KR102103638B1 - 저온 적응된 약독화 바이러스를 이용한 유니버설 독감 백신 - Google Patents

Abstract

본 발명은 저온 적응된 약독화 생백신을 이용한 유니버설 독감 백신에 관한 것으로서, 보다 구체적으로 본 발명은 1종 이상의 저온 적응된 약독화 생백신을 포함하는 유니버설 독감 백신 조성물 및 이를 이용한 독감 예방 접종 방법에 관한 것이다. 본 발명은 유니버설 독감 생백신 조성물은 광범위한 종류의 독감 바이러스에 대한 교차 방어 효과를 나타내며, 종래 HA 백신에서 기대할 수 없었던 강력한 방어 효능과 넓은 방어 범위, 및 안전성을 보장할 수 있다. 또한, 본 발명의 이종생백신 접종 방법은 다양한 면역학적 효과를 유도함으로써, 교차면역원성 및 교차방어능력을 현저히 상승시켜 유니버설 독감 예방 방법으로서 유용하게 활용될 수 있을 것으로 기대된다. 또한, 본 발명의 생백신 접종 방법에 따르면, 독감 바이러스의 감염 또는 독감 백신 접종을 통해 기저 면역이 존재하고 있는 사람의 경우 이미 1차 백신 접종 상태인 것으로 볼 수 있기 때문에, 1회의 생백신 접종(추가 접종에 해당)을 통해서 교차 면역 반응의 증강을 유도하여 다양한 바이러스에 대해 광범위한 방어효과를 기대할 수 있다.

Description

저온 적응된 약독화 바이러스를 이용한 유니버설 독감 백신{Universal influenza vaccine using cold-adapted live-attenuated virus}

본 발명은 저온 적응된 약독화 바이러스를 이용한 유니버설 독감 백신에 관한 것으로서, 보다 구체적으로 본 발명은 1종 이상의 저온 적응된 약독화 생백신을 포함하는 유니버설 독감 백신 조성물 및 이를 이용한 독감 예방 접종 방법에 관한 것이다.

독감 바이러스(influenza virus)는 매년 발생하는 유행성 독감과 전염성 호흡기 질환을 일으키며, 계절마다 독감 바이러스의 유행으로 인해 전세계적으로 3백만 ~ 5백만 건의 중증 질환자 및 25 ~ 50만 명의 사망자가 발생한다. 항원의 다양성과 바이러스의 가변성 때문에, 독감 백신은 유행하는 균주에 맞게 거의 매년 갱신되어야 한다. 현재 사용되는 독감 백신은 1차적으로 바이러스의 표면 당단백질인 적혈구응집소(hemagglutinin, HA)와 뉴라민분해효소(neuraminidase, NA)에 대한 중화 항체를 유도함으로써 단일 균주에 특이적인 면역원성을 제공하는 것이다.

지난 수 십 년 간, 유니버설 독감 백신을 개발하기 위한 노력이 있었고, HA 줄기에 기반한 방법(HA stalk-based), 유전자 재조합 HA(chimeric HA) 전략 등이 개발되었다.

현재까지 유니버설 독감 백신 기술로 가장 앞선 기술은 독감 바이러스 HA의 보존 영역(conserved region)인 줄기(stalk) 부분에 대한 항체를 유도하여 여러 HA 아형(HA subtype)의 독감 바이러스에 대한 교차방어를 제공하는 것이다. HA 줄기 항체는 HA 융합 펩타이드의 구조 변화를 막아 바이러스의 유전자가 숙주세포의 세포질 내로 전달되는 단계를 저해함으로써 바이러스의 감염성을 제거하는 중화 활성을 지니고 있다. HA 줄기를 이용한 대표적인 2가지 방법으로 1) HA 머리(HA head) 부분이 서로 다르고 줄기는 동일한 재조합 HA(chimeric HA) 단백질을 반복 접종하여 줄기 항체를 선택적으로 유도하는 전략과, 2) 머리 부분이 없는 줄기(stalk-only) 단백질을 반복 접종하는 전략이 제시되었다.

그러나 상기 줄기 항체를 기반으로 하는 백신 전략은 방어효능, 방어범위, 안전성 면에서 많은 한계점을 나타내었다. 먼저, A형 독감바이러스 내의 HA 아형(HA group 1 및 HA group 2)에 따라 줄기 부분에서도 상당한 아미노산 서열 차이가 존재한다. 이 때문에 줄기 백신은 대부분 동일한 HA 그룹 내에서만 교차방어능력을 보이며 다른 HA 그룹의 바이러스에 대해서는 거의 방어능력을 보이지 못한다. 둘째로, 줄기는 머리에 비해 면역원성이 떨어지고 줄기 항체의 중화능력도 머리 항체보다 떨어지기 때문에 3 ~ 4회 이상의 반복 투여를 하여야만 적정수준의 방어능력 제공할 수 있다. 셋째로, 비중화활성을 갖는 줄기 항체는 종종 바이러스를 중화하지 못하고 오히려 감염 능력을 증가시키는 치명적인 부작용이 보고된 바 있다. 마지막으로, 줄기 항체에 저항성을 보이는 돌연변이 바이러스가 발생할 수 있다는 것이 실험적으로 증명되었다.

상기와 같이, HA 줄기 기반 백신은 방어효능, 방어범위, 안전성 면에서 유니버설 백신으로서 적절하지 못한 문제점을 지니고 있다. 그럼에도 불구하고 현재까지 제시된 방법들 중 최선의 방법으로 인식되어 인간을 대상으로 하는 임상시험 단계에 이르고 있다.

한편, 저온 적응된 약독화 생백신(CAIV, cold-adapted live-attenuated influenza vaccine)은 바이러스 표면항원 단백질에 대한 항체 면역뿐만 아니라 내부 단백질에 대한과 세포성 면역도 유도되어, 다른 백신 플랫폼에 비해 교차방어 능력이 우수하다는 장점이 있다. 그러나, 이와 같은 우수한 교차 방어 능력에도 불구하고 생백신의 방어 기적이 매우 다양하고 복잡하여 실험적으로 정량화하기 어렵다는 문제가 있으며, 유니버설 백신 개발에서 필수로 여겨지는 줄기 항체 유도에 생백신이 적합하지 않다는 점 때문에 유니버설 백신 개발에서 생백신이 크게 주목 받지 못하고 있다. 따라서 적절한 방법을 통해 이러한 장점을 강화시킬 수 있다면, 생백신이 유니버설 독감 백신의 강력한 플랫폼이 될 것으로 기대된다.

그러나 현재까지 생백신에 관한 연구는 동종 균주를 타게팅하는 백신의 개발이나, 항원적으로 가까운 관계에 있는 균주를 대상으로 하는 교차 면역 연구가 있을 뿐, 이를 이용한 유니버설 독감 백신은 알려진 바가 없다.

본 발명의 목적은 저온 적응된 약독화 생백신을 이용한 유니버설 독감 생백신 조성물을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 상기 유니버설 독감 생백신 조성물을 이용한 이종 독감 바이러스 예방 접종 방법을 제공하는 것이다.

그러나, 본 발명이 이루고자 하는 기술적 과제는 이상에서 언급한 과제에 제한되지 않으며, 언급되지 않은 또 다른 과제들은 아래의 기재로부터 당업자에게 명확하게 이해될 수 있을 것이다.

본 발명은 상술한 문제점을 해결하기 위한 것으로, 서열번호 1 내지 6으로 표시되는 6개의 내부 유전자; 독감 바이러스 유래 표면 헤마글루티닌(HA) 유전자; 및 독감 바이러스 유래 표면 뉴라미니다아제(NA) 유전자를 포함하는 독감 생백신을 1종 이상 포함하는 유니버설 독감 생백신 조성물을 제공한다.

구체적으로, 본 발명은 (a) 서열번호 1 내지 6으로 표시되는 6개의 내부 유전자; 독감 바이러스 유래 표면 헤마글루티닌(HA) 유전자; 및 독감 바이러스 유래 표면 뉴라미니다아제(NA) 유전자를 포함하는 독감 생백신을 포함하는 1차 접종용 생백신 조성물; 및 (b) 서열번호 1 내지 6으로 표시되는 6개의 내부 유전자; 독감 바이러스 유래 표면 헤마글루티닌(HA) 유전자; 및 독감 바이러스 유래 표면 뉴라미니다아제(NA) 유전자를 포함하는 독감 생백신을 포함하는 2차 접종용 생백신 조성물을 포함하는 유니버설 독감 생백신 조성물을 제공한다.

본 발명의 상기 서열번호 1 내지 6으로 표시되는 유전자는 x-31 ca 바이러스의 내부 유전자로서, 구체적으로 PB2(서열번호 1), PB1(서열번호 2), PA(서열번호 3), NP(서열번호 4), M(서열번호 5) 및 NS(서열번호 6)이다.

본 발명의 유니버설 독감 생백신 조성물은 프라임-부스트 접종을 위한 것으로서 상기 1차 접종용 생백신 조성물과 2차 접종용 생백신 조성물은 각각 시간차를 두고 접종하기 위한 것이며, 생백신의 조성은 서로 같거나 다를 수 있다.

상기 1차 접종용 생백신 및 2차 접종용 생백신은 x-31 ca 바이러스의 내부 유전자 6개를 공통적으로 포함하고, 각각 임의의 독감 바이러스 유래 HA 유전자 및 NA 유전자 서열을 포함한다. 하나의 생백신에 포함된 HA 유전자 및 NA 유전자는 같은 독감 바이러스에서 유래한 HA 유전자 및 NA 유전자일 수 있고, 서로 다른 독감 바이러스에서 유래한 HA 유전자 및 NA 유전자를 조합한 것일 수도 있다. 본 발명의 일 실시예에서는 하나의 생백신에 동일한 독감 바이러스에서 유래한 HA 유전자 및 NA 유전자를 재조합하여 사용하였다.

본 발명의 상기 1차 접종용 생백신 및 2차 접종용 생백신은 서로 이종아형(heterosubtypic)의 HA 유전자 및 NA 유전자를 포함하는 바이러스를 2종 이상 포함하는 것일 수 있다. 본 발명의 용어 "이종아형(heterosubtypic)"이란 1차 접종용 생백신과 2차 접종용 생백신을 구성하는 HA 유전자 및 NA 유전자의 아형(subtype)이 상이한 것을 의미한다. 본 발명의 일 실시예에서는 상기 1차 접종용 생백신으로서 A/Korea/1/09(H1N1) 유래 HA 유전자 및 NA 유전자를 포함한 ca-pH1N1을 사용하고, 2차 접종용 생백신으로서 A/Indonesia/5/05(H5N1) 유래 HA 유전자 및 NA 유전자를 포함한 ca-IDH5N1을 사용하였다. 상기 본 발명의 일 실시예의 1차 접종용 생백신과 2차 접종용 생백신은 각각 H1N1과 H5N1으로서 상이한 바이러스로부터 유래한 상이한 아형을 가지는 것이다. 독감 바이러스의 HA 유전자는 크게 1군(group 1)과 2군(group 2)로 분류되는데, 본 발명의 이종아형 생백신의 조합은 각각 서로 다른 HA 군에서 유래한 바이러스의 유전자를 포함할 수도 있고, 동일한 HA 군에 속하지만 HA 아형이 상이한 바이러스의 유전자를 포함할 수도 있다.

본 발명의 상기 1차 접종용 생백신 및 2차 접종용 생백신은 서로 동종아형(homosubtypic)의 HA 유전자 및 NA 유전자를 포함하는 바이러스를 2종 이상 포함하는 것일 수 있다. 본 발명의 용어 "동종아형(homosubtypic)"이란 1차 접종용 생백신과 2차 접종용 생백신을 구성하는 HA 유전자 및 NA 유전자의 아형(subtype)이 동일한 것을 의미한다. 동종아형 관계의 생백신에서 각각의 HA 유전자 및 NA 유전자는 서로 동일한 바이러스로부터 유래한 것일 수도 있고 서로 다른 독감 바이러스로부터 유래한 것일 수도 있다.

본 발명의 일 실시예에서, 상기 동종아형의 바이러스를 포함하는 1차 접종용 생백신 및 2차 접종용 생백신은 서로 동종(homologous)의 독감 생백신을 포함한 것일 수 있다. 이 때 "동종(homologous)"이란 동일한 독감 바이러스 유래 HA 유전자 및 NA 유전자를 포함하는 것으로서, 1차 접종용 생백신과 2차 접종용 생백신이 완전히 동일한 것을 의미하며, 동일한 생백신을 시간차를 두고 투여하기 위해 사용될 수 있다. 본 발명의 일 실시예에서는 A/Korea/1/09(H1N1) 유래 HA 유전자 및 NA 유전자를 포함한 ca-pH1N1을 사용하여 1차 접종 및 2차 접종을 실시하였다.

본 발명의 일 실시예에서, 상기 1차 접종용 생백신 및 2차 접종용 생백신은 서로 이종(heterologous)의 독감 생백신을 포함한 것일 수 있다. 이 때 "이종(heterologous)"이란 서로 다른 바이러스 유래 HA 유전자 및 NA 유전자를 포함하는 것으로서, 상이한 바이러스의 HA, NA 아형이 동일한지 여부에 따라 동종아형(homosubtypic)일 수도 있고, 이종아형(heterosubtypic)일 수도 있다. 본 발명의 일 실시예에서는 상기 1차 접종용 생백신으로서 A/Korea/1/09(H1N1) 유래 HA 유전자 및 NA 유전자를 포함한 ca-pH1N1을 사용하고, 2차 접종용 생백신으로서 A/New Caledonia/20/99(H1N1) 유래 HA 유전자 및 NA 유전자를 포함한 ca-NVH1N1을 사용하였다. 이 경우 1차 접종용 생백신과 2차 접종용 생백신은 서로 다른 바이러스에서 유래한 것으로서 이종(heterologous) 백신이면서, 동시에 HA, NA 유전자 아형이 동일하므로 동종아형(homosubtypic) 백신에 속한다.

본 발명의 상기 HA 유전자 또는 NA 유전자는 A/Korea/1/09(H1N1), A/New Caledonia/20/99(H1N1) 및A/Indonesia/5/05(H5N1)으로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상의 독감 바이러스 균주에서 유래한 것일 수 있다.

본 발명의 상기 HA 유전자는 서열번호 7, 서열번호 9 및 서열번호 11로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상을 포함할 수 있으며, 상기 서열번호 7은 A/Korea/1/09(H1N1) 유래 HA 유전자, 서열번호 9는 A/New Caledonia/20/99(H1N1) 유래 HA 유전자, 서열번호 11은 A/Indonesia/5/05(H5N1) 유래 HA 유전자 서열을 나타낸다.

본 발명의 상기 NA 유전자는 서열번호 8, 서열번호 10 및 서열번호 12로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상을 포함할 수 있으며, 상기 서열번호 8은 A/Korea/1/09(H1N1) 유래 NA 유전자, 서열번호 10은 A/New Caledonia/20/99(H1N1) 유래 NA 유전자, 서열번호 12는 A/Indonesia/5/05(H5N1) 유래 NA 유전자 서열을 나타낸다.

본 발명의 일 구현예에 있어서, 상기 1차 접종용 생백신 조성물 또는 2차 접종용 생백신 조성물은 i) A/Korea/1/09(H1N1) 유래 표면 HA 유전자 및 표면 NA 유전자를 포함하는 독감 생백신(ca-pH1N1); ii) A/New Caledonia/20/99(H1N1) 유래 표면 HA 유전자 및 표면 NA 유전자를 포함하는 독감 생백신(ca-NCH1N1); 및 iii) A/Indonesia/5/05(H5N1) 유래 표면 HA 유전자 및 표면 NA 유전자를 포함하는 독감 생백신(ca-IDH5N1)으로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상을 포함하는 것일 수 있다.

본 발명의 독감 생백신은 저온 적응된 약독화 형질을 나타내는 것일 수 있다. 본 발명의 용어, "저온 적응된" 및 "약독화된"의 의미는 당업계에 공지되어 있다. "저온 적응된"이란 바이러스가 37℃에서의 그 성장의 100배 이내의 성장을 33 ℃에서 나타내는 것을 의미한다. "약독화된"이란 바이러스가 마우스의 상기도에서는 복제하지만 폐 조직에서는 검출 불가능하며 동물에서 인플루엔자형 질병을 야기하지 않음을 의미한다.

본 발명의 유니버설 독감 생백신 조성물은 서로 다른 아형(subtype)의 HA 단백질에 대해 교차 면역 반응을 형성할 수 있다.

본 발명의 일 구현예에 있어서, 상기 조성물은 H1, H2, H5, H6, H8, H9, H11, H12, H13 및 H16으로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상인 HA 단백질(HA group 1); 및 H3, H4, H7, H10, H14 및 H15로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상인 HA 단백질(HA group 2)에 대해 교차 면역 반응을 형성할 수 있다.

또한, 본 발명의 또 다른 구현예에 있어서 상기 조성물은 HA group 1 내에 속하는 2 이상의 서로 다른 아형의 HA 단백질에 대해 교차 면역 반응을 형성할 수 있으며, HA group 2 내에 속하는 2 이상의 서로 다른 아형의 HA 단백질에 대해 교차 면역 반응을 형성할 수 있다.

본 발명의 유니버설 독감 생백신 조성물은 서로 다른 아형(subtype)의 NA 단백질에 대해 교차 면역 반응을 형성할 수 있다.

본 발명은 또한, 서열번호 1 내지 6으로 표시되는 6개의 내부 유전자; 독감 바이러스 유래 표면 헤마글루티닌(HA) 유전자; 및 독감 바이러스 유래 표면 뉴라미니다아제(NA) 유전자를 포함하는 독감 생백신을 동물에 2회 이상 투여하는 단계를 포함하는 이종 독감 바이러스 예방 접종 방법을 제공한다.

본 발명의 일 구현예에 있어서, 상기 독감 생백신의 HA 유전자는 서열번호 7, 서열번호 9 및 서열번호 11로 이루어지는 군에서 선택될 수 있고, 상기 NA 유전자는 서열번호 8, 서열번호 10 및 서열번호 12로 이루어지는 군에서 선택될 수 있다.

본 발명의 일 구현예에 있어서, 상기 예방 접종 방법에 사용되는 독감 생백신은 i) A/Korea/1/09(H1N1) 유래 표면 HA 유전자 및 표면 NA 유전자를 포함하는 독감 생백신(ca-pH1N1); ii) A/New Caledonia/20/99(H1N1) 유래 표면 HA 유전자 및 표면 NA 유전자를 포함하는 독감 생백신(ca-NCH1N1); 및 iii) A/Indonesia/5/05(H5N1) 유래 표면 HA 유전자 및 표면 NA 유전자를 포함하는 독감 생백신(ca-IDH5N1)으로 이루어진 군에서 선택되는 것일 수 있다.

본 발명의 일 구현예에 있어서, 상기 투여 단계는 프라임-부스트 접종법을 포함할 수 있다.

본 발명의 용어 "프라임-부스트(prime-boost) 접종"의 의미는 당업계에 공지되어 있는 것으로, 면역원성 조성물 또는 백신을 프라임 접종(1차 접종)하는 단계, 상기 프라임 접종으로부터 일정한 시간 간격을 두고 부스트 접종(2차 접종) 하는 단계를 포함하는 예방 접종 방법이다. 프라임 접종에 사용되는 면역원성 조성물 또는 백신은 부스트 접종에 사용되는 것과 동일하거나 상이할 수 있다. 프라임 접종과 부스트 접종 사이의 시간 간격은 백신 접종 대상 개체의 종류와 몸무게에 따라, 접종하는 백신의 종류와 양에 따라 상이하며, 한정되지 않는다.

본 발명의 일 구현예에 있어서, 상기 프라임-부스트 접종법은 (a) 서열번호 1 내지 6으로 표시되는 6개의 내부 유전자; 독감 바이러스 유래 표면 헤마글루티닌(HA) 유전자; 및 독감 바이러스 유래 표면 뉴라미니다아제(NA) 유전자를 포함하는 독감 생백신을 포함하는 1차 접종용 생백신 조성물을 투여하는 단계; 및 (b) 서열번호 1 내지 6으로 표시되는 6개의 내부 유전자; 독감 바이러스 유래 표면 헤마글루티닌(HA) 유전자; 및 독감 바이러스 유래 표면 뉴라미니다아제(NA) 유전자를 포함하는 독감 생백신을 포함하는 2차 접종용 생백신 조성물을 투여하는 단계를 포함하는 것일 수 있다.

본 발명의 일 구현예에 있어서, 상기 프라임-부스트 접종법은 i) A/Korea/1/09(H1N1) 유래 표면 HA 유전자 및 표면 NA 유전자를 포함하는 독감 생백신(ca-pH1N1); ii) A/New Caledonia/20/99(H1N1) 유래 표면 HA 유전자 및 표면 NA 유전자를 포함하는 독감 생백신(ca-NCH1N1); 및 iii) A/Indonesia/5/05(H5N1) 유래 표면 HA 유전자 및 표면 NA 유전자를 포함하는 독감 생백신(ca-IDH5N1)으로 이루어진 군에서 선택되는 1차 접종용 생백신 조성물을 투여하는 단계; 및 상기 군에서 선택되는 2차 접종용 생백신 조성물을 투여하는 단계를 포함할 수 있다. 상기 제1독감 생백신과 제2독감 생백신은 서로 동일하거나 상이할 수 있다.

본 발명의 일 구현예에 있어서, 상기 접종 방법은 생백신 조성물을 인간을 제외한 동물에 투여하는 것일 수 있다.

본 발명자들은 독감 생백신 균주를 이용한 프라임-부스트 접종이 면역력을 촉진함으로써 강력하고 넓은 교차 면역 효과를 나타낸다는 점을 실험으로 입증함으로써 본 발명을 완성하였다.

주요 인체 감염 A형 독감 바이러스인 H1N1, H3N2, H5N1, H7N1 등은 HA 그룹 1 및 HA 그룹 2에 속하는 바이러스를 모두 포함한다. 이에 효과적인 유니버설 독감 백신을 개발하기 위해서는 HA 그룹 1 및 HA 그룹 2에 속하는 바이러스에 대한 교차 면역 효과를 제공해야 한다. 본 기술은 생백신을 이용하여 HA 그룹 1 및 HA 그룹 2에 속하는 바이러스를 모두 방어할 수 있는 전략으로서, 지금까지 개발된 HA 기반 유니버설 백신 전략에서는 달성할 수 없었던 모든 범위의 A형 독감 바이러스 방어가 가능하다는 점을 실험으로 확인하였다.

구체적으로 본 발명의 일 실시예에 따르면, 서로 다른 균주의 x-31 ca에 기반한 저온 적응된 약독화 생백신을 이용하여 프라임-부스트 백신 접종을 실시하였다. 실험 마우스에 서로 다른 프라임-부스트 조합의 생백신으로 접종을 하였고, 항원적으로 상이한 HA 그룹 1 독감 바이러스(H1 및 H5) 및 HA 그룹 2 독감 바이러스(H3 및 H7)에 대한 교차 예방 효과를 확인하였다. 그 결과, H1N1 및 H5N1 독감 생백신의 2회 접종을 통해 그룹 1의 바이러스(H1N1, H5N2)와 그룹 2의 바이러스(H3N2, H7N1)를 모두 완벽하게 방어하였다. 또한, 높은 치사량 (10 MLD₅₀)의 공격 접종에도 불구하고 마우스의 몸무게 감소가 전혀 없는 완벽한 수준의 교차방어 효과를 나타내었다. 뿐만 아니라, 백신 접종에 의해 유도된 비중화항체가 ADCC활성을 보이면서도 바이러스의 감염성 증가나 생백신간 면역간섭과 같은 부작용도 전혀 일으키지 않았다. 즉, 본 발명의 백신 접종은 방어 범위뿐만 아니라 방어 효능 및 안전성 면에서도 종래 HA 줄기 기반 백신을 뛰어넘는 우수한 장점을 지닌다고 할 수 있다.

본 발명의 유니버설 독감 생백신 조성물은 프라임-부스트 방법으로 접종함으로써 종래 HA 백신에서 기대할 수 없었던 강력한 방어 효능과 넓은 방어 범위, 및 안전한 예방 효과를 기대할 수 있다. 또한, 본 발명의 이종생백신 접종 방법은 다양한 면역학적 효과를 유도함으로써, 교차면역원성 및 교차방어능력을 현저히 상승시켜 유니버설 독감 예방 방법으로서 유용하게 활용될 수 있을 것으로 기대된다.

또한, 본 발명의 생백신 접종 방법에 따르면, 독감 바이러스의 감염 또는 독감 백신 접종을 통해 기저 면역이 존재하고 있는 사람의 경우 이미 1차 백신 접종 상태인 것으로 볼 수 있기 때문에, 1회의 생백신 접종(추가 접종에 해당)을 통해서 교차 면역 반응의 증강을 유도하여 다양한 바이러스에 대해 광범위한 방어효과를 기대할 수 있다.

도 1a는 백신접종 실험군별 프라임-부스트(prime-boost) 생백신 조합을 나타낸 것이고, 도 1b는 인플루엔자 바이러스 HA 아형의 계통학적 분류도를 나타낸 것이다.
도 2a는 백신유도항체의 HA 단백질에 대한 교차 결합력을 분석한 결과이다(n = 5, 평균±표준편차, 백신 접종군과 PBS 대조군을 비교하였을 때 유의도 ***, P < 0.001; **, P < 0.01; *, P < 0.05).
도 2b는 백신유도항체의 HA 전체 단백질 또는 HA 줄기 부분에 대한 교차 결합력을 분석한 결과이다(n = 5, 평균±표준편차, 서로 다른 두 백신 접종군을 비교하였을 때 유의도 ***, P < 0.001; **, P < 0.01; *, P < 0.05).
도 3은 백신유도항체의 NA 단백질에 대한 교차결합력을 분석한 결과이다(n = 5, 평균±표준편차, 백신 접종군과 PBS 대조군을 비교하였을 때 유의도 ***, P < 0.001; **, P < 0.01; *, P < 0.05).
도 4a는 백신유도 항체의 마이크로중화시험(microneutralization assay, MN assay) 결과를 나타낸 것이다(n = 5, 평균±표준편차, 백신 접종군과 PBS 대조군을 비교하였을 때 유의도 ***, P < 0.001; **, P < 0.01; *, P < 0.05).
도 4b는 백신유도 항체의 HA 억제 시험(hematogglutinin inhibition assay, HI assay) 결과를 나타낸 것이다(n = 5, 평균±표준편차, 백신 접종군과 PBS 대조군을 비교하였을 때 유의도 ***, P < 0.001; **, P < 0.01; *, P < 0.05).
도 4c는 백신유도 항체의 항체 의존성 세포 매개 독성(antibody-dependent cell-mediated cytotoxicity, ADCC) 활성 측정 결과를 나타낸 것이다(n = 5, 평균±표준편차, 백신 접종군과 PBS 대조군을 비교하였을 때 유의도 ***, P < 0.001; **, P < 0.01; *, P < 0.05).
도 5는 마우스에서 백신 접종군 별로 이종독감바이러스 공격접종에 대한 교차방어능력을 몸무게 감소 및 치사율로 확인한 결과이다(A, 비접종 대조군; B-E, 생백신 접종군; n = 4).
도 6은 마우스에서 백신 접종군 별로 이종독감바이러스 공격접종에 대한 마우스 몸무게의 최대 감소량을 나타낸 것이다.
도 7은 마우스에서 백신 접종군 별로 이종독감바이러스 공격접종에 대한 폐 조직 바이러스 증식 억제력을 나타낸 것이다(n = 5, 평균±표준편차, 서로 다른 백신 접종군끼리 비교하였을 때 유의도 ***, P < 0.001; **, P < 0.01; *, P < 0.05).
도 8은 바이러스 감염 후 메모리 CTL 활성 분석 결과이다(n = 3 to 5, 평균±표준편차, 대조군(D, E) 또는 서로 다른 백신 접종군(F)끼리 비교하였을 때 유의도 **, P < 0.01; *, P < 0.05).
도 9a는 백신 접종 마우스에서 T 세포 및 NK 세포의 교차 방어 기여도 분석 실험 개요를 나타낸 것이다.
도 9b 내지 f는 백신비접종(b) 및 백신접종(c-f) 실험군에서 마우스의 몸무게 변화 및 생존률을 확인한 결과이다.
도 10a 및 b는 비중화항체에 의한 이종독감 바이러스의 감염성 증가 현상 발생 여부를 MDCK 세포(a) 및 RAW264.7 세포(b)에서 확인한 결과이다.
도 10c는 이종생백신간 면역간섭 효과로 인한 항체반응 저해 현상 발생 여부를 확인한 결과이다.

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세하게 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 예시하기 위한 것으로서, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지 않는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.

[실험 재료 및 방법]

1. 세포주

MDCK 세포(Madin-Darby canine kidney, MDCK, ATCC CCL-34)는10% FBS(bovine serum, HyClone)가 추가된 MEM 배지(minimum essential medium; HyClone)에서 배양하였으며, 마우스 대식세포 세포주(Mouse macrophage cell line RAW264.7, ATCC TIB-71)는 10% FBS가 추가된 DMEM 배지(Dulbecco's Modified Eagle Medium, HyClone)에서 배양하였다.

2. 백신 및 바이러스

본 발명의 X-31 ca-기반 생백신(CAIV)은 X-31 ca 공여 균주의 6개의 내부 유전자를 공통적으로 포함하고, A/Korea/1/09 (H1N1) (GQ131023 and GQ132185), A/New Caledonia/20/99 (H1N1) (CY031336 and CY033624), 또는 A/Indonesia/5/05 (H5N1) (CY116646 and CY116648)의 표면 HA, NA 유전자를 포함하는 재배열 바이러스이다. 상기 X-31 ca는 X-31 모 바이러스 균주를 저온 적응시킨 것으로서, A/Puerto Rico/8/34 (H1N1)에 A/Hong Kong/1/1968 (H3N2)의 HA, NA 유전자를 포함하는 재배열 바이러스이다. 상기 X-31ca의 6개 내부 유전자의 유전 정보(GenBank database accession numbers)는 DQ874873(PB2, 서열번호 1), DQ874874(PB1, 서열번호 2), DQ874875(PA, 서열번호 3), DQ874877(NP, 서열번호 4), DQ874879(M, 서열번호 5), 및 DQ874880(NS, 서열번호 6)이다. 모든 생백신은 이전 연구를 통해 동물 모델에서 약독화 표현형, 백신 효율 및 안전성이 입증되었다.

본 발명의 실시예에서 사용된 실험 바이러스는 2종의 실험실 균주(PR8 (H1N1) (A/Puerto Rico/8/34) 및 MA81 (H5N2) (A/ aquatic bird/Korea/w81/05)), 1종의 야생형 바이러스(Phil82 (H3N2) (A/Philippines/2/82)), 및 1종의 7:1 재배열 바이러스(reNet03 (H7N1) (PR8:HA of A/Netherlands/219/03))를 포함한다.

각 바이러스의 마우스 치사량 50(MLD₅₀)은 예비 실험을 통해 결정되었으며, PR8(H1N1)은 5 × 10³ PFU(plaque forming unit), MA81(H5N2)는 1 × 10⁴ PFU, Phil82(H3N2)는 5 × 10⁴ PFU, 그리고 reNet03(H7N1)는 5 × 10³ PFU이다.

3. 재조합 독감 HA 단백질

곤충 세포에서 발현된 HA 단백질은 Sino Biological(China)에서 구입하였다. 7개의 다른 HA 단백질이 각각 A/California/6/2009 (H1N1), A/Puerto Rico/8/ 1934 (H1N1), A/Canada/720/2006 (H2N2), A/Indonesia/5/2005 (H5N1), A/Hong Kong/35820/2009 (H9N2), A/Sydney/5/1997 (H3N2), 및 A/Anhui/1/2013 (H7N9) 독감 바이러스에서 유래하였다.

본 발명자들은 또한 박테리아 발현 시스템을 이용하여 HA 단백질을 발현시켰다. 구체적으로, PR8 (H1N1) 및 A/Korea/1/09 (H1N1) 바이러스의 HA2 도메인에서 막관통 도메인(transmembrane domain)이 없는 HA 단백질(HAΔTM, positions 1531 in H1 numbering)과 줄기 부분 단백질(stalk region, positions 345531 in H1 numbering)을 대장균(Escherichia coli)에서 발현시켰다. 상기 막관통 도메인(positions 532566)은 HAΔTM 단백질의 수용성 발현을 위해 제거하였다. 발현 플라스미드(pLysRS-GE)를 대장균 BL21(DE3)pLysS에 형질전환하였고, 단백질을 발현시켰다. 다음으로 세포 용출물을 원심분리하여 수용성 분획과 불용성 분획으로 분리한 후 SDS-PAGE를 수행하고 쿠마시 블루(Coomassie brilliant blue R-250)로 염색하여 확인하였다. 발현된 단백질은 니켈 친화성 크로마토그래피를 사용하여 정제하였다.

4. 마우스 생백신 접종 및 공격 접종

마우스 백신 접종 실험을 위해 6주령 balb/c 암컷 마우스를 사용하였으며, 3종의 생백신 ca-pH1N1(2009 유행성 독감 A/Korea/1/09 (H1N1) virus), ca-NCH1N1(계절성 독감 A/New Caledonia/20/99 (H1N1) virus) 및 ca-IDH5N1(고병원성H5N1 조류 독감 A/Indonesia/ 5/05 (H5N1) virus)을 사용하여 총 5가지의 프라임-부스트(prime-boost) 백신접종 실험군을 구성하였다. 각 실험군별 프라임-부스트 조합은 도 1a에 나타내었다.

각 실험군별로 10⁵ PFU의 생백신을 비강투여하였고, 2주 간격으로 1차 접종(prime) 및 2차 접종(boost)을 하였다. 2차 접종 실시 4주 후 10 x MLD₅₀ 의 바이러스 공격 접종을 실시하였다. 공격접종 바이러스는 HA group 1에 속하는 바이러스 2종(H1N1, H5N2)과 HA group 2에 속하는 바이러스 2종(H3N2, H7N1)을 포함하였다.

독감 바이러스 HA 아형의 계통학적 분류도를 도 1b에 나타내었으며, 본 발명에서 백신의 방어 능력 및 백신유도항체와의 결합력 시험에 포함된 HA는 색깔로 표시하였다. 본 발명에 사용된 3종의 생백신은 X-31 ca에서 유래한 6개의 내부 유전자를 동일하게 포함하고, 각각 HA group 1에 속하는 다른 바이러스(H1, H5)로부터 서로 다른 표면 유전자를 포함하는 한편, 공격 접종용 바이러스는 두 그룹의 HA 균주를 모두 포함하여 구성하였다. 이와 같은 실험 디자인을 통해 A형 독감 HA group 1과 HA group 2에 속하는 다양한 독감 바이러스에 대한 방어 효능과 방어 범위를 평가하였다.

실시예 1. 백신유도 항체의 HA 단백질에 대한 교차결합력 분석

독감 바이러스 감염 예방 효과에서 HA 단백질이 주요한 면역 항원으로 작용하기 때문에, 이종 독감 바이러스 HA 단백질에 대한 본 발명의 백신유도 혈청 IgG 항체의 결합력을 확인하기 위해 곤충 세포에서 발현된 7종류 아형의 독감 바이러스의 재조합 HA 단백질을 코팅 항원으로 이용하여 ELISA 실험을 하였다. 실험에 사용한 HA 단백질은 group 1에 속하는 5종(A/California/6/2009(H1N1), A/Puerto Rico/8/1934(H1N1), A/Canada/720/2006(H2N2), A/Indonesia/5/2005(H5N1), 및 A/Hong Kong/35820/2009(H9N2))과 group 2에 속하는 2종(A/Sydney/5/1997(H3N2), 및 A/Anhui/1/2013(H7N9))에서 유래하였다.

96-웰 플레이트에 100 μl의 10⁵ PFU 수크로스-구배 정제된(sucrose-gradient purified) 바이러스 또는 1 μg/ml HA 단백질을 하룻밤 동안 코팅하였다. PBS에서 150 μl 1% BSA로 블로킹하고 플레이트를 세척한 후, 웰을 2배로 연속 희석한 혈청 또는 BALF 100 μl와 상온에서 1시간 동안 반응시켰다. 플레이트를 세척한 후, 웰을 100 μl의 HRP-결합된 2차 염소 항-마우스 IgG 항체 또는 IgA 항체로 상온에서 1시간 동안 반응시켰다. 다음으로 플레이트를 세척하고 100 μl TMB 용액을 넣은 후상온의 암실에서 30분 동안 반응시켰다. 2 N H₂SO₄ 용액 50 μl 를 넣어 반응을 멈춘 후, ELISA 리더에서 OD₄₅₀를 측정하였다. 항체가(antibody titers)는 대조군의 평균 + 2 표준편차(2SD)보다 큰 OD 값을 얻은 마지막 희석 농도로 계산하였다.

그 결과 도 2a에 나타낸 바와 같이, group 1에 속하는 HA 단백질의 경우, 모든 백신접종항체에서 백신주와 항원형이 가까운 H1, H2, H5 HA단백질에 대해 항체가(antibody titer) 1,760 ~ 9,000로 매우 높은 수준의 결합력을 나타내었다. 백신주와 항원형이 비교적 먼 H9 HA 단백질에 대해는 2회 백신접종을 통해 1회 접종보다 3 ~ 10 배 증가된 항체가를 유도하였다. 또한, 백신주와 다른 group 2 에 속하는 H3, H7 HA 단백질에 대해서도 항체가 25 ~ 160의 유의미한 결합력을 나타내었다.

본 발명의 생백신 접종으로 유도된 혈청 항체는 HA group 1 및 2를 모두 아우르는 광범위한 결합 능력을 나타내었으며, 특히 H9, H3, H7 HA에 대해서는 ca-pH1N1 + ca-NCH1N1 백신접종 혈청에서 가장 높은 항체가를 나타내었다. 이로부터 항원성이 멀리 떨어진 HA에 대해서는 프라임-부스트 조합에 따라 항체의 교차결합력이 변화할 수 있음을 알 수 있었다.

다음으로, 백신유도 혈청 IgG 항체의 HA 전체 단백질 및 줄기 부분(stalk region)에 대한 결합력을 분석하기 위하여, 대장균에서 발현시킨 A/Korea/1/09 (pH1N1) 및 PR8 (H1N1) 바이러스 유래 HA 전체 단백질 및 줄기 부분을 사용하여 ELISA를 실시하였다.

그 결과, 도 2b에 나타낸 바와 같이, pH1N1 HA에 대해서는 생백신 1회 접종보다 2회 접종을 통해 항체가가 1.5 ~ 2배로 증가하였고, pH1N1 HA stalk에 대해서는 1회 접종 항체가 192에서 2회 접종 항체가 250 ~ 520으로 현저히 증가하였다. PR8 HA에 대해서는 2회 접종 시 1회 접종보다 항체가가 약 4배로 증가하였고, PR8 HA stalk에 대해서는 1회 접종과 동종생백신주로 추가 접종하는 경우 항체가가 거의 동일한 반면, 이종생백신주로 추가 접종하는 경우 2배 이상 증가하였다. 이로부터 HA 줄기 항체를 유도하기 위해서는 이종생백신 2회 접종이 동종생백신 2회 접종보다 더 효율적임을 알 수 있었다.

이와 같은 결과는 동종생백신 2회 접종 시에는 면역학적으로 우세한 HA머리 항체가 증가하는 반면, HA가 서로 다른 이종생백신 2회 접종 시에는 서로 다른 바이러스 사이에서 보존되어 있는 HA 줄기 부분에 대한 항체가 선택적으로 유도될 수 있음을 시사한다.

실시예 2. 백신유도 항체의 NA 단백질에 대한 교차결합력 분석

백신유도 혈청 IgG항체의 NA에 대한 결합력을 분석하기 위해 곤충세포에서 발현된 6종류 아형의 NA 단백질을 코팅 항원으로 이용한 ELISA를 실시하였다. 실험에 사용된 NA 단백질은 A/California/04/2009(H1N1), A/Aichi/2/1968(H3N2), A/mallard/Ohio/657/2002(H4N6), A/Netherlands/219/2003(H7N7), A/duck/Guangdong/E1/2012(H10N8), 및 A/Anhui/1/2013 (H7N9)에서 유래하였다.

그 결과 도 3에 나타낸 바와 같이, 백신주와 동일한 아형인 N1 단백질에 대해서는 모든 백신혈청에서 항체가 8,320 ~ 25,600로 높은 수준의 결합력을 나타내었다. N6 NA에 대해서 유의미한 항체가는 측정되지 않았으나 N2, N7, N8, N9 NA에 대해서는 일부의 백신접종혈청에서 항체가 30 ~ 180 사이의 유의미한 항체 결합력을 나타내었다. 특히, 모든 NA에 대해서 동종생백신 2회 접종 시 가장 높은 항체결합력을 보여, 상기 실시예 1의 HA 단백질과는 다른 결과를 나타내었다. 이로부터 생백신 접종을 통해 다양한 아형의 NA에 대한 교차반응성을 갖는 항체반응이 유도됨을 알 수 있었다.

실시예 3. 백신유도항체를 매개로 하는 교차방어능력 분석

3-1. 혈청항체의 바이러스 중화 활성 분석

백신유도 항체의 교차 활성이 바이러스의 중화 활성에 영향을 미치는지 확인하기 위하여 마이크로중화시험(microneutralization assay, MN assay) 및 HA 억제 시험(hematogglutinin inhibition assay, HI assay)를 실시하여 중화 항체가를 측정하였다.

구체적으로, MN 분석을 위해, 혈청을 수용체-파괴 효소(receptor-destroying enzyme)로 전처리하여 37℃에서 하룻밤 동안 반응시킨 후 56℃에서 30분간 비활성화시켰다. 다음으로 2배로 연속 희석시킨 혈청 50 μl를 100 TCID₅₀(tissue cell infectious dose 50)의 바이러스와 혼합하였고, 96-웰 플레이트에서 키운 MDCK 세포에 혼합물을 넣어 감염시켰다. 세포병변효과(cytopathic effect, CPE)로 바이러스 감염을 확인하였고, 완전히 CPE를 억제하는 가장 높은 희석 농도로 MN 항체가를 계산하였다.

HI 분석을 위해, 상기와 동일하게 혈청을 수용체-파괴 효소로 전처리하여 37℃에서 하룻밤 동안 반응시킨 후 56℃에서 30분간 비활성화시켰다. 다음으로 2배로 연속 희석시킨 혈청 25 μl를 같은 부피의 4가지 이종 독감 바이러스 HA를 넣고 37℃에서 1시간 동안 반응시킨 후, 1% 닭 적혈구 50 μl를 넣고 4℃에서 1시간 동안 배양하였다. HI 항체가는 적혈구응집반응(hemagglutination)을 완전히 억제하는 가장 높은 희석 배수에 따라 계산하였다.

그 결과 도4a 및 4b에 나타낸 바와 같이, 백신주와 동종바이러스인 pH1N1에 대한 중화항체가만 측정될 뿐, 4종의 이종독감바이러스에 대해서는 MN, HI 항체가 측정되지 않았다.

3-2. 혈청항체의 항체 의존성 세포 매개 독성(antibody-dependent cell-mediated cytotoxicity , ADCC ) 활성 측정

백신유도 혈청 항체가 바이러스 감염된 MDCK 세포에 대하여 항체 의존성 세포 매개 독성(ADCC)을 나타내는지 여부를 확인하기 위해 ADCC 분석을 하였으며, NK(natural killer) 세포 대신에 마우스에서 적출한 1차 췌장 세포를 사용하였다.

96-웰 플레이트에서 키운 융합성(confluent) MDCK 세포에 4종의 독감 바이러스로 감염시키고 20 μM Z-VAD-FMK(Promega) 및 판-카스파아제 억제제(pan-caspase inhibitor)가 첨가되고, 트립신이 제외된 MEM 배지에서 배양하였다. 감염 8시간 후 상등액을 제거하고, MDCK 세포에 100 μl 혈청(1:10 희석)을 넣은 후 37℃에서 1시간 동안 반응시켰다. 다음으로 PBC 용해 버퍼(RBC lysis buffer)로 전처리한 100 μl의 마우스 비장 세포 (10⁶ cells)를 각 웰에 넣고 37℃에서 2시간 동안 반응시켰다. MDCK 세포사멸로 인해 세포 외부로 유출된 LDH(lactate dehydrogenase) 단백질의 양을 측정하여 타겟 MDCK 세포의 세포독성을 계산하였다.

그 결과, 도 4c에 나타낸 바와 같이, 모든 백신혈청에서 PR8 바이러스에 감염된 세포를 죽이는 ADCC 활성을 보였으며, 일부 백신 혈청에서는 H5N2, H3N2, H7N1 바이러스 감염된 세포에 대해서 유의미한 ADCC 활성을 나타내었다.

이로부터 비록 백신유도항체가 이종독감바이러스를 직접적으로 중화하는 활성을 갖지는 못하지만 바이러스가 감염된 세포를 제거할 수 있는 ADCC 활성을 통해 교차방어에 기여하고 있음을 알 수 있었다. 생백신유도 항체의 ADCC 활성 분석은 이전 연구(JVI, 2012)에서는 확인하지 않은 새로운 결과로서 생백신에 의해 유도된 비중화 항체가 ADCC 활성을 통해 이종독감바이러스에 감염된 세포를 제거할 수 있음을 보여준다.

실시예 4. 이종 독감 바이러스 공격 접종에 대한 교차방어 능력

마우스를 5개 그룹으로 나누고, 백신 비접종 또는 접종 그룹에 4종의 이종 독감 바이러스를 공격 접종한 후 마우스의 몸무게와 생존률 변화를 통해 백신의 방어 효능을 평가하였다.

그 결과, 백신 비접종 마우스는 4종의 바이러스 감염 후 급속한 몸무게 감소를 보이며 8일만에 100% 사망률을 나타내었다(도 5a). 반면, 생백신을 접종한 마우스들은 모두 생존하였다(도 5b-e).

구체적으로, 생백신 1회 접종 시 PR8(H1N1), Phil82(H3N2) 감염에 대해 1% 이내의 몸무게 감소가 나타났으며, MA81(H5N2), reNet03(H7N1) 감염에 대해서는 5 ~ 8% 몸무게 감소를 나타내었다(도 5b). 동종생백신으로 추가접종 시 PR8(H1N1), Phil82(H3N2), reNet03(H7N1) 감염에 대해 1회 접종과 비슷한 수준의 몸무게 감소를 보인 반면, MA81(H5N2) 바이러스 감염에 대해서는 12.9% 몸무게 감소를 보여 오히려 생백신1회 접종 시보다 몸무게가 2배 정도 더 감소하였다(도 5c). 그러나 이러한 현상은 이종생백신을 이용한 추가접종을 통해 몸무게 감소 없이 완벽한 방어 효과를 확인할 수 있었다. ca-NCH1N1로 추가 접종한 경우는 MA81(H5N2) 바이러스에 감염에 대해 5% 몸무게 감소를 보여 생백신1회 접종 시와 몸무게 감소는 비슷하였으나 회복속도는 더 빨라졌다(도 5d). ca-IDH5N1으로 추가 접종 시에는4종의 이종 독감 바이러스 감염에 대해 몸무게 감소 전혀 없이 완벽한 방어능력을 보여 가장 우수한 교차방어능력을 나타내었다(도 5e).

이로부터 1) 생백신 1회 접종으로도 HA group 1, 2의 바이러스를 모두 방어할 수 있으나, 2) 1회 접종과 비교하여 이종생백신 2회 접종을 통해 이종독감바이러스에 대한 교차방어의 효능과 범위를 현저히 개선할 수 있다는 점을 알 수 있었다.

예를 들어, 공격 접종으로 reNet03(H7N1) 바이러스를 사용하였을 때, 생백신 1회 접종 시 8%의 몸무게 감소를 나타낸 반면, ca-NCH1N1 추가 접종 시에는 2%로, ca-IDH5N1 추가 접종 시에는 1%로 각각 방어효능이 증가하였다. 몸무게 감소치를 방어효능으로 보았을 때 이는 각각 400%와 800%의 방어효능 증가효과로 정량화할 수 있다. 한편, MA81(H5N2) 바이러스의 경우 생백신1회 접종 시 5% 몸무게 감소가 관찰되었으나, 이종의 ca-IDH5N1 추가접종 시 무게 감소가 전혀 나타나지 않았고(0%), 이는 방어 효능이 500% 이상 현저하게 증가한 것으로 볼 수 있다.

상기 공격접종 후 마우스 몸무게 최대 감소량을 요약하여 도 6에 나타내었다. H5N2, H7N1 바이러스 공격접종에 대해 동종생백신 2회 접종 시 1회 접종보다 몸무게 감소량이 증가되는 병적 현상이 있음을 알 수 있었다. 그러나 이와 같은 현상은 이종백신으로 추가 접종하는 방법을 통하여 크게 개선되었으며 이는 4종의 다른 공격접종(PR8(H1N1), MA81(H5N2), Phil82(H3N2) 및 reNet03(H7N1))에서 모두 증명되었다. 구체적으로, 몸무게 감소(%)를 상대 비교할 때 PR8(H1N1) 경우 200 ~ 400%; MA81(H5N2)의 경우 250% 이상; Phil82(H3N2)의 경우 200%이상; reNet03(H7N1)의 경우 400 ~ 800%이상 방어 효능이 증가한 것을 알 수 있었다.

또한, 백신비접종 및 접종 마우스(n = 5)에 4종의 이종 독감 바이러스를 공격 접종하고 6일 후, 마우스의 폐를 채취하여 폐 조직 내 바이러스 역가(titer)를 측정하였다. 그 결과 도 7에 나타낸 바와 같이, 모든 백신접종 그룹에서 비접종 그룹보다 100배 이상의 바이러스 역가 감소를 나타내었다. 1회 단일접종 대비 이종백신으로 추가접종 시 4종의 다른 바이러스 모두에 대해 약 10배 ~ 50배 정도의 바이러스 역가 감소 효과를 나타내었다. 또한, H7N1, H5N2 바이러스에 대해 동종생백신 2회 접종이 1회 접종보다 바이러스 역가가 높아지는 현상은 마우스 몸무게 변화 결과(도 6)와 일치되는 결과이다. 따라서 이로부터 다양한 독감 바이러스에 대한 교차방어에는 이종생백신 2회 접종이 가장 효과적인 것을 알 수 있었다.

실시예 5. 바이러스 감염 후 메모리 CTL 활성 분석

A형 독감 바이러스 사이에서 보존되어 있는 NP_147-155(TYQRTRALV) 에피토프(epitope)를 인식하는 메모리 CTL(cytotoxic T-lymphocyte) 활성 분석을 수행하였다. 구체적으로, 생백신 2회 접종 후 한 달이 지난 다음 PR8(H1N1) 또는 Phil82 (H3N2)로 공격 접종을 하였다. 공격 접종일로부터 0일(공격접종 전), 2, 4, 6일째에 마우스 혈액을 채취하고, 6일째에 폐 조직을 채취한 후 유세포분석(flow cytometric analysis)을 통해 CD8+ CTL 빈도를 측정하였다(도 8a).

그 결과 바이러스 감염 후 혈액에서는 백신비접종 그룹 대비 백신접종 그룹에서 유의미한 CTL 증가는 나타나지 않았다(도 8b, c). 그러나 폐에서는 H1N1 바이러스 감염 후 백신접종 그룹에서 백신비접종 컨트롤 대비 7 ~ 10배 증가하였다(도 8d). H3N2 바이러스 감염 후에도 CTL빈도가 증가하였으나 통계적 유의성은 없었다(도 8e). 한편, H3N2 바이러스 감염 후에는 IFN-γ를 분비하는 CTL이 백신접종 그룹에서 대조군 대비 2 ~ 4배 증가하는 것으로 나타났고, 이로부터 NP_147-155 에피토프 외에 다른 에피토프를 인식하는 CTL이 증가함을 알 수 있었다(도 8f). IFN-γ를 분비하는 CTL의 증가는 생백신 1회 접종(9.4%) < 동종생백신 2회 접종(18%) < 이종생백신 2회 접종(29~33%) 순으로 증가하여 이종 독감 바이러스에 대한 T세포면역반응의 유도에도 이종생백신2회 접종이 매우 효과적임을 알 수 있었다.

실시예 6. T 세포 및 NK 세포의 교차 방어 기여도 분석

백신 접종 마우스에 고갈성 항체를 투여하여 CD4+ T 세포, CD8+ T세포 및 NK 세포를 고갈시킨 후 PR8(H1N1) 또는 Phil82(H3N2) 바이러스를 감염시켰다(도 9a). 구체적으로, CD4+ T 세포 및 CD8+ T 세포 고갈을 위해 200 μg 의 항-CD8 mAb(clone 2.43; BioXcell) 및 항-CD4 mAb(clone GK1.5; BioXcell)을 마우스 복강내 4회(공격 접종 1, 3, 5, 7일 전) 투여하였다. 대조군 마우스에는 동형 항체(isotype control rat IgG2b antibodies(clone LTF-2, BioXcell))를 투여하였다. 마지막 항체 주입으로부터 24시간 후 마우스의 혈액과 폐를 채취하고 유세포 분석을 통해 T 세포 고갈을 확인하였다. 유세포분석에는 항-CD8 mAb(clone 53-6.7; Biolegend) 및 항-CD4 mAb(clone RM4-5; Biolegend)를 사용하였다. NK 세포 고갈을 위해서는, 20 μl의 항-asialo GM1 antiserum(Wako Pure Chemical Industries)을 같은 방법으로 마우스에 주입하였다. 대조군 마우스에는 정상 토끼 혈청(Wako Pure Chemical Industries)을 투여하였다. 마지막 항체 주입으로부터 24시간 후에 췌장을 채취하고 항-CD3 mAb(clone 17A2; Biolegend) 및 항-CD49b mAb(clone DX5; Biolegend)를 이용하여 유세포분석을 함으로써 NK 세포 고갈을 확인하였다.

먼저, 생백신 1회 접종 그룹의 H1N1 바이러스 감염 후, 대조군(non-depleted) 마우스에서는 몸무게 감소가 거의 보이지 않았으나, CD8+T 세포 부재 시에는 약 11% 몸무게 감소를 나타내었다. CD8+T 세포, CD4+T 세포가 모두 없을 때는 약 13% 몸무게 감소와 20% 사망률을 보이고 생존 마우스들의 몸무게 회복이 느려져 CD8+T 세포와 CD4+T 세포가 모두 교차방어에 기여하고 있음을 알 수 있었다. NK 세포 부재 시에는 CD8+T 세포 부재 시와 비슷한 수준의 몸무게 감소를 보이며, 모든 T 세포 및 NK 세포가 없을 때 20% 몸무게 감소와 60% 사망률을 보여 NK 세포 또한 교차방어에 기여함을 알 수 있었다(도 9c). 이종생백신 2회 접종 그룹에서 T 세포, NK 세포 모두 없을 때는 H1N1 바이러스 감염 후 10% 몸무게 감소와 20% 사망률을 나타내었다(도 9d). 생백신 1회 접종 마우스에서 T 세포 및 NK 세포 모두 부재 시 H3N2 바이러스 감염 후 10% 몸무게 감소와 20% 사망률 나타내었다(도 9e). 이종생백신 2회 접종시에는 T 세포 및 NK 세포 모두 부재에도 불구하고 H3N2 바이러스 감염 후 몸무게 감소가 전혀 나타나지 않았다(도 9f).

이 결과를 통해, T 세포 및 NK 세포가 각각 교차방어에 기여하고 있으며, 이 외에도 다른 기작이 교차방어에 기여하고 있음을 알 수 있었다. NK 세포 및 T 세포 부재 시에도 생백신 1회 접종보다 2회 접종에 의해서 방어 효능이 더 증가한 결과로부터 백신접종에 의해 유도되는 항체를 매개로 하는 별도의 교차방어 기작이 존재함을 알 수 있었다.

실시예 7. 백신 안전성 검증

비중화항체에 의한 이종 독감 바이러스 감염성 증가 현상이 발생하는지 여부를 조사하기 위해 혈청과 바이러스 혼합액을 MDCK 및 RAW264.7 세포에 감염시킨 후 NP-based ELISA를 통해 바이러스 감염 정도를 측정하였다.

그 결과, 두 세포 주에서 모두 백신유도 항체는 백신주와 동종 바이러스인pH1N1 바이러스의 복제를 효과적으로 억제하였으며, 4종의 이종 독감 바이러스의 증식도 50 ~ 85% 억제하였으나, 이들 바이러스의 감염성을 백신비접종 항체보다 증가시키지는 않았다. 이 결과는 종래 HA 줄기 기반의 백신에서 나타나는 감염성 증가 현상이 본 발명의 백신에서는 발생하지 않음을 나타낸다(도 10a, b).

또한, 이종 생백신간 면역간섭효과로 인한 항체반응 저해현상 발생 여부를 확인하기 위해 2차 백신주로 사용된 생백신을 1회 접종한 후 이들의 중화항체가와 생백신 2회 접종 후 중화항체가를 비교하였다.

그 결과, 두 실험 조건 사이의 MN, HI 항체가가 서로 유사하게 나타났으며, 이를 통해 이종생백신의 2회 접종 시 면역간섭에 의한 항체반응 저해는 발생하지 않음을 알 수 있었다(도 10c). 이는 본 연구에서 사용한 백신과 이를 기반으로 하는 이종백신 추가접종 방법이 매우 안전함을 의미하는 것이다.

<110> Industry-Academic Cooperation Foundation, Yonsei University <120> Universal influenza vaccine using cold-adapted live-attenuated vaccine <130> 1063926 <160> 12 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 2295 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> DQ874873 (X-31 ca PB2) <400> 1 ttcaatatgg aaagaataaa agaactacga aatctaatgt cgcagtctcg cacccgcgag 60 atactcacaa aaaccaccgt ggaccatatg gccataatca agaagtacac atcaggaaga 120 caggagaaga acccagcact taggatgaaa tggatgatgg caatgaaata tccaattaca 180 gcagacaaga ggataacgga aatgattcct gagagaaatg agcaaggaca aactttatgg 240 agtaaaatga atgatgccgg atcagaccga gtgatggtat cacctctggc tgtgacatgg 300 tggaatagga atggaccaat aacaaataca gttcagtatc caaaaatcta caaaacttat 360 tttgaaagag tcgaaaggct aaagcatgga acctttggcc ctgtccattt tagaaaccaa 420 gtcaaaatac gtcggagagt tgacataaat cctggtcatg cagatctcag tgccaaggag 480 gcacaggatg taatcatgga agttgttttc cctaacgaag tgggagccag gatactaaca 540 tcggaatcgc aactaacgat aaccaaagag aagaaagaag aactccagga ttgcaaaatt 600 tctcctttga 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tggaaaatgt 960 ccaaaatatg taaaaagcac aaaattgaga ctggccacag gattgaggaa tgtcccgtct 1020 attcaatcta gaggcctatt tggggccatt gccggtttca ttgaaggggg gtggacaggg 1080 atggtagatg gatggtacgg ttatcaccat caaaatgagc aggggtcagg atatgcagcc 1140 gacctgaaga gcacacagaa tgccattgac gagattacta acaaagtaaa ttctgttatt 1200 gaaaagatga atacacagtt cacagcagta ggtaaagagt tcaaccacct ggaaaaaaga 1260 atagagaatt taaataaaaa agttgatgat ggtttcctgg acatttggac ttacaatgcc 1320 gaactgttgg ttctattgga aaatgaaaga actttggact accacgattc aaatgtgaag 1380 aacttatatg aaaaggtaag aagccagcta aaaaacaatg ccaaggaaat tggaaacggc 1440 tgctttgaat tttaccacaa atgcgataac acgtgcatgg aaagtgtcaa aaatgggact 1500 tatgactacc caaaatactc agaggaagca aaattaaaca gagaagaaat agatggggta 1560 aagctggaat caacaaggat ttaccagatt ttggcgatct attcaactgt cgccagttca 1620 ttggtactgg tagtctccct gggggcaatc agtttctgga tgtgctctaa tgggtctcta 1680 cagtgtagga tatgtattta a 1701 <210> 8 <211> 1410 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> GQ132185 (NA of A/Korea/1/09 (H1N1)) <400> 8 atgaatccaa accaaaagat aataaccatt ggttcggtct gtatgacaat tggaatggct 60 aacttaatat tacaaattgg aaacataatc tcaatatgga ttagccactc aattcaactt 120 gggaatcaaa atcagattga aacatgcaat caaagcgtca ttacttatga aaacaacact 180 tgggtaaatc agacatatgt taacatcagc aacaccaact ttgctgctgg acagtcagtg 240 gtttccgtga aattagcggg caattcctct ctctgccctg ttagtggatg ggctatatac 300 agtaaagaca acagtataag aatcggttcc aagggggatg tgtttgtcat aagggaacca 360 ttcatatcat gctccccctt ggaatgcaga accttcttct tgactcaagg ggccttgcta 420 aatgacaaac attccaatgg aaccattaaa gacaggagcc catatcgaac cctaatgagc 480 tgtcctattg gtgaagttcc ctctccatac aactcaagat ttgagtcagt cgcttggtca 540 gcaagtgctt gtcatgatgg catcaattgg ctaacaattg gaatttctgg cccagacaat 600 ggggcagtgg ctgtgttaaa gtacaacgga ataataacag acactatcaa gagttggaga 660 aacaatatat tgagaacaca agagtctgaa tgtgcatgtg taaatggttc ttgctttact 720 gtaatgaccg atggaccaag taatggacag gcctcataca agatcttcag aatagaaaag 780 ggaaagatag tcaaatcagt cgaaatgaat gcccctaatt atcactatga ggaatgctcc 840 tgttatcctg attctagtga aatcacatgt gtgtgcaggg ataactggca tggctcgaat 900 cgaccgtggg tgtctttcaa ccagaatctg gaatatcaga taggatacat atgccgtggg 960 attttcggag acaatccacg ccctaatgat aagacaggca gttgtggtcc agtatcgtct 1020 aatggagcaa atggagtaaa aggattttca ttcaaatacg gcaatggtgt ttggataggg 1080 agaactaaaa gcattagttc aagaaacggt tttgagatga tttgggatcc gaacggatgg 1140 actgggacag acaataactt ctcaataaag caagatatcg taggaataaa tgagtggtca 1200 ggatatagcg ggagttttgt tcagcatcca gaactaacag ggctggattg tataagacct 1260 tgcttctggg ttgaactaat cagagggcga cccaaagaga acacaatctg gactagcggg 1320 agcagcatat ccttttgtgg tgtaaacagt gacactgtgg gttggtcttg gccagacggt 1380 gctgagttgc catttaccat tgacaagtaa 1410 <210> 9 <211> 1775 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CY031336 (HA of A/New Caledonia/20/99 (H1N1)) <400> 9 agcaaaagca ggggaaaata aaaacaacca aaatgaaagc aaaactactg gtcctgttat 60 gtacatttac agctacatat gcagacacaa tatgtatagg ctaccatgcc aacaactcaa 120 ccgacactgt tgacacagta cttgagaaga atgtgacagt gacacactct gtcaacctac 180 ttgaggacag tcacaatgga aaactatgtc tactaaaagg aatagcccca ctacaattgg 240 gtaattgcag cgttgccgga tggatcttag gaaacccaga atgcgaatta ctgatttcca 300 aggaatcatg gtcctacatt gtagaaacac caaatcctga gaatggaaca tgttacccag 360 ggtatttcgc cgactatgag gaactgaggg agcaattgag ttcagtatct tcatttgaga 420 gattcgaaat attccccaaa gaaagctcat ggcccaccca caccgtaacc ggagtatcag 480 catcatgctc ccataatggg aaaagcagtt tttacagaaa tttgctatgg ctgacgggga 540 agaatggttt gtacccaaac ctgagcaagt cctatgtaaa caacaaagag aaagaagtcc 600 ttgtactatg gggtgttcat cacccgccta acatagggga ccaaagggcc ctctatcata 660 cagaaaatgc ttatgtctct gtagtgtctt cacattatag cagaagattc accccagaaa 720 tagccaaaag acccaaagta agagatcagg aaggaagaat caactactac tggactctgc 780 tggaacctgg ggatacaata atatttgagg caaatggaaa tctaatagcg ccatggtatg 840 cttttgcact gagtagaggc tttggatcag gaatcatcac ctcaaatgca ccaatggatg 900 aatgtgatgc gaagtgtcaa acacctcagg gagctataaa cagcagtctt cctttccaga 960 atgtacaccc agtcacaata ggagagtgtc caaagtatgt caggagtgca aaattaagga 1020 tggttacagg actaaggaac atcccatcca ttcaatccag aggtttgttt ggagccattg 1080 ccggtttcat tgaagggggg tggactggaa tggtagatgg gtggtatggt tatcatcatc 1140 agaatgagca aggatctggc tatgctgcag atcaaaaaag tacacaaaat gccattaacg 1200 ggattacaaa caaggtgaat tctgtaattg agaaaatgaa cactcaattc acagctgtgg 1260 gcaaagaatt caacaaattg gaaagaagga tggaaaactt aaataaaaaa gttgatgatg 1320 ggtttctaga catttggaca tataatgcag aattgttggt tctactggaa aatgaaagga 1380 ctttggattt ccatgactcc aatgtgaaga atctgtatga gaaagtaaaa agccaattaa 1440 agaataatgc caaagaaata ggaaacgggt gttttgaatt ctatcacaag tgtaacaatg 1500 aatgcatgga gagtgtgaaa aatggaactt atgactatcc aaaatattcc gaagaatcaa 1560 agttaaacag ggagaaaatt gatggagtga aattggaatc aatgggagtc tatcagattc 1620 tggcgatcta ctcaactgtc gccagttccc tggttctttt ggtctccctg ggggcaatca 1680 gcttctggat gtgttccaat gggtctttgc agtgtagaat atgcatctga gaccagaatt 1740 tcagaaatat aagaaaaaac acccttgttt ctact 1775 <210> 10 <211> 1414 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CY033624 (NA of A/New Caledonia/20/99 (H1N1)) <400> 10 aatgaatcca aatcaaaaaa taataaccat tggatcaatc agtatagcaa tcggaataat 60 tagtctaatg ttgcaaatag gaaatattat ttcaatatgg gctagtcact caatccaaac 120 tggaagtcaa aaccacactg gagtatgcaa ccaaagaatc atcacatatg aaaacagcac 180 ctgggtgaat cacacatatg ttaatattaa caacactaat gttgttgctg gaaaggacaa 240 aacttcagtg acattggccg gcaattcatc tctttgttct atcagtggat gggctatata 300 cacaaaagac aacagcataa gaattggctc caaaggagat gtttttgtca taagagaacc 360 tttcatatca tgttctcact tggaatgcag aacctttttt ctgacccaag gtgctctatt 420 aaatgacaaa cattcaaatg ggaccgttaa ggacagaagt ccttataggg ccttaatgag 480 ctgtcctcta ggtgaagctc cgtccccata caattcaaag tttgaatcag ttgcatggtc 540 agcaagcgca tgccatgatg gcatgggctg gttaacaatc ggaatttctg gtccagacaa 600 tggagctgtg gctgtactaa aatacaacgg cataataact gaaaccataa aaagttggaa 660 aaagcgaata ttaagaacac aagagtctga atgtgtctgt gtgaacgggt catgtttcac 720 cataatgacc gatggcccga gtaatggggc cgcctcgtac aaaatcttca agatcgaaaa 780 ggggaaggtt actaaatcaa tagagttgaa tgcacccaat tttcattatg aggaatgttc 840 ctgttaccca gacactggca cagtgatgtg tgtatgcagg gacaactggc atggttcaaa 900 tcgaccttgg gtgtctttta atcaaaacct ggattatcaa ataggataca tctgcagtgg 960 ggtgttcggt gacaatccgc gtcccaaaga tggagagggc agctgtaatc cagtgactgt 1020 tgatggagca gacggagtaa aggggttttc atacaaatat ggtaatggtg tttggatagg 1080 aaggactaaa agtaacagac ttagaaaggg gtttgagatg atttgggatc ctaatggatg 1140 gacagatacc gacagtgatt tctcagtgaa acaggatgtt gtggcaataa ctgattggtc 1200 agggtacagc ggaagtttcg ttcaacatcc tgagttaaca ggattggact gtataagacc 1260 ttgcttctgg gttgagttag tcagaggact gcctagagaa aatacaacaa tctggactag 1320 tgggagcagc atttcttttt gtggcgtaaa tagtgatact gcaaactggt cttggccaga 1380 cggtgctgag ttgccgttca ccattgacaa gtag 1414 <210> 11 <211> 1779 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CY116646 (HA of A/Indonesia/5/05 (H5N1)) <400> 11 agcaaaagca ggggttcaat ctgtaaaaat ggagaaaata gtgcttcttc ttgcaatagt 60 cagtcttgtt aaaagtgatc agatttgcat tggttaccat gcaaacaatt caacagagca 120 ggttgacaca atcatggaaa agaacgttac tgttacacat gcccaagaca tactggaaaa 180 gacacacaac gggaagctct gcgatctaga tggagtgaag cctctaattt taagagattg 240 tagtgtagct ggatggctcc tcgggaaccc aatgtgtgac gaattcatca atgtaccgga 300 atggtcttac atagtggaga aggccaatcc aaccaatgac ctctgttacc cagggagttt 360 caacgactat gaagaactga aacacctatt gagcagaata aaccattttg agaaaattca 420 aatcatcccc aaaagttctt ggtccgatca tgaagcctca tcaggagtga gctcagcatg 480 tccatacctg ggaagtccct ccttttttag aaatgtggta tggcttatca aaaagaacag 540 tacataccca acaataaaga aaagctacaa taataccaac caagaagatc ttttggtact 600 gtggggaatt caccatccta atgatgcggc agagcagaca aggctatatc aaaacccaac 660 cacctatatt tccattggga catcaacact aaaccagaga ttggtaccaa aaatagctac 720 tagatccaaa gtaaacgggc aaagtggaag gatggagttc ttctggacaa ttttaaaacc 780 taatgatgca atcaacttcg agagtaatgg aaatttcatt gctccagaat atgcatacaa 840 aattgtcaag aaaggggact cagcaattat gaaaagtgaa ttggaatatg gtaactgcaa 900 caccaagtgt caaactccaa tgggggcgat aaactctagt atgccattcc acaacataca 960 ccctctcacc atcggggaat gccccaaata tgtgaaatca aacagattag tccttgcaac 1020 agggctcaga aatagccctc aaagagagag cagaagaaaa aagagaggac tatttggagc 1080 tatagcaggt tttatagagg gaggatggca gggaatggta gatggttggt atgggtacca 1140 ccatagcaat gagcagggga gtgggtacgc tgcagacaaa gaatccactc aaaaggcaat 1200 agatggagtc accaataaag tcaactcaat cattgacaaa atgaacactc agtttgaggc 1260 cgttggaagg gaatttaata acttagaaag gagaatagag aatttaaaca agaagatgga 1320 agacgggttt ctagatgtct ggacttataa tgccgaactt ctggttctca tggaaaatga 1380 gagaactcta gactttcatg actcaaatgt taagaacctc tacgacaagg tccgactaca 1440 gcttagggat aatgcaaagg agctgggtaa cggttgtttc gagttctatc acaaatgtga 1500 taatgaatgt atggaaagta taagaaacgg aacgtacaac tatccgcagt attcagaaga 1560 agcaagatta aaaagagagg aaataagtgg ggtaaaattg gaatcaatag gaacttacca 1620 aatactgtca atttattcaa cagtggcgag ttccctagca ctggcaatca tgatggctgg 1680 tctatcttta tggatgtgct ccaatggatc gttacaatgc agaatttgca tttaaatttg 1740 tgagttcaga ttgtagttaa aaacaccctt gtttctact 1779 <210> 12 <211> 1398 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CY116648 (NA of A/Indonesia/5/05 (H5N1)) <400> 12 agcaaaagca ggagttcaaa atgaatccaa atcagaagat aataaccatt ggatcaatct 60 gtatggtaat tggaatagtt agcttaatgt tacaaattgg gaacatgatc tcaatatggg 120 tcattcattc aattcagaca gggaatcaac accaagctga atcaatcagc aatactaacc 180 ctcttactga gaaagctgtg gcttcagtaa cattagcggg caattcatct ctttgcccca 240 ttagaggatg ggctgtacac agtaaggaca acaatataag gatcggttcc aagggggatg 300 tgtttgttat tagagagccg ttcatctcat gctcccacct ggaatgcaga actttcttct 360 tgactcaggg agccttgctg aatgacaagc actccaacgg gactgtcaaa gacagaagcc 420 ctcacagaac attaatgagt tgtcctgtgg gtgaggctcc ctctccatat aactcaaggt 480 ttgagtctgt tgcttggtca gcaagtgctt gccatgatgg caccagttgg ttgacaattg 540 gaatttctgg cccagacaat gaggctgtgg ctgtattgaa atacaatggc ataataacag 600 acactatcaa gagttggagg aacgacatac tgagaactca agagtctgaa tgtgcatgtg 660 taaatggctc ttgctttact gtaatgactg atggaccaag taatgggcag gcatcatata 720 agatcttcaa aatggaaaaa ggaaaagtgg tcaaatcagt cgaattggat gctcctaatt 780 atcactatga ggaatgctcc tgttatcctg atgccggcga aatcacatgt gtttgcaggg 840 ataattggca tggctcaaat aggccatggg tatctttcaa tcaaaatttg gagtatcaaa 900 taggatatat atgcagtgga gttttcggag acaatccacg ccccaatgat ggaacaggta 960 gttgtggccc gatgtcccct aacggggcat atggggtaaa agggttttca tttaaatacg 1020 gcaatggtgt ttggatcggg agaaccaaaa gcactaattc caggagcggc tttgaaatga 1080 tttgggatcc aaatgggtgg actggaacgg acagtagctt ttcagtgaaa caagatatag 1140 tagcaataac tgattggtca ggatatagcg ggagttttgt ccagcatcca gaactgacag 1200 gattagattg cataagacct tgtttctggg ttgagttaat cagagggcgg cccaaagaga 1260 gcacaatttg gactagtggg agcagcatat ctttttgtgg tgtaaatagt gacactgtga 1320 gttggtcttg gccagacggt gctgagttgc cattcaccat tgacaagtag tttgttcaaa 1380 aaactccttg tttctact 1398

Claims (20)

1. (a) 서열번호 1 내지 6으로 표시되는 6개의 내부 유전자; A/Korea/1/09(H1N1) 독감 바이러스 유래의 서열번호 7로 표시되는 표면 헤마글루티닌(HA) 유전자; 및 A/Korea/1/09(H1N1) 독감 바이러스 유래의 서열번호 8로 표시되는 표면 뉴라미니다아제(NA) 유전자를 포함하는 독감 생백신을 포함하는 1차 접종용 생백신 조성물; 및
   (b) 서열번호 1 내지 6으로 표시되는 6개의 내부 유전자; A/New Caledonia/20/99(H1N1) 독감 바이러스 유래의 서열번호 9로 표시되는 표면 헤마글루티닌(HA) 유전자; 및 A/New Caledonia/20/99(H1N1) 독감 바이러스 유래의 서열번호 10으로 표시되는 표면 뉴라미니다아제(NA) 유전자를 포함하는 독감 생백신을 포함하는 2차 접종용 생백신 조성물을 포함하고,
   상기 1차 접종용 생백신 및 2차 접종용 생백신은 서로 이종(heterologous)이나, 동종아형(homosubtypic)의 HA 유전자 및 NA 유전자를 포함하는 바이러스를 포함하며,
   H1, H2, H5, H6, H8, H9, H11, H12, H13 및 H16으로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상인 HA 단백질(HA group 1); 및 H3, H4, H7, H10, H14 및 H15로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상인 HA 단백질(HA group 2) 모두에 대해 교차 면역 반응을 형성하는 것을 특징으로 하는
   유니버설 독감 생백신 조성물.
   
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9. 제1항에 있어서,
   상기 독감 생백신은 저온 적응된 약독화 형질을 나타내는 것을 특징으로 하는
   유니버설 독감 생백신 조성물.
   
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12. 제1항에 있어서,
    상기 조성물은 서로 다른 아형(subtype)의 NA 단백질에 대해 교차 면역 반응을 형성하는 것을 특징으로 하는
    유니버설 독감 생백신 조성물.
    
13. 제1항에 있어서,
    상기 조성물은 이종 독감 바이러스에 대해 교차 면역 반응을 형성하는 것을 특징으로 하는
    유니버설 독감 생백신 조성물.
    
14. (a) 서열번호 1 내지 6으로 표시되는 6개의 내부 유전자; A/Korea/1/09(H1N1) 독감 바이러스 유래의 서열번호 7로 표시되는 표면 헤마글루티닌(HA) 유전자; 및 A/Korea/1/09(H1N1) 독감 바이러스 유래의 서열번호 8로 표시되는 표면 뉴라미니다아제(NA) 유전자를 포함하는 독감 생백신을 포함하는 1차 접종용 생백신 조성물을 인간을 제외한 동물에 1차 투여하는 단계; 및
    (b) 서열번호 1 내지 6으로 표시되는 6개의 내부 유전자; A/New Caledonia/20/99(H1N1) 독감 바이러스 유래의 서열번호 9로 표시되는 표면 헤마글루티닌(HA) 유전자; 및 A/New Caledonia/20/99(H1N1) 독감 바이러스 유래의 서열번호 10으로 표시되는 표면 뉴라미니다아제(NA) 유전자를 포함하는 독감 생백신을 포함하는 2차 접종용 생백신 조성물을 인간을 제외한 동물에 2차 투여하는 단계를 포함하고,
    상기 1차 접종용 생백신 및 2차 접종용 생백신은 서로 이종(heterologous)이나, 동종아형(homosubtypic)의 HA 유전자 및 NA 유전자를 포함하는 바이러스를 포함하며,
    H1, H2, H5, H6, H8, H9, H11, H12, H13 및 H16으로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상인 HA 단백질(HA group 1); 및 H3, H4, H7, H10, H14 및 H15로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상인 HA 단백질(HA group 2) 모두에 대해 교차 면역 반응을 형성하는 것을 특징으로 하는
    이종 독감 바이러스 예방 접종 방법.
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