KR102136643B1 - 신규한 간암 진단 마커 및 이의 용도 - Google Patents

Abstract

본 발명은 신규한 간암 진단 마커 및 이의 용도에 관한 것으로, 간암을 예측 및 진단하기 위한 신규한 바이오 마커 조성물, 간암 진단용 조성물, 간암 진단 키트 및 간암을 예측 및 진단하기 위한 정보 제공 방법에 관한 것이다. 본 발명에 따른 신규한 간암 진단 마커들은 단일 불포화 지방산에 의한 증식성 간암세포에서 발현수준이 증가되어 있는 것으로 확인됨에 따라 이들 마커들을 간암 진단을 위한 용도로 유용하게 사용할 수 있다.

Description

신규한 간암 진단 마커 및 이의 용도{Novel hepatocellular carcinoma diagnostic marker and use thereof}

본 발명은 신규한 간암 진단 마커 및 이의 용도에 관한 것이다.

간암(hepatocellular carcinoma; HCC)은 세계적으로 가장 치명적인 암 중 하나이다. 특히 아시아와 사하라 이남 아프리카에서, 해마다 약 오십만명 이상이 간암으로 사망하고 있으며 우리나라의 경우도 해마다 간암 환자수가 증가하고 있다.간암의 발생은 p53이나 p16 ^INK4A과 같은 종양 억제제 유전자의 불활성화로 발병되기도 하고, 그 밖에 잘 알려지지 않은 발암유전자(oncogene)에 의해 활성화된다. 그 외, 간 조직에 B형 간염과 C형 간염 바이러스의 감염 및 아플라톡신 β1의 노출이 그 원인으로 보고되고 있으며, TGF-α(transforming growth factor α) 및 TGF-β와 같은 몇 가지 생장인자(growth factor)들이 간암의 진행기작에 연관됨이 보고되고 있다. 이 외에도 DNA 돌연변이와 유전자 발현의 유전적 변화(genetic alteration)등이 간암의 환자조직에서 확인된다는 보고가 있다.

한편, 간암의 근본적 치료로 간절제술이 있으나, 초기에 진단받은 30~40%만이 수술적 치료를 할 수 있으며, 수술을 시행할 수 없는 진행된 간암에 대한 보존적 항암치료는 효과가 낮고 재발율이 높아 초기 진단이 매우 중요시되고 있다.

현재 간암 진단을 위해 사용되는 방법으로는 초음파 검사, CT 검사, MRI 검사 등의 화상 진단 검사, 혈청 검사(AFP, PIVKA-II) 및 생검 재료의 병리 조직 검사가 이용되고 있다.

또한 최근에는 암을 조기에 진단하기 위하여 종양 마커를 이용한 진단방법이 사용되고 있는데, 종양 마커의 경우 특정 암 세포에서 과발현되는 경우가 많기 때문에 종양 마커가 기준치 이상으로 발현되었다는 것이 확인되면 바로 특정 장기의 암을 진단할 수 있기 때문이다. 또한 종양 마커를 이용한 암의 진단은 대부분 항체를 이용한 혈액 검사방법으로 수행되고 있으며, 일부는 조직 추출액, 소변, 대변 등을 이용하여 검사하기도 한다. 간암의 대표적인 종양 마커로는 알파-페토프로틴, 즉, 알파태아단백(Alpha-Fetoprotein:AFP)이 사용되고 있는데, AFP는 간세포가 형질전환되어 암세포로 탈분화 되었을 때 비정상적으로 생성되는 당단백질로서, 원발성 간암, 간염, 간경변 및 태아성암 등의 발견과 치료경과의 관찰에 이용되고 있다.

그러나 종래 사용되고 있는 AFP 간암 마커의 경우, 이에 대한 진단율은 40~50%에 불과하고 지방간이나 간염 환자들과의 차이가 나질 않는다는 단점이 있다. 따라서 이런 단점을 보강하여 조기 간암의 진단율을 효과적으로 증가시킬 수 있는 새로운 종양 마커의 개발이 시급한 실정이다.

한편, 지방산(fatty acid)은 높은 증식율을 보이는 암에서 증가되어 있는 것으로 보고되고 있으며, 암 세포로부터 분비 단백질을 조절하는 것으로 알려져 있다. 예로, 리놀레익산(linoleic acid)은 유방암에서 플라즈미노겐 활성 억제제 1(plasminogen activator inhibitor-1)의 분비를 증가시키는 것으로 알려져 있고, 올레이트산(Oleate)은 유방암 세포에서 MMP9의 분비를 증가시켜 암의 침습을 유도하는 것으로 알려져 있으며, 스테로이드성 간암 세포에서 인터루킨-8의 분비를 증가시켜 간염의 발생가능성을 높이는 것으로 알려져 있다. 특히, 지방산의 종류 중에서 올레이트산은 포유동물에서 가장 풍부한 순환형 자유 지방산(circulating free FA)이며, 암 조직에서 지방산의 수준이 증가되어 있는 것으로 알려져 있다.

그러나 아직까지 단일불포화 지방산인 올레이트가 간암에 미치는 구체적인 영향 및 올레이트 지방산에 의해 간암 세포 또는 간암 조직에서 발현의 변화를 보이는 인자들에 대한 연구는 미비한 실정이다.

대한민국 등록특허 제10-0325766호 대한민국 등록특허 제10-1351234호

이에 본 발명자들은 간암세포, 구체적으로는 단일불포화 지방산에 의한 증식성 간암세포에서 발현수준이 증가되어 있는 유전자들을 발굴하였고, 발굴된 이들 유전자들을 새로운 간암 진단용 바이오마커로 사용할 수 있음을 확인함으로써 본 발명을 완성하였다.

따라서 본 발명의 목적은 간암을 예측 및 진단하기 위한 신규한 바이오 마커 조성물을 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 신규한 간암 진단용 조성물을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 본 발명의 간암 진단용 조성물을 포함하는 간암 진단 키트를 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 간암을 예측 및 진단하기 위한 정보 제공 방법을 제공하는 것이다.

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 하기 표에 기재된 18개의 유전자들 중에서 선택되는 하나 이상의 유전자 또는 상기 유전자로부터 발현된 단백질을 포함하는, 간암을 예측 및 진단하기 위한 바이오 마커 조성물을 제공한다.

본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 유전자는 단일불포화 지방산 처리 시, 간암 세포에서 발현 수준이 증가하는 것일 수 있다.

본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 바이오 마커 조성물은 단일불포화 지방산에 의한 간암 세포의 증식 여부를 결정하는 것일 수 있다.

또한, 본 발명은 상기 표에 기재된 18개의 유전자들 중에서 선택되는 하나 이상의 유전자에 대한 mRNA 또는 이의 단백질 수준을 측정하는 물질을 포함하는, 간암 진단용 조성물을 제공한다.

본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 물질은 상기 표에 기재된 18개의 유전자들 중에서 선택되는 하나 이상의 유전자 또는 단백질에 특이적으로 결합하는 프라이머, 프로브 또는 항체일 수 있다.

본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 간암 진단용 조성물은 단일불포화 지방산에 의한 간암세포의 증식 여부를 결정하는 것일 수 있다.

또한 본 발명은 상기 본 발명의 간암 진단용 조성물을 포함하는, 간암 진단 키트를 제공한다.

나아가 본 발명은, (a) 환자로부터 분리된 생물학적 시료로부터 제1항의 표에 기재된 18개 유전자의 mRNA 또는 단백질 발현양을 측정하는 단계; 및 (b) 정상 대조군 시료로부터 상기 유전자의 mRNA 또는 단백질 발현양을 측정하여 상기 (a) 단계의 측정 결과와 비교하는 단계를 포함하는, 간암을 예측 및 진단하기 위한 정보 제공 방법을 제공한다.

본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 생물학적 시료는 피검체로부터 분리된 간 조직, 간 세포 또는 이들의 배양액일 수 있다.

본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 유전자의 mRNA 또는 단백질 발현양이 정상 대조군에 비해 증가되어 있는 경우, 간암이 발병하였거나 증식성 간암인 것으로 판단하는 단계를 더 포함하는 것일 수 있다.

본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 간암은 단일불포화 지방산에 의한 암 세포 증식활성을 갖는 증식성 간암일 수 있다.

본 발명은 간암을 예측 및 진단하기 위한 신규한 바이오 마커 조성물, 간암 진단용 조성물, 간암 진단 키트 및 간암을 예측 및 진단하기 위한 정보 제공 방법에 관한 것이다. 본 발명에 따른 신규한 간암 진단 마커들은 간암 발생의 원인이 되는 단일불포화 지방산을 처리할 경우, 발현이 증가되는 것으로 확인됨에 따라 이들 마커들을 간암 진단을 위한 용도로 유용하게 사용할 수 있다.

도 1은 본 발명의 일실시예에서 간암세포주(HepG2)를 대상으로 올레이트 처리에 따른 분비 단백질체의 변화 양상을 분석하기 위한 실험과정을 모식도로 나타낸 것이다.
도 2는 올레이트 처리에 따른 간암세포주의 세포증식 촉진 작용을 확인한 것으로, 2a는 올레이트 처리 농도별 간암세포의 증식 정도를 확인한 것이고, 2b는 팔미테이트와 올레이트를 함께 처리한 군 및 올레이트 단독 처리 군에서의 간암 세포의 증식 정도를 비교 분석한 것이다.
도 3은 올레이트를 처리한 군(Ole-CM#) 및 올레이트를 처리하지 않은 군(NT-CM#)에서의 LC-MS/MS 실험에 따른 베이스 피크의 크로마토그램을 나타낸 것이다.
도 4는 LC-MS/MS 분석에 의해 수득한 24개의 LC-MS/MS 데이터세트에 대한 ID (4a) 및 강도(4b)에 대한 유사도를 힛맵(heat map) 형식으로 나타낸 것으로, 올레이트 처리군은 ‘Oleate treated’로, 올레이트 미처리군은 ‘Control’로 나타내었고, 칼라 막대기는 유사도 점수의 정도를 나타낸 것이다.
도 5는 올레이트 처리군 및 올레이트 미처리군에 대한 MS-GF+ 분석 결과로 동정된 펩타이드 수와(도 5a), AMT-DB를 이용하여 동정한 펩타이드 수를 나타낸 것이다(도 5b).
도 6은 간암 세포주에서 올레이트 처리에 의해 상향 조절된 분비 단백질들을 세포 기능별로 분석하여 분류한 것을 나타낸 것이다.

본 발명은 간암을 예측 및 진단할 수 있는 신규한 바이오마커 및 이의 용도를 제공함에 특징이 있다.

본 발명자들은 간암을 정확하고 효과적으로 예측 및 진단할 수 있는 바이오마커를 발굴하기 위해 연구하던 중, 간암 세포주를 대상으로 단일불포화 지방산을 처리한 군과 처리하지 않은 군에서 발현 수준의 차이를 보이는 유전자들을 동정하였다.

구체적으로 단일불포화 지방산의 종류 중, 올레이트가 암 세포의 증식을 유도하는 것을 하기 실험을 통해 확인하였으며, 올레이트 처리에 의해 간암 세포에서 발현이 증가되는 유전자들을 분비 단백질체의 프로파일 분석을 통해 동정하였고, 이 중에서 최종 총 18개의 유전자들을 간암의 예측 및 진단을 위한 신규한 바이오 마커로 사용할 수 있음을 확인하였다.

따라서 본 발명은 하기 표에 기재된 18개의 유전자들 중에서 선택되는 하나 이상의 유전자 또는 상기 유전자로부터 발현된 단백질을 포함하는, 간암을 예측 및 진단하기 위한 바이오 마커 조성물을 제공할 수 있다.

또한, 상기 표에 기재된 18개의 유전자들은 올레이트에 의한 간암 세포의 증식 여부를 결정할 수 있는데, 즉 상기 18개의 유전자들 중에서 선택된 하나 이상의 유전자의 발현이 환자로부터 수득한 시료에서 정상 대조군에 비해 증가되어 있는 경우, 간암 세포의 증식 가능성 또는 간암의 발병 가능성이 있다고 판단할 수 있다.

따라서 본 발명은 상기 표에 기재된 18개의 유전자들 중에서 선택되는 하나 이상의 유전자에 대한 mRNA 또는 이의 단백질 수준을 측정하는 물질을 포함하는, 간암 진단용 조성물을 제공할 수 있다.

또한, 상기 물질은 상기 표에 기재된 18개의 유전자들 중에서 선택되는 하나 이상의 유전자 또는 단백질에 특이적으로 결합하는 프라이머, 프로브 또는 항체일 수 있다.

본 발명에서 상기 바이오마커란, 간암 발병 시, 간 조직 또는 간 세포에서 발현의 증가 또는 감소를 보이는 폴리펩타이드 또는 핵산(예컨대, mRNA 등), 지질, 당지질, 당단백질, 당(단당류, 이당류, 올리고당류 등) 등과 같은 유기 생체 분자 등을 포함한다. 본 발명에서 제공하는 바이오마커는 정상 간 조직에 비해 단일불포화지방산, 바람직하게는 올레이트가 처리된 간 세포에서 발현양이 증가하는 상기 18개의 유전자 또는 상기 유전자들이 발현된 단백질일 수 있다.

본 발명에서 유전자의 발현수준은, 바람직하게 상기 유전자가 발현된 mRNA 수준, 즉, mRNA의 양을 의미하며, 상기 수준을 측정할 수 있는 물질로는 상기 유전자에 특이적인 프라이머 또는 프로브를 포함할 수 있다. 본 발명에서 상기 18개 중에서 선택되는 어느 하나 이상의 유전자에 특이적인 프라이머 또는 프로브는 상기 유전자의 전체 또는 유전자의 특정 영역을 특이적으로 증폭할 수 있는 프라이머 또는 프로브일 수 있으며, 상기 프라이머 또는 프로브는 당업계에 알려진 방법을 통해 디자인할 수 있다.

본 발명에서 상기 프라이머란 용어는 적합한 온도 및 적합한 완충액 내에서 적합한 조건(즉, 4종의 다른 뉴클레오시드 트리포스페이트 및 중합반응 효소) 하에서 주형-지시 DNA 합성의 개시점으로 작용할 수 있는 단일-가닥 올리고뉴클레오타이드를 의미한다. 프라이머의 적합한 길이는 다양한 요소, 예컨대, 온도와 프라이머의 용도에 따라 변화가 있을 수 있다. 또한, 프라이머의 서열은 주형의 일부 서열과 완전하게 상보적인 서열을 가질 필요는 없으며, 주형과 혼성화되어 프라이머 고유의 작용을 할 수 있는 범위 내에서의 충분한 상보성을 가지면 충분하다. 따라서 본 발명에서의 프라이머는 주형인 유전자의 뉴클레오타이드 서열에 완벽하게 상보적인 서열을 가질 필요는 없으며, 이 유전자 서열에 혼성화되어 프라이머 작용을 할 수 있는 범위 내에서 충분한 상보성을 가지면 충분하다. 또한, 본 발명에 따른 프라이머는 유전자 증폭 반응에 이용될 수 있는 것이 바람직하다.

상기 증폭 반응은 핵산 분자를 증폭하는 반응을 말하며, 이러한 유전자의 증폭 반응들에 대해서는 당업계에 잘 알려져 있고, 예컨대, 중합효소 연쇄반응(PCR), 역전사 중합효소 연쇄반응(RT-PCR), 리가아제 연쇄반응(LCR), 전자 중재 증폭(TMA), 핵산 염기서열 기판 증폭(NASBA) 등이 포함될 수 있다.

본 발명에서, 상기 프로브라는 용어는 자연의 또는 변형된 모노머 또는 연쇄(linkages)의 선형 올리고머를 의미하며, 디옥시리보뉴클레오타이드 및 리보뉴클레오타이드를 포함하고 타켓 뉴클레오타이드 서열에 특이적으로 혼성화할 수 있으며, 자연적으로 존재하거나 또는 인위적으로 합성된 것을 말한다. 본 발명에 따른 프로브는 단일쇄일 수 있으며, 바람직하게는 올리고디옥시리보뉴클레오티드일 수 있다. 본 발명의 프로브는 자연 dNMP(즉, dAMP, dGMP, dCMP 및 dTMP), 뉴클레오타이드 유사체 또는 유도체를 포함할 수 있다. 또한, 본 발명의 프로브는 리보뉴클레오타이드도 포함할 수 있다. 예컨대, 본 발명의 프로브는 골격 변형된 뉴클레오타이드, 예컨대, 펩타이드 핵산 (PNA) (M. Egholm et al., Nature, 365:566-568(1993)), 포스포로티오에이트 DNA, 포스포로디티오에이트 DNA, 포스포로아미데이트 DNA, 아마이드-연결된 DNA, MMI-연결된 DNA, 2'-O-메틸 RNA, 알파-DNA 및 메틸 포스포네이트 DNA, 당 변형된 뉴클레오타이드 예컨대, 2'-O-메틸 RNA, 2'-플루오로 RNA, 2'-아미노 RNA, 2'-O-알킬 DNA, 2'-O-알릴 DNA, 2'-O-알카이닐 DNA, 헥소스 DNA, 피라노실 RNA 및 안히드로헥시톨 DNA, 및 염기 변형을 갖는 뉴클레오타이드 예컨대, C-5 치환된 피리미딘(치환기는 플루오로-, 브로모-, 클로로-, 아이오도-, 메틸-, 에틸-, 비닐-, 포르밀-, 에티틸-, 프로피닐-, 알카이닐-, 티아조릴-, 이미다조릴-, 피리딜- 포함), C-7 치환기를 갖는 7-데아자퓨린 (치환기는 플루오로-, 브로모-, 클로로-, 아이오도-, 메틸-, 에틸-, 비닐-, 포르밀-, 알카이닐-, 알켄일-, 티아조릴-, 이미다조릴-, 피리딜-), 이노신 및 디아미노퓨린을 포함할 수 있다.

또한, 본 발명에서 상기 단백질의 수준을 측정할 수 있는 물질로는 상기 본 발명의 마커 유전자로부터 발현된 단백질에 대해 특이적으로 결합할 수 있는 다클론 항체, 단일클론 항체 및 재조합 항체 등의 항체를 포함 할 수 있다.

상기 “항체”는 당해 기술분야의 일반적 기술자가 공지된 기술을 이용하여 제조된 것을 사용할 수 있는데, 상기 항체의 제조는 예컨대, 다클론 항체의 경우에는 상기 단백질의 항원을 동물에 주사하고 동물로부터 채혈하여 항체를 포함하는 혈청을 수득하는 당업계에 널리 공지된 방법에 의해 생산할 수 있으며, 이러한 다클론 항체는 염소, 토끼, 양, 원숭이, 말, 돼지, 소, 개 등의 임의의 동물 종 숙주로부터 제조가능하다. 단일클론 항체의 경우에는 당업계에 널리 공지된 하이브리도마(hybridoma) 방법(Kohler et al., European Jounral of Immunology, 6, 511-519, 1976)을 이용하여 제조할 수 있거나 또는 파지 항체 라이브러리(Clackson et al, Nature, 352, 624-628, 1991, Marks et al, J. Mol. Biol., 222:58, 1-597, 1991) 기술을 이용하여 제조할 수 있다. 또한, 본 발명에 따른 항체는 2개의 전체 길이의 경쇄 및 2개의 전체 길이의 중쇄를 가지는 완전한 형태뿐만 아니라, 항체 분자의 기능적인 단편을 포함할 수 있다. 항체 분자의 기능적인 단편이란 적어도 항원 결합 기능을 보유하고 있는 단편을 뜻하며, Fab, F(ab'), F(ab') 2 및 Fv 등이 있다. 또한, 본 발명은 상기 본 발명에 따른 간암 진단용 마커 또는 상기 간암 진단용 조성물을 포함하는 간암 진단 키트를 제공할 수 있다.

본 발명의 간암 진단 키트는 상기 마커 유전자의 발현 수준 또는 상기 유전자로부터 발현된 단백질의 양을 측정할 수 있는 프라이머, 프로브 또는 항체를 포함할 수 있으며, 이들의 정의는 앞서 기술된 바와 같다.

본 발명의 간암 진단 키트가 만일 PCR 증폭 과정에 적용되는 경우, 본 발명의 키트는 선택적으로, PCR 증폭에 필요한 시약, 예컨대, 완충액, DNA 중합효소(예컨대, Thermus aquaticus (Taq), Thermus thermophilus (Tth), Thermus filiformis, Thermis flavus, Thermococcus literalis 또는 Pyrococcus furiosus(Pfu)로부터 수득한 열 안정성 DNA 중합효소), DNA 중합 효소 조인자 및 dNTPs를 포함할 수 있으며, 본 발명의 간암 진단용 키트가 면역 분석에 적용되는 경우, 본 발명의 키트는 선택적으로, 이차항체 및 표지의 기질을 포함할 수 있다.

나아가, 본 발명에 따른 키트는 상기한 시약 성분을 포함하는 다수의 별도 패키징 또는 컴파트먼트로 제작될 수 있다.

또한 본 발명은 상기 간암 진단용 바이오 마커를 포함하는 간암 진단용 마이크로어레이를 제공할 수 있다.

본 발명의 마이크로어레이에 있어서, 상기 마커 단백질 또는 이를 암호화하는 유전자의 발현 수준을 측정할 수 있는 프라이머, 프로브 또는 항체는 혼성화 어레이 요소(hybridizable array element)로서 이용되며, 기질(substrate) 상에 고정화된다. 바람직한 기질은 적합한 견고성 또는 반-견고성 지지체로서, 예컨대, 막, 필터, 칩, 슬라이드, 웨이퍼, 파이버, 자기성 비드 또는 비자기성 비드, 겔, 튜빙, 플레이트, 고분자, 미소입자 및 모세관을 포함할 수 있다. 상기 혼성화 어레이 요소는 상기 기질 상에 배열되고 고정화되며, 이와 같은 고정화는 화학적 결합 방법 또는 UV와 같은 공유 결합적 방법에 의해 수행될 수 있다. 예를 들어, 상기 혼성화 어레이 요소는 에폭시 화합물 또는 알데히드기를 포함하도록 변형된 글래스 표면에 결합될 수 있고, 또한 폴리라이신 코팅 표면에서 UV에 의해 결합될 수 있다. 또한, 상기 혼성화 어레이 요소는 링커(예: 에틸렌 글리콜 올리고머 및 디아민)를 통해 기질에 결합될 수 있다.

한편, 본 발명의 마이크로어레이에 적용되는 시료가 핵산일 경우에는 표지(labeling)될 수 있고, 마이크로어레이상의 어레이 요소와 혼성화 될 수 있다. 혼성화 조건은 다양할 수 있으며, 혼성화 정도의 검출 및 분석은 표지 물질에 따라 다양하게 실시될 수 있다.

나아가 본 발명은 간암을 예측 및 진단하기 위한 정보 제공 방법을 제공할 수 있는데, 바람직하게 상기 방법은 (a) 환자로부터 분리된 생물학적 시료로부터 제1항의 표에 기재된 18개 유전자의 mRNA 또는 단백질 발현양을 측정하는 단계; 및 (b) 정상 대조군 시료로부터 상기 유전자의 mRNA 또는 단백질 발현양을 측정하여 상기 (a) 단계의 측정 결과와 비교하는 단계를 포함한다.

상기에서 유전자의 발현 수준 또는 단백질의 양을 측정하는 방법은 공지의 기술을 이용하여 생물학적 시료로부터 mRNA 또는 단백질을 분리하는 공지의 공정을 포함하여 수행될 수 있다.

본 발명에서 상기 "생물학적 시료"란 간암의 발생 또는 진행 정도에 따른 상기 유전자의 발현 수준 또는 단백질의 수준이 정상 대조군과는 다른, 생체로부터 채취된 시료를 말하며, 상기 시료로는 예를 들면, 이에 제한되지는 않으나, 조직, 세포, 혈액, 혈청, 혈장, 타액 및 뇨 등이 포함될 수 있고, 바람직하게는 간암 조직, 간암 세포 또는 이들의 배양액일 수 있다.

상기 유전자의 발현 수준 측정은 바람직하게는 mRNA의 수준을 측정하는 것이며, mRNA의 수준을 측정하는 방법으로는 역전사 중합효소연쇄반응(RT-PCR), 실시간 역전사 중합효소연쇄반응, RNase 보호 분석법, 노던 블럿 및 DNA 칩 등이 있으나, 이에 제한되지는 않는다.

또한, 단백질의 양 또는 단백질의 활성을 측정하는 방법은 당업계에 공지된 다양한 방법을 통해 수행될 수 있는데, 예를 들면, 이에 제한되지는 않으나, 웨스턴 블럿, 노던 블럿, ELISA(enzyme linked immunosorbent assay), 방사선면역분석(RIA: radioimmunoassay), 방사 면역 확산법(radioimmunodiffusion) 및 면역침전분석법(immunoprecipitation assay)등을 이용하여 수행할 수 있다.

상기 단백질 수준의 측정은 항체를 이용할 수 있는데, 이러한 경우, 생물학적 시료 내의 상기 마커 단백질과 이에 특이적인 항체는 결합물, 즉, 항원-항체 복합체를 형성하며, 항원-항체 복합체의 형성량은 검출 라벨(detection label)의 시그널의 크기를 통해서 정량적으로 측정할 수 있다. 이러한 검출 라벨은 효소, 형광물, 리간드, 발광물, 미소입자(microparticle), 레독스 분자 및 방사선 동위원소로 이루어진 그룹 중에서 선택할 수 있으며, 이에 제한되는 것은 아니다. 단백질 수준을 측정하기 위한 분석 방법으로는, 이에 제한되지는 않으나, 웨스턴 블럿, ELISA, 방사선면역분석, 방사선 면역 확산법, 오우크테로니 면역 확산법, 로케트 면역전기영동, 조직면역 염색, 면역침전 분석법, 보체 고정분석법, FACS, 단백질 칩 등이 있다.

따라서 본 발명은 상기와 같은 검출 방법들을 통하여, 대조군의 마커 유전자의 mRNA 발현 양 또는 단백질의 양과 간암 환자 또는 간암 의심환자에서의 마커 유전자의 mRNA 발현 양 또는 단백질의 양을 확인할 수 있고, 상기 발현 양의 정도를 대조군과 비교함으로써 간암의 발병 여부, 진행단계 또는 예후 등을 예측 및 진단할 수 있다.

보다 구체적으로 상기 간암의 발병을 예측 또는 진단하는 방법은 본 발명에 따른 마커 유전자의 발현 수준 또는 그 발현 단백질의 양이 정상 대조군 시료에 비해 증가되었을 경우, 간암이 유발하였거나 증식성 간암인 것으로 판단할 수 있다.

또한, 상기 증식성 간암은 단일불포화 지방산에 의해 암 세포의 증식이 촉진된 증식성 간암일 수 있으며, 바람직하게 상기 단일불포화 지방산은 올레이트일 수 있다.

이상 기술한 바와 같이, 본 발명에서 동정한 18개의 신규 간암 진단 및 예측용 바이오마커는 단일불포화 지방산에 의한 암세포 증식 활성을 갖는 간암 세포에서 발현이 증가되고 분비가 증가되는 분비 단백질로서, 이들 마커의 발현수준을 측정함으로써 간암을 손쉽게 예측 및 진단할 수 있다.

이하 본 발명을 실시예에 의하여 더욱 상세하게 설명한다. 이들 실시예는 단지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 국한되지 않는다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.

< 준비예 및 실험방법>

시약 및 세포배양

소듐 올레이트(O7501, St. Louis, MO) 및 소듐 팔미테이트(P9767, St. Louis, MO)는 시그마 알드리치사로부터 구입하였다. 소태아 혈청(BSA), fraction V 및 자유 지방산(fatty acid-free)(126575, San Diego, CA)은 칼바이오켐으로부터 구입하여 사용하였다. 올레이트 또는 팔미테이트는 100% 메탄올에 용해하여 사용하였고, 자유지방산과 BSA를 결합시켰는데, 이때 지방산 대 BSA는 5:1의 몰비로 사용하였다. 또한 이들을 세포에 처리할 때에는 혈청이 없는 MEM(Minimum Essential Medium)로 희석하여 적절한 최종 농도롤 제조하여 사용하였다. HepG2 세포는 MEM(Welgene, LM 007-07)배지를 이용하여 배양하였고, 이후 10%(v/v)의 FBS(Lonza), 2mM 글루타민 및 1% 페니실린-스트렙토마이신(Gibco)을 첨가하고 37℃, 5% CO2 및 95% 습도 조건에서 배양하였다.

세포증식 어세이

세포 증식은 비색 분석법으로 MTT (시그마 알드리치, M5655)를 사용하여 세포 생존 능력을 분석하였다. HepG2 세포를 96 웰 플레이트에 분주하고 24시간 동안 배양 후, 배지를 첨하지 않은 상태로 12시간 동안 배양한 다음, 24시간 동안 지방산을 첨가하여 배양하였고, 이후 세포분비체 분석(secretome analysis)을 위한 시료 준비를 하였다. 이때 대조군 시료는 지방산 대신 동일 농도의 메탄올 및 BSA를 처리한 것을 사용하였다. 세포에 0.5 mg/ml MTT 시약을 처리하고 페놀-레드 배지로 희석 후, 37℃ CO₂ 배양기에서 배양하였다. 2시간 후, 100 μl DMSO를 첨가하여 포르마잔 크리스탈을 용해시켰다. 강도측정은 540 nm 흡광도에서 마이클로플레이트 리더기를 이용하여 측정하였다.

시료제조

HepG2 세포를 지방산 처리 전 12시간 동안 기아 상태를 유지시킨 후, 이들 세포로부터 분비되는 분비인자(secretory factors)들의 제거를 위해 1xPBS로 3회 세척하였다. 올레익산이 처리된 시료의 제조를 위해 BSA-결합된 올레익산(Oleate)를 혈청이 없는 배지를 이용하여 최종 500uM의 농도가 되도록 희석하여 처리하고 24시간 동안 배양하였다. 대조군으로는 올레익산이 없는 혈청 없는 배지를 동일양으로 처리한 것을 사용하였다. 또한 컨디션화된 배지(conditioned media)는 보충되지 않은 혈청이 없는 배지로 교체하여 24시간 동안 37℃ CO₂ 배양기에서 배양하여 제조하였다. 이후 상기 배양배지를 3000rpm으로 4℃에서 10분 동안 원심분리하였고, 상층액을 수득하여 여과필터로 여과하여 오염물질들을 제거하였으며, 최종 수득한 컨디션화된 배지(conditioned media)는 동결건조기를 이용하여 건조시켜 시료를 제조하였다.

단백질 추출 및 분해

상기 방법으로 수득한 건조된 시료를 용해버퍼(urea, NaCl, 50mM Tris-HCl (pH 8.2))로 용해시키고 복합 미니 프로테아제 억제제 타블렛(Roche Applied Science, Basel, Switzerland)을 처리하였다. 이후 초원심분리기로 45,000xg로 4℃에서 1시간 동안 원심분리하였다. 이후, 상층액에 함유된 단백질 농도를 DC protein assay (Bio-Rad, Hercules, USA)를 이용하여 정량하였고, 단백질 시료를 0.5M DTT(100 μl)를 이용하여 50분동안 37℃에서 환원반응 시켰다. 이후 1.5 μl의 1M iodoacetamide를 처리하고 암 조건에서 30분 동안 상온에서 알킬화 반응을 수행하였다. 반응이 완료된 시료를 트립신으로 분해(1:50 enzyme-to-protein ratio (w/w), Promega, Madison, WI, USA)반응 시켰는데 37℃에서 밤새도록 반응시켰다. 반응이 완료된 펩타이드 시료들은 2500xg로 10분 동안 상온에서 원심분리 하였으며, 수득한 수용액을 reverse-phase tC18 Sep-Pak solid-phase extraction cartridges를 이용한 고상 추출(solid-phase extraction)을 통해 탈염처리 하였다. 이후 최종적인 펩타이드를 50% ACN 및 0.5% HAcO의 용매를 이용하여 용출시켰으며, 스피브백에서 건조시키고 0.1% 포름산 용액으로 용해시켰다. 이후 상기 시료를 LC-MS/MS 분석이전까지 20℃에서 보관하였다.

LC-MS/MS 분석

모든 펩타이드 시료들은 분석용 컬럼(Thermo Scientific, Easy-Column, 75 μm× 50 cm) 및 트랩 컬럼(75 μm× 2 cm)이 구비된 Thermo EASY-nLC 1000 (Thermo Scientific, Odense, Denmark) 장비를 이용하여 분리하였다. 이때 분석용 컬럼을 위한 작동 온도는 50℃가 되도록 하였고, 유속은 300 nl/min이 되도록 하였으며, 용매로 용매 A는 0.1% 포름산 및 2% 아세토니트릴이 함유된 물을 사용하였고 용매 B는 0.1% 포름산 및 2% 물이 함유된 아세토니트릴 용매를 사용하였다. 목적하는 단백질체(proteome) 분석을 위해 120분 동안 농도 구배 조건으로 펩타이들을 분석하였으며, 상기 농도구배는 2~40% 용매 B로 90분간 용출, 40~80% 용매 B로 10분간 용출, 80% 용매 B로 10분간 용출, 80~2% 용매 B로 10분간 용출시켰다. LC로부터 분리된 펩타이들은 nanoelectrospray 소스가 구비된 QExactive ™ hybrid quadrupole-Orbitrap mass spectrometer (Thermo Scientific)를 이용하여 분석하였으며, 용출된 펩타이드의 이온화를 위해 전사분사 이온화의 전기적 포텐셜이 1.7 kV가 되도록 하였고, 탈용매 모세관(desolvation capillary)의 온도가 270℃가 되도록 하였다. 또한 Q-Exactive 질량분석기는 데이터 종속 모드에서 450~2000 Thomsons (Th)의 질량범위에 대한 조사 스캔들을 70,000의 해상도 (m/z 200)로 수득하도록 작동시켰다. 이후 MS/MS 분석을 위해, 2.0Th의 분리 윈도우를 사용하여 조사 스캔에서 가장 많이 함유된 상위 10개의 이온들을 선별하였고, 25 표준 충돌 에너지 및 10초의 제외 기간으로 설정된 높은 에너지 충돌해리(HCD) 방식으로 펩타이드 이온을 단편화하였다.

이후 MS/MS 스캔들은 17,500의 해상도로 획득하였고, 전체 MS 및 MS/MS 스캔을 위한 최대 이온 주입시간은 각각 100ms 및 50ms로 하였다. 자동 게인 컨트롤(AGC) 목표 값은 전체 MS 및 MS/MS 스캔 각각에 대해 1.0 × 10⁶ 및 1.0 × 10⁵로 설정하였다.

펩타이드 동정

각 절편들의 스펙트럼은 MSConvert(ProteoWizard release: 3.0.4323) 방법을 이용하여 mzXML 파일로 생성되었다. MS 데이터는 1차적으로 탠덤 MS 데이터에 정확한 전구체 질량을 할당하기 위해 PE-MMR(postexperiment-monoisotopic mass refinement)을 사용하여 스펙트럼을 보정하였다. 또한 MS-GF + Beta (v10089) 분석 엔진을 사용하여 human-reference proteome (UniProtKB release 2015_11, 42,123개 단백질의 UniProtKB / Swiss-Prot 항목과 179 개의 일반적인 오염 단백질 목록이 포함된 복합 데이터베이스에 대해 target-decoy 설정으로 MS/MS 스펙트럼을 검색하였으며, 이때 다음의 파라미터들에 대한 분석을 수행하였다; semitryptic, 전구체 질량 허용 오차 10 ppm, 시스테인의 카르바미도메틸화를 고정 변형 옵션으로, 메티오닌 산화를 가변 변형 옵션으로 설정하였다. 또한 24개의 LC-MS/MS 데이터 세트의 검색 결과를 모두 결합하고, 타겟-디코이 분석을 상기 결합된 데이터세트에 적용하여 거짓 검출율 (FDR)이 0.01 이하인 펩타이드를 동정하였다.

비 표지 방식의 펩타이드의 정량분석

동정된 펩타이드에 대해 각각 MS 강도를 할당하기 위해, 이전에 기술된 바와 같이 24 개의 LC-MS/MS 데이터 세트에 MS 강도 기반의 비 표지 방식의 정량화 방법을 적용 하였다. 간단하게, PE-MMR 분석을 통해 LC-MS/MS 실험에서 LC 용출 동안 특정 시간에서 연속적으로 나타난 펩타이드의 MS 스펙트럼들을 고유질량등급 (UMC)으로 분류 하였다. 이상적으로, 각각의 UMC는 하나의 펩타이드에 상응하며, 펩타이드에 상응하는 이온들 및 그들의 전하 상태, 존재량 (강도), 스캔 번호 및 측정된 단일 동위원소 질량 등의 질량 스펙트럼 특징을 포함한다. 각 UMC에 대해 UMC에 속하는 모든 이온의 단일동위원소질량의 강도 가중 평균을 계산하여 UMC 질량을 계산하였다. UMC에 상응하는 펩타이드의 경우, 해당 펩타이드의 존재량은 UMC (UMC 강도)의 모든 이온 존재량의 합계로 평가하였다. 또한 PE-MMR으로 보정된 MS/MS 스펙트럼의 전구체 질량을 UMC 질량과 부합시킨 다음, 해당 값을 UMC의 질량으로 대체하였다. 이 과정에서 MS/MS 스펙트럼 정보는 부합된 UMC에 연동하였다. 연동된 MS/MS 스펙트럼은 이전 MS-GF + 검색 및 타겟-디코이 분석으로 계산된 FDR ≤ 0.01의 펩타이드서열 (펩타이드 ID)에 할당되었다. 펩타이드 ID는 UMC에 할당되었고, UMC 강도는 펩타이드 ID의 강도 값으로 할당하였다.

마스터 정밀질량/시간 태그 데이터베이스에 의한 UMC의 할당

미확인된 UMC에 펩타이드 ID를 할당하기 위해 이전에 기술한대로 마스터 정밀 질량/시간 태그 (AMT) 데이터베이스 (DB)를 제작하여 사용하였다. 간단히 설명하면, 24개의 LC-MS/MS 데이터 (8개 시료를 3회 반복한 LC-MS/MS 분석)의 펩타이드 ID를 가진 UMC에 대한 정보를 마스터 AMT DB 형태로 수집하였다. AMT는 실험으로 측정한 단일 동위원소 질량(monoisotopic masses)과 표준화된 용출 시간 (NET)으로 결정되는 독특한 펩타이드 서열이며, 각 AMT에 상응하는 펩타이드가 여러 번 측정된 경우 펩타이드의 평균 질량 및 NET의 중앙값을 AMT에 기록하였다. 이후 ± 10 p.p.m.의 질량 및 ± 0.02의 NET 오차를 허용하여 미확인된 UMC를 마스터 AMT DB의 AMT에 매핑하였다. 매핑 과정에서 확인되지 않은 UMC가 질량 및 NET 허용 오차 내에서 AMT에 매핑된 것을 확인하고, AMT와 UMC의 MS/MS 스펙트럼 간의 유사성을 평가하기 위해 Xcorr 측정 값을 계산하였다. 마지막으로 미확인된 UMC는 Xcorr이 3.0보다 클 때 AMT와 일치하도록 결정하였고, AMT와 일치하는 각각의 미확인된 UMC에 대해 AMT에 대한 펩타이드 ID를 미확인된 UMC에 할당하였고, 이때 AMT (UMC mass 및 NET)에 대한 모든 정보를 함께 할당하였다.

동정된 펩타이드의 정렬 과정

마스터 AMT DB를 사용하여 미확인 UMC를 할당한 후, LC-MS/MS 데이터 세트의 할당 및 확인된 UMC를 nm 정렬 표(m개 시료에서 나타난 n개의 UMC 및 UMC 강도에 대한 펩타이드 ID)로 정리하였다. 정렬 표의 누락된 값은 펩타이드가 해당 데이터 세트에서 확인되지 않았다는 것을 의미한다. 표의 각 행에 누락된 값을 채우기 위하여 UMC 질량 및 NET을 기준으로 정렬된 UMC와 일치할 가능성이 있는 미확인 UMC를 다음과 같은 오차 허용 기준으로 추가 검색하였다: 같은 시료에 대한 반복 데이터세트에 대해서는 ±10 p.p.m. 질량오차 및 ±0.01 NET 오차의 허용, 다른 실험 시료에 대해서는 ±10 p.p.m. 질량오차 및 ±0.02 NET 오차의 허용. 추가 검색으로 정렬표의 누락된 값을 추가한 뒤, 표에 나타난 UMC 강도에 대해 표본분위 표준화 (Quantile normalization)를 수행하여 데이터 세트 전반의 펩타이드 존재량을 보정하였다. 또한 LC-MS/MS 분석의 재현성을 평가를 위해, LC-MS/ MS 데이터 세트 사이에서 중복되는 펩타이드 ID 개수와 펩타이드 강도를 측정하여 각각을 두 가지 유형의 유사성 점수 (ID 유사성, 강도 유사성)로 계산하였다.

분비량이 유의하게 변하는 단백질의 동정

올레이트 처리 유무에 따라 분비량이 유의하게 변하는 단백질 (differentially secreted proteins; DSP)을 확인하기 위해, 이전에 보고된 통합 통계 방법을 정렬 표의 UMC (펩타이드) 강도에 적용하여 유의하게 발현이 변하는 펩타이드 (DEpeptides)를 선택하였다. 해당 통계 방법을 간단히 설명하면, 올레이트 처리된 시료에서 각 펩타이드의 log₂- 강도를 Student 's t- 테스트 및 각 펩타이드에 대한 T- 값 및 log₂- 중간비를 결과로 하는 중위도 테스트에 의해 미처리된 대조군의 log₂- 강도와 비교하였다. 이후 24 개의 시료를 무작위로 1000번 반복하여 T 값과 log₂ - 중간비의 경험적 귀무 분포를 추정하였다. 각 펩타이드에 대해 관찰된 T 값과 log₂ - 중간 비의 조정된 P 값은 양측 테스트를 통해 경험적 분포를 사용하여 계산하였고 Stouffer의 방법을 사용하여 통합된 P값을 계산하였다. DEpeptide는 다음과 같은 기준으로 정의되었다. 첫째, 올레이트를 처리, 혹은 처리하지 않은 조건 중 하나에서 적어도 6개의 시료에서 해당 펩타이드가 검출된 경우, 둘째, 펩타이드의 통합된 P 값이 0.05 미만이며 펩타이드의 log₂-비율의 절대값이 log₂- 중간비의 실험적 귀무 분포 상에서 95 백분위 이상인 경우, 해당 펩타이드를 DEpeptide로 동정하였다. 또한, 이렇게 얻은 DEpeptide에 추가로 올레이트의 처리 유무에 두 조건 중에서, 하나의 조건 하에서 모든 시료에서 검출이 되지 않았지만 다른 조건 하에서는 적어도 6개 시료에서 검출되는 펩타이드를 DEpeptides로 선택했다. 마지막으로, 올레이트 처리시 증가하거나 감소한 고유 DEpeptide 수가 2개 이상인 단백질에 대해서, 각각 증가하거나 감소한 DSP로 동정하였다.

검출된 단백질 또는 DSPs의 기능적 분석

검출된 단백질 또는 DSPs의 단백질 리스트들에 대한 Gene Ontology 생물학적 과정(GOBPs) 또는 Kyoto Encyclopedia의 Genes 및 Genomes (KEGG) 경로의 분석(enrichment analysis)을 DAVID 소프트웨어를 이용하여 분석하였다. 특정 단백질 목록을 대표하는 GOBP는 P <0.01 인 GOBP로 동정하였고, 세포 기능의 P 값은 시각화를 위해 Z = -N^-1 (P)를 사용하여 Z- 점수로 변환하였으며 여기서 N^-1은 역 표준 정규 분포를 나타낸다.

웨스턴 블럿팅

웨스턴 블럿팅을 위해 HepG2 세포를 프로테아제 칵테일(Roche Diagnostics, Indianapolis, USA)이 함유된 용해버퍼(10mM Tris-HCl, pH 7.4, 1.5mM EDTA, 10% Glycerol)를 이용하여 수집하였다. 이후 초음파 처리 및 원심분리를 수행하였고 브래드포드 시약으로 단백질을 정량하였다. 분비체(Secretome) 시료를 용해버퍼로 용해시키고 동결건조시켜 농축시킨 후, SDS 버퍼와 혼합하였다. 이후 6~16%의 농도구배 SDS-PAGE 겔 전기영동하고 니트로셀룰로스 막으로 이동시킨 후, 5% 스킴 밀크를 함유한 TBS-T 용액으로 30분 동안 블록킹을 수행한 다음, 1차 항체로 4℃에서 밤새도록 반응시켰고 이후 horseradish peroxidase가 결합된 항-마우스 또는 항-레빗 항체로 1시간 동안 반응시켰다. 이후 TBS-T 용액으로 멤브레인을 세척하고 ECL 용액을 이용하여 현상화시켜 단백질 발현 정도를 분석하였다.

데이터 이용

질량 분석 프로테오믹스 데이터는 PRIDE (데이터 세트 식별자 PXD007906 및 10.6019 / PXD007906)를 통해 ProteomeXchange 컨소시엄에 기탁된 것을 사용하였다.

< 실시예 1>

올레이트 지방산 처리에 의한 간암 세포의 세포증식 여부 확인

본 발명자들은 먼저 올레이트 지방산이 간암 세포의 세포증식을 촉진하는 작용을 하는지 확인하기 위해, 올레이트를 각 농도별로 간암 세포주인 HepG2 세포에 처리한 후, MTT 분석을 통해 간암 세포의 증식 여부를 분석하였다.

그 결과, 올레이트를 처리한 HepG2 세포군이 올레이트를 처리하지 않은 세포군에 비해 세포증식이 더 높은 것으로 나타났다. 따라서 이러한 결과를 통해 지방산인 올레이트가 간암 세포주의 세포 증식을 촉진할 수 있음을 알 수 있었다(도 2a 참조).

한편, 포화지방산 중 하나인 팔미테이트(palmitate)는 암 세포의 증식을 억제하는 활성이 있는 것으로 알려져 있어, 본 발명자들은 올레이트의 암세포 증식 활성을 재확인하기 위해 올레이트 단독처리군 및 올레이트와 팔미테이트 복합처리군에서의 세포증식 정도를 분석하였다.

그 결과, 도 2b에 나타낸 바와 같이, 올레이트 단독처리군이 올레이트와 팔미테이트의 복합처리군에 비해 암세포 증식이 현저히 높은 것으로 나타났다.

이로써 지방산 중 하나인 올레이트는 간암세포의 세포증식을 촉진시키는 활성이 있음을 알 수 있었고, 올레이트에 의한 암세포 증식에 의해 간암이 발병 및 진행될 수 있음을 알 수 있었다.

< 실시예 2>

올레이트 지방산 처리에 의해 발현수준의 변화를 보이는 간암세포주에서의 분비 단백질체 분석

나아가 본 발명자들은 실시예 1의 결과를 토대로, 올레이트 지방산에 의한 간암 발병여부 및 간암세포의 증식여부를 확인할 수 있는 바이오마커의 발굴을 위한 방법으로 질량분석 실험을 수행하였다. 간암 세포주인 HepG2 세포에 올레이트 지방산을 처리한 군과 처리하지 않은 군을 대상으로 상기 세포에서 분비되는 단백질들 중, 발현수준의 변화를 보이는 분비 단백질체들을 스크리닝하였다. 해당 분석 방법은 앞서 기술된 실험방법으로 수행하였고, 실험의 모식도는 도 1에 나타내었다. 또한 올레이트 처리군(n=4)과 미처리군(n=4)의 세포주에 대해 각각 3번씩 반복실험을 수행하여 결과를 추출하였다.

<2-1> LC-MS/MS 분석결과

올레이트 지방산을 처리한 HepG2 세포군과 올레이트 미처리 HepG2 세포군의 배양배지를 수득한 후, 트립신 처리로 단백질들을 가수분해하고, LC-MS/MS 분석을 수행하였다.

그 결과, 도 3에 나타낸 바와 같이, 올레이트를 처리한 HepG2 세포군에 대해 12개의 LC-MS/MS 데이터세트를 수집하였고, 올레이트 미처리 HepG2 세포군에 대해 12개의 LC-MS/MS 데이터세트를 수집하여 총 24개의 LC-MS/MS 데이터세트를 얻었다.

<2-2> 펩타이드 동정

상기 방법으로 수득한 24개의 LC-MS/MS 데이터세트에 대해 타겟 디코이 방법을 이용한 MS-GF+ 검색방법으로 PE-MMR 분석을 수행하여 펩타이드들의 특성을 분석하였고, 24개의 데이터세트로부터 확인된 UMC(고유질량등급:unique mass class)를 이용하여 30,933개의 펩타이드를 포함하는 마스터 AMT DB를 구축하였다. 이후 AMT DB를 사용하여 개별 시료의 미확인된 UMC에 대한 질량 및 NET 허용 오차를 사용하여 DB의 펩타이드와 일치시킨 다음, 일치된 펩타이드에 대해 ID를 할당하였다. AMT DB 검색 후 펩타이드는 24 개의 LC-MS/MS 데이터 세트에서 UMC 강도로 정량화시킨 다음 정렬표로 정리하였다. Quantile normalization에 의해 정상화된 펩타이드 존재량(peptide abundances; UMC 농도)을 사용하여 Mueller et al.에 의해 ID 및 강도 유사성 점수를 사용하여 비 표지 LC-MS/MS 분석의 재현성을 조사하였고, 24 개의 LC-MS/MS 데이터 세트의 평균 ID 및 강도 유사성 점수는 각각 0.94 및 0.90으로 비 표지 LC-MS/MS 분석의 높은 재현성을 확인하였다(도 4 참조). 또한, AMT DB에 있는 30,933 개의 펩타이드를 기반으로 2개 이상의 고유 펩타이드를 가진 단백질로 높은 신뢰성을 지닌 2640 개의 HepG2 분비 단백질(2630 개의 단백질 부호화 유전자)을 확인하였다. 상기 방법에 따른 MS-GF+ 분석 및 AMT DB 분석 결과는 도 5에 나타내었다.

<2-3> 올레이트 처리에 따른 발현변화를 보이는 분비 단백질의 확인

본 발명자들은 올레이트 처리 시, 간암 세포의 분비 단백질 중에서 발현 변화를 보이는 단백질들을 분석하였다. 이를 위해 먼저 24개의 상기 LC-MS/MS 세트(올레이트를 처리한 12개 시료 및 올레이트 미처리 12개 시료)에서 정량화된 30,933 펩타이드를 정렬표로 구성하고, 올레이트 처리군 및 미처리군에서의 이들 펩타이드의 존재량(abundances)을 비교분석 하였다. 즉, 정렬된 펩타이드에 대해 상기 기술된 통합 통계 방법을 사용하여 올레이트 처리에 의해 유의하게 증가 또는 감소된 2461개의 고유 펩타이드를(DEpeptide)를 동정하였다(P <0.05).

그 결과, 2개의 고유 펩타이드가 올레이트 처리에 의해 일관되게 증가 또는 감소 패턴을 보일 때, 이를 DSP(differentially secreted protein)로 정의하였고, 그 결과 349개의 DSP를 동정하였다. 이중 12 개의 DSP는 2개 이상의 증가, 감소된 DEpeptide가 한 단백질에서 동시에 나타나, 해당 DSP를 배제하였다. 남은 DSP들 중에서 145개가 올레이트 처리 시 증가되는 것으로 확인되었고, 192개는 감소됨을 확인하였다. 여기서 올레이트에 의해 간암 세포주에서 증가하는 145개의 단백질 리스트를 하기 표 1에 나타내었다.

올레이트에 의해 상향조절되는 145개의 단백질

번호	UniProtKB accession	Entrez ID	Symbol	Description	Number of unique DEpeptides
1	Q96DT5	8701	DNAH11	dynein, axonemal, heavy chain 11	2
2	Q07021	708	C1QBP	complement component 1, q subcomponent binding protein	2
3	P14174	4282	MIF	macrophage migration inhibitory factor (glycosylation-inhibiting factor)	3
4	P06727	-	APOA4	-	18
5	P13645	3858	KRT10	keratin 10, type I	3
6	P35637	2521	FUS	FUS RNA binding protein	3
7	P52815	6182	MRPL12	mitochondrial ribosomal protein L12	3
8	P00505	2806	GOT2	glutamic-oxaloacetic transaminase 2	2
9	Q9BPW8	8508	NIPSNAP1	nipsnap homolog 1 (C. elegans)	2
10	Q92608	1794	DOCK2	dedicator of cytokinesis 2	2
11	P23588	1975	EIF4B	eukaryotic translation initiation factor 4B	2
12	O15067	5198	PFAS	phosphoribosylformylglycinamidine synthase	2
13	P02787	7018	TF	transferrin	12
14	P61916	10577	NPC2	Niemann-Pick disease, type C2	2
15	P07306	432	ASGR1	asialoglycoprotein receptor 1	2
16	Q86VP6	55832	CAND1	cullin-associated and neddylation-dissociated 1	4
17	P49902	22978	NT5C2	5'-nucleotidase, cytosolic II	2
18	P10619	5476	CTSA	cathepsin A	4
19	P53999	10923	SUB1	SUB1 homolog, transcriptional regulator	2
20	Q6IN85	55671	PPP4R3A	protein phosphatase 4 regulatory subunit 3A	2
21	P02753	5950	RBP4	retinol binding protein 4	3
22	Q9NTK5	29789	OLA1	Obg-like ATPase 1	3
23	P06681	717	C2	complement component 2	2
24	O43852	813	CALU	calumenin	7
25	P30566	158	ADSL	adenylosuccinate lyase	3
26	Q15582	7045	TGFBI	transforming growth factor beta induced	2
27	Q8NI22	90411	MCFD2	multiple coagulation factor deficiency 2	2
28	Q9H4A6	64083	GOLPH3	golgi phosphoprotein 3	3
29	Q6PCB0	64856	VWA1	von Willebrand factor A domain containing 1	5
30	Q8NBS9	81567	TXNDC5	thioredoxin domain containing 5 (endoplasmic reticulum)	3
31	O43847	4898	NRDC	nardilysin convertase	2
32	O00410	3843	IPO5	importin 5	2
33	P78509	5649	RELN	reelin	18
34	Q86V81	10189	ALYREF	Aly/REF export factor	4
35	P07858	1508	CTSB	cathepsin B	8
36	P08697	5345	SERPINF2	serpin peptidase inhibitor, clade F (alpha-2 antiplasmin, pigment epithelium derived factor), member 2	2
37	P27797	811	CALR	calreticulin	4
38	P31937	11112	HIBADH	3-hydroxyisobutyrate dehydrogenase	3
39	P05067	351	APP	amyloid beta precursor protein	5
40	P29622	5267	SERPINA4	serpin peptidase inhibitor, clade A (alpha-1 antiproteinase, antitrypsin), member 4	2
41	P51659	3295	HSD17B4	hydroxysteroid (17-beta) dehydrogenase 4	4
42	P18859	522	ATP5J	ATP synthase, H+ transporting, mitochondrial Fo complex subunit F6	2
43	P02751	2335	FN1	fibronectin 1	4
44	Q15084	10130	PDIA6	protein disulfide isomerase family A member 6	6
45	Q92820	8836	GGH	gamma-glutamyl hydrolase	4
46	P36955	5176	SERPINF1	serpin peptidase inhibitor, clade F (alpha-2 antiplasmin, pigment epithelium derived factor), member 1	5
47	Q14651	5357	PLS1	plastin 1	2
48	P62805	8294	HIST1H4I	histone cluster 1, H4i	3
49	O60832	1736	DKC1	dyskeratosis congenita 1, dyskerin	2
50	P01019	183	AGT	angiotensinogen	10
51	O95445	55937	APOM	apolipoprotein M	5
52	P07602	5660	PSAP	prosaposin	7
53	P04040	847	CAT	catalase	3
54	P07686	3074	HEXB	hexosaminidase subunit beta	4
55	P10909	1191	CLU	clusterin	2
56	P20142	5225	PGC	progastricsin (pepsinogen C)	2
57	Q14697	23193	GANAB	glucosidase, alpha; neutral AB	3
58	P53634	1075	CTSC	cathepsin C	2
59	P07237	5034	P4HB	prolyl 4-hydroxylase subunit beta	5
60	P00751	629	CFB	complement factor B	2
61	P10451	6696	SPP1	secreted phosphoprotein 1	3
62	Q6P988	147111	NOTUM	notum pectinacetylesterase homolog (Drosophila)	5
63	P61626	4069	LYZ	lysozyme	4
64	P02647	335	APOA1	apolipoprotein A-I	6
65	Q9H993	79624	ARMT1	acidic residue methyltransferase 1	2
66	O43405	1690	COCH	cochlin	4
67	P01011	12	SERPINA3	serpin peptidase inhibitor, clade A (alpha-1 antiproteinase, antitrypsin), member 3	10
68	Q13162	10549	PRDX4	peroxiredoxin 4	3
69	P04114	338	APOB	apolipoprotein B	118
70	P00450	1356	CP	ceruloplasmin (ferroxidase)	16
71	P59998	10093	ARPC4	actin related protein 2/3 complex subunit 4	2
72	P26641	1937	EEF1G	eukaryotic translation elongation factor 1 gamma	2
73	P25705	498	ATP5A1	ATP synthase, H+ transporting, mitochondrial F1 complex, alpha subunit 1, cardiac muscle	2
74	P13473	3920	LAMP2	lysosomal associated membrane protein 2	2
75	P04066	2517	FUCA1	fucosidase, alpha-L- 1, tissue	4
76	P02679	2266	FGG	fibrinogen gamma chain	4
77	Q9UHG2	27344	PCSK1N	proprotein convertase subtilisin/kexin type 1 inhibitor	3
78	P07339	1509	CTSD	cathepsin D	3
79	P19022	1000	CDH2	cadherin 2	3
80	Q9H3G5	54504	CPVL	carboxypeptidase, vitellogenic like	6
81	P06396	2934	GSN	gelsolin	4
82	Q9BZZ5	8539	API5	apoptosis inhibitor 5	2
83	P14625	7184	HSP90B1	heat shock protein 90kDa beta family member 1	3
84	Q15181	5464	PPA1	pyrophosphatase (inorganic) 1	2
85	O15232	4148	MATN3	matrilin 3	4
86	P30101	2923	PDIA3	protein disulfide isomerase family A member 3	9
87	P50895	4059	BCAM	basal cell adhesion molecule (Lutheran blood group)	2
88	Q9NYU2	56886	UGGT1	UDP-glucose glycoprotein glucosyltransferase 1	6
89	O95433	10598	AHSA1	AHA1, activator of heat shock 90kDa protein ATPase homolog 1 (yeast)	2
90	P02795	4502	MT2A	metallothionein 2A	2
91	P18206	7414	VCL	vinculin	2
92	O00584	8635	RNASET2	ribonuclease T2	2
93	Q14696	23184	MESDC2	mesoderm development candidate 2	2
94	P06865	3073	HEXA	hexosaminidase subunit alpha	4
95	Q9BSE5	79814	AGMAT	agmatinase	2
96	Q08830	2267	FGL1	fibrinogen like 1	4
97	P22792	1370	CPN2	carboxypeptidase N subunit 2	2
98	P28799	2896	GRN	granulin	2
99	P05154	5104	SERPINA5	serpin peptidase inhibitor, clade A (alpha-1 antiproteinase, antitrypsin), member 5	4
100	P19823	3698	ITIH2	inter-alpha-trypsin inhibitor heavy chain 2	11
101	P14314	5589	PRKCSH	protein kinase C substrate 80K-H	6
102	P31040	6389	SDHA	succinate dehydrogenase complex flavoprotein subunit A	3
103	P42765	10449	ACAA2	acetyl-CoA acyltransferase 2	2
104	P13688	634	CEACAM1	carcinoembryonic antigen related cell adhesion molecule 1	2
105	Q02818	4924	NUCB1	nucleobindin 1	3
106	O60568	8985	PLOD3	procollagen-lysine, 2-oxoglutarate 5-dioxygenase 3	3
107	Q9Y2B0	10330	CNPY2	canopy FGF signaling regulator 2	4
108	O14773	1200	TPP1	tripeptidyl peptidase I	2
109	Q9UNW1	9562	MINPP1	multiple inositol-polyphosphate phosphatase 1	4
110	P02749	350	APOH	apolipoprotein H	3
111	P13667	9601	PDIA4	protein disulfide isomerase family A member 4	8
112	Q03167	7049	TGFBR3	transforming growth factor beta receptor III	2
113	P01031	727	C5	complement component 5	11
114	P14543	4811	NID1	nidogen 1	4
115	Q9BWS9	66005	CHID1	chitinase domain containing 1	3
116	Q99574	5274	SERPINI1	serpin peptidase inhibitor, clade I (neuroserpin), member 1	2
117	Q14978	9221	NOLC1	nucleolar and coiled-body phosphoprotein 1	2
118	Q06033	3699	ITIH3	inter-alpha-trypsin inhibitor heavy chain 3	5
119	Q96HE7	30001	ERO1A	endoplasmic reticulum oxidoreductase alpha	6
120	Q14554	10954	PDIA5	protein disulfide isomerase family A member 5	2
121	P23141	1066	CES1	carboxylesterase 1	2
122	O94985	22883	CLSTN1	calsyntenin 1	2
123	P07996	7057	THBS1	thrombospondin 1	3
124	P02545	4000	LMNA	lamin A/C	2
125	P10253	2548	GAA	glucosidase, alpha; acid	2
126	P15144	290	ANPEP	alanyl aminopeptidase, membrane	5
127	P35613	682	BSG	basigin (Ok blood group)	2
128	O00748	8824	CES2	carboxylesterase 2	4
129	Q02809	5351	PLOD1	procollagen-lysine, 2-oxoglutarate 5-dioxygenase 1	2
130	P61160	10097	ACTR2	ARP2 actin-related protein 2 homolog (yeast)	2
131	P55145	7873	MANF	mesencephalic astrocyte derived neurotrophic factor	4
132	P11021	3309	HSPA5	heat shock protein family A (Hsp70) member 5	2
133	P12956	2547	XRCC6	X-ray repair complementing defective repair in Chinese hamster cells 6	2
134	P55157	4547	MTTP	microsomal triglyceride transfer protein	2
135	Q9H488	23509	POFUT1	protein O-fucosyltransferase 1	4
136	P00738	3240	HP	haptoglobin	2
137	P62158	801	CALM1	calmodulin 1 (phosphorylase kinase, delta)	2
138	P05156	3426	CFI	complement factor I	6
139	P16870	1363	CPE	carboxypeptidase E	2
140	P62993	2885	GRB2	growth factor receptor bound protein 2	3
141	P22307	6342	SCP2	sterol carrier protein 2	2
142	P15586	2799	GNS	glucosamine (N-acetyl)-6-sulfatase	2
143	P23284	5479	PPIB	peptidylprolyl isomerase B	2
144	P00742	2159	F10	coagulation factor X	2
145	P06576	506	ATP5B	ATP synthase, H+ transporting, mitochondrial F1 complex, beta polypeptide	7

<2-4> 올레이트 처리에 따른 발현변화를 보이는 분비 단백질들의 세포 기능분석

상기 <2-3>에서 올레이트 처리에 의해 발현수준의 변화를 보이는 동정된 단백질들 중, 분비가 증가하는 145개의 단백질들을 대표하는 GOBPs 및 KEGG 경로를 동정하기 위해 DAVID 소프트웨어를 이용하여 기능 분석을 수행하였다.

그 결과, 도 6에 나타낸 바와 같이, 올레이트 처리 시 증가하는 단백질들은 하기 표 2와 같은 세포 기능에 유의하게 관여하였다.

올레이트 처리에 의해 분비가 증가하는 단백질들이 주로 관여하는 세포 기능

번호	Description	Count	P value
1	extracellular matrix organization	21	1.82E-10
2	protein folding	17	2.89E-10
3	response to wounding	33	6.00E-10
4	proteolysis	40	2.17E-09
5	lipid transport	15	3.44E-07
6	cell migration	26	2.46E-05
7	endocytosis	18	3.61E-05
8	inflammatory response	17	1.09E-04
9	lipid metabolic process	23	0.001905
10	cell adhesion	24	0.003426
11	Lysosome	12	5.01E-07
12	Protein processing in endoplasmic reticulum	12	1.20E-05
13	Complement and coagulation cascades	8	3.31E-05

<2-5> 간암 세포주에서 올레이트 처리에 의해 상향조절을 보이는 신규 단백질 동정

상기 간암 세포주에서 올레이트 처리 시 발현수준이 증가하는 총 145개의 단백질들 중에서, 종래 간암과의 관련성에 대한 보고가 없고 올레이트 처리 시 처리하지 않은 군에 비해 간암 세포에서 발현 및 분비가 증가되는 총 18개의 단백질을 동정하였으며, 단백질 리스트는 하기 표 3에 나타낸 바와 같다.

올레이트 처리 시 간암세포에서 증가하는 신규단백질 목록

번호	UniProtKB accession	Entrez ID	Symbol	Description	log2-fold change	서열번호 (아미노산)
1	Q96DT5	8701	DNAH11	dynein, axonemal, heavy chain 11	2.865	1
2	Q9BPW8	8508	NIPSNAP1	nipsnap homolog 1	1.719	2
3	O15067	5198	PFAS	phosphoribosylformylglycinamidine synthase	1.696	3
4	Q6IN85	55671	PPP4R3A	protein phosphatase 4 regulatory subunit 3A	1.527	4
5	Q8NI22	90411	MCFD2	multiple coagulation factor deficiency 2	1.375	5
6	O43847	4898	NRDC	nardilysin convertase	1.354	6
7	Q86V81	10189	ALYREF	Aly/REF export factor	1.291	7
8	P51659	3295	HSD17B4	hydroxysteroid (17-beta) dehydrogenase 4	1.265	8
9	Q14651	5357	PLS1	plastin 1	1.212	9
10	P20142	5225	PGC	progastricsin (pepsinogen C)	1.165	10
11	Q9H993	79624	ARMT1	acidic residue methyltransferase 1	1.099	11
12	Q9UHG2	27344	PCSK1N	proprotein convertase subtilisin/kexin type 1 inhibitor	1.070	12
13	Q9NYU2	56886	UGGT1	UDP-glucose glycoprotein glucosyltransferase 1	1.034	13
14	O95433	10598	AHSA1	AHA1, activator of heat shock 90kDa protein ATPase homolog 1 (yeast)	1.031	14
15	P02795	4502	MT2A	metallothionein 2A	1.029	15
16	Q14696	23184	MESDC2	mesoderm development candidate 2	1.016	16
17	P06865	3073	HEXA	hexosaminidase subunit alpha	1.014	17
18	P19823	3698	ITIH2	inter-alpha-trypsin inhibitor heavy chain 2	1.002	18

이상의 결과를 통해, 본 발명자들은 상기 표 3의 18개의 단백질들을 간암 진단을 위한 새로운 바이오마커로서 사용가능함을 알 수 있었고, 나아가 올레이트에 의한 암 세포 증식 여부를 확인하기 위한 바이오마커로도 사용할 수 있음을 알 수 있었다.

이제까지 본 발명에 대하여 그 바람직한 실시예들을 중심으로 살펴보았다. 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자는 본 발명이 본 발명의 본질적인 특성에서 벗어나지 않는 범위에서 변형된 형태로 구현될 수 있음을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 개시된 실시예들은 한정적인 관점이 아니라 설명적인 관점에서 고려되어야 한다. 본 발명의 범위는 전술한 설명이 아니라 특허청구범위에 나타나 있으며, 그와 동등한 범위 내에 있는 모든 차이점은 본 발명에 포함된 것으로 해석되어야 할 것이다.

<110> Korea Brain Research Institute <120> Novel hepatocellular carcinomar diagnostic marker and use thereof <130> NPDC-71084 <160> 18 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 4516 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> DNAH11 amino acid sequence <400> 1 Met Ala Ala Gln Val Ala Ala Arg Glu Ala Arg Asp Phe Arg Glu Ala 1 5 10 15 Pro Thr Leu Arg Leu Thr Ser Gly Ala Gly Leu Glu Ala Val Gly Ala 20 25 30 Val Glu Leu Glu Glu Glu Glu Glu Asn Glu Glu Glu Ala Ala Ala Arg 35 40 45 Arg Ala Arg Ser Phe Ala Gln Asp Ala Arg Val Arg Phe Leu Gly Gly 50 55 60 Arg Leu Ala Met Met Leu Gly Phe Thr Glu Glu Lys Trp Ser Gln Tyr 65 70 75 80 Leu Glu Ser Glu Asp Asn Arg Gln Val Leu Gly Glu Phe Leu Glu Ser 85 90 95 Thr Ser Pro Ala Cys Leu Val Phe Ser Phe Ala Ala Ser Gly Arg Leu 100 105 110 Ala Ala Ser Gln Glu Ile Pro Arg Asp Ala Asn His Lys Leu Val Phe 115 120 125 Ile Ser Lys Lys Ile Thr Glu Ser Ile Gly Val Asn Asp Phe Ser Gln 130 135 140 Val Val Leu Phe Gly Glu Leu Pro Ala Leu Ser Leu Gly His Val Ser 145 150 155 160 Ala Phe Leu Asp Glu Ile Leu Val Pro Val Leu Ser Asn Lys Asn Asn 165 170 175 His Lys Ser Trp Ser Cys Phe Thr Ser Gln Asp Met Glu Tyr His Ile 180 185 190 Glu Val Met Lys Lys Lys Met Tyr Ile Phe Arg Gly Lys Met Ser Arg 195 200 205 Arg Thr Leu Leu Pro Ile Pro Thr Val Ala Gly Lys Met Asp Leu Asp 210 215 220 Gln Asn Cys Ser Glu Asn Lys Pro Pro Ser Asn Glu Arg Ile Ile Leu 225 230 235 240 His Ala Ile Glu Ser Val Val Ile Glu Trp Ser His Gln Ile Gln Glu 245 250 255 Ile Ile Glu Arg Asp Ser Val Gln Arg Leu Leu Asn Gly Leu His Leu 260 265 270 Ser Pro Gln Ala Glu Leu Asp Phe Trp Met Met Arg Arg Glu Asn Leu 275 280 285 Ser Cys Ile Tyr Asp Gln Leu Gln Ala Pro Val Val Leu Lys Met Val 290 295 300 Lys Ile Leu Thr Thr Lys Gln Ser Ser Tyr Phe Pro Thr Leu Lys Asp 305 310 315 320 Ile Phe Leu Ala Val Glu Asn Ala Leu Leu Glu Ala Gln Asp Val Glu 325 330 335 Leu Tyr Leu Arg Pro Leu Arg Arg His Ile Gln Cys Leu Gln Glu Thr 340 345 350 Glu Phe Pro Gln Thr Arg Ile Leu Ile Ala Pro Leu Phe His Thr Ile 355 360 365 Cys Leu Ile Trp Ser His Ser Lys Phe Tyr Asn Thr Pro Ala Arg Val 370 375 380 Ile Val Leu Leu Gln Glu Phe Cys Asn Leu Phe Ile Asn Gln Ala Thr 385 390 395 400 Ala Tyr Leu Ser Pro Glu Asp Leu Leu Arg Gly Glu Ile Glu Glu Ser 405 410 415 Leu Glu Lys Val Gln Val Ala Val Asn Ile Leu Lys Thr Phe Lys Asn 420 425 430 Ser Phe Phe Asn Tyr Arg Lys Lys Leu Ala Ser Tyr Phe Met Gly Arg 435 440 445 Lys Leu Arg Pro Trp Asp Phe Gln Ser His Leu Val Phe Cys Arg Phe 450 455 460 Asp Lys Phe Leu Asp Arg Leu Ile Lys Ile Glu Asp Ile Phe Ala Thr 465 470 475 480 Thr Leu Glu Phe Glu Lys Leu Glu Arg Leu Glu Phe Gly Gly Thr Lys 485 490 495 Gly Ala Ile Leu Asn Gly Gln Val His Glu Met Ser Glu Glu Leu Met 500 505 510 Glu Leu Cys Lys Leu Phe Lys Gln Ser Thr Tyr Asp Pro Ser Asp Cys 515 520 525 Thr Asn Met Glu Phe Glu Ser Asp Tyr Val Ala Phe Lys Ser Lys Thr 530 535 540 Leu Glu Phe Asp Arg Arg Leu Gly Thr Ile Ile Cys Glu Ala Phe Phe 545 550 555 560 Asn Cys Asn Gly Leu Glu Ala Ala Phe Lys Leu Leu Thr Ile Phe Gly 565 570 575 Asn Phe Leu Glu Lys Pro Val Val Met Glu Ile Phe Ser Leu His Tyr 580 585 590 Ser Thr Leu Val His Met Phe Asn Thr Glu Leu Asp Val Cys Lys Gln 595 600 605 Leu Tyr Asn Glu His Met Lys Gln Ile Glu Cys Gly His Val Val Leu 610 615 620 Asn Lys Asn Met Pro Phe Thr Ser Gly Asn Met Lys Trp Ala Gln Gln 625 630 635 640 Val Leu Gln Arg Leu Gln Met Phe Trp Ser Asn Phe Ala Ser Leu Arg 645 650 655 Tyr Leu Phe Leu Gly Asn Pro Asp His Ala Leu Val Tyr Gln Lys Tyr 660 665 670 Val Glu Met Thr Thr Leu Leu Asp Gln Phe Glu Ser Arg Ile Tyr Asn 675 680 685 Glu Trp Lys Ser Asn Val Asp Glu Ile Cys Glu Phe Asn Leu Asn Gln 690 695 700 Pro Leu Val Lys Phe Ser Ala Ile Asn Gly Leu Leu Cys Val Asn Phe 705 710 715 720 Asp Pro Lys Leu Val Ala Val Leu Arg Glu Val Lys Tyr Leu Leu Met 725 730 735 Leu Lys Lys Gln Asp Ile Pro Asp Ser Ala Leu Ala Ile Phe Lys Lys 740 745 750 Arg Asn Thr Ile Leu Lys Tyr Ile Gly Asn Leu Asp Leu Leu Val Gln 755 760 765 Gly Tyr Asn Lys Leu Lys Gln Thr Leu Leu Glu Val Glu Tyr Pro Leu 770 775 780 Ile Glu Asp Glu Leu Arg Ala Ile Asp Glu Gln Leu Thr Ala Ala Thr 785 790 795 800 Thr Trp Leu Thr Trp Gln Asp Asp Cys Trp Gly Tyr Ile Glu Arg Val 805 810 815 Arg Ala Ala Thr Ser Glu Leu Glu His Arg Val Glu Arg Thr Gln Lys 820 825 830 Asn Val Lys Val Ile Gln Gln Thr Met Arg Gly Trp Ala Arg Cys Val 835 840 845 Leu Pro Pro Arg Arg Glu His Arg Arg Glu Ala Ala Phe Thr Leu Glu 850 855 860 Asp Lys Gly Asp Leu Phe Thr Lys Lys Tyr Lys Leu Ile Gln Gly Asp 865 870 875 880 Gly Cys Lys Ile His Asn Leu Val Glu Glu Asn Arg Lys Leu Phe Lys 885 890 895 Ala Asn Pro Ser Leu Asp Thr Trp Lys Ile Tyr Val Glu Phe Ile Asp 900 905 910 Asp Ile Val Val Glu Gly Phe Phe Gln Ala Ile Met His Asp Leu Asp 915 920 925 Phe Phe Leu Lys Asn Thr Glu Lys Gln Leu Lys Pro Ala Pro Phe Phe 930 935 940 Gln Ala Gln Met Ile Leu Leu Pro Pro Glu Ile Val Phe Lys Pro Ser 945 950 955 960 Leu Asp Arg Glu Ala Gly Asp Gly Phe Tyr Asp Leu Val Glu Glu Met 965 970 975 Leu Cys Asn Ser Phe Arg Met Ser Ala Gln Met Asn Arg Ile Ala Thr 980 985 990 His Leu Glu Ile Lys Asn Tyr Gln Asn Asp Met Asp Asn Met Leu Gly 995 1000 1005 Leu Ala Glu Val Arg Gln Glu Ile Met Asn Arg Val Val Asn Val Ile 1010 1015 1020 Asn Lys Val Leu Asp Phe Arg Asn Thr Leu Glu Thr His Thr Tyr Leu 1025 1030 1035 1040 Trp Val Asp Asp Arg Ala Glu Phe Met Lys His Phe Leu Leu Tyr Gly 1045 1050 1055 His Ala Val Ser Ser Asp Glu Met Asp Ala His Ala Asn Glu Glu Ile 1060 1065 1070 Pro Glu Gln Pro Pro Thr Leu Glu Gln Phe Lys Glu Gln Ile Asp Ile 1075 1080 1085 Tyr Glu Ala Leu Tyr Val Gln Met Ser Lys Phe Glu Asp Phe Arg Val 1090 1095 1100 Phe Asp Ser Trp Phe Lys Val Asp Met Lys Pro Phe Lys Val Ser Leu 1105 1110 1115 1120 Leu Thr Ile Ile Lys Lys Trp Ser Trp Met Phe Gln Glu His Leu Leu 1125 1130 1135 Arg Phe Val Ile Asp Ser Leu Asn Glu Leu Gln Glu Phe Ile Lys Glu 1140 1145 1150 Thr Asp Ser Gly Leu Gln Arg Glu Leu Asn Glu Gly Asp His Asp Gly 1155 1160 1165 Leu Val Asp Ile Met Val His Leu Leu Ala Val Arg Ser Arg Gln Arg 1170 1175 1180 Ala Thr Asp Glu Leu Phe Glu Pro Leu Lys Glu 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Arg 325 330 335 Leu Phe <210> 15 <211> 61 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> MT2A amino acid sequence <400> 15 Met Asp Pro Asn Cys Ser Cys Ala Ala Gly Asp Ser Cys Thr Cys Ala 1 5 10 15 Gly Ser Cys Lys Cys Lys Glu Cys Lys Cys Thr Ser Cys Lys Lys Ser 20 25 30 Cys Cys Ser Cys Cys Pro Val Gly Cys Ala Lys Cys Ala Gln Gly Cys 35 40 45 Ile Cys Lys Gly Ala Ser Asp Lys Cys Ser Cys Cys Ala 50 55 60 <210> 16 <211> 234 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> MESDC2 amino acid sequence <400> 16 Met Ala Ala Ser Arg Trp Ala Arg Lys Ala Val Val Leu Leu Cys Ala 1 5 10 15 Ser Asp Leu Leu Leu Leu Leu Leu Leu Leu Pro Pro Pro Gly Ser Cys 20 25 30 Ala Ala Glu Gly Ser Pro Gly Thr Pro Asp Glu Ser Thr Pro Pro Pro 35 40 45 Arg Lys Lys Lys Lys Asp Ile Arg Asp Tyr Asn Asp Ala Asp Met Ala 50 55 60 Arg Leu Leu Glu Gln Trp Glu Lys Asp Asp Asp Ile Glu Glu Gly Asp 65 70 75 80 Leu Pro Glu His Lys Arg Pro Ser Ala Pro Val Asp Phe Ser Lys Ile 85 90 95 Asp Pro Ser Lys Pro Glu Ser Ile Leu Lys Met Thr Lys Lys Gly Lys 100 105 110 Thr Leu Met Met Phe Val Thr Val Ser Gly Ser Pro Thr Glu Lys Glu 115 120 125 Thr Glu Glu Ile Thr Ser Leu Trp Gln Gly Ser Leu Phe Asn Ala Asn 130 135 140 Tyr Asp Val Gln Arg Phe Ile Val Gly Ser Asp Arg Ala Ile Phe Met 145 150 155 160 Leu Arg Asp Gly Ser Tyr Ala Trp Glu Ile Lys Asp Phe Leu Val Gly 165 170 175 Gln Asp Arg Cys Ala Asp Val Thr Leu Glu Gly Gln Val Tyr Pro Gly 180 185 190 Lys Gly Gly Gly Ser Lys Glu Lys Asn Lys Thr Lys Gln Asp Lys Gly 195 200 205 Lys Lys Lys Lys Glu Gly Asp Leu Lys Ser Arg Ser Ser Lys Glu Glu 210 215 220 Asn Arg Ala Gly Asn Lys Arg Glu Asp Leu 225 230 <210> 17 <211> 529 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> HEXA amino acid sequence <400> 17 Met Thr Ser Ser Arg Leu Trp Phe Ser Leu Leu Leu Ala Ala Ala Phe 1 5 10 15 Ala Gly Arg Ala Thr Ala Leu Trp Pro Trp Pro Gln Asn Phe Gln Thr 20 25 30 Ser Asp Gln Arg Tyr Val Leu Tyr Pro Asn Asn Phe Gln Phe Gln Tyr 35 40 45 Asp Val Ser Ser Ala Ala Gln Pro Gly Cys Ser Val Leu Asp Glu Ala 50 55 60 Phe Gln Arg Tyr Arg Asp Leu Leu Phe Gly Ser Gly Ser Trp Pro Arg 65 70 75 80 Pro Tyr Leu Thr Gly Lys Arg His Thr Leu Glu Lys Asn Val Leu Val 85 90 95 Val Ser Val Val Thr Pro Gly Cys Asn Gln Leu Pro Thr Leu Glu Ser 100 105 110 Val Glu Asn Tyr Thr Leu Thr Ile Asn Asp Asp Gln Cys Leu Leu Leu 115 120 125 Ser Glu Thr Val Trp Gly Ala Leu Arg Gly Leu Glu Thr Phe Ser Gln 130 135 140 Leu Val Trp Lys Ser Ala Glu Gly Thr Phe Phe Ile Asn Lys Thr Glu 145 150 155 160 Ile Glu Asp Phe Pro Arg Phe Pro His Arg Gly Leu Leu Leu Asp Thr 165 170 175 Ser Arg His Tyr Leu Pro Leu Ser Ser Ile Leu Asp Thr Leu Asp Val 180 185 190 Met Ala Tyr Asn Lys Leu Asn Val Phe His Trp His Leu Val Asp Asp 195 200 205 Pro Ser Phe Pro Tyr Glu Ser Phe Thr Phe Pro Glu Leu Met Arg Lys 210 215 220 Gly Ser Tyr Asn Pro Val Thr His Ile Tyr Thr Ala Gln Asp Val Lys 225 230 235 240 Glu Val Ile Glu Tyr Ala Arg Leu Arg Gly Ile Arg Val Leu Ala Glu 245 250 255 Phe Asp Thr Pro Gly His Thr Leu Ser Trp Gly Pro Gly Ile Pro Gly 260 265 270 Leu Leu Thr Pro Cys Tyr Ser Gly Ser Glu Pro Ser Gly Thr Phe Gly 275 280 285 Pro Val Asn Pro Ser Leu Asn Asn Thr Tyr Glu Phe Met Ser Thr Phe 290 295 300 Phe Leu Glu Val Ser Ser Val Phe Pro Asp Phe Tyr Leu His Leu Gly 305 310 315 320 Gly Asp Glu Val Asp Phe Thr Cys Trp Lys Ser Asn Pro Glu Ile Gln 325 330 335 Asp Phe Met Arg Lys Lys Gly Phe Gly Glu Asp Phe Lys Gln Leu Glu 340 345 350 Ser Phe Tyr Ile Gln Thr Leu Leu Asp Ile Val Ser Ser Tyr Gly Lys 355 360 365 Gly Tyr Val Val Trp Gln Glu Val Phe Asp Asn Lys Val Lys Ile Gln 370 375 380 Pro Asp Thr Ile Ile Gln Val Trp Arg Glu Asp Ile Pro Val Asn Tyr 385 390 395 400 Met Lys Glu Leu Glu Leu Val Thr Lys Ala Gly Phe Arg Ala Leu Leu 405 410 415 Ser Ala Pro Trp Tyr Leu Asn Arg Ile Ser Tyr Gly Pro Asp Trp Lys 420 425 430 Asp Phe Tyr Ile Val Glu Pro Leu Ala Phe Glu Gly Thr Pro Glu Gln 435 440 445 Lys Ala Leu Val Ile Gly Gly Glu Ala Cys Met Trp Gly Glu Tyr Val 450 455 460 Asp Asn Thr Asn Leu Val Pro Arg Leu Trp Pro Arg Ala Gly Ala Val 465 470 475 480 Ala Glu Arg Leu Trp Ser Asn Lys Leu Thr Ser Asp Leu Thr Phe Ala 485 490 495 Tyr Glu Arg Leu Ser His Phe Arg Cys Glu Leu Leu Arg Arg Gly Val 500 505 510 Gln Ala Gln Pro Leu Asn Val Gly Phe Cys Glu Gln Glu Phe Glu Gln 515 520 525 Thr <210> 18 <211> 946 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> ITIH2 amino acid sequence <400> 18 Met Lys Arg Leu Thr Cys Phe Phe Ile Cys Phe Phe Leu Ser Glu Val 1 5 10 15 Ser Gly Phe Glu Ile Pro Ile Asn Gly Leu Ser Glu Phe Val Asp Tyr 20 25 30 Glu Asp Leu Val Glu Leu Ala Pro Gly Lys Phe Gln Leu Val Ala Glu 35 40 45 Asn Arg Arg Tyr Gln Arg Ser Leu Pro Gly Glu Ser Glu Glu Met Met 50 55 60 Glu Glu Val Asp Gln Val Thr Leu Tyr Ser Tyr Lys Val Gln Ser Thr 65 70 75 80 Ile Thr Ser Arg Met Ala Thr Thr Met Ile Gln Ser Lys Val Val Asn 85 90 95 Asn Ser Pro Gln Pro Gln Asn Val Val Phe Asp Val Gln Ile Pro Lys 100 105 110 Gly Ala Phe Ile Ser Asn Phe Ser Met Thr Val Asp Gly Lys Thr Phe 115 120 125 Arg Ser Ser Ile Lys Glu Lys Thr Val Gly Arg Ala Leu Tyr Ala Gln 130 135 140 Ala Arg Ala Lys Gly Lys Thr Ala Gly Leu Val Arg Ser Ser Ala Leu 145 150 155 160 Asp Met Glu Asn Phe Arg Thr Glu Val Asn Val Leu Pro Gly Ala Lys 165 170 175 Val Gln Phe Glu Leu His Tyr Gln Glu Val Lys Trp Arg Lys Leu Gly 180 185 190 Ser Tyr Glu His Arg Ile Tyr Leu Gln Pro Gly Arg Leu Ala Lys His 195 200 205 Leu Glu Val Asp Val Trp Val Ile Glu Pro Gln Gly Leu Arg Phe Leu 210 215 220 His Val Pro Asp Thr Phe Glu Gly His Phe Asp Gly Val Pro Val Ile 225 230 235 240 Ser Lys Gly Gln Gln Lys Ala His Val Ser Phe Lys Pro Thr Val Ala 245 250 255 Gln Gln Arg Ile Cys Pro Asn Cys Arg Glu Thr Ala Val Asp Gly Glu 260 265 270 Leu Val Val Leu Tyr Asp Val Lys Arg Glu Glu Lys Ala Gly Glu Leu 275 280 285 Glu Val Phe Asn Gly Tyr Phe Val His Phe Phe Ala Pro Asp Asn Leu 290 295 300 Asp Pro Ile Pro Lys Asn Ile Leu Phe Val Ile Asp Val Ser Gly Ser 305 310 315 320 Met Trp Gly Val Lys Met Lys Gln Thr Val Glu Ala Met Lys Thr Ile 325 330 335 Leu Asp Asp Leu Arg Ala Glu Asp His Phe Ser Val Ile Asp Phe Asn 340 345 350 Gln Asn Ile Arg Thr Trp Arg Asn Asp Leu Ile Ser Ala Thr Lys Thr 355 360 365 Gln Val Ala Asp Ala Lys Arg Tyr Ile Glu Lys Ile Gln Pro Ser Gly 370 375 380 Gly Thr Asn Ile Asn Glu Ala Leu Leu Arg Ala Ile Phe Ile Leu Asn 385 390 395 400 Glu Ala Asn Asn Leu Gly Leu Leu Asp Pro Asn Ser Val Ser Leu Ile 405 410 415 Ile Leu Val Ser Asp Gly Asp Pro Thr Val Gly Glu Leu Lys Leu Ser 420 425 430 Lys Ile Gln Lys Asn Val Lys Glu Asn Ile Gln Asp Asn Ile Ser Leu 435 440 445 Phe Ser Leu Gly Met Gly Phe Asp Val Asp Tyr Asp Phe Leu Lys Arg 450 455 460 Leu Ser Asn Glu Asn His Gly Ile Ala Gln Arg Ile Tyr Gly Asn Gln 465 470 475 480 Asp Thr Ser Ser Gln Leu Lys Lys Phe Tyr Asn Gln Val Ser Thr Pro 485 490 495 Leu Leu Arg Asn Val Gln Phe Asn Tyr Pro His Thr Ser Val Thr Asp 500 505 510 Val Thr Gln Asn Asn Phe His Asn Tyr Phe Gly Gly Ser Glu Ile Val 515 520 525 Val Ala Gly Lys Phe Asp Pro Ala Lys Leu Asp Gln Ile Glu Ser Val 530 535 540 Ile Thr Ala Thr Ser Ala Asn Thr Gln Leu Val Leu Glu Thr Leu Ala 545 550 555 560 Gln Met Asp Asp Leu Gln Asp Phe Leu Ser Lys Asp Lys His Ala Asp 565 570 575 Pro Asp Phe Thr Arg Lys Leu Trp Ala Tyr Leu Thr Ile Asn Gln Leu 580 585 590 Leu Ala Glu Arg Ser Leu Ala Pro Thr Ala Ala Ala Lys Arg Arg Ile 595 600 605 Thr Arg Ser Ile Leu Gln Met Ser Leu Asp His His Ile Val Thr Pro 610 615 620 Leu Thr Ser Leu Val Ile Glu Asn Glu Ala Gly Asp Glu Arg Met Leu 625 630 635 640 Ala Asp Ala Pro Pro Gln Asp Pro Ser Cys Cys Ser Gly Ala Leu Tyr 645 650 655 Tyr Gly Ser Lys Val Val Pro Asp Ser Thr Pro Ser Trp Ala Asn Pro 660 665 670 Ser Pro Thr Pro Val Ile Ser Met Leu Ala Gln Gly Ser Gln Val Leu 675 680 685 Glu Ser Thr Pro Pro Pro His Val Met Arg Val Glu Asn Asp Pro His 690 695 700 Phe Ile Ile Tyr Leu Pro Lys Ser Gln Lys Asn Ile Cys Phe Asn Ile 705 710 715 720 Asp Ser Glu Pro Gly Lys Ile Leu Asn Leu Val Ser Asp Pro Glu Ser 725 730 735 Gly Ile Val Val Asn Gly Gln Leu Val Gly Ala Lys Lys Pro Asn Asn 740 745 750 Gly Lys Leu Ser Thr Tyr Phe Gly Lys Leu Gly Phe Tyr Phe Gln Ser 755 760 765 Glu Asp Ile Lys Ile Glu Ile Ser Thr Glu Thr Ile Thr Leu Ser His 770 775 780 Gly Ser Ser Thr Phe Ser Leu Ser Trp Ser Asp Thr Ala Gln Val Thr 785 790 795 800 Asn Gln Arg Val Gln Ile Ser Val Lys Lys Glu Lys Val Val Thr Ile 805 810 815 Thr Leu Asp Lys Glu Met Ser Phe Ser Val Leu Leu His Arg Val Trp 820 825 830 Lys Lys His Pro Val Asn Val Asp Phe Leu Gly Ile Tyr Ile Pro Pro 835 840 845 Thr Asn Lys Phe Ser Pro Lys Ala His Gly Leu Ile Gly Gln Phe Met 850 855 860 Gln Glu Pro Lys Ile His Ile Phe Asn Glu Arg Pro Gly Lys Asp Pro 865 870 875 880 Glu Lys Pro Glu Ala Ser Met Glu Val Lys Gly Gln Lys Leu Ile Ile 885 890 895 Thr Arg Gly Leu Gln Lys Asp Tyr Arg Thr Asp Leu Val Phe Gly Thr 900 905 910 Asp Val Thr Cys Trp Phe Val His Asn Ser Gly Lys Gly Phe Ile Asp 915 920 925 Gly His Tyr Lys Asp Tyr Phe Val Pro Gln Leu Tyr Ser Phe Leu Lys 930 935 940 Arg Pro 945

Claims (11)

1. 하기 표에 기재된 18개의 단백질을 모두 포함하는, 올레이트 지방산에 의한 간암세포의 증식활성을 갖는 증식성 간암을 예측 및 진단하기 위한 바이오 마커 조성물.
   

   
2. 제1항에 있어서,
   상기 단백질은 올레이트 지방산 처리 시, 간암세포에서 발현 수준이 증가하는 것을 특징으로 하는, 올레이트 지방산에 의한 간암세포의 증식활성을 갖는 증식성 간암을 예측 및 진단하기 위한 바이오 마커 조성물.
3. 삭제
4. 하기 표에 기재된 18개의 모든 단백질 수준을 측정하는 물질을 포함하는, 올레이트 지방산에 의한 간암세포의 증식활성을 갖는 증식성 간암 진단용 조성물.
   

   
5. 제4항에 있어서,
   상기 물질은 상기 표에 기재된 18개의 단백질에 특이적으로 결합하는 항체인 것을 특징으로 하는, 올레이트 지방산에 의한 간암세포의 증식활성을 갖는 증식성 간암 진단용 조성물.
6. 삭제
7. 삭제
8. (a) 간암환자로부터 분리된 생물학적 시료로부터 제1항의 표에 기재된 18개의 모든 단백질의 발현양을 측정하는 단계; 및
   (b) 대조군 시료로부터 상기 단백질의 발현양을 측정하여 상기 (a) 단계의 측정 결과와 비교하는 단계를 포함하는,
   올레이트 지방산에 의한 간암세포의 증식활성을 갖는 증식성 간암을 예측 및 진단하기 위한 정보 제공 방법.
9. 제8항에 있어서,
   상기 생물학적 시료는 피검체로부터 분리된 간 조직, 간 세포 또는 간 세포 배양액인 것을 특징으로 하는, 올레이트 지방산에 의한 간암세포의 증식활성을 갖는 증식성 간암을 예측 및 진단하기 위한 정보 제공 방법.
10. 제8항에 있어서,
    상기 간암환자로부터 분리된 생물학적 시료에서의 단백질 발현양이 대조군에 비해 증가되어 있는 경우, 올레이트 지방산에 의해 간암세포의 증식이 촉진된 증식성 간암인 것으로 판단하는 단계를 더 포함하는 것을 특징으로 하는, 올레이트 지방산에 의한 간암세포의 증식활성을 갖는 증식성 간암을 예측 및 진단하기 위한 정보 제공 방법.
11. 삭제

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