KR102156699B1 - 소음인 판별용 조성물 - Google Patents

Abstract

본 발명은 소음인과 연관된 SNP를 포함하는 소음인 판별용 마커, 상기 마커를 검출할 수 있는 수단을 포함하는 소음인 판별용 조성물, 상기 조성물을 포함하는 소음인 판별용 키트 및 상기 조성물 또는 키트를 이용하여 소음인 판별을 위한 정보를 제공하는 방법에 관한 것이다.
본 발명의 마커를 이용하면 객관적이고 높은 정확도 및 높은 재현성으로 소음인 체질인지 여부를 판별할 수 있고, 상기 마커는 효과적인 건강관리에도 널리 활용될 수 있다.

Description

소음인 판별용 조성물{Composition for determining Soeumin}

본 발명은 소음인 판별용 조성물에 관한 것으로, 보다 구체적으로 본 발명은 소음인과 연관된 SNP를 포함하는 소음인 판별용 마커, 상기 마커를 검출할 수 있는 수단을 포함하는 소음인 판별용 조성물, 상기 조성물을 포함하는 소음인 판별용 키트 및 상기 조성물 또는 키트를 이용하여 소음인 판별을 위한 정보를 제공하는 방법에 관한 것이다.

사상의학에 의한 체질의 분류는 1894년에 이제마에 의해 처음으로 제시된 사상체질의학에서 비롯되었으며, 그 핵심적인 내용은, 사람의 체질은 오장육부의 편차에 따라 4가지, 즉, 태양인, 태음인, 소양인, 소음인으로 나눌 수 있으며, 같은 질병이나 증상에 대하여도 체질에 따라 치료방법을 다르게 하는 것이 효과적이라는 것이다. 또한, 이러한 사상의학에 근거한 체질의 판별은, 예를 들면, 진맥을 통해 판별하거나, 사상체질별 체형기상, 성질재간, 용모사기, 병증약리에서 나타나는 특징을 근거로 삼는 전통적인 방법이 있고, 최근에는, 1997년에 사상체질의학회에서 인증한 '설문지를 이용한 사상체질판별 프로그램(QSSCCII)'을 통해 각각의 체질병증을 찾아 확인하는 방법이 사용되고 있다. 그러나, 이러한 종래의 방식은, 진단자의 주관적인 판단에 의존하게 되는 경우가 많아 그 객관적인 신빙성에 한계가 있으므로, 보다 객관적인 사실에 근거하여 체질을 판정하기 위한 연구가 활발하게 진행되고 있다.

예를 들어, 한국공개특허 제2012-0034475호에는 사람의 얼굴, 설문, 체형, 음성 등의 정보를 종합적으로 이용하여 보다 객관적이고 정확하게 사상체질을 판별하는 방법이 개시되어 있다.

동의수세보원에 의하면, 체질은 선천적이며 일생에 걸쳐서 변하지 않는다고 알려져 있으므로, 생물학적으로는 유전적인 특성이라고 할 수 있다. 사람의 모든 생물학적 형질은 유전자의 정보를 근간으로 발현되는 것이며, 따라서, 사상의학에서 제시하는 체질적 속성 역시 유전자가 지닌 형질에 내재 되어 있는 속성이라 할 수 있다.

유전성을 이용하여 사상체질과 연관된 유전체 부위를 과학적으로 규명하려는 시도가 있었으나, 결과적으로는 사상체질과 뚜렷하게 연관된 유전자를 밝히거나 진단에 이용할 수 있는 유전적 지표를 밝혀내지는 못하였다.

이러한 배경하에서, 본 발명자들은 소음인 체질에 내재되어 있는 유전성을 도출하는 방법을 개발하고자 예의 노력한 결과, 소음인 체질과 연관된 SNP를 발굴하였으며, 상기 SNP를 이용할 경우 소음인 체질 관련 유전적 영향력을 도출 가능함을 확인하고, 본 발명을 완성하였다.

대한민국 공개특허공보 제2012-0034475호

본 발명의 하나의 목적은 소음인과 연관된 SNP를 포함하는 소음인 판별용 마커를 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 상기 마커를 검출할 수 있는 수단을 포함하는 소음인 판별용 조성물을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 상기 조성물을 포함하는 소음인 판별용 키트를 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 상기 조성물 또는 키트를 이용하여 소음인 판별을 위한 정보를 제공하는 방법을 제공하는 것이다.

상술한 목적을 달성하기 위한 본 발명의 일 실시양태로서, 본 발명은 서열번호 1(rs136639 SNP) 또는 서열번호 2(rs74956063 SNP)의 염기서열로 구성되는 폴리뉴클레오티드, 또는 이의 상보적인 폴리뉴클레오티드를 포함하는 소음인 판별용 마커를 제공한다.

본 발명자들은 객관적으로 소음인을 판별하는 방법을 개발하고자 다양한 연구를 수행하던 중, SNP에 주목하게 되었다. 사람을 비롯한 고등동물에서 개체에 따른 생물학적 특성은 유전자에 포함된 SNP에 의하여 결정될 수 있음이 알려져 있으므로, 소음인 체질과 연관된 SNP가 존재할 수도 있을 것으로 가정하였다.

상기 가정을 입증하기 위하여, 도 1에 도시된 방법에 따라, 소음인 체질과 연관된 SNP를 발굴하였다. 즉, 전형적인 소음인 16명의 WGS(Whole Genome Sequence)에서 SNP를 추출하고, 이를 질병관리본부에서 분양받은 한국인 397명의 참조 유전체의 SNP와 비교하여, 전형적인 소음인 그룹에서 높은 빈도로 존재하는 SNP들을 선별하였다. 상기 SNP들은 체질 확진자를 대상으로 하여 선형 회귀 분석을 통해 검증하였고, 이 중 소음인 확률값의 증가와 유의하게 연관되어 있는 SNP 2개를 선별하였는데 이들은 rs136639, rs74956063 이다.

ROC(Receiver Operating Characteristic)를 이용하여 상기 두 SNP의 소음인군 판별 정확도를 계산하였다. 그 결과 상기 SNP를 소음인 판별에 이용할 경우 기본정보(나이, 허리-엉덩이 둘레비, 중성지방, 수축기혈압, 공복혈당)만으로 구한 소음인 판별 정확도 대비 정확도가 증가하는 것을 확인하였다(도 4 및 도 5). 따라서, 본 발명의 상기 SNP는 소음인 판별용 마커로 사용될 수 있음을 확인하였다.

또한, 상기 rs136639 SNP의 확인된 SNP 위치인 rs136639의 26번째 염기는 G 또는 T인데, 상기 위치의 염기가 T 일 때, 남성 소음인 판별의 정확도가 증가하는 것을 확인하였다.

아울러, 상기 rs74956063 SNP의 확인된 SNP 위치인 rs74956063의 26번째 염기는 C 또는 G인데, 상기 위치의 염기가 G 일 때, 여성 소음인 판별의 정확도가 증가하는 것을 확인하였다.

이처럼, 소음인 체질과 관련된 SNP로 상기의 두 SNP는 지금까지 전혀 보고되어 있지 않으며, 본 발명자에 의하여 최초로 규명되었다.

본 발명의 용어 "서열번호 1의 염기서열로 구성되는 폴리뉴클레오티드"는 다형성 서열(polymorphic sequence)인 rs136639로서, 다형성 서열이란 폴리뉴클레오티드 서열 중에 SNP를 포함하는 다형성 부위(polymorphic site)를 포함하는 서열을 의미한다. 상기 폴리뉴클레오티드 서열은 DNA 또는 RNA가 될 수 있다.

본 발명의 용어 "서열번호 2의 염기서열로 구성되는 폴리뉴클레오티드"는 다형성 서열인 rs74956063를 의미한다.

본 발명의 용어 "다형성(polymorphism)"이란, 하나의 유전자 좌위(locus)에 두 가지 이상의 대립유전자(allele)가 존재하는 경우를 의미하며 다형성 부위(polymorphic site) 중에서, 단일 염기만이 다른 것을 단일염기 다형성(single nucleotide polymorphism, SNP)이라 한다. 바람직한 다형성 마커는 선택된 집단에서 1% 이상, 더욱 바람직하게는 5% 또는 10% 이상의 발생빈도를 나타내는 두 가지 이상의 대립유전자를 가진다.

본 발명의 용어 "대립유전자(allele)"란, 상동염색체의 동일한 유전자 좌위에 존재하는 한 유전자의 여러 타입을 의미한다. 대립유전자는 다형성을 나타내는데 사용되기도 하며, 예컨대, SNP는 두 종류의 대립인자(biallele)를 갖는다.

본 발명의 용어 "rs_id"란, 1998년부터 SNP 정보를 축적하기 시작한 NCBI가 초기에 등록되는 모든 SNP에 대하여 부여한 독립된 표지자인 rs-ID를 의미한다. 본 발명에서는 "rs136639" 또는 “rs74956063” 와 같은 형태로 기재하였다. 이와 같은 rs136639 또는 rs74956063는 본 발명의 다형성 마커인 SNP 마커를 의미한다. 당업자라면 상기 rs_id를 이용하여 SNP의 위치 및 서열을 용이하게 확인할 수 있을 것이다. NCBI의 dbSNP(The Single Nucleotide Polymorphism Database) 번호인 rs136639 또는 rs74956063에 해당하는 구체적인 서열은 시간이 지남에 따라 약간 변경될 수 있다. 본 발명의 범위가 상기 변경된 서열에도 미치는 것은 당업자에게 자명할 것이다.

본 발명의 용어 "소음인(小陰人)"은 사상의학(四象醫學)에서 분류한 네 가지 체질 중의 하나를 의미한다.

본 발명에 있어서, 상기 서열번호 1의 염기서열에서 26번째 염기는 T일 수 있다.

본 발명에 있어서, 상기 서열번호 1의 염기서열에서 26번째 염기가 T 일 때, 본 발명의 마커는 남성 소음인을 판별하는 것 일 수 있다.

본 발명에서 있어서, 상기 서열번호 2의 염기서열에서 26번째 염기는 G일 수 있다.

본 발명에서 있어서, 상기 서열번호 2의 염기서열에서 26번째 염기가 G일 때, 본 발명의 마커는 여성 소음인을 판별하는 것 일 수 있다.

상술한 목적을 달성하기 위한 본 발명의 다른 실시양태로서, 본 발명은 상기 소음인 판별용 마커를 검출 또는 증폭할 수 있는 제제를 포함하는, 소음인 판별용 조성물을 제공한다.

본 발명의 용어 "마커를 검출 또는 증폭할 수 있는 제제" 란, 상기 소음인 판별용 마커에 포함된 SNP에 특이적으로 결합하여 인식할 수 있도록 하거나 상기 SNP를 증폭시킬 수 있는 제제로서, 구체적으로는 SNP가 포함된 다형성 부위에 특이적으로 결합할 수 있는 프로브, 상기 SNP 마커를 포함하는 폴리뉴클레오티드 또는 이의 상보적인 폴리뉴클레오티드를 특이적으로 증폭할 수 있는 프라이머일 수 있다.

본 발명의 용어 "프로브(probe)"란 상기와 같은 다형성 부위와 특이적 결합을 이룰 수 있는, 짧게는 수 염기 내지 길게는 수백 염기에 해당하는 RNA 또는 DNA 등의 핵산 단편을 의미하며, 라벨링(labeling) 되어 있어 특정 SNP의 존재 유무를 확인할 수 있다. 프로브는 올리고 뉴클레오타이드(oligonucleotide) 프로브, 단일 사슬 DNA(single stranded DNA) 프로브, 이중 사슬 DNA(double stranded DNA) 프로브, RNA 프로브 등의 형태로 제작될 수 있다.

본 발명에서 SNP 마커에 결합하여 인식하는 데 사용되는 프로브는 SNP를 포함하는 폴리뉴클레오티드 서열에 대해 상보적인 서열을 포함하며, 이에 제한되지 않으나 DNA, RNA 또는 DNA-RNA 잡종(hybrid) 형태일 수 있다. 또한, 육안으로 인식 가능하도록 하기 위해 프로브의 5' 또는 3' 말단에 형광 표지인자, 방사선 표지 인자 등을 추가로 부착할 수 있다.

본 발명의 용어 "프라이머"란, 짧은 자유 3' 말단 수산화기(free 3' hydroxyl group)를 가지는 염기서열로 상보적인 템플레이트(template)와 염기쌍(base pair)을 형성할 수 있고 주형 가닥 복사를 위한 시작 지점으로 기능을 하는 짧은 서열을 의미한다. 본 발명에서 SNP 마커 증폭에 사용되는 프라이머는, 적절한 버퍼 중의 적절한 조건(예를 들면, 4개의 다른 뉴클레오시드 트리포스페이트 및 DNA, RNA 폴리머라제 또는 역전사 효소와 같은 중합제) 및 적당한 온도 하에서 주형-지시 DNA 합성의 시작점으로서 작용할 수 있는 단일가닥 올리고뉴클레오티드가 될 수 있는데, 상기 프라이머의 적절한 길이는 사용 목적에 따라 달라질 수 있으나, 통상 15 내지 30 뉴클레오티드의 크기로 사용될 수 있다. 상기 프라이머 서열은 상기 SNP 마커를 포함하는 폴리뉴클레오티드 또는 이의 상보적인 폴리뉴클레오티드와 완전하게 상보적일 필요는 없으며, 혼성화 할 정도로 충분히 상보적이면 사용가능하다.

또한, 프라이머는 변형시킬 수 있으며, 예를 들어 메틸화, 캡화, 뉴클레오타이드의 치환 또는 뉴클레오타이드 간의 변형, 예를 들면, 하전되지 않은 연결체(예: 메틸 포스포네이트, 포스포트리에스테르, 포스포로아미데이트, 카바메이트 등) 또는 하전된 연결체(예: 포스포로티오에이트, 포스포로디티오에이트 등)로의 변형이 있을 수 있다.

상술한 목적을 달성하기 위한 본 발명의 다른 실시양태로서, 본 발명은 상기 조성물을 포함하는 소음인 판별용 키트를 제공한다. 구체적으로, 상기 키트는 이에 제한되지는 않으나 RT-PCR(Reverse transcription Polymerase Chain Reaction) 키트, DNA 분석용 (예, DNA 칩) 키트일 수 있다.

본 발명의 키트는 상기 조성물을 이용하여 본 발명에서 제공하는 SNP의 염기를 증폭을 통해 확인하거나, 또는 mRNA의 발현 수준을 확인함으로써 소음인 체질 여부를 판단할 수 있다. 구체적인 일례로서, 본 발명에서 제공하는 상기 키트는 RT-PCR을 수행하기 위해 필요한 필수 요소를 포함하는 키트일 수 있다.

예를 들어, RT-PCR 키트는, 상기 SNP에 대한 특이적인 각각의 프라이머 쌍 외에도 테스트 튜브 또는 다른 적절한 컨테이너, 반응 완충액(pH 및 마그네슘 농도는 다양), 데옥시뉴클레오타이드(dNTPs), Taq-폴리머라아제 및 역전사효소와 같은 효소, DNase, RNAse 억제제, DEPC-수(DEPC-water), 멸균수 등을 포함할 수 있다. 또한 정량 대조군으로 사용되는 유전자에 특이적인 프라이머 쌍을 포함할 수 있다.

또 다른 예로서, 본 발명의 키트는 DNA 칩을 수행하기 위해 필요한 필수 요소를 포함하는 소음인 판별용 DNA 칩 키트일 수 있다.

본 발명의 용어 "DNA 칩"이란, 수십만 개의 DNA의 각 염기를 한번에 확인할 수 있는 DNA 마이크로어레이의 하나를 의미한다.

상기 DNA 칩 키트는, 일반적으로 편평한 고체 지지판, 전형적으로는 현미경용 슬라이드보다 크지않은 유리 표면에 핵산 종을 격자형 배열(gridded array)로 부착한 것으로, 칩 표면에 핵산이 일정하게 배열되어, DNA 칩 상의 핵산과 칩 표면에 처리된 용액 내에 포함된 상보적인 핵산 간에 다중 혼성화(hybridization) 반응이 일어나 대량 병렬 분석이 가능하도록 하는 도구이다.

상술한 목적을 달성하기 위한 본 발명의 다른 실시양태로서, 본 발명은 (a) 개체로부터 분리된 시료의 DNA로부터 서열번호 1 또는 서열번호 2의 염기서열로 구성되는 폴리뉴클레오티드 또는 이의 상보적인 폴리뉴클레오티드의 SNP를 포함하는 다형성 부위(polymorphic site)를 증폭시키는 단계; 및 (b) 상기 증폭된 다형성 부위의 염기를 결정하는 단계; 를 포함하는, 소음인 판별을 위한 정보를 제공하는 방법을 제공한다. 이때, 상기 분리된 시료의 DNA는 개체로부터 분리된 시료로부터 수득할 수 있다.

본 발명의 용어 "개체"란 소음인 체질 여부를 판별하고자 하는 대상인 사람을 의미하며, 상기 사람으로부터 얻어진 분리된 검체를 이용하여, 상기 SNP를 포함하는 다형성 부위의 염기를 분석함으로써 상기 개체의 소음인 여부를 판별할 수 있다. 상기 검체로는 털, 뇨, 혈액, 각종 체액, 분리된 조직, 분리된 세포 또는 타액과 같은 시료 등이 될 수 있으나, 이에 특별히 제한되지는 않는다.

상기 (a) 단계의 DNA로부터 상기 SNP의 다형성 부위를 증폭하는 단계는 당업자에게 알려진 어떠한 방법이든 사용 가능하다. 예를 들면, 표적 핵산을 PCR을 통하여 증폭하고 이를 정제하여 얻을 수 있다. 그 외 리가제 연쇄 반응(LCR)(Wu 및 Wallace, Genomics 4, 560(1989), Landegren 등, Science 241, 1077(1988)), 전사증폭(transcription amplification)(Kwoh 등, Proc. Natl.Acad. Sci. USA 86, 1173(1989)) 및 자가유지 서열 복제(Guatelli 등, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87, 1874(1990)) 및 핵산에 근거한 서열 증폭(NASBA)이 사용될 수 있다.

상기 (b)단계의 증폭된 다형성 부위의 염기를 결정하는 것은 서열 분석, 마이크로어레이(microarray)에 의한 혼성화, 대립유전자 특이적인 PCR(allele specific PCR), 다이나믹 대립유전자 혼성화 기법(dynamic allele-specifichybridization, DASH), PCR 연장 분석, PCR-SSCP, PCR-RFLP 분석 또는 TaqMan 기법, SNPlex 플랫폼(Applied Biosystems), 질량 분석법(예를 들면, Sequenom의 MassARRAY 시스템), 미니-시퀀싱(mini-sequencing) 방법, Bio-Plex 시스템(BioRad), CEQ and SNPstream 시스템(Beckman), Molecular Inversion Probe 어레이 기술(예를 들면, Affymetrix GeneChip), 및 BeadArray Technologies(예를 들면, Illumina GoldenGate 및 Infinium 분석법) 등을 이용하여 수행될 수 있으나, 특별히 이에 제한되지는 않는다. 상기 방법들 또는 본 발명이 속하는 기술분야의 당업자에게 이용 가능한 다른 방법에 의해, 상기 SNP를 포함하는 폴리뉴클레오티드에서 대립유전자를 확인할 수 있다. 이와 같은 변이 부위의 염기를 결정하는 것은 바람직하게는 DNA 칩을 통해 수행할 수 있다.

상기 TaqMan 방법은 (1) 원하는 DNA 단편을 증폭할 수 있도록 프라이머 및 TaqMan 탐침을 설계 및 제작하는 단계; (2) 서로 다른 대립유전자의 탐침을 FAM 염료 및 VIC 염료로 표지(Applied Biosystems)하는 단계; (3) 상기 DNA를 주형으로 하고, 상기의 프라이머 및 탐침을 이용하여 PCR을 수행하는 단계; (4) 상기의 PCR 반응이 완성된 후, TaqMan 분석 플레이트를 핵산 분석기로 분석 및 확인하는 단계; 및 (5) 상기 분석결과로부터 단계 (1)의 폴리뉴클레오티들의 염기를 결정하는 단계를 포함한다.

상기 시퀀싱 분석은 염기서열 결정을 위한 통상적인 방법을 사용할 수 있으며, 자동화된 유전자분석기를 이용하여 수행될 수 있다. 또한, 대립유전자 특이적 PCR은 변이 부위가 위치하는 염기를 3' 말단으로 하여 고안한 프라이머를 포함한 프라이머 세트로 상기 변이가 위치하는 DNA 단편을 증폭하는 PCR 방법을 의미한다. 상기 방법의 원리는, 예를 들어, 특정 염기가 A에서 G로 치환된 경우, 상기 A를 3' 말단염기로 포함하는 프라이머 및 적당한 크기의 DNA 단편을 증폭할 수 있는 반대 방향 프라이머를 고안하여 PCR 반응을 수행할 경우, 상기 변이 위치의 염기가 A인 경우에는 증폭반응이 정상적으로 수행되어 원하는 위치의 밴드가 관찰되고, 상기 염기가 G로 치환된 경우에는 프라이머는 주형 DNA에 상보결합할수 있으나, 3' 말단 쪽이 상보결합을 하지 못함으로써 증폭반응이 제대로 수행되지 않는 점을 이용한 것이다. DASH는 통상적인 방법으로 수행될 수 있고, 바람직하게는 프린스 등에 의한 방법에 의하여 수행될 수 있다.

한편, PCR 연장 분석은 먼저 단일염기 다형성이 위치하는 염기를 포함하는 DNA 단편을 프라이머 쌍으로 증폭을 한 다음, 반응에 첨가된 모든 뉴클레오티드를 탈인산화시킴으로써 불활성화시키고, 여기에 특이적 연장 프라이머, dNTP 혼합물, 디디옥시뉴클레오티드, 반응 완충액 및 DNA 중합효소를 첨가하여 프라이머 연장반응을 수행함으로써 이루어진다. 이때, 연장 프라이머는 변이 부위가 위치하는 염기의 5' 방향의 바로 인접한 염기를 3' 말단으로 삼으며, dNTP 혼합물에는 디디옥시뉴클레오티드와 동일한 염기를 갖는 핵산이 제외되고, 상기 디디옥시뉴클레오티드는 변이를 나타내는 염기 종류 중 하나에서 선택된다. 예를 들어, A에서 G로의 치환이 있는 경우, dGTP, dCTP 및 TTP 혼합물과 ddATP를 반응에 첨가할 경우, 상기 치환이 일어난 염기에서 프라이머는 DNA 중합효소에 의하여 연장되고, 몇 염기가 지난 후 A 염기가 최초로 나타나는 위치에서 ddATP에 의하여 프라이머 연장반응이 종결된다. 만일 상기 치환이 일어나지 않았다면, 그 위치에서 연장반응이 종결되므로, 상기 연장된 프라이머의 길이를 비교함으로써 변이를 나타내는 염기 종류를 판별할 수 있게 된다.

이때, 검출방법으로는 연장 프라이머 또는 디디옥시뉴클레오티드를 형광 표지한 경우에는 일반적인 염기서열 결정에 사용되는 유전자 분석기(예를 들어, ABI사의 Model 3700 등)를 사용하여 형광을 검출함으로써 상기 변이를 검출할 수 있으며, 무-표지된 연장 프라이머 및 디디옥시뉴클레오티드를 사용할 경우에는 MALDI-TOF(matrix assisted laser desorption ionization-time of flight) 기법을 이용하여 분자량을 측정함으로써 상기 SNP의 유전적 변이를 검출할 수 있다.

구체적으로, 본 발명의 소음인 판별을 위한 정보를 제공하는 방법은

(c1) 상기 (b) 단계에서 결정된 염기서열 중, 상기 서열번호 1의 염기서열로 구성되는 폴리뉴클레오티드의 26번째 염기에 해당하는 염기가 T일 경우, 개체는 남성 소음인이라고 판단하는 단계를 추가로 포함할 수 있다.

또한, 본 발명의 소음인 판별을 위한 정보를 제공하는 방법은

(c2) 상기 (b) 단계에서 결정된 염기서열 중, 상기 서열번호 2의 염기서열로 구성되는 폴리뉴클레오티드의 26번째 염기에 해당하는 염기가 G일 경우, 개체는 여성 소음인이라고 판단하는 단계를 추가로 포함할 수 있다.

본 발명의 마커를 이용하면 객관적이고 높은 정확도 및 높은 재현성으로 소음인 체질인지 여부를 판별할 수 있고, 효과적인 건강관리에도 널리 활용될 수 있다.

도 1은 본 발명에서 제공하는 소음인 판별용 SNP 마커를 발굴하고 이를 검증하는 방법을 나타내는 개략도이다.
도 2는 WGS(Whole Genome Sequence) raw data를 분석하는 과정을 나타내는 개략도이다.
도 3은 전 염색체 상에서의 한국인참조유전체(Ref) 대비 전형적인 소음인(SE) 유전체 SNP의 대립유전자 빈도(allele frequency) 비율의 변화 양상을 표시한 것으로, 빨간선은 전형적인 소음인의 SNP 대립유전자 빈도가 일반 한국인(Ref)의 SNP 대립유전자 빈도보다 세 배 더 높은 것을 나타낸다.
도 4는 소음인 남성에서 rs136639의 ROC(Receiver Operating Characteristic)를 분석하여 rs136639의 소음인군 판별 정확도를 계산한 결과를 나타낸 것이다.
도 5는 소음인 여성에서 rs174956063의 ROC를 분석하여 rs174956063의 소음인군 판별 정확도를 계산한 결과를 나타낸 것이다.

이하 본 발명을 실시예를 통하여 보다 상세하게 설명한다. 그러나 이들 실시예는 본 발명을 예시적으로 설명하기 위한 것으로 본 발명의 범위가 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.

실시예 1. 연구대상자 선정

연구대상자는 기본적으로 체질 약재를 30일 이상 복용하고 전문의에 의해 체질이 확진되었으며, 체질 판별 설문지(KS15)를 완료한 사람을 대상으로 하였다. KS15를 통해서 각 대상자는 태음인, 소음인, 소양인에 대한 확률값을 부여받으며, 이 확률값을 더하면 100%가 되도록 하였다. 상기 체질확진자는 2009년부터 2012년 사이에 수집되어 한의임상정보은행(KDC, Korean medicine Data Center)에서 관리하고 있다.

WGS(Whole Genome Sequencing)를 위한 소음인 대상자는 대사증후군이 없는 건강한 20~30대를 대상으로 하였고, 체질량 지수(BMI, body mass index)가 18.5 kg/m² 이상으로 저체중인 사람은 제외하였다. 이들 중 소음인에 대한 KS15 체질 확률값이 높은 순서대로 남녀 각 8 명을 WGS 분석을 위해 선별하였다.

WGS 대상자 16명을 제외한 체질 확진자(1401명: 남 509명, 여 892명)는 소음인 후보 WGS SNP의 검증용 genotyping을 위한 대상자들이며, KS15 설문 기반의 체질 확률값이 제시되어 있다.

WGS 및 genotyping을 위한 DNA는 혈액에서 추출되어 -80℃ 초저온 냉동고에 보관하였다.

실시예 2. 소음인과 연관된 SNP 탐색

실시예 2-1: WGS data 생산

염기서열 해독(sequencing)을 위해 해독 전문기관인 ㈜마크로젠에 연구용역으로 의뢰하여 실시하였다.

WGS DNA 샘플의 농도와 순도는 QC 기준을 통과하였으며, TruSeq DNA PCR free 타입의 라이브러리 구축에 대한 QC도 기준을 통과하였다. WGS 생산은 Illumina 사의 HiSeq X를 사용하여 실시하였다(30X, 90G).

WGS raw data는 RTA 2(Real Time Analysis 2) 소프트웨어로 생성하였으며, Illumina 사의 bcl2fastq(버전 2.15.0) 패키지를 이용하여 BCL(base calls) binary 파일을 FASTQ로 전환하였다.

생성된 WGS raw data는 Isaac aligner(버전 01.15.02.08), Isaac variant caller(버전 2.0.13), SnpEff(버전 3.3), Manta(버전 0.20.2), Control-FREEC(버전 6.4) 소프트웨어로 분석하여, SNP, structural variant, copy number variants(CNV)를 선별하였고, variant annotation까지 수행하였다(도 2).

실시예 2-2: WGS data 비교 분석- 한국인 참조 유전체와의 비교

WGS data 생산으로 얻어진 전형적인 소음인 SNP 정보는 VCF(variant call format)으로 확보하였고, 비교 분석할 한국인 참조 유전체의 VCF 파일은 질병관리본부로부터 분양 받아 사용하였다(한국인 참조 유전체는 개인식별정보, 임상정보 등이 포함되지 않으며 남녀 구별이 없음).

소음인 남녀 각 8명의 WGS SNP과 한국인 참조 유전체의 SNP의 대립유전자 빈도를 비교하였다. 즉, 일반 한국인에 비해서 전형적인 소음인에서 높은 빈도로 존재하는 SNP이 있다면 소음인의 특성과 연관될 수 있다고 보았다.

전형적인 소음인 연관 SNP은 SNP의 대립유전자 빈도 차이가 3배 이상으로 소음인에서 높아야 하고, 비교 대상이 되는 소음인 8명(남자든 여자든)은 해당 SNP의 대립유전자 2개 중에 1개는 보유하고 있어야 한다. 또한, 서로 강한 LD(linkage disequilibrium, D′> 0.7) 관계에 있는 SNP들은 해당 LD에서 1개를 선별하는 것으로 하였다.

추가적으로 남녀별로 선별한 소음인 연관 후보 SNP에 대해서 남녀 통합 8명(소음인 확률값이 높은 남녀 각 4명씩)을 대상으로도 한국인 참조 유전체 SNP과 비교 분석으로 대립유전자 빈도 차이가 높게 나오는 SNP을 조사하였다. 전형적인 소음인 16명의 임상 정보는 하기 표 1에 정리하였다.

Trait	Men (n = 8)		Women (n = 8)
	mean	SD	mean	SD
Age	31.0	5.1	35.2	4.3
BMI (kg/m2)	19.9	1.2	19.6	0.53
Height (cm)	172.6	6.7	159.6	5.7
Weight (kg)	59.5	7.3	50.0	3.8
Waist (cm)	74.7	5.8	72.5	5.4
WHR	0.828	0.051	0.805	0.051
SBP (mmHg)	109	8.5	115	19.3
DBP (mmHg)	68.4	7.9	75.9	6.6
Triglyceride (mg/dl)	97.5	39.3	83.5	35.5
HDL cholesterol (mg/dl)	41.8	9.7	52.9	7.3
Fasting glucose (mg/dl)	92.3	5.5	93.3	6.0

소음인 16명에 대한 WGS을 모두 확보하였고, 분석에서 나온 SNP 개수는330~350만개 이며, synonymous SNP, non-synonymous SNP, splicing variant, stop 코돈이나 frame shift와 관련된 SNP를 확인할 수 있었다. 소음인 16명의 WGS에서 나온 SNP 정보는 하기 표 2에 나타내었다.

Sample	SNPs	Synonymous coding variants	Non-synonymous coding variants	Splicing variants	Stop gained	Stop lost	Frame shift	% from dbSNP
S1	3,480,987	10,852	9,954	246	67	44	298	97.6
S2	3,495,611	10,886	9,776	255	83	44	266	97.7
S3	3,502,274	11,039	9,932	250	75	45	289	97.5
S4	3,297,934	10,090	9,020	223	61	32	281	97.9
S5	3,411,269	10,323	9,321	236	65	32	301	97.7
S6	3,241,078	9,705	8,702	236	56	38	298	97.9
S7	3,354,024	10,313	9,230	227	62	35	271	97.8
S8	3,378,609	10,315	9,361	245	70	41	328	97.8
S9	3,354,014	10,135	9,277	212	71	40	245	97.8
S10	3,338,337	10,326	9,286	230	70	45	265	97.8
S11	3,418,551	10,301	9,385	233	70	36	266	97.6
S12	3,342,846	10,122	9,074	231	75	37	292	97.9
S13	3,442,817	10,803	9,624	254	68	42	248	97.8
S14	3,413,203	10,531	9,439	245	67	44	306	97.8
S15	3,412,051	10,572	9,701	239	64	33	249	97.8
S16	3,440,945	10,717	9,735	247	78	40	303	97.8

남녀 별로 대립유전자 빈도의 차이를 도 3에 표시하였다. SNP 대립유전자 빈도의 소음인:일반인 비율을 로그 스케일로 표시하기 위해서 비율에 대해 log3을 취했으며, 이 경우, 3배의 비율 SNP은 Y축 값이 1을 나타나게 된다. 남녀별 중복 SNP 및 강한 LD SNP을 제외하여 총 65개의 소음인 연관 후보 SNP를 선별하였다.

실시예 2-3: 개별 SNP genotyping

실시예 1의 1401명의 체질확진자를 대상으로 하여 상기 소음인 연관 후보 SNP의 개별적인 genotyping을 TaqMan 기법을 활용하여 실시하였고, 개별 SNP genotyping은 ㈜테라젠이텍스에 연구용역으로 의뢰하여 수행하였다. 개별 SNP의 genotype은 PLINK 프로그램 포맷 및 엑셀 파일 형태로 생성하였다.

소음인 연관 후보 SNP로서, genotype이 생산되고 추후 검증 대상으로 삼은 SNP은 총 65개로, 이들을 대상으로 소음인 연관성 검증 분석을 실시하였다.

실시예 3. 소음인과 연관된 SNP의 검증

실시예 3-1: 선형 회귀 분석

체질확진자 1401명 전체 집단과 남자 집단 및 여자 집단을 대상으로 선형 회귀 분석을 PLINK 프로그램으로 실시하였다. 이때 종속 변수는 KS15 소음인 확률값이며, 독립 변수는 SNP genotype(0, 1, 2로 표현)이고, 공변수는 나이와 성별(전체 집단 분석에서만)이다.

검증의 기준은,

① WGS 비교 분석에서 연관된 성별 집단과 일치하게 연관성이 나오고(전체 집단에서 나온 WGS SNP의 경우면 남녀 집단 상관하지 않음), ② WGS 비교 분석에서 확인한 소음인 연관 대립유전자에 의해서 KS15 소음인 확률값이 증가 추세에 있으며(β > 0), ③ p 값이 0.05 미만이다.

소음인 연관 후보 SNP 중에서 소음인 확률값의 증가와 유의하게 연관되어 있는 SNP은 2개 나왔는데, 이는 rs136639, rs74956063 이다.

SNP rs136639(T>G)는 WGS 비교 분석에서 남자 집단에서 T 대립유전자의 빈도가 참조 한국인에 비해 3배 이상 높게 나왔으며, 선형 회귀분석에서는 남자 집단에서 T 대립유전자가 소음인 확률값을 유의하게 높이는 것으로 나타났다 (표 3).

SNP rs74956063(G>C)는 WGS 비교 분석에서 전체와 남자 집단에서 G 대립유전자의 빈도가 참조 한국인에 비해 3배 이상 높게 나왔으며, 선형 회귀분석에서는 여자 집단에서 G 대립유전자가 소음인 확률값을 유의하게 높이는 것으로 나타났다(표 3).

SNP	Chr	Allele	Subject	A1	n	Beta	95% CI	P
rs136639	22	T>G	All	G	1401	-0.0047	-0.022, 0.013	0.60
			Men	G	509	-0.039	-0.065, -0.013	0.0031
			Women	G	892	0.017	-0.0064, 0.039	0.16
rs74956063	19	G>C	All	C	1401	-0.013	-0.032, 0.0057	0.17
			Men	C	509	0.012	-0.018, 0.041	0.44
			Women	C	892	-0.026	-0.050, -0.0017	0.036

실시예 3-2: 소음인 판별력 분석

소음인 판별력 탐색을 위한 ROC(Receiver Operating Characteristic) 분석을 위해, 체질확진자 중 20대 이상의 성인을 대상으로 소음인 확률값을 5 분위로 나누고 확률값이 가장 낮은 1 분위군을 비소음인군으로, 확률값이 가장 높은 5 분위군을 소음인군으로 지정하였다.

비소음인군 대비 소음인군에 대해서 로지스틱 회귀 모델을 계산하여, ROC curve 분석을 위한 예측 확률값을 확보하였다. 소음인군 대상 로지스틱 회귀 모델은 나이, 허리-엉덩이 둘레비, 중성지방, 수축기혈압, 공복혈당을 기본 변수로 하고, 소음인 판별 SNP의 genotype(0, 1, 2)의 효과를 보고자 하였다. 따라서, 소음인 판별 SNP이 제외된 신체 측정 변수에 의한 로지스틱 회귀 모델의 소음인군 예측 확률값과 SNP이 포함되었을 때의 소음인군 예측 확률값을 계산하여 비교하였다. x축을 1-특이도로 y축을 민감도로 하는 ROC curve에 대해서 판별 정확도를 의미하는 AUC(Area Under the Curve)값과 p 값을 계산하였고, 소음인 판별 SNP에 의한 AUC 증가량을 확인하였다.

ROC 분석 결과, 남성 소음인에서 rs136639는 비소음인군 대비 소음인군 판별에 대해 76.4% 정확도(AUC)를 보임으로써, 기본 정보(base: 나이, 허리-엉덩이 둘레비, 중성지방, 수축기혈압, 공복혈당)만으로 구한 정확도 대비 정확도가 2.3% 증가하는 것을 확인하였다(도 4).

또한, 여성 소음인에서 rs74956063은 비소음인군 대비 소음인군 판별에 대해 75.4% 정확도(AUC)를 보임으로써, 기본 정보(base: 나이, 허리-엉덩이 둘레비, 중성지방, 수축기혈압, 공복혈당)만으로 구한 정확도 대비 정확도가 1.4% 증가하는 것을 확인하였다(도 5).

따라서, rs136639는 남성 소음인에 대해, rs74956063은 여성 소음인에 대해 소음인 판별 마커로 활용할 수 있음을 확인하였다.

<110> Korea Institute of Oriental Medicine <120> Composition for determining Soeumin <130> KPA181407-KR <160> 2 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 51 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> rs136639 <220> <221> variation <222> (26) <223> y = g or t <400> 1 ccgccatacc aggctaatgt ttaaaytttt tttgtagagg cagggtttcg c 51 <210> 2 <211> 51 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> rs74956063 <220> <221> variation <222> (26) <223> k = c or g <400> 2 tgtacagaaa attcaaagtc tggctkagca agaaaaatag gagcaacggg g 51

Claims (10)

1. 서열번호 1의 염기서열로 구성되는 폴리뉴클레오티드 또는 이의 상보적인 폴리뉴클레오티드를 포함하는, 남성 소음인 판별용 마커 조성물.
   
2. 서열번호 1의 염기서열로 구성되는 폴리뉴클레오티드, 또는 이의 상보적인 폴리뉴클레오티드를 검출 또는 증폭할 수 있는 제제를 포함하는, 남성 소음인 판별용 조성물.
   
3. 제2항에 있어서, 상기 서열번호 1의 염기서열에서 26번째 염기는 T인 것인, 남성 소음인 판별용 조성물.
   
4. 서열번호 2의 염기서열로 구성되는 폴리뉴클레오티드 또는 이의 상보적인 폴리뉴클레오티드를 포함하는, 여성 소음인 판별용 마커 조성물.
   
5. 서열번호 2의 염기서열로 구성되는 폴리뉴클레오티드, 또는 이의 상보적인 폴리뉴클레오티드를 검출 또는 증폭할 수 있는 제제를 포함하는, 여성 소음인 판별용 조성물.
   
6. 제5항에 있어서, 상기 서열번호 2의 염기서열에서 26번째 염기는 G인 것인, 여성 소음인 판별용 조성물.
   
7. 제2항 또는 제3항의 조성물을 포함하는, 남성 소음인 판별용 키트.
   
8. (a) 남성 개체로부터 분리된 시료의 DNA로부터 서열번호 1의 염기서열로 구성되는 폴리뉴클레오티드 또는 이의 상보적인 폴리뉴클레오티드의 SNP를 포함하는 다형성 부위(polymorphic site)를 증폭시키는 단계; 및
   (b) 상기 증폭된 다형성 부위의 염기를 결정하는 단계;를 포함하는, 남성 소음인 판별을 위한 정보를 제공하는 방법.
   
9. 제5항 또는 제6항의 조성물을 포함하는, 여성 소음인 판별용 키트.
   
10. (a) 여성 개체로부터 분리된 시료의 DNA로부터 서열번호 2의 염기서열로 구성되는 폴리뉴클레오티드 또는 이의 상보적인 폴리뉴클레오티드의 SNP를 포함하는 다형성 부위(polymorphic site)를 증폭시키는 단계; 및
    (b) 상기 증폭된 다형성 부위의 염기를 결정하는 단계;를 포함하는, 여성 소음인 판별을 위한 정보를 제공하는 방법.

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