KR102136522B1

KR102136522B1 - 안전성 및 장부착능이 우수한 모유유래 락토바실러스 루테리 lm1071 균주, 및 상기 균주 또는 이의 배양물을 포함하는 조성물

Info

Publication number: KR102136522B1
Application number: KR1020200027335A
Authority: KR
Inventors: 전민규; 김태락; 조수빈; 정수연
Original assignee: 주식회사 락토메이슨
Priority date: 2020-03-04
Filing date: 2020-03-04
Publication date: 2020-07-22
Anticipated expiration: 2040-03-04
Also published as: CN113355255B; WO2021177526A1; CN113355255A; US20220002664A1

Abstract

본원은, 락토바실러스 루테리 (Lactobacillus reuteri) LM1071 균주 (KCCM12650P), 이를 포함하는 장내 환경 개선용 조성물에 관한 것이다.
본원의 일 구현예에 따른 락토바실러스 루테리 (Lactobacillus reuteri) LM1071 균주 (KCCM12650P)는 용혈성 및 생체 아민 생성능이 없어 우수한 생체 안전성을 가지고 있으며, 장부착능이 우수하여 장내 환경 개선 효과 및 장 건강 개선 효과를 갖는 바, 상기 균주는 약학 조성물, 식품 조성물, 건강기능식품 조성물, 사료 조성물 등에 응용될 수 있다.

Description

안전성 및 장부착능이 우수한 모유유래 락토바실러스 루테리 LM1071 균주, 및 상기 균주 또는 이의 배양물을 포함하는 조성물 {LACTOBACILLUS REUTERI LM1071 FROM BREAST MILK HAVING HIGH SAFETY AND INTESTINE ADHESIVE PROPERTY, AND COMPOSITION COMPRISING THE STRAIN OR ITS CULTURE FLUID}

본원은, 락토바실러스 루테리 (Lactobacillus reuteri) LM1071 균주 (KCCM12650P), 이를 포함하는 장내 환경 개선용 조성물에 관한 것이다.

유산균은 인체의 소화계에 공생하면서 섬유질 및 복합 단백질들을 분해하여 중요한 영양성분으로 만드는 역할을 담당한다. 이와 같이 사람을 포함한 동물의 위장관 내에서 숙주의 장내 미생물 환경을 개선하여 숙주의 건강에 유익한 영향을 주는 살아있는 미생물을 통칭하여 프로바이오틱스라고 한다. 대표적인 프로바이오틱스로는 락토바실러스 속(Lactobacillus sp.) 유산균, 락토코커스 속(Lactococcus sp.) 유산균 등이 있다. 프로바이오틱스가 나타내는 건강증진 효과로는 면역기능 개선, 감염예방, 무기물의 흡수개량, 장내 유해세균 억제에 의한 정장작용, 젖당불내증(lactose intolerance)의 경감, 변비 방지, 혈중 콜레스테롤의 감소, 항종양 작용, 당뇨 예방, 혈압강하 등이 있다.

한편, 프로바이오틱스로 인정받기 위해서는 균주가 체내의 위산 및 담즙산에 대해 생존하여 소장까지 도달하여야 하며 장 상피세포에 부착하여 항균, 항염 등 유용한 효과를 나타내며 독성이 없고 비병원성이어야 하며, 이러한 프로바이오틱스의 안전성 및 기능성은 현재까지도 다양하게 연구되고 있다.

장균총(microbiota)은 미생물균총으로 환경 내 미생물 군집을 말하며, 장균총은 숙주 예를 들어, 사람의 면역, 대사물질 등의 항상성 유지에 중요한 역할을 한다고 알려져 있다. 장균총과 숙주는 직접 상호작용 하거나 간접적으로 화학물질 신호를 주고 받으며 장균총에 의한 면역세포의 발현이나 신경전달물질 생성, 단쇄지방산(SCFA; Short chain fatty acids) 등이 숙주 내 체계에 비대한 영향을 미치며, 특히 프로바이오틱스/프리바이오틱스는 숙주의 불균형한 장균총을 균형화하고, 이에 따른 건강한 장균총의 대사산물이 호스트의 건강을 증진시킬 수 있다.

장내 환경 개선을 위한 조성물에 대한 연구 결과로 홍국의 물 추출물을 유효성분으로 포함하는 조성물(대한민국 등록특허 제10-1850308호), 더덕의 에탄올 추출물을 유효성분으로 포함하는 조성물(대한민국 등록특허 제10-1826673호) 등이 있으나, 장내 환경 개선 및 장 질환 치료와 관련하여, 우수한 효과를 나타내는 조성물에 대한 개발 및 연구가 여전히 필요한 실정이다.

이에, 본 발명자들은 장내 환경을 개선하고 장 건강 개선에 도움을 주는 우수한 조성물을 개발하기 위해 예의 노력한 결과, 용혈성 및 생체 아민 생성능이 낮아 안전성이 우수하면서 장부착능이 향상된 신규 균주를 개발하여, 본 발명을 완성하였다.

본원은, 락토바실러스 루테리 (Lactobacillus reuteri) LM1071 균주 (KCCM12650P), 상기 균주를 포함하는 장내 환경 개선용 조성물을 제공하고자 한다.

그러나, 본원이 해결하고자 하는 과제는 이상에서 언급한 과제로 제한되지 않으며, 언급되지 않은 또 다른 과제들은 아래의 기재로부터 당업자에게 명확하게 이해될 수 있을 것이다.

본원의 제1측면은, 락토바실러스 루테리 (Lactobacillus reuteri) LM1071 균주 (KCCM12650P)를 제공한다.

본원의 제2측면은, 락토바실러스 루테리 (Lactobacillus reuteri) LM1071 균주 (KCCM12650P) 또는 이의 배양물을 유효성분으로 포함하는, 장내 환경 개선용 조성물을 제공한다.

본원의 일 구현예에 따른 락토바실러스 루테리 (Lactobacillus reuteri) LM1071 균주 (KCCM12650P)는 용혈성 및 생체 아민 생성능이 없어 우수한 생체 안전성을 가지고 있으며, 장부착능이 우수하여 장내 환경 개선 효과 및 장 건강 개선 효과를 갖는 바, 상기 균주는 약학 조성물, 식품 조성물, 건강기능식품 조성물, 사료 조성물 등에 응용될 수 있다.

도 1은, 본원의 LM1071 균주의 HT-29 세포와의 부착능을 확인한 결과를 나타낸 도면이다.
도 2는, 본원의 LM1071 균주의 MATS(Microbial adhesion to solvents) 실험 결과를 나타낸 도면이다.

아래에서는 첨부한 도면을 참조하여 본원이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자가 용이하게 실시할 수 있도록 본원의 실시예를 상세히 설명한다. 그러나 본원은 여러 가지 상이한 형태로 구현될 수 있으며 여기에서 설명하는 실시예에 한정되지 않는다. 그리고 도면에서 본원을 명확하게 설명하기 위해서 설명과 관계없는 부분은 생략하였으며, 명세서 전체를 통하여 유사한 부분에 대해서는 유사한 도면 부호를 붙였다.

본원 명세서 전체에서, 어떤 부분이 다른 부분과 “연결”되어 있다고 할 때, 이는 “직접적으로 연결”되어 있는 경우뿐 아니라, 그 중간에 다른 링커 등의 물질을 사이에 두고 “간접적으로 연결”되어 있는 경우도 포함한다.

본원 명세서 전체에서, 어떤 부분이 어떤 구성 요소를 “포함” 한다고 할 때, 이는 특별히 반대되는 기재가 없는 한 다른 구성 요소를 제외하는 것이 아니라 다른 구성 요소를 더 포함할 수 있는 것을 의미한다. 본원 명세서 전체에서 사용되는 정도의 용어 “약”, “실질적으로” 등은 언급된 의미에 고유한 제조 및 물질 허용오차가 제시될 때 그 수치에서 또는 그 수치에 근접한 의미로 사용되고, 본원의 이해를 돕기 위해 정확하거나 절대적인 수치가 언급된 개시 내용을 비양심적인 침해자가 부당하게 이용하는 것을 방지하기 위해 사용된다. 본원 명세서 전체에서 사용되는 정도의 용어 “~(하는) 단계” 또는 “~의 단계”는 “~ 를 위한 단계”를 의미하지 않는다.

본원 명세서 전체에서, 마쿠시 형식의 표현에 포함된 “이들의 조합(들)”의 용어는 마쿠시 형식의 표현에 기재된 구성 요소들로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상의 혼합 또는 조합을 의미하는 것으로서, 상기 구성 요소들로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상을 포함하는 것을 의미한다.

본원 명세서 전체에서, “A 및/또는 B”의 기재는 “A 또는 B, 또는 A 및 B”를 의미한다.

이하, 첨부된 도면을 참조하여 본원의 구현예 및 실시예를 상세히 설명한다. 그러나, 본원이 이러한 구현예 및 실시예와 도면에 제한되지 않을 수 있다.

본원의 제 1 측면은, 락토바실러스 루테리 (Lactobacillus reuteri) LM 1071 균주 (KCCM12650P)를 제공한다.

본원의 일 구현예에 있어서, 상기 균주는 γ-용혈 활성을 갖는 것일 수 있다.

본원 명세서 전체에서 사용되는 용어 "용혈성(Hemolysis)" 또는 "용혈 활성"은 임의의 병균 또는 질환이 적혈구(Red blood cell, RBC)를 파괴하는 병원성 중 하나로서, 용혈 정도에 따라 α-용혈성(α-hemolysis)은 적혈구 내의 헤모글로빈의 부분적 분해, β-용혈성(β-hemolysis)은 완전 분해, γ-용혈성(γ-hemolysis)은 분해하지 않는 것을 의미한다. 용혈을 일으키는, 즉 용혈성을 갖는 병원성 박테리아 또는 곰팡이는 적혈구의 세포막을 손상시켜 패혈증을 유발할 수 있는 용혈소(hemolysins)를 생산할 수 있어, 프로바이오틱스로 사용하기 위한 균주를 선별하기 위해 용혈성은 반드시 확인되어야 하며, 용혈성이 없는 균주는 특히 생체 안전성이 우수하다는 것을 의미하는 것일 수 있다.

본원의 일 구현예에 있어서, 상기 균주는 γ-용혈 활성을 갖는 균주로서, 용혈성이 없어 생체 내 안전성을 가지고 있으므로, 다양한 조성물에 이용할 수 있다.

본원의 일 구현예에 있어서, 상기 균주는 생체 아민을 생성하는 않는 것일 수 있으며, 구체적으로 상기 생체 아민은 카다베린(cadaverine), 티라민(tyramine), 히스타민(histamine) 및 푸트레신(putrescine)으로 구성된 군에서 선택된 하나 이상일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

본원 명세서 전체에서 사용되는 용어 "생체 아민(biogenic amines)"은 아미노산으로부터 α-카복시기가 제거되면서 형성되는 유기 질소 화합물 및 저분자 물질로서, 생체내에 존재하면서 생리학적 기능을 중개 또는 조절하는 물질로 알려져 있다. 또한, 생체 아민은 두통, 고혈압, 발열 및 심장병 등의 독성학적 사건을 유발할 수 있다고 알려져 있다. 주요 생체 아민으로서, 카다베린(cadaverine), 티라민(tyramine), 히스타민(histamine) 및 푸트레신(putrescine)이 있으며, 상기 생체 아민들은 각각 라이신, 티로신, 히스티딘 또는 오르니틴에 의해 합성된다. 독성이 있는 생체 아민은 생체 내에서 다양한 부정적인 효과를 나타낼 수 있는 바, 프로바이오틱스로 사용하기 위한 균주를 선별하기 위해 상기 생체 아민의 생성능을 필수적으로 확인해야 한다.

본원의 일 구현예에 있어서, 상기 균주는 항생제에 대한 감수성 또는 민감성이 높은 것일 수 있으며, 구체적으로 상기 항생제는 암피실린 (ampicillin), 에리트로마이신 (erythromycin), 젠타마이신 (gentamicin), 테트라사이클린 (tetracycline), 스트렙토마이신 (streptomycin), 반코마이신 (vancomycin), 클로람페니콜 (chloramphenicol), 카나마이신 (kanamycin) 및 클린다마이신(clindamycin)으로 구성된 군에서 선택된 하나 이상일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

본원의 일 구현예에 있어서, 상기 균주가 항생제에 대한 감수성 또는 민감성이 높다는 것은 상기 균주의 항생제에 대한 최소 억제 농도(minimal inhibitory concentration, MIC)가 유럽 식품 안전청(European Food Safety Authority, EFSA) 브레이크 포인트보다 낮다는 것을 의미하는 것일 수 있다. 상기 MIC는 항균력을 측정하는 가장 기초적인 지표로 시험관내 세균 감수성 검사(in vitro sensitivity test)에서 미생물의 번식을 억제할 수 있는 항생제의 최저농도로 정의한다. 또한, EFSA 브레이크 포인트는 인간 및 수의학적으로 중요한 항생제에 대한 박테리아 저항성 평가에 사용되는 기준으로서, 주어지는 브레이크 포인트 레벨에서 성장해서는 안된다는 것을 의미한다.

본원의 일 구현예에 있어서, 상기 본원의 균주는 암피시린에 대한 MIC가 2mg/L미만이고, 에리트로마이신에 대한 MIC가 1mg/L미만이고, 젠타마이신에 대한 MIC가 8mg/L미만이고, 테트라사이클린에 대한 MIC가 16mg/L미만이고, 스트렙토마이신에 대한 MIC가 64mg/L미만이고, 클로람페니콜에 대한 MIC가 4mg/L미만이고, 카나마이신에 대한 MIC가 64mg/L미만이고, 또는 클린다마이신에 대한 MIC가 1mg/L미만일 수 있으며, 구체적으로 상기 본원의 균주는 암피시린에 대한 MIC가 0.5mg/L이하고, 에리트로마이신에 대한 MIC가 0.25mg/L이하고, 젠타마이신에 대한 MIC가 2mg/L이고, 테트라사이클린에 대한 MIC가 1mg/L이고, 스트렙토마이신에 대한 MIC가 0.25mg/L이하이고, 클로람페니콜에 대한 MIC가 0.5mg/L이하고, 카나마이신에 대한 MIC가 8mg/L이하고, 또는 클린다마이신에 대한 MIC가 1mg/L이하일 수 있다.

본원의 일 구현예에 있어서, 상기 균주는 항생제에 대한 내성 또는 저항성이 낮은 바, 항생제　내성 유전자의 전이에 따른 우려는 발생하지 않을 것으로 확인된다.

본원의 일 구현예에 있어서, 상기 균주는 장부착능이 우수한 것일 수 있다.

본원의 일 구현예에 있어서, 상기 균주는 장부착능이 우수하여, 유해균이 장벽에 부착되지 못하도록 하면서 유익균이 증식할 수 있는 환경을 조성할 수 있고, 장벽을 보다 강화하여 위장관 차단벽(gastrointestinal barrier, GIB)을 형성하여 유익한 영양소만 장 상피세포를 통해 흡수하고 유해한 물질을 걸러낼 수 있다. 또한, 상기 균주는 장부착능이 우수하여 장내 상피세포에 부착해 항균성 박테리오신, 젖산, 유기산, 과산화수소 등을 합성/분비하므로, 장내 유해균인 대장균, 티브스, 파라티부스, 적리균, 콜레라균 및 위장염과 위암을 일으키는 헬리코박터 세균 (Helicobacter pylorie) 등에 대한 항균력이 우수하다.

본원의 일 구현예에 있어서, 상기 균주는 장부착능이 락토바실러스 람노서스(LGG)보다 우수한 것일 수 있다.

본원의 일 구현예에 있어서, 상기 균주는 소수성 특성을 갖는 것일 수 있으며, 구체적으로 상기 균주의 표면이 소수성을 갖는 것일 수 있다.

본원의 일 구현예에 있어서, 상기 균주는 헥사데칸 용매에서 60% 이상의 소수적 친화성을 갖는 것일 수 있으며, 구체적으로 락토바실러스 람노서스(LGG)보다 높은 소수성을 갖는 것일 수 있다.

본원의 일 구현예에 있어서, 상기 균주는 장 상피세포에 부착 또는 점착하는 특성이 우수한 균주일 수 있다.

본원의 일 구현예에 있어서, 상기 균주는 장내 환경을 개선하거나, 장 건강 개선에 도움을 줄 수 있으며, 구체적으로 상기 균주는 장내 환경 개선용 약학 조성물, 식품 조성물, 화장료 조성물, 건강기능식품 조성물, 사료 조성물 등 다양한 조성물에 포함될 수 있다.

본원의 제2측면은, 락토바실러스 루테리 (Lactobacillus reuteri) LM 1071 균주 (KCCM12650P) 또는 이의 배양물을 유효성분으로 포함하는, 장내 환경 개선용 조성물을 제공한다. 제1측면과 중복되는 내용은 제2측면의 조성물에도 공히 적용된다.

본원 명세서 전체에서 사용되는 용어 "개선"은, 상기 조성물의 투여로 장내 환경이 호전되거나 이롭게 변경되는 모든 행위를 의미한다.

본원 명세서 전체에서 사용되는 용어 "장내 환경 개선"은, 장 내 미생물 및 상기 미생물들의 대사체 등의 구성을 유리하게 바꾸거나, 장내 균총을 개선하거나, 장 기능 및 장 건강 등을 개선하는 것으로서, 장내 환경 개선에 의해 장내 유익균 및 유익균 대사체가 증가하여, 비타민 합성, 소화 흡수 증진, 감염 예방, 항균 및 면역 조절/강화 등의 효과를 나타낼 수 있으며, 유해균 및 유해균 대사체 등이 감소하여, 장내 부패 감소, 세균 독소 감소 및 발암 물질 등을 감소시키는 것을 의미한다. 또한 장내 환경을 개선함으로서 설사, 변비 및 장염 등의 장 관련 질병뿐만 아니라, 암, 비만, 당뇨 및 뇌관련 질병 등을 예방 또는 치료 할 수 있다.

본원의 일 구현예에 있어서, 상기 장내 환경 개선은 장균총의 미생물 다양성 증가, 장내 균총 개선, 장내 유익균 증진, 장내 유해균 억제, 장내 면역 기능 조절 및 항균 활성 증진, 장 건강 개선 및 증진, 장내 미생물로부터 유래된 내독소 및 황화수소의 감소, 유익한 장균총 유래 대사체의 증가, 유익균의 종류 및 수의 증가 및 유해균의 종류 및 수의 감소 등으로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

본원의 일 구현예에 있어서, 상기 조성물은 장내 균총 개선용 조성물, 장내 유익균 생장 증진용 조성물, 장내 유해균 생장 억제용 조성물, 장내 면역 강화 및 조절용 조성물 또는 장 건강 개선용 조성물일 수 있다.

본원의 일 구현예에 있어서, 상기 조성물은 락토바실러스 루테리 LM1071 균주, 이의 생균체, 이의 사균체, 이의 배양액, 이의 파쇄물 및/또는 이의 추출물을 포함하는 것일 수 있다.

본원 명세서 전체에서 사용되는 용어 "사균체"는 생균의 반대되는 개념으로서 발효를 통해 얻어진 생균과 대사산물들을 열처리 등에 의해 균의 성장이 일어나지 못하도록 한 형태를 의미한다. 사균체는 세포질(cytoplasm), 세포벽(cell wall), 박테리오신(bacteriocin) 등의 항균활성 물질, 다당류(polysaccharide), 유기산 등을 포함할 수 있다. 상기 사균체를 이용한 제품은 생균 제품과 비교하여 높은 안정성을 가지고 있으며, 특히 내열성이 우수하며, 외부 환경에 대한 안정성이 높아 기존 생균 제품보다 보관이 용이하고 유통기간을 늘일 수 있다는 장점을 가지고 있다. 또한, 항생제 사용에 대한 규제가 강화되고 있기 때문에 대체제로서의 활용성과 아직 사균체 제품 생산에 본격적으로 뛰어든 업체가 손에 꼽을 정도이기 때문에 시장성과 성장가능성이 매우 크다.

본원 명세서 전체에서 사용되는 용어 "배양액"은 본원의 균주를 공지의 액체 배지 또는 고체 배지에서 배양시켜 수득한 사물을 의미하며, "배양물"과 혼용하여 사용될 수 있다.

본원의 일 구현예에 있어서, 상기 조성물은 식품 조성물 또는 건강기능식품 조성물일 수 있다.

본원 명세서 전체에서 사용되는 용어 "식품"은 육류, 소시지, 빵, 초콜릿, 캔디류, 스낵류, 과자류, 피자, 라면, 기타 면류, 껌류, 아이스크림류를 포함한 낙농제품, 각종 스프, 음료수, 차, 드링크제, 알코올음료, 비타민 복합제, 건강 기능 식품 및 건강 식품 등이 있으며, 통상적인 의미에서의 식품을 모두 포함한다.

본원 명세서 전체에서 사용되는 용어 "건강기능식품"은 건강기능식품에 관한 법률 제6727호에 따른 인체에 유용한 기능성을 가진 원료나 성분을 사용하여 제조 및 가공한 식품을 의미하며, '기능성'이라 함은 인체의 구조 및 기능에 대하여 영양소를 조절하거나 생리학적 작용 등과 같은 보건 용도에 유용한 효과를 얻는 것을 의미한다.

본원의 식품은 당 업계에서 통상적으로 사용되는 방법에 의하여 제조 가능하며, 상기 제조시에는 당 업계에서 통상적으로 첨가하는 원료 및 성분을 첨가하여 제조할 수 있다. 또한, 상기 식품의 제형 또한 식품으로 인정되는 제형이면 제한 없이 제조될 수 있다. 본 발명의 식품용 조성물은 다양한 형태의 제형으로 제조될 수 있으며, 일반 약품과는 달리 식품을 원료로 하여 약품의 장기 복용 시 발생할 수 있는 부작용 등이 없는 장점이 있고 휴대성이 뛰어나므로, 본 발명의 식품은 장내 환경 개선의 효과를 증진시키기 위한 보조제로 섭취가 가능하다.

상기 건강 식품(health food)은 일반식품에 비해 적극적인 건강유지나 증진 효과를 가지는 식품을 의미하고, 건강보조식품(health supplement food)은 건강 보조 목적의 식품을 의미한다. 경우에 따라, 건강 기능 식품, 건강 식품, 건강 보조 식품의 용어는 혼용될 수 있다. 구체적으로, 상기 건강 기능 식품은 본원의 락토바실러스 루테리 LM1071 균주를 음료, 차류, 향신료, 껌, 과자류 등의 식품 소재에 첨가하거나, 캡슐화, 분말화, 현탁액 등으로 제조한 식품으로, 이를 섭취할 경우 건강상 특정한 효과를 가져오는 것을 의미하나, 일반 약품과는 달리 식품을 원료로 하여 약품의 장기 복용 시 발생할 수 있는 부작용이 없는 장점이 있다.

본원의 식품 조성물은, 일상적으로 섭취하는 것이 가능하기 때문에 장내 환경 개선에 대하여 높은 효과를 기대할 수 있으므로, 매우 유용하게 사용될 수 있다.

상기 식품 조성물은 생리학적으로 허용 가능한 담체를 추가로 포함할 수 있는데, 담체의 종류는 특별히 제한되지 않으며 당해 기술 분야에서 통상적으로 사용되는 담체라면 어느 것이든 사용할 수 있다.

또한, 상기 식품 조성물은 식품 조성물에 통상 사용되어 냄새, 맛, 시각 등을 향상시킬 수 있는 추가 성분을 포함할 수 있다. 예들 들어, 비타민 A, C, D, E, B1, B2, B6, B12, 니아신 (niacin), 비오틴 (biotin), 폴레이트 (folate), 판토텐산 (panthotenic acid) 등을 포함할 수 있다. 또한, 아연(Zn), 철(Fe), 칼슘(Ca), 크롬(Cr), 마그네슘(Mg), 망간(Mn), 구리(Cu), 크륨(Cr) 등의 미네랄을 포함할 수 있다. 또한, 라이신, 트립토판, 시스테인, 발린 등의 아미노산을 포함할 수 있다.

또한, 상기 식품 조성물은 방부제(소르빈산 칼륨, 벤조산나트륨, 살리실산, 데히드로초산나트륨 등), 살균제(표백분과 고도 표백분, 차아염소산나트륨 등), 산화방지제(부틸히드록시아니졸(BHA), 부틸히드록시톨류엔(BHT) 등), 착색제(타르색소 등), 발색제(아질산 나트륨, 아초산 나트륨 등), 표백제(아황산나트륨), 조미료(MSG 글루타민산나트륨 등), 감미료(둘신, 사이클레메이트, 사카린, 나트륨 등), 향료(바닐린, 락톤류 등), 팽창제(명반, D-주석산수소칼륨 등), 강화제, 유화제, 증점제(호료), 피막제, 검기초제, 거품억제제, 용제, 개량제 등의 식품 첨가물(food additives)을 포함할 수 있다. 상기 첨가물은 식품의 종류에 따라 선별되고 적절한 양으로 사용될 수 있다.

본원의 락토바실러스 루테리 LM1071 균주는 그대로 첨가하거나 다른 식품 또는 식품 성분과 함께 사용될 수 있고, 통상적인 방법에 따라 적절하게 사용될 수 있다. 유효성분의 혼합양은 그의 사용 목적(예방, 건강 또는 치료적 처치)에 따라 적합하게 결정될 수 있다. 일반적으로, 식품 또는 음료의 제조시에 본 발명의 식품 조성물은 식품 또는 음료에 대하여 50 중량부 이하, 구체적으로 20 중량부 이하의 양으로 첨가될 수 있다. 그러나 건강 및 위생을 목적으로 장기간 섭취할 경우에는 상기 범위 이하의 함량을 포함할 수 있으며, 안전성 면에서 아무런 문제가 없기 때문에 유효성분은 상기 범위 이상의 양으로도 사용될 수 있다.

본원의 식품 조성물의 일 예로 건강음료 조성물로 사용될 수 있으며, 이 경우 통상의 음료와 같이 여러 가지 향미제 또는 천연 탄수화물 등을 추가 성분으로 함유할 수 있다. 상술한 천연 탄수화물은 포도당, 과당과 같은 모노사카라이드; 말토스, 슈크로스와 같은 디사카라이드; 덱스트린, 사이클로덱스트린과 같은 폴리사카라이드; 자일리톨, 소르비톨, 에리트리톨 등의 당알콜일 수 있다. 감미제는 타우마틴, 스테비아 추출물과 같은 천연 감미제; 사카린, 아스파르탐과 같은 합성 감미제 등을 사용할 수 있다. 상기 천연 탄수화물의 비율은 본 발명의 건강음료 조성물 100 mL 당 일반적으로 약 0.01 ∼ 0.04 g, 구체적으로 약 0.02 ∼ 0.03 g이 될 수 있다.

상기 외에 건강음료 조성물은 여러 가지 영양제, 비타민, 전해질, 풍미제, 착색제, 펙트산, 펙트산의 염, 알긴산, 알긴산의 염, 유기산, 보호성 콜로이드 증점제, pH 조절제, 안정화제, 방부제, 글리세린, 알코올 또는 탄산화제 등을 함유할 수 있다. 그 밖에 천연 과일주스, 과일주스 음료, 또는 야채 음료의 제조를 위한 과육을 함유할 수 있다. 이러한 성분은 독립적으로 또는 혼합하여 사용할 수 있다. 이러한 첨가제의 비율은 크게 중요하진 않지만 본 발명의 건강음료 조성물 100 중량부당 0.01 ~ 0.1 중량부의 범위에서 선택되는 것이 일반적이다.

본원의 식품 조성물은 장내 환경 개선 효과를 나타낼 수 있다면 본원의 락토바실러스 루테리 LM1071 균주를 다양한 중량%로 포함할 수 있으며, 구체적으로 본원의 락토바실러스 루테리 LM1071 균주를 식품 조성물의 총 중량 대비 0.00001 내지 100 중량% 또는 0.01 내지 80 중량%로 포함할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

본원의 제3측면은, 락토바실러스 루테리 (Lactobacillus reuteri) LM1071 균주 (KCCM12650P) 또는 이의 배양물을 유효성분으로 포함하는, 장 건강 개선용 조성물을 제공한다. 제1측면 및 제2측면과 중복되는 내용은 제3측면의 조성물에도 공히 적용된다.

본원의 일 구현예에 있어서, 상기 조성물은 식품 조성물, 건강기능식품 조성물 또는 약학 조성물일 수 있다.

본원의 일 구현예에 있어서, 상기 약학 조성물은 각각 통상의 방법에 따라 산제, 과립제, 정제, 캡슐제, 현탁액, 에멀젼, 시럽, 에어로졸 등의 경구형 제형, 외용제, 좌제 또는 멸균 주사용액의 형태로 제제화하여 사용될 수 있으나, 이에 제한되지 않을 수 있다.

본원의 일 구현예에 있어서, 상기 약학 조성물을 제제화할 경우, 일반적으로 사용하는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 또는 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 조제될 수 있으나, 이에 제한되지 않을 수 있다.

본원의 일 구현예에 있어서, 경구투여를 위한 고형 제제에는 정제, 환제, 산제, 과립제, 또는 캡슐제 등이 포함되며, 이러한 고형 제제는 상기 락토바실러스 루테리의 사균체에 적어도 하나 이상의 부형제, 예를 들면, 전분, 칼슘카보네이트 (calcium carbonate), 수크로스 (sucrose), 락토오스 (lactose), 또는 젤라틴 등을 섞어 조제될 수 있다. 또한, 예를 들어, 단순한 부형제 이외에도 마그네슘 스테아레이트, 탈크 같은 윤활제들도 사용될 수 있으나, 이에 제한되지 않을 수 있다.

본원의 일 구현예에 있어서, 경구투여를 위한 액상 제제로는 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제 등이 해당되는데, 흔히 사용되는 단순 희석제인 물, 리퀴드 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등이 포함될 수 있으나, 이에 제한되지 않을 수 있다.

본원의 일 구현예에 있어서, 비경구 투여를 위한 제제로는 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결건조 제제 및 좌제가 포함될 수 있으나, 이에 제한되지 않을 수 있다. 예를 들어, 상기 비수성용제 또는 현탁제로는, 프로필렌글리콜(propylene glycol), 폴리에틸렌 글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있으나, 이에 제한되지 않을 수 있다. 예를 들어, 상기 좌제로는, 위텝솔(witepsol), 마크로골, 트윈 (tween) 61, 카카오지, 라우린지, 글리세로젤라틴 등이 사용될 수 있으나, 이에 제한되지 않을 수 있다.

본원의 일 구현예에 따른 약학 조성물은 의약품 조성물 또는 의약외품 조성물일 수 있다.

본원 명세서 전체에서 사용되는 용어 "의약외품"은 사람이나 동물의 질병을 진단, 치료, 개선, 경감, 처치 또는 예방할 목적으로 사용되는 물품들 중 의약품보다 작용이 경미한 물품들을 의미하는 것으로, 예를 들어 약사법에 따르면 의약외품이란 의약품의 용도로 사용되는 물품을 제외한 것으로, 사람ㆍ동물의 질병 치료나 예방에 쓰이는 제품, 인체에 대한 작용이 경미하거나 직접 작용하지 않는 제품 등이 포함된다.

본원의 상기 의약외품 조성물은 바디 클렌저, 소독 청결제, 세정제, 주방용 세정제, 청소용 세정제, 치약, 가글제, 물티슈, 세제, 비누, 핸드 워시, 헤어세정제, 헤어 유연제, 가습기 충진제, 마스크, 연고제 및 필터 충진제로 이루어진 군에서 선택되는 제형으로 제조할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

본원의 일 구현예에 있어서, 상기 약학 조성물은 약제학적으로 유효한 양으로 투여될 수 있는데, 본원의 용어 "약제학적으로 유효한 양"이란 의학적 치료 또는 예방에 적용 가능한 합리적인 수혜/위험 비율로 질환을 치료 또는 예방하기에 충분한 양을 의미하며, 유효 용량 수준은 질환의 중증도, 약물의 활성, 환자의 연령, 체중, 건강, 성별, 환자의 약물에 대한 민감도, 사용된 본 발명 조성물의 투여 시간, 투여 경로 및 배출 비율 치료기간, 사용된 본 발명의 조성물과 배합 또는 동시 사용되는 약물을 포함한 요소 및 기타 의학 분야에 잘 알려진 요소에 따라 결정될 수 있다. 본원의 약학 조성물은 단독으로 투여하거나 공지된 장 질환에 대한 치료 효과를 나타내는 것으로 알려진 성분과 병용하여 투여될 수 있다. 상기 요소를 모두 고려하여 부작용 없이 최소한의 양으로 최대 효과를 얻을 수 있는 양을 투여하는 것이 중요하다.

본원의 일 구현예에 있어서, 상기 약학 조성물의 투여량은 사용목적, 질환의 중독도, 환자의 연령, 체중, 성별, 기왕력, 또는 유효성분으로서 사용되는 물질의 종류 등을 고려하여 당업자가 결정할 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 약학 조성물은 성인 1인당 약 0.1ng 내지 약 1,000 mg/kg, 바람직하게는 1 ng 내지 약 100 mg/kg로 투여할 수 있고, 본원의 조성물의 투여빈도는 특별히 이에 제한되지 않으나, 1일 1회 투여하거나 또는 용량을 분할하여 수회 투여할 수 있다. 상기 투여량 또는 투여횟수는 어떠한 면으로든 본원의 범위를 한정하는 것은 아니다.

이하, 본원의 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세하게 설명하고자 하나, 하기의 실시예는 본원의 이해를 돕기 위하여 예시하는 것 일뿐, 본원의 내용이 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.

[실시예]

실시예 1: 락토바실러스 루테리 LM1071의 용혈성 확인

본원의 신규 균주인 락토바실러스 루테리 LM1071 (Lactobacillus reuteri LM1071, 기탁기관: 한국미생물보존센터, 수탁번호: KCCM12650P, 수탁일자: 2019년 12월 31일, 이하 LM1071)의 용혈성을 확인하기 위해, 하기와 같은 실험을 수행하였다.

구체적으로, 본원의 LM1071 균주를 MRS 배지에서, 37℃, 18시간동안 배양한 후, 상기 배양된 균주를 5% 양피(sheep blood)가 포함된 한천(agar) 플레이트에 처리하고 37℃, 24시간동안 배양하였다. 배양 후, 콜로니 주변의 투명한 영역의 형성 정도를 토대로 β-용혈성을 확인하였으며, E.coli. ATCC 25922를 양성 대조군으로 이용하였다.

상기 실험 결과, 본원의 LM1071 균주는 용혈성이 없는 것을 의미하는 γ-용혈성를 나타냈으나, 양성 대조군인 E.coli. ATCC 25922는 용혈성(β-hemolysis)을 나타냈음을 확인하였다(표 1).

상기 결과를 토대로, 본원의 LM1071 균주는 용혈성이 없어 이를 프로바이오틱스로 이용할 수 있으며, 다양한 조성물에 사용할 수 있음을 알 수 있다.

실시예 2: 락토바실러스 루테리 LM1071의 생체 아민 생성능 확인

본원의 신규 균주인 락토바실러스 루테리 LM1071의 생체아민 생성능을 확인하기 위해, 하기와 같은 실험을 수행하였다.

구체적으로, 본원의 LM1071 균주를 MRS 배지에서, 37℃, 24시간동안 배양한 후, 상기 균주를 주요 생체 아민[각각 카다베린(cadaverine), 티라민(tyramine), 히스타민(histamine) 및 푸트레신(putrescine)]의 전구체인 라이신, 티로신, 히스티딘 또는 오르니틴 각각이 함유된 특이적 한천 배지에서 37℃, 24시간동안 배양하여 생체 아민의 생성 여부를 확인하였다. 또한, E.coli. ATCC 25922를 양성 대조군으로 이용하였다.

상기 실험 결과, 양성 대조군인 E.coli. ATCC 25922는 주요 생체 아민인 카다베린, 티라민, 히스타민 및 푸트레신을 모두 생성하는 것으로 확인되었으나, 본원의 LM1071 균주는 상기 생체 아민을 모두 생성하지 않는 것이 확인되었다(표 2).

상기 결과를 토대로, 본원의 LM1071 균주는 생체 아민 생성능이 없는 바, 이를 프로바이오틱스로 이용할 수 있으며, 다양한 조성물에 사용할 수 있음을 알 수 있다.

실시예 3: 락토바실러스 루테리 LM1071의 항생제 감수성 확인

본원의 신규 균주인 락토바실러스 루테리 LM1071의 항생제 감수성을 확인하기 위해, 하기와 같은 실험을 수행하였다.

구체적으로, CLSI(Clinical and Laboratory Standards Institute) 권고사항을 고려하여, 본원의 LM1071 균주를 한천 IST(90%) 및 MRS(10%)가 포함된 혼합 배지에서 37℃, 48시간동안 배양한 후, 항생제에 대한 한천 희석법에 의해 최소 억제 농도(minimal inhibitory concentration, MIC)를 확인하였다. MIC를 확인하기 위해, 단일 콜로니를 수득하여 0.01 OD(optical density)를 갖도록 PBS에 재현탁하고, 멀티핀-이노큘레이터(multipin-inoculator)를 사용하여 37℃, 24시간동안 플레이트에 상기 균주를 접종하였다. MIC 값의 기준은 유럽 식품 안전청(European Food Safety Authority, EFSA)에 의해 정해진, 눈에 보이는 성장이 억제된 항생제의 최저 농도로 결정하였다.

병원성 미생물 감염에 따른 질병을 치료하기 위해 항생제를 도입한 이래로, 병원성 박테리아의 항생제 내성 발달은 큰 위협으로 다가오고 있다. 이와 관련하여, 일부 연구에 따르면 공생 박테리아는 병원성 박테리아와 같은 항생제 내성 유전자를 저장할 수 있으며, 상기 박테리아는 항생제 내성 유전자를 병원성 박테리아로 옮기는 매개체로서 항생제 내성 발달에 큰 역할을 하는 것으로 알려져 있다. 최근에는 유산균에 대해서도 이와 같은 현상이 관찰이 되고 있다. 따라서 프로바이오틱스로 사용하는 유산균주에 대해서는 항생제 감수성을 평가하는 것이 중요하다.

상기 실험 결과, 본원의 LM1071 균주는 암피실린 (ampicillin), 에리트로마이신 (erythromycin), 젠타마이신 (gentamicin), 테트라사이클린 (tetracycline), 스트렙토마이신 (streptomycin), 반코마이신 (vancomycin), 클로람페니콜 (chloramphenicol), 카나마이신 (kanamycin) 및 클린다마이신(clindamycin) 등의 항생제에 대한 MIC 값이 EFSA에서 제시한 농도보다 낮은 것이 확인되었는 바(표 3), 상기 균주는 일반적인 다른 균주에 비해 항생제에 대한 저항성이 낮은 것을 알 수 있다.

상기 결과를 토대로, 본원의 LM1071 균주는 항생제에 대한 감수성이 높은 것을 알 수 있는 바, 상기 균주를 프로바이오틱스로 이용할 수 있으며, 다양한 조성물에 사용할 수 있음을 알 수 있다.

실시예 4: 락토바실러스 루테리 LM1071의 장부착능 활성 확인

본원의 신규 균주인 락토바실러스 루테리 LM1071의 장부착능 활성을 확인하기 위해, 하기와 같은 실험을 수행하였다.

먼저, 인간 결장암(human colon adenocarcinoma) 세포주인 HT-29 세포에 대한 부착능을 확인하기 위해, 10% 소혈청(fetal bovine serum), 100 U/ml 페니실린(penicillin) 및 100 mg/ml 스트렙토마이신(streptomycin)이 포함된 RPMI1640 배지에서 37℃, 5% CO₂ 조건으로 HT-29 세포를 배양하고, 24-웰 조직 배양 플레이트에 웰 당 1 x 10⁵ 세포를 시딩하여 HT-29 단일층을 제작하였다. 다음으로 본원의 LM1071 균주를 0.1 OD값을 갖도록 펩톤수(peptone water)로 희석한 후, 1ml을 상기 단일층으로 제조된 HT-29 세포에 처리하고 37℃, 5% CO₂ 조건에서 2시간 동안 배양하였다. 배양 후, 상기 HT-29세포에 부탁되지 않은 균을 제거하기 위해 PBS로 세척하고, 0.25% 트립신-EDTA(trypsin-EDTA)를 처리하였다. 상기 HT-29세포에 부착된 세포의 수를 계산하기 위해, 트립신으로 처리되어 균주가 포함된 샘플을 단계별로 희석한 후, 희석된 샘플 1ml을 플레이트에 뿌리고, 냉각된 MRS 한천 배지를 붓는 방식의 주입평판법(pour plate method)을 이용하였다. 상기 접착 활성은 상대적인 접착율로 표현하였다(접착된 균주의 CFU/첨가된 균주의 CFU x 100). 또한, 양성대조군으로 락토바실러스 람노서스 (Lactobacillus rhamnosus) GG (ATCC53103, 이하LGG) 균주를 이용하였다.

한편, 인간의 위장관(gastrointestinal, GI)에는 ~10¹⁴ 의 박테리아가 존재하며, 1000여종 이상의 박테리아가 끊임없이 상호작용하여 존재한다. 따라서, 위장관의 점액 층에 대한 박테리아의 부착능은 인간 건강에 영향을 끼치기 위한 중요한 전제 조건 중 하나로 알려져 있다.

상기 실험 결과, 실험관 수준에서(in vitro) HT-29 세포에 대한 부착능은 본원의 LM1071 균주가 대조군인 LGG 균주보다 현저히 우수한 것을 확인하였다(도 1).

다음으로, 용매에 대한 미생물의 부착능(Microbial adhesion to solvents, MATS)를 측정하기 위해, 본원의 LM1071 균주를 MRS 배지에서 24시간동안 배양한 후, 12000rpm으로 2분동안 원심분리하여 세포 펠렛을 수득하고, PBS로 세척한 후, 600nm 에서 1.0 ± 0.05 OD 값(약 1.0×10⁸ CFU/ml)을 갖도록 희석하였다 (A₀). 상기 세포 현탁액을 동일한 양의 용매와 혼합한 후, 30분동안 상온에서 정치하고, 수상액 층의 흡광도를 600 nm 조건에서 측정하였다 (A₁). 용매에 대한 균주의 부착능 백분율은 (1 - A₁/A₀)x100로 계산하였다.

한편, 병원균의 억제는 접착 효과가 있는 박테리아 세포벽의 물리 화학적 특성에 기인하는 것으로서, 상기 접착 특성은 반 데르 발스(van der Waals), 루이스 산-염기(Lewis acid-base), 소수성 및 정전기적 상호 작용과 같은 상호 작용에 의해 영향을 받는다. 따라서, 박테리아 세포와 점액 또는 상피 세포 사이의 첫번째 접촉 시 나타나는 소수성이 가장 중요하다고 알려져 있다. 또한, 미생물세포의 장내 부착성은 세포표면의 구조와 조성에 많은 영향을 받는데, 특히 세포표면의 소수성이 주요한 요인으로 알려져 있다.

상기 실험 결과, 본원의 LM1071 균주는 헥사데칸(hexadecane) 용매에서 대조군인 LGG 균주보다 소수성 친화도가 현저히 우수한 것을 확인하였으며(도 2), 크실렌(xylene) 용매에서는 두 균주간 차이가 없었다.

상기 결과를 토대로, 본원의 LM1071 균주는 우수한 장부착능을 갖는 것을 알 수 있는 바, 상기 균주를 프로바이오틱스로 이용할 수 있으며, 다양한 조성물에 사용할 수 있음을 알 수 있다.

전술한 본원의 설명은 예시를 위한 것이며, 본원이 속하는 기술분야의 통상의 지식을 가진 자는 본원의 기술적 사상이나 필수적인 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 쉽게 변형이 가능하다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 이상에서 기술한 실시예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적이 아닌 것으로 이해해야만 한다. 예를 들어, 단일형으로 설명되어 있는 각 구성 요소는 분산되어 실시될 수도 있으며, 마찬가지로 분산된 것으로 설명되어 있는 구성 요소들도 결합된 형태로 실시될 수 있다.

본원의 범위는 상기 상세한 설명보다는 후술하는 특허청구범위에 의하여 나타내어지며, 특허청구범위의 의미 및 범위 그리고 그 균등 개념으로부터 도출되는 모든 변경 또는 변형된 형태가 본원의 범위에 포함되는 것으로 해석되어야 한다.

한국미생물보존센터(국외)

KCCM12650P

20191231

Claims

암피실린 (ampicillin), 에리트로마이신 (erythromycin), 젠타마이신 (gentamicin), 테트라사이클린 (tetracycline), 스트렙토마이신 (streptomycin), 클로람페니콜 (chloramphenicol), 카나마이신 (kanamycin) 및 클린다마이신(clindamycin)에 대한 감수성 및 장부착능을 가지는, 락토바실러스 루테리 (Lactobacillus reuteri) LM1071 균주 (KCCM12650P).
제1항에 있어서,
상기 균주는 γ-용혈 활성을 갖는 것인, 균주.
제1항에 있어서,
상기 균주는 생체 아민을 생성하지 않는 것인, 균주.
제3항에 있어서,
상기 생체 아민은 카다베린(cadaverine), 티라민(tyramine), 히스타민(histamine) 및 푸트레신(putrescine)으로 구성된 군에서 선택된 하나 이상인 것인, 균주.
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