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KR102136132B1 - CRISPR/Cas9 시스템을 통한 닭 백혈병 바이러스(Avian Leukosis Virus, ALV) 저항성 조류의 제조방법 - Google Patents

CRISPR/Cas9 시스템을 통한 닭 백혈병 바이러스(Avian Leukosis Virus, ALV) 저항성 조류의 제조방법 Download PDF

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KR102136132B1
KR102136132B1 KR1020190012633A KR20190012633A KR102136132B1 KR 102136132 B1 KR102136132 B1 KR 102136132B1 KR 1020190012633 A KR1020190012633 A KR 1020190012633A KR 20190012633 A KR20190012633 A KR 20190012633A KR 102136132 B1 KR102136132 B1 KR 102136132B1
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한재용
이홍조
나이르 베뉴고팔
야오 용시우
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서울대학교 산학협력단
더 피르브라이트 인스티튜트
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Abstract

본 발명은 CRISPR/Cas9 시스템을 이용하여 제작한 닭 백혈병 바이러스(Avian leukosis virus, ALV) 저항성 조류 및 이의 제조방법에 관한 것이다. 보다 구체적으로는 CRISPR/Cas9 시스템을 통한 유전자 편집을 실시하여 닭의 chNHE1 유전자 내 Trp38, Thr37 및 Gln40 중에서 선택된 하나 이상의 부위를 특이적으로 변형시켜 제조한 ALV 하위그룹 J(ALV-J)에 대한 저항성을 가진 ALV-J 저항성 조류 및 이의 제조방법에 관한 것이다. 본 발명에 따른 닭 백혈병 바이러스(Avian Leukosis Virus, ALV) 저항성 조류는 바이러스 감염의 위험이 없어 축산품으로서의 가치가 높다. 또한, 본 발명의 유전자 편집 방법은 바이러스와 수용체간의 결합을 억제할 수 있는 특정 유전자형의 발굴 및 세포주를 활용한 바이러스-수용체 결합 연구에 활용될 수 있고, 나아가 닭 백혈병 바이러스에 저항성을 가진 조류를 생산하는 시스템을 확립할 수 있을 것으로 기대된다.

Description

CRISPR/Cas9 시스템을 통한 닭 백혈병 바이러스(Avian Leukosis Virus, ALV) 저항성 조류의 제조방법{A METHOD FOR PRODUCING AVIAN LEUKOSIS VIRUS(ALV)-RESISTANT AVIAN LINE USING CRISPR/CAS9 SYSTEM}
본 발명은 CRISPR/Cas9 시스템을 이용하여 제작한 닭 백혈병 바이러스(Avian leukosis virus, ALV) 저항성 조류 및 이의 제조방법에 관한 것이다. 보다 구체적으로는 CRISPR/Cas9 시스템을 통한 유전자 편집을 실시하여 닭의 chNHE1 유전자 내 Trp38, Thr37 및 Gln40 중에서 선택된 하나 이상의 부위를 특이적으로 변형시켜 제조한 ALV 하위그룹 J(Avian Leukosis Virus subgroup J)에 대한 저항성을 가진 ALV-J 저항성 조류 및 이의 제조방법에 관한 것이다.
최근 3세대 유전자 가위인 CRISPR/Cas9 시스템을 이용한 유전자 편집(genome editing)이 생명공학 분야에서 새로운 혁신을 가져오고 있다. CRISPR/Cas9 시스템은 Cas9(CRISPR associated protein 9) 단백질과 guide RNA의 결합을 통해 표적 유전자를 효과적으로 절단하여 DNA 이중가닥 절단(double strand breaks, DSBs)을 일으킨다. 이중가닥절단이 형성되면, 잘린 DNA는 크게 비상동성 말단 접합(non-homologous end joining, NHEJ) 또는 상동 재조합(homologous recombination, HR)의 두 가지 경로에 의해 수선되는데, 이 때 표적 특이적인 돌연변이 및 유전자 변형이 일어나게 된다. 이와 같은 CRISPR/Cas9 시스템에 기반하여 표적화된 유전자 조절이 가능하다.
닭 백혈병 바이러스는 숙주 수용체와 특이적으로 결합하여 질병을 전파하여, 국내 가금분야는 물론 전세계적으로 꾸준히 막대한 경제적 피해를 야기하고 있다. 닭 백혈병 바이러스(Avian Leukosis Virus, ALV)는 표면 당단백질의 종류에 따라 하위 그룹이 나뉘고, 각각의 그룹은 특정 숙주 수용체와 결합한다는 것이 알려져 있다. 특히, 닭 백혈병 바이러스 중 하위 그룹 J(Avian Leukosis Virus subgroup J, ALV-J)는 Na+/H+ exchange 1(NHE1)이라는 수용체와 특이적으로 결합한다.
이처럼 닭 백혈병 바이러스가 특이적으로 결합하는 숙주 수용체에 대한 정보는 기존의 연구를 통해 잘 알려져 있지만, 기술적 한계에 의해 숙주의 수용체 유전자 편집을 통한 저항성 획득 연구에 관해서는 관련 연구가 진행된 바가 거의 없다.
이에, 본 발명자들은 상기 숙주 수용체의 변이를 통해 조류에서 ALV-J 바이러스의 침투를 억제할 수 있을 것으로 판단하고, CRISPR/Cas9을 사용하여 특정 유전자 염기서열을 인지한 후 그 부위에 염기서열 이중나선 결손을 유도하여 유전자 편집을 실시하였다. 나아가, 정확한 유전자 편집을 위해 단일가닥 올리고데옥시뉴클레오티드(single-stranded oligodeoxynucleotide, ssODN)를 CRISPR/Cas9 벡터와 함께 도입하였다. 그 결과, 유전자 내 특정 부위 또는 특정 아미노산의 결손만을 유도하여 효율적으로 chNHE1 유전자를 변형시켜 ALV-J에 저항성을 가진 조류모델을 제조할 수 있음을 확인하고 본 발명을 완성하였다.
본 발명의 목적은 제1 프로모터 및 이와 작동가능하게 연결된 chNHE1(chicken Na+/H+ exchange 1)의 gRNA(guide RNA); 및 제2 프로모터 및 이와 작동가능하게 연결된 Cas9(CRISPR associated protein 9)을 암호화하는 유전자를 포함하는 ALV-J(Avian Leukosis Virus-J, 닭 백혈병 바이러스 하위그룹 J) 저항성 조류모델 제작용 재조합 벡터를 제공하는 데에 있다.
또한, 본 발명의 목적은 본 발명에 따른 재조합 벡터 및 ssODN(single-stranded oligodeoxynucleotide, 단일 가닥 올리고데옥시뉴클레오티드)을 포함하는 것을 특징으로 하는 유전체 교정용 조성물을 제공하는 데에 있다.
또한, 본 발명의 목적은 본 발명에 따른 재조합 벡터 또는 유전체 교정용 조성물이 도입된 ALV-J 저항성 조류모델 제작용 형질전환 세포주를 제공하는 데에 있다.
또한, 본 발명의 목적은 본 발명에 따른 재조합 벡터 또는 유전체 교정용 조성물을 제조하는 단계; 및 상기 재조합 벡터 또는 유전체 교정용 조성물을 조류 체세포에 도입하는 단계;를 포함하는 ALV-J 저항성 조류모델 제작용 형질전환 세포주의 제조방법 및 상기 형질전환 세포주를 이용한 ALV-J 저항성 조류모델의 제조방법을 제공하는 데에 있다.
상기와 같은 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 제1 프로모터 및 이와 작동가능하게 연결된 chNHE1(chicken Na+/H+ exchange 1)의 gRNA(guide RNA); 및 제2 프로모터 및 이와 작동가능하게 연결된 Cas9(CRISPR associated protein 9)을 암호화하는 유전자를 포함하는 ALV-J(Avian Leukosis Virus-J, 닭 백혈병 바이러스 하위그룹 J) 저항성 조류모델 제작용 재조합 벡터를 제공한다.
또한, 본 발명은 본 발명에 따른 재조합 벡터 및 ssODN(single-stranded oligodeoxynucleotide, 단일 가닥 올리고데옥시뉴클레오티드)을 포함하는 것을 특징으로 하는 유전체 교정용 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은 본 발명에 따른 재조합 벡터 또는 유전체 교정용 조성물이 도입된 ALV-J 저항성 조류모델 제작용 형질전환 세포주를 제공한다.
또한, 본 발명은 본 발명에 따른 재조합 벡터 또는 유전체 교정용 조성물을 제조하는 단계; 및 상기 재조합 벡터 또는 유전체 교정용 조성물을 조류 체세포에 도입하는 단계;를 포함하는 ALV-J 저항성 조류모델 제작용 형질전환 세포주의 제조방법을 제공한다.
또한, 본 발명은 본 발명에 따른 형질전환 세포주를 수용체 조류의 배아에 이식하는 단계; 를 포함하는 ALV-J 저항성 조류모델의 제조방법을 제공한다.
본 발명에 따른 닭 백혈병 바이러스(Avian Leukosis Virus, ALV) 저항성 조류는 바이러스 감염의 위험이 없어 축산품으로서의 가치가 높다. 또한, 본 발명의 유전자 편집 방법은 바이러스와 수용체간의 결합을 억제할 수 있는 특정 유전자형의 발굴 및 세포주를 활용한 바이러스-수용체 결합 연구에 활용될 수 있고, 나아가 닭 백혈병 바이러스에 저항성을 가진 조류를 생산하는 시스템을 확립할 수 있을 것으로 기대된다.
도 1은 본 발명에 따른 CRISPR/Cas9 벡터의 개열지도 및 본 발명에 따른 ALV-J 저항성 세포주 확립 과정을 도식적으로 나타낸 것이다. CRISPR/Cas9 벡터는 Cas9 단백질 코딩 서열, chNHE1 타겟 gRNA(guide RNA), 네오마이신/퓨로마이신 저항성 유전자를 포함하며 DF-1 세포에 도입하여 형질전환시켰다. U6: 인간 U6 프로모터(human U6 promoter), CBh: 닭 베타-액틴 프로모터(chicken beta-actin short promoter), Amp: 엠피실린(ampicillin), Tk: 티미딘 키나아제 프로모터(thymidine kinase promoter), Neo: 네오마이신 저항성 유전자, Puro: 퓨로마이신 저항성 유전자, LTR: 긴 말단 반복(long terminal repeat), GFP: 녹색 형광 단백질(green fluorescent protein).
도 2는 DF-1 섬유아세포에서 CRISPR/Cas9을 이용한 chNHE1 유전자 내 변형을 나타내는 도이다. 도 2의 A는 chNHE1 유전자의 구조 및 NHE1#3, NHE1#4 CRISPR/Cas9 벡터의 인식 부위를 나타낸 도이며, 파란 선은 guide RNA 인식 부위를, 빨간 선은 PAM(protospacer-adjacent motif) 서열을 의미한다(Scale bar = 1 kb). 도 2의 B는 NHE1#3-neo (N3N), NHE1#4-neo (N4N), NHE1#3-puro (N3P) 및 NHE1#4-puro (N4P)로 감염시킨 DF-1 세포의 T7E1 분석 결과를 나타낸 도이다(숫자는 indel 효율을 의미). 도 2의 C는 감염된 DF-1 세포의 서열 분석 결과를 나타낸 도이며, 주황색 화살표는 chNHE1 유전자의 38번째 트립토판 잔기(Trp38)를, 빨간색 화살표는 CRISPR/Cas9 벡터의 타겟 부위를 의미한다.
도 3은 chNHE1 유전자 변형이 확인된 DF-1 클론에서 바이러스 감염 확인 및 유세포 분석(flow cytometry)을 실시한 결과를 나타낸 도이다.
도 4는 DF-1 섬유아세포에서 ssODN(single-stranded oligodeoxynucleotide)을 사용한 chNHE1 유전자 편집을 나타낸 도이다.
도 5는 chNHE1 유전자의 Trp38을 타겟팅한 DF-1 클론의 바이러스 감염 및 유세포 분석 결과를 나타낸 도이다. 도 5의 A는 NHE1#3-puro + ssODN (N3Pss)로 감염된 DF-1로부터 얻은 chNHE1 유전자의 Trp38을 타겟팅한 DF-1 클론의 유세포 분석 결과를 나타낸 도이며, 총 9개의 DF-1 클론이 관찰되었다(Scale bar = 200μm). 도 5의 B는 chNHE1 조기 종결 코돈을 생성하는 indel 유도된 DF-1 클론, C는 기타 변형이 유도된 DF-1 클론을 형광현미경으로 관찰한 결과 및 유세포 분석 결과를 나타낸 도이다(Scale bar = 200μm). 각 막대는 모든 실험을 3회 반복으로 행한 표준편차를 의미한다.
도 6은 chNHE1 단백질 서열의 생물정보학적 분석 결과를 나타낸 도이다. 도 6의 A는 chNHE1의 구조를 도식적으로 나타낸 도이며, 세포 외(extracellular) 및 세포질(cytoplasmic)에 존재하는 부위를 각각 노란색, 하늘색으로 나타내었다. N-말단 세포 외 서열은 신호 펩타이드 서열에 밑줄 표시로 나타내었다. PSIPRED에 의해 예측된 이차 구조는 해당 서열 위에 별표(*, α-나선) 및 점(, β-가닥)으로 나타내었다. DISOPRED3에 의해 예측된 disordered 단백질 결합 부위는 confidence score > 0.8에 대하여 빨간색 글자로 나타내었다. 도 6의 B는 DISOPRED3에 의해 예측된 chNHE1의 disorder 경향을 나타낸 도이며, confidence score > 0.8에 대하여 빨간 선으로 나타내었다.
도 7은 원시생식세포(Primordial germ cells, PGC)에서 CRISPR/Cas9을 이용한 chNHE1 유전자 내 Trp38 indel 유도를 확인한 결과를 나타낸 도이다. 도 7의 A는 NHE1#3 PGC로 감염시킨 PGC의 T7E1 분석 결과를 나타낸 도이다. 도 7의 B는 감염된 PGC의 서열 분석 결과를 나타낸 도이다.
이하, 본 발명을 상세히 설명한다.
본 명세서에서 용어 “CRISPR/Cas9” 또는 “CRISPR/Cas9 시스템”은, 크리스퍼(Clustered regularly interspaced short palindromic repeat, CRISPR) 유전자 가위라 불리는 게놈 편집 방법으로, 특정 염기서열에 특이적으로 결합하는 RNA(gRNA)와 특정한 염기서열을 자르는 가위 역할인 Cas9 단백질로 구성된다. 이러한 CRISPR/Cas9 시스템을 이용하면 세포나 동물에 플라스미드(Plasmid) DNA를 도입하여 특정 유전자의 기능을 억제할 수 있는 녹-아웃(knock-out)이 가능하다.
본 명세서에서 용어 “Cas9(CRISPR associated protein 9) 단백질”은, CRISPR/Cas9 시스템에서 필수적인 단백질 요소를 의미하고, CRISPR RNA(crRNA) 및 트랜스-활성화 crRNA (trans-activating crRNA, tracrRNA)로 불리는 두 RNA와 복합체를 형성할 때, 활성 엔도뉴클레아제 또는 니카아제(nickase)를 형성한다.
본 명세서에서 용어 "프로모터"는, RNA 중합효소에 대한 결합 부위를 포함하고 프로모터 다운스트림(downstream) 유전자의 mRNA로의 전사 개시 활성을 가지는, 암호화 영역의 상위(upstream)의 비해독된 핵산 서열을 말한다.
본 명세서에서 용어 "벡터"는, 목적하는 DNA 단편을 숙주균 등에 도입시켜 주고 증식할 수 있는 DNA로서, 클로닝 운반체(cloning vehicle)라고도 하는데, 벡터(vector) DNA는 제한효소 등으로 절단하여 개환하고 여기에 목적으로 하는 DNA 단편을 삽입하여 연결하고 숙주균에 도입시킨다. 목적 DNA 단편을 연결한 벡터 DNA는 숙주균이 증식됨에 따라 복제하여 균의 분열과 더불어 각 낭세포로 분배되어 목적 DNA 단편을 대대로 유지하여 이어져 나가며, 플라스미드 (plasmid), 파지 염색체를 주로 사용한다.
본 명세서에서 용어 "재조합 벡터"는, CRISPR/Cas9 시스템을 사용하여 특정 유전자 부위에 염기서열 이중나선 결손을 유도하여 유전자 편집을 실시하고, 적절한 숙주 세포에서 효율적으로 타겟 유전자를 변형시키는 벡터로서 사용될 수 있다. 숙주 세포는 바람직하게는 진핵세포일 수 있으며, 숙주세포의 종류에 따라 프로모터(promoter), 종결자(terminator), 인핸서(enhancer) 등과 같은 발현 조절 서열, 막 표적화 또는 분비를 위한 서열 등을 적절히 선택하고 목적에 따라 다양하게 조합할 수 있다.
본 명세서에서 용어 “gRNA(guide RNA)”는, RNA를 편집할 때 수식반응의 주형이 되는 염기순서정보를 갖는 45~70 뉴클레오티드가량의 작은 RNA를 지칭하는데, gRNA의 5′ 측 영역은 RNA 편집되는 mRNA의 일부와 상보적 순서로 되어 있고, 이 영역을 매개로 하여 mRNA에 결합되며, 3′ 측 영역에는 편집 후의 최종적 mRNA의 순서에 상보적 염기순서가 존재하고, 그 순서정보에 따라 우리딘(uridine) 염기의 삽입이나 결실이라는 RNA수식반응이 일어난다.
본 명세서에서 용어 "세포주"는 세포를 분리해서 순수 배양하여 계대배양해 나갈때 세포계의 각 개체를 말하며, 이때 세포주는 유전적 형질에 의해 다른 세포주와 구별될 수 있으며, 계대배양에도 원 세포의 형질이 유지되는 것을 말한다.
본 명세서에서 용어 "형질전환"은 외부로부터 주어진 DNA에 의하여 생물의 유전적인 성질이 변하는 것으로, 즉 생물의 어떤 계통의 세포에서 추출된 핵산의 일종인 DNA를 다른 계통의 살아있는 세포의 주었을 때 DNA가 그 세포에 들어가서 유전형질이 변화하는 현상으로 형질변환, 형전환 또는 형변환 등이라고도 한다. 즉, "형질전환"이란 유전자를 숙주세포 내에 도입하여 숙주세포 내에서 발현시킬 수 있도록 하는 것을 의미한다.
본 발명은 제1 프로모터 및 이와 작동가능하게 연결된 chNHE1(chicken Na+/H+ exchange 1)의 gRNA(guide RNA); 및 제2 프로모터 및 이와 작동가능하게 연결된 Cas9(CRISPR associated protein 9)을 암호화하는 유전자를 포함하는 ALV-J(Avian Leukosis Virus-J, 닭 백혈병 바이러스 하위그룹 J) 저항성 조류모델 제작용 재조합 벡터를 제공한다.
본 발명에 있어서, 상기 “chNHE1(chicken Na+/H+ exchange 1)”은 닭 백혈병 바이러스 ALV-J가 특이적으로 결합하는 수용체로, 본 발명자들은 CRISPR/Cas9 시스템을 이용한 숙주에서의 상기 수용체의 변이를 통해 조류에서 ALV-J 바이러스 저항성을 유도할 수 있음을 확인하였다. 본 발명의 일 실시예에서는, CRISPR/Cas9 시스템을 이용하여 chNHE1 유전자의 38번째 트립토판 잔기(Trp38, 또는 W38)에 변형을 유도하기 위하여 네오마이신 저항성 유전자를 포함하는 NHE1#3-Neo(N3N) 및 NHE1#4-Neo(N4N); 퓨로마이신 저항성 유전자를 포함하는 NHE1#3-Puro(N3P) 및 NHE1#4-Puro(N4P)의 CRISPR/Cas9 벡터를 제작하였다.
한편, 야생형 chNHE1 유전자(wild-type chNHE1)의 서열은 다음과 같다: GCCCGCTGCTGCCCGGCCAGCGCTTGCAGGCCGACGCCACGCGTGTCTCCGAGCCCACCTGGGAGCAGCCGTGGGGAGAGCCCGGGGGTATCACCGCCGCCCCGCTGGCCACGGCCCAGGAGGTGCACCCGCTGAACAAACAGCACCACAACCACTC (서열번호 5)
본 발명에 있어서, 상기 제1 프로모터는 gRNA의 발현을 개시할 수 있는 프로모터라면 제한 없이 사용할 수 있으며, 당업자에게 자명한 공지의 모든 프로모터를 사용할 수 있으나, 바람직하게는 CMV(cytomegalovirus), CAG(chicken beta-actin), CBh(hybrid form of the chicken beta-actin), U6 등의 유비쿼터스(ubiquitous) 프로모터 또는 조직 특이적 프로모터를 목적에 따라 사용할 수 있고, 보다 바람직하게는 인간 U6 프로모터(human U6 promoter)를 사용할 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 chNHE1(chicken Na+/H+ exchange 1)의 gRNA(guide RNA)는 서열번호 1 또는 서열번호 2로 표시되는 것일 수 있다.
상기 서열번호 00 또는 00으로 표시되는 염기서열의 변이체 또한 본 발명의 범위 내에 포함된다. 본 발명은 상기 염기서열의 등가물, 예를 들어, 일부 염기서열이 결실(deletion), 치환(substitution) 또는 삽입(insertion)에 의해 변형되었지만, chNHE1(chicken Na+/H+ exchange 1) gRNA(guide RNA)와 기능적으로 동일한 작용을 할 수 있는 변이체(variants)를 포함하는 개념이다. 구체적으로, chNHE1(chicken Na+/H+ exchange 1) gRNA(guide RNA)는 각 서열번호 00 또는 00의 염기 서열과 각각 70% 이상, 더욱 바람직하게는 80% 이상, 더더욱 바람직하게는 90% 이상, 가장 바람직하게는 95% 이상의 서열 상동성을 가지는 염기 서열을 포함할 수 있다. 폴리뉴클레오티드에 대한 "서열 상동성의 %"는 두 개의 최적으로 배열된 서열과 비교 영역을 비교함으로써 확인되며, 비교 영역에서의 폴리뉴클레오티드 서열의 일부는 두 서열의 최적 배열에 대한 참고 서열(추가 또는 삭제를 포함하지 않음)에 비해 추가 또는 삭제(즉, 갭)를 포함할 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 제2 프로모터는 바람직하게는 CMV(cytomegalovirus), CAG(chicken beta-actin), CBh(hybrid form of the chicken beta-actin), U6 등의 유비쿼터스(ubiquitous) 프로모터 또는 조직 특이적 프로모터를 목적에 따라 사용할 수 있고, 보다 바람직하게는 닭 베타-액틴 프로모터(chicken beta-actin short promoter)일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명에 있어서, 상기 재조합 벡터는 도 1(좌측)에 기재된 개열 지도를 갖는 것으로, 본 발명의 chNHE1 유전자 변형을 달성할 수 있는 벡터의 구성이라면 이에 제한되지 않는다.
또한, 본 발명은 본 발명에 따른 재조합 벡터 및 ssODN(single-stranded oligodeoxynucleotide, 단일 가닥 올리고데옥시뉴클레오티드)을 포함하는 것을 특징으로 하는 유전체 교정용 조성물을 제공한다. 본 발명의 일 실시예에서는 CRISPR/Cas9 시스템을 사용함과 동시에, DNA를 보다 효율적으로 변형시키기 위해 단일가닥 올리고데옥시뉴클레오티드(single-stranded oligodeoxynucleotide, ssODN)를 CRISPR/Cas9 벡터와 함께 도입하여 보다 높은 효율로 정확하게 ALV-J에 저항성을 가진 조류모델을 제조할 수 있음을 확인하였다.
본 명세서에서 용어 “ssODN(single-stranded oligodeoxynucleotide, 단일 가닥 올리고데옥시뉴클레오티드)”는 한가닥의 DNA로 구성되어 있고, 비정상 염기(base)를 정상 염기로 교체하기 위하여 정상 유전자의 공여자(donor)로 사용된다.
본 발명에 있어서, 상기 ssODN은 chNHE1 유전자에 상보적으로 결합하며 서열번호 12의 염기서열로 표시되는 것일 수 있으나 이에 제한되는 것은 아니다. 또한, 상기 ssODN은 chNHE1 유전자에서 Trp38 결실 및 BsaI 제한효소 부위를 생성하기 위한 T96G 치환을 유도하는 것을 특징으로 할 수 있다. 본 발명의 일 실시예에서는 서열번호 00의 염기서열로 표시되며 chNHE1 유전자에 상보적으로 결합하여 chNHE1 유전자에서 Trp38 결실 및 BsaI 제한효소 부위를 생성하는 ssODN과 CRISPR/Cas9 재조합 벡터를 결합하여 세포를 형질전환하고, Trp38 결실 및 T96G 치환이 유도된 DF-1 세포의 단일 클론(single clone)을 확립하였다.
본 명세서에서 용어 “유전체 교정(genome editing)”은, 특별한 언급이 없는 한, 표적 유전자의 표적 부위에서의 절단에 의한 핵산 분자(하나 이상, 예컨대 1-100,000bp, 1-10,000bp, 1-1000bp, 1-100bp, 1-70bp, 1-50bp, 1-30bp, 1-20bp 또는 1-10bp)의 결실, 삽입, 치환 등에 의하여 유전자 기능을 상실, 변경, 및/또는 회복(수정) 시키는 것을 의미하기 위하여 사용될 수 있다.
또한, 본 발명은 본 발명에 따른 재조합 벡터 또는 유전체 교정용 조성물이 도입된 ALV-J 저항성 조류모델 제작용 형질전환 세포주를 제공한다.
본 발명에 있어서 상기 세포주는 난모세포주, 섬유아세포주 또는 신장세포주일 수 있으며, 바람직하게는 섬유아세포주를 이용할 수 있으나, 이에 본 발명이 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 재조합 벡터를 세포주에 도입하여 형질전환하는 방법은 본 발명의 재조합 벡터를 당업계에 공지된 방법, 예를 들어 이에 한정되지는 않으나, 일시적인 형질감염(transient transfection), 미세주사, 형질도입(transduction), 세포 융합, 칼슘 포스페이트 침전법, 리포좀 매개된 형질감염(liposem-mediated transfection), DEAE 덱스트란-매개된 형질감염(DEAE Dextran-mediated transfection), 폴리브렌-매개된 형질 감염(polybrene-mediated transfection), 전기 침공법(electroporation) 등의 공지 방법으로 진핵세포에 도입하여 형질전환시킬 수 있으며, 바람직하게는 미세주사 방법을 이용하여 형질전환시킬 수 있다.
상기 형질전환된 세포의 선별은 당업계에서 공지된 유전자 교정 여부를 확인하는 방법으로 선별할 수 있다. 본 발명의 일 실시예에서는 G418, 네오마이신 및 퓨로마이신과 같은 항생제 내성 유전자를 사용하여 형질전환된 DF-1 세포를 선별하고 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명에서는 상기 형질전환된 DF-1 세포의 바람직한 실시예의 하나로서, G418을 이용하여 chNHE1 유전자 변형이 확인된 DF-1 세포 선별 후, NHE1#3-Neo(N3N), NHE1#3-Puro(N3P) 또는 NHE1#4-Puro(N4P) 벡터로 형질감염된 DF-1 섬유아세포로부터 다양한 indel 변형을 갖는 클론을 확립하였다. 또한, Trp38 결실에 따른 보다 정확한 효과를 확인하기 위하여 NHE1#3-Puro(N3P) 또는 NHE1#4-Puro(N4P)와 함께 ssODN을 함께 처리한 후 퓨로마이신을 이용하여 형질전환이 이루어진 DF-1 세포 선별 후, Trp38 결실 및 T96G 치환이 유도된 단일 클론을 확립하였다.
특히, Trp38 결실과 함께 T96G 치환을 포함하는 N3Pss#12의 경우, CRISPR/Cas9 벡터 및 ssODN으로 형질전환됨에 따라 chNHE1 유전자에서 Trp38을 정확히 타겟팅한 유전자 편집이 이루어짐을 확인하였다. 상기의 특징을 가지는 형질전환 세포주를 2018년 4월 25일 한국세포주연구재단 (KCLRF, Korean Cell Line Research Foundation)에 수탁번호 KCLRF-BP-00433로 기탁하였다.
본 발명에 있어서, 본 발명에 따른 재조합 벡터 또는 유전체 교정용 조성물이 도입되는 상기 형질전환 세포주는 공여체 조류의 원시생식세포(primordial germ cells, PGCs)인 것을 특징으로 할 수 있다.
상기 재조합 벡터 또는 유전체 교정용 조성물은 당업계에 공지된 다양한 방법에 따라 조류 원시생식세포에 도입될 수 있다. 예를 들어, 원시생식세포로의 유전자 전달은 전기천공법(electroporation), 리포좀-매개 전달방법 및 레트로바이러스-매개 전달방법 등을 참고하여 실시할 수 있다.
본 발명에서 이용될 수 있는 원시생식세포는 다양한 소스로부터 얻을 수 있으나, 가장 바람직하게는 조류의 배아의 생식기(embryonic gonad)로부터 분리된 것이다. 원시생식세포의 소스로서 배아를 이용하는 경우, 본 발명에서 이용되는 공여체 배아는 다양한 단계에 진입한 것이 이용될 수 있으며, 1-10일령 배아가 이용될 수 있고, 바람직하게는 배 발달 스테이지 약 24-36 (약 4 일령-8 일령), 가장 바람직하게는 배 발달 스테이지 배 발달 스테이지 약 28 (약 5.5 일령)의 배아가 이용될 수 있다. 원시생식기로부터 원시생식세포를 수득하는 방법은 다양하게 실시될 수 있으며, 본 발명자들의 특허 제 0305715 호 및 특허 제 0267633 호에 개시된 것을 참고할 수 있다. 예컨대, 난황이 제거된 배아로부터 원시생식기를 회수하고, 원시생식기에 단백질분해효소 (예: 트립신)를 처리하여, 원시생식기 세포를 분리한다. 이러한 원시생식기 세포는 다양한 세포종의 군집으로서, 원시생식세포 이외에 기저세포 (stroma cells) 등이 포함되어 있다. 본 명세서에서 용어 “원시생식기 세포 (gonadal cells)” 는 원시생식기에 존재하는 모든 세포 종의 군집을 의미하며, 용어 “원시생식기-유래 원시생식세포 (gonadal primordial germ cells)” 는 후에 생식세포가 되는 원시생식기 세포의 일종을 나타내며, 약어 “gPGCs” 또는 “PGC"로 나타낼 수 있다.
유전자가 편집된 원시생식세포는 수용체 배아에 주입된다. 원시생식세포를 수용체 배아에 주입하는 방법은 다양한 방법에 따라 실시될 수 있으며, 바람직하게는 배아의 대동맥에 주입하여 실시된다. 예를 들어, 적합한 개수의 원시생식세포를 포함하는 세포 현탁액을 배아의 등쪽 대동맥에 미세바늘로 주입하고, 배아를 포함하는 난을 밀봉한 다음 적절한 시간 동안 배양하여 실시된다. 그런 다음, 상기 수용체 배아를 포함하는 난을 배양 및 부화하고, 성성숙에 이른 수용체를 검정교배를 통해 유전자 편집된 조류를 생산한다. 유전자 편집 조류의 확인은 예를 들어, 유전자 편집 조류의 깃털수질(feather pulp) 또는 혈액으로부터 얻은 유전체 DNA를 주형으로 이용하여 PCR(polymerase-chain reaction), 실시간 PCR 방법 또는 염기서열분석법으로 서열이 편집되어 있는 지 여부를 검사하여 실시할 수 있다.
본원에 따른 방법은 상기 방법에 의해 생산된 유전자 변형체를 검정교배하여, 동형접합 유전자 변형체 선별하는 단계를 추가로 포함할 수 있다.
또한, 본원에 따른 방법은 유전자 변형이 발생한 원시생식세포의 선별을 위해, 형광 단백질을 코딩하는 핵산을 조류 원시생식세포에 도입하는 단계를 추가로 포함할 수 있다. 형광 단백질은 조류의 세포에서 발현될 수 있는 한 특별히 제한되는 것은 아니며, 예를 들면 Green Fluorescent Protein (GFP)를 들 수 있다. 이러한 단백질은 조류에서 작용하는 벡터에 도입되어, PGC에 함께 도입될 수 있으며, 도입 후에 형광단백질을 발현하는 세포를 FACS와 같은 방법으로 선별한 후, 이러한 세포만을 수용체의 배아에 도입하여, 형질전환 조류의 생산 효율을 높일 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 공여체 조류는 닭, 메추라기, 칠면조, 오리, 거위, 꿩 및 비둘기를 포함하며, 바람직하게는 닭인 것을 특징으로 할 수 있다.
또한, 본 발명에 있어서, 상기 형질전환 세포주는 수탁번호가 KCLRF-BP-00432임을 특징으로 할 수 있다.
본 발명의 일 실시예에서는, 본 발명에 따른 CRISPR/Cas9 재조합 벡터로 형질감염시킨 PGC(NHE1#3 PGC)에서 chNHE1 유전자의 Trp38 위치를 정확히 타겟팅한 유전자 편집이 이루어짐을 확인하였다. 상기의 특징을 가지는 형질전환 세포주를 2018년 4월 25일 한국세포주연구재단 (KCLRF, Korean Cell Line Research Foundation)에 수탁번호 KCLRF-BP-00432로 기탁하였다.
또한, 본 발명은 본 발명에 따른 재조합 벡터 또는 유전체 교정용 조성물을 제조하는 단계; 및 상기 재조합 벡터 또는 유전체 교정용 조성물을 조류 체세포에 도입하는 단계;를 포함하는 ALV-J 저항성 조류모델 제작용 형질전환 세포주의 제조방법을 제공한다.
또한, 본 발명은 본 발명에 따른 형질전환 세포주를 수용체 조류의 배아에 이식하는 단계; 를 포함하는 ALV-J 저항성 조류모델의 제조방법을 제공한다. 상기 형질전환 세포주는 공여체 조류의 원시생식세포(primordial germ cells, PGCs)인 것을 특징으로 한다.
본 발명에 따른 형질전환 세포주는 바이러스 감염 실험 결과 매우 낮은 GFP 발현을 나타내어 ALV-J에 대한 저항성을 획득할 수 있으므로, 닭 백혈병 바이러스(Avian Leukosis Virus-J, ALV-J)에 저항성을 가진 조류 생산에 유용하게 이용될 수 있다.
이하, 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명한다. 단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐 본 발명의 내용이 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다. 본 발명의 실시예는 당업계에서 평균적인 지식을 가진 자에게 본 발명을 보다 완전하게 설명하기 위해 제공되는 것이다.
실시예 1. CRISPR / Cas9 시스템을 통한 chNHE1 타겟 재조합 벡터 제조
chNHE1(chicken Na+/H+ exchange 1) 유전자의 38번째 트립토판 잔기에 변형을 유도하기 위하여 네오마이신 저항성 유전자를 포함하는 2개의 CRISPR/Cas9 벡터 NHE1#3-Neo(N3N) 및 NHE1#4-Neo(N4N); 퓨로마이신 저항성 유전자를 포함하는 2개의 CRISPR/Cas9 벡터 NHE1#3-Puro(N3P) 및 NHE1#4-Puro(N4P)를 제작하였다. 상기 재조합 벡터의 개열지도를 도 1에 나타내었다.
구체적으로, chNHE1 수용체를 타겟으로 하기 위한 재조합 벡터를 제조하기 위해 네오마이신 저항성 유전자 및 퓨로마이신 저항성 유전자를 NotI 제한효소(New England Biolabs, Ipswich, MA, USA)를 이용하여 CRISPR/Cas9 벡터에 도입하였다. 또한, guide RNA를 CRISPR/Cas9 벡터에 도입하기 위해 센스 및 안티센스 올리고뉴클레오티드(Bionics, Seoul, Korea)를 합성하여 95℃에서 30초, 72℃에서 2분, 37℃에서 2분 및 25℃에서 2분 조건으로 어닐링하였다. chNHE1 gRNA 2개 (각각 서열번호 1, 서열번호 2), 사용한 모든 프라이머 및 올리고뉴클레오티드의 서열을 표 1 및 표 2에 각각 나타내었다. CBh 프로모터는 Addgene(Cambridge, MA)에서 구매한 pX330A 플라스미드에 존재하는 염기서열을 사용하였고, 본 발명에 사용한 chNHE1 gRNA는 닭의 chNHE1 유전자 내 Trp38 부분(W38)을 효과적으로 타겟팅하기 위하여 임의로 제작하였다.
이름 서열 (5'-3') 서열번호
NHE1#3 CTCTCCCCACGGCTGCTCCC 1
NHE1#4 GCGTGTCTCCGAGCCCACCT 2
U6-NHE1 #3-gRNA scaffold GAGGGCCTATTTCCCATGATTCCTTCATATTTGCATATACGATACAAGGCTGTTAGAGAGATAATTGGAATTAATTTGACTGTAAACACAAAGATATTAGTACAAAATACGTGACGTAGAAAGTAATAATTTCTTGGGTAGTTTGCAGTTTTAAAATTATGTTTTAAAATGGACTATCATATGCTTACCGTAACTTGAAAGTATTTCGATTTCTTGGCTTTATATATCTTGTGGAAAGGACGAAACACCGCTCTCCCCACGGCTGCTCCC GTTTTAGAGCTAGAAATAGCAAGTTAAAATAAGGCTAGTCCGTTATCAACTTGAAAAAGTGGCACCGAGTCGGTGC 3
U6-NHE1 #4-gRNA scaffold GAGGGCCTATTTCCCATGATTCCTTCATATTTGCATATACGATACAAGGCTGTTAGAGAGATAATTGGAATTAATTTGACTGTAAACACAAAGATATTAGTACAAAATACGTGACGTAGAAAGTAATAATTTCTTGGGTAGTTTGCAGTTTTAAAATTATGTTTTAAAATGGACTATCATATGCTTACCGTAACTTGAAAGTATTTCGATTTCTTGGCTTTATATATCTTGTGGAAAGGACGAAACACCGGCGTGTCTCCGAGCCCACCT GTTTTAGAGCTAGAAATAGCAAGTTAAAATAAGGCTAGTCCGTTATCAACTTGAAAAAGTGGCACCGAGTCGGTGC 4
밑줄은 인간 U6 프로모터를 의미한다. 볼드체로 표시된 염기는 NHE1#3 또는 NHE1#4를 나타내고,
이탤릭체로 표시된 염기는 gRNA 스캐폴드(scaffold) 부분을 의미한다.
Primers 서열 (5'-3') 서열번호
chNHE1 #3 F CAC CGC TCT CCC CAC GGC TGC TCC C 6
chNHE1 #3 R AAA CGG GAG CAG CCG TGG GGA GAG C 7
chNHE1 #4 F CAC CGG CGT GTC TCC GAG CCC ACC T 8
chNHE1 #4 R AAA CAG GTG GGC TCG GAG ACA CGC C 9
chNHE1 seq F GCA CCT CAC GCC TGT GCA AC 10
chNHE1 seq R GGG ATG CGG ACG TGC GAG TA 11
ssODN(154mer) GCCCGCTGCTGCCCGGCCAGCGCTTGCAGGCCGACGCCAC
GCG G GTCTCCGAGCCCACC(TGG)GAGCAGCCGTGGGGAGA
GCCCGGGGGTATCACCGCCGCCCCGCTGGCCACGGCCCAG
GAGGTGCACCCGCTGAACAAACAGCACCACAACCACTC		 12
굵은 이탤릭체로 표시된 염기는 BsaI 제한효소 부위(밑줄 부분)를 생성하는 T96G 치환을 의미한다. 음영표시된 괄호 안의 TGG는 ssODN에서 삭제된 38번째 트립토판(Trp38)을 코딩하는 뉴클레오티드를 의미한다.
실시예 2. 재조합 벡터를 이용한 섬유아세포의 형질전환
상기 실시예 1에서 제조한 CRISPR/Cas9 재조합 벡터(3 ㎍)를 Opti-MEM(Thermo Fisher-Invitrogen)에서 Lipofectamine 2000 시약(Thermo Fisher-Invitrogen)과 혼합하고, 상기 혼합물을 5 x 105 개의 DF-1 세포에 도입하여 형질전환 시켰다. 이때 사용한 섬유아세포 DF-1은 60-70%의 상대습도, 5% 이산화탄소 및 37℃ 조건에서 10% 소태아혈청(FBS; Hyclone) 및 1x 안티바이오틱-안티마이코틱(ABAM; Thermo Fisher-Invitrogen, Carlsbad, CA, USA)이 첨가된 DMEM(Hyclone, Logan, UT, USA) 배지 내에서 유지하였다. 형질전환 6시간 후, 형질전환 혼합물을 DF-1 배양 배지로 교환하였다. 형질전환을 수행하고 1일 경과 후, G418(300 ㎍/ml) 및 퓨로마이신(1 ㎍/ml)을 배지에 첨가하였다. G418 및 퓨로마이신을 이용한 선별 과정은 7일까지 소요되었다.
실시예 3. chNHE1 유전자의 Trp38 indel 유도 및 녹아웃 확인
상기 실시예 2에서 생산한 형질전환 섬유아세포에서 chNHE1 유전자의 Trp38 위치에 indel이 정상적으로 유도되었는지 여부를 확인하기 위하여 T7 엔도뉴클라아제 1(T7E1) 분석을 수행하였다. 구체적으로 이형접합(heteroduplex) DNA 구조를 형성하기 위하여 상기 PCR 산물을 변성 이후 리어닐링하였고, 그 후 리어닐링한 산물을 37℃에서 20분 동안 T7E1(New England Biolabs) 효소로 분해하였다. T7E1으로 분해된 산물은 1% 아가로스 겔을 사용하여 전기영동시키고, 이후 이를 Gel Doc gel imaging system(Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA, USA)를 사용하여 정량화하였다. chNHE1 유전자의 구조 및 NHE1#3, NHE1#4 CRISPR/Cas9 벡터의 인식 부위를 도 2의 A에 나타내었으며, 상기 T7E1 분석 결과를 도 2의 B에 나타내었다.
도 2의 B에 나타낸 바와 같이, G418(왼쪽) 또는 퓨로마이신(오른쪽)으로 선별하기 전 세포에 비해 선별된 세포에서 타겟 위치의 indel 변형 비율이 높음을 확인하였다. 구체적으로, indel 유도 효율은 N3N, N4N, N3P 및 N4P에서 각각 18.0%, 19.1%, 23.9% 및 34.0%으로 나타남을 확인하였다.
추가적으로 chNHE1 유전자의 Trp38 위치에 녹아웃이 정상적으로 발생하였는지 여부를 확인하기 위하여 PCR을 수행하였다. 먼저, 형질전환 세포의 유전체 DNA는 G418을 이용한 세포 선별 후 DF-1에서 추출하였다. CRISPR/Cas9 타겟 부위를 포함하는 유전자 부위는 상기 표 2에 나타낸 프라이머 세트를 이용하여 증폭하였다. PCR은 총 20㎕의 100ng의 유전체 DNA에 대하여 10x PCR 버퍼(BioFACT, Daejeon, Korea), 0.4㎕ dNTPs(각각 10mM), 각 프라이머 10pmol 및 0.5 U Taq 폴리머레이즈(BioFACT)를 사용하여 다음과 같은 조건으로 수행하였다: 5분 동안 94℃에서 1차 변성을 1회 반복하였고, 후에 20초 동안 94℃에서 변성, 40초 동안 61℃에서 어닐링(annealing) 및 120초 동안 72℃에서 연장하는 단계를 35회 반복하였으며, 마지막으로 10분 동안 72℃에서 후-연장을 1회 반복하였다. 그 결과를 도 2의 C에 나타내었다.
도 2의 C에 나타낸 바와 같이, CRISPR/Cas9 재조합 벡터가 도입된 DF-1 섬유아세포의 chNHE1 유전자에서 삽입, 치환 또는 결실을 포함하는 변형이 발생하였음을 확인하였다.
실시예 4. chNHE1 유전자 변형이 확인된 세포주의 클론 확립
상기 실시예 3에서 확인한 CRISPR/Cas9 재조합 벡터가 도입된 DF-1 섬유아세포로부터 DF-1 클론을 확립하였다. 이 과정에서, 타겟 위치에서 다양한 indel 변형을 갖는 수개의 클론을 확립하였다.
구체적으로, G418를 이용하여 유전자 변형이 확인된 세포 선별 후, CRISPR 벡터가 도입된 DF-1 세포들을 100μL의 DF-1 배양 배지가 들어있는 96-웰 플레이트에 분주하였다. 분주된 세포들이 각 웰에 충분히 부착(confluency)되었을 때, 세포들을 48-웰 플레이트에 계대배양 하고 유전체 DNA 추출에 사용하였다. CRISPR/Cas9 타겟 부위를 포함하는 유전자 부위를 상기 표 2에 나타낸 프라이머 세트를 이용하여 증폭시키고, ABI Prism 3730 XL DNA Analyzer (Thermo Fisher-Applied Biosystems, Foster City, CA, USA)를 사용하여 PCR 산물의 염기서열을 분석하였다.
그 결과, N3N으로 형질감염된 DF-1 섬유아세포에서 총 26개의 클론을 확립하였고, 시퀀싱 분석 결과 14개의 클론에서 indel 변형을 확인하였다. 동일한 방법으로 N3P로 형질감염된 실험군에서 총 18개의 클론을 확립하였고, 이 중 6개의 클론에서 indel 변형을 확인하였다. N4P로 형질감염된 DF-1 섬유아세포에서는 총 22개의 클론을 확립하였고, 이 중 16개의 클론에서 변형을 확인하였다. Indel 변형이 유도된 DF-1 클론의 서열분석 결과를 하기 표 3에 나타내었다. 하기 표 3에 나타낸 바와 같이, 닭 DF-1 섬유아세포에서 indel 변형을 유도함에 있어서 CRISPR/Cas9 시스템이 효과적인 도구임을 확인하였다.
ID 서열 (5'-3') Indel
WT TTGCAGGCCGACGCCACGCGTGTCTCCGAGCCCACCTGG
GAGCAGCCGTGGGGAGAGCCCGGGGGTATCACCGCC (서열번호 13)		 WT
N3N#1 TTGCAGGCCGACGCCACGCGTGTCTCCGAGCCCACCTGG
GAGCAGCCGTGGGGAGAGCCCGGGGGTATCACCGCC		 -1 bp
N3N#8 TTGCAGGCCGACGCCACGCGTGTCTCCGAGCCCACCTGG
GAGCAGCCGTGGGGAGAGCCCGGGGGTATCACCGCC		 -16 bp
N3N#10 TTGCAGGCCGACGCCACGCGTGTCTCCGAGCCCACCTGG
GAGCAGCCGTGGGGAGAGCCCGGGGGTATCACCGCC		 -23 bp
N3N#12 TTGCAGGCCGACGCCACGCGTGTCTCCGAGCCCACCTGG
GAGCAGCCGTGGGGAGAGCCCGGGGGTATCACCGCC		 -3 bp
N3N#13 TTGCAGGCCGACGCCACGCGTGTCTCCGAGCCCACCTGG
GAGCAGCCGTGGGGAGAGCCCGGGGGTATCACCGCC		 -3 bp
N3N#16 TTGCAGGCCGACGCCACGCGTGTCTCCGAGCCCACCTGG
GaAGCAGCCGTGGGGAGAGCCCGGGGGTATCACCGCC		 +1 bp
N3N#18 TTGCAGGCCGACGCCACGCGTGTCTCCGAGCCCACCTGG
GaAGCAGCCGTGGGGAGAGCCCGGGGGTATCACCGCC		 +1 bp
N3N#19 TTGCAGGCCGACGCCACGCGTGTCTCCGAGCCCACCTG G
GAGCAGCCGTGGGGAGAGCCCGGGGGTATCACCGCC		 -1 bp
N3N#20 TTGCAGGCCGACGCCACGCGTGTCTCCGAGCCCACCTGG
GAGCAGCCGTGGGGAGAGCCCGGGGGTATCACCGCC		 -2 bp
N3N#21 TTGCAGGCCGACGCCACGCGTGTCTCCGAGCCCA A CTGG
GAGCAGCCGTGGGGAGAGCCCGGGGGTATCACCGCC		 1-bp modification, -4 bp
N3N#22 TTGCAGGCCGACGCCACGCGTGTCTCCGAGCCCACCTG G
GAGCAGCCGTGGGGAGAGCCCGGGGGTATCACCGCC		 -11 bp
N3N#27 TTGCAGGCCGACGCCACGCGTGTCTCCGAGCCCACCTGG
GAGCAGCCGTGGGGAGAGCCCGGGGGTATCACCGCC		 -46 bp
N3N#29 TTGCAGGCCGACGCCACGCGTGTCTCCGAGCCCACCTG G
GAGCAGCCGTGGGGAGAGCCCGGGGGTATCACCGCC		 -11 bp
N3N#37 TTGCAGGCCGACGCCACGCGTGTCTCCGAGCCCACCTGG
GAGCAGCCGTGGGGAGAGCCCGGGGGTATCACCGCC		 -15 bp
N3P#4 TTGCAGGCCGACGCCACGCGTGTCTCCGAGCCCACCTG G
GAGCAGCCGTGGGGAGAGCCCGGGGGTATCACCGCC		 -2 bp
N3P#6 TTGCAGGCCGACGCCACGCGTGTCTCCGAGCCCACCTGG
GAGCAGCCGTGGGGAGAGCCCGGGGGTATCACCGCC		 -15 bp
N3P#12 TTGCAGGCCGACGCCACGCGTGTCTCCGAGCCCACCTGG
GAGCAGCCGTGGGGAGAGCCCGGGGGTATCACCGCC		 -12 bp
N3P#15 TTGCAGGCCGACGCCACGCGTGTCTCCGAGCCCACCTG G
GAGCAGCCGTGGGGAGAGCCCGGGGGTATCACCGCC		 -11 bp
N3P#16 TTGCAGGCCGACGCCACGCGTGTCTCCGAGCCCACCTG G
GAGCAGCCGTGGGGAGAGCCCGGGGGTATCACCGCC		 -2 bp
N3P#17 TTGCAGGCCGACGCCACGCGTGTCTCCGAGCCCACCTGG
GAGCAGCCGTGGGGAGAGCCCGGGGGTATCACCGCC		 -12 bp
N4P#2 TTGCAGGCCGACGCCACGCGTGTCTCCGAGCCCACCTGG
GAGCAGCCGTGGGGAGAGCCCGGGGGTATCACCGCC		 -12 bp
N4P#4 TTGCAGGCCGACGCCACGCGTGTCTCCGAGCCCACCTGG GAGCAGCCGTGGGGAGAGCCCGGGGGTATCACCGCC -41 bp
N4P#6 TTGCAGGCCGACGCCACGCG A G ATA C A GAGCCCACCTGG
GAGCAGCCGTGGGGAGAGCCCGGGGGTATCACCGCC		 -11 bp, 5-bp modification, -2 bp
N4P#7 TTGCAGGCCGACGCCACGCGTGTCTCCGAGCCCACCTGG
GAGCAGCCGTGGGGAGAGCCCGGGGGTATCACCGCC		 -38 bp
N4P#9 TTGCAGGCCGACGCCACGCGTGTCTCCGAGCCCAaCCTGG
GAGCAGCCGTGGGGAGAGCCCGGGGGTATCACCGCC		 +1 bp
N4P#11 TTGCAGGCCGACGCCACGCGTGTCTCCGAGCCCACCTGG
GAGCAGCCGTGGGGAGAGCCCGGGGGTATCACCGCC		 -3 bp
N4P#12 TTGCAGGCCGACGCCACGCGTGTCTCCGAGCCCACCTGG
GAGCAGCCGTGGGGAGAGCCCGGGGGTATCACCGCC		 -33 bp
N4P#15 TTGCAGGCCGACGCCACGCGTGTCTCCGAGCCCACCTGG
GAGCAGCCGTGGGGAGAGCCCGGGGGTATCACCGCC		 -12 bp
N4P#16 TTGCAGGCCGACGCCACGCGTGTCTCCGAGCCCACCTGG
GAGCAGCCGTGGGGAGAGCCCGGGGGTATCACCGCC		 -12 bp
N4P#20 TTGCAGGCCGACGCCACGCGTGTCTCCGAGCCCACCTGG
GAGCAGCCGTGGGGAGAGCCCGGGGGTATCACCGCC		 -8 bp
N4P#22 TTGCAGGCCGACGCCACGCGTGTCTCCGAGCCCAaCCTGG
GAGCAGCCGTGGGGAGAGCCCGGGGGTATCACCGCC		 +1 bp
N4P#23 TTGCAGGCCGACGCCACGCGTGTCTCCGA A CCCACCTGGG
AGCAGCCGTGGGGAGAGCCCGGGGGTATCACCGCC		 1-bp modification, -3 bp
N4P#26 TTGCAGGCCGACGCCACGCGTGTCACCGAGCtcggtg T CTCC
TGGGAGCAGCCGTGGGGAGAGCCCGGGGGTATCACCGCC		 3-bp modification, +6 bp
N4P#27 TTGCAGGCCGACGCCACGCGTGTCTCCGAGCCCACCTGG
GAGCAGCCGTGGGGAGAGCCCGGGGGTATCACCGCC		 -12 bp
N4P#28 TTGCAGGCCGACGCCACGCGTGTCTCCGAGCCCAaCCTGG
GAGCAGCCGTGGGGAGAGCCCGGGGGTATCACCGCC		 +1 bp
N4P#34 TTGCAGGCCGACGCCACGCGTGTCTCCGAGCCCACCTGG
GAGCAGCCGTGGGGAGAGCCCGGGGGTATCACCGCC		 -28 bp
볼드체로 표시된 염기는 chNHE1 수용체의 Trp38 코딩 부위를 의미한다. 음영표시된 염기는 결실 돌연변이를, 굵은 소문자는 삽입 뉴클레오티드를 의미한다. 굵은 이탤릭체로 표시된 염기는 변형된 돌연변이를 의미한다.
실시예 5. ALV -J 바이러스에 감수성을 보유하는 클론 선별
상기 실시예 4에서 확립한 모든 chNHE1 유전자 변형된 DF-1 클론 중 바이러스 감염 확인 및 유세포 분석(flow cytometry)을 실시할 20개의 클론을 선별하였다. 그 후, 확립된 DF-1 클론의 ALV-J에 대한 감수성을 평가하기 위하여 RCAS-J-EGFP 벡터를 도입하여 chNHE1 유전자를 타겟으로 하는 DF-1 클론에 ALV-J 바이러스를 감염시켰다. 상기 벡터에 ALV-J gag, env 및 pol 유전자와 함께 녹색 형광 단백질(GFP)-발현 카세트를 포함시켜 야생형(wild-type, WT) 세포와 비교하여 GFP가 발현되었는지 여부에 따라 바이러스 감염 여부를 판단하였다. 이와 같은 벡터의 개열지도는 도 1의 우측에 나타내었다.
구체적으로, RCAS-J-EGFP DNA 5 μg을 Opti-MEM(Thermo Fisher-Invitrogen)에서 Lipofectamine 2000 시약(Thermo Fisher-Invitrogen)과 혼합하고, 상기 혼합물을 5 x 105 개의 DF-1 세포에 도입하여 형질전환 시켰다. 형질전환 6시간 후, 형질전환 혼합물을 DF-1 배양 배지로 교환하였다. 형질전환을 수행하고 1일 경과 후, DF-1 세포에서 바이러스 감염을 의미하는 녹색 형광을 검출하였다. 세포를 계대배양하고, 계대 하루 경과시 배양 배지를 교체하였다. 1일 후, 바이러스를 포함하는 배지를 수확(harvest)한 후 사용 전까지 -70℃에서 동결 보관하였다. 이후, 바이러스 감염 수행 시에는 바이러스를 포함하는 배지를 37℃로 녹여 DF-1 클론에 첨가하였다. 4 dpi(days post-infection)에 DF-1 클론을 형광현미경(TU-80; Nikon, Tokyo, Japan) 하에서 관찰하고 FACSCalibur software (BD Biosciences, San Jose, CA, USA)를 사용하여 형광을 분석하였다. 그 결과를 도 3에 나타내었다.
도 3의 A는 DF-1 세포의 GFP 발현을 나타낸 것으로, 총 20개의 DF-1 클론을 형광현미경으로 관찰한 결과를 나타내었다(Scale bar = 200μm). 도 3의 A에 나타낸 바와 같이, N3P#12는 야생형(WT) DF-1과 유사한 정도의 강한 GFP 발현을 보였으며, N3N#13, N4P#11 및 N4P#23은 중등도의 GFP 발현을 나타냄을 확인하였다. 이를 제외한 나머지 16개의 클론은 매우 낮은 GFP 발현을 나타내었다.
도 3의 B에 chNHE1 조기 종결 코돈(premature stop codon)을 가진 바이러스 감염된 DF-1 클론, C에는 chNHE1 조기 종결 코돈이 없고, Trp38의 결실이 있거나/없는 바이러스 감염된 DF-1 클론의 유세포 분석 결과를 나타내었다(각 막대는 모든 실험을 3회 반복으로 행한 표준편차를 의미). 도 3의 B에 나타낸 바와 같이, chNHE1 수용체 상에 조기 종결 코돈을 가진 DF-1 클론들(N3N#1, N3N#8, N3N#10, N3N#18, N3N#19, N3N#20, N3N#21, N3N#22 및 N3N#27)은 GFP 발현이 거의 없었으며, 이를 통해 ALV-J에 대한 절대적인 저항성을 획득하였음을 확인하였다. 또한, 도 3의 C에 나타낸 바와 같이, 인공적으로 생성된 조기 종결 코돈이 없고, indel 변형이 유도된 DF-1 클론들은 다양한 ALV-J 바이러스 감수성을 나타냄을 확인하였다. 구체적으로, Trp38 결실이 있고, indel 변형이 유도된 DF-1 클론들(N3N#37, N4P#2, N4P#12, N4P#15, N4P#16 및 N4P#27)은 Trp38 결실이 없고, indel 변형이 유도된 DF-1 클론들(N3N#13, N3P#12, N4P#11 및 N4P#23)보다 GFP 발현이 현저히 낮게 나타남을 확인하였다.
실시예 6. 보다 정확한 유전자 편집을 위한 ssODN의 도입
Trp38 결실에 따른 보다 정확한 효과를 확인하기 위하여, CRISPR/Cas9 벡터와 함께 Trp38 결실 및 BsaI 제한효소 부위를 생성하기 위한 T96G 치환을 포함하는 ssODN을 도입하여 chNHE1 유전자의 상동 재조합을 수행하였다. 이를 통해 CRISPR/Cas9 벡터와 ssODN을 결합하여 세포를 형질전환시키고, Trp38 결실을 가지는 chNHE1 대립유전자를 얻을 수 있을 것으로 예상하였으며, ssODN을 주형으로 이용한 상동 재조합을 도 4의 A에 도식화하였다.
구체적으로, 상동 재조합(homologous recombination)을 위하여 단일가닥 올리고데옥시뉴클레오티드(single-stranded oligodeoxynucleotide, ssODN) 2nmol을 3μg의 CRISPR/Cas9 퓨로마이신 벡터와 함께 사용하였다. 사용한 ssODN의 염기서열은 상기 표 2에 나타내었다. 상기 실시예 2에서 수행한 방법과 동일하게, 형질전환 6시간 후 형질전환 혼합물을 DF-1 배양 배지로 교환하였다. 형질전환을 수행하고 1일 경과 후, 퓨로마이신(1 ㎍/ml)을 배지에 첨가하였다. 퓨로마이신을 이용한 선별이 완료된 후, N3Pss(NHE1#3-Puro + ssODN) 처리된 DF-1 세포들을 선택 및 증식시켰다.
또한, chNHE1의 타겟 대립유전자(allele)를 확인하기 위하여, N3Pss(NHE1#3-Puro + SSODN) 또는 N4Pss(NHE1#4-Puro + SSODN) 처리한 DF-1 세포 및 N3Pss 단일 클론의 유전체 DNA를 분석하였다. CRISPR/Cas9 타겟 부위를 포함하는 유전자 부위는 상기 표 2에 나타낸 프라이머 세트를 이용하여 증폭하였다. PCR은 총 20㎕의 100ng의 유전체 DNA에 대하여 10x PCR 버퍼(BioFACT, Daejeon, Korea), 0.4㎕ dNTPs(각각 10mM), 각 프라이머 10pmol 및 0.5 U Taq 폴리머레이즈(BioFACT)를 사용하여 다음과 같은 조건으로 수행하였다: 5분 동안 94℃에서 1차 변성을 1회 반복하였고, 후에 20초 동안 94℃에서 변성, 40초 동안 61℃에서 어닐링(annealing) 및 120초 동안 72℃에서 연장하는 단계를 35회 반복하였으며, 마지막으로 10분 동안 72℃에서 후-연장을 1회 반복하였다. 앰플리콘(amplicon)들은 37℃에서 1시간 동안 BsaI 제한효소(New England Biolabs)로 처리한 후 1% 아가로즈 젤을 사용하여 전기영동하여 분석하였다. 이후 이를 Gel Doc gel imaging system(Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA, USA)를 사용하여 정량화하였다. 그 결과를 도 4의 B 및 C에 나타내었다.
도 4의 B에 NHE1#3-puro + ssODN (N3Pss), NHE1#4-puro + ssODN (N4Pss) 처리된 DF-1 세포에 BsaI 제한효소를 처리한 결과를 나타내었다. 도 4의 B에 나타낸 바와 같이, 제한효소 절단 분석 결과 BsaI가 NHE1#3-puro + ssODN (N3Pss), NHE1#4-puro + ssODN (N4Pss)으로 형질감염된 DF-1 세포에서 각각 7.8% 및 6.7%의 효율로 절단 밴드를 생성하였음을 관찰하여, chNHE1 유전자에서 보다 정확한 유전자 편집이 이루어졌음을 확인하였다. 도 4의 C에는 CRISPR/Cas9 벡터 및 ssODN으로 형질전환된 DF-1 섬유아세포를 시퀀싱한 결과를 나타내었다. 도 4의 C에 나타낸 바와 같이, N3Pss로 형질감염된 DF-1 섬유아세포는 Trp38 결실과 함께 T96G 치환이 유도됨을 확인하였으며, N4Pss 실험군에서는 Trp38 결실 없이 indel 변형이 유도된 것을 확인하였다.
한편, N3Pss 실험군의 염기서열 분석 결과 Trp38 결실 및 T96G 치환이 유도된 대립유전자의 존재가 예상되었기 때문에, 추가적으로 실험군에서 몇 개의 단일 클론(single clone)을 확립하였다. 총 15개의 클론을 확립하였으며, 하기 표 4에 Trp38 타겟 변형이 일어난 모든 클론의 염기서열 분석 결과를 나타내었다. 하기 표 4에 나타낸 바와 같이, 4개 클론들(N3Pss#4, N3P#12, N3P#13 및 N3P#18)은 Trp38 결실과 함께 T96G 치환을 포함하고 있었으며, 다른 4개 클론들(N3Pss#1, N3Pss#5, N3Pss#8 및 N3Pss#11)은 T96G 치환 없이 Trp38 결실만 포함하고 있음을 확인하였다. N3Pss#9는 또 다른 3-bp 결실과 함께 재조합 Trp38 대립 유전자를 가지고 있음을 확인하였다. 나아가, indel 변형이 유도된 그룹에서, 4개 클론들(N3Pss#6, N3Pss#7, N3Pss#10 및 N3Pss#17)은 chNHE1 수용체에서 조기 종결 코돈을 형성했으며, 다른 2개 클론들(N3Pss#14 및 N3Pss#16)은 조기 종결 코돈을 형성하지 않음을 확인하였다. N3Pss#18의 경우 변형 대립 유전자와 야생형(WT) 대립 유전자의 이형접합체(heterozygous)임을 확인하였다.
DF-1 클론의 이형접합성(heterozygosity)을 확인하기 위하여 PCR 산물에 BsaI 제한효소를 처리하고, 그 결과를 도 4의 D에 나타내었다. 도 4의 D에 나타낸 바와 같이, 상기 방법으로 ssODN 주형에서 유래한 BsaI 제한효소를 가진 DF-1 클론과 가지지 않은 DF-1 클론 간의 명확한 차이를 확인하였다(* 표시는 절단된 밴드를 의미). 상기 결과를 통해, N3Pss#18은 이형접합체(heterozygous)임을 확인하였다.
ID 서열 (5'-3') Indel
WT TTGCAGGCCGACGCCACGCGTGTCTCCGAGCCCACCTGG
GAGCAGCCGTGGGGAGAGCCCGGGGGTATCACCGCC (서열번호 13)		 WT
N3Pss#1 TTGCAGGCCGACGCCACGCGTGTCTCCGAGCCCACCTGG
GAGCAGCvCGTGGGGAGAGCCCGGGGGTATCACCGCC		 -3 bp
N3Pss#4 TTGCAGGCCGACGCCACGCG G GTCTCCGAGCCCACCTGG
GAGCAGCCGTGGGGAGAGCCCGGGGGTATCACCGCC		 -3 bp, T96G
N3Pss#5 TTGCAGGCCGACGCCACGCGTGTCTCCGAGCCCACCTGG
GAGCAGCCGTGGGGAGAGCCCGGGGGTATCACCGCC		 -3 bp
N3Pss#6 TTGCAGGCCGACGCCACGCGTGTCTCCGAGCCCACCTGG
GAaGCAGCCGTGGGGAGAGCCCGGGGGTATCACCGCC		 +1 bp
N3Pss#7 TTGCAGGCCGACGCCACGCGTGTCTCCGAGCCCACCTGG
GAGCAGCCGTGGGGAGAGCCCGGGGGTATCACCGCC		 -1 bp
N3Pss#8 TTGCAGGCCGACGCCACGCGTGTCTCCGAGCCCACCTGG
GAGCAGCCGTGGGGAGAGCCCGGGGGTATCACCGCC		 -3 bp
N3Pss#9 TTGCAGGCCGACGCCACGCGTGTCTCCGAGCCCACCTGG
GAGCAGCCGTGGGGAGAGCCCGGGGGTATCACCGCC		 -3 bp, -3 bp
N3Pss#10 TTGCAGGCCGACGCCACGCGTGTCTCCGAGCCCACCTGG
GAGCAGCCGTGGGGAGAGCCCGGGGGTATCACCGCC		 -1 bp
N3Pss#11 TTGCAGGCCGACGCCACGCGTGTCTCCGAGCCCACCTGG
GAGCAGCCGTGGGGAGAGCCCGGGGGTATCACCGCC		 -3 bp
N3Pss#12 TTGCAGGCCGACGCCACGCG G GTCTCCGAGCCCACCTGG
GAGCAGCCGTGGGGAGAGCCCGGGGGTATCACCGCC		 -3 bp, T96G
N3Pss#13 TTGCAGGCCGACGCCACGCG G GTCTCCGAGCCCACCTGG
GAGCAGCCGTGGGGAGAGCCCGGGGGTATCACCGCC		 -3 bp, T96G
N3Pss#14 TTGCAGGCCGACGCCACGCGTGTCTCCGAGCCCACCTGG
GAGCAGCCGTGGGGAGAGCCCGGGGGTATCACCGCC		 -15 bp
N3Pss#16 TTGCAGGCCGACGCCACGCGTGTCTCCGAGCCCACCTGG
GAGCAGCCGTGGGGAGAGCCCGGGGGTATCACCGCC		 -15 bp
N3Pss#17 TTGCAGGCCGACGCCACGCGTGTCTCCGAGCCCACCTG G
GAGCAGCCGTGGGGAGAGCCCGGGGGTATCACCGCC		 -2 bp
N3Pss #18 TTGCAGGCCGACGCCACGCG G GTCTCCGAGCCCACCTGG
GAGCAGCCGTGGGGAGAGCCCGGGGGTATCACCGCC /TTGCAGGCCGACGCCACGCGTGTCTCCGAGCCCACCTGG
GAGCAGCCGTGGGGAGAGCCCGGGGGTATCACCGCC		 -3 bp, T96G/WT
모든 클론들은 NHE1#3-Puro + ssODN(N3Pss)로 형질감염된 DF-1 섬유아세포로부터 유래된 것이다. 볼드체로 표시된 염기는 chNHE1 수용체의 Trp38 코딩 부위를 의미한다. 볼드 및 이탤릭체로 표시된 염기( G )는 BsaI 제한효소 부위를 생성하는 T96G 치환을 의미한다. 음영표시된 염기는 결실 돌연변이를, 굵은 소문자는 삽입 뉴클레오티드를 의미한다.
실시예 7. 바이러스 감염 실험
상기 실시예 6에서 확립된 chNHE1 유전자의 Trp38을 정교하게 타겟팅한 DF-1 클론의 ALV-J에 대한 감수성을 평가하기 위하여 RCAS-J-EGFP 벡터를 도입하여 실시예 5와 동일한 방법으로 바이러스 감염 실험을 수행하였다. 그 결과를 도 5에 나타내었다.
도 5의 A에 나타낸 바와 같이, chNHE1 유전자의 Trp38을 정교하게 타겟팅한 DF-1 클론들(N3Pss#1, N3Pss#4, N3Pss#5, N3Pss#8, N3Pss#9, N3Pss#11, N3Pss#12 및 N3Pss#13)은 매우 낮은 GFP 발현을 나타내어, ALV-J에 대한 저항성을 획득하였음을 확인하였다(이형접합성을 나타내는 N3Pss#18 제외). 또한, 도 5의 B에 나타낸 바와 같이, chNHE1 유전자 상에 조기 종결 코돈을 생성하는 indel 변형을 가진 DF-1 클론들(N3Pss#6, N3Pss#7, N3Pss#10 및 N3Pss#17) 역시 매우 낮은 GFP 발현을 나타냄을 확인하였다. 조기 종결 코돈이 없고, Trp38 결실을 포함하는 indel 변형이 유도된 DF-1 클론(N3Pss#16)의 경우 Trp38 결실을 포함하지 않는 indel 변형이 유도된 DF-1 클론(N3Pss#14)에 비하여 현저하게 낮은 GFP 발현을 나타내어, 이를 통해 Trp38이 ALV-J 감염에 중요한 역할을 함을 다시 한 번 확인하였다. 상기의 특징을 가지는 형질전환 세포주들 중 N3Pss#12 클론을 2018년 4월 25일 한국세포주연구재단 (KCLRF, Korean Cell Line Research Foundation)에 수탁번호 KCLRF-BP-00433로 기탁하였다.
실시예 8. chNHE1 수용체의 단백질 서열 분석
ALV-J 바이러스 감염에 영향을 미치는 chNHE1 수용체 잔기들을 확인하기 위하여, 하기 표 5와 같이 미스센스 돌연변이(missense mutation)를 가진 chNHE1 변형된 DF-1 클론의 추론된 아미노산 서열을 분석하였다. 하기 표 5에 나타낸 바와 같이, 돌연변이체와 바이러스 감염된 클론의 아미노산 서열을 비교한 결과, Trp38만큼은 아니지만 Thr37 및 Gln40에서의 단일 아미노산 결실 역시 바이러스 유입(entry)에 영향을 미침을 확인하였다. 또한, 돌연변이를 삽입시켜 아미노산 사슬이 연장되거나(N4P#26) 또는 큰 결실(N4P#12)이 유도된 DF-1 세포들이 낮은 GFP 발현을 나타냄을 통해, chNHE1 단백질의 이차 구조가 바이러스 감염에 중요한 역할을 함을 확인하였다.
[표 5]
Figure 112019011480255-pat00001
다음으로, chNHE1 수용체의 구조적 특성을 확인하기 위하여 생물정보학적 분석을 수행하였다. TMHMM v2.0 software(Krogh et al., 2001)를 사용하여 chNHE1의 트랜스멤브레인 구조(transmembrane topology)를 분석하였다. 또한, chNHE1의 이차 구조를 PSIPRED(Jones, 1999) 및 웹서버 DISOPRED3(Jones and Cozzetto, 2015)로 분석하였다. 그 결과를 도 6에 나타내었다.
chNHE1의 트랜스멤브레인 구조는 N-말단 부위를 제외하고는 이전의 연구결과(Chai and Bates, 2006; Kucerova et al., 2013)와 동일하게 나타남을 확인하였다. 도 6의 A에 나타낸 바와 같이, TMHMM을 사용한 분석 결과 chNHE1의 N-말단 부위(Met1-Ala28 잔기)는 막에 내재된 신호 펩타이드로서 α-나선 구조를 가짐을 예상할 수 있었다. 또한, 도 6의 B에 나타낸 바와 같이, DISOPRED3을 사용하여 단백질 결합 부위 및 disorder 경향(propensity)을 분석한 결과 잔기 1-10 및 잔기 21-83이 disordered 단백질 부위인 것으로 예상되었다(잔기 1-73에 대한 예측은 confidence score > 0.90에 따라 얻어졌다). 이를 통해, ALV-J 유입 저지에 중요한 역할을 수행하는 Ser34와 Gln40 사이 잔기들이 IDR(intrinsically disordered regions)에 속함을 확인하였다. 그러나, 상기 잔기들은 높은 confidence score(>0.8)로 disordered 단백질 결합 부위(잔기 1-12 및 잔기 53-72)에는 포함되지 않음을 확인하였다.
이를 통해, 단순히 Trp38뿐만 아니라 chNHE1 수용체의 ECL1(Extracellular loop 1) 영역(Met1-Val119)의 단백질 이차 구조도 ALV-J에 대한 민감도에 영향을 미침을 확인하였다.
실시예 9. 재조합 벡터를 이용한 원시생식세포(PGC)의 형질감염
상기 실시예 1에서 제조한 CRISPR/Cas9 재조합 벡터(3 ㎍)를 Opti-MEM(Thermo Fisher-Invitrogen)에서 Lipofectamine 2000 시약(Thermo Fisher-Invitrogen)과 혼합하고, 상기 혼합물을 5 x 105 개의 원시생식세포(Primordial germ cells, 이하 PGC)에 도입하여 형질전환 시켰다. 혼합물 도입 4시간 후, PGC 배양액으로 교체하였다. 유전자 도입 하루 또는 이틀 후, 퓨로마이신(1 ㎍/ml)을 배양액에 첨가하였다. 선별은 2일 동안 실시하였다.
이때 사용한 PGC는 20% FBS (Invitrogen), 2% chicken serum (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA), 1×nucleosides (Millipore, Temecula, CA, USA), 2 mM L-glutamine, 1×nonessential amino acids, β-mercaptoethanol, 10 mM sodium pyruvate, 1×antibiotic-antimycotic (Invitrogen), human basic fibroblast growth factor (10 ng/mL; Sigma-Aldrich)가 포함된 knockout DMEM(Invitrogen) 배양액을 사용하였으며, 37℃, 5% CO2, 60-70% 상대 습도 조건에서 배양되었다. 이 세포는 mitomycin-inactivated mouse embryonic fibroblasts (MEFs)위에서 배양되었으며, 5-6일 간격으로 계대 배양되었다.
실시예 10. chNHE1 유전자의 Trp38 indel 유도 확인
상기 실시예 9에서 생산한 형질전환 PGC에서 chNHE1 유전자의 Trp38 위치에 indel이 정상적으로 유도되었는지 여부를 확인하기 위하여 T7 엔도뉴클라아제 1(T7E1) 분석을 수행하였다. 구체적으로 이형접합(heteroduplex) DNA 구조를 형성하기 위하여 상기 PCR 산물을 변성 이후 리어닐링하였고, 그 후 리어닐링한 산물을 37℃에서 20분 동안 T7E1(New England Biolabs) 효소로 분해하였다. T7E1으로 분해된 산물은 1% 아가로스 겔을 사용하여 전기영동시켰다. PCR 산물은 pGEM-T easy 벡터 (promega)에 클로닝하여 염기서열 분석을 실시하였다. 그 결과를 도 7에 나타내었다.
도 7에 나타낸 바와 같이, PGC(NHE1#3 PGC)에서 chNHE1 유전자의 Trp38 위치에 4 bp, 5 bp의 indel이 유도된 것을 T7E1, 염기서열 분석법을 통해 확인하였다. 상기의 특징을 가지는 형질전환 세포주를 2018년 4월 25일 한국세포주연구재단 (KCLRF, Korean Cell Line Research Foundation)에 수탁번호 KCLRF-BP-00432로 기탁하였다.
상기 결과를 통해, 본 발명의 CRISPR/Cas9 시스템을 통한 유전자 편집은 닭 백혈병 바이러스 하위그룹 J(Avian leukosis virus-J, ALV-J)가 특이적으로 결합하는 chNHE1 수용체에 변이를 유도하여 저항성을 획득할 수 있음을 확인하였다. 특히, 정확한 유전자 편집을 위해 ssODN을 CRISPR/Cas9 벡터와 함께 도입하여 특정 아미노산의 결손만을 유도하여, 숙주 자체의 유전자를 성공적으로 편집함으로써 ALV-J 바이러스에 저항성을 획득할 수 있음을 확인하였다. 따라서, 본 발명에 따른 CRISPR/Cas9 시스템을 통한 유전자 편집은 질병 저항성 세포주, 질병 저항성 조류 생산에 널리 적용될 수 있다.
이상, 본 발명의 바람직한 실시예에 대하여 상세히 설명하였으나, 본 발명의 기술적 범위는 전술한 실시예에 한정되지 않고 특허청구범위에 의하여 해석되어야 할 것이다. 이때, 이 기술분야에서 통상의 지식을 습득한 자라면, 본 발명의 범위에서 벗어나지 않으면서도 많은 수정과 변형이 가능함을 고려해야 할 것이다.
한국세포주연구재단 KCLRF-BP-00432 20180425 한국세포주연구재단 KCLRF-BP-00433 20180425
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Claims (16)

  1. 제1 프로모터 및 이와 작동가능하게 연결된 chNHE1(chicken Na+/H+ exchange 1) 유전자 내 Trp38, Thr37 및 Gln40으로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 부위를 표적으로 하는 gRNA(guide RNA); 및
    제2 프로모터 및 이와 작동가능하게 연결된 Cas9(CRISPR associated protein 9)을 암호화하는 유전자를 포함하는 ALV-J(Avian Leukosis Virus subgroup J, 닭 백혈병 바이러스 하위그룹 J) 저항성 조류모델 제작용 재조합 벡터.
  2. 제1항에 있어서, 상기 제1 프로모터는 U6(human U6) 프로모터인 것을 특징으로 하는, ALV-J(Avian Leukosis Virus-J, 닭 백혈병 바이러스 하위그룹 J) 저항성 조류모델 제작용 재조합 벡터.
  3. 제1항에 있어서, 상기 gRNA(guide RNA)는 서열번호 1 또는 서열번호 2로 표시되는 것을 특징으로 하는, ALV-J(Avian Leukosis Virus-J, 닭 백혈병 바이러스 하위그룹 J) 저항성 조류모델 제작용 재조합 벡터.
  4. 제1항에 있어서, 상기 제2 프로모터는 CBh(chicken beta-actin) 프로모터인 것을 특징으로 하는, ALV-J(Avian Leukosis Virus-J, 닭 백혈병 바이러스 하위그룹 J) 저항성 조류모델 제작용 재조합 벡터.
  5. 제1항의 재조합 벡터 및 ssODN(single-stranded oligodeoxynucleotide, 단일 가닥 올리고데옥시뉴클레오티드)을 포함하는 것을 특징으로 하는 유전체 교정용 조성물.
  6. 제5항에 있어서, 상기 ssODN은 chNHE1 유전자에 상보적으로 결합하며 서열번호 12의 염기서열로 표시되는 것을 특징으로 하는, 유전체 교정용 조성물.
  7. 제6항에 있어서, 상기 ssODN은 chNHE1 유전자에서 Trp38 결실 및 T96G 치환을 유도하는 것을 특징으로 하는, 유전체 교정용 조성물.
  8. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항의 재조합 벡터 또는 제5항 내지 제7항 중 어느 한 항의 유전체 교정용 조성물이 도입된 ALV-J 저항성 조류모델 제작용 형질전환 세포주.
  9. 제8항에 있어서, 상기 형질전환 세포주는 chNHE1 유전자 내 Trp38, Thr37 및 Gln40로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 부위가 특이적으로 변형된 것을 특징으로 하는, ALV-J 저항성 조류모델 제작용 형질전환 세포주.
  10. 제9항에 있어서, 상기 형질전환 세포주는 수탁번호가 KCLRF-BP-00433 임을 특징으로 하는, ALV-J 저항성 조류모델 제작용 형질전환 세포주.
  11. 제8항에 있어서, 상기 형질전환 세포주는 공여체 조류의 원시생식세포(primordial germ cells, PGCs)인 것을 특징으로 하는, ALV-J 저항성 조류모델 제작용 형질전환 세포주.
  12. 제11항에 있어서, 상기 원시생식세포는 상기 공여체 조류의 1-10일령 배아의 원시 생식기로부터 유래된 것을 특징으로 하는, ALV-J 저항성 조류모델 제작용 형질전환 세포주.
  13. 제12항에 있어서, 상기 공여체 조류는 닭인 것을 특징으로 하는, ALV-J 저항성 조류모델 제작용 형질전환 세포주.
  14. 제11항에 있어서, 상기 형질전환 세포주는 수탁번호가 KCLRF-BP-00432임을 특징으로 하는, ALV-J 저항성 조류모델 제작용 형질전환 세포주.
  15. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항의 재조합 벡터 또는 제5항 내지 제7항 중 어느 한 항의 유전체 교정용 조성물을 제조하는 단계; 및
    상기 재조합 벡터 또는 유전체 교정용 조성물을 조류 체세포에 도입하는 단계;를 포함하는 ALV-J 저항성 조류모델 제작용 형질전환 세포주의 제조방법.
  16. 제11항의 형질전환 세포주를 수용체 조류의 배아에 이식하는 단계; 를 포함하는 ALV-J 저항성 조류모델의 제조방법.
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