KR102167826B1 - Sox2, c-Myc를 이용하여 비신경 세포로부터 직접 리프로그래밍된 유도신경줄기세포를 제조하는 방법 - Google Patents

Abstract

본 발명은 직접 리프로그래밍을 통한 비신경 세포로부터 유도된 신경줄기세포 제조 방법 및 이의 용도에 관한 것이다. 본 발명의 유도 신경 줄기세포의 생산 방법은 유도 인자로서 Sox2와 c-Myc의 2개 유도인자만을 이용하여도 비신경 세포로부터 유도 신경줄기세포를 제작할 수 있기 때문에, 기존의 4개의 인자, 5개의 유도인자를 이용한 생산 방법보다 더 효율적으로 유도 신경 줄기세포를 제작할 수 있으며, 상기 방법으로 제조된 유도신경줄기세포는 분화능 및 증식능이 우수한 바, 이를 향후 치료목적으로 활용할 수 있다.

Description

Sox2, c-Myc를 이용하여 비신경 세포로부터 직접 리프로그래밍된 유도신경줄기세포를 제조하는 방법{A method for producing directly reprogrammed induced neural stem cells from non-neuronal cells using Sox2 and c-Myc}

본 발명은 직접 리프로그래밍을 통한 비신경 세포로부터 유도된 신경줄기세포 제조 방법 및 이의 용도에 관한 것이다.

줄기세포는 일반적으로 전능 또는 만능으로 분류된다. 전능줄기세포는 전체로 분화능을 갖는 세포로서, 이는 신체에서 상이한 세포 유형 모두를 생성시킬 수 있다. 수정란 세포는 전능줄기세포의 일례이다. 만능줄기세포는 3개의 주요 배엽 또는 배아 그 자체로부터 유래하는 신체에서 임의의 세포 유형을 생성시킨다.

배아줄기세포(ESC)와 같은 만능줄기세포는 만능성, 즉 다양한 세포 유형으로 분화하는 능력을 유지하면서 신속히 증식하기 때문에 상기 배아줄기세포는 세포 이식 치료에 대해 유용하게 이용될 수 있다. 지금까지 만능줄기세포는 주로 핵 이식 및 세포 융합에 의해 생성되었다(Philos Trans R Soc Lond B Biol Sci. 363(1500): 2079-2087). 그러나, 상기 두 방법 모두는 배아줄기세포를 사용하기 때문에 연구 및 치료용 모두에 있어서 윤리적 딜레마(ethical dilemma)가 제기된다.

최근 유도 만능줄기세포(induced, pluripotent stem cell, iPSC)를 발견함에 따라 배아줄기세포를 사용함에 따른 이러한 문제점을 극복할 수 있게 되었다. "유도 만능줄기세포(iPSC)"는 배아줄기세포(ESCs)와 비슷한 특성을 나타내는 세포이다. 유도 만능줄기세포는 2006년에 마우스 섬유아세포(Cell 126: 663-676 (2006)) 및 2007년에는 인간 섬유아세포(Science 318: 1917-1920 (2007),)로부터 지정 인자(defined factor)들의 발현을 증대시킴으로써 최초로 생성되었다. 이들 연구에서는 성숙한 체세포의 iPSC로의 리프로그래밍을 개시하기 위해 Oct-3/4, Sox2, Klf4 및 c-Myc를 포함하고; Oct4, Sox2, Nanog 및 Lin28을 사용하였다. 그러나, iPSC는 배아줄기세포에서처럼 테라토마(teratoma)라는 암이 발생함과 동시에 생체에 이식시 분화조절이 잘 되질 않아, 원하는 세포로의 생체 내 전환이 되지 않는다는 한계를 가지고 있다.

따라서, 이러한 한계를 극복하기 위해 최근에는 직접적인 유도법 또는 직접 리프로그래밍법(Direct Conversion/reprograming)을 통해 특정 lineage의 세포로 분화시키는 기술이 주목받고 있다. 해당 기술은 완전히 분화가 끝난 세포, 즉, 섬유아세포에 특정 lineage 특이 유전자 등을 도입하여 전분화능(pluripotent) 상태를 거치지 않고 직접 특정세포를 유도하는 기술로 전분화능 세포의 종양 형성(teratoma) 위험을 배제할 수 있는 기술이다.

특히 한번 손상되면 영구적인 데미지를 받을 수 있는 신경세포의 경우 세계 여러 연구진들이 활발하게 직접 리프로그래밍을 시도하였다. 하지만 자기재생능 없는 유도 신경세포(induced neurons)는 체외에서 일정기간 이상 배양이 어렵고 따라서 충분한 양의 세포를 확보할 수 없기 때문에 직접 리프로그래밍에 관여하는 분자 세포학적 메커니즘을 비롯하여 세포치료에 필요한 충분한 양의 세포를 얻어내는 것이 현실적으로 불가능하다.

이러한 배경 하에, 본 발명자들은 유전적으로 안전하면서도 우수한 분화능을 갖는 유도신경줄기세포를 제조하는 방법을 개발하고자 예의 노력한 결과, Sox2 및 c-Myc가 포함된 바이러스의 MOI를 정밀하게 조절하여 Sox2 및 c-Myc의 도입만으로도 유도신경줄기세포를 제조할 수 있다는 사실을 발견하였으며, 제조된 유도신경줄기세포의 안정성 및 분화능을 확인함으로써 본 발명을 완성하였다.

본 발명의 하나의 목적은 (a) 분리된 세포에 Sox2 및 c-Myc을 도입하는 단계; 및 (b) 상기 (a)단계의 세포를 배양하여 분리된 세포로부터 계통이 전환된 세포로 직접 리프로그래밍을 유도하는 단계를 포함하는, 신경줄기세포 제조방법을 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 상기 방법에 따라 제조된 신경줄기세포를 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 상기 방법에 따라 제조된 신경줄기세포를 유효성분으로 포함하는, 세포치료제를 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 상기 방법에 따라 제조된 신경줄기세포를 유효성분으로 포함하는, 신경계질환 치료 또는 예방용 약학적 조성물을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 상기 방법에 따라 제조된 신경줄기세포 또는 이로부터 분화된 신경세포에 후보물질을 처리하여, 상기 신경줄기세포가 유래된 개체에 맞춤형인 신경계질환 치료제를 확인하는 단계를 포함하는, 개인 맞춤형 신경계 질환 치료제의 스크리닝 방법을 제공한다.

본 출원에서 개시된 각각의 설명 및 실시형태는 각각의 다른 설명 및 실시 형태에도 적용될 수 있다. 즉, 본 출원에서 개시된 다양한 요소들의 모든 조합이 본 출원의 범주에 속한다. 또한, 하기 기술된 구체적인 서술에 의하여 본 출원의 범주가 제한된다고 볼 수 없다.

본 발명의 목적을 달성하기 위한 하나의 양태는 (a) 분리된 세포에 Sox2 및 c-Myc을 도입하는 단계; 및 (b) 상기 (a) 단계의 세포를 배양하여 분리된 세포로부터 계통이 전환된 세포로 직접 리프로그래밍을 유도하는 단계를 포함하는, 신경줄기세포 제조방법을 제공하는 것이다.

본 발명에서 (a) 단계는 분리된 세포에 Sox2 및 c-Myc를 도입하는 단계이다.

본 발명의 용어, “분리된 세포”는 특별한 제한은 없으며, 구체적으로는 체세포(Somatic cell), 생식세포 또는 전구세포(Progenitor cell) 등 이미 계통(Lineage)이 특정된 세포일 수 있으며, 성체줄기세포, 골수세포, 중배엽 줄기세포 등 분화능이 한정된 줄기세포일 수 있다.

본 발명의 분리된 세포에는 생체내 또는 생체외의 세포가 모두 포함될 수 있으며, 구체적으로, 생체에서 분리된 세포일 수 있다. 본 발명에서 “체세포”는 생식세포를 제외한 동·식물을 구성하는 분화가 완결된 모든 세포를 뜻하며, 본 발명의 체세포는 신경세포를 제외한 체세포일 수 있다.

또한, 상기 "전구세포"는 자손에 해당하는 세포가 특정 분화 형질을 발현하는 것으로 밝혀진 경우, 분화 형질을 발현하지 않으나, 그 분화 운명(Fate)을 가지고 있는 모세포를 말한다.

본 발명의 "성체줄기세포"는 발생과정이 진행되어 배아의 각 장기가 형성되는 단계 혹은 성체단계에서 나타나는 줄기세포를 의미하며, 이는 그 분화능이 일반적으로 특정 조직을 구성하는 세포로만 한정된다. 구체적으로, 성체줄기세포는 유방, 골수, 제대혈, 혈액, 간, 피부, 위장관, 태반, 및 자궁 등으로 구성된 군에서 유래할 수 있으며, 본 발명의 성체줄기세포는 신경줄기세포를 제외한 성체줄기세포일 수 있다.

또한, 상기 성체줄기세포는 중간엽 줄기세포일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 본 발명의 "중간엽 줄기세포”란 연골, 뼈, 지방, 골수간질, 근육, 신경, 피부 등을 만드는데 원조가 되는 세포로서, 성인에서는 일반적으로 골수에 머물러 있지만 제대, 제대혈, 말초혈액, 기타 조직 등으로부터도 수득할 수 있는 세포를 의미한다. 구체적으로는 제대, 제대혈, 골수, 지방, 근육, 피부, 양막 및 태반으로 구성된 군에서 선택되는 세포 유래인 것일 수 있으나 이에 제한되는 것은 아니며, 본 발명의 중간엽 줄기세포는 제대혈 중간엽 줄기세포일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

또한, 상기 분리된 세포는 비신경 세포일 수 있다. 본 발명에서 "비신경 세포"는 신경세포가 아닌 모든 분화 또는 미분화된 세포를 포함하며, 본 발명의 표적세포 역할을 한다. 본 발명의 비신경 세포는 인간, 원숭이, 돼지, 말, 소, 양, 개, 고양이, 생쥐 및 토끼 등의 다양한 동물로부터 유래한 세포일 수 있으며, 구체적으로는 인간으로부터 유래한 세포일 수 있으나, 이에 의하여 유도 신경줄기세포로 리프로그래밍시킬 수 있는 세포가 제한되는 것은 아니다.

본 발명의 일 실시예에서는, 비신경 세포인 섬유아세포(실시예 1), 니만-피크병(Niemann-Pick disease) 유래 섬유아세포 및 제대혈 유래 중간엽줄기세포(실시예 2)에 Sox2 및 c-Myc를 도입하여 신경줄기세포를 제작하였다.

본 발명에서 사용된 비신경세포로서, 섬유아세포는 체세포의 대표적인 실시예이며, 제대혈 유래 중간엽줄기세포는 성체줄기세포의 대표적인 실시예인 바, 이러한 결과는 Sox2 및 c-Myc를 리프로그래밍 유도인자로서 사용하여 체세포뿐만 아니라 성체줄기세포 역시 유도 신경줄기세포로 효과적으로 리프로그래밍시킬 수 있음을 나타낸다.

본 발명의 “Sox2” 유전자는 SRY(Sex determining region Y)-box2 유전자라고도 하며, 미분화된 배아줄기 세포에서 전분화능을 유지하는 데 필수적인 전사인자로 알려져 있고, 신경줄기세포의 자기복제에 관여하는 유전자로 알려져 있다.

본 발명의 “c-Myc” 유전자는 핵 내 DNA 결합 단백질을 코딩하는 원형 암 유전자의 하나로, 세포 증식에 관여한다.

본 발명의 Sox2 유전자 및 c-Myc 유전자 또는 이로부터 발현되는 단백질은 인간 또는 쥐 등 동물 유래의 모든 SOX2 및 c-Myc를 포함하며, 구체적으로는 인간으로부터 유래된 Sox2 및 c-Myc일 수 있다. 또한, 본 발명의 Sox2 및 c-Myc 유전자 로부터 발현되는 단백질은 이의 야생형의 아미노산 서열을 갖는 단백질뿐만 아니라 이의 변이체도 포함할 수 있다. Sox2 및 c-Myc 단백질의 변이체란 SOX2 및 c-Myc의 천연 아미노산 서열과 하나 이상의 아미노산 잔기가 결실, 삽입, 비보전적 또는 보전적 치환, 또는 이들의 조합에 의하여 상이한 서열을 가지는 단백질을 포함한다. 상기 변이체는 천연 단백질과 동일한 생물학적 활성을 나타내는 기능적 등가물이거나 필요에 의해서 단백질의 물리·화학적 성질이 변형된 변이체로서, 물리·화학적 환경에 대한 구조적 안정성이 증대되거나 생리학적 활성이 증대된 변이체일 수 있다.

또한, 본 발명에서 "Sox2 또는 c-Myc 유전자"는 Sox2 또는 c-Myc 단백질의 야생형 또는 상기한 바와 같은 변이체 형태의 Sox2 또는 c-Myc 단백질을 코딩하는 뉴클레오티드 서열로서, 하나 이상의 염기가 치환, 결실, 삽입, 또는 이들의 조합에 의해 변이될 수 있으며, 천연에서 분리되거나 화학적 합성법을 이용하여 제조할 수 있다.

상기 Sox2 및 c-Myc 유전자는 유도만능줄기세포(iPSC) 제작에서 매우 중요하게 활용되고 있는 전사인자이지만, 직접 리프로그래밍을 통한 유도신경줄기세포 제작 연구에 있어서는 아직까지 Sox2 및 c-Myc의 조합을 이용하여 신경줄기세포의 제작에 성공한 사례가 없다.

본 발명의 상기 Sox2 단백질을 코딩하는 핵산분자 및 c-Myc 단백질을 코딩하는 핵산분자는 각각 독립적으로 발현벡터에 포함된 형태를 가질 수 있다.

구체적으로, 상기 Sox2 단백질 또는 c-Myc 단백질은, 이들을 코딩하는 핵산분자를 포함하는 발현벡터를 이용하여 시험관 내에서 세포주로부터 발현된 형태의 단백질일 수 있다. 상기 발현벡터는 바이러스 벡터, 비바이러스성 벡터, 플라스미드 벡터, 코즈미드 벡터를 포함할 수 있고, 상기 발현벡터는 Baculovirus 발현벡터, Mammalian 발현벡터 또는 Bacterial 발현벡터를 이용할 수 있으며, 상기 세포주는 곤충세포주, 포유동물 세포주 또는 박테리아 세포주를 이용할 수 있으나, 이에 의하여 본 발명에서 이용 가능한 발현벡터 및 세포주가 제한되는 것은 아니다.

본 발명의 용어 “발현벡터”는, 적당한 숙주세포에서 목적 단백질을 발현할 수 있는 벡터로서, 유전자 삽입물이 발현되도록 작동가능하게 연결된 필수적인 조절 요소를 포함하는 유전자 작제물을 말한다.

본 발명의 발현벡터는 프로모터, 오퍼레이터, 개시코돈, 종결코돈, 폴리아데닐화시그널, 인핸서 같은 발현 조절 요소 외에도 막 표적화 또는 분비를 위한 신호 서열 또는 리더 서열을 포함하며 목적에 따라 다양하게 제조될 수 있다. 발현벡터의 프로모터는 구성적 또는 유도성일 수 있다. 또한, 발현벡터는 벡터를 함유하는 숙주 세포를 선택하기 위한 선택성 마커를 포함하고, 복제 가능한 발현벡터인 경우 복제 기원을 포함한다. 발현벡터는 자가 복제하거나 숙주 DNA에 통합될 수 있다.

구체적으로, 상기 바이러스 벡터는 레트로바이러스(Retrovirus), 렌티바이러스(lentivirus), 예를 들어 HIV(Human immunodeficiency virus), MLV(Murineleukemia virus), ASLV(Avian sarcoma/Leukosis), SNV(Spleen necrosis virus), RSV(Rous sarcoma virus), MMTV(Mouse mammary tumor virus) 등, 아데노바이러스(Adenovirus), 아데노 관련 바이러스(Adeno-associated virus), 헤르페스 심플렉스 바이러스(Herpes simplex virus), 센다이 바이러스(Sendai virus) 등에서 유래한 벡터를 포함할 수 있다. 또한, 더욱 구체적으로 RNA 기반 바이러스 벡터일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

본 발명의 용어 "작동가능하게 연결된(Operably linked)"은 일반적 기능을 수행하도록 핵산 발현조절 서열과 목적하는 단백질을 코딩하는 핵산 서열이 기능적으로 연결(Functional linkage)되어 있는 것을 말한다. 재조합 벡터와의 작동적 연결은 당해 기술 분야에서 잘 알려진 유전자 재조합 기술을 이용하여 제조할 수 있으며, 부위-특이적 DNA 절단 및 연결은 당해 기술 분야에서 일반적으로 알려진 효소 등을 사용한다.

상기 Sox2 또는 c-Myc 단백질을 코딩하는 핵산분자는 messenger RNA(mRNA)일수 있다.

본 발명에서 "Sox2 및 c-Myc를 도입하는 단계"는 발현벡터, Sox2 또는 c-Myc 단백질을 코딩하는 mRNA, 유전자 변형, 외래 발현 유전자 도입, 발현 유도 효과를 가지는 물질의 처리 등을 통하여 세포 내에 존재하는 Sox2 및 c-Myc 유전자 및 이로부터 발현되는 단백질의 발현 수준을 증가시키는 방법일 수 있으나, 상기 유전자 및 단백질의 발현 수준을 증가시키는 한 제한되지 않는다. 특히, 상기 유전자를 도입하는 단계는 원하는 시간 및 조건 하에서 상기 유전자의 발현을 유도하는 방법일 수 있다.

구체적으로, 상기 (a) 단계의 유전자를 세포에 도입하는 방법은 당업계에서 통상적으로 사용되는 세포에 핵산분자(DNA 또는 RNA)를 제공하는 데에 제한 없이 사용할 수 있다. 예를 들어, Sox2 및/또는 c-Myc 단백질을 코딩하는 핵산분자가 발현벡터 안에 작동 가능하게 연결되어 세포 내로 전달될 수 있으며, 숙주 세포의 염색체 내로 삽입되는 형태로 세포 내로 전달될 수 있다. 또한, 상기 Sox2 및/또는 c-Myc을 분리된 세포의 배양액에 투여하는 방법 또는 분리된 세포에 직접 주입하는 방법, Sox2 또는 c-Myc 단백질을 코딩하는 mRNA을 분리된 세포에 직접 주입하는 방법 등을 사용할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

상기 Sox2 및/또는 c-Myc를 분리된 세포에 직접 주입하는 방법은 당업계에 공지된 임의의 방법을 선택하여 사용할 수 있으며, 이에 제한되지는 않으나, 미세주입법(microinjection), 전기천공법(electroporation), 입자 분사법(particle bombardment), 직접근육주입법, 인슐레이터(insulator) 및 트랜스포존을 이용한 방법 중에서 적절하게 선택하여 적용할 수 있다.

본 발명에서 Sox2 및/또는 c-Myc를 분리된 세포에 도입하는 방법은 바이러스를 이용하는 것일 수 있고, 구체적으로 Sox2 단백질을 코딩하는 핵산분자 및 c-Myc 단백질을 코딩하는 핵산분자를 각각 삽입한 바이러스 벡터로 형질전환시킨 패키징 세포로부터 수득한 바이러스를 분리된 세포의 배양액에 처리하는 과정을 통해 Sox2 및/또는 c-Myc을 도입하는 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

상기 바이러스 벡터는 레트로바이러스, 렌티바이러스, 아데노바이러스, 아데노-관련 바이러스, 헤르페스 심플렉스바이러스, 센다이 바이러스 등에서 유래한 벡터를 사용할 수 있으며, 이에 제한되지는 않으나, 구체적으로는 레트로바이러스 벡터를 사용할 수 있다. 또한, 상기 패키징 세포는 사용된 바이러스 벡터에 따라 당업계에 공지된 다양한 세포를 선택하여 사용할 수 있다.

본 발명에서 상기 바이러스를 이용하여 도입하는 방법은 일정 수준의 MOI로 처리하는 방법일 수 있다.

본 발명의 용어 “MOI”는 “감염 다중도”를 의미하는 “Multiplicity of infection”의 약자이다. 예를 들어, 만약 1,000,000개의 벡터가 100,000개의 숙주 세포들을 형질도입하기 위해 사용되었다면, MOI는 10이다. 바이러스성 벡터를 이용하는 경우, MOI는 바이러스를 접종시킨 세포 수에 대한 접종 바이러스양의 비율을 나타내며, 즉 단일 세포를 감염시키는 바이러스 입자의 평균 수를 의미한다. 이 용어의 사용은 형질도입에 관련된 경우에 제한되지 않고, 대신 리포펙션, 미세주입법, 칼슘 인산 침전법, 및 전기천공법과 같은 수단에 의한 숙주 안으로의 벡터의 도입을 포함한다.

본 발명에서 Sox2 및 c-Myc 도입에 사용되는 MOI 값은, 0초과 내지 20 미만, 0 초과 내지 15 미만, 0 초과 내지 10 미만, 0 초과 내지 5 미만, 0.5 초과 내지 10 미만, 0.5 초과 5 미만, 0.5 초과 4 미만, 0.5 초과 3 미만 또는 0.5 초과 2 미만의 MOI일 수 있고, 구체적으로는 1 MOI일 수 있으나, 신경줄기세포로의 직접교차분화를 일으키는 범위 이내인 한, 제한되지 않는다.

본 발명의 일 실시예에서는 c-Myc과 Sox-2를 코딩하는 레트로바이러스 벡터를 MOI 1로 섬유아세포에 처리하여 신경줄기세포가 제조되었음을 확인하였다(실시예 1).

또한, 본 발명에서 Sox2 및/또는 c-Myc를 분리된 세포에 도입하는 방법은 비바이러스성 벡터를 이용하는 것일 수 있고, 구체적으로 Sox2 및/또는 c-Myc의 핵산분자가 포함된 비바이러스성 에피솜 벡터를 분리된 세포에 도입하는 것일 수 있다.

본 발명의 비바이러스성 에피솜 벡터(Episomal vector)는 비바이러스성 비삽입성 벡터로서, 염색체 내에 삽입되지 않고 벡터에 포함된 유전자를 발현시킬 수 있는 특성을 가지는 것으로 알려져 있다. 본 발명의 목적상 에피솜 벡터를 포함하는 세포는, 에피솜 벡터가 유전체 내에 삽입되거나, 또는 유전체 내에 삽입되지 않은 상태로 세포 내 존재하는 경우를 모두 포함한다.

또한, 본 발명에서 Sox2 및/또는 c-Myc를 분리된 세포에 도입하는 방법은 Sox2 또는 c-Myc의 mRNA를 분리된 세포에 직접 도입하는 것일 수 있다. 상기 mRNA를 분리된 세포에 직접 도입하는 방법은 당업계에 공지된 임의의 방법을 선택하여 사용할 수 있으며, 이에 제한되지는 않는다.

다음으로, 본 발명의 (b)단계는 상기 (a) 단계의 세포를 배양하여 분리된 세포로부터 계통이 전환된 세포로 직접 리프로그래밍을 유도하여, 신경줄기세포를 제조하는 방법이다.

본 발명에서 용어, “계통이 전환된 세포”란, 세포가 가지고 있던 고유의 계통 특성이 발생학적으로 또는 인위적인 방법으로 바뀌어 다른 계통 특성을 가진 세포유형으로 전환된 세포로서, 전환되기 전의 세포 유형의 특성과는 전혀 다른 세포 유형의 특성을 가지는 세포로 전환되는 것을 말한다. 구체적으로 본 발명에서는 리프로그래밍을 통해 비신경세포로부터 전환된 신경줄기세포일 수 있다.

본 발명에서 용어, “리프로그래밍(Reprogramming)”은 특정 세포가 가지는 전체 유전자 발현 패턴 (Global gene expression pattern) 등을 조절하여, 목적하는 세포로 전환시키는 방법을 의미한다. 다시 말해서, 본 발명에서 리프로그래밍은 세포의 운명을 인위적으로 조작하여 전혀 다른 특성을 가지는 세포로 전환시키는 방법을 의미하며, 본 발명의 목적상 상기 리프로그래밍은 외래 유전자 혹은 RNA 또는 DNA를 포함하는 벡터를 세포에 도입함으로써 수행되는 것일 수 있다. 일례로, 리프로그래밍은 세포의 역분화(Dedifferentiation), 직접 리프로그래밍 (Direct reprogramming 또는 Direct conversion), 또는 직접 교차분화(Trans-differentiation)을 포함할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

본 발명에서 용어, "리프로그래밍 인자(Reprogramming factor)"는 최종적으로 또는 일정부분 분화된 세포에 도입되어 리프로그래밍을 유도할 수 있는 유전자(혹은 이를 코딩하는 폴리뉴클레오티드), 또는 단백질을 의미한다. 상기 리프로그래밍 인자는 리프로그래밍을 유도하고자 하는 그 목적 세포에 따라, 그리고 리프로그래밍이 유도되는 분리된 세포의 종류에 따라 달라질 수 있다. 예컨대, 본 발명의 일 실시예에서는 Sox2 및 c-Myc만을 도입함으로써 초기 세포를 목적 세포인 유도신경줄기세포로 리프로그래밍시켰으나, 본 발명의 범위가 상기 리프로그래밍 인자에 제한되는 것은 아니며, 신경줄기세포를 제조하는 경우 도입되는 리프로그래밍 인자는 Sox2, c-Myc. Lin28, Asc11, Pitx3, Nurr1, Lmx1a, Nanog, Oct3, Oct4 및 Klf4로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 인자를 포함하는 것일 수 있다. 그 외에도 Sox21의 과발현을 유도하고, 신경외배엽 계통 유전자인 Tapa1, Atbf1, NeuroD1, Mash1, Hes1, Hes6, Id2의 과발현을 유도하는 인자를 포함할 수 있으며, 신경줄기세포를 제조할 수 있는 것으로 당업계에 공지된 모든 인자를 포함할 수 있다. 또한, 상기 리프로그래밍 인자를 이용하여 신경줄기세포로의 직접 리프로그래밍을 유도할 수 있다. 리프로그래밍 유전인자를 이용한 리프로그래밍은 세포가 가지는 전체 유전자 발현 패턴을 조절하여 목적 세포로의 전환을 유도하는 것이므로, 상기 리프로그래밍 유전 인자가 세포에 도입되고, 세포를 일정 기간 배양함으로써 목적하는 종류의 세포의 유전자 발현 패턴을 가지는 목적 세포로 초기 세포를 리프로그래밍시킬 수 있다.

본 발명의“직접 리프로그래밍”은 리프로그래밍 과정을 통해 전분화능을 가진 유도 만능 줄기세포를 제작하는 기술과는 차별화되며, 리프로그래밍 배양을 통해 직접적으로 원하는 목적 세포로의 직접 전환을 유도하는 기술이다. 기존 체세포 핵이식은 난자를 사용해야 하는 단점이 있어 다른 세포 리프로그래밍 기술에 비해 활용가능성이 낮으며, 유도 만능 줄기세포 리프로그래밍 기술을 이용하는 경우 태생적으로 전분화능 줄기세포를 경유하기 때문에, 미분화 세포의 잔류 여부 및 안전성 확보 여부가 검증되어야 한다는 단점이 있다. 하지만, 본 발명은 직접 리프로그래밍을 통해 목적 세포인 신경줄기세포를 초기 세포로부터 직접 생산함으로써, 생산 시간, 비용, 효율, 안전성 등 상기 기술의 문제점을 극복할 수 있는 대안을 제공할 수 있을 것으로 기대된다. 본 발명의 목적상 직접 리프로그래밍은 직접 역분화, 직접 분화, 직접 전환, 직접교차분화, 교차분화 등과 혼용될 수 있다. 본 발명에서 직접 리프로그래밍은 신경줄기세포로의 직접 역분화 또는 교차분화를 의미할 수 있다.

본 발명의 "유도 신경줄기세포(induced neural stem cell, iNSC)"는 분화능이 없는 세포 또는 일정부분 분화능이 있는 세포 등 서로 다른 양태로 존재하는 분화된 세포로부터 리프로그래밍 기술을 이용하여 신경줄기세포와 유사 또는 동일한 다분화능(multipotency)을 가진 미분화 상태의 줄기세포를 확립하는 방식으로 만들어진 세포들을 포함한다. 유도 신경줄기세포는 신경줄기세포와 동일 또는 유사한 특성을 가지고 있는데, 구체적으로는 비슷한 세포형태를 보여주고, 유전자 및 단백질 발현 패턴이 유사하며, 생체 내외에서 다분화능을 가질 수 있다. 따라서 본 발명의 유도 신경줄기세포는 뉴런(신경세포), 별아교세포(astrocyte), 희소돌기아교세포(oligodendrocyte), GABA성 신경 세포 또는 도파민성 신경 세포 등 다양한 신경세포로 분화가능한 것일 수 있다. 본 발명의 용어“신경줄기세포”는 달리 지시되지 않는 한 “유도 신경줄기세포”와 동일한 의미를 갖는 것으로서, 상호 교환적으로 사용되었다.

본 발명의 실시예에서는, 본 발명의 방법에 따라 제조된 신경줄기세포가 뉴런, 성상교세포 및 희소돌기아교세포로 분화할 수 있음을 확인하였다(실시예 1). 또한 제조된 신경줄기세포에서 p53 유전자의 돌연변이가 일어나지 않았음을 통해 안전성을 확인하였다(실시예 3).

본 발명의 다른 양태는, 상기 방법에 따라 제조된 신경줄기세포를 제공한다. 상기 신경줄기세포는 전술한 바와 같다. 본 발명에서 제조된 신경줄기세포는 뉴런, 성상교세포 및 희소돌기아교세포로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상의 신경세포로 분화될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

본 발명의 또 다른 양태는, 상기 방법에 따라 제조된 신경줄기세포를 유효성분으로 포함하는 세포 치료제를 제공한다. 상기 신경줄기세포는 전술한 바와 같다.

본 발명의 용어, “세포 치료제”는 개체로부터 분리, 배양 및 특수한 조작을 통해 제조된 세포 및 조직으로 치료, 진단 및 예방의 목적으로 사용되는 의약품(미국 FDA 규정)으로서, 세포 혹은 조직의 기능을 복원시키기 위하여 살아있는 자가, 동종, 또는 이종 세포를 체외에서 증식 선별하거나 다른 방법으로 세포의 생물학적 특성을 변화시키는 등의 일련의 행위를 통하여 치료, 진단 및 예방의 목적으로 사용되는 의약품을 의미한다.

본 발명의 세포치료제는 1ml 당 1.0×10개 내지 1.0×10⁹개의 세포를 포함할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 본 발명의 세포치료제는 동결되지 않은 채 사용되거나 차후 사용을 위해 동결될 수 있다. 동결되어야 할 경우, 표준 냉동보존제 (예를 들어 DMSO, 글리세롤, 에피라이프 (Epilife) 세포 동결 배지 (Cascade Biologics))가 동결 전 세포 집단에 첨가될 수 있다. 또한, 상기 세포치료제는 약학적 분야에서 통상의 방법에 따라 환자의 신체 내 투여에 적합한 단위투여형의 제제로 제형화시켜 투여할 수 있으며, 상기 제제는 1회 또는 수회 투여에 의해 효과적인 투여량을 포함한다. 이러한 목적에 적합한 제형으로는 비경구투여 제제로서 주사용 앰플과 같은 주사제, 주입 백과 같은 주입제, 및 에어로졸 제제와 같은 분무제 등이 이용될 수 있다. 상기 주사용 앰플은 사용 직전에 주사액과 혼합 조제할 수 있으며, 주사액으로는 생리 식염수, 포도당, 만니톨, 링거액 등을 사용할 수 있다. 또한, 주입 백은 염화폴리비닐 또는 폴리에틸렌 재질의 것을 사용할 수 있으며, 박스터 (Baxter), 벡톤 디킨슨 (Becton ickinson), 메드셉(Medcep), 내셔날 호스피탈 프로덕츠 (National Hospital Products) 또는 테루모 (Terumo) 사의 주입 백을 예시할 수 있다.

상기 세포치료제에는 하나 또는 그 이상의 약학적으로 허용가능한 통상의 불활성 담체, 예를 들어, 주사제의 경우에는 보존제, 무통화제, 가용화제 또는 안정화제 등을, 국소 투여용 제제의 경우에는 기제(base), 부형제, 윤활제 또는 보존제 등을 추가로 포함할 수 있다.

이렇게 제조된 본 발명의 세포치료제는 당업계에서 통상적으로 사용하는 투여방법을 이용하여 이식 및 기타 용도에 사용되는 다른 줄기세포와 함께 또는 그러한 줄기세포와의 혼합물의 형태로 투여될 수 있으며, 치료가 필요한 환자의 질환 부위에 직접 생착 또는 이식하거나 복강에 직접 이식 또는 주입하는 것이 가능하나 이에 한정되지는 않는다. 또한, 상기 투여는 카테터를 이용한 비외과적 투여 및 질환부위 절개 후 주입 또는 이식 등 외과적 투여방법 모두 가능하다. 또한 통상의 방법에 따라 비경구적으로, 예를 들면 직접 병변에 투여하는 것 외에 조혈계 줄기세포 이식의 일반적 방법인 혈관 내 주입에 의한 이식도 가능하다.

상기 세포치료제는 1회 또는 수회로 나누어 투여할 수 있다. 그러나, 유효성분의 실제 투여량은 치료하고자 하는 질환, 질환의 중증도, 투여경로, 환자의 체중, 연령 및 성별 등의 여러 관련 인자에 비추어 결정되어야 하는 것으로 이해되어야 하며, 따라서, 상기 투여량은 어떠한 면으로든 본 발명의 범위를 한정하는 것은 아니다.

본 발명에서 "예방"은 상기 조성물의 투여로 신경세포 손상 질환의 발병을 억제 또는 지연시키는 모든 행위를 포함한다.

본 발명에서 "치료"는 상기 조성물의 투여로 신경세포 손상 질환의 증세가 호전되거나 이롭게 되는 모든 행위를 포함한다.

본 발명의 또 다른 양태는, 상기 방법에 따라 제조된 신경줄기세포를 유효성분으로 포함하는, 신경세포 손상 질환 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다. 상기 신경줄기세포는 전술한 바와 같다.

본 발명에서 "신경세포 손상질환"은 신경세포의 변형, 손실 등이 원인이 되어 발생하는 질환으로, 파킨슨씨병, 알츠하이머, 피크병(Pick's disease), 헌팅톤병(Huntington's disease), 근위축성 측면 경화증(amyotriophiclateral sclerosis), 허혈성 뇌질환(stroke), 탈수초질환(demyelinating disease), 다발성 경화증, 간질, 퇴행성 신경질환, 척추 손상(spinal cord injury) 등을 포함할 수 있으나, 상기 예에 제한되지 않는다.

상기 조성물은 약학적으로 허용 가능한 담체를 포함할 수 있다.

상기 "약학적으로 허용 가능한 담체"란 생물체를 자극하지 않으면서, 주입되는 화합물의 생물학적 활성 및 특성을 저해하지 않는 담체 또는 희석제를 의미할 수 있다. 본 발명에 사용 가능한 상기 담체의 종류는 특별히 제한되지 아니하며 당해 기술 분야에서 통상적으로 사용되고 약학적으로 허용되는 담체라면 어느 것이든 사용할 수 있다. 상기 담체의 비제한적인 예로는, 식염수, 멸균수, 링거액, 완충 식염수, 알부민 주사 용액, 덱스트로즈 용액, 말토 덱스트린 용액, 글리세롤, 에탄올 등을 들 수 있다. 이들은 단독으로 사용되거나 2 종 이상을 혼합하여 사용될 수 있다.

약학적으로 허용 가능한 담체를 포함하는 상기 조성물은 경구 또는 비경구의 여러 가지 제형일 수 있다. 제제화할 경우에는 보통 사용하는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 조제된다.

상세하게는, 경구 투여를 위한 고형제제에는 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제 등이 포함되며, 이러한 고형제제는 상기 화합물에 적어도 하나 이상의 부형제, 예를 들면, 전분, 칼슘카보네이트, 수크로오스, 락토오스, 젤라틴 등을 섞어 조제될 수 있다. 또한, 단순한 부형제 이외에 마그네슘 스테아레이트, 탈크 같은 윤활제들도 사용될 수 있다. 경구를 위한 액상 제제로는 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제 등이 해당되는데, 흔히 사용되는 단순 희석제인 물, 액체 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등이 포함될 수 있다. 비경구 투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결건조 제제 및 좌제가 포함된다. 비수성용제, 현탁제로는 프로필렌글리콜, 폴리에틸렌 글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 오일, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다. 좌제의 기제로는 위텝솔, 마크로골, 트윈 61, 카카오지, 라우린지, 글리세로젤라틴 등이 사용될 수 있다.

본 발명의 또 다른 양태로, 상기 신경세포 손상 질환 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 투여하는 단계를 포함하는 신경세포 손상 질환 예방 또는 치료 방법을 제공한다. 상기 신경줄기세포는 전술한 바와 같다.

상기 조성물은 약학적으로 유효한 양으로 투여할 수 있다.

상기 "약학적으로 유효한 양"은 의학적 치료에 적용 가능한 합리적인 수혜/위험 비율로 질환을 치료하기에 충분한 양을 의미하며, 유효 용량 수준은 개체 종류 및 중증도, 연령, 성별, 감염된 바이러스 종류, 약물의 활성, 약물에 대한 민감도, 투여 시간, 투여 경로 및 배출 비율, 치료 기간, 동시 사용되는 약물을 포함한 요소 및 기타 의학 분야에 잘 알려진 요소에 따라 결정될 수 있다.

상기 투여는 어떠한 적절한 방법으로 환자에게 본 발명의 조성물을 도입하는 것을 의미하며, 상기 조성물의 투여 경로는 목적 조직에 도달할 수 있는 한 어떠한 일반적인 경로를 통하여 투여될 수 있다. 복강 내 투여, 정맥 내 투여, 근육 내 투여, 피하 투여, 피내 투여, 경구 투여, 국소 투여, 비 내 투여될 수 있으나, 이에 제한되지는 않는다.

본 발명의 조성물을 매일 투여 또는 간헐적으로 투여해도 좋고, 1일당 투여 횟수는 1회 또는 2~3회로 나누어 투여하는 것이 가능하다. 두 유효성분이 각각 단제인 경우의 투여횟수는 같은 횟수여도 좋고, 다른 횟수로 해도 된다. 또한, 본 발명의 조성물은 신경세포 손상 질환의 예방 또는 치료를 위하여 단독으로, 또는 다른 약물 치료와 병용하여 사용할 수 있다. 상기 요소를 모두 고려하여 부작용 없이 최소한의 양으로 최대 효과를 얻을 수 있는 양을 투여하는 것이 중요하며, 당업자에 의해 용이하게 결정될 수 있다.

상기 개체란, 신경 세포 손상 질환이 발병하였거나 발병할 수 있는 인간과, 원숭이, 소, 말, 양, 돼지, 닭, 칠면조, 메추라기, 고양이, 개, 마우스, 쥐, 토끼 또는 기니아 피그를 포함한 모든 동물을 의미한다. 본 발명의 약학적 조성물을 개체에게 투여함으로써 상기 질환을 효과적으로 예방 또는 치료할 수 있다면 개체의 종류는 제한없이 포함된다.

본 발명의 구체적인 실시예에서는, 직접 리프로그래밍에 의해 제조된 신경줄기세포가 다양한 종류의 신경세포로 분화 가능하다는 점을 확인하였는 바, 본 발명의 신경줄기세포는 다양한 신경 세포 손상 질환의 치료제로서 이용될 수 있다.

본 발명의 또 다른 양태로, 상기 방법에 따라 제조된 신경줄기세포 또는 이로부터 분화된 신경세포에 후보물질을 처리하여, 상기 신경줄기세포가 유래된 개체에 맞춤형인 신경계질환 치료제를 확인하는 단계를 포함하는, 개인 맞춤형 신경계 질환 치료제의 스크리닝 방법을 제공한다.

구체적으로, 환자 개인의 체질이나 환경에 따른 개인 맞춤형 신경계질환 치료제를 선별하기 위하여, 본 발명의 방법으로 제조된 신경줄기세포 또는 이로부터 분화된 신경세포에 후보물질을 처리하여, 신경계 질환의 치료와 관련된 메커니즘의 변화 및 이와 연관된 단백질 등의 발현변화 등을 확인함으로써, 상기 신경줄기세포를 생성하기 위하여 사용된 분리된 세포가 유래된 개체에 대한 맞춤형 신경계 질환 치료제가 될 수 있는지 여부를 확인 및 검증할 수 있다.

본 발명의 유도신경줄기세포의 생산 방법은 유도 인자로서 Sox2와 c-Myc의 2개 유도인자만을 이용하여도 비신경 세포로부터 유도 신경줄기세포를 제작할 수 있기 때문에, 기존의 4개의 인자, 5개의 유도인자를 이용한 생산 방법보다 더 효율적으로 유도 신경 줄기세포를 제작할 수 있으며, 상기 방법으로 제조된 유도신경줄기세포는 분화능 및 증식능이 우수한 바, 이를 향후 치료목적으로 활용할 수 있다.

도 1은 hc-Myc 및 hSox-2를 과발현시키기 위한 레트로바이러스 벡터 및 그 제작 과정을 나타낸 것이다. 도 1A는 pMX 벡터에 hc-Myc 및 hSox2를 도입한 구조를 도식화한 것이다. 도 1B 내지 도 1D는 인간 섬유아세포(hDF)에 hSox2 및 hc-Myc를 도입하기 위한 레트로바이러스 벡터 제작 및 그 역가 조정 과정을 도식화한 것이다.
도 2는 인간 섬유아세포(hDF)에 hSox2 및 hc-Myc를 처리한 결과를 나타낸 것이다. 도 2A는 hDF에 hSox2 레트로바이러스를 MOI 1로 처리하고, hc-Myc 레트로바이러스를 MOI를 각각 1, 5, 및 10으로 처리한 후 시간의 경과에 따라 형질도입된 세포의 수를 측정한 것이다. MOI가 5 또는 10인 경우에 비교하여, MOI가 1인 경우 세포의 수가 크게 증가한 것을 확인할 수 있다. 도 2B는 hDF에 hSox2 및 hc-Myc 레트로바이러스 벡터의 MOI를 1로 처리한 경우 hDF의 형태를 관찰한 것이다. 그 결과 유도신경줄기세포(iNSC)와 유사한 형태를 보이며 리프로그래밍이 일어났음을 확인할 수 있다. 도 2C는 hDF에 hSox2 및 hc-Myc를 MOI 1로 처리하여 제작된 iNSC(hDF-iNSC)를 배양한 결과이다. 부착시켜 배양하거나(attached culture), 배양액에 부유시키는 경우(suspension culture) 모두에서 배양이 가능한 것을 확인할 수 있다. 도 2D는 hDF-iNSC를 동결시킨 후, 다시 해동시킨 결과이다. 동결 및 해동 이후에도 iNSC의 특이적인 형태와 증식능을 유지하고 있음을 확인할 수 있다. 도 2E는 hDF-iNSC의 유전자 지문 분석 결과를 나타낸 것이다. 유전자 지문 분석 결과, 제작된 iNSC가 제작에 사용한 hDF로부터 유래하였음을 확인할 수 있다. 도 2F는 신경줄기세포의 마커인 CD133이 양성인 세포의 비율을 분석한 결과이다. 직접교차분화 효율을 비교분석한 결과 hDF 배치(batch) 별로 0.2-0.5% 의 차이를 보임을 확인할 수 있다.
도 3은 hSox2 및 hc-Myc의 MOI 값 변화에 따른 p53의 발현량을 측정한 것이다. 도 3A는 p53의 전사(transcription)수준을 나타낸 그래프로, MOI 1인 경우 대조군에 비해 p53의 발현량이 유의하게 증가하지 않는 반면, MOI 5 및 MOI 10인 경우 발현량이 유의하게 증가한 결과를 나타내고 있다. 도 3B는 p53 단백질의 발현 수준을 측정한 실험 결과로, p53 단백질 발현량이 MOI에 비례하여 증가하고 있음을 나타낸다.
도 4는 제작된 iNSC가 전분화능을 갖지 않음을 확인한 것이다. 도 4A는 hDF-iNSC의 Oct4 발현량을 확인한 그래프이다. Oct4의 전사 및 발현량이 인간 유도만능줄기세포(hiPSC)에 비해 낮은 것을 확인할 수 있다. (P < 0.01) 대표적인 전분화능 마커인 Oct4의 낮은 발현량을 확인함으로써, 전분화능을 갖는 단계를 거치지 않고 직접교차분화가 일어났음을 알 수 있다. 도 4B는 유전자를 도입한 세포를 iPSC 제조 시 이용되는 인자인 Oct4(O), Sox-2(S), c-Myc(M), Klf-4(K)의 존재 하에 배양한 결과이다. 본 연구팀의 실험 조건에서는 OSMK 중 1개라도 제외되면, 유전자가 도입된 세포를 iPSC 리프로그래밍이 일어나기 유리한 조건에서 배양하더라도 alkaline phosphatase positive colony가 전혀 형성되지 않았다. OSMK 중 hSox-2만 제외한 OMK 유전자를 체세포에 도입하였을때는 colony가 다수 형성되었지만 모두 alkaline phosphatase negative colony였다.
도 5는 제조된 hDF-iNSC의 신경줄기세포 특성과 증식능 및 분화능을 확인한 것이다. 도 5A 및 5B는 신경줄기세포 특이적 마커인 Sox2, Nestin 및 Pax6을 전사 수준(5A) 및 단백질 수준(5B)에서 과발현하고 있음을 확인한 것이다. 이를 통해 hDF-iNSC가 신경줄기세포로 리프로그래밍되었음을 확인할 수 있다. 도 5C는 제조된 hDF-iNSC의 배가 시간(doubling time)을 측정한 것이다. 제조된 hDF-iNSC는 약 21.3h의 배가 시간을 보이며 자가 증식함을 확인할 수 있다. 도 5D는 제조된 hDF-iNSC의 MAP2, GFAP 및 Olig1 발현량을 측정한 것이다. MAP2는 신경돌기, GFAP는 성상세포 및 뇌실막세포(Ependymal cell)를 포함하는 중추신경계(CNS) 세포, Olig1은 희소돌기아교세포의 형성에 관여하는 유전자로, 제조된 hDF-iNSC의 다분화능(multipotency)을 확인할 수 있다.
도 6은 인간 제대혈 유래 중간엽 줄기세포(human umbilical cord blood-derived mesenchymal stem cells: hUCB-MSC)에 Sox2 및 c-Myc를 MOI 1로 처리한 결과를 나타낸 것이다. 도 6A는 실험에 사용한 hUCB-MSC의 마커 패턴을 확인한 것이다. hUCB-MSC가 중배엽 줄기세포의 특성을 갖는다는 것을 확인할 수 있다. 도 6B는 hUCB-MSC에 hSox2 및 hc-Myc를 MOI 1로 처리한 경우 hUCB-MSC의 형태를 관찰한 것이다. hUCB-MSC가 iNSC와 유사한 형태를 보이며 리프로그래밍이 일어남을 확인할 수 있다. 도 6C는 제작된 hUCBMSC-iNSC의 직접교차분화 효율을 확인한 것이다. 1.0-2.4% 정도의 효율로 직접교차분화가 일어남을 확인할 수 있다. 도 6D는 제작된 hUCBMSC-iNSC에서 신경줄기세포 마커인 Sox2, Nestin, Pax6의 발현을 확인한 것으로, 신경줄기세포로 리프로그래밍이 일어났음을 확인할 수 있다. 도 6E는 hUCBMSC-iNSC가 뉴런 형태로 분화되고 있는 것을 관찰한 결과이다. 이를 통해 hUCBMSC-iNSC의 분화능을 확인할 수 있다.
도 7은 인간 니만 피크병 C형 유래 피부 섬유아세포(Human Niemann-Pick Type C disease derived dermal fibroblasts: hNPCDF)에 Sox2 및 c-Myc를 MOI 1로 처리한 결과를 나타낸 것이다. 도 7A는 정상 hDF와 비교하여 실험에 사용한 hNPCDF의 유전자 변이 위치를 나타낸 것이다. 도 7B는 hNPCDF에 hSox2 및 hc-Myc를 MOI 1로 처리하여 iNSC와 유사한 형태를 나타냄을 확인한 것이다. 이를 통해 신경줄기세포로 리프로그래밍이 일어났음을 확인할 수 있다. 도 7C는 hNPCDF-iNSC의 콜로니 형성 비율을 나타낸 것으로, 직접교차분화 효율이 약 1.3%임을 확인할 수 있다. 도 7D 및 7E는 hNPCDF-iNSC에서 신경세포 특이적 마커인 Nestin과 Pax6의 발현량(도 7D) 및 섬유아세포 마커인 COL1A2 및 S100A4의 발현량(도 7E)를 확인한 것이다. hNPCDF-iNSC는 신경줄기세포인 H9NSC와 마찬가지로 신경세포 특이적 마커의 상대적 발현량은 높으면서도, 섬유아세포 마커의 상대적 발현량은 낮게 나타났다. 도 7F는 제조된 hNPCDF-iNSC의 분화능을 확인한 것이다. Tuj 1(Alexa 594)은 신경에 특이적으로 결합하는 항체로, 제조된 iNPCDF-iNSC가 신경세포로 분화하였음을 나타낸다. 또한 신경세포 분화에 관여하는 Olig2의 발현을 통해 제조된 iNPCDF-iNSC의 분화능을 확인할 수 있다.
도 8은 제조된 hDF-iNSC의 유전적 안정성을 검증한 실험 결과를 나타낸 것이다. 도 8A는 제조된 hDF-iNSC의 핵형을 분석한 결과이다. 일반적인 핵형과 동일한 형태로, 이를 통해 제조된 hDF-iNSC가 거시적인 관점에서 유전적으로 안정함을 알 수 있다. 도 8B는 제조된 hDF-iNSC에서의 p53 genomic DNA의 PCR 증폭 결과이다. 일반 hDF와 동일한 증폭 정도를 보이고 있으며, 이를 통해 p53 대립유전자의 개수가 정상적임을 확인할 수 있다. 도 8C 및 도 8D는 p53 유전자의 돌연변이가 자주 일어나는 부위를 시퀀싱하여 정상 세포(hDF)와 비교한 결과이다. 이를 통해 hDF-iNSC에서 p53 돌연변이가 발생하지 않았음을 확인할 수 있다.

이하 본 발명을 실시예 및 실험예를 통하여 보다 상세하게 설명한다. 그러나 이들 실시예 및 실험예는 본 발명을 예시적으로 설명하기 위한 것으로 본 발명의 범위가 이들 실시예 및 실험예에 한정되는 것은 아니다.

실시예 1: 인간 섬유아세포(hDF)로부터 Sox2, c-Myc 과발현 조절을 통한 iNSC 제조

실시예 1-1: Sox2, c-Myc 레트로바이러스 벡터 제조

hc-Myc과 hSox-2를 체세포에서 과발현시키기 위한 레트로바이러스를 제작하였다.

먼저, 레트로바이러스 발현 벡터인 pMX 레트로바이러스 벡터에 hcMyc 및 hSOX-2를 도입시켜 pMXs-hc-MYC 및 pMXs-hSOX2를 각각 제작하였다(도 1A).

그 후, 상기에서 제작한 pMXs-hc-MYC 및 pMXs-hSOX2 벡터를 이용하여 hcMyc 또는 hSOX-2의 도입을 위한 hcMyc 또는 hSOX-2 레트로바이러스를 제작하였다. 구체적으로, Convoy 24 ul, pMXs-hc-Myc 또는 pMXs-hSox-2 4 ug, VSV-G 2 ug 및 Gag-Pol 2 ug을 PBS(phosphate buffered saline)에 혼합한 뒤, 10분간 상온에서 정치하였다. 그 후, 상기 혼합물을 100 mm 세포배양접시에 부착된 2×10⁶ 개의 293FT 세포에 첨가하여 37℃ 5% CO₂ 조건에서 하루동안 트랜스펙션(transfection) 하였다. 또한, 적정을 위해 pMXs-GFP 벡터도 동일한 조건으로 트랜스펙션 하였다. 트랜스펙션 후 생성된 바이러스 soup는 트렌스펙션 후 각각 24, 48, 72시간 뒤에 모아 4℃에서 보관하였다.

상기 바이러스의 농축을 위해 상기 바이러스 soup를 0.45 um로 여과시킨 뒤, Retro-X concentrator (Clontech)를 바이러스 soup의 1/3 부피로 첨가한 뒤 4℃ 에서 하룻동안 인큐베이션 하였다. 24시간 뒤 상기 혼합물을 60분 동안 4℃에서 4,000rpm으로 원심분리 하였다. 원심분리 후, soup을 버리고, 레트로바이러스 펠렛을 PBS로 현탁한 뒤 분주하였고, 사용시까지 -80℃에 보관하였다.

상기 바이러스의 적정을 위해 6-웰 플레이트에 시딩한 5×10⁵ 개의 293FT 세포에 농축된 GFP 레트로바이러스를 각각 50, 5, 0.5, 0 ul로 하루동안 형질도입(overnight transduction) 하였다. 2일 뒤 세포 중 GFP 발현 세포의 비율을 유세포 분석기를 이용하여 분석하였다. 1-20% 이내의 결과값을 이용하여 도 1D에 제시된 계산식에 도입하여 역가(titer)를 계산하였다(도 1B 내지 D).

실시예 1-2: Sox2 및 c-Myc 레트로바이러스의 MOI값의 차이에 따른 유도신경줄기세포 제조 여부 확인

상기 실시예 1-1에서 제조한 Sox2 및 c-Myc 레트로바이러스에 의해 인간 섬유아세포를 이용하여 유도신경줄기세포를 제조할 수 있는지 확인하였다.

먼저, 유도신경줄기세포(iNSC)을 제조하기 위해 실시예 1-1에서 제조한 hSOX-2 도입용 레트로바이러스는 MOI 1로 처리하고, hcMyc 도입용 레트로 바이러스는 각각 MOI 1, 5 및 10으로 인간 섬유아세포에 처리하여 직접 리프로그래밍을 유도하였다.

구체적으로, 레트로바이러스 형질도입 전날 24-웰 조직 배양 플레이트에 1.25 × 10⁴개 인간섬유아세포를 플레이팅 하였다. 다음날 실시예 1-1에서 제조한 Sox2 및 c-Myc 레트로바이러스를 정해진 MOI로 세포에 첨가한 뒤 20℃에서 60분 동안 800xg로 spinfection 하였다. Spinfection 후 20% (v/v) FBS(fetal bovine serum) 과 1X primocin이 포함된 DMEM/F12 에서 배양하였다.

2일차의 세포 수를 비교한 결과, hcMyc 도입용 레트로 바이러스를 MOI 1로 처리한 경우의 세포 수가 MOI 5 혹은 10에 비해 유의하게 증가되었다(P < 0.01) (도 2A).

또한, 상기와 같이 Sox2 및 c-Myc 레트로바이러스를 형질전환 시킨 후 3일째에 poly L-ornithine/Fibronectin이 코팅된 6-웰 플레이트에 상기 형질전환된 세포를 5 × 10³개씩 시딩하였다. 시딩 후, 5일째에 상기 세포가 플레이트에 부착된 것을 확인한 뒤 iNSC 배지(1X supplement, 1X primocin, 20 ng/ml bFGF, 20 ng/ml EGF이 첨가된 Stempro NSC 배지)로 교체하였다. 배지교환은 2일에 한번씩 하였다. 상기 iNSC 배지에서 배양을 시작한 후 14-21일째에, iNSC 콜로니를 mechanical picking하여 poly L-ornithine/Fibronectin이 코팅된 플레이트에서 배양을 계속하였다. 신경구(Neurosphere) 배양를 위해 부착된 상태로 배양중인 iNSC를 accutase를 이용하여 떼어낸 뒤 페트리디쉬에 현탁하여 신경구를 형성하였다.

상기 실험결과, hcMyc 도입용 레트로 바이러스를 MOI 1로 레트로바이러스를 처리한 경우 유도신경줄기세포와 유사한 형태를 보이며 직접교차분화된 것을 확인할 수 있었고(도 2B), 부착시켜 배양하거나(attached culture), 배양액에 부유시키는 경우(suspension culture) 모두에서 배양이 가능한 것을 확인하였으며(도 2C), 5% DMSO가 첨가된 iNSC 배지를 이용하여 천천히 동결시킨 후 37℃ 수조에서 천천히 다시 해동하였음에도 불구하고 제조된 유도신경줄기세포가 특이적인 형태와 증식능을 유지하는 것을 확인하였다(도 2D). 그러나 MOI를 5 이상으로 처리한 경우에서는 유도신경줄기세포와 유사한 형태가 관찰되지 않았다(도 2B).

상기 제조된 hDF-iNSC가 사용한 hDF로부터 유래한 것인지 확인하기 위해 유전자 지문 분석(fingerprinting)을 수행한 결과, parental hDF origin임이 확인되었다(도 2E).

또한, NSC 마커인 CD133이 양성인 세포 비율로 직접교차분화 효율을 비교 분석하였다. 구체적으로, 1x10⁵ 내지 1x10⁶ 개의 세포를 PBS 100 ul에 현탁하였다. 그 후, 상기 세포에 Fluorescein isothiocyanate(FITC)가 결합된 항체 3 ul를 혼합한 뒤, 빛을 차단시킨 공간에서 실온에서 30분 동안 결합을 유도하였다. 사용한 항체는 anti-CD133/1-VioBright/FITC (Miltenyi Biotec)이다. 그 후, PBS 3ml을 첨가하여 워싱한 뒤 상기 세포를 MACSQuant VYB (Miltenyi Biotec)을 이용하여 유세포 분석을 하였다. 그 결과, hDF 배치(batch) 별로 0.2-0.5% 의 차이를 보였다(도 2F).

또한, hDF에 처리하는 Sox2 및 c-Myc 레트로바이러스의 MOI가 증가함에 따라, 리프로그래밍에 장애물로 작용하는 주요한 요소인 p53의 전사 및 p53 단백질의 발현양을 확인하기 위해 하기와 같은 실험을 수행하였다.

구체적으로, p53의 전사 발현양을 확인하기 위해 qRT-PCT을 수행하였다. 상기 qRT-PCT을 수행하기 위해 PureLink RNA Mini Kit (Invitrogen)를 이용하여 세포 펠렛으로부터 mRNA를 분리하였고, AccuPower RT Premix(Bioneer)를 이용하여 분리된 mRNA로부터 cDNA를 합성하였다. 상기 cDNA, PowerUp SYBR Green Master Mix (Appliedbiosystems), p53 정방향 및 역방향 프라이머(서열번호 19 및 20) 및 증류수를 혼합하여 20 ul로 만들고, Quant Studio3 (Appliedbiosystems) 를 이용하여 PCR 반응을 수행하여, p53 유전자의 상대적인 배수 값을 계산하였다.

p53 뿐만 아니라 이후의 실시예에서 사용하는 프라이머는 하기 표 1에 기재하였다.

또한, p53 단백질 발현양을 확인하기 위해 웨스턴 블랏팅을 수행하였다. 상기 실험을 수행하기 위해, Sox2 및 c-Myc 레트로바이러스를 세포에 도입하고 6일째에 세포에 용해 완충액(lysis buffer)를 처리하여 세포로부터 단백질을 분리하였고, 가열 과정을 통해 단백질을 변성시키는 과정을 통해 샘플링하였다. 그 후, 상기 준비된 샘플을 SDS-PAGE 겔(Bio-Rad, Hercules, CA, USA)에서 전기영동을 수행하였고, 상기 겔의 단백질을 polyvinylidene fluoride (Bio-Rad)막에 트랜스퍼(transfer) 한 뒤, 탈지분유를 이용하여 상기 막을 블락킹 하였다. 그 후, 상기 막에 항-p53 항체(1:1,000; Santacruz)를 4℃에서 하루동안 처리하였다. 다음날 워싱 후, HRP가 접합된 2차 항체(1:1,000; Santacruz)를 실온에서 1시간 동안 처리하고, 워싱 후 상기 막을 ECL solution (iNTRON)으로 현상하여, p53 단백질의 발현량을 확인하였다.

상기 qRT-PCR 및 웨스턴블랏 결과, p53의 전사 및 p53 단백질의 발현양이 MOI에 비례하여 유의하게 증가하는 것을 확인하였다(P < 0.05 및 P < 0.01) (도 3A 및 B).

상기 결과를 토대로, 인간 섬유아세포에 처리하는 Sox2, c-Myc 레트로바이러스의 MOI 값이 높을수록 유도신경줄기세포로의 리프로그래밍을 유발하기 어려우며, MOI 5 미만으로 처리하는 경우 hDF 세포를 유도신경줄기세포로 리프로그래밍 시킬 수 있다는 점을 확인하였다.

실시예 1-3: 전분화능을 갖는 단계를 거치지 않는 직접교차분화 확인

실시예 1-2에 기재된 qRT-PCR 실험을 통해 hDF-iNSC의 Oct4 발현량을 확인한 결과, Oct4의 전사 및 발현량이 인간 유도만능줄기세포에 비해 낮은 것을 확인하였다(P < 0.01)(도 4A). 대표적인 전분화능 마커인 Oct4의 낮은 발현량을 확인함으로써, 전분화능을 갖는 단계를 거치지 않고 직접교차분화가 일어났음을 확인할 수 있었다.

또한, 본 연구팀의 실험 조건에서는 iPSC 기술의 리프로그래밍 4 인자(hOct-4, hSox-2, hc-Myc, 및 hKlf-4; OSMK) 중 1개라도 제외된 경우의 전능성을 확인하기 위해 하기와 같은 실험을 수행하였다.

구체적으로, 실시예 1-1에 기재된 레트로바이러스 형질도입 과정과 같이, hOct-4, hSox-2, hc-Myc 및 hKlf-4 중 1개씩 제외된 4개의 조합으로 리프로그래밍 인자를 도입하였다. 그 후, 3일간 20%(v/v) FBS가 포함된 DMEM/F12 에서 배양하였다. 3일째에 STO feeder 세포가 시딩된 조직배양 플레이트에 계대하였다. 그 후, 5-21일까지 iPSC 배지(DMEM/F12, 20% serum replacement, 1x primocin, 4ng/ml bFGF)으로 매일 배지를 교환하였다. 21일째에 alkaline phosphatase 염색을 하였고, alkaline phosphatase 양성 콜로니의 숫자를 계수하여 리프로그래밍 효율을 정량화하였다.

그 결과, 리프로그래밍 4 인자(hOct-4, hSox-2, hc-Myc, 및 hKlf-4; OSMK) 중 1개라도 제외된 조합이 도입된 세포를 iPSC 리프로그래밍 조건에서 배양하더라도 alkaline phosphatase 양성 콜로니가 전혀 형성되지 않았다. 흥미롭게도 OSMK 중 hSox-2만 제외한 OMK 유전자를 체세포에 도입하였을때는 colony가 다수 형성되었지만 모두 alkaline phosphatase 음성 콜로니였다(도 4B).

실시예 1-4: 제조된 유도신경줄기세포의 다분화능(multipotency) 확인

본 발명의 방법으로 제조된 hDF-iNSC가 신경줄기세포 특성을 갖는지 확인하고, 상기 세포의 증식능 및 분화능을 확인하였다.

먼저, 상기 hDF-iNSC가 신경줄기세포 특성을 갖는지 확인하기 위해 신경줄기세포 특이적 마커의 발현 양상을 확인하였다.

구체적으로, 실시예 1-2에 기재된 qRT-PCR 실험을 통해, 상기 실시예 1-2에서 제조된 hDF-iNSC은 신경줄기세포 특이적 마커인 내인성 Sox2, Nestin, Pax6 를 전사 수준에서 과발현하고 있음을 확인하였다(도 5A).

또한, 면역 염색법을 이용하여 신경줄기세포 특이적 마커가 단백질 수준에서 과발현하고 있음을 확인하였다. 상기 면역 염색법은 하기와 같은 과정으로 수행하였다. 먼저, 고정(Fixation), 투과(permeabilization) 및 블락킹(blocking)이 완료된 상기 hDF-iNSC에 실험목적에 맞게 항-Nestin (Abcam), 항-PAX6 (BioLegent) 1차 항체 (각각 1:100) 를 4℃에서 하루동안 처리하였다. 다음날 PBS로 워싱 후 1차 항체의 유래에 맞춰서 Alex Fluor 488 염소 항-마우스 (Invitrogen), Alex Fluor 594 염소 항-마우스 (Invitrogen), Alex Fluor 594 염소 항-토끼 (Invitrogen) 2차 항체(각각 1:1,000)를 실온에서 2시간 처리하였다. 그 후, 여분의 2차 항체를 PBS로 워싱하여 제거한 뒤, DAPI(4`,6`-Diamidino-2-Phenylindole, Dihydrochloride)로 세포핵을 염색하였다. 염색된 세포의 관찰은 Nikon ECLIPSE Ti-U 현미경 (Nikon)을 이용하였다. Excitation/emission wavelength는 DAPI가 358/461 nm, Alex Fluor 488이 488/525 nm, Alex Fluor 594가 594/617 nm 였다. 상기 면역염색 결과 Nestin, Pax6은 단백질 수준에서 과발현 하고 있음을 확인하였다(도 5B).

이를 통해, 본 발명에서 제조된 세포가 신경줄기세포로 리프로그래밍되었음을 확인하였다.

또한, 제조된 hDF-iNSC의 증식능 및 분화능을 측정하였다. 구체적으로, bFGF/EGF 미첨가 iNSC 배지로 3주간 배양하여 iNSC의 자발적인 분화(spontaneous differentiation)을 유도하였다. 배지교환은 2-3 일에 한번씩 하였고, 상기 배양은 37℃ 5% CO₂ 조건에서 수행하였다. 분화가 완료된 세포는 실시예 1-1에 기재된 qRT-PCR 방법으로 MAP2, GFAP 및 Olig1의 전사 수준을 확인하였다. 그 결과, 제조된 hDF-iNSC는 약 21.3h의 배가 시간(doubling time)을 보이며 자가 증식(self-renewal)하였고, 자발적인 분화(spontaneous differentiation)에 의해 뉴런 및 교세포(성상교세포 및 희소돌기아교세포)로 분화될 수 있는 다분화능을 가지고 있음을 확인하였다(도 5C 및 D).

실시예 2: 다양한 체세포 유래의 iNSC 제조

실시예 1에서 확인한 체세포 유래 유도신경줄기세포 제조 방법이 인간 섬유아세포 외에 다양한 체세포에서도 일반적으로 적용할 수 있는지 확인하기 위해 인간 제대혈 유래 중간엽 줄기세포(human umbilical cord blood-derived mesenchymal stem cells: hUCB-MSC) 및 인간 니만 피크병 C형 유래 피부 섬유아세포(Human Niemann-Pick Type C disease derived dermal fibroblasts: hNPCDF)에서 하기와 같은 실험을 수행하였다.

실시예 2-1: hUCB-MSC를 이용한 iNSC제조

먼저, 전형적인 MSC 특이적 마커 발현 패턴을 확인하기 위해, 항-HLA-ABC (BD), 항-HLA-DR (BD), 항-CD34 (BD), 항-CD45 (BD), 항-CD73 (BD), 항-CD105 (BD) 항체를 이용하여 실시예 1-2에서 수행한 유세포 분석을 수행하였다. 그 결과, hUCB-MSC가 HLA-ABC+, HLA-DR-, CD34-, CD45-, CD73+, CD105+로 전형적인 MSC 특이적 마커 발현 패턴을 보였는바(도 6A), 이를 통해 실험에 사용한 hUCB-MSC가 중배엽줄기세포의 특성을 갖는다는 것을 확인하였다.

상기 세포에 hc-Myc 및 hSox-2의 도입을 위해 실시예 1과 같이 레트로바이러스를 MOI 1로 처리한 결과, iNSC 특이적인 부착 콜로니 형태(attached colony morphology)를 보임을 확인하였고(도 6B), 항-CD133/1-VioBright/FITC (Miltenyi Biotec) 항체를 이용하여 실시예 1-2에 기재된 유세포 분석을 수행한 결과, 2가지 종류의 hUCB-MSC 각각에서 약 1.0-2.4%의 효율로 직접교차분화가 일어난다는 것을 확인하였다 (도 6C).

또한, 실시예 1-1에 기재된 qRT-PCR 실험을 수행하여, 상기에서 제조된 hUCB-MSC-iNSC는 NSC 특이적 마커인 내인성 Sox2, Nestin, Pax6를 발현하였고, 뉴런 유사 형태로 분화됨을 확인하였는 바(도 6D 및 E), 상기 세포가 유도신경줄기세포로 직접 리프로그래밍 되었고, 신경세포로의 분화능이 있음을 알 수 있다.

이를 통해, 실시예 1의 유도신경줄기세포 제조 방법이 hUCB-MSC에서도 적용됨을 알 수 있다.

실시예 2-2: hNPCDF를 이용한 iNSC 제조

실험 대상이 된 hNPCDF 는 NPC1 유전자에 점돌연변이를 가지고 있어서 NPC1 단백질의 이소류신(isoleucine)이 트레오닌(threonine)으로 치환되어 있다(도 7A). 즉, 인간 섬유아세포의 한 유전자에 돌연변이가 존재하는 체세포이다.

상기 세포에 hc-Myc 및 hSox-2의 도입을 위해 실시예 1과 같이 레트로바이러스를 MOI 1로 처리한 결과, 상기 hNPCDF는 약 1.3%의 효율로 직접교차분화하여 신경줄기세포와 유사한 형태를 나타냈다(도 7B 및 C). 또한, 실시예 1-2에 기재된 qRT-PCR 실험을 통해, hNPCDF-iNSC는 NSC 특이적 마커인 Nestin, Pax6를 발현하였고, 반대로 섬유아세포 마커인 COL1A2, S100A4는 발현하지 않는 것을 확인하였는 바(도 7D 및 E), 이를 통해 hNPCDF 또한 신경줄기세포로 리프로그래밍 될 수 있다는 것과 그 효율을 확인하였다.

또한, 항-Olig2(Millipore), 항-Tuj 1(Abcam) 1차 항체(각각 1:100)를 이용한 면역염색 방법(실시예 1-3에 기재)을 통해, 상기 제조된 hNPCDF-iNSC를 분화시킨 결과 neuron과 glia (oligodendrocyte)로 분화됨을 확인하였는 바(도 7F), 상기 hNPCDF-iNSC 또한 분화능이 있음을 알 수 있다.

실시예 3: 제조된 유도신경줄기세포의 안정성 검증

본 발명에서 제조된 유도신경줄기세포의 안정성을 검증하기 위해서, 하기와 같은 실험을 수행하였다.

구체적으로, 본 발명에서 제조된 hDF-iNSC의 핵형을 확인한 결과, 일반적인 핵형(46, XX)을 나타낸 것을 확인하였고, 이를 통해 본 발명에서 제조된 유도신경줄기세포가 거시적인 관점에서 유전적으로 안정함을 확인하였다(도 8A).

또한, 암세포화를 막는데에 가장 중요하다고 알려진 p53에 돌연변이가 발생했는지 여부를 검증하기 위해, 하기와 같은 실험을 수행하였다.

구체적으로, AccuPrep Genomic DNA Extraction Kit (Bioneer)를 이용하여 hDF-iNSC에서 gDNA를 분리하였다. AccuPower PCR Premix (Bioneer), 표 1에 제시된 p53 정방향 및 역방향 프라이머(서열번호 19 및 20), Genetouch Thermal Cycler(Hanzhou bioer technology)를 이용하여 분리된 gDNA를 주형으로 하여 PCR 증폭을 수행하였다. PCR이 끝난뒤 겔 전기영동(Mupid)를 통해 유전자 증폭 여부를 확인하였으며(도 8B), 상기 PCR product를 MEGAquick-spin plus fragment DNA purification kit(iNtRON) 를 이용하여 정제하였다. 상기 정제된 PCR product는 PCR에 사용한 정방향 프라이머(서열번호 19)와 함께 마크로젠(Seoul, Korea)에서 sequencing을 진행하였다(도 8C).

그 결과, p53 유전자의 돌연변이가 자주 일어나는 부위(mutation hotspot) 6군데 모두에서 돌연변이가 관찰되지 않았다(도 8C).

또한, 극히 일부의 세포에서라도 p53 유전자가 변이되었을 가능성을 완전히 배제하기 위해, 하기와 같은 실험을 수행하였다.

구체적으로, In-depth genotyping을 위해서는 PCR product를 TOPcloner TA Kit (Enzynomics)을 이용하여 클로닝하였고, 이를 열 충격 방법을 이용하여 DH5a chemically competent E.coli(Enzynomics)에 형질전환하였다. 상기 형질전환된 E.coli를 LB Agar LOP plate(Narae biotech)에 도말하여 37℃ 에서 하루동안 인큐베이션 하였다. 다음날 10개의 콜로니를 LB broth (Gibco)에서 37℃ 에서 하루동안 인큐베이션 하였다. 그 후, AccuPrep Plasmid Mini Extraction Kit (Bioneer)를 이용하여 증식한 E.coli에서 플라스미드를 분리하였고, 이를 이용하여 마크로젠(Seoul, Korea)에서 sequencing을 진행하였다. 그 결과, 10개를 개별적으로 시퀀싱한 결과 모두에서 p53 유전자의 돌연변이가 관찰되지 않았다(도 8D).

상기 결과를 통해, 본 발명의 방법을 통해 제조된 유도신경줄기세포가 유전적으로 안정하다는 것을 확인하였다.

이상의 설명으로부터, 본 발명이 속하는 기술분야의 당업자는 본 발명이 그 기술적 사상이나 필수적 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 실시될 수 있다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 이와 관련하여, 이상에서 기술한 실시예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적인 것이 아닌 것으로 이해해야만 한다. 본 발명의 범위는 상기 상세한 설명보다는 후술하는 특허 청구범위의 의미 및 범위 그리고 그 등가 개념으로부터 도출되는 모든 변경 또는 변형된 형태가 본 발명의 범위에 포함되는 것으로 해석되어야 한다.

<110> Kangstem Biotech CO., LTD. <120> A method for producing directly reprogrammed induced neural stem cells from non-neuronal cells using Sox2 and c-Myc <130> KPA180273-KR <160> 24 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> COL1A2_F <400> 1 acaaggcatt cgtggcgata 20 <210> 2 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> COL1A2_R <400> 2 accatggtga ccagcgatac 20 <210> 3 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Endogeneous Sox2_F <400> 3 gagagtgttt gcaaaagggg g 21 <210> 4 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Endogeneous Sox2_R <400> 4 cgccgccgat gattgttatt a 21 <210> 5 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> GADPH_F <400> 5 gtcagtggtg gacctgacct 20 <210> 6 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> GADPH_R <400> 6 tgctgtagcc aaattcgttg 20 <210> 7 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> GFAP_F <400> 7 gctcaatgac cgctttgcca g 21 <210> 8 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> GFAP_R <400> 8 cctgtgccag attgtccctc t 21 <210> 9 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> MAP2_F <400> 9 ggcagatgaa cggaaagatg aagc 24 <210> 10 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> MAP2_R <400> 10 gtatttgaat aggtgccctg tgacc 25 <210> 11 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Nestin_F <400> 11 gcatgtgaat gggggagtga 20 <210> 12 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Nestin_R <400> 12 tctccctcag agactagcgg 20 <210> 13 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> NPC1_F <400> 13 atgagattcc tgcccatgtt cc 22 <210> 14 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> NPC1_R <400> 14 gacacaccga ggttgaagat agtg 24 <210> 15 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Oct-4_F <400> 15 gaaggatgtg gtccgagtgt 20 <210> 16 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Oct-4_R <400> 16 gtgaagtgag ggctcccata 20 <210> 17 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Olig1_F <400> 17 tcctccacct cctccacttc 20 <210> 18 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Olig1_R <400> 18 ctatcttgga gagcttgcgg c 21 <210> 19 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> p53_F <400> 19 tctgtgactt gcacgtactc c 21 <210> 20 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> p53_R <400> 20 gagaggagct ggtgttgttg g 21 <210> 21 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Pax6_F <400> 21 cagaghagac aggccagcaa 20 <210> 22 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Pax6_R <400> 22 tggttggtag acactggtgc 20 <210> 23 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> S100A4_F <400> 23 gggcaaagag ggtgacaagt 20 <210> 24 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> S100A4_R <400> 24 cctgttgctg tccaagttgc 20

Claims (12)

1. (a) 분리된 세포에 Sox2 및 c-Myc 도입 수준을 0 초과 5 미만의 MOI로 바이러스를 이용하여 조절하여 도입하는 단계; 및
   (b) 상기 (a) 단계의 세포를 배양하여 분리된 세포로부터 계통이 전환된 세포로 직접 리프로그래밍을 유도하는 단계
   를 포함하는, 신경줄기세포 제조방법.
2. 삭제
3. 삭제
4. 삭제
5. 삭제
6. 제1항에 있어서, 상기 분리된 세포는 신경세포를 제외한 체세포인 것인, 신경줄기세포 제조방법.
7. 제1항에 있어서, 상기 분리된 세포는 신경줄기세포를 제외한 성체줄기세포인 것인, 신경줄기세포 제조방법.
8. 삭제
9. 삭제
10. 삭제
11. 삭제
12. 삭제

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