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KR102136172B1 - 세포성장조절 단백질을 포함하는 인간줄기세포 배양액의 제조방법 - Google Patents

세포성장조절 단백질을 포함하는 인간줄기세포 배양액의 제조방법 Download PDF

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KR102136172B1
KR102136172B1 KR1020190118090A KR20190118090A KR102136172B1 KR 102136172 B1 KR102136172 B1 KR 102136172B1 KR 1020190118090 A KR1020190118090 A KR 1020190118090A KR 20190118090 A KR20190118090 A KR 20190118090A KR 102136172 B1 KR102136172 B1 KR 102136172B1
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KR
South Korea
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serum
human
stem cells
medium
culture medium
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KR1020190118090A
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김봉준
김은지
오승익
김미정
하민진
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주식회사 다산씨엔텍
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Abstract

본 발명은 세포성장조절 단백질을 포함하는 인간줄기세포 배양액의 제조방법을 제공한다. 인간줄기세포 배양액의 제조방법은 인간줄기세포를 인간 혈소판 용해물(human Platelet Lysates)을 포함하는 계대배양용 배지에서 계대배양 하는 제1 단계, 상기 계대배양용 배지를 제거하고 무혈청 배양배지(Serum Free Medium)에서 상기 인간줄기세포를 배양하는 제2 단계 및 상기 무혈청 배양배지의 상등액을 필터로 여과하여 세포성장조절 단백질을 포함하는 줄기세포 배양액을 얻는 제3 단계를 포함한다.

Description

세포성장조절 단백질을 포함하는 인간줄기세포 배양액의 제조방법{METHOD FOR PRODUCTION OF HUMAN STEM CELL CONDITIONED MEDIUM COMPRISING CELL GROWTH-REGULATING PROTEINS}
본 발명은 세포성장조절 단백질을 포함하는 인간줄기세포 배양액의 제조방법에 관한 것으로, 보다 상세하게는 동물유래 혈청을 사용하지 않는 고농도의 세포성장조절 단백질을 포함하는 인간줄기세포 배양액의 제조방법에 관한 것이다.
대부분의 세포 배양 배지는 20가지 필수 아미노산, 비필수 아미노산, 비타민, 염류, 포도당, 유기화합물, 호르몬 및 성장인자, 항생제 등을 포함한다. 이들 중 화학 합성이 불가한 복잡한 화합물인 호르몬, 성장인자 등은 일반적으로 우태혈청(Fetal Bovine Serum, FBS) 또는 우아혈청(Bovine Calf Serum, BCS) 등과 같은 동물유래 혈청(Xenogeneic Sera)을 통하여 공급한다. 우태혈청은 우아혈청에 비해 단백질, 지질, 호르몬 및 항체 등의 양은 적지만, 세포 성장 및 증식을 자극하는 많은 성장 인자를 포함하고 있어 가장 널리 사용되고 있다.
그러나 이러한 동물유래 혈청은 곰팡이, 박테리아, 바이러스 또는 프리온과 같은 미생물 오염원으로서의 가능성을 가질 뿐만 아니라, 이종 감염 등의 생물학적 위험요소로 인하여 오랫동안 학계에서 논란의 대상이 되어왔다. 또한, 우태혈청의 대량 생산을 위해 수집되는 동물 혈액은 동물복지에 있어서 비인도적인 행위임이 분명하다. 따라서 동물유래 혈청을 사용함으로 인한 생물학적 위험성, 동물복지의 개선 및 생산비용의 절감 측면과 같은 문제점들을 해결하기 위한 다양한 방법들이 연구되어 왔다.
한국공개특허공보 10-2011-0097064(2011.08.31.)호는 무혈청 줄기세포 배양 조성물에 관한 것으로, 아미노산 또는 그 유사체, 비타민 또는 그 유사체 및 무기질을 포함하는 무혈청 배양 배지에서 인간 지방유래줄기세포를 배양한 배양액을 함유하는 조직 재생용 조성물을 개시하고 있다.
그러나 상기 기술은 줄기세포를 동물유래 혈청을 포함하는 DMEM 배양 배지에서 계대배양 한 후 무혈청 배양 배지에서 줄기세포를 배양하고 있어, 줄기세포가 미생물 오염원에 노출되거나 이종간의 감염 위험성을 여전히 내포하고 있다.
최근의 연구에 따르면 인간 혈소판 용해물(human Platelet Lysates, hPL)은 우태혈청의 대체 물질로서의 가능성이 보고되었다. 인간 혈소판 용해물은 인간의 혈소판에서 유래되어 혈소판의 용해로부터 방출되는 다양한 성장인자, 사이토카인, 케모카인 등을 포함한다. 따라서 인간 혈소판 용해물을 포함하는 배양배지는 중간엽 줄기세포의 배양에 있어서 높은 세포 성장률과 생존율 그리고 분화 능력에 이르기까지 우수한 것으로 검증되고 있다.
본 발명은 인간 혈소판 용해물 및 무혈청 배양배지(Serum Free) 또는 혈청 대체물(Serum Replacements, SR)을 첨가한 배양배지를 사용하여, 보다 안전한 줄기세포 배양액의 제조방법을 제공한다.
1. 한국공개특허공보 공개번호 10-2011-0097064(2011.08.31.)호
본 발명이 해결하고자 하는 제1 기술적 과제는 세포성장조절 단백질을 포함하는 인간줄기세포 배양액의 제조방법을 제공함에 있다.
본 발명이 해결하고자 하는 제2 기술적 과제는 상기 인간줄기세포 배양액의 제조방법에 의하여 제조되는 인간줄기세포 배양액의 유효성분을 포함하는 화장품 조성물을 제공함에 있다.
상술한 제1 기술적 과제를 해결하기 위하여 본 발명은 인간줄기세포를 인간 혈소판 용해물(human Platelet Lysates)을 포함하는 계대배양용 배지에서 계대배양 하는 제1 단계, 상기 계대배양용 배지를 제거하고 무혈청 배양배지(Serum Free Medium)에서 상기 인간줄기세포를 배양하는 제2 단계 및 상기 무혈청 배양배지의 상등액을 필터로 여과하여 세포성장조절 단백질을 포함하는 줄기세포 배양액을 얻는 제3 단계를 포함하는 인간줄기세포 배양액의 제조방법을 제공한다.
상기 인간줄기세포는 인체의 지방조직에서 유래된 지방유래줄기세포일 수 있다.
상기 계대배양용 배지는 인간 혈소판 용해물을 2 % 내지 10 % 포함할 수 있다.
상기 무혈청 배양배지는 혈청 대체물(Serum Replacements)을 포함할 수 있다.
상술한 제2 기술적 과제를 해결하기 위하여 본 발명은 상술한 방법에 의하여 제조되는 인간줄기세포 배양액의 유효성분을 포함하는 화장품 조성물을 제공한다.
본 발명에 따른 인간줄기세포 배양액의 제조방법은 인간 혈소판 용해물을 포함하는 계대배양 배지를 이용함으로써 우태혈청 또는 우아혈청과 같은 동물유래 혈청으로 인한 이종감염 및 미생물 오염의 위험성을 제거하고 우수한 증식률을 유지하며 인간줄기세포를 체외배양 할 수 있다. 최종적으로 무혈청 배양배지 또는 혈청 대체물을 포함하는 배양배지에서 인간줄기세포를 배양함으로써 인체에 안전하며 고농도의 세포성장인자들을 포함하는 인간줄기세포 배양액을 수득하여 세포 성장 및 조직 재생 능력을 갖는 화장품 조성물을 제조할 수 있다.
본 발명의 기술적 효과들은 이상에서 언급한 것들로 제한되지 않으며, 언급되지 않은 또 다른 기술적 효과들은 아래의 기재로부터 당업자에게 명확하게 이해될 수 있을 것이다.
도 1은 본 발명의 일 실시예에 따른 인간줄기세포 배양액의 제조방법을 설명하기 위한 순서도이다.
도 2는 (a) 우태혈청을 포함하는 계대배양 배지 및 (b) 인간 혈소판 용해물을 포함하는 계대배양 배지에서 각각 배양한 지방유래줄기세포(human Adiopse-derived Stem Cells, hADSCs)의 사진이다.
도 3은 우태혈청을 포함하는 계대배양 배지 및 인간 혈소판 용해물을 포함하는 계대배양 배지에서 각각 배양한 지방유래줄기세포의 줄기세포 특이적인 세포 표면 항원의 발현 여부를 형광라벨 유세포분석(Fluorescence activated cell sorting) 방법으로 확인한 결과를 도시하는 그래프이다.
도 4는 우태혈청을 포함하는 계대배양 배지 및 인간 혈소판 용해물을 포함하는 계대배양 배지에서 각각 배양한 지방유래줄기세포의 세포성장률(Cumulative Population Doubling Level)을 도시하는 그래프이다.
도 5는 우태혈청을 포함하는 계대배양 배지 및 인간 혈소판 용해물을 포함하는 계대배양 배지에서 각각 배양한 지방유래줄기세포의 (a) 지방세포, (b) 골세포 및 (c) 연골세포로의 분화효율을 나타내는 사진 및 그래프이다.
도 6은 우태혈청-무혈청 배양배지(FBS-SF), 인간 혈소판 용해물-무혈청 배양배지(hPL-SF), 인간 혈소판 용해물-혈청 대체물(hPL-SR)을 포함하는 배양배지에서 각각 배양된 지방유래줄기세포 배양액 내의 세포성장조절 단백질(Collagen I α-1, Prolactin, GM-CSF, EGF, IL-6 및 IL-8)의 발현량을 효소결합면역흡착검사법(enzyme-linked immunosorbent assay, ELISA)로 확인한 결과를 도시하는 그래프이다.
본 발명이 여러 가지 수정 및 변형을 허용하면서도, 그 특정 실시예들이 도면들로 예시되어 나타내어지며, 이하에서 상세히 설명될 것이다. 그러나 본 발명을 개시된 특별한 형태로 한정하려는 의도는 아니며, 오히려 본 발명은 청구항들에 의해 정의된 본 발명의 사상과 합치되는 모든 수정, 균등 및 대용을 포함한다.
비록 제1, 제2 등의 용어가 여러 가지 요소들, 성분들, 영역들, 층들 및/또는 지역들을 설명하기 위해 사용될 수 있지만, 이러한 요소들, 성분들, 영역들, 층들 및/또는 지역들은 이러한 용어에 의해 한정되어서는 안 된다는 것을 이해할 것이다.
이하 첨부한 도면들을 참조하여, 본 발명의 바람직한 실시예를 보다 상세하게 설명하고자 한다.
제조방법
도 1은 본 발명의 일 실시예에 따른 인간줄기세포 배양액의 제조방법을 설명하기 위한 순서도이다.
도 1을 참조하면, 먼저 인간줄기세포를 인간 혈소판 용해물을 포함하는 계대배양용 배지에서 계대배양한다(S1).
본 발명에서 인간줄기세포는 인체 유래 줄기세포로서, 분화능(potency) 및 자기재생(self-renewal)능을 갖는 세포를 의미한다. 상기 인간줄기세포는 지방세포, 골세포, 연골세포 및 피부세포 등으로 분화 가능한 다분화능을 가지며, 자기재생능을 갖는 중간엽 줄기세포일 수 있다.
상기 인간줄기세포는 인체의 지방조직에서 유래된 지방유래줄기세포일 수 있으며, 통상의 기술자에게 공지된 방법으로 수득할 수 있다. 예를 들어 지방유래줄기세포는 지방조직을 분리 효소 처리하여 수득하는 것이거나, 추출된 지방유래줄기세포를 구매한 것일 수 있으나 이에 한정되는 것은 아니다.
인간 혈소판 용해물은 계대배양용 배지의 2 % 내지 10 %의 부피비로 포함될 수 있다. 계대배양용 배지는 동물유래 혈청을 포함하지 않으며, 통상의 기술자에게 공지된 인간줄기세포의 배양에 적합한 배양배지일 수 있다. 예를 들어 인간 혈소판 용해물을 포함하는 계대배양용 배지는 DMEM(Dulbecco's Modified Eagle's Medium), MEM(Minimal Essential Medium), BME(Basal Medium Eagle), RPMI1640, F-10, F-12, DMEM/F12, α-MEM(α-Minimal Essential Medium), G-MEM(Glasgow's Minimal Essential Medium), IMDM(Iscove's Modified Dulbecco's Medium), MacCoy's 5A 배지, AmnioMax complete 배지, AminoMax±complete 배지, EBM-2 Basal 배지, Chang's Medium 및 MesenCult-XF로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상을 포함하는 것일 수 있으나 이에 한정되는 것은 아니다.
인간줄기세포는 계대배양용 배지에서 3×103/㎠ 내지 6×103/㎠의 밀도가 되도록 계대배양할 수 있다.
상기 계대배양용 배지를 제거하고 무혈청 배양배지(Serum Free Medium)에서 상기 인간줄기세포를 배양한다(S2).
상기 계대배양용 배지를 제거하기 위하여 인산염 완충 식염수(Phosphate Buffered Saline, PBS)로 1회, 2회 또는 3회 이상 세척하는 단계를 포함할 수 있다.
무혈청 배양배지는 동물유래 혈청을 포함하지 않으며, 통상의 기술자에게 공지된 인간줄기세포의 배양에 적합한 배양배지일 수 있다. 무혈청 배양배지는 콜린클로라이드(Choline chloride) 등의 화장품 조성물로 적합하지 아니한 성분을 포함하지 않는 배양배지일 수 있다. 예를 들어 무혈청 배양배지는 항생제, 페놀레드(Phenol Red), 콜린클로라이드 및 그 외 화장품 조성물로 적합하지 아니한 성분들이 제외되며, 통상의 기술자에게 공지된 인간줄기세포의 배양에 적합한 배양배지로, DMEM(Dulbecco's Modified Eagle's Medium), MEM(Minimal Essential Medium), BME(Basal Medium Eagle), RPMI1640, F-10, F-12, DMEM/F12, α-MEM(α-Minimal Essential Medium), G-MEM(Glasgow's Minimal Essential Medium), IMDM(Iscove's Modified Dulbecco's Medium), MacCoy's 5A 배지, AmnioMax complete 배지, AminoMax±complete 배지, EBM-2 Basal 배지, Chang's Medium 및 MesenCult-XF로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상을 포함하는 것일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
무혈청 배양배지는 혈청 대체물을 포함할 수 있다. 상기 혈청 대체물은 통상의 기술자에게 공지된 인간줄기세포 배양에 혈청을 대체하여 적용 가능한 물질일 수 있다. 혈청 대체물은 알부민 또는 알부민 치환물, 아미노산, 비타민, 트랜스페린 또는 트렌스페린 치환물, 인슐린 또는 인슐린 치환물, 콜라겐 전구체 및 미량 원소로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 성분을 포함하는 물질 일 수 있으며, 시판품일 수 있으나 이에 한정되지 않는다.
인간줄기세포는 무혈청 배양배지 또는 혈청 대체물을 포함하는 배양배지에서 12 시간 이상 배양될 수 있다. 인간줄기세포는 무혈청 배양배지 또는 혈청 대체물을 포함하는 배양배지에서 48 시간 내지 84 시간 동안 배양될 수 있다.
상기 무혈청 배양배지의 상등액을 필터로 여과하여 세포성장조절 단백질을 포함하는 줄기세포 배양액을 얻는다(S3).
필터로 여과하는 단계는 기공의 크기가 0.01 μm 내지 0.5 μm인 필터로 여과하는 단계일 수 있으며, 동일한 크기의 기공을 가지거나, 서로 다른 크기의 기공을 가지는 복수 개의 필터를 조합하여 여과할 수 있으며, 경우에 따라 복수 번의 여과 단계를 거칠 수 있다.
무혈청 배양배지의 상등액은 필터로 여과하는 단계 이전에 원심분리를 통하여 불순물을 제거하는 단계를 더 포함할 수 있다.
필터로 여과하여 수득한 인간줄기세포 배양액은 세포성장조절 단백질을 포함한다. 상기 세포성장조절 단백질은 콜라겐의 구성성분인 Collagen I α-1, 피부재생과 관련된 프롤락틴(Prolactin), 상처치유와 관련된 GM-CSF 및 EGF, 미백과 관련된 IL-6 및 세포의 성장조절과 관련된 IL-8 등 피부 미용 및 조직 재생을 위한 유효 성분들을 포함할 수 있으며, 인간줄기세포가 무혈청 배양배지에서 배양된 컨디션 및 배양 시간에 따라 유효 성분의 종류 및 농도를 달리할 수 있다.
상술한 제조방법에 따라 제조된 인간줄기세포 배양액은 화장품 조성물에 이용될 수 있다. 본 발명의 일 실시예에 따라 제조된 인간줄기세포 배양액의 유효성분을 포함하는 화장품 조성물은 용액, 겔, 고체, 현탁액, 포말, 에어로졸 또는 패치 형태로 이용될 수 있다.
상기 화장품 조성물은 화장품의 목적에 따라 통상적으로 배합되는 다른 성분들을 포함할 수 있다. 예를 들어 상기 용해액은 보존제, 보습제, 계면 활성제, 유기 및 무기 안료, 유기 분체, 자외선 흡수제, 방부제, 살균제, 산화 방지제, 안정화제, 글리세린, pH 조절제, 알콜, 색소, 향료, 냉감제 등을 포함할 수 있으나 이에 한정되는 것은 아니다.
또한, 화장품 조성물은 동결건조 조성물 상태로 화장품 사용자에게 공급될 수 있다. 따라서 화장품 사용자는 직접 정제수, 화장수, 미용액, 토너, 크림, 젤, 패치, 마스크 등을 동결건조 조성물에 적용하여 피부에 적용할 수 있다.
실험예 1. 지방유래 줄기세포의 배양
ATCC(American Type Culture Collection)에서 구입한 인간 지방유래 줄기세포를 페놀레드(Phenol Red)와 콜린클로라이드(Choline chloride)가 제외된 DMEM/F12(Dulbecco’s Modified Eagle Medium/Ham’s F-12 Nutrient Mixture), 1% 페니실린 스트렙토마이신(penicillin streptomycin), 10 % 우태혈청(fetal bovine serum,FBS) 또는 5 % 인간 혈소판 용해물(human platelet lysate, hPL)을 포함하는 계대배양용 배지에서 37 ℃, 5 % CO2 의 배양기 조건으로 배양하였다.
도 2는 (a) 10 % 우태혈청(FBS)을 포함하는 계대배양 배지 및 (b) 인간 혈소판 용해물(hPL)을 포함하는 계대배양 배지에서 각각 배양한 지방유래줄기세포를 40배 확대한 현미경 사진이다.
도 2를 참조하면, 지방유래줄기세포는 방추상의 섬유아세포(Fibroblast-like morphology)의 형태를 가지는 것을 확인할 수 있다. 인간 혈소판 용해물을 포함하는 계대배양 배지에서 배양된 지방유래줄기세포는 바닥에 길쭉한 모양으로 붙어 자라는 특징을 가지며, 계대배양을 반복하여도 형태를 잘 유지하는 것을 확인하였다.
실험예 2. 형광라벨 유세포분석(Fluorescence Activated Cell Sorting, FACS)
실험예 1에서 배양된 줄기세포는 P3(Passage number 3)에서 2×105개의 세포로 각각 분주하고 CD29, CD73, CD90, CD14, CD34 및 CD45를 포함하는 세포표면 표식인자(Surface marker antibody) 5 ㎕를 첨가하여 40분 동안 암실에서 반응시켰다. 이후 줄기세포를 PBS 200 ㎕로 2회 세척 후, 원심 분리하여 상층액을 제거하고 남아있는 세포에 PBS 200 ㎕를 첨가한 후, FACS를 이용하여 세포 수를 확인하였다.
도 3은 우태혈청(FBS 10 %)을 포함하는 계대배양 배지 및 인간 혈소판 용해물(hPL 5 %)을 포함하는 계대배양 배지에서 각각 배양한 지방유래줄기세포의 줄기세포 특이적인 세포 표면 항원의 발현 여부를 형광라벨 유세포분석 방법으로 확인한 결과를 도시하는 그래프이다.
중간엽 줄기세포 특이적인 세포 표면항원으로는 CD29, CD73 및 CD90를 선택하였고, 비특이적인 세포 표면항원으로는 CD14, CD34 및 CD45를 선택하였다. 도 3을 참조하면, 중간엽 줄기세포 표식인자인 CD29, CD73 및 CD90의 발현율은 FBS(10%) 및 hPL(5%)로 각각 배양된 세포에서 모두 99.88 % 이상의 높은 발현율을 보였고, 나머지 CD14, CD34 및 CD45의 경우 5 % 미만의 낮은 발현율을 보여 지방유래 줄기세포임을 확인하였다.
실험예 3. 줄기세포의 성장률 측정
실험예 1에서 배양된 줄기세포 3×103/㎠ 를 FBS(10%) 및 hPL(5%)이 포함된 배양배지에서 배양 한 후, 세포 성장률(Cumulative Population Doubling Level, CDPL)을 확인하였다.
CPDL의 값은 다음과 같은 식으로 계산하였다.
CPDL = ln(Nf/Ni)/Ln2
(Ni = 초기 seeding한 세포 수; Nf = 최종 세포 수)
도 4는 우태혈청(FBS 10 %)을 포함하는 계대배양 배지 및 인간 혈소판 용해물(hPL 5 %)을 포함하는 계대배양 배지에서 각각 배양한 지방유래줄기세포의 세포성장률을 도시하는 그래프이다.
도 4를 참조하면, 계대수(Passage number)에 따른 CPDL 값은 지방유래줄기세포의 P4 및 P7에서 hPL을 5 % 포함하는 계대배양 배지로 배양한 지방유래줄기세포의 증식률이 FBS 10%를 포함하는 계대배양 배지로 배양한 지방유래줄기세포의 증식률보다 우수한 것을 확인할 수 있다.
실험예 4. 줄기세포의 분화능 확인
실험예 1에서 배양된 줄기세포를 P4(Passage number 4)에서 지방세포(Adipocyte), 골세포(Osteocyte) 및 연골세포(Chondrocyte)로의 분화를 유도하고 분화능력을 평가하였다.
지방세포로의 분화는 FBS(10%) 및 hPL(5%)를 포함하는 계대배양 배지에서 각각 배양된 지방유래줄기세포를 6-well 플레이트에 웰 당 1×104 cells/㎠씩 분주하고 4일 후, 배지를 지방세포 분화용 배지(Adipogenic differentiation medium)로 교환하고, 3~4일 마다 배지를 교환하며 2주간 배양 하였다. 이후 Oil red O로 염색하여 세포를 관찰하였다.
골세포로의 분화는 FBS(10%) 및 hPL(5%)를 포함하는 계대배양 배지에서 각각 배양된 지방유래줄기세포를 6-well 플레이트에 웰 당 5×103 cells/㎠씩 분주하고 4일 후, 배지를 골세포 분화용 배지(Osteogenic differentiation medium)로 교환한 후, 3~4일 마다 배지를 교환해가며 2주간 배양 하였다. 이후 Alizarin red S로 염색하여 세포를 관찰하였다.
연골세포로의 분화는 FBS(10%) 및 hPL(5%)를 포함하는 계대배양 배지에서 각각 배양된 지방유래줄기세포를 6-well 플레이트에 웰 당 1.6×107 cells/㎠씩 분주하고 2시간 후, 연골세포 분화용 배지(Chondrogenic differentiation medium)로 교환한 후, 3~4일 마다 배지를 교환해가며 2주 내지 3주간 배양 하였다. 이후 Alician Blue로 염색하여 세포를 관찰하였다.
도 5는 우태혈청(FBS 10 %)을 포함하는 계대배양 배지 및 인간 혈소판 용해물(hPL 5 %)을 포함하는 계대배양 배지에서 각각 배양한 지방유래줄기세포의 (a) 지방세포, (b) 골세포 및 (c) 연골세포로의 분화 효율을 나타내는 사진 및 그래프이다.
분화효율을 시각적으로 표시하기 위하여 Image J 프로그램을 이용하여 염색된 면적은 Intensity로 수치화 하고, 두 집단 간의 평균값의 차이는 독립 표본 t-test(p<0.05)로 검정하였다.
도 5를 참조하면, hPL을 포함하는 계대배양 배지에서 배양된 지방유래줄기세포의 분화능력이 더 우수한 것을 확인할 수 있다. 특히 골세포로의 분화능력이 FBS를 포함하는 계대배양 배지에서 배양된 지방유래줄기세포에 비해 9.15배(23.8/2.6) 높아 가장 큰 차이를 보였고, 지방세포의 경우 2.96배(25.8/8.7), 그리고 연골세포의 경우 2.25배(74.6/33.1)로 높은 것을 확인하였다.
실험예 5. 줄기세포 배양액의 수득 및 줄기세포 배양액 내의 성장인자 분석
실험예 1에서 배양된 지방유래줄기세포를 각각 P3(Passage number 3)에서 1×106/dish의 농도로 분주하고, 2시간 이후 각각의 배양액을 제거한 후 PBS로 3회 세척하였다. 세척한 지방유래줄기세포를 무혈청 배양배지(Serum Free, SF), 혈청대체물(Serum Replacement, SR)을 포함하는 배양배지에서 각각 76 시간동안 배양하였다. 무혈청 배양배지 및 혈청대체물을 포함하는 배양배지는 항생제, 페놀 레드(Phenol Red)와 콜린클로라이드(Choline chloride)가 제외된, α-MEM을 이용하였다. 각각의 배양액을 1,500 rpm에서 5 분간 원심 분리를 하여 불순물을 제거한 후, 상등액을 0.22 ㎛ 주사식 여과기로 여과하여 줄기세포 배양액을 수득하였다.
수득한 배양액 내의 세포성장조절 단백질(Collagen type I α-1, Prolactin, GM-CSF, EGF, IL-6 및 IL-8 )의 발현 수준을 효소결합면역흡착검사법(enzyme-linked immunosorbent assay, ELISA)로 확인하였다. 두 집단 간의 평균값의 차이는 독립표본 t-test(p<0.05)로 검정하였다.
도 6은 우태혈청-무혈청 배양배지(FBS-SF), 인간 혈소판 용해물-무혈청 배양배지(hPL-SF), 인간 혈소판 용해물-혈청 대체물(hPL-SR)을 포함하는 배양배지에서 각각 배양된 지방유래줄기세포 배양액 내의 세포성장조절 단백질(Collagen I α-1, Prolactin, GM-CSF, EGF, IL-6 및 IL-8)의 발현량을 효소결합면역흡착검사법로 확인한 결과를 도시하는 그래프이다.
도 6을 참조하면, 인간 혈소판 용해물을 포함하는 계대배양 배지에서 계대배양하고, 혈청 대체물을 포함하는 배양배지에서 배양된 지방유래줄기세포의 배양액(hPL-SR) 내의 세포성장조절 단백질의 발현이 우태혈청을 포함하는 계대배양 배지에서 계대배양하고, 무혈청 배양배지에서 배양된 지방유래줄기세포의 배양액(FBS-SF)에 비하여 유의미한 수준으로 증가된 것을 확인하였다.
콜라겐 구성성분인 Collagen I α-1은 28배(883/31) 증가하였고, 피부재생과 관련된 Prolactin는 1.9배(1.5/0.8) 증가하였으며, 상처치유와 관련된 GM-CSF 및 EGF는 각각 2배(6/3) 그리고 1.2배(2.9/2.5) 증가하였다. 미백과 관련된 IL-6는 1.5배(220/150) 증가하였고, 세포의 성장조절과 관련된 IL-8은 18배(1367/74) 증가 하였다.

Claims (5)

  1. 인간줄기세포를 인간 혈소판 용해물(human Platelet Lysates)을 포함하는 계대배양용 배지에서 계대배양 하는 제1 단계;
    상기 계대배양용 배지를 제거하고 무혈청 배양배지(Serum Free Medium)에서 상기 인간줄기세포를 배양하는 제2 단계; 및
    상기 무혈청 배양배지의 상등액을 필터로 여과하여 세포성장조절 단백질을 포함하는 줄기세포 배양액을 얻는 제3 단계를 포함하고,
    상기 인간줄기세포는 인체의 지방조직에서 유래된 지방유래줄기세포이고,
    상기 무혈청 배양배지는 알부민 또는 알부민 치환물, 아미노산, 비타민, 트랜스페린 또는 트랜스페린 치환물, 인슐린 또는 인슐린 치환물, 콜라겐 전구체 및 미량 원소로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 성분을 포함하는 혈청 대체물(Serum Replacements)을 포함하는 인간줄기세포 배양액의 제조방법.
  2. 삭제
  3. 제1항에 있어서,
    상기 계대배양용 배지는 인간 혈소판 용해물을 2 % 내지 10 % 포함하는 것을 특징으로 하는 인간줄기세포 배양액의 제조방법.
  4. 제1항에 있어서,
    상기 세포성장조절 단백질은 Collagen I α-1, 프롤락틴(Prolactin), GM-CSF, EGF, IL-6 및 IL-8의 피부 미용 및 조직 재생을 위한 유효 성분들을 포함하는 인간줄기세포 배양액의 제조방법.
  5. 제1항, 제3항 및 제4항 중 어느 한 항의 방법에 의하여 제조되는 인간줄기세포 배양액의 유효성분을 포함하는 것을 특징으로 하는 화장품 조성물.
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