-LC_HC (5'-3')).
상이한 프로모터가 bGH polyA 신호 및 hGT 전사 종료자와 조합되었다 (하기 표 참조).
사용된 벡터:
본원에서 보고되는 벡터 엘리먼트들/엘리먼트 조합을 사용하여 증가된 발현 (생산성) 이 달성될 수 있는 것으로 밝혀졌다:
- Intron A 를 포함하지 않는 인간 CMV: 100 % (레퍼런스)
- Intron A 를 포함하는 인간 CMV: 일시적 234 %,
푸울 123 %,
클론 38 %
- Intron A 를 포함하는 랫트 CMV: 일시적 50 %,
푸울 60 %
- Intron A 를 포함하는 인간EF1α: 일시적 153 %,
푸울 564 %,
단일 클론:
84 % (SV40 polyA)
약 100 % (bGH 및 hGT)
- Intron A 및 최적화된 5'UTR 을 포함하는 인간EF1α:
+ 40 % (인간EF1α 에 비해)
- MPSV: 29 %
- bGH polyA: 일시적 146 %,
푸울 + 38%,
안정적 클론 92 %
- hGT: 일시적 131 %,
안정적 푸울 137 %,
단일 클론 123 %
- bGH polyA 및 hGT: 일시적 158 %,
안정적 푸울 163 %,
단일 클론 140 %
인간 CMV 프로모터:
Xu et al., J. Control. Release, 81 (2002) 155-163.
Xia et al., Prot. Expr. Purif. 45 (2006) 115-124.
랫트 CMV 프로모터:
Xia et al., Prot. Expr. Purif. 45 (2006) 115-124.
인간EF1α 프로모터:
Teschendorf et al., Anticancer Res. 22 (2002) 3325-3330.
Li et al., J. Immunol. Methods 318 (2007) 113-124.
MPSV 프로모터:
Xia et al., Prot. Expr. Purif. 45 (2006) 115-124.
Artelt et al., Gene 68 (1988) 213-219.
Stocking et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82 (1985) 5746-5750.
Lin et al., Gene 147 (1994) 287-292.
MPSV-CMV 하이브리드 프로모터:
Liu et al., Anal. Biochem. 246 (1996) 150-152.
선별 마커의 발현에 IRES-연결된 발현 카세트를 사용함으로써 높은 선별성 및 높은 스트린전시 선별 과정이 제공될 수 있다:
- 항체 발현에 대한 선별 압력은 높은 선별성을 초래한다
- 항체 및 선별 마커의 연결된 발현은 높은 선별성을 초래한다
- 약한 활성을 갖는 IRES 엘리먼트의 사용은 높은 스트린전시, 즉 높은 항체 생산 및 낮은 선별 마커 생산을 초래하는 것으로 밝혀졌다
- IRES 엘리먼트에 의해 항체 및 선별 마커의 발현을 연결시킨다
- IgG 발현을 아주 조금 변경시키는 약한 활성을 갖는 IRES 엘리먼트 (EMCV/Gtx) 를 식별한다
- 선별 및 스크리닝 마커로서 작용하는 융합 단백질을 사용한다
- 양기능 GFP-네오마이신 융합 단백질
- 오르니틴 데카르복실라제의 PEST 서열은 강한 단백질분해 신호 서열이고, 감소된 단백질 반감기를 부여한다
- 융합 단백질의 IRES 연결된 발현은 높은 선별성을 초래한다
- 단백질분해 신호 서열에 의한 짧은 반감기는 높은 스트린전시를 초래한다
- 융합 단백질의 약한 발현 및 짧은 반감기로 인해 강한 발현이 요구된다
- FACS 에 의해 고 생산자를 신속히 식별한다 (GFP 고발현 클론의 소팅은 고 생산자의 선별을 제공한다)
상이한 IRES 엘리먼트에 의해 항체 중쇄에 연결된 선별 마커
- px5068 (IRES 를 포함하지 않는): 100 % 항체 발현 (레퍼런스)
- Gtx-IRES: 20-27 %
- EMCV-IRES 81-94 %
- EV71-IRES 20-36 %
- ELF4G-IRES 3-17 %
- Gtx-IRES (합성) 88 %
상이한 IRES 엘리먼트에 의해 항체 중쇄에 연결된 GFP-Neo 융합 단백질
Gtx EV71 ELF4G EMCV
GFP 발현: + +++ - +
항체 발현: - - - +
Gtx-IRES:
Komuro et al., EMBO J. 12 (1993) 1387-1401.
EMCV-IRES:
Mountford et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91 (1991) 4303-4307.
EV71-IRES:
Lee et al., Biotechnol. Bioeng. 90 (2005) 656-662.
ELF4G-IRES:
Wong et al., Gene Ther. 9 (2002) 337-344.
Gtx (합성)-IRES:
Chappell et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA97 (2000) 1536-1541.
EV71-IRES 엘리먼트에 의해 경쇄 발현 카세트를 중쇄 발현 카세트에 연결시킴으로써 증가된 발현 (생산성) 이 달성될 수 있는 것으로 밝혀졌다:
- IRES 를 포함하지 않는 px5068: 100 % 항체 발현 (레퍼런스)
- Gtx-IRES (합성): 3 %
- EV71-IRES: 82 %
- ELF4G-IRES: 5 %
- EMCV-IRES: 7 %
벡터 구성과 조합된 벡터 엘리먼트
하기 벡터가 CHO-K1 숙주 세포주 내에서 일시적 트랜스펙션, 안정적 푸울 및 단일 클론 수준에서 시험되었다.
여러 전사 관련 유전 엘리먼트 및 그들의 조합이 레퍼런스 벡터 (px9001, 벡터 구성 SM (3'-5' 배향)-LC-HC (5'-3' 배향)) 와 비교되었다. 비교 실험에 기초하여 레퍼런스 벡터 (px9001, 양방향 벡터 구성 SM (3'-5')-LC-HC (5'-3')) 에 비해 동일한 방향의 경쇄 및 중쇄 (경쇄 발현 카세트가 중쇄 발현 카세트의 상류에 위치함) 및 선별 마커 발현 카세트를 포함하는 단방향 벡터 구성에 대해 하기 결과가 수득되었다 (하기 표 참조).
일시적 트랜스펙션에서 CHO-K1 세포 내로 뉴클레오펙션한 후에 상이한 벡터의 성능이 시험되었다 (도 9 참조).
인간 신장 인자 1 알파 프로모터 (hEF1α) 함유 벡터 (벡터 구성 LC-HC-SM 에 기초함) 는 hCMV 프로모터를 사용하는 경우에 비해, 사용된 polyA 신호 서열에 따라, 각각, 약 + 34% (px9003 과 px9002 를 비교; SV40 polyA 신호 서열) 및 + 30 % (px9006 과 px9004 를 비교; bGH polyA 신호 서열) 의 증가된 생산성을 갖는다.
bGH polyA 신호 서열에 인간 가스트린 종료자 (hGT) 를 부가하는 경우 hCMV- 함유 벡터의 생산성에 양성 효과를 갖는다 (px9005 과 px9004 를 비교; + 13 %).
항체의 경쇄 및 중쇄의 양방향 발현에 기초하는 발현 벡터는 개선된 성능을 보인다. 생산 역가는 사용된 프로모터 (hEF1α 또는 hCMV) 및 사용된 polyA 신호 서열 (SV40 또는 bGH polyA 신호 서열) 에 따라 대조군 벡터 px9001 에 비해 약 2.7 ~ 3.4 배 증가된다.
인간 신장 인자 1 알파 프로모터 및 bGH polyA 신호 서열을 사용하는 경우 생산성에 벡터 구성 LC-HC-SM (+ 50%; px9006 과 px9002 를 비교) 에서는 양성 효과를 갖지만, 벡터 구성 LC(3'-5')-HC-SM (- 28 %; px9010 과 px9011 을 비교) 에서는 양성 효과를 갖지 않는 것으로 밝혀졌다.
발현 벡터 px9002 와 벡터 px9003 - 9007 의 생산성을 비교하기 위해 벡터가 뉴클레오펙션에 의해 CHO-K1 세포 내로 트랜스펙션되고, 안정적 푸울이 선별되었다. 푸울의 생산성이 회분식 분석에서 분석되었다 (도 10 참조).
안정적 푸울의 회분식 분석으로 인간 신장 인자 1 알파 프로모터 함유 벡터 (px9003, px9006, px9007) 로 트랜스펙션된 푸울로부터의 항체 역가가 짧은 길이 hCMV 프로모터 함유 레퍼런스 벡터 (벡터 px9002) 로 트랜스펙션된 세포의 항체 역가보다 약 7-8 배 더 높은 것으로 밝혀졌다 (벡터 px9003, px9006 및 px9007 의 97.5 ㎍/㎖, 112.5 ㎍/㎖ 및 95.6 ㎍/㎖ 와 벡터 px9002 의 14.0 ㎍/㎖ 를 비교).
벡터 px9001, px9002 및 px9004 ~ px9007 이 CHO-K1 세포 내로 뉴클레오펙션에 의해 트랜스펙션되고, 상위 단일 클론이 고전적 스크리닝 과정에 의해 식별되었다. 각각의 벡터의 상위 36 클론의 생산성이 회분식 분석에서 분석되었고, 회분식 분석에서의 상위 15 클론이 유가식 분석에서 시험되었다.
회분식 분석에서 벡터 px9001 로 생성된 상위 36 단일 클론의 평균 생산성은 356 ㎍/㎖ 이다. 벡터 px9002 또는 벡터 px9004 및 9005 (SV40 polyA 신호 대신 bGH polyA 신호 (단독으로 또는 HGT 와의 조합으로) 를 부가적으로 함유함) 로 생성된 클론은 대조군 벡터 px9001 에 비해 각각 37 % (px9002), 61 % (px9004) 및 53 % (px9005) 의 생산성 증가를 보인다. 벡터 px9006 및 px9007 의 클론은 각각 약 19 % 및 7 % 의 생산성 증가를 보인다.
유가식 실험에서, 회분식 분석에서 각각의 벡터로 수득된 상위 15 클론이 유가식 분석에서 14 일에 걸쳐 시험되었다.
유가식 분석에서 상위 15 인 하우스 (in house) 단일 클론 (벡터 px9001 로 생성됨) 의 평균 생산성은 1345 ㎍/㎖ 이다. 벡터 px9002 또는 벡터 px9004 및 9005 (SV40 polyA 신호 서열 대신 bGH polyA 신호 서열 (단독으로 또는 hGT 와의 조합으로) 을 부가적으로 함유함) 로 생성된 클론은 대조군 벡터 px9001 에 비해 각각 80 % (px9002), 58 % (px9004) 및 92 % (px9005) 의 생산성 증가를 보인다.
증가된 평균 생산성 (상기 참조) 외에 상위 클론의 성능도 크게 개선된다. 벡터 px9002, px9004 및 px9005 는, 상위 5 클론의 생산성과 관련하여, 대조군 벡터 px9001 에 비해 약 64 % (px9002), 50 % (px9004) 및 88 % (px9005) 의 증가를 보인다.
하기에서 각각의 상이한 벡터에 대해 생산 및 비-생산 세포의 백분율이 각각 직접 비교되었다. 벡터 px9001 로 생성된 클론의 14.2 % 가 항체를 생산하고, 나머지 저항성 클론에서는 항체 발현이 침묵되거나 클론이 다른 결함을 갖는다.
벡터 px9002 의 벡터 구성은 생산 세포의 백분율을 거의 2 배 (26.0 %) 로 만들었다. SV40 polyA 신호 서열 대신 bGH PolyA 신호 서열을 단독으로 (벡터 px9004) 또는 hGT 와의 조합으로 (벡터 px9005) 부가적으로 함유하는 벡터는 생산 세포 백분율의 약 3 배 (각각 39 % 및 43 %) 증가를 보인다.
hCMV 프로모터 대신 인간 신장 인자 1 알파 프로모터를 사용하는 경우 생산 세포의 수가 5 배 증가했다 (선별 과정 후 수득된 클론의 70 % 초과가 항체를 실제로 생산한다).
벡터 px9001 ~ 9007 로 트랜스펙션하여 수득된 15 상위 클론 (유가식 결과에 기초하여) 이 하이그로마이신 B 의 존재 및 부재 하에 15 계대 (= 약 60 세대) 동안 배양되었다. 15 계대 후 회분식 분석에서의 클론의 생산 역가가 안정성 시험의 시작시 회분식 분석에서의 클론의 생산 역가와 비교되었다.
선별 압력의 존재 하에 각각의 벡터의 15 클론 사이의 생산 역가의 변화는 15 계대 후 벡터 px9007 은 - 14.7 %, 벡터 px9002 는 + 0.2 % 로 다양하다.
선별 압력의 부재 하에 생산 역가의 감소는 벡터 px9004 는 25.5 %, 벡터 px9005 는 5.9 % 이하로 다양하다.
선별 마커의 존재 및 부재 하에 둘다 규정된 안정성 기준 예컨대 회분식 분석에서 생산 역가 80 % 초과 (시작점 (G0) 에서의 생산 역가에 비해) 를 만족시키는 클론의 수는 4 ~ 10 로 다양하다. 마찬가지로 선별 압력/선별 마커의 존재 및 부재 하에 벡터 px9005, px9007 및 px9002 는 최고수의 안정적 클론을 초래한다 (px9005: 10; px9007: 7; px9002:6)).
이와 같이, 벡터 px9005 의 구성은 안정성에 양성 효과를 보이고, 특히 선별 압력의 부재 하에, 안정적 클론의 수를 증가시키는 것으로 밝혀졌다.
전사 종료자 (hGT) 를 포함하지 않는 SV40 polyA 에 비해 bGH polyA 와 hGT 의 조합은 사용된 프로모터와 무관하게 안정적 클론의 생산성을 명백히 증가시키는 것으로 밝혀졌다.
일시적 트랜스펙션:
- 인간 신장 인자 1 알파 프로모터 (Intron A 를 포함함) 를 사용하는 경우 증가된 생산성이 제공된다 (LC-HC-SM 구성에서)
- 소 성장 호르몬 polyA 신호 서열을 사용하는 경우 SV40 polyA 신호 서열을 사용하는 경우에 비해 증가된 생산성이 제공된다
- bGH polyA 신호 서열에 HGT 를 부가하는 경우 hCMV 프로모터 함유 벡터에서 증가된 생산성이 초래된다
- 벡터 구성 LC(3'-5')-HC-SM 은 개선된 발현을 초래한다
안정적 푸울
- hEF1α 프로모터 함유 벡터로 생성된 푸울은 회분식 분석에서 증가된 생산성을 보인다
- hEF1α 프로모터 함유 벡터로 생성된 클론은 감소된 수의 저 생산 클론을 보인다
- hEF1α 프로모터 함유 벡터로 생성된 클론은 IgG 발현의 더 높은 안정성을 보인다
단일 클론
- 선별 마커가 하류에 위치하는 벡터 구성 (LC-HC-SM) 은 단일 클론의 생산성에 양성 효과를 갖는다
- bGH polyA 신호 서열 및 hGT 함유 벡터로 생성된 클론은 더 높은 생산성 및 안정성을 갖는다
하기 실시예, 도면 및 서열은 본 발명의 이해를 돕기 위해 제공되며, 본 발명의 진정한 범위는 첨부된 청구항에서 제시된다. 발명의 의미에서 벗어나지 않으면서 제시된 절차에 변형이 가해질 수 있다고 이해된다.
서열
SEQ ID NO: 01 Intron A 를 포함하지 않는 짧은 인간 CMV 프로모터
SEQ ID NO: 02 Intron A 를 포함하지 않고 5'UTR 을 포함하는 짧은 인간 CMV 프로모터
SEQ ID NO: 03 Intron A 를 포함하는 전장 인간 CMV 프로모터
SEQ ID NO: 04 Intron A 를 포함하지 않는 전장 인간 EF1 알파 프로모터
SEQ ID NO: 05 Intron A 를 포함하는 전장 인간 EF1 알파 프로모터
SEQ ID NO: 06 Intron A 를 포함하고 5'UTR 을 포함하는 짧은 인간 EF1 알파 프로모터
SEQ ID NO: 07 Intron A 를 포함하는 전장 랫트 CMV 프로모터
SEQ ID NO: 08 SV40 polyA 신호 서열
SEQ ID NO: 09 bGH polyA 신호 서열
SEQ ID NO: 10 hGT 종료자 서열
SEQ ID NO: 11 SV40 프로모터
SEQ ID NO: 12 오르니틴 데카르복실라제의 PEST 서열
SEQ ID NO: 13 GFP 인코딩 핵산 서열
SEQ ID NO: 14 네오마이신 선별 마커
SEQ ID NO: 15 GFP-PEST-NEO 융합 폴리펩티드 인코딩 핵산
SEQ ID NO: 16 EMCV-IRES
SEQ ID NO: 17 EV71-IRES
실시예
발현 벡터 p5068 및 p5069
발현 플라스미드 p5068 및 p5069 는 WO 2005/100402 에서 보고된 바와 같은 항-P-셀렉틴 항체의 발현을 위한 발현 카세트 (엑손-인트론 구성이 유지된 게놈 구성 발현 카세트) 를 포함한다.
항-P-셀렉틴 HuMab 경쇄 및 중쇄 인코딩 유전자가 포유류 세포 발현 벡터 내에 분리되어 조립되었다.
그에 의해 항-P-셀렉틴 HuMab 경쇄 가변 영역 (VL) 및 인간 κ-경쇄 불변 영역 (CL) 을 인코딩하는 유전자 분절이 항-P-셀렉틴 HuMab 중쇄 가변 영역 (VH) 및 인간 γl-중쇄 불변 영역 또는 인간 γ4-중쇄 불변 영역 (CH1-힌지-CH2-CH3) 에 대한 유전자 분절과 같이 연결되었다.
코돈 사용법이 추론될 수 있는 인간 경쇄 및 중쇄의 뉴클레오티드 서열에 관한 일반 정보가: Kabat, E. A. 등, Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th ed., Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD (1991), NIH Publication No 91-3242 에 제공되어 있다.
항-P-셀렉틴 HuMab κ-경쇄의 전사 유닛은 하기 엘리먼트로 구성된다:
- 인간 사이토메갈로바이러스 (hCMV) 로부터의 조기 발현 인핸서 및 프로모터,
- Kozak 서열을 포함하는 합성 5'-UT,
- 신호 서열 인트론을 포함하는 쥐 면역글로불린 중쇄 신호 서열,
- 5' 말단의 독특한 BsmI 제한 자리 및 스플라이스 공여자 자리 및 3' 말단의 독특한 NotI 제한 자리로 배열된 클로닝된 항-P-셀렉틴 HuMab 가변 경쇄 cDNA,
- 인트론 2 마우스 Ig-κ 인핸서를 포함하는 게놈 인간 κ-유전자 불변 영역 (Picard, D., and Schaffner, W. Nature 307 (1984) 80-82), 및
- 인간 면역글로불린 κ-폴리아데닐화 ("poly A") 신호 서열.
항-P-셀렉틴 HuMab γl-중쇄의 전사 유닛은 하기 엘리먼트로 구성된다:
- 인간 사이토메갈로바이러스 (hCMV) 로부터의 조기 발현 인핸서 및 프로모터,
- Kozak 서열을 포함하는 합성 5'-UT,
- 신호 서열 인트론을 포함하는 수식된 쥐 면역글로불린 중쇄 신호 서열,
- 5' 말단의 독특한 BsmI 제한 자리 및 스플라이스 공여자 자리 및 3' 말단의 독특한 NotI 제한 자리로 배열된 클로닝된 항-P-셀렉틴 HuMab 가변 중쇄 cDNA,
- 마우스 Ig μ-인핸서를 포함하는 게놈 인간 γl-중 유전자 불변 영역 (Neuberger, M.S., EMBO J. 2 (1983) 1373-1378), 및
- 인간 γl-면역글로불린 폴리아데닐화 ("poly A") 신호 서열.
항-P-셀렉틴 HuMab κ-경쇄 또는 γl-중쇄 발현 카세트 외에 이들 플라스미드는 하기를 함유한다:
- 하이그로마이신 내성 유전자,
- 엡스타인 바 바이러스 (EBV) 의 복제 기점, oriP,
- 이러한 플라스미드의 대장균 내에서의 복제를 가능하게 하는 벡터 pUC18 로부터의 복제 기점, 및
- 대장균에서 암피실린 내성을 부여하는 β-락타마제 유전자.
재조합 DNA 기술
Sambrook et al., 1999 (상기) 에 기재된 표준 클로닝 기술을 사용하여 클로닝을 실시했다. 모든 분자 생물 시약은 상업적으로 입수가능했고 (다르게 명시되지 않는 경우), 제조사의 지침에 따라 사용했다.
핵산 합성
상이한 유전 엘리먼트의 DNA 가 Geneart AG, Regensburg 에 의해 합성되었다.
핵산 서열 확인
SequiServe (SequiServe GmbH, Germany) 에서 실시한 이중 가닥 시퀀싱에 의해 DNA 서열을 확인했다.
DNA 및 단백질 서열 분석 및 서열 데이타 관리
Vector NTI Advance suite version 9.0 을 서열 제작, 맵핑, 분석, 주해 (annotation), 및 도해에 사용했다.
세포 배양 기술
1x HT 보충제 (Invitrogen Corp., Gibco®, Cat. No. 11067-030) 를 보충한 CD-CHO 배지 (Invitrogen Corp., Gibco®, Cat. No. 10743-011) 에서 CHO-K1 세포를 성장시켰다.
안정적으로 트랜스펙션된 CHO-K1 푸울/세포주의 선별을 위해 400 ~ 800 ㎍/㎖ G418 또는 200 ~ 400 ㎍/㎖ 하이그로마이신을 첨가했다 (Roche Diagnostics GmbH, Roche Applied Sciences, Germany, Cat. No.: 843555).
모든 세포주를 가습 인큐베이터 내에서 37 ℃ 에서 5 % CO2 로 120 ~ 140 rpm/min 의 일정한 진탕 하에 유지했다. 매 3 ~ 4 일 마다 세포를 프레쉬 배지 내로 분할했다. 배양물의 밀도 및 생활력을 Casey TT 또는 Cedex Hires 세포 계수기 (Roche innovates AG, Bielefeld) 를 사용하여 측정했다. 세포의 트랜스펙션을 Amaxa 뉴클레오펙션 기술 (Lonza GmbH, Germany) 에 의해 실시했다.
게다가 예를 들어 Bonifacino, J.S. 등, (eds.), Current Protocols in Cell Biology, John Wiley and Sons, Inc. (2000) 에 기재된 바와 같은 표준 세포 배양 기술을 적용했다.
세포 계수 및 세포 생활력의 측정
a) 전계 세포 계수 시스템 (CASY)
CASY® Technology Cell Counter, Model TT (Roche Innovatis AG, Bielefeld) 는 세포 계수에 전류를 사용한다. 펄스 면적 분석 (Pulse Area Analysis) 을 사용하여 세포가 저전압장에서 측정 세공을 통과할 때 생성되는 신호로부터 정보를 얻었다. 세포막의 구조 무결성은 세포 생활력의 정도이다. 그러므로 생활력 측정에 트리판 블루와 같은 염료가 필요하지 않다.
b) 자동화 트리판 블루 배제 방법 (Cedex)
푸울 선별 동안 및 자동화 세포 계수 동안 Cedex HiRes 시스템 (Roche Innovatis AG, Bielefeld) 을 사용하여 세포 생활력을 측정했다.
트리판 블루는 온전한 세포막을 통해 세포 내로 진입할 수 없는 염료이다. 오직 손상된 세포막을 갖는 세포만 염색되고, 사망한 것으로 표지된다. 염색 과정, 세포 계수 및 결과의 그래프 분석이 Cedex 시스템으로 디지탈 영상 인식에 의해 자동으로 수행되었다. 기타 측정 매개변수는 세포 크기, 형태 및 응집률이다. 멀티 샘플러로, 20 개 이하의 샘플을 연이어 측정했다.
플라스미드 제조 및 트랜스펙션에서 플라스미드의 정확한 비교를 위한 품질 체크
트랜스펙션 효능 및 그에 따라 생산성이 여러 인자 예컨대 DNA 양 및 품질에 의해 크게 영향을 받는다. 각각의 벡터에 동등한 시작 조건을 보장하기 위해 모든 벡터의 DNA 양 및 품질을 트랜스펙션 전에 집중 체크했다.
- 발현 벡터의 동시 제조
High Speed Maxi 플라스미드 단리 키트 (Qiagen GMBH, Hilden) 를 제조사의 지침에 따라 사용하여 모든 벡터를 동시에 제조했다.
- 페놀/클로로포름 정제 및 에탄올 침전
모든 벡터를 페놀/클로로포름 정제에 의해 동시에 정제했다. 500 ㎍ 의 각각의 선형화된 플라스미드 DNA 를 200 ㎕ Tris-완충 50 % (v/v) 페놀, 48 % (v/v) 클로로포름, 2 % (v/v) 이소아밀 알코올 용액과 혼합하고 1 분 동안 13,000 rpm 에서 원심분리했다. 그 후 상부 수성 상을 새로운 튜브 내로 옮기고, 200 ㎕ 96 % (v/v) 클로로포름, 4 % (v/v) 이소아밀 알코올과 혼합하고, 1 분 동안 13,000 rpm 에서 원심분리했다. 상부 상을 다시 새로운 튜브 내로 옮기고, 1/10 (총 부피) 3 M 나트륨 아세테이트 (pH 5.2) 및 2.5 배 (총 부피) 100 % 에탄올과 혼합했다. 혼합하고 반응물을 5 분 동안 실온에서 인큐베이팅한 후, DNA 를 펠렛화하기 위해 혼합물을 5 분 동안 13,000 rpm 에서 원심분리했다. 상청액을 폐기하고, 펠렛을 900 ㎕ 70 % (v/v) 에탄올로 세정하고, 5 분 동안 실온에서 인큐베이팅했다. 최대 속도에서 5 분 동안의 최종 원심분리 단계 후에, 상청액을 폐기하고, 펠렛을 건조시키고, 멸균 H2O 로 재현탁시켰다.
- DNA 측정
각각의 벡터의 DNA 양을 BioPhotometer (Eppendorf; Hamburg) 를 사용하여 측정했다. DNA 측정은 항상 Tris pH 8.0 에서 1:20 희석률을 사용하여 3 차례 실시했다.
- 아가로스 겔
각각의 플라스미드의 DNA 품질을 0.8 % 아가로스 겔 상에서 체크했다. DNA 분해, 벡터 입체구조 및 DNA 농도를 확인했다. 비슷한 양 및 품질 (DNA 분해 없음, 유사한 수퍼코일 (ccc) 형태, 겔 상의 유사한 DNA 양) 을 보이는 벡터를 일시적 및 안정적 트랜스펙션에 사용했다.
일시적 트랜스펙션
모든 벡터를 CHO-K1 세포 내에 Amaxa 96 웰 셔틀 시스템 (Lonza GmbH, Germany) 을 제조사의 지침에 따라 사용하여 트랜스펙션했다. 각각의 벡터를 8 회 반복 트랜스펙션했다. 트랜스펙션된 벡터의 DNA 양을 1 ㎍ 의 레퍼런스 발현 플라스미드 (p5068 또는 p5069) 에 따른 등몰량/카피수로 정규화시켰다. 생산성을 측정하기 위해 무세포 세포 배양 상청액을 트랜스펙션 후 제 4 일 ~ 제 7 일에 원-스텝 유니버설 (one-step universal) ELISA (Dianova) 에 의해 IgG 역가에 대해 분석했다.
Amaxa 96 웰 셔틀 시스템:
스피너 플라스크에서 성장하는 CHO-K1 세포를 850 rpm 에서 5 분 동안 원심분리하여 펠렛화하고, 배양 배지에 재현탁시켰다. 원형 플라스미드를 96-웰 뉴클레오펙션 플레이트 내에서 1 ㎍ 의 레퍼런스 발현 벡터 p5068 또는 p5069 에 따른 등몰 농도에서 플레이팅했다. 그 후 세포를 플레이트 내에 4 x 105 세포/웰 의 농도로 첨가했다. 트랜스펙션을 Amaxa 프로그램 DN-137 에 의해 실시했다. 트랜스펙션 후 10 분 동안 세포를 인큐베이팅한 후, 200 ㎕ 배양 배지를 함유하는 96 웰 넓적 바닥 인큐베이션 플레이트 내로 옮겼다. 그 후 세포를 정적으로 배양했다. 트랜스펙션 후 제 4 일 ~ 제 6 일에 원-스텝 유니버설 ELISA 를 사용하여 IgG 수준을 측정했다.
안정적 트랜스펙션 및 재조합 CHO 세포주의 생성
안정적 트랜스펙션을 뉴클레오펙션 기술 (Amaxa Biosystems, Lonza cologne AG) 을 제조사의 지침에 따라 사용하여 실시했다. 트랜스펙션 전에 플라스미드를 제한 효소 SgrA I 에 의해 선형화했다. 각각의 플라스미드를 2 회 또는 3 회 반복 트랜스펙션했다. 1 회의 트랜스펙션마다 5 x 106 세포 및 1.2 pmol 선형화된 플라스미드를 사용했다. (Nucleofector Kit T, Amaxa 프로그램 A33).
트랜스펙션을 위해 세포를 Nucleofector solution T 에 재현탁시키고, 2 ㎖ 튜브 내로 분배했다. 플라스미드를 첨가한 후, 펄스를 가하여 트랜스펙션을 실시했다. 그 후 미리 데운 4 ㎖ 프레쉬 배지 및 4 ㎖ 조정 배지를 함유하는 T25 조직 배양 플라스크 내로 세포를 옮겼다. 트랜스펙션 후 24 시간에 250 ㎍/㎖ 하이그로마이신 B 를 첨가하여 선별 압력을 가했다.
안정적 푸울의 생성
Amaxa 뉴클레오펙션 기술에 의해 벡터를 CHO-K1 세포 내로 트랜스펙션하고, 하이그로마이신 B 또는 G418 을 선별제로서 사용하여 안정적 푸울을 선별했다. 각각의 트랜스펙션을 3 회 반복 실시했다. 안정적 푸울의 생성을 위해, 모든 플라스미드를 SgrA I 에 의한 제한 소화로 균일하게 선형화했다. Nucleofector Kit T (Amaxa) 를 사용하여 안정적 트랜스펙션을 실시하고, 각각의 플라스미드를 3 회 반복 트랜스펙션했다.
안정적 푸울을 다음과 같이 확립했다: 5 x 106 세포 및 1.2 pmol 선형화된 플라스미드를 각각의 트랜스펙션에 사용했다. 세포를 Solution T 에 재현탁시키고, 2 ㎖ 튜브 내로 분배했다. 플라스미드를 첨가한 후, 펄스를 가하여 트랜스펙션을 실시했다 (Amaxa program A33). 트랜스펙션된 세포 푸울을 미리 데운 4 ㎖ 프레쉬 배지 및 4 ㎖ 조정 배지를 함유하는 T25 조직 배양 플라스크에서 정적으로 배양했다.
트랜스펙션 후 24 시간에 선별 압력을 가했다: 세포를 5 분 동안 800 rpm 에서 원심분리하고, 300 ㎍/㎖ 하이그로마이신 B 를 함유하는 3 ㎖ 배양 배지에 재현탁시켰다. 트랜스펙션 후 3 일에 세포를 넓적 바닥 6-웰 플레이트 내로 옮겼다. 그 후 세포 생활력이 최소로 하락하고 다시 99 % 위로 상승할 때까지 2 주 동안 세포를 배양했다. 세포 수 및 생활력이 Cedex HiRes 시스템 (Innovatis, Bielefeld) 으로 일정하게 확인되었다. 배양 동안, 세포 데브리스 (debris) 를 원심분리로 제거하고, 세포를 항상 3 ㎖ 프레쉬 배지에 재현탁시켰다.
Caliper 로봇 시스템을 사용하는 안정적 클론의 생성
상기와 같이 벡터를 CHO-K1 세포 내로 트랜스펙션했다. 트랜스펙션 후 48 시간에 선별 압력을 가하고 (하이그로마이신 B 또는 G418), 세포를 자동 고처리 클론 단리 시스템 (Sciclone ALH 3000 workstation, Caliper Life Sciences GmbH, Mainz) 을 사용하여 384 웰 넓적 바닥 플레이트 위로 350 ~ 700 세포/웰 의 농도로 파종했다.
10 ~ 14 일 후 384 웰 플레이트를 ELISA 기반 초고처리 스크리닝 (ELSIA uHTS) 을 사용하여 IgG 수준에 대해 스크리닝했다. 1 차 스크리닝으로부터 상위 생산 클론을 선택하고, 넓적 바닥 96 웰 플레이트 내로 옮겼다. 3 ~ 6 일 후에 세포를 IgG 수준에 대해 두번째 스크리닝했다. 다시 상위 생산 클론을 선택하고, 넓적 바닥 24 웰 플레이트 내로 수동으로 옮겼다. 추가의 ELISA 기반 스크리닝 단계 후에 상위 클론을 선택하고, 넓적 바닥 6 웰 플레이트 내로 옮겼다. 6-웰 플레이트 내의 IgG 수준을 ProtA 측정에 의해 측정하여, 진탕 6 웰 플레이트 내에서의 회분식 배양을 위한 최종 상위 클론을 식별했다.
푸울/단일 클론의 회분식 분석
생산성 및 안정성의 차이를 탐지하기 위해, 클론/푸울의 세포수를 Casey 세포 계수기를 사용하여 계수하고, 넓적 바닥 6 웰 플레이트 내로 농도 3 x 105 세포/㎖ 및 총 부피 3.0 ㎖ 로 균일하게 파종했다. 모든 회분식 배양물을 12 일 동안 배양하고, 제 4 일, 제 7 일, 제 9 일, 제 11 일 또는 제 12 일에 세포 배양 상청액을 인간 IgG 수준에 대해 스크리닝했다.
IgG 정량화
일시적 실험에서 및 스크리닝 포맷 (384 웰 ~ 24-웰) 에서의 IgG 역가를 원-스텝 유니버설 ELISA 를 사용하여 측정했다. 회분식 실험에서 안정적 푸울 및 안정적 단일 클론의 생산성을 Protein A HPLC 에 의해 측정했다.
원-스텝 유니버설 ELISA
원-스텝 유니버설 ELISA (Dianova) 를 사용하여 세포 배양 상청액으로부터 인간 IgG 수준을 측정했다. 희석 완충액 (PBS + 5 % (w/v) RPLA1) 을 사용하여 0.3125-20 ng/㎖ 의 범위에서 항-P-셀렉틴 항체 (F. Hoffmann-La Roche AG, Basle, Switzerland) 의 계단 희석물을 사용하여 표준 곡선을 준비했다. 0.5 ㎍/㎖ 비오티닐화 F(ab')2-항-인간 Fc 항체 (Jackson laboratories) 및 0.1 ㎍/㎖ 퍼옥시다제 접합 F(ab')2-항-인간 Fc 항체 (Jackson laboratories; Suffolk) 를 함유하는 95 ㎕ 항체-믹스를 스트렙타비딘-코팅된 96-웰 MTP (StreptaWell, Roche Diagnostics GmbH) 에 첨가했다. 5 ㎕ 의 1:20.000 희석된 세포 배양 상청액을 플레이트에 첨가하고, 1 시간 동안 인큐베이션했다. 항체 코팅된 플레이트를 200 ㎕ 세정 완충액 (PBS + 0.05 % (v/v) Tween20) 으로 3 회 세정했다. 100 ㎕ ABTS (Roche Diagnostics GmbH, Mannheim, Germany) 를 플레이트에 첨가하고, 흡광도를 405 ㎚ 에서 레퍼런스 파장 492 ㎚ 로 측정했다.
ProtA-측정
HPLC 기반 크로마토그래피를 원-스텝 유니버설 ELISA 와 조합하여 사용하여 Protein A 에 의해 회분식 분석의 IgG 역가를 측정했다.
FACS
안정적 또는 일시적 트랜스펙션된 세포의 트랜스펙션 효율 (GFP 발현 세포에 기초함) 또는 GFP 발현 수준을 형광-활성화 세포 소팅을 사용하여 측정했다. 일반적으로 각각의 클론 또는 푸울의 5 x 106 세포를 FACSCalibur Flow Cytometer (BD Biosciences, San Diego, CA) 를 사용하여 측정했다. 정방향 및 측방향 산란 데이타를 사용하여 세포 크기, 생활력 및 세포 형태를 측정했다.
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gttgacattg attattgact agttattaat agtaatcaat tacggggtca ttagttcata 60
gcccatatat ggagttccgc gttacataac ttacggtaaa tggcccgcct ggctgaccgc 120
ccaacgaccc ccgcccattg acgtcaataa tgacgtatgt tcccatagta acgccaatag 180
ggactttcca ttgacgtcaa tgggtggagt atttacggta aactgcccac ttggcagtac 240
atcaagtgta tcatatgcca agtacgcccc ctattgacgt caatgacggt aaatggcccg 300
cctggcatta tgcccagtac atgaccttat gggactttcc tacttggcag tacatctacg 360
tattagtcat cgctattagc atggtgatgc ggttttggca gtacatcaat gggcgtggat 420
agcggtttga ctcacgggga tttccaagtc tccaccccat tgacgtcaat gggagtttgt 480
tttggcacca aaatcaacgg gactttccaa aatgtcgtaa caactccgcc ccattgacgc 540
aaatgggcgg taggcgtgta cggtgggagg tctatataag cagagctccg tttagtgaac 600
gtcagatc 608
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cgacatcaag ctggcacatg gccaatgcat atcgatctat acattgaatc aatattggcc 420
attagccata ttattcattg gttatatagc ataaatcaat attggctatt ggccattgca 480
tacgttgtat ccatatcata atatgtacat ttatattggc tcatgtccaa cattaccgcc 540
atgttgacat tgattattga ctagttatta atagtaatca attacggggt cattagttca 600
tagcccatat atggagttcc gcgttacata acttacggta aatggcccgc ctggctgacc 660
gcccaacgac ccccgcccat tgacgtcaat aatgacgtat gttcccatag taacgccaat 720
agggactttc cattgacgtc aatgggtgga gtatttacgg taaactgccc acttggcagt 780
acatcaagtg tatcatatgc caagtacgcc ccctattgac gtcaatgacg gtaaatggcc 840
cgcctggcat tatgcccagt acatgacctt atgggacttt cctacttggc agtacatcta 900
cgtattagtc atcgctatta ccatggtgat gcggttttgg cagtacatca atgggcgtgg 960
atagcggttt gactcacggg gatttccaag tctccacccc attgacgtca atgggagttt 1020
gttttggcac caaaatcaac gggactttcc aaaatgtcgt aacaactccg ccccattgac 1080
gcaaatgggc ggtaggcgtg tacggtggga ggtctatata agcagagctc gtttagtgaa 1140
ccgtcagatc gcctggagac gccatccacg ctgttttgac ctccatagaa gacaccggga 1200
ccgatccagc ctccgcggcc gggaacggtg cattggaacg cggattcccc gtgccaagag 1260
tgacgtaagt accgcctata gagtctatag gcccaccccc ttggcttctt atgcatgcta 1320
tactgttttt ggcttggggt ctatacaccc ccgcttcctc atgttatagg tgatggtata 1380
gcttagccta taggtgtggg ttattgacca ttattgacca ctcccctatt ggtgacgata 1440
ctttccatta ctaatccata acatggctct ttgccacaac tctctttatt ggctatatgc 1500
caatacactg tccttcagag actgacacgg actctgtatt tttacaggat ggggtctcat 1560
ttattattta caaattcaca tatacaacac caccgtcccc agtgcccgca gtttttatta 1620
aacataacgt gggatctcca cgcgaatctc gggtacgtgt tccggacatg ggctcttctc 1680
cggtagcggc ggagcttcta catccgagcc ctgctcccat gcctccagcg actcatggtc 1740
gctcggcagc tccttgctcc taacagtgga ggccagactt aggcacagca cgatgcccac 1800
caccaccagt gtgccgcaca aggccgtggc ggtagggtat gtgtctgaaa atgagctcgg 1860
ggagcgggct tgcaccgctg acgcatttgg aagacttaag gcagcggcag aagaagatgc 1920
aggcagctga gttgttgtgt tctgataaga gtcagaggta actcccgttg cggtgctgtt 1980
aacggtggag ggcagtgtag tctgagcagt actcgttgct gccgcgcgcg ccaccagaca 2040
taatagctga cagactaaca gactgttcct ttccatgggt cttttctgca gtcaccgtcc 2100
ttgacacggt ttaaacgccg ccacc 2125
<210> 4
<211> 575
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 4
cccgggctgg gctgagaccc gcagaggaag acgctctagg gatttgtccc ggactagcga 60
gatggcaagg ctgaggacgg gaggctgatt gagaggcgaa ggtacaccct aatctcaata 120
caacctttgg agctaagcca gcaatggtag agggaagatt ctgcacgtcc cttccaggcg 180
gcctccccgt caccaccccc cccaacccgc cccgaccgga gctgagagta attcatacaa 240
aaggactcgc ccctgccttg gggaatccca gggaccgtcg ttaaactccc actaacgtag 300
aacccagaga tcgctgcgtt cccgccccct cacccgcccg ctctcgtcat cactgaggtg 360
gagaagagca tgcgtgaggc tccggtgccc gtcagtgggc agagcgcaca tcgcccacag 420
tccccgagaa gttgggggga ggggtcggca attgaaccgg tgcctagaga aggtggcgcg 480
gggtaaactg ggaaagtgat gtcgtgtact ggctccgcct ttttcccgag ggtgggggag 540
aaccgtatat aagtgcagta gtcgccgtga acgtt 575
<210> 5
<211> 1571
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 5
cccgggctgg gctgagaccc gcagaggaag acgctctagg gatttgtccc ggactagcga 60
gatggcaagg ctgaggacgg gaggctgatt gagaggcgaa ggtacaccct aatctcaata 120
caacctttgg agctaagcca gcaatggtag agggaagatt ctgcacgtcc cttccaggcg 180
gcctccccgt caccaccccc cccaacccgc cccgaccgga gctgagagta attcatacaa 240
aaggactcgc ccctgccttg gggaatccca gggaccgtcg ttaaactccc actaacgtag 300
aacccagaga tcgctgcgtt cccgccccct cacccgcccg ctctcgtcat cactgaggtg 360
gagaagagca tgcgtgaggc tccggtgccc gtcagtgggc agagcgcaca tcgcccacag 420
tccccgagaa gttgggggga ggggtcggca attgaaccgg tgcctagaga aggtggcgcg 480
gggtaaactg ggaaagtgat gtcgtgtact ggctccgcct ttttcccgag ggtgggggag 540
aaccgtatat aagtgcagta gtcgccgtga acgttctttt tcgcaacggg tttgccgcca 600
gaacacaggt aagtgccgtg tgtggttccc gcgggcctgg cctctttacg ggttatggcc 660
cttgcgtgcc ttgaattact tccacgcccc tggctgcagt acgtgattct tgatcccgag 720
cttcgggttg gaagtgggtg ggagagttcg aggccttgcg cttaaggagc cccttcgcct 780
cgtgcttgag ttgaggcctg gcctgggcgc tggggccgcc gcgtgcgaat ctggtggcac 840
cttcgcgcct gtctcgctgc tttcgataag tctctagcca tttaaaattt ttgatgacct 900
gctgcgacgc tttttttctg gcaagatagt cttgtaaatg cgggccaaga tctgcacact 960
ggtatttcgg tttttggggc cgcgggcggc gacggggccc gtgcgtccca gcgcacatgt 1020
tcggcgaggc ggggcctgcg agcgcggcca ccgagaatcg gacgggggta gtctcaagct 1080
ggccggcctg ctctggtgcc tggcctcgcg ccgccgtgta tcgccccgcc ctgggcggca 1140
aggctggccc ggtcggcacc agttgcgtga gcggaaagat ggccgcttcc cggccctgct 1200
gcagggagct caaaatggag gacgcggcgc tcgggagagc gggcgggtga gtcacccaca 1260
caaaggaaaa gggcctttcc gtcctcagcc gtcgcttcat gtgactccac ggagtaccgg 1320
gcgccgtcca ggcacctcga ttagttctcg atcttttgga gtacgtcgtc tttaggttgg 1380
ggggaggggt tttatgcgat ggagtttccc cacactgagt gggtggagac tgaagttagg 1440
ccagcttggc acttgatgta attctccttg gaatttgccc tttttgagtt tggatcttgg 1500
ttcattctca agcctcagac agtggttcaa agtttttttc ttccatttca ggtggtttaa 1560
acgccgccac c 1571
<210> 6
<211> 1653
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> human elongation factor 1 alpha promoter with Intron A and with
optimized 5'UTR
<400> 6
cccgggctgg gctgagaccc gcagaggaag acgctctagg gatttgtccc ggactagcga 60
gatggcaagg ctgaggacgg gaggctgatt gagaggcgaa ggtacaccct aatctcaata 120
caacctttgg agctaagcca gcaatggtag agggaagatt ctgcacgtcc cttccaggcg 180
gcctccccgt caccaccccc cccaacccgc cccgaccgga gctgagagta attcatacaa 240
aaggactcgc ccctgccttg gggaatccca gggaccgtcg ttaaactccc actaacgtag 300
aacccagaga tcgctgcgtt cccgccccct cacccgcccg ctctcgtcat cactgaggtg 360
gagaagagca tgcgtgaggc tccggtgccc gtcagtgggc agagcgcaca tcgcccacag 420
tccccgagaa gttgggggga ggggtcggca attgaaccgg tgcctagaga aggtggcgcg 480
gggtaaactg ggaaagtgat gtcgtgtact ggctccgcct ttttcccgag ggtgggggag 540
aaccgtatat aagtgcagta gtcgccgtga acgttctttt tcgcaacggg tttgccgcca 600
gaacacaggt aagtgccgtg tgtggttccc gcgggcctgg cctctttacg ggttatggcc 660
cttgcgtgcc ttgaattact tccacgcccc tggctgcagt acgtgattct tgatcccgag 720
cttcgggttg gaagtgggtg ggagagttcg aggccttgcg cttaaggagc cccttcgcct 780
cgtgcttgag ttgaggcctg gcctgggcgc tggggccgcc gcgtgcgaat ctggtggcac 840
cttcgcgcct gtctcgctgc tttcgataag tctctagcca tttaaaattt ttgatgacct 900
gctgcgacgc tttttttctg gcaagatagt cttgtaaatg cgggccaaga tctgcacact 960
ggtatttcgg tttttggggc cgcgggcggc gacggggccc gtgcgtccca gcgcacatgt 1020
tcggcgaggc ggggcctgcg agcgcggcca ccgagaatcg gacgggggta gtctcaagct 1080
ggccggcctg ctctggtgcc tggcctcgcg ccgccgtgta tcgccccgcc ctgggcggca 1140
aggctggccc ggtcggcacc agttgcgtga gcggaaagat ggccgcttcc cggccctgct 1200
gcagggagct caaaatggag gacgcggcgc tcgggagagc gggcgggtga gtcacccaca 1260
caaaggaaaa gggcctttcc gtcctcagcc gtcgcttcat gtgactccac ggagtaccgg 1320
gcgccgtcca ggcacctcga ttagttctcg atcttttgga gtacgtcgtc tttaggttgg 1380
ggggaggggt tttatgcgat ggagtttccc cacactgagt gggtggagac tgaagttagg 1440
ccagcttggc acttgatgta attctccttg gaatttgccc tttttgagtt tggatcttgg 1500
ttcattctca agcctcagac agtggttcaa agtttttttc ttccatttca ggtgtcgtga 1560
ggaattagct ctgggagagg agcccagcac tagaagtcgg cggtgtttcc attcggtgat 1620
cagcactgaa cacagaggaa gcttgccgcc acc 1653
<210> 7
<211> 2473
<212> DNA
<213> Rattus norvegicus
<400> 7
gatattttta tggaaatttt aaaaaattct ggtaagctat ttaaaaaaat gaactttatt 60
atgaaactat tgcccttttc tctaaaaaac aacacaattt cacggaatat cctatgatta 120
attatgacct tttagccagt tcccatatta agaatgagtt atagatgact ctctttaaaa 180
aattattcga tttaaaccat ctgttttaaa gcacagcatt tgtgaataat gtgaagaact 240
tagaagtata atctactcca aggtctgatg tatttttcaa ggccacgtta aagtgtatgc 300
ttgtaacaga gtgcttacat tcaagccaaa tgttaatata acaatcctga attcgtacat 360
aatgtgaata agacactcaa ctctatttaa atccagatct aaatagttac ttttatctaa 420
atgtcaccat ctgtttctac ttagaataat aaacttctta aaggtcacgt atcgggctga 480
ttataaatca ttataattat aacaaaacag atgatttgtt taaaggtcac atcccgttcc 540
gtggtctttt tagtcgaaat aactattaat cttcattatg tttctgagaa agtttaaata 600
tcacgatttc cacccataac agtcattatg agtcagtggg agtcatactg aatcagggta 660
ttttaactgg aaattttttg aaaaacatga gtttttctta aggtcaacat ctggtcttat 720
aaacagaact gagatttatg gccggtaatt accactggac gatttcccgg gaaatcgcta 780
tgggaacggc ccgttttgca acttctttga ccaaaatata tcgagttaag caacttttaa 840
ggccaagtca ctatgactat gccaaataaa gcaactatta aggtcatttc actatggaaa 900
cacccaattc agcaacattg taagccaaat ctccatagaa acctcataag tcagccaaaa 960
gtcaacgacc taccatctgt ttctgcttat ttctctaatt ttaattgcag actttgtcat 1020
tttatgttcc tcttattctg agaatacgtg acgcccgctc gttaaggaca ccgaaactgc 1080
ataagagtca cgttgactca gatgacctcg acatctggtc tggtttttct gccaattttt 1140
cgtctaaact gtggaaaatc cccacagatg acctacaaaa ctccgatttc tattggacga 1200
tgaccgtcag acgtaggtat aaatctccta acgccgttcg ggcagtcaca gtcttcggat 1260
cggacgccgt ggaacgcagt tctcagcgaa gaaggacacc gcccgactcc agaagacacc 1320
gctgcccgaa gaagagaaga cttcatcggt aagagaccca gcttctcctc cccggagctt 1380
cggccacgcc gctccacacc cgggaaccga ggcttcggag cccgataccc ggacagaagc 1440
ttctccccgg ccgctccaca tcagggagcc ttgaccggcg agcctgctat ccgggtagag 1500
actgtcctgc ggccgcttca gcagctccac gatcgacgac tgtgaccgtt gagcccgccg 1560
tttaggcaga ggctccgctt caactaccct accgacacat tcgcggttct tcctccagaa 1620
catcttaccc tctactcggc cactctacaa ggaccggtaa gcaattttta tatactagac 1680
ttaaatgttt ctatgatcat tatgtggtga tggttctgtg tatgaagaga gctaggtgga 1740
ggctatcttt cgcttcggtg atggaacact actcttacaa tggcggctct aatgacggtt 1800
ttctcaacat cggtggcggc tctaattacg gttctctcaa catcggtggt ggtcttcgca 1860
tgcgagctct agattttttt tatctgtaaa ataagattga agatggttga ctgtgtatca 1920
attctttttc ataggcatca gatcttgtca accgttatta atctttagga tcagatgaac 1980
ttgcgagctc gatatctaga atagaatccc cgtgactgct aagatcatct ccgttcatac 2040
accagatgtt acaggccacg gctaccatta tgaatccaaa catgaacaga attgccagaa 2100
tggtgctcaa tggttgtatc catctcgctg gtctattttc tctcaccgac gagaccccaa 2160
catcgagagt tccgtttatt tcatgagtcg accttttagt tcgtgattta ttttctgtgt 2220
taagaaaatc agtgagatca attattgtca gtctatacga ttacaataat gtctgaatta 2280
tcgacgtgca taagatcgtc tcacccggcg cagattccaa cagatctttg tcgccatgcc 2340
ttccgttaga aaggtagtat agtaatatga taccagcaat gcacagaatc gaacatttga 2400
taacaatttt gttgatgtcg tatatctgtt aaaaattaat aaatatatta cagtcagttt 2460
aaacgccgcc acc 2473
<210> 8
<211> 129
<212> DNA
<213> Simian virus 40
<400> 8
aacttgttta ttgcagctta taatggttac aaataaagca atagcatcac aaatttcaca 60
aataaagcat ttttttcacc attctagttg tggtttgtcc aaactcatca atgtatctta 120
tcatgtctg 129
<210> 9
<211> 225
<212> DNA
<213> Bos taurus
<400> 9
ctgtgccttc tagttgccag ccatctgttg tttgcccctc ccccgtgcct tccttgaccc 60
tggaaggtgc cactcccact gtcctttcct aataaaatga ggaaattgca tcgcattgtc 120
tgagtaggtg tcattctatt ctggggggtg gggtggggca ggacagcaag ggggaggatt 180
gggaagacaa tagcaggcat gctggggatg cggtgggctc tatgg 225
<210> 10
<211> 73
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 10
caggataata tatggtaggg ttcatagcca gagtaacctt tttttttaat ttttatttta 60
ttttattttt gag 73
<210> 11
<211> 288
<212> DNA
<213> Simian virus 40
<400> 11
agtcagcaac caggtgtgga aagtccccag gctccccagc aggcagaagt atgcaaagca 60
tgcatctcaa ttagtcagca accatagtcc cgcccctaac tccgcccatc ccgcccctaa 120
ctccgcccag ttccgcccat tctccgcccc atggctgact aatttttttt atttatgcag 180
aggccgaggc cgcctctgcc tctgagctat tccagaagta gtgaggaggc ttttttggag 240
gcctaggctt ttgcaaaaag ctcccgggag cttgtatatc cattttcg 288
<210> 12
<211> 81
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 12
catggcttcc cgccggaggt ggaggagcag gatgatggca cgctgcccat gtcttgtgcc 60
caggagagcg ggatggaccg t 81
<210> 13
<211> 798
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> green fluorescent protein encoding nucleic acid
<400> 13
atggtgagca agggcgagga gctgttcacc ggggtggtgc ccatcctggt cgagctggac 60
ggcgacgtaa acggccacaa gttcagcgtg tccggcgagg gcgagggcga tgccacctac 120
ggcaagctga ccctgaagtt catctgcacc accggcaagc tgcccgtgcc ctggcccacc 180
ctcgtgacca ccctgaccta cggcgtgcag tgcttcagcc gctaccccga ccacatgaag 240
cagcacgact tcttcaagtc cgccatgccc gaaggctacg tccaggagcg caccatcttc 300
ttcaaggacg acggcaacta caagacccgc gccgaggtga agttcgaggg cgacaccctg 360
gtgaaccgca tcgagctgaa gggcatcgac ttcaaggagg acggcaacat cctggggcac 420
aagctggagt acaactacaa cagccacaac gtctatatca tggccgacaa gcagaagaac 480
ggcatcaagg tgaacttcaa gatccgccac aacatcgagg acggcagcgt gcagctcgcc 540
gaccactacc agcagaacac ccccatcggc gacggccccg tgctgctgcc cgacaaccac 600
tacctgagca cccagtccgc cctgagcaaa gaccccaacg agaagcgcga tcacatggtc 660
ctgctggagt tcgtgaccgc cgccgggatc actctcggca tggacgagct gtacaagtcc 720
ggactcagat ctcgagctca agcttcgaat tctgcagtcg acggtaccgc gggcccggga 780
tccaccggat ctagatga 798
<210> 14
<211> 795
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> neomycin selection marker
<400> 14
atgattgaac aagatggatt gcacgcaggt tctccggccg cttgggtgga gaggctattc 60
ggctatgact gggcacaaca gacaatcggc tgctctgatg ccgccgtgtt ccggctgtca 120
gcgcaggggc gcccggttct ttttgtcaag accgacctgt ccggtgccct gaatgaactg 180
caggacgagg cagcgcggct atcgtggctg gccacgacgg gcgttccttg cgcagctgtg 240
ctcgacgttg tcactgaagc gggaagggac tggctgctat tgggcgaagt gccggggcag 300
gatctcctgt catctcacct tgctcctgcc gagaaagtat ccatcatggc tgatgcaatg 360
cggcggctgc atacgcttga tccggctacc tgcccattcg accaccaagc gaaacatcgc 420
atcgagcgag cacgtactcg gatggaagcc ggtcttgtcg atcaggatga tctggacgaa 480
gagcatcagg ggctcgcgcc agccgaactg ttcgccaggc tcaaggcgcg catgcccgac 540
ggcgaggatc tcgtcgtgac ccatggcgat gcctgcttgc cgaatatcat ggtggaaaat 600
ggccgctttt ctggattcat cgactgtggc cggctgggtg tggcggaccg ctatcaggac 660
atagcgttgg ctacccgtga tattgctgaa gagcttggcg gcgaatgggc tgaccgcttc 720
ctcgtgcttt acggtatcgc cgctcccgat tcgcagcgca tcgccttcta tcgccttctt 780
gacgagttct tctga 795
<210> 15
<211> 1677
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> GFP-PEST-NEO fusion polypeptide encoding nucleic acid
<400> 15
atggtgagca agggcgagga gctgttcacc ggggtggtgc ccatcctggt cgagctggac 60
ggcgacgtaa acggccacaa gttcagcgtg tccggcgagg gcgagggcga tgccacctac 120
ggcaagctga ccctgaagtt catctgcacc accggcaagc tgcccgtgcc ctggcccacc 180
ctcgtgacca ccctgaccta cggcgtgcag tgcttcagcc gctaccccga ccacatgaag 240
cagcacgact tcttcaagtc cgccatgccc gaaggctacg tccaggagcg caccatcttc 300
ttcaaggacg acggcaacta caagacccgc gccgaggtga agttcgaggg cgacaccctg 360
gtgaaccgca tcgagctgaa gggcatcgac ttcaaggagg acggcaacat cctggggcac 420
aagctggagt acaactacaa cagccacaac gtctatatca tggccgacaa gcagaagaac 480
ggcatcaagg tgaacttcaa gatccgccac aacatcgagg acggcagcgt gcagctcgcc 540
gaccactacc agcagaacac ccccatcggc gacggccccg tgctgctgcc cgacaaccac 600
tacctgagca cccagtccgc cctgagcaaa gaccccaacg agaagcgcga tcacatggtc 660
ctgctggagt tcgtgaccgc cgccgggatc actctcggca tggacgagct gtacaagtcc 720
ggactcagat ctcgagctca agcttcgaat tctgcagtcg acggtaccgc gggcccggga 780
tccaccggat ctagacatgg cttcccgccg gaggtggagg agcaggatga tggcacgctg 840
cccatgtctt gtgcccagga gagcgggatg gaccgtagtt taaacattga acaagatgga 900
ttgcacgcag gttctccggc cgcttgggtg gagaggctat tcggctatga ctgggcacaa 960
cagacaatcg gctgctctga tgccgccgtg ttccggctgt cagcgcaggg gcgcccggtt 1020
ctttttgtca agaccgacct gtccggtgcc ctgaatgaac tgcaggacga ggcagcgcgg 1080
ctatcgtggc tggccacgac gggcgttcct tgcgcagctg tgctcgacgt tgtcactgaa 1140
gcgggaaggg actggctgct attgggcgaa gtgccggggc aggatctcct gtcatctcac 1200
cttgctcctg ccgagaaagt atccatcatg gctgatgcaa tgcggcggct gcatacgctt 1260
gatccggcta cctgcccatt cgaccaccaa gcgaaacatc gcatcgagcg agcacgtact 1320
cggatggaag ccggtcttgt cgatcaggat gatctggacg aagagcatca ggggctcgcg 1380
ccagccgaac tgttcgccag gctcaaggcg cgcatgcccg acggcgagga tctcgtcgtg 1440
acccatggcg atgcctgctt gccgaatatc atggtggaaa atggccgctt ttctggattc 1500
atcgactgtg gccggctggg tgtggcggac cgctatcagg acatagcgtt ggctacccgt 1560
gatattgctg aagagcttgg cggcgaatgg gctgaccgct tcctcgtgct ttacggtatc 1620
gccgctcccg attcgcagcg catcgccttc tatcgccttc ttgacgagtt cttctga 1677
<210> 16
<211> 583
<212> DNA
<213> Encephalomyocarditis virus
<400> 16
ggcgcgcccc cctctccctc ccccccccct aacgttactg gccgaagccg cttggaataa 60
ggccggtgtg cgtttgtcta tatgtgattt tccaccatat tgccgtcttt tggcaatgtg 120
agggcccgga aacctggccc tgtcttcttg acgagcattc ctaggggtct ttcccctctc 180
gccaaaggaa tgcaaggtct gttgaatgtc gtgaaggaag cagttcctct ggaagcttct 240
tgaagacaaa caacgtctgt agcgaccctt tgcaggcagc ggaacccccc acctggcgac 300
aggtgcctct gcggccaaaa gccacgtgta taagatacac ctgcaaaggc ggcacaaccc 360
cagtgccacg ttgtgagttg gatagttgtg gaaagagtca aatggctctc ctcaagcgta 420
ttcaacaagg ggctgaagga tgcccagaag gtaccccatt gtatgggatc tgatctgggg 480
cctcggtgca catgctttac atgtgtttag tcgaggttaa aaaaacgtct aggccccccg 540
aaccacgggg acgtggtttt cctttgaaaa acacgatgga tcc 583
<210> 17
<211> 655
<212> DNA
<213> Enterovirus 71
<400> 17
ggcgcgcccc cgaagtaact tagaagctgt aaatcaacga tcaatagcag gtgtggcaca 60
ccagtcatac cttgatcaag cacttctgtt tccccggact gagtatcaat aggctgctcg 120
cgcggctgaa ggagaaaacg ttcgttaccc gaccaactac ttcgagaagc ttagtaccac 180
catgaacgag gcagggtgtt tcgctcagca caaccccagt gtagatcagg ctgatgagtc 240
actgcaaccc ccatgggcga ccatggcagt ggctgcgttg gcggcctgcc catggagaaa 300
tccatgggac gctctaattc tgacatggtg tgaagagcct attgagctag ctggtagtcc 360
tccggcccct gaatgcggct aatcctaact gcggagcaca tgctcacaaa ccagtgggtg 420
gtgtgtcgta acgggcaact ctgcagcgga accgactact ttgggtgtcc gtgtttcctt 480
ttattcctat attggctgct tatggtgaca atcaaaaagt tgttaccata tagctattgg 540
attggccatc cggtgtgcaa cagggcaatt gtttacctat ttattggttt tgtaccatta 600
tcactgaagt ctgtgatcac tctcaaattc attttgaccc tcaacacaat caaac 655
Claims (52)
- 하기를 포함하는 발현 벡터:
- 항체 경쇄 발현 카세트,
- 항체 중쇄 발현 카세트, 및
- 선별 마커 발현 카세트,
여기에서 발현 카세트는 단방향 배열되어 있고,
여기에서 발현 카세트는 5' 에서 3' 서열의 항체 중쇄 발현 카세트, 항체 경쇄 발현 카세트 및 선별 마커 발현 카세트로 배열되어 있고,
상기 발현 카세트 모두는 인간 CMV 프로모터를 포함하고,
1, 2, 또는 모든 3 개의 발현 카세트가 소 성장 호르몬 polyA 신호 서열을 포함하고,
1, 2, 또는 모든 3 개의 발현 카세트가 polyA 신호 서열 뒤에 인간 가스트린 종료자 서열을 포함함. - 제 1 항에 있어서, 1, 2, 또는 모든 3 개의 발현 카세트가 SV40 프로모터를 포함하는 것을 특징으로 하는 발현 벡터.
- 제 1 항에 있어서, 항체 경쇄 인코딩 핵산 및/또는 항체 중쇄 인코딩 핵산이 하나 이상의 인트론을 포함하는 것을 특징으로 하는 발현 벡터.
- 제 1 항에 있어서, 항체 경쇄 인코딩 핵산 및/또는 항체 중쇄 인코딩 핵산이 cDNA 인 것을 특징으로 하는 발현 벡터.
- 제 1 항 내지 제 4 항 중 어느 한 항에 있어서, 항체의 재조합 생산을 위해 사용되는 것을 특징으로 하는 발현 벡터.
- 제 1 항 내지 제 4 항 중 어느 한 항에 있어서, 안정적 세포주의 생성을 위해 사용되는 것을 특징으로 하는 발현 벡터.
- 제 1 항 내지 제 4 항 중 어느 한 항에 있어서, 생산 세포주의 생성을 위해 사용되는 것을 특징으로 하는 발현 벡터.
- 하기 단계를 포함하는 항체 생산 방법:
- 제 1 항 내지 제 4 항 중 어느 한 항에 따른 발현 벡터로 트랜스펙션된 진핵 세포를 배양하는 단계, 및
- 세포 또는 배양 배지로부터 항체를 회수하는 단계. - 제 1 항 내지 제 4 항 중 어느 한 항에 있어서, 발현 벡터가 이중특이적 항체를 인코딩하는 것을 특징으로 하는 발현 벡터.
- 제 9 항에 있어서, 이중특이적 항체가 제 1 항원 또는 제 1 항원 상의 제 1 에피토프에 특이적으로 결합하는 제 1 결합 특이성 또는 결합 자리를 갖고, 이중특이적 항체가 제 2 항원 또는 제 2 항원 상의 제 2 에피토프에 특이적으로 결합하는 제 2 결합 특이성 또는 결합 자리를 갖는 것을 특징으로 하는 발현 벡터.
- 제 1 항 내지 제 4 항 중 어느 한 항에 있어서, 하기를 포함하는 것을 특징으로 하는 발현 벡터:
- 5' 에서 3' 방향으로 프로모터, 제 1 항체 경쇄 인코딩 핵산, polyA 신호 서열, 및 임의로 종료자 서열을 포함하는 제 1 발현 카세트,
- 5' 에서 3' 방향으로 프로모터, 제 2 항체 경쇄 인코딩 핵산, polyA 신호 서열, 및 임의로 종료자 서열을 포함하는 제 2 발현 카세트,
- 5' 에서 3' 방향으로 프로모터, 제 1 항체 중쇄 인코딩 핵산, polyA 신호 서열, 및 임의로 종료자 서열을 포함하는 제 3 발현 카세트,
- 5' 에서 3' 방향으로 프로모터, 제 2 항체 중쇄 인코딩 핵산, polyA 신호 서열, 및 임의로 종료자 서열을 포함하는 제 4 발현 카세트,
여기에서 적어도 하나의 발현 카세트는 인간 가스트린 종료자 서열을 포함함,
또는
- 5' 에서 3' 방향으로 프로모터, 항체 경쇄 인코딩 핵산, polyA 신호 서열, 및 임의로 종료자 서열을 포함하는 제 1 발현 카세트,
- 5' 에서 3' 방향으로 프로모터, 제 1 항체 중쇄 인코딩 핵산, polyA 신호 서열, 및 임의로 종료자 서열을 포함하는 제 2 발현 카세트, 및
- 5' 에서 3' 방향으로 프로모터, 제 2 항체 중쇄 인코딩 핵산, polyA 신호 서열, 및 임의로 종료자 서열을 포함하는 제 3 발현 카세트,
여기에서 적어도 하나의 발현 카세트는 인간 가스트린 종료자 서열을 포함하고,
여기에서 항체 경쇄는 항체 중쇄 둘다에 대한 공통 경쇄임. - 제 1 항 내지 제 4 항 중 어느 한 항에 있어서, 하기를 포함하는 것을 특징으로 하는 발현 벡터:
- 항체 경쇄 발현 카세트,
- 제 1 항체 중쇄 발현 카세트,
- 제 2 항체 중쇄 발현 카세트, 및
- 선별 마커 발현 카세트,
여기에서 항체 중쇄 발현 카세트 및 항체 경쇄 발현 카세트 및 선별 마커 발현 카세트 중 하나 이상은 단방향 배열되어 있고,
여기에서 단방향 발현 카세트는 5' 에서 3' 서열의 항체 중쇄 발현 카세트, 항체 경쇄 발현 카세트 및 선별 마커 발현 카세트로 배열되어 있음. - 제 1 항 내지 제 4 항 중 어느 한 항에 있어서, 하기를 포함하는 것을 특징으로 하는 발현 벡터:
- 제 1 항체 경쇄 발현 카세트,
- 제 2 항체 경쇄 발현 카세트,
- 제 1 항체 중쇄 발현 카세트,
- 제 2 항체 중쇄 발현 카세트, 및
- 선별 마커 발현 카세트,
여기에서 항체 중쇄 발현 카세트 중 하나 및 항체 경쇄 발현 카세트 중 하나 및 선별 마커 발현 카세트는 단방향 배열되어 있고,
여기에서 단방향 발현 카세트는 5' 에서 3' 서열의 항체 중쇄 발현 카세트, 항체 경쇄 발현 카세트 및 선별 마커 발현 카세트로 배열되어 있음. - 제 9 항에 있어서, 항체 중쇄 발현 카세트 중 하나가 홀 돌연변이를 포함하는 항체 중쇄를 인코딩하는 것을 특징으로 하는 발현 벡터.
- 제 14 항에 있어서, 항체 중쇄 발현 카세트 중 하나가 놉 돌연변이를 포함하는 항체 중쇄를 인코딩하는 것을 특징으로 하는 발현 벡터.
- 제 9 항에 있어서, 항체 경쇄 발현 카세트 중 하나가 항체 경쇄 가변 도메인 및 불변 도메인으로서 항체 중쇄 CH1 도메인을 포함하는 항체 경쇄 변이체를 인코딩하고/거나, 항체 경쇄 발현 카세트 중 하나가 항체 경쇄 가변 도메인 및 불변 도메인으로서 항체 경쇄 CL 도메인을 포함하는 항체 경쇄를 인코딩하는 것을 특징으로 하는 발현 벡터.
- 제 9 항에 있어서, 항체 중쇄 발현 카세트 중 하나가 제 1 불변 도메인으로서 항체 경쇄 불변 도메인 (CL) 을 포함하는 항체 중쇄 변이체를 인코딩하고/거나, 항체 중쇄 발현 카세트 중 하나가 제 1 불변 도메인으로서 항체 중쇄 CH1 도메인을 포함하는 항체 중쇄를 인코딩하는 것을 특징으로 하는 발현 벡터.
- 제 2 항에 있어서, 항체 경쇄 인코딩 핵산 및/또는 항체 중쇄 인코딩 핵산이 cDNA 인 것을 특징으로 하는 발현 벡터.
- 제 9 항에 있어서, 하기를 포함하는 것을 특징으로 하는 발현 벡터:
- 5' 에서 3' 방향으로 프로모터, 제 1 항체 경쇄 인코딩 핵산, polyA 신호 서열, 및 임의로 종료자 서열을 포함하는 제 1 발현 카세트,
- 5' 에서 3' 방향으로 프로모터, 제 2 항체 경쇄 인코딩 핵산, polyA 신호 서열, 및 임의로 종료자 서열을 포함하는 제 2 발현 카세트,
- 5' 에서 3' 방향으로 프로모터, 제 1 항체 중쇄 인코딩 핵산, polyA 신호 서열, 및 임의로 종료자 서열을 포함하는 제 3 발현 카세트,
- 5' 에서 3' 방향으로 프로모터, 제 2 항체 중쇄 인코딩 핵산, polyA 신호 서열, 및 임의로 종료자 서열을 포함하는 제 4 발현 카세트,
여기에서 적어도 하나의 발현 카세트는 인간 가스트린 종료자 서열을 포함함,
또는
- 5' 에서 3' 방향으로 프로모터, 항체 경쇄 인코딩 핵산, polyA 신호 서열, 및 임의로 종료자 서열을 포함하는 제 1 발현 카세트,
- 5' 에서 3' 방향으로 프로모터, 제 1 항체 중쇄 인코딩 핵산, polyA 신호 서열, 및 임의로 종료자 서열을 포함하는 제 2 발현 카세트, 및
- 5' 에서 3' 방향으로 프로모터, 제 2 항체 중쇄 인코딩 핵산, polyA 신호 서열, 및 임의로 종료자 서열을 포함하는 제 3 발현 카세트,
여기에서 적어도 하나의 발현 카세트는 인간 가스트린 종료자 서열을 포함하고,
여기에서 항체 경쇄는 항체 중쇄 둘다에 대한 공통 경쇄임. - 제 9 항에 있어서, 하기를 포함하는 것을 특징으로 하는 발현 벡터:
- 항체 경쇄 발현 카세트,
- 제 1 항체 중쇄 발현 카세트,
- 제 2 항체 중쇄 발현 카세트, 및
- 선별 마커 발현 카세트,
여기에서 항체 중쇄 발현 카세트 및 항체 경쇄 발현 카세트 및 선별 마커 발현 카세트 중 하나 이상은 단방향 배열되어 있고,
여기에서 단방향 발현 카세트는 5' 에서 3' 서열의 항체 중쇄 발현 카세트, 항체 경쇄 발현 카세트 및 선별 마커 발현 카세트로 배열되어 있음. - 제 9 항에 있어서, 하기를 포함하는 것을 특징으로 하는 발현 벡터:
- 제 1 항체 경쇄 발현 카세트,
- 제 2 항체 경쇄 발현 카세트,
- 제 1 항체 중쇄 발현 카세트,
- 제 2 항체 중쇄 발현 카세트, 및
- 선별 마커 발현 카세트,
여기에서 항체 중쇄 발현 카세트 중 하나 및 항체 경쇄 발현 카세트 중 하나 및 선별 마커 발현 카세트는 단방향 배열되어 있고,
여기에서 단방향 발현 카세트는 5' 에서 3' 서열의 항체 중쇄 발현 카세트, 항체 경쇄 발현 카세트 및 선별 마커 발현 카세트로 배열되어 있음. - 제 11 항에 있어서, 항체 중쇄 발현 카세트 중 하나가 홀 돌연변이를 포함하는 항체 중쇄를 인코딩하는 것을 특징으로 하는 발현 벡터.
- 제 12 항에 있어서, 항체 중쇄 발현 카세트 중 하나가 홀 돌연변이를 포함하는 항체 중쇄를 인코딩하는 것을 특징으로 하는 발현 벡터.
- 제 13 항에 있어서, 항체 중쇄 발현 카세트 중 하나가 홀 돌연변이를 포함하는 항체 중쇄를 인코딩하는 것을 특징으로 하는 발현 벡터.
- 제 11 항에 있어서, 항체 경쇄 발현 카세트 중 하나가 항체 경쇄 가변 도메인 및 불변 도메인으로서 항체 중쇄 CH1 도메인을 포함하는 항체 경쇄 변이체를 인코딩하고/거나, 항체 경쇄 발현 카세트 중 하나가 항체 경쇄 가변 도메인 및 불변 도메인으로서 항체 경쇄 CL 도메인을 포함하는 항체 경쇄를 인코딩하는 것을 특징으로 하는 발현 벡터.
- 제 12 항에 있어서, 항체 경쇄 발현 카세트 중 하나가 항체 경쇄 가변 도메인 및 불변 도메인으로서 항체 중쇄 CH1 도메인을 포함하는 항체 경쇄 변이체를 인코딩하고/거나, 항체 경쇄 발현 카세트 중 하나가 항체 경쇄 가변 도메인 및 불변 도메인으로서 항체 경쇄 CL 도메인을 포함하는 항체 경쇄를 인코딩하는 것을 특징으로 하는 발현 벡터.
- 제 13 항에 있어서, 항체 경쇄 발현 카세트 중 하나가 항체 경쇄 가변 도메인 및 불변 도메인으로서 항체 중쇄 CH1 도메인을 포함하는 항체 경쇄 변이체를 인코딩하고/거나, 항체 경쇄 발현 카세트 중 하나가 항체 경쇄 가변 도메인 및 불변 도메인으로서 항체 경쇄 CL 도메인을 포함하는 항체 경쇄를 인코딩하는 것을 특징으로 하는 발현 벡터.
- 제 14 항에 있어서, 항체 경쇄 발현 카세트 중 하나가 항체 경쇄 가변 도메인 및 불변 도메인으로서 항체 중쇄 CH1 도메인을 포함하는 항체 경쇄 변이체를 인코딩하고/거나, 항체 경쇄 발현 카세트 중 하나가 항체 경쇄 가변 도메인 및 불변 도메인으로서 항체 경쇄 CL 도메인을 포함하는 항체 경쇄를 인코딩하는 것을 특징으로 하는 발현 벡터.
- 제 11 항에 있어서, 항체 중쇄 발현 카세트 중 하나가 제 1 불변 도메인으로서 항체 경쇄 불변 도메인 (CL) 을 포함하는 항체 중쇄 변이체를 인코딩하고/거나, 항체 중쇄 발현 카세트 중 하나가 제 1 불변 도메인으로서 항체 중쇄 CH1 도메인을 포함하는 항체 중쇄를 인코딩하는 것을 특징으로 하는 발현 벡터.
- 제 12 항에 있어서, 항체 중쇄 발현 카세트 중 하나가 제 1 불변 도메인으로서 항체 경쇄 불변 도메인 (CL) 을 포함하는 항체 중쇄 변이체를 인코딩하고/거나, 항체 중쇄 발현 카세트 중 하나가 제 1 불변 도메인으로서 항체 중쇄 CH1 도메인을 포함하는 항체 중쇄를 인코딩하는 것을 특징으로 하는 발현 벡터.
- 제 13 항에 있어서, 항체 중쇄 발현 카세트 중 하나가 제 1 불변 도메인으로서 항체 경쇄 불변 도메인 (CL) 을 포함하는 항체 중쇄 변이체를 인코딩하고/거나, 항체 중쇄 발현 카세트 중 하나가 제 1 불변 도메인으로서 항체 중쇄 CH1 도메인을 포함하는 항체 중쇄를 인코딩하는 것을 특징으로 하는 발현 벡터.
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Comment text: Divisional Application for International Patent Patent event code: PA01041R01D Patent event date: 20201119 Application number text: 1020147016980 Filing date: 20140620 |
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