KR102107332B1 - CRISPR/Cas9 기반 Bacillus subtillis 유전체 편집 메커니즘을 이용한 콜레라 백신 - Google Patents

Abstract

본 출원은 콜레라의 예방 또는/및 치료를 위한 조성물, 백신 제조방법, 치료방법에 관한 것이다.

Description

CRISPR/Cas9 기반 Bacillus subtillis 유전체 편집 메커니즘을 이용한 콜레라 백신{Cholera vaccine using CRISPR/Cas9 based Bacillus subtillis genome editing mechanism}

본 출원은 인간을 대상으로 하는 항원성 물질, CRISPR/Cas9 시스템 및 이를 포함한 콜레라 백신 조성물에 관한 것이다.

본 출원은 인간을 대상으로 하는 항원성 물질, CRISPR/Cas9 시스템 및 이를 포함한 콜레라 백신 제조방법에 관한 것이다.

본 출원은 콜레라를 치료하는 치료방법에 관한 것이다.

백신은 질병 예방 또는/및 치료를 위해 조치할 수 있는 가장 중요한 수단 중 하나이다.

현재까지 여러 질병들에 대한 다양한 백신이 개발되어 왔음에도 불구하고 질병을 일으키는 원인체의 변이가 일어날 경우 개발되어 있는 백신만으로는 치료 또는/및 예방이 불가능하다.

이와 같이, 질병을 일으키는 원인체의 변이에도 신속하게 대응할 수 있는 백신의 개발은 필요하다.

본 출원의 일 과제는, 항원성물질, CRISPR/Cas9 시스템 및 이를 포함한 콜레라 백신 조성물을 제공하는 것을 목적으로 한다.

본 출원의 다른 과제는, 콜레라를 일으키는 원인체에 대한 백신 및 이의 제조 방법을 제공하는 것을 목적으로 한다.

본 출원의 또 다른 과제는, 콜레라를 예방 또는/및 치료하기 위한 용도를 제공하는 것을 목적으로 한다.

전술한 본 출원의 과제를 해결하기 위하여, 본 출원의 일 양태에 의하면, i) 박테리아 유래 포자; 이 때, 상기 박테리아 유래 포자는 지노믹 DNA에 항원성 물질을 코딩하는 서열을 가지고 있는 포자이며,

ii) 상기 박테리아 포자의 표면에 존재하는 포자 코트 단백질,

iii) 상기 포자 코트 단백질에 연결된 콜레라 항원성 물질

을 포함하는 콜레라 예방 또는 치료용 백신 조성물이 제공된다.

또한, 본 출원은 콜레라 항원성 물질이 ctxA, ctxB, 및 tcpA인 것을 특징으로 하는 콜레라 예방 또는 치료용 백신 조성물을 제공한다.

또한, 본 출원은 콜레라 항원성 물질의 농도가 조성물 기준으로 10¹² ~10¹⁴개/ml 농도인 것을 특징으로 하는 콜레라 예방 또는 치료용 백신 조성물을 제공한다.

또한, 전술한 본 출원의 과제를 해결하기 위하여, 본 출원의 일 양태에 의하면, i) 박테리아의 지노믹 DNA(genomic DNA)에 CRISPR/Cas9을 이용하여 항원성 물질을 넉인(Knock-in) 시키는 단계;

ii) 상기 박테리아의 포자를 형성시키는 단계; 및

iii) 상기 박테리아의 포자 표면에 항원성 물질을 발현시키는 단계;

를 포함하는 것을 특징으로 하는 콜레라 예방 또는 치료용 백신 제조방법이 제공된다.

본 출원에 따르면 다음과 같은 효과가 발생된다.

첫째, 본 출원에 의하면, 콜레라의 예방 또는/및 치료할 수 있는 조성물을 제공할 수 있게 된다. 특히, 항원성물질, CRISPR/Cas9 시스템 및 이를 포함한 콜레라의 예방 또는/및 치료 조성물을 제공할 수 있게 된다.

둘째, 본 출원에 의해 제공되는 조성물을 이용함으로써, 콜레라 질병을 일으키는 원인체에 변이가 발생했을 때 신속하게 대응할 수 있는 효과를 제공할 수 있게 된다.

도 1은 pHCas9 벡터를 도시한 도면이다.
도 2는 B. subtilis Coat protein (CotG)의 가이드 RNA 그리고 promoter를 포함하는 CotG CDS 를 포함하는 pJB 벡터를 도시한 도면이다.
도 3은 B. subtilis Coat protein (CotG)의 가이드 RNA 그리고 promoter를 포함하는 CotG CDS와 GFP를 포함하는 pJB-GFP 벡터를 도시한 도면이다.
도 4는 B. subtilis Coat protein (CotG)의 가이드 RNA 그리고 promoter를 포함하는 CotG CDS와 CtxA를 포함하는 pJB001 벡터를 도시한 도면이다.
도 5는 B. subtilis Coat protein (CotG)의 가이드 RNA 그리고 promoter를 포함하는 CotG CDS와 CtxB를 포함하는 pJB002 벡터를 도시한 도면이다.
도 6은 B. subtilis Coat protein (CotG)의 가이드 RNA 그리고 promoter를 포함하는 CotG CDS와 TcpA를 포함하는 pJB003 벡터를 도시한 도면이다.
도 7은 항생제 저항성유전자의 결손을 위해 ampicillin 저항성 유전자를 목적으로 하는 가이드 RNA를 포함하는 pJB-sg02 벡터를 도시한 도면이다.
도 8은 항생제 저항성유전자의 결손을 위해 neomycin 저항성 유전자를 목적으로 하는 가이드 RNA를 포함하는 pJB-sg03 벡터를 도시한 도면이다.
도 9는 B. subtilis의 포자 표면에 GFP가 발현되는지 확인하기 위해 수행한 PCR 분석 결과를 나타낸 도면이다.
도 10는 B. subtilis의 포자 표면에 GFP가 발현되는지 확인하기 위해 수행한 FACS 분석 결과를 나타낸 도면이다.
도 11은 B. subtilis의 포자 표면에 CtxA, CtxB, TcpA가 발현되는지 확인하기 위해 수행한 PCR 분석 결과를 나타낸 도면이다
도 12는 항원 특이적 항체 형성여부를 확인한 ELISA 결과를 나타낸 도면이다.
도 13은 항원 특이적 항체 형성여부를 확인한 Western blot 결과를 나타낸 도면이다.

본 출원에 의해 개시되는 기술에서 사용되는 용어 또는 실시는 달리 정의되지 않는 한, 당업계의 기술 내에 있는 미생물학, 바이러스학, 세균학, 유전학, 면역학, 생화학, 분자 생물학, 미생물학, 세포 생물학, 유전체학 및 통상의 기술 등을 사용하는 당업자에 의해 통상적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 가진다.

1. 백신(vaccine)

본 출원의 일 태양은 백신에 관한 것이다.

"백신(vaccine)"은 질병에 대한 방어 면역을 생성하는 물질을 지칭한다. 상기 방어 면역은 바이러스, 세균, 기생충 등의 병원체를 특이적으로 인식하는 항체나 T세포(T cell)로 생체에서 병원체를 배제하는 모두 포함할 수 있으나, 이에 한정하지는 않는다. 상기 백신은 사백신(killed vaccine), 생백신(attenuated vaccine), 독소백신(toxoid vaccine), 조각백신(subnunit vaccine), 결합백신(conjugated vaccine) 등 통상의 백신은 모두 포함할 수 있으며, 이에 한정하지는 않는다. 용어 "백신" 또는 "예방주사"는 상호교환 가능하게 사용된다. 병을 예방하기 위해 상기 예방주사를 맞는 것을 예방접종이라고 한다.

상기 백신의 대상은 인간, 돼지, 닭, 개 등일 수 있으나, 이에 제한하지 않는다.

예를 들어, 본 출원에서 백신의 대상은 인간일 수 있다.

1-1. 포자

상기 백신은 포자를 포함할 수 있다.

상기 포자는 자연 상태의 포자 및 그 변형물을 포함할 수 있다.

예를 들어, 포자는 식물, 효모, 진균, 박테리아 등의 포자일 수 있다.

상기 박테리아의 포자에서 박테리아는 Clostridium 속, Streptococcus 속, Bacillus 속 등일 수 있으나, 이에 한정하지는 않는다.

상기 Clostridium 속은 예를 들어, C. difficile, C. botulinum, C. perfringens 등 일 수 있으나 이에 한정하지는 않는다.

상기 Bacillus 속은 예를 들어, B. subtilis, B. anthrasis, B. thuringiensis, B. cereus 등 일 수 있으나 이에 한정하지는 않는다.

예를 들어, 본 출원은 B. subtilis의 포자를 포함한 백신일 수 있다.

상기 박테리아는 GRAS(generally recognized as safe)로 인정되고 있는 예를 들어, B. subtilis 등의 박테리아를 포함할 수 있다.

특히, 본 출원이 포자를 포함한 백신일 경우, GRAS로 인정되는 박테리아라면 모두 사용할 수 있다.

상기 포자는 식물, 효모, 진균, 박테리아 등의 외부에 형성되는 외생포자(exospore) 및 내부에 형성되는 내생포자(endospore)를 포함할 수 있다.

예를 들어, 본 출원은 내생포자를 포함한 백신일 수 있다.

상기 외생포자는 포자가 포자낭 밖에서 만들어져서 그대로 분리되어 나오는 것으로, 포자의 생식기능에 관여하는 포자를 지칭한다.

상기 내생포자는 포자의 내부(구체적으로, 세포 안)에 형성하는 포자를 지칭하며, 대사활동이 거의 없으며 생존이 어려운 조건이 오면 일시적으로 형성되는 포자를 지칭한다.

예를 들어, 본 출원은 B. subtilis의 내생포자를 포함한 백신일 수 있다.

상기 내생포자가 형성되는 조건은 영양분이 고갈된 영양학적 조건, 고온 또는 저온의 온도적 조건, 고수분 또는 저수분의 수분적 조건, 살균제, 보존제 등의 화학적 조건, 산성 또는 알칼리성의 pH적 조건 등에서 형성될 수 있으나, 이에 한정하지는 않는다.

이와 같이 내생포자는 생존이 어려운 조건에서 형성될 수 있기 때문에, 다양한 환경에서 오랫동안 살아남을 수 있다. 즉, 내생포자는 열, 건조, 독성 화학물질, 영양분 고갈, 자외선 조사 등과 같은 해로운 조건에 엄청난 저항성을 가질 수 있다.

상기 포자는 포자외부단백질을 포함할 수 있으며, 예를 들어 상기 포자외부단백질은 spore exosporium protein, spore coat protein, transmembrane protein, spore appendage protein, spore associated enzyme 등 일 수 있다.

예를 들어, 본 출원은 동일한 속의 미생물들의 포자 간에는 서로의 포자외부단백질을 사용할 수 있다.

상기 spore exosporium protein은 예를 들어, BclA, InhA 등 일 수 있다.

상기 포자 코트단백질(coat protein)은 예를 들어, CotA, CotB, CotC, CotD, CotE, CotF, CotG, CotN, CotS, CotT, CotV, CotW, CotX, CotY, CotZ, CotH, CotJA, CotJC, CotK, CotL, CotM 등 일 수 있다.

상기 transmembrane protein은 예를 들어, prkC, OppA 등 일 수 있다.

상기 spore appendage protein은 예를 들어, P29a, P29b, P85 등 일 수 있다.

상기 spore associated enzyme은 예를 들어, CotA(laccase), oxdD(oxalate decarboxylase), CotQ(reticuline oxidase-like protein), tgI(transglutaminase)등 일 수 있다.

상기 포자는 소수성(hydrophobic)을 지니고 있을 수 있다. 이 때 포자 전체 또는 일부에서 소수성을 지니고 있을 수 있다.

상기 포자는 포자 시스템의 구성요소일 수 있다.

상기 백신은 포자 시스템을 포함할 수 있다.

상기 포자 시스템은 시스템 구조체가 포자이거나 포자, 항원성 물질 및 부가 물질을 포함한 시스템 모두를 지칭한다.

상기 부가 물질은 백신의 효능을 더 증진시킬 수 있는 물질 모두를 지칭한다. 예를 들어, 알루미늄 겔 입자(알루미늄염), 광유(mineral oil)를 주성분으로 함유하는 오일 어쥬번트, 백편두(white hyacinth bean)로부터 정제된 사포닌과 같은 계면활성제-유사 어쥬번트, 세균 내 독소(LPS 등) 유래의 TH1 유도형 어쥬번트 등 일 수 있으나, 이에 한정하지는 않는다.

1-2. 항원성 물질

본 출원은 항원성 물질을 포함한 백신일 수 있다.

본 출원에서 사용되는 용어 "항원(antigen)"은 면역 반응을 일으키는 물질을 지칭한다. 상기 항원은 예를 들어, 병원균, 바이러스, 단백질, 다당류, 인위적으로 합성된 물질, 생체 내에서 변이가 생긴 물질 등을 포함할 수 있으나, 이에 한정하지는 않는다. 용어 "항원" 또는 "면역원"은 상호교환 가능하게 사용된다.

상기 항원성 물질은 방어 면역 반응을 일으키는 모든 물질을 포함하며, 예를 들어 병원체, 에피토프, 폴리펩티드, 단백질, 비단백질 분자 및 이들의 단편 등일 수 있다.

상기 항원성 물질은 야생형(wild type), 변이형(mutant type)일 수 있다. 이 때, 상기 변이는 항원성 물질의 일부 또는/및 전체가 결실, 변형 등의 조작이 이루어진 것으로 자연적인 조작 또는 인위적인 조작을 포함할 수 있다.

예를 들어, 상기 항원성 물질의 일부를 포함한 백신일 수 있다.

예를 들어, 상기 항원성 물질의 전체를 포함한 백신일 수 있다.

병원체(pathogen)는 예를 들어, 바이러스, 세균, 박테리아 등을 포함하는 질병을 일으키는 개체를 지칭한다.

예를 들어, 병원체 자체를 항원성 물질로 포함한 백신일 수 있다.

예를 들어, 병원체의 일부를 항원성 물질로 포함한 백신일 수 있다.

상기 병원체는 특정 부위가 변형 또는 조작된 것일 수 있다. 상기 변형과 조작은 자연적으로 또는 인위적으로 이루어질 수 있다.

상기 병원체는 인간 대상 질병의 병원체일 수 있다.

예를 들어, 병원체는 장내세균과(enterobacteriaceae)일 수 있다.

예를 들어, 병원체는 비브리오속(vibrio)일 수 있다.

예를 들어, 병원체는 대장균속(Escherichia)일 수 있다.

예를 들어, 병원체는 살모넬라속(Salmonella)일 수 있다.

예를 들어, 사람 대상 질병의 병원체는 비브리오 콜레라(Vibrio cholera), 비브리오 파라헤모라이티쿠스(Vibrio parahemolyticus), 살모넬라 타이피 (Salmonella enterica enterica, serovar Typhi), 대장균(Escherichia coli) 일 수 있다.

본 출원의 백신은 콜레라 병원체를 포함할 수 있다.

에피토프(epitope)는 항원 결정기라고 불리며, 항원을 식별하게 해주는 항원의 특정한 부위를 지칭한다.

예를 들어, 에피토프 자체를 항원성 물질로 포함한 백신일 수 있다.

예를 들어, 에피토프의 일부를 항원성 물질로 포함한 백신일 수 있다.

상기 에피토프는 특정 부위가 변형 또는 조작된 것일 수 있다. 상기 변형과 조작은 자연적으로 또는 인위적으로 이루어질 수 있다.

상기 에피토프는 1 이상의 독소를 포함할 수 있다. 독소는 외독소와 내독소를 포함할 수 있다.

상기 독소는 시가톡신(Shiga toxin), 이열성 독소(heat-labile toxin), 콜레라 톡신(cholera toxin), 캄필로박터 제주니 장독소(Campylobacter jejuni enterotoxin), 퍼츄시스 톡신(pertussis toxin), 시가 유사 톡신(shiga-like toxin 또는 verotoxin) 등을 포함할 수 있으나, 이에 한정하지는 않는다.

예를 들어, 1 이상의 콜레라 톡신(cholera toxin, CT)을 포함한 백신일 수 있다. 이 때, 콜레라 톡신은 ctxA(cholera toxin subunit A), ctxB(cholera toxin subunit B) 등을 포함할 수 있으나, 이에 한정하지는 않는다.

상기 에피토프는 2 이상이 서로 예를 들어 단일 결합, 이중 결합 등의 결합 방식에 의해 연결된 다중 에피토프도 포함할 수 있다.

예를 들어, 본 출원의 백신은 콜레라 항원성 물질을 포함할 수 있다.

본 출원은 종래 백신의 한계를 해결 또는 최소화 할 수 있다. 특히, 종래 콜레라 백신의 한계를 해결 또는 최소화 할 수 있다.

본 출원은 상기 항원성 물질을 1 이상 포함한 백신으로, 질병을 일으키는 원인체의 변이에 신속하게 대응할 수 있다. 특히, 1 이상의 콜레라 독소를 항원성 물질로 포함하고 있어서 콜레라 질병의 예방 또는/및 치료에 용이하게 사용할 수 있다.

2. 콜레라(cholera)

본 출원은 콜레라의 예방 또는/및 치료를 표적 하는 백신일 수 있다.

상기 콜레라는 콜레라균(Vibrio cholera)이 분비하는 독소에 의해 설사와 구토 등을 일으키는 수인성 전염병이다.

상기 콜레라균은 Vibrionaceae과에 속하는 굽은 그람음성 막대균이다. 콜레라균의 세포벽에 있는 지질 다당질의 O항원에 따라 200가지 이상의 혈청군으로 구분된다.

예를 들어, 본 출원의 콜레라는 V. cholerae O1 혈청군일 수 있다.

예를 들어, 본 출원의 콜레라는 V. cholerae O27 혈청군일 수 있다.

예를 들어, 본 출원의 콜레라는 V. cholerae O37 혈청군일 수 있다.

예를 들어, 본 출원의 콜레라는 V. cholerae O139 혈청군일 수 있다.

상기 콜레라는 독소에 의한 질환이다. 콜레라 독소는 외독소로서 1개의 A 아단위와 5개의 B 아단위로 구성되어 있는데, B 아단위는 장 상피세포의 GM1 ganglioside와 결합하여 A 아단위가 장 상피세포의 세포질 내로 잘 침투하게 한다. 장 상피세포 내로 침투한 콜레라 독소 A 아단위는 adenylatecyclase를 활성화시켜 세포 내 cyclic AMP를 증가시킴으로써, Na⁺과 Cl^-의 흡수를 억제하고 Cl^-와 수분 분비를 촉진하여 분비성 설사를 유발한다. 두 번째 병독인자는 toxin-coregulated philus(TCP)로 그 발현이 콜레라 독소와 평행하게 조절되며 균주가 작은 창자 내에 집락화 하는데 필수적이다.

상기 콜레라 독소는 콜레라를 일으키는 원인체(또는 항원성 물질)일 수 있다.

상기 콜레라 독소와 관련 있는 유전자는 병원성에 직접적으로 관여하는 예를 들어 ctxA, ctxB 등이 있을 수 있고, phage repressor에 관여하는 예를 들어 rstR 등이 있을 수 있고, toxin-coregulated pilus(TCP)로 알려져 있는 섬모를 이용해 콜레라균이 장기에 점착하는데 관여하는 tcpA 등이 있을 수 있으나, 본 출원에서는 콜레라 독소와 관련된 모든 인자를 포함하는 것으로 한다.

예를 들어, 본 출원의 콜레라 백신은 ctxA, ctxB, rstR, tcpA 중 선택되는 1 이상을 포함할 수 있다.

2-1. 콜레라 백신

현재 콜레라 백신은 경구용 백신과 주사용 백신이 있지만, 주사용 백신은 방어력이 낮고 중증 이상반응의 발생빈도가 높아 WHO에서는 권고하고 있지 않다. 백신을 경구로 투여 시 투여가 쉽고, 주사관련 감염의 위험성이 없으며, 자연 발생하는 질환에 의해 유도되는 면역반응과 매우 유사한 방식으로 장관 내에 국소 면역체계를 자극하는 장점이 있어 콜레라 백신은 주로 경구용 백신이 개발되었다. 경구용 백신에는 불활화 백신과 생백신이 있는데, 생백신으로 Orochol (CVD 103-HgR)이 최초로 사용 허가된 경구용 생백신이나 예방효과가 충분히 확립되지 않아 더 이상 생산되지 않고 있다.

상기 콜레라의 예방 또는/및 치료를 표적 하는 백신은 제조방법에 따라 사백신(killed vaccine), 약독화백신(attenuated vaccine), 성분백신(Component vaccine), DNA 백신 (DNA vaccine), 재조합 백신(recombinant vaccine) 등을 이용한 백신일 수 있으나 백신을 제조할 수 있는 방법이라면 모두 포함하는 것으로 하며, 이에 제한하지는 않는다.

상기 사백신은 바이러스나 세균의 전부 도는 일부를 화학물질이나 열 등을 이용화여 불활화시켜 제조한 백신을 지칭한다.

상기 약독화 백신은 질병을 일으키는 바이러스나 세균의 일부분을 변형시켜 자기 번식 및 면역 유발 능력은 있으나 독성을 일으키는 능력은 제거시켜 제조한 백신을 지칭한다.

상기 성분 백신은 병원체의 대사과정에서 생성되거나 병원체 자체가 가지고 있는 독소(toxin)를 가열하거나 포르말린 등의 약품을 처리하여 제조한 백신을 지칭한다. 성분 백신은 소단위백신(subunit vaccine), 아단위백신, 특이항원 추출백신으로도 지칭될 수 있다.

상기 DNA 백신은 플라스미드 DNA(plasmid DNA)를 사용하여 유전자를 전달하는 방법으로 제조된 백신을 지칭한다. 상기 플라스미드 DNA는 유전자를 발현하기 위한 여러 가지 유전 요소들을 가지고 있어, 세포 내에 들어가면 삽입되어 있는 유전자로부터 항원을 발현하게 하는 것을 의미한다.

상기 재조합 백신은 병원체에서 항원으로 작용하는 부위만을 유전자조작을 통하여 만들어 제조된 백신을 지칭한다. 이 때, 유전자조작은 재조합기술을 이용하여 항원의 유전자를 다른 세포 내에 도입하여 발현시키는 기술을 지칭한다.

상기 재조합 백신을 만들 때 사용되는 재조합기술은 벡터를 이용하는 방법, 비벡터를 이용하는 방법, 유전체 편집을 이용하는 방법 등 유전자조작이 가능한 기술이라면 이에 제한하지 않는다.

상기 벡터는 비바이러스 벡터, 바이러스 벡터 등 통상적으로 유전자를 운반할 수 있는 기능을 가진 기능을 가진 모두를 포함할 수 있다.

상기 바이러스 벡터의 바이러스는 DNA 바이러스 또는 RNA 바이러스일 수 있다.

상기 DNA 바이러스는 이중가닥 DNA(ds DAN)바이러스 또는 단일가닥 DNA(ss DNA)바이러스 일 수 있다.

상기 바이러스 벡터는 아데노바이러스 벡터, 레트로바이러스 벡터, 렌티바이러스 벡터, 아데노-연관 바이러스(AAV) 벡터, 백시니아바이러스 벡터, 폭스바이러스 벡터, 단순포진바이러스 등일 수 있으나, 이에 제한하지는 않는다.

바이러스 벡터는 유전자전달 효율이 높으나 병원성이 있는 바이러스이므로 안전성의 문제 및 벡터 내 삽입 가능한 유전자의 크기에도 제한적일 수 있다.

상기 비바이러스 벡터는 플라스미드(Plasmid), 네이키드 DNA(naked DNA), 리포좀(Liposome) 등일 수 있으나, 이에 제한하지는 않는다.

비바이러스 벡터는 인체 세포 내 바이러스 유전물질의 유입이 되지 않으며 생산의 용이성, 벡터 내 삽입 유전자의 크기 무제한성 및 숙주에 대한 면역 반응이 낮음에 따른 낮은 부작용 등이 장점이 될 수도 있으나, 바이러스 벡터에 비해 세포 내 도입 효율이 현저하게 낮은 단점이 발생할 수 있다.

상기 비벡터는 전기천공법, 유전자총, 초음파천공법, 자기주입법, 일시적인 세포의 압축 또는 스퀴징, 지질-매개 형질감염, 나노입자, 실리카 등의 방법을 포함할 수 있으나 벡터를 사용하지 않는 방법이라면 이에 제한하지 않는다.

상기 유전체 편집을 이용하는 방법은 ZFN(Zinc-finger nucleases), TALEN(transcription activator-like effector nucleases), CRISPR/Cas(Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats/ CRISPR-associated sequences)의 등을 포함할 수 있으나, 특정 DNA부위를 자르는데 사용하는 인공 효소를 이용하여 유전자의 표적 부위를 편집할 수 있는 기술이라면 이에 제한하지 않는다.

상기 ZFN는 특정 DNA 염기서열을 인식하여 결합할 수 있는 Zinc finger protein과 DNA를 절단할 수 있는 FokI restriction endonuclease 도멘인으로 구성되어 있는 유전체 편집 기술을 지칭한다.

상기 TALEN은 DNA binding domain과 FokI nuclease domain으로 구성되어 있는 유전체 편집 기술을 지칭한다.

상기 CRISPR/Cas는 RGEN(RNA-guided endonuclease)로도 불리며, 상기 ZFN 및 TALEN과는 다르게 RNA에 의해 DNA 염기서열 특이성이 유도되는 유전체 편집 기술을 지칭한다.

본 출원에서 개시되는 백신은 CRISPR/Cas를 이용하여 만든 콜레라 백신일 수 있다.

특히, 본 출원에서 개시되는 백신은 spCas9을 이용하여 만든 콜레라 백신일 수 있다.

CRISPR/Cas는 주기적 간격으로 분포하는 짧은 회문 구조의 반복(Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats: CRISPR)과, 연관된 서열(cas)과의 조합된 것을 지칭한다.

상기 CRISPR/Cas 시스템은 가이드 RNA 및 Cas 단백질로 구성되어 있다.

상기 가이드 RNA는 표적 서열을 인식할 수 있는 RNA를 의미하며, Cas 단백질과 결합하여 Cas 단백질을 표적 서열로 안내할 수 있는 기능을 가진 것을 지칭한다.

상기 가이드 RNA는 crRNA(CRISPR RNA) 또는/및 tracrRNA(trans-activating crRNA)를 포함할 수 있다. 상기 crRNA와 상기 tracrRNA의 특정 부위가 융합된 형태를 sgRNA(sinlge-chain guide RNA)로 지칭할 수 있다.

상기 Cas 단백질은 표적 서열 또는 유전자를 절단할 수 있는 기능을 수행하는 단백질을 지칭하며, 상기 Cas 단백질은 효소를 포함할 수 있으며 상기 효소는 뉴클레아제, 프로테아제, 제한효소 등을 포함할 수 있으나 이에 제한하지는 않는다.

상기 유전자가위 단백질은 자연 상태에 존재하는 또는 존재하지 않는 인위적으로 생성된 효소 또는 단백질의 형태 또는 그것들의 일부가 변형된 형태를 포함할 수 있다.

상기 효소는 CRISPR 효소일 수 있다.

상기 CRISPR 효소는 CRISPR-Cas 시스템을 구성하는 단백질로서, 가이드핵산과 결합하여 복합체를 형성하여 표적 서열을 절단 또는 위치를 변형시키는 기능을 수행할 수 있다.

상기 CRISPR 효소는 효소의 활성을 변경시켜 불완전 또는 부분 활성을 가지도록 변형한 형태를 포함할 수 있다.

상기 CRISPR 효소는 Cas1, Cas1B, Cas2, Cas3, Cas4, Cas5, Cas6, Cas7, Cas8, Cas9(Csn1 및 Csx12로도 알려짐), Cas10, Csy1, Csy2, Csy3, Cse1, Cse2, Csc1, Csc2, Csa5, Csn2, Csm2, Csm3, Csm4, Csm5, Csm6, Cmr1, Cmr3, Cmr4, Cmr5, Cmr6, Csb1, Csb2, Csb3, Csx17, Csx14, Csx10, Csx16, CsaX, Csx3, Csx1, Csx15, Csf1, Csf2, Csf3, Csf4, Cpf1 등의 자연상태로 존재하는 것 또는 인위적으로 변형된 형태를 포함할 수 있으나, 이에 제한하지는 않는다.

상기 CRISPR 효소는 CRISPR 시스템의 종류에 따라 크게 6가지의 Type으로 나눌 수 있다. Type I은 Cas1, Cas2, Cas3, Cas8 등으로 구성될 수 있고; Type II는 Cas1, Cas2, Cas2/Cas4, Cas9 등으로 구성될 수 있고; Type III는 Cas5, Cas6, Cmr1, Cmr3, Cmr4, Cmr5, Cas5/Cmr1, Cam2, Cmr5 등으로 구성될 수 있고; Type IV는 Csf1, Csf2, Csf3 등으로 구성될 수 있고; Type V는 Cas1, Cas2, Cas1, Cas2, Cas4, Cpf1, Cpf2 등으로 구성될 수 있고; Type VI는 C2C2, Cas1, Cas2 등으로 구성될 수 있으나, 이에 한정하지 않는다.

상기 CRISPR 효소의 Type 중 Type II의 Cas9과 Type V의 Cpf1이 일반적으로 가장 많이 사용된다.

본 출원의 CRISPR/Cas 시스템에서 CRISPR 효소는 Cas9을 사용할 수 있다.

상기 Cas9은 스트렙토코커스 피오게네스(Streptococcus pyogenes), 스트렙토코커스 써모필러스(Streptococcus thermophilus), 스트렙토코커스 속(Streptococcus sp.), 황색포도상구균(Staphylococcus aureus), 노카르디옵시스 다손빌레이(Nocardiopsis dassonvillei), 스트렙토마이세스 프리스티네스피랄리스(Streptomyces pristinaespiralis), 스트렙토마이세스 비리도크로모게네스(Streptomyces viridochromogenes), 스트렙토마이세스 비리도크로모게네스(Streptomyces viridochromogenes), 스트렙토스포랑기움 로세움(Streptosporangium roseum), 스트렙토스포랑기움 로세움(Streptosporangium roseum), 알리사이클로바클루스 아시도칼다리우스(AlicyclobacHlus acidocaldarius), 바실러스 슈도마이코이데스(Bacillus pseudomycoides), 바실러스 셀레니티레두센스(Bacillus selenitireducens), 엑시구오박테리움 시비리쿰(Exiguobacterium sibiricum), 락토바실러스 델브루에키이(Lactobacillus delbrueckii), 락토바실러스 살리바리우스(Lactobacillus salivarius), 미크로스 킬라 마리나(Microscilla marina), 부르크홀데리아레스 박테리움(Burkholderiales bacterium), 폴라로모나스 나프탈레니보란스(Polaromonas naphthalenivorans), 폴라로모나스 속(Polaromonas sp.), 크로코스파에라 와트소니이(Crocosphaera watsonii), 시아노테세 속(Cyanothece sp.), 마이크로시스티스 아에루기노사(Microcystis aeruginosa), 시네코코커스 속(Synechococcus sp.), 아세토할로비움 아라바티쿰(Acetohalobium arabaticum), 암모니펙스 데겐시이(Ammonifex degensii), 칼디셀룰로시럽토 베시이(Caldicelulosiruptor bescii), 칸디다투스 데술포루디스(Candidatus Desulforudis), 클로스트리듐 보툴리눔(Clostridium botulinum), 클로스트리듐 디피실레(Clostridium difficile), 피네골디아 마그나(Finegoldia magna), 나트라나에로비우스 써모필러스 (Natranaerobius thermophilus), 펠로토마쿨럼 써모프로피오니쿰(Pelotomaculum thermopropionicum), 아시디티오바실러스 칼두스(Acidithiobacillus caldus), 아시디티오바실러스 페로옥시단스(Acidithiobacillus ferrooxidans), 알로크로마티움 비노숨(Allochromatium vinosum), 마리노박터 속(Marinobacter sp.), 니트로소코커스 할로필러스(Nitrosococcus halophilus), 니트로소코커스 와트소니(Nitrosococcus watsoni), 슈도알테로 모나스 할로플란크티스(Pseudoalteromonas haloplanktis), 크테도노박테르 라세미페르(Ktedonobacter racemifer), 메타노할로비움 에베스티가툼(Methanohalobium evestigatum), 아나베나 바리아빌리스(Anabaena variabilis), 노둘라리아 스푸미게나(Nodularia spumigena), 노스톡 속(Nostoc sp.), 아르트로스피라 맥시마(Arthrospira maxima), 아르트로스피라 플라텐시스(Arthrospira platensis), 아르트로스피라 속(Arthrospira sp.), 링비아속(Lyngbya sp.), 마이크로콜레우스 크토노플라스테스(Microcoleus chthonoplastes), 오실라토리아 속(Oscillatoria sp.), 페트로토가 모빌리스(Petrotoga mobilis), 써모시포 아프리카누스(Thermosipho africanus) 또는 아카리오클로리스 마리나(Acaryochloris marina) 등 다양한 미생물 유래의 Cas9일 수 있다.

또한, 상기 Cpf1은 Streptococcus, Campylobacter, Nitratifractor, Staphylococcus, Parvibaculum, Roseburia, Neisseria, Gluconacetobacter, Azospirillum, Sphaerochaeta, Lactobacillus, Eubacterium, Corynebacter, Carnobacterium, Rhodobacter, Listeria, Paludibacter, Clostridium, Lachnospiraceae, Clostridiaridium, Leptotrichia, Francisella, Legionella, Alicyclobacillus, Methanomethyophilus, Porphyromonas, Prevotella, Bacteroidetes, Helcococcus, Letospira, Desulfovibrio, Desulfonatronum, Opitutaceae, Tuberibacillus, Bacillus, Brevibacilus, Methylobacterium 또는 Acidaminococcus 유래의 Cpf1일 수 있다.

상기 CRISPR 효소는 가이드핵산과 상호작용하여 복합체를 형성하여 표적 핵산 또는 유전자의 표적 서열을 절단 또는 위치를 변형시키는 기능을 수행할 수 있다. 이 때, 그 기능은 상기 CRISPR 효소가 직접적으로 인지하는 PAM(protospacer adjacent modif)을 포함해야 한다. 즉, 상기 PAM의 염기서열은 CRISPR 효소의 종에 따라 달라진다. 예를 들어, 일반적으로 많이 사용되는, Streptococcus pyogenes 에서 유래된 Cas9 단백질의 경우 5'-NGG-3'가 PAM 염기서열이 된다. 예를 들어, Staphylococcus aureus 에서 유래된 Cas9 단백질은 5'-NNGRRT-3'를 PMA 염기서열로 가진다. 결과적으로 상기 표적 핵산 또는 유전자의 표적 서열을 절단 또는 위치의 변형을 수행할 때, CRISPR 효소의 종의 선택에 따라 필수적으로 PAM의 염기서열이 바뀌며, 그것들에 의해 표적 서열을 절단 또는 위치의 변형이 결정된다.

본 출원의 CRISPR/Cas 시스템은 대상(target)을 조작하는데 사용될 수 있다.

상기 조작은 넉아웃(Knock-out), 넉인(Knock-in), 넉다운(Knock-down) 중 선택되는 어느 하나 이상일 수 있다.

예를 들어, 상기 조작은 넉인일 수 있다.

예를 들어, 상기 조작은 넉아웃일 수 있다.

상기 대상은 표적 핵산 또는 유전자를 포함하는 유기체일 수 있다.

상기 유기체는 세포, 조직, 식물, 동물 또는 인간일 수 있다.

예를 들어, 상기 유기체는 인간일 수 있다.

상기 세포는 원핵세포 또는 진핵세포일 수 있다.

따라서, 본 출원에 의해 개시되는 콜레라의 예방 또는/및 치료를 표적 하는 백신 조성물 및 제조방법은 기존의 콜레라 백신에 비해 효과가 월등히 뛰어날 수 있으며, 콜레라 원인체의 변이에도 신속하게 대응할 수 있을 것으로 기대된다.

3. 콜레라 백신 조성물

전술한 본 출원의 과제를 해결하기 위하여, 본 출원의 일 양태에 의하면, 콜레라 백신 조성물이 제공된다.

상기 콜레라 백신 조성물은 i) 박테리아 유래 포자; 이 때, 상기 박테리아 유래 포자는 지노믹 DNA에 항원성 물질을 코딩하는 서열을 가지고 있는 포자이며, ii) 상기 박테리아 포자의 표면에 존재하는 포자 코트 단백질 및 iii) 상기 포자 코트 단백질에 연결된 콜레라 항원성 물질을 포함할 수 있다.

본 출원에 의해 개시되는 콜레라 백신 조성물은 병원 원인체의 변이에 신속하게 대응할 수 있다.

본 출원의 콜레라 백신 조성물의 박테리아 포자는 B. subtilis, B. anthrasis, B. thuringiensis, B. cereus 중 선택되는 포자일 수 있다.

예를 들어, 본 출원의 콜레라 백신 조성물의 박테리아 포자는 B. subtilis의 포자일 수 있다.

본 출원의 콜레라 백신 조성물의 포자 코트 단백질은 CotA, CotB, CotC, CotD, CotE, CotF, CotG, CotN, CotS, CotT, CotV, CotW, CotX, CotY, CotZ, CotH, CotJA, CotJC, CotK, CotL, CotM 중 선택되는 포자 코트 단백질일 수 있다.

예를 들어, 본 출원의 콜레라 백신 조성물의 포자 코트 단백질은 CotB, CotC, CotG 중 선택되는 포자 코트 단백질일 수 있다.

본 출원의 콜레라 백신 조성물의 항원성 물질은 ctxA, ctxB, rstR, tcpA 중 선택되는 항원성 물질일 수 있다.

본 출원의 콜레라 백신 조성물은 박테리아 포자, 1개의 포자 코트 단백질 및 1 개의 항원성 물질을 포함할 수 있다.

본 출원의 콜레라 백신 조성물은 박테리아 포자, 1개의 포자 코트 단백질 및 2 이상의 항원성 물질을 포함할 수 있다.

본 출원의 콜레라 백신 조성물은 박테리아 포자, 2 이상의 포자 코트 단백질 및 1개의 항원성 물질을 포함할 수 있다.

본 출원의 콜레라 백신 조성물은 박테리아 포자, 2 이상의 포자 코트 단백질 및 2 이상의 항원성 물질을 포함할 수 있다.

상기 콜레라 백신 조성물은 포자 코트 단백질 및 항원성 물질을 연결하는 링커(linker)를 더 포함할 수 있다.

상기 링커는 효소, 절단효소, 폴리펩타이드, 단백질, 염기서열, 인위적인 화학적 결합을 형성하고 있는 인공 염기서열 등일 수 있으나 상기 포자 코트 단백질 및 항원성 물질을 연결할 수 있는 기능을 가진 것이라면, 이에 한정하지 않는다.

상기 콜레라 백신 조성물은 안정제, 유화제, 수산화알루미늄, 인산알루미늄, pH 조정제, 계면활성제, 리포솜, 이스콤 (iscom) 보조제, 합성 글리코펩티드, 증량제, 카복시폴리메틸렌, 세균 세포벽, 세균 세포벽의 유도체, 세균백신, 동물 폭스바이러스 단백질, 바이러스 일부 (subviral) 입자 보조제, 콜레라 독소, N, N-디옥타데실-N',N'-비스(2-하이드록시에틸)-프로판디아민, 모노포스포릴 지질 A, 디메틸디옥타데실-암모늄 브로마이드 및 이의 혼합물로 구성된 군에서 선택된 어느 하나 이상의 제2보조제를 추가로 포함할 수 있다.

또한, 상기 콜레라 백신 조성물은 의학적으로 허용 가능한 담체, 희석제, 결합제, 붕해제, 윤활제, pH 조절제, 산화방지제, 용해보조제, 항원 보강제, 안정제, 보존제, 항균제, 항진균제, 흡착 지연제 등의 첨가제를 추가로 더 포함할 수 있다.

상기 담체는 세포 또는 조직내로의 화합물의 부가를 용이하게 하는 화합물로 정의된다. 예를 들어, 디메틸 술폭사이드(DMSO)를 사용할 수 있다.

상기 희석제(버퍼 용액)는, 예를 들어, 슈가, 전분, 미결정셀룰로오스, 유당(유당수화물), 포도당, 디-만니톨, 알기네이트, 알칼리토금속류염, 클레이, 폴리에틸렌글리콜, 무수인산수소칼슘, 또는 이들의 혼합물 등을 사용할 수 있으며; 결합제는 전분, 미결정셀룰로오스, 고분산성 실리카, 만니톨, 디-만니톨, 자당, 유당수화물, 폴리에틸렌글리콜, 폴리비닐피롤리돈(포비돈), 폴리비닐피롤리돈 공중합체(코포비돈), 히프로멜로오스, 히드록시프로필셀룰로오스, 천연검, 합성검, 코포비돈, 젤라틴, 또는 이들의 혼합물 등을 포함할 수 있다.

상기 붕해제는 예를 들어, 전분글리콘산나트륨, 옥수수전분, 감자전분 또는 전호화전분 등의 전분 또는 변성전분; 벤토나이트, 몬모릴로나이트, 또는 비검(veegum) 등의 클레이; 미결정셀룰로오스, 히드록시프로필셀룰로오스 또는 카르복시메틸셀룰로오스 등의 셀룰로오스류; 알긴산나트륨 또는 알긴산 등의 알긴류; 크로스카멜로스(croscarmellose)나트륨 등의 가교 셀룰로오스류; 구아검, 잔탄검 등의 검류; 가교 폴리비닐피롤리돈(crospovidone) 등의 가교 중합체; 중탄산나트륨, 시트르산 등의 비등성 제제, 또는 이들의 혼합물을 사용할 수 있다.

상기 윤활제는 예를 들어, 탈크, 스테아린산, 스테아린산 마그네슘, 스테아린산 칼슘, 라우릴설페이트나트륨, 수소화식물성오일, 나트륨벤조에이트, 나트륨스테아릴푸마레이트, 글리세릴 베헤네이트, 글리세릴 모노레이트, 글리세릴모노스테아레이트, 글리세릴 팔미토스테아레이트, 콜로이드성 이산화규소 또는 이들의 혼합물 등을 사용할 수 있다.

상기 pH 조절제는 예를 들어, 초산, 아디프산, 아스코르빈산, 아스코르빈산 나트륨, 에테르산 나트륨, 사과산, 숙신산, 주석산, 푸마르산, 구연산(시트르산)과 같은 산성화제와 침강 탄산 칼슘, 암모니아수, 메글루민, 탄산 나트륨, 산화 마그네슘, 탄산 마그네슘, 구연산 나트륨, 삼염기칼슘인산염과 같은 염기성화제 등을 사용할 수 있다.

상기 산화방지제는 예를 들어, 디부틸 히드록시 톨루엔, 부틸레이티드 히드록시아니솔, 초산 토코페롤, 토코페롤, 프로필 갈레이트, 아황산수소나트륨, 피로아황산나트륨 등을 사용할 수 있다.

상기 용해보조제는 예를 들어, 라우릴황산나트륨, 폴리소르베이트 등의 폴리옥시에틸렌 소르비탄 지방산 에스테류, 도큐세이트 나트륨, 폴록사머(poloxamer) 등을 사용할 수 있다.

또한, 지연방출성 제제를 만들기 위해 장용성 고분자, 수불용성 중합체, 소수성 화합물, 및 친수성 고분자를 포함할 수 있다.

상기 장용성 고분자는 예를 들어, 히프로멜로오스아세테이트숙시네이트, 히프로멜로오스프탈레이트(히드록시프로필메틸셀룰로오스 프탈레이트), 히드록시메틸에틸셀룰로오스프탈레이트, 셀룰로오스아세테이트프탈레이트, 셀룰로오스아세테이트숙시네이트, 셀룰로오스아세테이트말레이트, 셀룰로오스벤조에이트프탈레이트, 셀룰로오스프로피오네이트프탈레이트, 메틸셀룰로오스프탈레이트, 카르복시메틸에틸셀룰로오스, 에틸히드록시에틸셀룰로오스프탈레이트 및 메틸히드록시에틸셀룰로오스과 같은 장용성 셀룰로오스 유도체; 스티렌-아크릴산 룰로오스, 아크릴산메틸-아크릴산 룰로오스, 아크릴산메틸메타크릴산 룰로오스(예컨대, 아크릴-이즈), 아크릴산부틸-스티렌-아크릴산 룰로오스, 및 아크릴산메틸-메타크릴산-아크릴산옥틸룰로오스와 같은 상기 장용성 아크릴산계 룰로오스; 폴리(메타크릴산 메틸 메타크릴레이트) 룰로오스(예컨대, 유드라짓 L, 유드라짓 S, 에보셀독일트, 카르 (메타크릴산 에틸아크릴레이트) 룰로오스 (예컨대, 유드라짓 L100-55)와 같은 장용성 카르메타크릴레이트 룰로오스; 아세트산비닐-말레인산틸셀룰물 룰로오스, 스티렌-말레인산틸셀룰물 룰로오스, 스티렌-말레인산모노에스테를 룰로오스, 비닐메틸에테르-말레인산틸셀룰물 룰로오스, 에틸렌-말레인산틸셀룰물 룰로오스, 비닐부틸에테르-말레인산틸셀룰물 룰로오스, 아크릴로니트릴-크릴산메틸ㆍ말레인산틸셀룰물 룰로오스, 및 아크릴산부틸-스티렌-말레인산틸셀룰물 룰로오스와 같은 장용성 말레인산계 룰로오스; 및 로니트릴알콜프탈레이트, 로니트릴아세탈프탈레이트, 폴리비닐부틸레이트프탈레이트 및 폴리비닐아세트아세탈프탈레이트와 같은 장용성 폴리비닐 유도체가 있다.

상기 수불용성 중합체는 약물의 방출을 제어하는 약제학적으로 허용 가능한 물에 용해되지 않는 고분자를 말한다. 예를 들어, 수불용성 중합체는 폴리비닐아세테이트(예컨대, 콜리코트 SR30D), 수불용성 폴리메타크릴레이트 공중합체[예컨대, 폴리(에틸아크릴레이트-메틸 메타크릴레이트) 공중합체(예컨대, 유드라짓 NE30D, 폴리(에틸아크릴레이트-메틸 메타크릴레이트-트리메틸아미노에틸메타크릴레이트)공중합체(예컨대, 유드라짓RSPO)등], 에틸셀룰로오스, 셀룰로오스 에스테르, 셀룰로오스 에테르, 셀룰로오스 아실레이트, 셀룰로오스 디아실레이트, 셀룰로오스 트리아실레이트, 셀룰로오스 아세테이트, 셀룰로오스 디아세테이트 및 셀룰로오스 트리아세테이트 등이 있다.

상기 소수성 화합물은 예를 들어, 글리세릴 팔미토스테아레이트, 글리세릴 스테아레이트, 글리세릴 비헤네이트, 세틸 팔미테이트, 글리세릴 모노 올레이트 및 스레아린산과 같은 지방산 및 지방산 에스테르류; 세토스테아릴 알코올, 세틸알코올 및 스테아릴알코올과 같은 지방산 알코올류; 카르나우바왁스, 밀납, 및 미결정왁스와 같은 왁스류; 탈크, 침강탄산칼슘, 인산일수소칼슘, 산화아연, 산화티탄, 카올린, 벤토나이트, 몬모릴로나이트 및 비검과 같은 무기질 물질 등이 있다.

상기 친수성 고분자는 예를 들어, 덱스트린, 폴리덱스트린, 덱스트란, 펙틴 및 펙틴 유도체, 알긴산염, 폴리갈락투론산, 자일란, 아라비노자일란, 아라비노갈락탄, 전분, 히드록시프로필스타치, 아밀로오스, 및 아밀로펙틴와 같은 당류; 히프로멜로오스, 히드록시프로필셀룰로오스, 히드록시메틸셀룰로오스, 히드록시에틸셀룰로오스, 메틸셀룰로오스 및 카르복시메틸셀룰로오스 나트륨과 같은 셀룰로오스 유도체; 구아검, 로커스트 콩 검, 트라가칸타, 카라기난, 아카시아검, 아라비아검, 젤란검, 및 잔탄검과 같은 검류; 젤라틴, 카제인, 및 제인과 같은 단백질; 폴리비닐 알코올, 폴리비닐 피롤리돈, 및 폴리비닐아세탈디에틸아미노아세테이트와 같은 폴리비닐유도체; 폴리(부틸 메타크릴레이트-(2-디메틸아미노에틸)메타크릴레이트-메틸메타크릴레이트) 공중합체(예컨대, 유드라짓E100, 에보닉, 독일), 폴리(에틸 아크릴레이트-메틸 메타크릴레이드-트리에틸아미노에틸- 메타크릴레이트 클로라이드) 공중합체 (예컨대, 유드라짓 RL, RS, 에보닉, 독일)와 같은 친수성 폴리메타크릴레이트 공중합체; 폴리에틸렌 글리콜, 및 폴리에틸렌 옥사이드와 같은 폴리에틸렌 유도체; 카보머 등이 있다.

이외에도 착색제, 향료 중에서 선택된 다양한 첨가제로서 약학적으로 허용 가능한 첨가제를 선택 사용하여 본 출원의 제제를 제제화할 수 있다.

본 출원에서 첨가제의 범위가 상기 첨가제를 사용하는 것으로 한정되는 것은 아니며, 상기한 첨가제를 선택에 의하여 통상 범위의 용량을 함유하여 제제화할 수 있다.

또한, 상기 콜레라 백신 조성물은 각각 통상의 방법에 따라 산제, 과립제, 정제, 캡슐제, 현탁액, 에멀젼, 시럽, 에어로졸 등의 경구형 제형 및 멸균 주사용액의 형태로 제형화하여 사용될 수 있다. 제제화할 경우에는 보통 사용되는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 조제할 수 있다. 경구투여를 위한 고형제제에는 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제 등이 포함되며, 이러한 고형제제는 상기 레시틴 유사 유화제에 적어도 하나 이상의 부형제 예를 들면, 전분, 칼슘카보네이트 (calciumcarbonate), 수크로오스 또는 락토오스, 젤라틴 등을 섞어 조제할 수 있다. 또한 단순한 부형제 이외에 마그네슘 스티레이트 탈크 같은 윤활제들도 사용할 수 있다. 경구투여를 위한 액상제제로는 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제 등을 사용할 수 있으며, 흔히 사용되는 단순 희석제인 물, 리퀴드 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등이 포함될 수 있다. 비경구투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수용성제, 현탁제, 유제, 동결건조제제가 포함된다. 비수용성제제, 현탁제로는 프로필렌글리콜 (propylene glycol), 폴리에틸렌 글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

경구용 제형의 경우, 방출 위치는 위, 소장(십이지장, 공장(jejunum), 회장(ileum)) 또는 대장일 수 있다. 본 기술분야의 통상의 기술자는 예컨대 장용 코팅을 사용함으로써 위에서는 용해되지 않지만 그 물질을 장내의 십이지장 또는 다른 곳에 방출하는 제형을 이용할 수 있다. 장용 코팅으로 사용되는 보다 일반적인 불활성 성분의 예는 셀룰로오스 아세테이트 트리멜리테이트(CAT), 히드록시프로필메틸셀룰로오스 프탈레이트(HPMCP), HPMCP 50, HPMCP 55, 폴리비닐 아세테이트 프탈레이트(PVAP), 유드라짓(Eudragit) L30D, 아쿠아테릭(Aquateric), 셀룰로오스 아세테이트 프탈레이트(CAP), 유드라짓 L, 유드라짓 S 및 쉘락(Shellac)이다. 이들 코팅은 혼합된 필름으로 사용될 수 있다.

또한, 코팅 또는 코팅의 혼합물은 위에 대한 보호를 목적으로 하지 않는 정제 위에 사용될 수 있다. 이것은 당 코팅 또는 상기 정제를 삼키기 쉽게 만드는 코팅을 포함할 수 있다. 캡슐은 건조된 치료제(즉, 분말)의 운반용으로 경질의 쉘(hard shell)(예컨대, 젤라틴)로 이루어질 수 있거나, 액체 형태의 경우 연질 젤라틴 쉘이 사용될 수 있다. 까세의 쉘 물질은 두꺼운 전분 또는 다른 식용 종이일 수 있다. 알약, 로젠지, 성형된 정제 또는 정제 연마물의 경우, 습기 매싱 기술(moist massing technique)이 사용될 수 있다. 캡슐 투여용 물질의 제형은 또한 분말, 가볍게 압착된 플러그 또는 심지어 정제의 형태일 수 있다. 상기 치료제는 압착에 의해 제조될 수 있다.

4. 콜레라 백신 제조방법

전술한 본 출원의 과제를 해결하기 위하여, 본 출원의 일 양태에 의하면, 콜레라 백신 제조방법이 제공된다.

예를 들어 본 출원의 콜레라 백신 제조 방법은, i) 박테리아의 지노믹 DNA(genomic DNA)에 CRISPR/Cas9을 이용하여 항원성 물질을 넉인(Knock-in) 시키는 단계; ii) 상기 박테리아의 포자를 형성시키는 단계; 및 iii) 상기 박테리아의 포자 표면에 항원성 물질을 발현시키는 단계;를 포함할 수 있다.

상기 콜레라 백신 제조 방법은 박테리아의 지노믹 DNA에 도너(donor)로서 외래물질을 삽입시키는 단계를 포함할 수 있다.

상기 "도너(donor)"는 특정 펩타이드 또는 단백질을 발현시킬 수 있는, exogenous nucleotide를 의미하며, 예를 들어, HDR 메커니즘을 이용하여 지노믹 DNA 내로 삽입될 수 있다. 이때, 도너는 특정 펩타이드 또는 단백질을 코딩하는 특정 핵산을 포함할 수 있다.

상기 도너는 이중가닥 핵산 또는 단일가닥 핵산일 수 있다.

상기 도너는 선형 또는 원형일 수 있다.

상기 도너는 표적 유전자 또는 핵산에 상동성을 가지는 핵산서열을 포함할 수 있다.

상기 도너는 항원성 물질을 코딩하는 핵산일 수 있다.

예를 들어, 상기 도너는 콜레라 항원성 물질을 코딩하는 핵산일 수 있다. 일 예로, ctxA, ctxB, rstR 및 tcpA 중 선택되는 어느 하나 이상을 코딩하는 핵산일 수 있다. 다른 예로 상기 도너는 콜레라 항원성 물질인 ctxA, ctxB 및 tcpA를 모두 코딩하고 있는 핵산일 수 있다.

상기 도너는 박테리아의 지노믹 DNA 서열 중 특정 영역과 상동성을 가지는 핵산서열(예를 들어, 상동성 암;arm)과 결합된 콜레라 항원성 물질일 수 있다.

본 출원의 상기 콜레라 백신을 제조방법은 일 구체예서, CRISPR/Cas9을 이용하여 박테리아의 지노믹 DNA(genomic DNA)에 변형을 가할 수 있다.

상기 CRISPR/Cas9을 이용하는 박테리아의 지노믹 DNA(genomic DNA)에 변형은 넉인(Knock-in), 넉아웃(Knock-out), 넉다운(Knock-Downn) 중 선택되는 1 이상일 수 있다.

예를 들어, CRISPR/Cas9을 사용하여 박테리아의 지노믹 DNA(genomic DNA)의 특정 영역을 타겟하여 외래성 항원성 물질을 넉인시킬 수 있다.

예를 들어 CRISPR/Cas9을 사용하여 박테리아의 지노믹 DNA(genomic DNA)의 특정 유전자를 넉아웃시킬 수 있다.

예를 들어 CRISPR/Cas9을 사용하여 박테리아의 지노믹 DNA(genomic DNA)의 특정 유전자를 넉다운시킬 수 있다.

이하, CRISPR/Cas9을 이용하여 박테리아의 지노믹 DNA(genomic DNA)의 특정 영역을 타겟팅하여 콜레라 항원성 물질을 코딩하는 핵산을 삽입(넉인)하는 과정을 중심으로 설명한다.

이를 위해, 콜레라 항원성 물질을 넉인 하기 위해서, 박테리아의 지노믹 DNA 내 표적 부위 서열 또는 표적 유전자의 염기서열을 결정한다. 이 때, 상기 표적 서열은 CRISPR 효소, 즉 Cas9 또는 Cpf1이 인식할 수 있는 PAM 서열에 근접한 위치에 위치한 염기서열일 수 있다. 상기 표적 서열은 가이드 RNA와 상보성을 가지거나 동일할 수 있다.

예를 들어, 공지의 데이터베이스(예를 들어, NCBI)를 이용하여 표적 염기서열 데이터를 수집하고, 상기 염기서열 중 CRISPR/Cas9이 인식하는 부위인 PAM서열(예를 들어, 5'-NGG-3')을 고려한 가이드 RNA를 설계할 수 있다.

CRISPR/Cas9의 Cas9 단백질은 스트렙토코커스 속(streptococcus spp.) 유래를 사용할 수 있다. 예를 들어, Streptococcus pyogenes Cas9(spCas9)을 사용할 수 있으나, 이에 제한하지 않는다. 이 때, 상기 PAM 서열은 5'-NGG-3' (N은 A, T, G, 또는 C임)일 수 있다.

CRISPR/Cas9을 이용하여 표적 유전자 또는 핵산이 절단될 수 있다. 상기 절단된 표적 핵산 부위는 NHEJ 또는 HDR 메커니즘을 통해 박테리아의 지노믹 DNA 상에 변형을 포함할 수 있다.

본 출원에서 일 구체예로서 사용하는 CRISPR/Cas9는 원핵생물 유래 시스템이기 때문에, 박테리아의 지노믹 DNA의 변형에 높은 효율을 가지는 장점이 있다.

특히, 진핵세포와 비교하여, 박테리아 내에서 HDR 메커니즘이 보다 잘 작동하여, 매우 높은 효율로 박테리아의 지노믹 DNA 상에 특정 핵산을 삽입시킬 수 있다.

박테리아의 지노믹 DNA에 항원성 물질이 삽입되면(형질전환 되면), 이는 박테리아 지노믹 DNA의 자체 발현 시스템을 이용하기 때문에, 계속해서 상기 항원성 물질이 발현될 수 있어, 백신의 제조 시마다 형질전환을 수행해야 하는 과정을 생략할 수 있는 장점이 있다.

본 출원의 일 실시예에서는 ctxA, ctxB 및 tcpA 중 1이상의 콜레라 항원성 물질을 높은 효율로 바실러스 내 지노믹 DNA 상에 삽입시켰다.

한편, 상기 CRISPR/Cas9을 이용하여 넉인 시키는 방법 이외에도 ZFN(Zinc-finger nucleases), TALEN(transcription activator-like effector nucleases)을 이용하는 방법 등 넉인이 가능한 기술이라면 이에 제한하지 않는다.

상기 넉인을 할 때 벡터를 이용할 수 있다.

박테리아에 가이드 RNA, Cas9 및 항원성 물질을 이용하여 넉인 시키기 위해 벡터를 제조하여 형질전환 할 수 있다. CRISPR/Cas9 벡터와 항원성 물질 벡터는 하나의 벡터에 Cas9, 가이드 RNA 및 항원성 물질을 포함할 수도 있고, Cas9, 가이드 RNA 및 항원성 물질을 서로 동일한 또는 상이한 벡터에 각각 독립적으로 포함할 수도 있다.

상기 벡터는 바이러스 벡터 또는 비바이러스 벡터일 수 있다.

상기 바이러스 벡터는 레트로바이러스, 렌티바이러스, 아데노바이러스, 아데노-연관 바이러스(AAV), 백시니아바이러스, 폭스바이러스 등의 바이러스 벡터일 수 있으나, 이에 제한하지는 않는다.

상기 비바이러스 벡터는 플라스미드, 네이키드 DNA 등일 수 있으나, 이에 제한하지는 않는다.

또한, 벡터를 이용하는 방법 이외에도, 전기천공법, 유전자총, 자기주입법, 초음파천공법 등을 사용할 수 있으나, 이에 제한하지는 않는다.

박테리아의 지노믹 DNA에 콜레라 항원성 물질을 코딩하는 도너를 삽입한 후, 포자 디스플레이(spore display) 시스템을 이용하기 위하여 상기 박테리아로부터 포자를 형성시키는 단계를 수행한다.

상기 ii) 상기 박테리아의 포자를 형성시키는 단계는 영양분이 고갈된 영양학적 조건, 고온 또는 저온의 온도적 조건, 고수분 또는 저수분의 수분적 조건, 살균제, 보존제 등의 화학적 조건, 산성 또는 알칼리성의 pH적 조건 등을 이용하여 포자를 형성시킬 수 있으나, 이에 한정하지는 않는다.

예를 들어, 본 출원의 콜레라 백신을 제조할 때 박테리아의 포자를 형성시키는 단계는 영양분이 고갈된 영약학적 조건, 고온 또는 저온의 온도적 조건 중 선택되는 어느 하나 이상으로 이루어 질 수 있다.

다음으로, 상기 형성된 박테리아의 포자에서, 포자 표면에 항원성 물질을 발현시키는 단계를 수행한다(상기 iii) 단계).

상기 항원성 물질은 박테리아의 포자 표면에 발현된 포자 코트 단백질과 a) 직접적으로 연결되어 발현되거나 또는 b)간접적으로 연결되어 발현될 수 있다.

상기 a) 직접 발현은 박테리아의 포자 표면에 존재하는 포자 코트 단백질과 항원성 물질이 매개물질(예를 들어, 링커)없이 직접적으로 연결되어 있는 형태를 의미한다.

상기 b) 간접 발현은 박테리아의 포자 표면에 존재하는 포자 코트 단백질과 항원성 물질 사이를 연결시켜주는 링커(linker)에 의해 간접적으로 연결되어 있는 형태를 의미한다.

본 출원의 일 구체예서, 포자 코트 단백질과 콜레라 항원성 물질을 링커로 연결하여 발현시킬 수 있다.

상기 콜레라 백신을 제조하는 방법은 큐어링(curing)단계를 선택적으로 더 포함할 수 있다.

상기 큐어링 단계는 콜레라 백신의 조성에서 목적하는 물질만 수득하거나 원하지 않는 물질을 제거하는 것일 수 있다.

예를 들어, 큐어링 단계는 항생제 내성 유발 물질을 제거하는 것일 수 있다.

예를 들어, 큐어링 단계는, 백신 제조과정에서 첨가된 외래 플라스미드를 제거하는 것일 수 있다.

상기 큐어링 단계는 2회 이상의 계대 배양으로 수행될 수 있으나, 통상의 큐어링 방법이라면 이에 제한하지는 않는다.

상기 콜레라 백신을 제조하는 방법은 부가적인 물질을 추가하는 단계를 더 포함할 수 있다.

이 때, 부가적인 물질은 백신 제조시, 통상적으로 약학적으로 허용 가능한 첨가제라면 모두 포함하는 것으로 한다.

상기 콜레라 백신은 근육내(intramuscular), 비강내(intranasal), 경구(oral), 복강내(intraperitoneal), 피하(subcutaneous), 국소(topical), 피내(intradermal)와 경피(transdermal) 전달용으로 조제된다.

백신의 투여 경로는 근육내, 비강내, 경구, 복강내, 피하, 국소, 피내 그리고 경피 전달에서 선택된다.

5. 콜레라 치료방법

전술한 본 출원의 과제를 해결하기 위하여, 본 출원의 일 양태에 의하면, 콜레라 치료방법이 제공된다.

상기 콜레라 치료방법은 상기 조성물을 유효성분으로 포함하는 조성물을 투여하여 콜레라를 치료하는 방법이 제공된다.

본 출원에서 용어, "투여"는 어떠한 적절한 방법으로 포유류에 본 출원의 약학조성물을 도입하는 것을 의미하며, 본 출원의 약학 조성물의 투여 경로는 목적 조직에 도달할 수 있는 한 어떠한 일반적인 경로를 통하여 투여될 수 있다. 경구 투여, 복강내 투여, 정맥내 투여, 근육내 투여, 피하 투여, 내피 투여, 비내 투여, 폐내투여, 직장내 투여, 강내 투여, 복강내 투여, 경막내 투여될 수 있으며, 이에 제한되지 않는다. 또한 상기 포유류는 사람, 강아지, 쥐, 등을 포함할 수 있으나, 이에 제한되지는 않는다.

또한, 상기 조성물을 유효성분으로 포함하는 조성물을 투여하는 방법은 다음의 예시와 같이 투여될 수 있으나, 이에 한정하지는 않는다.

예를 들어 상기 조성물을 유효성분으로 포함하는 조성물 투여시, 인체에 대한 투여용량은 환자의 나이, 몸무게, 성별, 투여형태, 건강상태 및 질병 정도에 따라 달라질 수 있으며, 몸무게가 70 kg인 성인환자를 기준으로 할 때 일반적으로 1일 0.01 mg 내지 5000 mg이며, 의사 또는 약사의 판단에 따라 일정 시간간격으로 1일 1회 내지 수회로 분할 투여할 수도 있다.

상기 콜레라 백신의 투여량은 동물 당 유도체 1 ㎍ 내지 100 ㎍이 바람직한데, 이 투여량은 동물의 크기에 따라 부분적으로 달라질 수 있다. 예를 들어, 돼지의 경우, 매우 적합한 투여량은 20 ㎍ 내지 80 ㎍이다. 예를 들어, 사람의 경우, 매우 적합한 투여량은 10 ㎍ 내지 100 ㎍이다.

상기 콜레라 백신의 투여 방법은 근육내(intramuscular) 투여, 비강내(intranasal) 투여, 경구(oral) 투여, 복강내(intraperitoneal) 투여, 피하(subcutaneous) 투여, 국소(topical) 투여, 피내(intradermal) 투여, 경피(transdermal) 투여 등의 방법으로 투여될 수 있으나, 통상적인 투여 방법이라면 사용할 수 있다.

예를 들어, 본 출원의 상기 콜레라 백신은 근육내 투여 방법을 사용할 수 있다.

예를 들어, 본 출원의 상기 콜레라 백신은 비강내 투여 방법을 사용할 수 있다.

예를 들어, 본 출원의 상기 콜레라 백신은 경구 투여 방법을 사용할 수 있다.

예를 들어, 본 출원의 상기 콜레라 백신은 복강내 투여 방법을 사용할 수 있다.

예를 들어, 본 출원의 상기 콜레라 백신은 피하 투여 방법을 사용할 수 있다.

예를 들어, 본 출원의 상기 콜레라 백신은 국소 투여 방법을 사용할 수 있다.

예를 들어, 본 출원의 상기 콜레라 백신은 피내 투여 방법을 사용할 수 있다.

예를 들어, 본 출원의 상기 콜레라 백신은 경피 투여 방법을 사용할 수 있다.

본 출원에 의해 개시되는 상기 조성물을 유효성분으로 포함하는 콜레라 백신 조성물이 포유류에 투여될 때 농도가 1mg/kg 내지 100mg/kg으로 투여될 수 있다.

본 출원은 상기 조성물을 유효성분으로 포함하는 조성물을 인간에게 투여하여 콜레라를 치료하는 방법을 제공할 수 있다.

예를 들어, 상기 조성물을 유효성분으로 포함하는 조성물을 인간에게 1mg/kg 내지 100mg/kg 투여하면 콜레라를 치료하는 방법을 제공할 수 있다.

따라서, 본 출원에 의해 개시되는 조성물로 콜레라를 치료하면 병원 원인체의 변이가 일어나더라도 신속하게 대응할 수 있을 뿐만 아니라 기존 콜레라 백신 보다 효과가 더 좋을 수도 있다.

[출원의 실시를 위한 형태]

이하, 실시예를 통하여 본 출원을 더욱 상세히 설명하고자 한다.

본 출원의 하기 일 실시예는 콜레라 백신을 위한 항원, 항체 및 백신 제조에 관한 것이나, 이들 실시예는 오로지 본 출원을 예시하기 위한 것으로 본 출원의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 본 출원이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자에 있어 자명할 것이다.

실시예 1 : 바실러스 실험종과 벡터제작

i)바실러스 실험종

실험에 사용한 바실러스 종은 Bacillus subtilis 168로 Bacillus Genetic Stock Center에서 분양받아 Luria-Bertani (LB) broth와 LB 평판배지를 이용하여 37°C에서 배양하였다. 분양받은 cell stock은 LB 고체배지에서 1차 스크리닝(18hs)을 수행하였고, 1개의 colony를 확보하여 2차 액체 배양(18hs)을 수행하였다.

ii)B. subtilis 포자 형성

B. subtillis를 sporulation salt (1 M CaCl₂ 1ml/L, 0.1 M MnCl₂ 1 ml/L, 0.01 M FeSO₄ 1 ml/L)가 포함된 NB 배지 (nutrient broth 8 g/L, MgSO₄ - 0.25 g/L, KCl - 1 g/L)를 사용하여 37℃ 에서 진탕 배양 (48 h) 후 8,000 rpm 15 min 원심분리, harvest를 수행하였다.

Cold water (D.W.)를 이용해 60% 농축하여 재현탁하고 4℃ overnight (18 h) 반응시켜 주었다. 그 후 80℃에서 30분 heat inactivation을 수행한다. 8,000 rpm 15 min 원심분리, harvest 후 1 X PBS로 재현탁 후 생성된 포자를 4℃ 보관하여 사용하였다.

iii)벡터 제작

(a) pHCas9 발현 벡터 (도 1)

B. subtilis 내 S. pyogenes Cas9(SpCas9) 단백질 발현을 위한 pHCas9 벡터로 pHCas9 발현벡터는 한국생명공학연구원에서 분양받아 사용하였다.

(b) 항원결정기 벡터

B. subtilis Coat protein (CotG)의 가이드 RNA 그리고 promoter를 포함하는 CotG CDS와 항원결정기를 포함하는 유전자복합체인 공여체 DNA를 포함하는 벡터를 제작하였다.

B. subtilis 유전체에서 가이드RNA 제작 프로그램 CCTOP (https://crispr.cos.uni-heidelberg.de)를 이용하여 CotG 영역의 가이드 RNA (SEQ ID NO. 1 : TACGTTCATCCTTAACATATTTTTAAAAGGA)를 제작하였고, 제한효소 NcoI 과 EcoRV를 이용하여 pHY300PLK 벡터에 도입하였고 pJB라 명명하다(도 2).

이 때, 항원결정기로 GFP, Cholera Toxin인 CtxA, CtxB 및 TcpA를 각각 포함하는 벡터를 제작하였다.

ㆍpJB-GFP (도 3)

B. subtilis 포자 표면에 목적한 항원결정기가 위치하는지 확인하기 위해 녹색형광단백질 (eGFP)이 삽입된 발현벡터를 제작하였다. GFP 유전자는 MDH1-PGK-GFP_2.0 벡터에서 primer를 제작(표 1의 SEQ ID NO. 2, 3)하여 PCR을 통해 증폭하였고, 5′ 말단에 제한효소 PstI를, 3′ 말단에 BamHI을 제작하였다. 증폭된 GFP DNA는 제한효소 PstI과 BamHI을 이용하여 pJB001 벡터에서 CtA를 제거하고 도입하여 pJB-GFP를 제작하였다.

ㆍpJB-Cholera Toxin (pJB001 내지 pJB003) (도 4 내지 6)

B. subtilis 포자 표면에 항원결정부위를 올리기 위해 B. subtilis gDNA에서 CotG-Full_F와 CotG-Full_R 프라이머(표 1; SEQ ID NO. 4, 5)를 사용하여 Coat protein (CotG)의 프로모터와 CDS부분을 증폭하였고, 5′ 말단에 제한효소 HindIII을, 3′ 말단에 15 bp의 링커를 포함한 제한효소 PstI을 제작하였다. 또한 항원결정부위는 Vibrio cholerae gDNA에서 cholera toxin A와 B, TcpA 영역을 확인하였고, 제한효소 PstI이 포함된 CtxA_F, CtxB_F, TcpA_F와 BamHI이 포함된 CtxA_R, CtxB_R, TcpA_R을 이용하여 cholera toxin 유전자들을 확보하였다(표 1; SEQ ID NO. 6 내지 11)

확보된 coat protein과 cholera toxin유전자들을 PstI 제한효소를 사용하여 절단하고 T4 Ligase를 이용하여 공여체 DNA를 제작하였다. 제작된 공여체 DNA는 제한효소 HindIII과 BamHI을 이용하여 pJB 벡터에 도입하여 각각 cholera toxin CtA가 삽입된 pJB001, CtB가 삽입된 pJB002, TcpA가 삽입된 pJB003를 제작하였고 명명하였다.

No.	Name	Sequence (5'→ 3')
SEQ ID NO. 2	GFP_F	ATAAAGCTTATGGTGAGCAAG
SEQ ID NO. 3	GFP_R	TATGGATCCTTACTTGTACAG
SEQ ID NO. 4	CotG-Full_F	ATAAAGCTTAGTGTCCCTAGCTCCG
SEQ ID NO. 5	CotG-Full_R	TATCTGCAGTGAACCCCCACCTCCTTTGTATTTCTTTTTG
SEQ ID NO. 6	CtxA_F	ATACTGCAGATGGTAAAGATA
SEQ ID NO. 7	CtxA_R	TATGGATCCGGATGAATTATGA
SEQ ID NO. 8	CtxB_F	ATACTGCAGATGATTAAATTAA
SEQ ID NO. 9	CtxB_R	TATGGATCCTATGGCAAATTAA
SEQ ID NO. 10	TcpA_F	ATACTGCAGATGACATTACTCGAAG
SEQ ID NO. 11	TcpA_R	TATGGATCCGTAACAGTTAA

(c) 항생제결손 벡터(pJB-sg02 내지 pJB-sg03) (도 7 내지 8)

항생제 저항성유전자의 결손을 위해 ampicillin 저항성유전자를 목적으로 하는 가이드 RNA (SEQ ID NO. 12 :CGATACGTGCTCCGGTTCCCAACGATCAAGGA)와 neomycin 저항성 유전자를 목적으로 하는 가이드 RNA (SEQ ID NO. 13 :GACGAGT TATTAATAGCTGAATAAGAACGGT)를 제작하였고, 제한효소 NcoI 과 EcoRV를 이용하여 pJB 벡터에 도입하였고, 항생제 저항성 유전자의 가운데의 염기서열을 결손시킨 공여체 DNA를 사용하여, pJB-sg02 (amp deletion), pJB-sg03 (neo deletion) 벡터를 제작하였다.

실시예 2 : 바실러스 수용성 세포 제작 (B. Subtilis 수용성 세포 (Competent cell) 제작)

B. Subtilis 세포 내에 외래 물질(plasmid, phage DNA 등)을 도입할 수 있도록 다음과 같이 수행하였다.

B. subtilis 수용성 세포의 제작은 하나의 B. subtilis colony를 Growth medium (LB broth + 0.5M Sorbitol)를 이용하여 37°C 진탕배양기에서 1차 배양 (18hs) 후 Growth medium에 1/16 희석하여 O.D600 에서 0.85-0.95가 될 때까지 2차 배양하였다.

배양액을 얼음상에서 10분간 반응하여 차갑게 해주고, 4°C, 5000 X g에서 5분간 원심분리를 수행하여 상층액을 버린고 차가운(ice-cold) Wash buffer (0.5 M sorbitol, 0.5 M mannitol, 10 % glycerol)에 반복하여 4회 세척하였다. 1 - 1.3 * 1010 cfu/mL이 되도록 electroporation solution (0.5 M sorbitol, 0.5 M mannitol, 10 % glycerol)희석하여 수용성 세포를 제작한 후 60 μl 식 분주하여 -80°C 에서 보관하였다.

실시예 3 : B. Subtilis 형질전환체 생성

실시예 2에서 제작된 B. Subtilis 수용성 세포 (Competent cell)에 실시예 1에서 제작된 벡터들을 각각 도입하여 형질전환 시키기 위해 다음과 같이 수행하였다.

B. subtilis의 형질전환은 Gene Pulser System (BIO-RAD. USA)를 이용하여 Electroporation방법 (Xue. et al. 1999)으로 수행하였다. 제작된 B. subtilis 수용성 세포 (60 μl)에 형질전환 발현벡터 5μl (200 ng/μl)를 첨가하여 섞어주고 얼음에서 3분간 반응 후 electroporation cuvette (0.1 cm gap)에 넣어준다. voltage; 2,100 V, time constant; 5 ms, No. of pulses; 1 조건하에서 전기충격을 주어 형질전환 발현벡터를 세포 내 도입되도록 유도한다. 그 후 37°C에서 3시간 배양하며 형질전환 세포의 회복을 유도하고 항생제 선택배지에 도말하여 37°C에서 배양한다.

(a) pHCas9 벡터가 도입된 B. Subtilis 형질전환체

pHCas9 벡터가 도입된 B. Subtilis 형질전환체는 Neomycin (10 μg/mL)을 첨가하여 배양하였다.

(b) pJB-GFP 벡터가 도입된 B. Subtilis 형질전환체

pJB-GFP 벡터가 도입된 B. Subtilis 형질전환체는 Ampicillin (100 μg/mL)과 Neomycin (10 μg/mL)이 첨가된 LB 고체배지에 배양하였다.

(c) pJB-Cholera Toxin (pJB001 내지 pJB003)벡터가 도입된 B. Subtilis 형질전환체

pJB001 내지 pJB003 벡터가 도입된 B. Subtilis 형질전환체는 Ampicillin (100 μg/mL)과 Neomycin (10 μg/mL)이 첨가된 LB 고체배지에 배양하였다.

(d) 항생제결손 벡터(pJB-sg02 내지 pJB-sg03)가 도입된 B. Subtilis 형질전환체

항생제 저항성 유전자의 결손을 위해 pJB-sg02 또는 pJB-sg03 벡터가 도입된 B. Subtilis 형질전환체는 항생제를 넣지 않은 LB 고체배지에 1차 배양 후 각 Colony를 항생제 배지에 옮겨 확인하였고, 항생제 배지에서 자라지 않는 colony를 선별하였다.

실시예 4 : B. subtilis 형질전환체 내의 벡터 도입여부 확인

B. subtilis의 포자에 GFP 발현벡터가 도입되어 포자의 포면에 GFP가 발현되는지 확인하기 위해, PCR 분석 및 유세포 분석을 통해 확인하였다.

ㆍ PCR 분석

형질전환체 B. subtilis의 Colony를 LB broth에서 배양하여 gDNA를 분리하였다. Primer를 제작 (표 2의 SEQ ID NO. 14, 15; In-GFP_F, In-GFP_R)하여 PCR을 수행하여 형질전환체와 야생형의 DNA에서 도입유전자의 여부를 확인하였다.

No.	Name	Sequence (5'→ 3')
SEQ ID NO. 14	In-GFP_F	ATCATGGCCGACAAGCAGAA
SEQ ID NO. 15	In-GFP_R	TCTCGTTGGGGTCTTTGCTC
SEQ ID NO. 16	In-CtxA_F	ATACTGCAGATGGTAAAGATA
SEQ ID NO. 17	In-CtxA_R	TATGGATCCTCATAATTCATCC
SEQ ID NO. 18	In-CtxB_F	ATACTGCAGATGATTAAATTAA
SEQ ID NO. 19	In-CtxB_R	TATGGATCCTTAATTTGCCATA
SEQ ID NO. 20	In-TcpA_F	ATACTGCAGATGACATTACTCGAAG
SEQ ID NO. 21	In-TcpA_R	TATGGATCCTTAACTGTTAC

B. subtilis 세포의 게놈 내에 GFP 발현 벡터가 도입되어 B. subtilis 포자 표면에 GFP 의 발현을 확인하기 위해 수행한 PCR 결과는 도 9에 도시하였다.

도 9에서 GFP의 밴드가 확인되는 것으로 보아, B. subtilis 세포 포자의 표면에 GFP가 발현됨을 알 수 있었다.

ㆍ유세포 분석 (FACS)

B. subtilis의 형질전환체 내의 도입된 유전자 단백질의 표면 발현 검증을 위해 pJB-GFP 벡터를 이용하여 유세포분석을 수행하여 확인하였다.

유동세포 계측법에 의한 분석을 위해 pJB-GFP 벡터로 형질전환 한 B. subtilis를 0.22 ㎛의 여과된 1.5 x PBS로 세척하고, 희석하였다. 미소구의 농도는 106 beads^-1 범위로 계산하였고, B. subtilis 세포는 재현탁 후 몇 분 이내에 유세포 분석기에 주입되었다. FACScalibur (Becton Dickinson, Oxford, UK) 계측기를 사용하여 분석을 수행하였다.

600V의 전압에서 설정된 형광검출기를 통해 515-545nm 범위의 형광을 검출하였다. 전방산란 (FS)은 증폭 계수가 10 인 다이오드로 수집하고 로그 값으로 계산하였다. 366V로 설정된 광전자 증 배관에 의해 로그 값에서 사이드 스캐터 (SS)가 검출되었다. 모든 출력 신호 [형광 (FL), FS 및 SS]에 대해 대수 채널수를 선형 강도로 변환하고 'G 평균'이 있는 기하 평균은 다음과 같이 정의됩니다. G 평균 = 10ΣlogX (i) / n; 각 측정에 대해 10,000 개의 신호를 측정하였다.

B. subtilis 세포내 pJB-GFP 발현 벡터 도입여부를 확인하기 위해 수행한 유세포분석 결과는 도 10에 도시하였다.

도 10에서 pJB-GFP 발현 벡터가 도입되지 않은 wild type 그래프에 비해 pJB-GFP 발현 벡터가 도입된 CotG-GFP, CotC-GFP, CotB-GFP 그래프에서 GFP가 그래프가 확인되는 것으로 보아, PCR 결과와 동일하게, B. subtilis 세포 포자의 표면에 GFP가 발현됨을 알 수 있었다.

실시예 5 : B. subtilis 포자 표면에 목적한 항원결정기의 확인

실시예 4에서 B. subtilis의 포자에 GFP 발현벡터가 도입되어 포자의 포면에 GFP가 발현되는지 확인하였고, GFP 발현벡터 대신 목적하는 항원발현벡터가 포자의 표면에 발현되는지 확인하기 위해, 목적발현벡터(pJB001 내지 pJB003)의 발현여부를 PCR 분석을 통해 확인하였다.

ㆍPCR 분석

형질전환체 B. subtilis의 Colony를 LB broth에서 배양하여 gDNA를 분리하였다. Primer를 제작(표 2의 SEQ ID NO. 16 내지 21; In-CtA_F, In-CtA_R, In-CtB_F, In-CtB_R, In-TcpA_2F, In-TcpA_2R)하여 PCR을 수행하여 형질전환체와 야생형의 DNA에서 도입유전자의 여부를 확인하였다.

B. subtilis 포자 표면에 목적한 항원의 발현 벡터 발현여부를 확인하기 위해 수행한 PCR 결과는 도 11에 도시하였다.

도 11에서 CtxA, CtxB, TcpA의 증폭 밴드를 확인할 수 있었으며, 이를 통해 B. subtilis의 포자 포면에 목적하는 항원이 발현됨을 알 수 있었다.

실시예7 : 항체형성 확인

B. subtilis 포자의 게놈내에 삽입되어진 항생제 저항성 유전자(예를 들어, neo, amp 등)를 제거하기 위하여, Cholera toxin 발현벡터가 도입된 B. subtilis 형질전환체를 pJB-sg02, 03 벡터로 형질전환을 수행하여 항생제 저항성 유전자의 결손을 유도하였다. 형질전환체를 항생제가 첨가되지 않은 LB 평판 배지에 도말 한 후 형성된 각각의 단일 colony를 항생제 LB 평판 배지에 음성 선택 배양하였고, 항생제 LB 평판 배지에서 자라지 않는 colony를 선별하여 항생제 유전자 결손 B. subtilis를 확보하였다.

항생제 유전자가 결손된 목적 항원이 발현되는 B. subtilis의 형질전환체를 이용한 면역형성을 확인하기 위하여 B. subtilis 포자는 80˚C에서 20분 동안 고온처리하여 불활화 단계를 거쳐 동물실험에 사용하였다. Mouse는 C57BL/6, 암컷, 8주령을 사용하였고, 5마리의 mouse를 한 그룹으로 설정하였다.

투여 경로는 점막을 통한 면역형성을 확인하기 위해 mouse용 존데를 이용하여 위내 직접 투여하였고, dose는 5x10^10 spore/0.2ml로 하였다. 투여는 총 3회로 진행하였고, 1회 투여 시 3일 연속으로 투여하고 각 회 차의 간격은 2주로 하였다.

항체형성확인 실험은 동물실험을 이용한 ELISA와 western blot으로 분석하였다.

ELISA와 western blot에 필요한 혈청은 투여 하루 전 가벼운 마취 후 안와채혈하여 실온에서 30~60분간 비동화한 후 6000rpm, 7min, 4℃에서 원심분리하여 상층액만 분리하여 수행하였다.

ㆍIndirect ELISA 분석

Plate에 항원을 coating 하는 방법을 사용하였고 cholera toxin 특이적 항체형성 검출을 위해 정제된 cholera toxin peptide 또한 100 ng/well의 농도로 코팅하였다. 코팅용액은 0.05M의 Carbonate/bicarbonate buffer (pH 9.6)을 사용하였다.

항체의 희석 배수 그리고 이차 항체의 희석배수를 결정하여 ELISA 분석 조건을 확립하기 위해 고정화 용액 (1% BSA)을 사용하여 분석하였다. 일차 항체의 희석배수를 1:10 부터 1:10,000까지, 이차 항체는 Goat-anti-mouse IgG-HRP를 사용하였으며, 희석 배수는 1:5,000부터 1:160,000까지의 범위로 정하여 분석 분석하였다. 반응 정도 (B_T/B₀)의 값이 50%를 유지하는 농도 (1:10,000)를 선택하여 분석 실험에 사용하는 최적 농도로 결정하였다.

세척 용액은 0.05%의 Tween 20을 첨가한 PBS buffer를 사용하였고, 각 단계의 반응은 상온에서 2시간 배양하여 반응시켰다. 기질 용액은 TMB를 사용하였고, 반응의 종결은 0.16 M H₂SO₄ (stop solution) 100 ul을 주입하여 반응을 멈춘 후 ELISAreader (TECAN SUNRISE, BioSurplus)에서 450 nm의 파장에서 O.D값을 측정하였다(도 12).

도 12에는 Indirect ELISA 분석 결과를 도시하였다.

도 12의 ELISA 결과를 통해, 항원을 투여한 쥐의 혈액에서 항원 특이적 항체 중 CtxA는 2주차에 CtxB, TcpA는 4주차에 생성됨을 도 12의 결과를 통해 알 수 있었다.

ㆍWestern blot 분석

cholera toxin peptide 500ng/ml를 10% SDS-PAGE gel에 loading하여 단백질을 분리하였다. 분리된 단백질은 4℃ cold room에서 polyvinylidene difluoride membrane (PVDF, Bio-rad)에 100 mA로 2시간 동안 전사시킨 후, 5% skim milk가 포함된 TBST (Tris buffered saline with Tween 20, pH 7.5) 용액으로 상온에서 1시간 동안 blocking하였다. Primary antibody로는 Anti-Ovalbumin antibody (abcam)를 1:1000으로 5% skim milk에 희석해서 사용하였고, Mouse에서 Ovalbumin의 항체 발현 양을 검토하기 위해서는 Mouse에서 채취한 혈액의 혈청 (Serum)을 5% skim milk에 1:10 또는 1:100으로 희석하여 사용하였다. 각각 4℃에서 18시간 동안 반응시킨 후 TBST로 5분씩 3회 세정하였다. 2차 항체로는 horse radish peroxidase (HRP)가 결합된 goat anti-mouse IgG H&L (abcam)를 1:20,000으로 5% skim milk에 희석하여 상온에서 1시간 반응시킨 후, TBST로 3회 세정하였다. ECL (Thermo Scientific, Rockford, IL, USA) 기질과 1~3분간 반응한 후 각각의 단백질 밴드는 LAS-3000으로 가시화하였다(도 13).

도 13에는 Western blot 분석 결과를 도시하였다.

도 13의 결과를 통해, 항원을 투여한 쥐의 혈액에서 항원 특이적 항체 중 CtxA는 2주차에 CtxB, TcpA는 4주차에 생성됨을 도 13를 통해 확인할 수 있었다.

도 12 및 13의 Indirect ELISA 및 Western blot 분석을 통해 본 출원의 방법으로 만들어진 CRISPR/Cas9 기반의 Bacillus subtillis 포자는 목적하는 항원인 콜레라 항원이 B. subtilis의 포자의 표면에 발현되어 항체를 형성할 수 있음을 확인할 수 있었다.

<110> JBBiotech <120> Cholera vaccine using CRISPR/Cas9 based Bacillus subtillis genome editing mechanism <130> CP19-055 <160> 21 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 31 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CotG_gRNA <400> 1 tacgttcatc cttaacatat ttttaaaagg a 31 <210> 2 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> GFP_F <400> 2 ataaagctta tggtgagcaa g 21 <210> 3 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> GFP_R <400> 3 tatggatcct tacttgtaca g 21 <210> 4 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CotG-Full_F <400> 4 ataaagctta gtgtccctag ctccg 25 <210> 5 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CotG-Full_R <400> 5 tatctgcagt gaacccccac ctcctttgta tttctttttg 40 <210> 6 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CtxA_F <400> 6 atactgcaga tggtaaagat a 21 <210> 7 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CtxA_R <400> 7 tatggatccg gatgaattat ga 22 <210> 8 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CtxB_F <400> 8 atactgcaga tgattaaatt aa 22 <210> 9 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CtxB_R <400> 9 tatggatcct atggcaaatt aa 22 <210> 10 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> TcpA_F <400> 10 atactgcaga tgacattact cgaag 25 <210> 11 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> TcpA_R <400> 11 tatggatccg taacagttaa 20 <210> 12 <211> 32 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> ampicillin_gRNA <400> 12 cgatacgtgc tccggttccc aacgatcaag ga 32 <210> 13 <211> 31 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> neomycin_gRNA <400> 13 gacgagttat taatagctga ataagaacgg t 31 <210> 14 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> In-GFP_F <400> 14 atcatggccg acaagcagaa 20 <210> 15 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> In-GFP_R <400> 15 tctcgttggg gtctttgctc 20 <210> 16 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> In-CtxA_F <400> 16 atactgcaga tggtaaagat a 21 <210> 17 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> In-CtxA_R <400> 17 tatggatcct cataattcat cc 22 <210> 18 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> In-CtxB_F <400> 18 atactgcaga tgattaaatt aa 22 <210> 19 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> In-CtxB_R <400> 19 tatggatcct taatttgcca ta 22 <210> 20 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> In-TcpA_F <400> 20 atactgcaga tgacattact cgaag 25 <210> 21 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> In-TcpA_R <400> 21 tatggatcct taactgttac 20

Claims (17)

1. i) 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis)의 포자;
   ii) 상기 바실러스 서브틸리스 포자의 표면에 존재하는 포자 코트 단백질인 CotG 단백질;
   iii) 상기 포자 코트 단백질에 연결된 펩타이드로 구성된 링커(linker);
   iv) 상기 링커에 연결되어 발현하는, CtxA, CtxB, TcpA 중 선택되는 어느 하나 이상의 인간 유래 콜레라 항원성 물질;
   을 포함하고,
   상기 바실러스 서브틸리스 포자의 지노믹 DNA 서열 중 CotG 영역을 코딩하는 서열 내에 외래성(exogenous)의 CotG를 코딩하는 서열, 링커를 코딩하는 서열, 인간 유래 콜레라 항원성 물질을 코딩하는 서열이 순서대로 삽입되어 있는 지노믹 DNA를 가진 포자인 것을 특징으로 하는,
   인간 콜레라 예방 또는 치료용 백신 조성물.
   
2. 삭제
3. 삭제
4. 삭제
5. 삭제
6. 삭제
7. 삭제
8. 삭제
9. 제 1항에 있어서,
   상기 조성물에서 콜레라 항원성 물질의 농도는 상기 조성물 기준으로 10¹² ~10¹⁴개/ml 농도인 것을 특징으로 하는 인간 콜레라 예방 또는 치료용 백신 조성물.
   
10. 삭제
11. 삭제
12. 제 1항에 있어서,
    상기 백신 조성물은 경구 투여용, 복강내 투여용, 정맥내 투여용, 근육내 투여용, 피하 투여용, 내피 투여용, 비내 투여용, 폐내 투여용, 직장내 투여용, 강내 투여용, 복강내 투여용, 경막내 투여용 중 선택되는 어느 하나 이상인 것을 특징으로 하는 인간 콜레라 예방 또는 치료용 백신 조성물.
    
13. 제 1항에 있어서,
    안정제, 유화제, 수산화알루미늄, 인산알루미늄, pH 조정제, 계면활성제, 리포솜, 이스콤 (iscom) 보조제, 합성 글리코펩티드, 증량제, 카복시폴리메틸렌, 세균 세포벽, 세균 세포벽의 유도체, 세균백신, 동물 폭스바이러스 단백질, 바이러스 일부 (subviral) 입자 보조제, 콜레라 독소, N, N-디옥타데실-N',N'-비스(2-하이드록시에틸)-프로판디아민, 모노포스포릴 지질 A, 디메틸디옥타데실-암모늄 브로마이드 중 선택되는 어느 하나 이상을 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는 인간 콜레라 예방 또는 치료용 백신 조성물.
    
14. 다음을 바실러스 서브틸리스에 도입하는 단계
    i) Cas9 단백질 또는 이를 코딩하는 핵산;
    ii) 서열번호 1로 코딩되는 핵산 또는 이로부터 전사된 가이드 RNA(guide RNA);
    - 이 때, 상기 가이드 RNA는 상기 바실러스 서브틸리스의 게놈 DNA 서열 중 CotG를 코딩하는 서열의 일부를 타겟함-;
    iii) 외래성(exogenous)의 CotG를 코딩하는 핵산, 링커를 코딩하는 핵산, 콜레라 항원성물질인 CtxA, CtxB, TcpA 중 적어도 어느 하나를 코딩하는 핵산, 및 항생제 저항성 유전자를 코딩하는 핵산을 포함하는 도너;
    상기 바실러스 서브틸리스의 게놈 DNA 서열 중 CotG를 코딩하는 서열 내에 상기 도너가 삽입된 게놈 DNA를 가지고 있는 바실러스 서브틸리스를 선택하는 단계;
    상기 선택된 바실러스 서브틸리스의 게놈 내에 삽입된 상기 항생제 저항성 유전자를 넉아웃 시키는 단계;
    상기 항생제 저항성 유전자가 넉아웃된 바실러스 서브틸리스를 선택하는 단계;
    상기 선택된 바실러스 서브틸리스로 포자를 형성시키는 단계;
    를 포함하는 것을 특징으로 하는 콜레라 예방 또는 치료용 백신 제조방법.
    
15. 제 14항에 있어서,
    상기 도입은 벡터를 이용하는 것을 특징으로 하는 콜레라 예방 또는 치료용 백신 제조방법.
    
16. 제 14항에 있어서,
    포자를 형성시키는 단계는 영양분이 고갈된 영약학적 조건을 이용하는 방법; 및
    고온 또는 저온의 온도적 조건을 이용하는 방법;
    중 선택되는 어느 하나 이상으로 수행되는 것을 특징으로 하는 콜레라 예방 또는 치료용 백신 제조방법.
    
17. 제 14항에 있어서,
    상기 항생제 저항성 유전자를 넉아웃 시키는 단계는,
    항생제 저항성 유전자 영역을 표적으로 하는 가이드 RNA인 서열번호 12 또는 서열번호 13 중 선택되는 어느 하나를 포함하는 벡터를 추가로 도입하여 상기 항생제 저항성 유전자를 코딩하는 핵산 서열 내에 인델을 형성시키는 것을 특징으로 하는 콜레라 예방 또는 치료용 백신 제조방법.

Images