KR102076417B1 - 측방유동분석법을 이용한 세균성 폐렴균의 검출 방법 및 키트 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 PCR을 이용한 분자생물학적 검출 방법과 측방유동분석법의 장점만을 모아서 정형성 폐렴균 및 비정형성 폐렴균을 하나의 키트에서 동시에 검출할 수 있다. 구체적으로, 본 발명은 측방유동분석 디바이스, 예를 들어 멤브레인 스트립에서 스트렙토코커스 뉴모니에(정형성 폐렴균) 및 마이코플라즈마 뉴모니에(비정형성 폐렴균)의 표적유전자에 대한 PCR 증폭산물의 검출이 가능하게 함으로써 고가의 분자진단장비 없이도 스트렙토코커스 뉴모니에 및 마이코플라즈마 뉴모니에를 저렴하고 간편하게 하나의 키트에서 효율적으로 검출할 수 있다.
Description
본 발명은 측방유동분석법을 이용한 세균성 폐렴균의 검출 방법 및 키트에 관한 것으로서, 보다 상세하게는 PCR을 이용한 분자생물학적 검출 방법과 측방유동분석법의 장점만을 모아서 정형성 폐렴균 및 비정형성 폐렴균을 하나의 키트에서 동시에 검출할 수 있는 방법 및 이를 위한 키트에 관한 것이다.
또한, 본 발명은 측방유동분석 디바이스에서 스트렙토코커스 뉴모니에(정형성 폐렴균) 및 마이코플라즈마 뉴모니에(비정형성 폐렴균)의 표적유전자에 대한 PCR 증폭산물의 검출이 가능하게 함으로써 고가의 분자진단장비 없이도 스트렙토코커스 뉴모니에 및 마이코플라즈마 뉴모니에를 저렴하고 간편하게 하나의 키트에서 효율적으로 검출할 수 있는 방법 및 이를 위한 키트에 관한 것이다.
세균성 또는 박테리아성 폐렴은 호흡을 통해 폐에 침투된 세균에 의해 발생하는 폐의 염증을 말하며, 다양한 원인균이 폐렴을 일으킬 수 있다. 세균성 폐렴은 환자의 기침, 재채기, 접촉 등의 형태로 다른 사람에게 쉽게 전파될 수 있다. 가장 대표적인 세균성 폐렴의 원인균은 폐렴 구균으로 이로 인한 폐렴을 정형성 폐렴이라 부른다. 정형성 폐렴을 제외하고 발생하는 폐렴을 비정형성 폐렴이라 부른다. 비정형성 폐렴을 일으키는 다양한 원인균이 있지만, 대표적인 비정형성 폐렴균은 마이코플라즈마, 클라미디어, 레지오넬라 등이 있다.
정형성 폐렴은 사슬알균의 일종인 스트렙토코커스 뉴모니에(Streptococcus pneumoniae)에 의해 발생한다. 정형성 폐렴의 경우 성인에서는 폐렴 증상이 가장 흔하고 소아에서는 중이염, 부비동염, 폐렴 및 균혈증 등이 흔하다. 정형성 폐렴의 확인진단은 무균성 체액인 혈액, 뇌척수액, 관절액, 늑막액, 심낭액, 복수 또는 생검 조직에서 균을 분리·동정한다. 또한, 항원검출 및 유전자 검출에 의해 정형성 폐렴의 진단도 가능하다.
마이코플라즈마는 세포벽이 없어 그 형태가 일정하지 않고, 인공배지에서 증식이 가능한 세균 중 가장 작은 세균이다. 많은 종류의 마이코플라즈마가 보고되었고, 이중에서 폐렴을 유발하는 마이코플라즈마 뉴모니에(Mycoplasma pneumoniae)와, 비뇨생식기계에 감염을 유발하는 마이코플라즈마 호미니스(M. hominis), 마이코플라즈마 제니탈리움(M. genitalium) 및 유레아플라즈마 유레아라이티컴(U. urealyticum)의 4종이 병원성 마이코플라즈마 균으로 알려져 있다. 마이코플라즈마 뉴모니에 감염 시 폐렴, 수포성 고막염, 인플루엔자와 유사한 증상, 발진 등 다양한 증상을 보이며, 진단은 기본적으로 균 분리배양을 진행한 후 항체를 이용하여 진단한다. 일반적으로 광학현미경으로 관찰할 수 없어 최근 PCR을 이용한 분자진단법이 유용하게 적용되고 있다.
이러한 세균성 폐렴의 원인균을 확인하는데 있어 기본적으로 배양법이 진행되지만, 배양법의 경우 실험자의 숙련도에 의해 결과가 달라질 수 있으며 배양과정에서 오염이 발생할 수 있고 추가적인 항체를 이용한 확인이 필요한 단점이 있다. 임상적 증상만으로는 세균성과 바이러스성 폐렴을 구분하기 어렵고 세균성 폐렴을 유발하는 다양한 세균이 존재하기 때문에 배양법으로는 동시에 다양한 원인균에 대한 분리·동정이 어려워 유전자 검사법으로 확인하는 것이 효율적인 것으로 알려져 있다.
세균성 폐렴은 유아, 노인 등에게 발병하며 면역력이 떨어진 중환자에게 발병 시 생명에 위협을 주는 치명적인 질환이다. 분자생물학적 진단법이 다른 세균성 폐렴 진단법과 비교하였을 때 많은 장점을 가지고 있지만 고가의 분자진단장비가 필요한 단점이 있어 낮은 검사비용의 진단법의 개발과 보급이 시급한 실정이다.
따라서, 본 발명이 속한 기술분야에서는 종래의 PCR을 이용한 분자생물학적 진단법 보다는 비용이 저렴하면서 간편하고 민감도 높게 정형성 폐렴균 및 비정형성 폐렴균을 동시에 검출할 수 있는 새로운 기술의 제공이 요구되고 있다고 할 수 있다.
한편, 상기한 배경기술로서 설명된 사항들은 본 발명의 배경에 대한 이해 증진을 위한 것일 뿐, 본 발명의 "선행 기술"로서 이용될 수 있다는 승인으로서 인용한 것은 아님을 이해하여야 한다.
본 발명의 목적은 측방유동분석법을 이용한 세균성 폐렴균의 검출 방법 및 키트를 제공하는데 있다. 구체적으로, 본 발명의 목적은 PCR을 이용한 분자생물학적 검출 방법과 측방유동분석법의 장점만을 모아서 정형성 폐렴균 및 비정형성 폐렴균을 하나의 키트에서 동시에 검출할 수 있는 방법 및 이를 위한 키트를 제공하는데 있다.
또한, 본 발명의 목적은 측방유동분석 디바이스에서 스트렙토코커스 뉴모니에(정형성 폐렴균) 및 마이코플라즈마 뉴모니에(비정형성 폐렴균)의 표적유전자에 대한 PCR 증폭산물의 검출이 가능하게 함으로써 고가의 분자진단장비 없이도 스트렙토코커스 뉴모니에 및 마이코플라즈마 뉴모니에를 저렴하고 간편하게 하나의 키트에서 효율적으로 검출할 수 있는 방법 및 이를 위한 키트를 제공하는데 있다.
그러나, 전술한 바와 같은 본 발명의 과제는 예시적인 것으로, 이에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것은 아니다. 또한, 본 발명의 다른 목적 및 이점은 하기의 발명의 상세한 설명, 청구범위 및 도면에 의해 보다 명확하게 된다.
상기한 발명의 기술적 과제를 해결하고 상기한 발명의 목적에 부합되도록 예의 연구를 거듭한 결과, 본 발명자는 스트렙토코커스 뉴모니에(Streptococcus pneumoniae)의 검출을 위해 뉴모라이신(pneumolysin) 유전자를 표적유전자로 선정하고 마이코플라즈마 뉴모니에(Mycoplasma pneumoniae)의 검출을 위해 CARDS 톡신 유전자를 표적 유전자로 선정한 후 이들 표적유전자들 각각의 공통서열을 선택하여 스트렙토코커스 뉴모니에 및 마이코플라즈마 뉴모니에의 판별을 위한 특이적인 프라이머들을 각각 설계하였고, 이들 프라이머들에 의해 증폭된 PCR 증폭산물, 즉 스트렙토코커스 뉴모니에 및 마이코플라즈마 뉴모니에의 표적유전자에 대한 PCR 증폭산물을 면역학적 분석법인 측방유동분석법으로 확인할 수 있는 검사 키트 및 방법을 고안하기에 이르렀다.
본 명세서에서 사용되는 용어인 "검체"란 감염 의심 환자의 객담, 타액, 혈액 외에도 스트렙토코커스 뉴모니에 및/또는 마이코플라즈마 뉴모니에의 유전자 검출이 가능한 각종 시료, 예를 들어 뇌척수액, 관절액, 늑막액, 심낭액, 복수 또는 생검 조직 등도 포함하는 개념으로 사용된다.
본 명세서에서 사용되는 용어인 "유전자 샘플"이란 DNA, RNA, 역전사 효소에 의해 RNA로부터 생성된 cDNA, pre-PCR (예비 PCR)을 통해 증폭된 DNA 또는 cDNA 등을 포함하는 광의의 개념으로 사용된다.
본 명세서에서 "측방 유동 분석 디바이스", "측방 유동 분석 스트립" 또는 "측방 유동 분석 멤브레인 스트립"은 PCR 증폭산물이 모세관 현상으로 흐를 수 있는 다공성 막인 멤브레인에 적어도 2종의 항체가 고정되어 있고, 멤브레인의 상류 측에는 적하되는 PCR 증폭산물을 흡수하고 균일한 유동을 보장하는 로딩패드를 구비할 수 있다. 로딩패드에는 PCR 증폭산물에 포함된 비오틴(또는 이와 동등한 물질)과 선택적으로 결합할 수 있는 스트렙타비딘(또는 이와 동등한 물질)이 접합된 금 나노입자들이 침지되어 있을 수 있다. 로딩패드는 PCR 증폭산물이 적하되는 샘플패드와, 스트렙타비딘(또는 이와 동등한 물질)이 접합된 금 나노입자들이 침지된 접합 패드로 구성될 수 있고, 멤브레인의 하류 측에는 모세관 현상을 촉진하는 흡수 패드가 구비될 수 있다.
본 발명의 일 구체예의 측방유동분석법을 이용한 세균성 폐렴의 검출 방법은,
스트렙토코커스 뉴모니에의 검출을 위한 표적유전자인 스트렙토코커스 뉴모니에의 뉴모라이신(pneumolysin) 유전자에 특이적으로 결합하는 제1 정방향 프라이머의 5' 말단에 제1 태그를 표지하고, 마이코플라즈마 뉴모니에의 검출을 위한 표적유전자인 마이코플라즈마 뉴모니에의 CARDS 톡신 유전자에 특이적으로 결합하는 제2 정방향 프라이머 5' 말단에 제2 태그를 표지하며, 스트렙토코커스 뉴모니에의 검출을 위한 표적유전자인 스트렙토코커스 뉴모니에의 뉴모라이신(pneumolysin) 유전자에 특이적으로 결합하는 제1 역방향 프라이머의 5' 말단 및 마이코플라즈마 뉴모니에의 검출을 위한 표적유전자인 마이코플라즈마 뉴모니에의 CARDS 톡신 유전자에 특이적으로 결합하는 제2 역방향 프라이머의 5' 말단에 제3 태그를 표지하는 단계와,
상기 제1 정방향 프라이머 및 상기 제1 역방향 프라이머의 쌍과, 상기 제2 정방향 프라이머 및 상기 제2 역방향 프라이머의 쌍을 이용하여, 검체 내의 유전자 샘플을 PCR로 증폭하는 단계와,
상기 PCR 증폭산물을 측방 유동 분석 디바이스의 일측에 로딩하여 상기 제3 태그와 특이적으로 결합하는 결합자가 접합된 금 나노입자와의 복합체를 형성시키는 단계와,
상기 복합체를 상기 측방 유동 분석 디바이스의 타측으로 이동시키고, 상기 복합체를 상기 측방 유동 분석 디바이스의 제1 테스트 라인 내의 항-제1 태그 항체와, 상기 제1 테스트 라인과 거리를 두고 위치하는 제2 테스트 라인 내의 항-제2 태그 항체와 결합시키는 단계와,
상기 제1 테스트 라인 및 상기 제2 테스트 라인에서 상기 복합체의 금 나노입자의 모임에 의해 나타나는 밴드 형성 여부를 확인하여 상기 검체 내의 스트렙토코커스 뉴모니에 및 마이코플라즈마 뉴모니에를 검출하는 단계를 포함한다.
상기 제1 테스트 라인에서 밴드가 형성되면 상기 검체 내에 스트렙토코커스 뉴모니에가 존재하는 것이고, 상기 제2 테스트 라인에서 밴드가 형성되면 상기 검체 내에 마이코플라즈마 뉴모니에가 존재하는 것으로 판단할 수 있다.
본 발명의 일 구체예의 세균성 폐렴의 검출 방법에 있어서, 상기 제1 태그는 디곡시게닌(DIG)일 수 있고, 상기 제2 태그는 플루오레세인일 수 있다.
본 발명의 일 구체예의 세균성 폐렴의 검출 방법에 있어서, 상기 항-제1 태그 항체는 항-DIG 항체일 수 있고, 상기 항-제2 태그 항체는 항-FITC 항체일 수 있다.
본 발명의 일 구체예의 세균성 폐렴의 검출 방법에 있어서, 상기 제3 태그는 비오틴일 수 있고, 상기 결합자는 스트렙타비딘일 수 있다.
본 발명의 일 구체예의 세균성 폐렴의 검출 방법에 있어서, 상기 제1 정방향 프라이머 및 상기 제1 역방향 프라이머는 각각 서열번호 1의 프라이머 및 서열번호 2의 프라이머일 수 있다.
본 발명의 일 구체예의 세균성 폐렴의 검출 방법에 있어서, 상기 제2 정방향 프라이머 및 상기 제2 역방향 프라이머는 각각 서열번호 3의 프라이머 및 서열번호 4의 프라이머일 수 있다.
본 발명의 일 구체예의 측방유동분석법을 이용한 세균성 폐렴의 검출 키트는,
스트렙토코커스 뉴모니에의 검출을 위한 표적유전자인 스트렙토코커스 뉴모니에의 뉴모라이신(pneumolysin) 유전자에 특이적으로 결합하고 5' 말단에 제1 태그가 표지된 제1 정방향 프라이머;
마이코플라즈마 뉴모니에의 검출을 위한 표적유전자인 마이코플라즈마 뉴모니에의 CARDS 톡신 유전자에 특이적으로 결합하고 5' 말단에 제2 태그가 표지된 제2 정방향 프라이머;
스트렙토코커스 뉴모니에의 검출을 위한 표적유전자인 스트렙토코커스 뉴모니에의 뉴모라이신(pneumolysin) 유전자에 특이적으로 결합하고 5' 말단에 제3 태그가 표지된 제1 역방향 프라이머; 및
마이코플라즈마 뉴모니에의 검출을 위한 표적유전자인 마이코플라즈마 뉴모니에의 CARDS 톡신 유전자에 특이적으로 결합하고 5' 말단에 제3 태그가 표지된 제2 역방향 프라이머를 포함하는 PCR 증폭용 조성물과,
상기 제3 태그와 특이적으로 결합하는 결합자가 접합된 금 나노입자들이 일측에 제공되고, 상기 제1 태그와 특이적으로 결합하는 항-제1 태그 항체를 갖는 제1 테스트 라인과, 상기 제2 태그와 특이적으로 결합하는 항-제2 태그 항체를 갖고 상기 제1 테스트 라인과 거리를 두고 위치하는 제2 테스트 라인을 구비한 측방 유동 분석 디바이스를 포함한다.
본 발명의 일 구체예의 세균성 폐렴의 검출 키트에 있어서, 상기 제1 태그는 디곡시게닌(DIG)일 수 있고, 상기 제2 태그는 플루오레세인일 수 있다.
본 발명의 일 구체예의 세균성 폐렴의 검출 키트에 있어서, 상기 항-제1 태그 항체는 항-DIG 항체일 수 있고, 상기 항-제2 태그 항체는 항-FITC 항체일 수 있다.
본 발명의 일 구체예의 세균성 폐렴의 검출 키트에 있어서, 상기 제3 태그는 비오틴일 수 있고, 상기 결합자는 스트렙타비딘일 수 있다.
본 발명의 일 구체예의 세균성 폐렴의 검출 키트에 있어서, 상기 PCR 증폭용 조성물은 DNA 중합효소, dNTPs 및 PCR 완충용액을 더 포함할 수 있다.
본 발명의 일 구체예의 세균성 폐렴의 검출 키트에 있어서, 상기 제1 정방향 프라이머 및 상기 제1 역방향 프라이머는 각각 서열번호 1의 프라이머 및 서열번호 2의 프라이머일 수 있다.
본 발명의 일 구체예의 세균성 폐렴의 검출 키트에 있어서, 상기 제2 정방향 프라이머 및 상기 제2 역방향 프라이머는 각각 서열번호 3의 프라이머 및 서열번호 4의 프라이머일 수 있다.
본 발명에 따르면, PCR을 이용한 분자생물학적 검출 방법과 측방유동분석법의 장점만을 모아서 정형성 폐렴균 및 비정형성 폐렴균을 하나의 키트에서 동시에 검출할 수 있다.
구체적으로, 본 발명은 측방유동분석 디바이스, 예를 들어 멤브레인 스트립에서 스트렙토코커스 뉴모니에(정형성 폐렴균) 및 마이코플라즈마 뉴모니에(비정형성 폐렴균)의 표적유전자에 대한 PCR 증폭산물의 검출이 가능하게 함으로써 고가의 분자진단장비 없이도 스트렙토코커스 뉴모니에 및 마이코플라즈마 뉴모니에를 저렴하고 간편하게 하나의 키트에서 효율적으로 검출할 수 있다.
따라서, 본 발명은 스트렙토코커스 뉴모니에 및/또는 마이코플라즈마 뉴모니에에 감염된 환자 내지는 보균자를 저렴한 비용으로 신속하고 정확하게 진단하여 세균성 폐렴균이 병원, 학교 등 다수의 인원이 생활하는 공간에서 전염되는 것을 사전에 차단할 수 있다.
한편, 전술한 바와 같은 효과들에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것은 아니다.
도 1은 스트렙토코커스 뉴모니에의 검출을 위한 표적유전자인 뉴모라이신(pneumolysin) 유전자에 대한 상동성 분석결과를 나타내는 도면이다.
도 2는 마이코플라즈마 뉴모니에의 검출을 위한 표적유전자인 CARDS 톡신 유전자에 대한 상동성 분석결과를 나타내는 도면이다.
도 3은 본 발명의 일 구체예에 따른 측방 유동 분석 디바이스의 주요 구조를 나타내는 도면이다.
도 4는 도 3에 도시된 측방 유동 분석 디바이스를 이용하여 스트렙토코커스 뉴모니에(S. pneumoniae) 및 마이코플라즈마 뉴모니에(M. pneumoniae)의 표적유전자의 PCR 증폭산물에 대해 측방 유동 분석을 수행한 결과를 나타내는 도면이다.
도 2는 마이코플라즈마 뉴모니에의 검출을 위한 표적유전자인 CARDS 톡신 유전자에 대한 상동성 분석결과를 나타내는 도면이다.
도 3은 본 발명의 일 구체예에 따른 측방 유동 분석 디바이스의 주요 구조를 나타내는 도면이다.
도 4는 도 3에 도시된 측방 유동 분석 디바이스를 이용하여 스트렙토코커스 뉴모니에(S. pneumoniae) 및 마이코플라즈마 뉴모니에(M. pneumoniae)의 표적유전자의 PCR 증폭산물에 대해 측방 유동 분석을 수행한 결과를 나타내는 도면이다.
이하 본 발명을 하기 실시예에서 보다 상세하게 기술한다. 다만, 하기 실시예는 본 발명의 내용을 예시하는 것일 뿐 본 발명의 권리범위를 제한하거나 한정하는 것이 아니다. 본 발명의 상세한 설명 및 실시예로부터 본 발명이 속하는 기술분야의 통상의 기술자가 용이하게 유추할 수 있는 것은 본 발명의 권리범위에 속하는 것으로 해석된다. 본 발명에 인용된 참고문헌들은 본 발명에 참고로서 통합된다.
명세서 전체에서, 어떤 부분이 어떤 구성 요소를 "포함"한다고 할 때, 이는 특별히 반대되는 기재가 없는 한 다른 구성 요소를 제외하는 것이 아니라 다른 구성 요소를 더 포함할 수 있는 것을 의미한다.
실시예 1: 스트렙토코커스 뉴모니에 유전자 상동성 분석
스트렙토코커스 뉴모니에(S. pneumoniae)를 확인하기 위한 표적유전자로 뉴모라이신(pneumolysin) 유전자를 선택하였고 Genbank에 등록되어 있는 스트렙토코커스 뉴모니에의 서열정보를 이용하여 상동성 분석을 진행하였다. 스트렙토코커스 뉴모니에의 유전자 상동성은 공개용 상동성 분석 프로그램인 MEGA 7.0 (https://www.megasoftware.net/)을 이용하여 분석하였다. 스트렙토코커스 뉴모니에의 상동성 분석을 위한 서열정보는 하기의 표 1과 같다.
| S. pneumoniae | |
| AP018044.1 | AP018391.1 |
| CP018838.1 | CP020551.1 |
| CP025256.1 | CP026670.1 |
| EF413934.1 | EF413956.1 |
| FQ312042.1 | KP110734.1 |
실시예 2: 마이코플라즈마 뉴모니에 유전자 상동성 분석
마이코플라즈마 뉴모니에(M. pneumoniae)의 CARDS 톡신 유전자를 표적유전자로 선택하였고 Genbank에 등록되어 있는 마이코플라즈마 뉴모니에의 서열정보를 이용하여 상동성 분석을 진행하였다. 마이코플라즈마 뉴모니에의 유전자 상동성 분석 역시 공개용 상동성 분석 프로그램인 MEGA 7.0을 이용하여 분석하였다. 마이코플라즈마 뉴모니에의 상동성 분석을 위한 서열정보는 하기의 표 2와 같다.
| M. pneumoniae | ||||||
| AB024618.1 | AB678699.1 | AF290000.1 | AF290001.1 | AP012303.1 | AP017318.1 | AP017319.1 |
| LC311244.1 | CP010539.1 | CP010540.1 | CP010542.1 | CP010546.1 | CP010547.1 | CP010548.1 |
| CP010550.1 | CP010551.1 | CP013829.1 | CP014267.1 | CP017327.1 | CP017328.1 | CP017329.1 |
| CP017330.1 | CP017332.1 | CP017333.1 | CP017335.1 | CP017336.1 | CP017337.1 | CP017338.1 |
| CP017341.1 | CP017342.1 | CP017343.1 | CP020711.1 | CP020712.1 | DQ383277.1 | EF470909.2 |
| EF656612.1 | FJ215695.1 | FJ215696.1 | FJ603699.1 | FJ603717.1 | FJ603735.1 | FJ603752.1 |
| FJ603860.1 | FJ603879.1 | FJ603950.1 | FJ603969.1 | JN048894.1 | GQ861493.1 | GQ861494.1 |
| GQ861495.1 | JN048895.1 | HM447037.1 | HM447039.1 | JN048891.1 | JN048893.1 | |
실시예 3: 스트렙토코커스 뉴모니에 및 마이코플라즈마 뉴모니에의 표적유전자 증폭 실험을 위한 양성대조군 준비
아래의 표 3 및 표 4와 같은 서열정보를 이용하여, 스트렙토코커스 뉴모니에와 마이코플라즈마 뉴모니에의 표적유전자 증폭을 위한 주형으로 사용되는 유전자 합성을 진행하였다. 각각의 유전자 합성은 (주)바이오니아(대한민국 대전광역시 소재)의 유전자 합성 서비스를 이용하여 전행하였으며, 스트렙토코커스 뉴모니에와 마이코플라즈마 뉴모니에의 합성 유전자는 정량하여 102~105 카피/μL의 농도로 준비하였다.
| S. pneumoniae (뉴클레오티드 위치, 142-244, KP110734.1) |
| AGAAAGAAGCGGAGCTTGTCGACAAATACAAGTGATATTTCTGTAACAGCTACCAACGACAGTCGCCTCTATCCTGGAGCACTTCTCGTAGTGGATGAGACCT |
| M. pneumoniae (뉴클레오티드 위치, 1519-1612, LC311244.1) |
| GGTGAGGTGAATGGGTTGTTGAATCCGGCGTTGGTGGAAACCTATTTTGGGAACACGCGAGCGGGTGGTTCGGGGTCCAACACGACCAGTTCAC |
실시예 4: 스트렙토코커스 뉴모니에와 마이코플라즈마 뉴모니에의 검출을 위한 표적유전자 증폭용 프라이머 준비 및 유전자 증폭
스트렙토코커스 뉴모니에와 마이코플라즈마 뉴모니에를 각각 특이적으로 증폭하기 위한 프라이머는 뉴모라이신 유전자 서열 및 CARDS 톡신 유전자 서열 중 상동성 있는 부분을 선택하고 동일한 증폭조건에서 실험이 진행될 수 있도록 유사한 Tm 값을 갖도록 설계하였다. 선택된 프라이머 서열에 대한 Tm 값 분석은 IDT(INTEGRATED DNA TECHNOLOGIES)사에서 제공하는 웹 기반 프로그램인 oligoanalyzer 3.1을 이용하여 수행하였다. 상세한 프라이머 서열정보는 아래 표 5와 같다.
| 서열번호 | 명칭 | 염기서열 (5' → 3') | 길이 | %GC | Tm | 크기 |
| 1 | S. pneumoniae 정방향 프라이머 | AGAAAGAAGCGGAGCTTGTC | 20 | 50 | 55.2 | 103bp |
| 2 | S. pneumoniae 역방향 프라이머 | AGGTCTCATCCACTACGAGAA | 21 | 47.6 | 54.7 | |
| 3 | M. pneumoniae 정방향 프라이머 | GGTGAGGTGAATGGGTTGT | 19 | 52.6 | 55 | 96bp |
| 4 | M. pneumoniae 역방향 프라이머 | GTGAACTGGTCGTGTTGGA | 19 | 52.6 | 55 |
서열번호 1의 프라이머와 서열번호 2의 프라이머는 각각 스트렙토코커스 뉴모니에의 표적유전자를 특이적으로 증폭하기 위한 정방향 프라이머 및 역방향 프라이머로서, 증폭 시 103bp의 뉴모라이신(pneumolysin) 유전자 증폭이 가능하다. 서열번호 3의 프라이머와 서열번호 4의 프라이머는 각각 마이코플라즈마 뉴모니에의 표적유전자를 특이적으로 증폭하기 위한 정방향 프라이머 및 역방향 프라이머로서, 증폭 시 96 bp의 CARDS 톡신 유전자를 증폭할 수 있다.
본 실시예에서는 스트렙토코커스 뉴모니에 및 마이코플라즈마 뉴모니에의 표적유전자 증폭산물, 즉 스트렙토코커스 뉴모니에의 뉴모라이신(pneumolysin) 유전자 증폭산물 및 마이코플라즈마 뉴모니에의 CARDS 톡신 유전자 증폭산물을 면역분석법인 측방유동분석법으로 확인할 수 있도록, 서열번호 2의 프라이머 및 서열번호 4의 프라이머 5' 말단에 비오틴(biotin)을 표지하였고, 서열번호 1의 프라이머의 5' 말단에는 디곡시게닌(digoxigenin; DIG)을 표지하였으며 서열번호 3의 프라이머의 5' 말단에는 6-카르복시플루오레세인(6-Carboxyfluorescein)을 결합·반응시켜 표지하였다. 각각의 표지된 프라이머들은 (주)바이오니아(대한민국 대전광역시 소재)의 올리고 합성 서비스를 이용하여 합성하였고, 최종 농도가 100 μM이 되도록 멸균증류수를 첨가하여 준비하였으며, 증폭 실험 전까지 냉장 보관하였다. PCR 증폭을 위한 마스터 믹스로는 (주)피엠디엑스(대한민국 경기도 용인시 소재)의 2X PCR 마스터 믹스(master mix)를 사용하였다.
유전자 증폭은 하기의 표 6의 조성과 표 7의 반응조건에 따라 (주)바이오니아의 AllInOneCycler™ PCR 시스템을 이용하여 수행하였다.
| 농도 | 반응 당 사용량 (부피) | |
| 서열번호 1의 프라이머 | 100 μM | 0.1 μL |
| 서열번호 2의 프라이머 | 100 μM | 0.1 μL |
| 서열번호 3의 프라이머 | 100 μM | 0.1 μL |
| 서열번호 4의 프라이머 | 100 μM | 0.1 μL |
| PCR 마스터 믹스 | 2× | 10 μL |
| DNA 주형 | 102~105 카피(copies)/μL | 1 μL |
| DW (증류수) | - | 8.6 μL |
| 전체 부피 | - | 20 μL |
| 변성 | 95℃, 5분 | 1 사이클 |
| 변성 | 95℃, 15초 | 32 사이클 |
| 어닐링 & 연장 | 55℃, 45초 | |
| 연장 | 72℃, 5분 | 1 사이클 |
실시예 5: 측방유동분석법을 이용한 스트렙토코커스 뉴모니에 및 마이코플라즈마 뉴모니에 유전자 증폭 산물 확인
본 실시예에서는 스트렙토코커스 뉴모니에를 검출하기 위한 정방향 프라이머(서열번호 1의 정방향 프라이머)의 5' 말단에 디곡시게닌(digoxigenin)을 표지하고 마이코플라즈마 뉴모니에를 검출하기 위한 정방향 프라이머(서열번호 3의 정방향 프라이머)의 5' 말단에 플루오레세인(fluorescein)을 표지하며 역방향 프라이머(서열번호 2 및 4의 역방향 프라이머)의 5' 말단에는 비오틴(biotin)을 표지한 후 상기 프라이머들에 의해 증폭된 PCR 증폭산물을 측방 유동 분석 디바이스에 주입하여 항-DIG 항체(스트렙토코커스 뉴모니에 검출) 및 항-FITC 항체(마이코플라즈마 뉴모니에 검출)가 각각 표지된 멤브레인에서 스트렙타비딘이 접합된 금 나노입자(streptavidin-conjugated gold)와 함께 반응시키는 스트렙토코커스 뉴모니에 및 마이코플라즈마 뉴모니에 동시 검출용 키트의 일례를 제공한다.
상기와 같은 설계에 따른 측방유동분석법을 위한 디바이스는 (주)피엠디엑스(대한민국 경기도 용인시 소재)에 의뢰하여 제조하였다. 스트렙토코커스 뉴모니에 검출을 위한 서열번호 1 및 2의 프라이머 쌍과 마이코플라즈마 뉴모니에 검출을 위한 서열번호 3 및 4의 프라이머 쌍에 의해 증폭된 PCR 증폭산물의 확인을 위해 항-DIG 항체(스트렙토코커스 뉴모니에 검출)와 항-FITC 항체(마이코플라즈마 뉴모니에 검출)를 각각 멤브레인의 테스트 라인 1 및 2에 침지시켰다. PCR 증폭산물이 적하되는 로딩패드에는 스트렙타비딘-접합 금 나노입자들을 침지시켜 측방유동분석을 위한 디바이스를 제작하였다(도 3). 상기와 같이 준비된 디바이스의 로딩패드에 실시예 4에서 증폭하여 얻은 증폭산물 5μL을 적하한 후 전개버퍼 100μL를 첨가하고 5분 경과 후 분석을 진행하였다.
로딩패드에는 비오틴과 특이적으로 결합 가능한 스트렙타비딘이 접합된 금 나노입자들이 침지되어 있기 때문에, 비오틴에 의해 표지된 PCR 증폭산물(즉, 서열번호 2 또는 서열번호 4의 역방향 프라이머에 의해 증폭된 스트렙토코커스 뉴모니에 표적유전자 증폭산물 또는 마이코플라즈마 뉴모니에 표적유전자 증폭산물)이 로딩패드에 적하되면 스트렙타비딘-접합 금 나노입자는 비오틴에 의해 표지된 PCR 증폭산물와 결합하여 복합체를 형성한다.
그리고 전개버퍼에 의한 모세관 현상에 의해 복합체는 이동하게 되는데, 복합체에서 디곡시게닌에 의해 표지된 증폭산물(즉, 서열번호 1의 정방향 프라이머에 의해 증폭된 스트렙토코커스 뉴모니에 표적유전자 증폭산물)은 테스트 라인 1의 항-DIG 항체와 결합하여 금 나노입자들이 모이면서 테스트 라인 1에서는 적색의 밴드를 나타내게 낸다. 이는 증폭대상이 된 유전자 샘플 내에 스트렙토코커스 뉴모니에의 표적유전자가 존재하는 것, 즉 스트렙토코커스 뉴모니에의 검출신호를 나타낸다.
또한, 전개버퍼에 의한 모세관 현상에 의해 복합체가 추가적으로 이동하고, 복합체에서 플루오레세인에 의해 표지된 증폭산물(즉, 서열번호 3의 정방향 프라이머에 의해 증폭된 마이코플라즈마 뉴모니에 표적유전자 증폭산물)은 테스트 라인 2의 항-FITC 항체와 결합하여 금 나노입자들이 모이면서 테스트 라인 2에서는 적색의 밴드를 나타내게 낸다. 이는 증폭대상이 된 유전자 샘플 내에 마이코플라즈마 뉴모니에의 표적유전자가 존재하는 것, 즉 마이코플라즈마 뉴모니에의 검출신호를 나타낸다.
반면에, 검사 대상이 되는 유전자 샘플 내에 스트렙토코커스 뉴모니에 또는 마이코플라즈마 뉴모니에가 존재하지 않는 경우에는 스트렙타비딘-접합 금 나노입자는 PCR 증폭산물과 복합체를 형성하지 못하고 전개버퍼에 의한 모세관 현상에 의해 테스트 라인 1 및 2를 지나치게 된다. 왜냐하면, 테스트 라인 1 및/또는 테스트 라인 2에서 스트렙타비딘-접합 금 나노입자들이 모이기 위해서는 금 나노입자-복합체에 디곡시게닌이나 플루오레세인이 존재하여야 하지만, 유전자 샘플 내에 스트렙토코커스 뉴모니에 또는 마이코플라즈마 뉴모니에가 존재하지 않는 경우에는 PCR 증폭과정에서 디곡시게닌이 표지된 서열번호 1의 정방향 프라이머나 플루오레세인이 표지된 서열번호 3의 정방향 프라이머가 사용되지 않기 때문이다. 본 실시예에서는 설명의 편의상 생략하였지만, 이와 같이 PCR 증폭산물과의 복합체를 형성하지 못한 스트렙타비딘-접합 금 나노입자들이 멤브레인 스트립의 말단부(버퍼 전개 방향에서 맨끝)에 제공되는 콘트롤 라인(음성 표시 라인)에서 적색 밴드를 나타내게 할 수도 있다.
따라서, 본 발명의 일 구체예의 측방유동분석법을 이용한 스트렙토코커스 뉴모니에 및 마이코플라즈마 뉴모니에의 검출 키트를 이용할 경우, 테스트 라인 1 및 2에서 적색 밴드가 나타나는지 여부만 간단히 확인하면 검체 내에 스트렙토코커스 뉴모니에 및 마이코플라즈마 뉴모니에가 존재하는지를 간단하고 효과적으로 분석할 수 있다.
한편, 본 실시예에서는 실시예 4의 PCR 증폭산물에 대한 측방 유동 분석 결과, 102~105 카피/μL의 농도까지 스트렙토코커스 뉴모니에와 마이코플라즈마 뉴모니에의 표적유전자 증폭을 검출 키트에서 확인할 수 있었다(도 4).
결국, 도 4에서 확인되는 바와 같이, 본 발명은 측방유동분석 디바이스, 예를 들어 멤브레인 스트립에서 스트렙토코커스 뉴모니에 및 마이코플라즈마 뉴모니에의 표적유전자에 대한 PCR 증폭산물의 검출이 가능하게 함으로써 고가의 분자진단장비 없이도 스트렙토코커스 뉴모니에 및 마이코플라즈마 뉴모니에를 저렴하고 간편하게 하나의 키트에서 효율적으로 검출할 수 있다.
따라서, 본 발명은 스트렙토코커스 뉴모니에 및/또는 마이코플라즈마 뉴모니에에 감염된 환자 내지는 보균자를 저렴한 비용으로 신속하고 정확하게 진단하여 세균성 폐렴균이 병원, 학교 등 다수의 인원이 생활하는 공간에서 전염되는 것을 사전에 차단할 수 있다.
이상, 본 발명을 상기 실시예를 들어 설명하였으나, 본 발명은 이에 제한되는 것이 아니다. 당업자라면 본 발명의 취지 및 범위를 벗어나지 않고 수정, 변경을 할 수 있으며 이러한 수정과 변경 또한 본 발명에 속하는 것임을 알 수 있을 것이다.
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<212> DNA
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<220>
<223> S. pneumoniae forward primer
<400> 1
agaaagaagc ggagcttgtc 20
<210> 2
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> S. pneumoniae reverse primer
<400> 2
aggtctcatc cactacgaga a 21
<210> 3
<211> 19
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> M. pneumoniae forward primer
<400> 3
ggtgaggtga atgggttgt 19
<210> 4
<211> 19
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> M. pneumoniae reverse primer
<400> 4
gtgaactggt cgtgttgga 19
<210> 5
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<213> Artificial Sequence
<220>
<223> S. pneumoniae (nucleotide position, 142-244, KP110734.1)
<400> 5
agaaagaagc ggagcttgtc gacaaataca agtgatattt ctgtaacagc taccaacgac 60
agtcgcctct atcctggagc acttctcgta gtggatgaga cct 103
<210> 6
<211> 94
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> M. pneumoniae (nucleotide position, 1519-1612, LC311244.1)
<400> 6
ggtgaggtga atgggttgtt gaatccggcg ttggtggaaa cctattttgg gaacacgcga 60
gcgggtggtt cggggtccaa cacgaccagt tcac 94
Claims (13)
- 스트렙토코커스 뉴모니에의 검출을 위한 표적유전자인 스트렙토코커스 뉴모니에의 뉴모라이신(pneumolysin) 유전자에 특이적으로 결합하는 제1 정방향 프라이머의 5' 말단에 제1 태그를 표지하고, 마이코플라즈마 뉴모니에의 검출을 위한 표적유전자인 마이코플라즈마 뉴모니에의 CARDS 톡신 유전자에 특이적으로 결합하는 제2 정방향 프라이머 5' 말단에 제2 태그를 표지하며, 스트렙토코커스 뉴모니에의 검출을 위한 표적유전자인 스트렙토코커스 뉴모니에의 뉴모라이신(pneumolysin) 유전자에 특이적으로 결합하는 제1 역방향 프라이머의 5' 말단 및 마이코플라즈마 뉴모니에의 검출을 위한 표적유전자인 마이코플라즈마 뉴모니에의 CARDS 톡신 유전자에 특이적으로 결합하는 제2 역방향 프라이머의 5' 말단에 제3 태그를 표지하는 단계와,
상기 제1 정방향 프라이머 및 상기 제1 역방향 프라이머의 쌍과, 상기 제2 정방향 프라이머 및 상기 제2 역방향 프라이머의 쌍을 이용하여, 검체 내의 유전자 샘플을 PCR로 증폭하는 단계와,
상기 PCR 증폭산물을 측방 유동 분석 디바이스의 일측에 로딩하여 상기 제3 태그와 특이적으로 결합하는 결합자가 접합된 금 나노입자와의 복합체를 형성시키는 단계와,
상기 복합체를 상기 측방 유동 분석 디바이스의 타측으로 이동시키고, 상기 복합체를 상기 측방 유동 분석 디바이스의 제1 테스트 라인 내의 항-제1 태그 항체와, 상기 제1 테스트 라인과 거리를 두고 위치하는 제2 테스트 라인 내의 항-제2 태그 항체와 결합시키는 단계와,
상기 제1 테스트 라인 및 상기 제2 테스트 라인에서 상기 복합체의 금 나노입자의 모임에 의해 나타나는 밴드 형성 여부를 확인하여 상기 검체 내의 스트렙토코커스 뉴모니에 및 마이코플라즈마 뉴모니에를 검출하는 단계를 포함하는, 측방유동분석법을 이용한 세균성 폐렴의 검출 방법. - 제1항에 있어서,
상기 제1 태그는 디곡시게닌(DIG)이고, 상기 제2 태그는 플루오레세인(fluorescein)인 것을 특징으로 하는, 검출 방법. - 제2항에 있어서,
상기 항-제1 태그 항체는 항-DIG 항체이고, 상기 항-제2 태그 항체는 항-FITC 항체인 것을 특징으로 하는, 검출 방법. - 제3항에 있어서,
상기 제3 태그는 비오틴이고, 상기 결합자는 스트렙타비딘인 것을 특징으로 하는, 검출 방법. - 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 제1 정방향 프라이머 및 상기 제1 역방향 프라이머는 각각 서열번호 1의 프라이머 및 서열번호 2의 프라이머인 것을 특징으로 하는, 검출 방법. - 제5항에 있어서,
상기 제2 정방향 프라이머 및 상기 제2 역방향 프라이머는 각각 서열번호 3의 프라이머 및 서열번호 4의 프라이머인 것을 특징으로 하는, 검출 방법. - 스트렙토코커스 뉴모니에의 검출을 위한 표적유전자인 스트렙토코커스 뉴모니에의 뉴모라이신(pneumolysin) 유전자에 특이적으로 결합하고 5' 말단에 제1 태그가 표지된 제1 정방향 프라이머;
마이코플라즈마 뉴모니에의 검출을 위한 표적유전자인 마이코플라즈마 뉴모니에의 CARDS 톡신 유전자에 특이적으로 결합하고 5' 말단에 제2 태그가 표지된 제2 정방향 프라이머;
스트렙토코커스 뉴모니에의 검출을 위한 표적유전자인 스트렙토코커스 뉴모니에의 뉴모라이신(pneumolysin) 유전자에 특이적으로 결합하고 5' 말단에 제3 태그가 표지된 제1 역방향 프라이머; 및
마이코플라즈마 뉴모니에의 검출을 위한 표적유전자인 마이코플라즈마 뉴모니에의 CARDS 톡신 유전자에 특이적으로 결합하고 5' 말단에 제3 태그가 표지된 제2 역방향 프라이머를 포함하는 PCR 증폭용 조성물과,
상기 제3 태그와 특이적으로 결합하는 결합자가 접합된 금 나노입자들이 일측에 제공되고, 상기 제1 태그와 특이적으로 결합하는 항-제1 태그 항체를 갖는 제1 테스트 라인과, 상기 제2 태그와 특이적으로 결합하는 항-제2 태그 항체를 갖고 상기 제1 테스트 라인과 거리를 두고 위치하는 제2 테스트 라인을 구비한 측방 유동 분석 디바이스를 포함하는, 측방유동분석법을 이용한 세균성 폐렴의 검출 키트. - 제7항에 있어서,
상기 제1 태그는 디곡시게닌(DIG)이고, 상기 제2 태그는 플루오레세인(fluorescein)인 것을 특징으로 하는, 검출 키트. - 제8항에 있어서,
상기 항-제1 태그 항체는 항-DIG 항체이고, 상기 항-제2 태그 항체는 항-FITC 항체인 것을 특징으로 하는, 검출 키트. - 제9항에 있어서,
상기 제3 태그는 비오틴이고, 상기 결합자는 스트렙타비딘인 것을 특징으로 하는, 검출 키트. - 제7항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 PCR 증폭용 조성물은 DNA 중합효소, dNTPs 및 PCR 완충용액을 더 포함하는, 검출 키트. - 제7항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 제1 정방향 프라이머 및 상기 제1 역방향 프라이머는 각각 서열번호 1의 프라이머 및 서열번호 2의 프라이머인 것을 특징으로 하는, 검출 키트. - 제12항에 있어서,
상기 제2 정방향 프라이머 및 상기 제2 역방향 프라이머는 각각 서열번호 3의 프라이머 및 서열번호 4의 프라이머인 것을 특징으로 하는, 검출 키트.
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- 2018-08-01 KR KR1020180089806A patent/KR102076417B1/ko active Active
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