KR102039299B1 - 시클레소나이드를 포함하는, 유방암 줄기세포 성장 억제용 조성물 - Google Patents

Abstract

본 발명은 시클레소나이드 또는 이의 약학적으로 염을 유효성분으로 포함하는, 암 줄기세포 성장 억제용 조성물, 상기 조성물을 포함하는 암의 전이 억제, 또는 암의 치료 또는 예방용 약학적 조성물, 식품 조성물 등에 관한 것이다.
본 발명의 시클레소나이드는 유방암과 폐암 세포의 성장을 억제하며, 유방암과 폐암 줄기세포의 형성을 억제한다. 또한, 유방암과 폐암 줄기세포에서 특징적으로 발현하는 것으로 알려진 Nanog, C-myc, Oct4, Sox2, Snail 및 CD44와 같은 자가 재생 유전자의 발현을 억제하였으며, 유방암 줄기세포의 맘모스페어 형성과 폐암 줄기세포의 투머스페어 형성에 관여하는 것으로 알려진 IL-6와 IL-8의 생산을 억제하였으며, STAT3 신호전달 경로를 억제하는 것을 확인하였다. 이에 따라, 상기 화합물은 유방암과 폐암 등의 암 줄기세포의 성장과 이들 암의 성장을 억제하는 바, 유방암과 폐암 등의 암의 치료에 활용이 가능하다.

Description

시클레소나이드를 포함하는, 유방암 줄기세포 성장 억제용 조성물{Composition for inhibiting a growth of breast cancer stem cells comprising ciclesonide}

본 발명은 시클레소나이드 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 유효성분으로 포함하는, 암 줄기세포 성장 억제용 조성물, 상기 조성물을 포함하는 암의 전이 억제, 또는 암의 치료 또는 예방용 약학적 조성물, 식품 조성물 등에 관한 것이다.

항암치료가 종양내의 세포군을 효과적으로 표적화하여 치료하지 못하고, 종양의 재발 및 전이로 연결됨에 따라 암 줄기세포에 대한 관심이 대두되었다. 많은 세포독성 항암제는 대개 빠르게 증식하는 세포를 표적으로 하고 있어, 천천히 증식하는 특징을 가진 암 줄기세포는 세포독성 항암요법에서 살아남을 수 있게 된다. 기저세포형(basal cell phenotype) 유방암은 분화과정의 초기 단계의 유선 모세포(earliest mammary progenitor cell)에서 기원한 것으로 여겨지며, 예후가 불량하고 기존의 항암요법에 내성을 나타낸다고 알려져 있는데, 항암 치료의 실패원인이 암 줄기세포에 대한 표적치료가 실패하였기 때문이란 것을 지지하는 좋은 예라 할 수 있다.

암 줄기세포 가설에 근거하여 여러 치료방법들이 고안되었는데, 그 중 많이 알려진 방법은 암 줄기세포의 자가재생(self-renewal) 경로를 이용하는 방법이다. 이러한 치료에서 중요한 점은 정상 줄기세포의 자가재생은 유지하면서 암 줄기세포의 자가재생만을 표적으로 해야 하는 것이다. 예로서, Notch 신호는 secretase라는 효소에 의해 진행되는데, 이에 대한 억제제(secretase inhibitor)를 Notch1이 과발현된 유방암에 사용하면 종양 억제 효과를 볼 수 있다. Hedgehog 신호체계를 표적으로 할 경우에도 항암효과를 보인다는 최근 보고가 있는데, Hedgehog 억제제인 cyclopamine을 종양 이종이식(tumor xenograft)한 동물에 투여했을 때 극적으로 종양이 위축되었다는 것이다.

한편, 유방암은 여성에서 흔한 암이며, 여성 암 환자에서 주요 사망의 원인으로 알려져 있다(al A, Bray F, Center MM, Ferlay J, Ward E and Forman D. Globalcancer statistics. CA Cancer J Clin. 2011; 61(2):69-90). 초기 유방암에 폴리항암화학요법(polychemotherapy), 타목시펜과 함께 광범위한 유방 X 선 촬영 및 보조 요법이 유방암의 사망률을 줄였으나, 유방암은 여전히 재발과 전이로 인해 가장 위험한 질병으로 알려져 있다. 최초로 암 줄기세포(Cancer stem cell, CSCs)가 골수성 백혈병에서 확인되었고, 이후, 유방, 뇌, 결장, 난소, 췌장, 및 전립선 암 등 다양한 고형암에서 발견되었다. 상기 암 줄기세포는 종양-시작 세포(tumor-initiating cells)와 암 줄기 유사 세포(cancer stem-like cell)로 불리기도 한다. 또한 유방암을 포함한 다양한 암 유형이 종양의 소집단인, 암줄기세포(CSCs)로부터 유래되는 것으로 나타났다. 이러한 집단은 자가 재생(self-renewal) 및 분화를 통해 종양 부피에 변화를 유발하는 것으로 알려져 있다. Wnt (wingless), Shh (Sonic hedgehog), Stat3, NF-κB, Wnt/β-catenin, TGF-β 및 Notch 신호 전달 경로는 CSCs의 자가 재생(self-renewal)에 결정적인 것으로 알려져 있다.

암 줄기세포는 화학 요법과 방사선 치료에 대한 약제 내성 및 방사선 내성을 나타내며, 암의 재발과 전이를 유발한다. 따라서 암 줄기세포에 대한 표적 치료는 암 치료에 필수적이다. 암 줄기세포는 Oct4, C-myc, Nanog, 및 알데히드 탈수소효소-1 (Aldehyde dehydrogenase-1, ALDH)을 포함하는 특정 단백질을 발현하는 것으로 알려져 있다. 상기 ALDH는 유전 독성의 알데히드를 산화하는 효소이며, 이의 효소 활성은 백혈병, 두경부, 방광, 뼈, 결장, 간, 폐, 췌장, 전립선, 갑상선 및 자궁경부암의 CSC(cancer stem cells) 마커로 널리 사용되고 있다. ALDH는 암 줄기세포의 치료표적으로 알려져 있다. 또한, 임상 표본에서 CD44+/CD24-를 발현하는 유방암 집단에서 종양을 형성하는 능력이 뛰어난 것으로 알려져 있다(Al-Hajj M, Wicha MS, Benito-Hernandez A, Morrison SJ and Clarke MF. Prospective identification of tumorigenic breast cancer cells. Proc Natl Acad Sci U S A. 2003; 100(7):3983-3988).

Stat3(Signal transducers and activators of transcription 3)는 CSCs에서 주로 활성화되어 있고, 맘모스페어(mammosphere) 형성은 JAK1-STAT3 경로와 관련이 있다. 분비된 IL-6는 JAK1-STAT3 경로를 활성화시키고, Oct4 유전자의 발현을 증가시킨다. IL-6/JAK1/STAT3 신호전달 경로는 NSCCs(Non-CSCs)의 CSCs로의 전환에 중요한 것으로 알려져 있다. STAT3 신호 전달경로를 차단하면 유방암 세포유래 CD44+/CD24- 줄기 세포 유사(stem cell-like) 세포의 성장을 억제하는 것으로 알려져 있다. NF-κB(Nuclear factor-κB) 전사 인자는 결장, 유방, 간암을 포함하는 종양 세포에서 구조적으로(일정하게) 활성화되고, IκB 키나제(IKK) 복합체에 의해 조절된다. NF-κB의 억제제인 피롤리딘디티오카르바민산염 (pyrrolidinedithiocarbamate, PDTC)는 유방암 줄기 유사 세포를 억제하는 것으로 알려져 있다.

상기 유방암 줄기세포는 CD44^high/CD24^low, ESA+(상피 특이 항원)과 ALDH 같은 바이오 마커의 발현에 의해 확인할 수 있다고 알려져 있다. 항암 화학 요법은 CD44+/CD24를 발현하는 암세포의 비율과 맘모스페어 형성을 증가시키는 것으로 알려져 있다. CSCs는 독소로부터 CSCs를 보호하기 위해 특이 ABC 수송체(ABC transporters)를 과발현한다. ABC 펌프는 side population (SP)를 분리하는데 사용되고, ABCG2 transporter-specific Hoechst 33342 dyes에 의해 분류될 수 있다. 유방 CSCs는 종양 세포(tumor cells)에 비해 반응성 산소종 (ROS)을 낮은 수준 생성하기 때문에, 유방암 줄기세포 유사 세포(breast cancer stem-likes cells)는 방사선 저항이 있다. 왜냐하면, ROSs는 이온화 방사선-유도된 세포 사멸의 주요 매개체이기 때문에, CSCs는 비-줄기 암세포(non-stem cancer cells) 보다 DNA 손상이 덜한 것으로 알려져 있다(Diehn M, Cho RW, Lobo NA, Kalisky T, Dorie MJ, Kulp AN, Qian D, Lam JS, Ailles LE, Wong M, Joshua B, Kaplan MJ, Wapnir I, Dirbas FM, Somlo G, Garberoglio C, et al. Association of reactive oxygen species levels and radioresistance in cancer stem cells. Nature. 2009; 458(7239):780-783).

유방암 세포주 MCF-7은 in vitro에서 부착 없이도 세포 자멸사를 하지 않고 타원 형태로의 성장을 할 수 있는 줄기 세포와 유사한 능력을 가진 세포의 부분집락을 가진 것으로 알려져 있다. 부유배양으로 기층이 없는 조건을 인공적으로 만들면 줄기세포의 성질을 가지는 세포들은 서로 부착되어 구형의 세포 덩어리를 만들게 되며, 이러한 세포 덩어리는 뉴로스페어(neurosphere)로 명명되었다. 인간의 유방 줄기세포에 이러한 개념을 적용한 것이 "맘모스페어(mammosphere)"이다. 맘모스페어에는 일반 인간 유방 세포보다 8배 많은 전구 세포들이 존재하며 지속적으로 계대 배양이 가능하고, 여러 번의 계대 배양 후에는 100%의 세포가 모두 bi-potent 전구체로 자라는 특징이 있다. 맘모스페어는 성인 유방 세포인 유선 상피세포(mammary gland epitherlial cell), 관 상피세포(ductal epithelial cell), 엘비올라 상피세포(alveolar epitherlial cell)들로 모두 분화가 가능하며, 마트리겔(Matrigel)내에서 삼차원 구조를 이루면서 복잡한 기능성 유방 구조물을 형성하는 것이 관찰된다. 맘모스페어는 줄기세포의 가장 특징 중의 하나인 자가 증식을 할 수 있는 성질이 있어서 하나의 맘모스페어에서 여러 개의 맘모스페어 또는 유방줄기세포를 다량으로 얻을 수 있다. 또한 조혈모 세포, 신경 줄기세포, 배아 줄기세포 등과 비교하여 많은 발현 유전자가 중복되는 것이 확인되어, 맘모스페어가 실제적인 유방 줄기세포인 것으로 보고되었다. 이러한, 암 줄기세포의 자가 재생 능력의 표준 분석 방법은 in vivo 에서의 이식(transplantation) 및 in vitro에서의 맘모스페어 형성을 분석하는 것이다.

또한, 유방암 세포주 뿐만 아니라 폐암을 비롯한 다양한 암 세포주에서 줄기세포의 성질을 가지는 세포들이 서로 부착되어 구형의 세포 덩어리를 형성할 수 있으며, 이를 투머스페어(tumorsphere)라 한다. 상기 투머스페어는 하나의 암 줄기세포 또는 암 전구세포의 증식에 의해 발달된 종양구를 의미한다.

한편, 폐암은 전 세계의 암 관련 사망의 주된 원인으로, 두 가지의 주요 아형인, 비소세포 폐암(NSCLC) 및 소세포 폐암(SCLC)로 분류된다. 비소세포 폐암(NSCLC)은 폐암 환자의 85 %를 차지하고, 소세포 폐암(SCLC)은 15%를 차지한다. 상기 비소세포 폐암(NSCLC)은 세 개의 하위 유형, 선암, 편평세포암, 대세포암으로 구분된다. 흡연은 폐암의 주요 위험 인자이다. 폐암은 화학 요법 및 방사선 조사로 치료 가능하나, 내성이 생기게 된다. 폐암의 5 년 생존률은 낮으며, 소세포 폐암의 1 년 생존율은 40%, 5년 생존율은 5% 이하이다. 하지만, 폐암에서 상기 방사선과 항암화학요법에 대한 내성 메카니즘은 잘 알려져 있지 않다. 암줄기세포는 벌크 종양을 근절하는 화학요법과 방사선 치료에 대한 약제 내성 및 방사선 저항 특성을 가지고 있는데, 결과적으로 이에 의해 암의 재발과 전이를 유발하게 된다. 따라서, CSC를 타겟팅하는 치료는 폐암 치료에 필수적이다.

지금까지 암 줄기세포에 대한 연구에는 제한성도 많고, 종양의 형성이나 유지에서의 역할에 대해서는 확실하게 밝혀진 것은 없었다. 정상 줄기세포에는 손상을 주지 않으면서 암 줄기세포만을 표적으로 하는 치료를 효율적으로 수행하기 위해서는 암 줄기세포의 유지와 조절에 중요한 분자생물학적인 특성이나 그 조절 경로에 대한 지식과 이해가 필요하다.

현재까지 암 줄기세포를 직접적으로 타겟팅하는 항암제나 천연물 유래 추출물의 연구는 거의 없는 실정이다. 종래의 기술은 암 줄기세포의 직접적인 타겟 유전자를 억제하는 실험으로 암 줄기세포를 억제하거나 또는 암 줄기세포의 상위 신호전달 단백질을 억제하여 암 줄기세포를 억제하는 연구들이 진행되었다. 그러나 많은 종양환자에 있어서 종양유전자의 변이나 단백질의 변이로 이러한 타겟팅 실험이 어려움이 많았다.

본 발명의 목적은 화학식 1로 표시되는 시클레소나이드 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 유효성분으로 포함하는, 암 줄기세포 성장 억제용 조성물을 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은, 상기 암 줄기세포 성장 억제용 조성물을 포함하는, 암의 치료 또는 예방용 약학적 조성물을 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은, 상기 암 줄기세포 성장 억제용 조성물을 포함하는, 암전이 억제용 약학적 조성물을 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은, 상기 암 줄기세포 성장 억제용 조성물을 포함하는, 암의 개선 또는 예방용 식품 조성물을 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은, 상기 암 줄기세포 성장 억제용 조성물을 포함하는, 암전이 개선 또는 예방용 식품 조성물을 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은, 화학식 1로 표시되는 시클레소나이드 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 시험관(in vitro) 또는 인간을 제외한 개체에 투여하는 단계를 포함하는, 암 줄기세포의 성장을 억제하는 방법을 제공하는 것이다.

본 발명자는 암 줄기 세포의 억제 후보자로, 다양한 화합물을 이용하여 암 줄기 세포의 성장을 억제하는 지를 확인하였으며, 그 중에서 시클레소나이드(ciclesonide)가 유방암 줄기세포와 폐암 줄기세포를 선택적으로 억제하는 것을 확인하였다. 시클레소나이드는 FDA 승인된 천식 치료제로 알려져 있으나, 본 발명자에 의해 최초로 유방암 줄기세포의 성장을 억제하고, MCF-7 벌크 세포에 비해 유방암 유래된 맘모스페어에서 STAT3 신호 전달경로를 선택적으로 억제하는 것을 확인하였다. 또한, 마우스 이종이식 모델을 사용하여 종양의 성장을 효과적으로 억제하는 것을 확인하였다. 이에 따라, 시클레소나이드는 CSCs를 타겟팅함으로써 유방암과 폐암을 비롯한 암 줄기세포의 성장을 억제하고, 유방암과 폐암을 비롯한 암 치료에 이용할 수 있음을 확인하고 본 발명을 완성하였다.

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 하기 화학식 1로 표시되는 시클레소나이드 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 유효성분으로 포함하는, 암 줄기세포 성장 억제용 조성물을 제공한다.

[화학식 1]

본 발명에서 상기 시클레소나이드(ciclesonide)는 천식 치료제로 알려져 있으나, 본 발명자에 의해 최초로 유방암과 폐암 줄기세포의 성장을 억제하는 것을 확인하였다.

본 발명에서, 용어 "암"은 일반적으로 비조절된 세포 성장의 특징을 갖는 포유동물의 생리학적 상태를 나타내거나 설명한다. "암"이란 세포의 정상적인 분열, 분화 및 사멸의 조절 기능에 문제가 발생하여 비정상적으로 과다 증식하여 주위 조직 및 장기에 침윤하여 덩어리를 형성하고 기존의 구조를 파괴하거나 변형시키는 상태를 의미한다.

본 발명에서, 용어 "암 줄기세포"는 다양한 암세포로 분화할 수 있는 능력을 가진 미분화세포로, 상기 암으로는 결장암 및 직장암을 포함하는 대장암, 유방암, 자궁암, 자궁경부암, 난소암, 전립선암, 뇌종양, 두경부암종, 흑색종, 골수종, 백혈병, 림프종, 위암, 폐암, 췌장암, 간암, 식도암, 소장암, 항문부근암, 나팔관암종, 자궁내막암종, 질암종, 음문암종, 호지킨병, 방광암, 신장암, 수뇨관암, 신장세포암종, 신장골반암종, 골암, 피부암, 두부암, 경부암, 피부흑색종, 안구내흑색종, 내분비선암, 갑상선암, 부갑상선암, 부신암, 연조직육종, 요도암, 음경암, 중추신경계(central nervous system;CNS) 종양, 1차 CNS 림프종, 척수종양, 뇌간신경교종 또는 뇌하수체선종일 수 있다. 이에 제한되지 않지만, 상기 암 줄기세포는 유방암 또는 폐의 줄기세포일 수 있다.

본 발명에서 용어 "유방암 줄기세포"는 유방암세포로 분화할 수 있는 능력을 가진 미분화세포를 의미한다.

본 발명에서 용어 "폐암 줄기세포"는 폐암세포로 분화할 수 있는 능력을 가진 미분화세포를 의미한다.

본 발명에서 용어 "유방암 줄기세포 성장 억제"는 유방암 줄기세포 유지 (maintenance) 억제, 유방암 줄기세포 악성화(malignance) 억제, 유방암 줄기세포 이동 및 유방암 줄기세포 침윤활성(invasive) 억제를 포함하는 의미이다.

본 발명에서 용어 "폐암 줄기세포 성장 억제"는 폐암 줄기세포 유지 (maintenance) 억제, 폐암 줄기세포 악성화(malignance) 억제, 폐암 줄기세포 이동 및 폐암 줄기세포 침윤활성(invasive) 억제를 포함하는 의미이다.

본 발명의 일실시예에서는 시클레소나이드가 유방암 줄기세포의 성장을 억제할 수 있는지 여부를 확인하기 위해, MCF-7 및 MDA-MB-231 세포로부터 유래된 1차 맘모스페어(mammosphere)에 시클레소나이드를 처리하였으며, 그 결과, 시클레소나이드는 유방암 세포주로부터 유래된 1차 맘모스페어의 형성을 억제하는 것을 확인하였으며, 구체적으로, 유방암 세포인 MCF-7 및 MDA-MB-231 세포로부터 유래된 맘모스페어의 수가 90%까지 감소하는 것을 확인하였을 뿐만 아니라, 맘모스페어의 크기도 감소하는 것을 확인하였다(도 3A 및 3B). 다만, 같은 Glucocorticoids에 속하는 프레드니손(prednisone)과 덱사메타손(dexamethasone)은 80μM의 고농도에서도 유방암 줄기세포의 성장을 억제하지 못하는 것을 확인하였다(도 3C).

또한, 본 발명의 다른 일실시예에서는 시클레소나이드가 폐암 줄기세포의 성장을 억제할 수 있는지 여부를 확인하기 위해, A549 세포로부터 유래된 1차 투머스페어(tumorsphere)에 시클레소나이드를 처리하였으며, 그 결과, 시클레소나이드는 폐암 세포주로부터 유래된 1차 투머스페어의 형성을 억제하는 것을 확인하였으며, 구체적으로, 폐암 세포인 A549 세포로부터 유래된 투머스페어의 수가 90%까지 감소하는 것을 확인하였을 뿐만 아니라, 투머스페어의 크기도 감소하는 것을 확인하였다(도 9A). 또한, 시클레소나이드의 활성화형인 이소부티릴 시클레소나이드(isobutyryl ciclesonide)를 처리한 결과 5μM 와 10μM에서 폐암 줄기세포 억제활성을 나타내는 것을 확인하였다. 그러나, 동일한 Glucocorticoids에 속하는 프레드니손 및 덱사메타손은 80μM에서도 폐암 줄기세포 억제 활성을 나타내지 않았다(도 9C).

이에 따라, 본 발명의 상기 화합물은 상기 화합물은 (i) 유방암 유래의 맘모스페어(mammosphere)의 형성을 억제하거나, (ii) 유방암 유래의 맘모스페어의 증식을 억제하거나, (iii) 폐암 유래의 투머스페어(tumorsphere)의 형성을 억제하거나, 또는 (iv) 폐암 유래의 투머스페어의 증식을 억제할 수 있다.

본 발명의 일실시예에서, 상기 유방암 줄기세포는 Nanog, C-myc, Oct4, Sox2, 및 CD44로 선택되는 하나 이상의 자가 재생(self-renewal) 유전자를 발현할 수 있으며, 상기 폐암 줄기세포는 Nanog, Sox2, C-myc, 및 Snail로 선택되는 하나 이상의 자가 재생(self-renewal) 유전자를 발현할 수 있다.

본 발명의 일실시예에서는 시클레소나이드가 유방암 줄기세포에서 특징적으로 발현하는 것으로 알려진 Nanog, C-myc, Oct4, Sox2, 및 CD44과 같은 자가 재생 유전자의 발현을 억제하였으며(도 6A), 유방암 줄기세포의 맘모스페어 형성에 관여하는 것으로 STAT3 신호전달 경로를 억제하는 것을 확인하였다(도 5A 및 5B). 또한, 유방암 줄기세포의 맘모스페어 형성에 관여하는 것으로 알려진 IL-6과 IL-8의 생산을 억제하는 것을 확인하였다(도 5C). 이에 따라, 상기 화합물은 유방암 줄기세포의 성장을 억제할 수 있음을 확인하였다.

또한, 시클레소나이드가 폐암 줄기세포에서 특징적으로 발현하는 것으로 알려진 nanog, sox2, c-myc, 및 snail과 같은 자가 재생 유전자의 발현을 억제하였으며(도 11A), 폐암 줄기세포의 투머스페어 형성에 관여하는 것으로 알려진 IL-8의 생산을 억제하는 것을 확인하였다(도 12). 이에 따라, 상기 화합물은 폐암 줄기세포의 성장을 억제할 수 있음을 확인하였다.

본 발명의 상기 조성물은 약학적 조성물 또는 식품조성물로 이용할 수 있다.

본 발명의 상기 조성물이 약학적 조성물로 활용되는 경우, 상기 시클레소나이드 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 포함할 수 있다.

본 발명에서 사용되는 용어 "약학적으로 허용가능한 염"은 상기 화합물의 원하는 생물학적 및/또는 생리학적 활성을 보유하고 있고, 원하지 않는 독물학적 효과는 최소한으로 나타내는 모든 염을 의미한다. 당해 기술분야에서 통상적인 방법에 따라 제조된 염을 의미하며, 이러한 제조방법은 당업자에게 공지되어 있다. 구체적으로, 상기 약학적으로 허용가능한 염은 약리학적 또는 생리학적으로 허용가능한 무기산과 유기산 및 염기로부터 유도된 염을 포함하지만 이것으로 한정되지는 않는다.

예를 들어, 약제학적으로 허용가능한 염기 부가 염들은 무기 및 유기 염기들로부터 제조될 수 있다. 무기 염기들로부터 유도된 염들은, 이에 제한되는 것은 아니지만, 나트륨, 칼륨, 리튬, 암모늄, 칼슘, 및 마그네슘 염들을 포함할 수 있다. 유기 염기들로부터 유도된 염들은, 이에 제한되는 것은 아니지만, 일차, 이차 및 삼차 아민; 천연적으로 발생하는 치환된 아민들을 포함하는 치환된 아민들; 및 이소프로필아민, 트리메틸아민, 디에틸아민, 트리에틸아민, 트리프로필아민, 에탄올아민, 2-디메틸아미노에탄올, 트로메타민(tromethamine), 라이신, 아르기닌, 히스티딘, 카페인, 프로카인(procaine), 히드라바민 (hydrabamine), 콜린(choline), 베타인(betaine), 에틸렌디아민, 글루코사민, N-알킬글루카민, 테오브로민(theobromine), 퓨린, 피페라진, 피페리딘, 및/또는 N-에틸피페리딘을 포함하는 시클릭 아민들의 염들을 포함할 수 있다. 또한, 다른 카르복실산 유도체, 예를 들어 카르복사미드(carboxamides), 저급 알킬 카르복사미드, 디(저급 알킬) 카르복사미드 등을 포함하는 카르복실산 아미드도 포함될 수 있다.

예를 들어, 약학적으로 허용가능한 산 부가 염들은 무기 및 유기산들로부터 제조될 수 있다. 무기산들로부터 유도된 염들은 염산, 브롬산, 황산, 질산, 인산 등을 포함한다. 유기산들로부터 유도된 염들은 아세트산, 프로피온산, 글리콜산, 피루브산, 옥살산, 말산 (malic acid), 말론산, 숙신산, 말레산(maleic acid), 푸마르산, 타르타르산, 시트르산, 벤조산, 신남산(cinnamic acid), 만델산(mandelic acid), 메탄술폰산, 에탄술폰산, p-톨루엔술폰산, 및/또는 살리실산 등을 포함할 수 있으나, 이에 제한되지 않을 수 있다.

본 발명에서, 상기 약학 조성물은 약학적으로 허용가능한 담체(carrier) 또는 첨가제를 포함할 수 있다. 본 발명에서 상기 "약학적으로 허용가능한" 의미는 유효성분의 활성을 억제하지 않으면서 적용(처방) 대상이 적응 가능한 이상의 독성을 지니지 않는다는 의미이다. 상기 "담체"는 세포 또는 조직 내로의 화합물의 부가를 용이하게 하는 화합물로 정의된다.

본 발명의 시클레소나이드는 단독으로 또는 어떤 편리한 담체 등과 함께 혼합하여 투여될 수 있고, 그러한 투여 제형은 단회투여 또는 반복투여 제형일 수 있다. 상기 약학 조성물은 고형 제제 또는 액상 제제일 수 있다. 고형 제제는 산제, 과립제, 정제, 캅셀제, 좌제 등이 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. 고형 제제에는 담체, 착향제, 결합제, 방부제, 붕해제, 활택제, 충진제 등이 포함될 수 있으나 이에 한정되는 것은 아니다. 액상 제제로는 물, 프로필렌 글리콜 용액 같은 용액제, 현탁액제, 유제 등이 있으나, 이에 한정되는 것은 아니며, 적당한 착색제, 착향제, 안정화제, 점성화제 등을 첨가하여 제조할 수 있다. 예를 들어, 산제는 본 발명의 유효 성분인 시클레소나이드와 유당, 전분, 미결정셀룰로오스 등 약제학적으로 허용가능한 적당한 담체를 단순 혼합함으로써 제조될 수 있다. 과립제는 본 발명의 상기 시클레소나이드; 약학적으로 허용가능한 적당한 담체; 및 폴리비닐피롤리돈, 히드록시프로필셀룰로오스 등의 약학적으로 허용가능한 적당한 결합제를 혼합한 후, 물, 에탄올, 이소프로판올 등의 용매를 이용한 습식과립법 또는 압축력을 이용한 건식과립법을 이용하여 제조될 수 있다. 또한 정제는 상기 과립제를 마그네슘스테아레이트 등의 약학적으로 허용가능한 적당한 활택제와 혼합한 후, 타정기를 이용하여 타정함으로써 제조될 수 있다.

본 발명의 시클레소나이드는 치료해야 할 질환 및 개체의 상태에 따라 경구제, 주사제(예를 들어, 근육주사, 복강주사, 정맥주사, 주입(infusion), 피하주사, 임플란트), 흡입제, 비강투여제, 질제, 직장투여제, 설하제, 트랜스더말제, 토피칼제 등으로 투여될 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. 투여 경로에 따라 통상적으로 사용되고 비독성인, 약학적으로 허용가능한 운반체, 첨가제, 비히클을 포함하는 적당한 투여 유닛 제형으로 제제화될 수 있다.

본 발명의 약학 조성물은 매일 약 0.0001 mg/kg 내지 약 10 g/kg이 투여될 수 있으며, 약 0.001 mg/kg 내지 약 1 g/kg의 1일 투여 용량으로 투여될 수 있다. 그러나 상기 투여량은 상기 혼합물의 정제 정도, 환자의 상태(연령, 성별, 체중 등), 치료하고 있는 상태의 심각성 등에 따라 다양할 수 있다. 필요에 따라 편리성을 위하여 1일 총 투여량을 하루 동안 여러 번 나누어 투여될 수 있다.

본 발명의 조성물이 약학 조성물로 사용될 경우, 상기 조성물 내의 시클레소나이드의 함량은 질환의 증상, 증상의 진행 정도, 환자의 상태 등에 따라서 항염 활성을 나타낼 수 있는 유효량을 적절히 조절 가능하며, 예컨대, 상기 시클레소나이드의 양은 전체 조성물 총 중량을 기준으로 0.0001 중량% 이상, 구체적으로 0.001 중량% 이상일 수 있고, 80 중량% 이하, 구체적으로는 50 중량% 이하일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.

또한, 본 발명의 상기 시클레소나이드는 유방암 세포 유래 맘모스페어의 성장(증식)을 억제하는 것을 확인하였는 바, 유방암 줄기세포 성장 억제용 식품 조성물로 이용이 가능하다. 또한, 상기 시클레소나이드는 폐암 세포 유래 투머스페어의 성장(증식)을 억제하는 것을 확인하였는 바, 폐암 줄기세포 성장 억제용 식품 조성물로 이용이 가능하다.

본 발명의 상기 조성물이 식품 조성물로 이용되는 경우, 허용가능한 식품 보조 첨가제를 포함할 수 있으며, 식품의 제조에 통상적으로 사용되는 적절한 담체, 부형제 및 희석제를 더욱 포함할 수 있다.

본 발명에서 식품은 영양소를 한 가지 또는 그 이상 함유하고 있는 천연물 또는 가공품을 의미하며, 구체적으로 어느 정도의 가공 공정을 거쳐 직접 먹을 수 있는 상태가 된 것을 의미하며, 통상적인 의미로서, 각종 식품, 기능성 식품, 음료, 식품 첨가제 및 음료 첨가제를 모두 포함하는 의미로 사용된다. 상기 식품의 예로서 각종 식품류, 음료, 껌, 차, 비타민 복합제, 기능성 식품 등이 있다. 추가로, 본 발명의 식품에는 특수영양식품(예, 조제유류, 영,유아식 등), 식육가공품, 어육제품, 두부류, 묵류, 면류(예, 라면류, 국수류 등), 건강보조식품, 조미식품(예, 간장, 된장, 고추장, 혼합장 등), 소스류, 과자류(예, 스넥류), 유가공품(예, 발효유, 치즈 등), 기타 가공식품, 김치, 절임식품(각종 김치류, 장아찌 등), 음료(예, 과실, 채소류 음료, 두유류, 발효음료류, 아이스크림류 등), 천연조미료(예, 라면 스프 등), 비타민 복합제, 알코올 음료, 주류 및 그 밖의 건강보조식품류를 포함하나 이에 한정되지 않는다. 상기 기능성 식품, 음료, 식품첨가제 또는 음료첨가제는 통상의 제조방법으로 제조될 수 있다.

상기 "기능성 식품"이란 식품에 물리적, 생화학적, 생물공학적 수법 등을 이용하여 해당 식품의 기능을 특정 목적에 작용, 발현하도록 부가가치를 부여한 식품군이나 식품 조성이 갖는 생체방어리듬조절, 질병 방지와 회복 등에 관한 체내조절기능을 생체에 대하여 충분히 발현하도록 설계하여 가공한 식품을 의미하며, 구체적으로는 건강기능식품일 수 있다.

본 발명에서 사용되는 용어 "건강기능식품"이란 인체에 유용한 기능성을 가진 원료나 성분을 사용하여 정제, 캅셀, 분말, 과립, 액상 및 환 등의 형태로 제조 및 가공한 식품을 말한다. 여기서 "기능"이라 함은 인체의 구조 및 기능에 대하여 영양소를 조절하거나 생리학적 작용 등과 같은 보건용도에 유용한 효과를 얻는 것을 의미한다. 본 발명의 건강기능식품은 당업계에서 통상적으로 사용되는 방법에 의하여 제조가능하며, 상기 제조시에는 당업계에서 통상적으로 첨가하는 원료 및 성분을 첨가하여 제조할 수 있다. 또한 상기 건강기능식품의 제형 또한 건강기능식품으로 인정되는 제형이면 제한없이 제조될 수 있다. 본 발명의 식품용 조성물은 다양한 형태의 제형으로 제조될 수 있으며, 일반 약품과는 달리 식품을 원료로 하여 약품의 장기 복용 시 발생할 수 있는 부작용 등이 없는 장점이 있고, 휴대성이 뛰어나, 본 발명의 건강기능식품은 유방암과 폐암 줄기세포 성장 억제의 효과를 증진시키기 위한 보조제로 섭취가 가능하다.

또한, 상기 기능성 식품에는 식품학적으로 허용 가능한 식품 보조 첨가제를 포함할 수 있으며, 기능성 식품의 제조에 통상적으로 사용되는 적절한 담체, 부형제 및 희석제를 더욱 포함할 수 있다.

또한, 상기 식품 조성물에서, 상기 시클레소나이드의 양은 식품 조성물 총 중량의 0.00001 중량% 이상, 구체적으로 0.1 중량% 이상일 수 있고, 80 중량% 이하, 구체적으로 50 중량% 이하, 더욱 구체적으로 40 중량% 이하로 포함될 수 있으며, 상기 식품이 음료인 경우에는 식품 전체의 부피 100 ml를 기준으로 0.001 g 이상, 구체적으로 0.01 g 이상, 50 g 이하, 구체적으로 10 g 이하, 더욱 구체적으로 2g 이하의 비율로 포함될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

본 발명의 식품 조성물에는 그 유효성분 이외에 감미제, 풍미제, 생리활성 성분, 미네랄 등이 포함될 수 있다. 감미제는 식품이 적당한 단맛을 나게 하는 양으로 사용될 수 있으며, 천연의 것이거나 합성된 것일 수 있다. 구체적으로는 천연 감미제를 사용하는 경우인데, 천연 감미제로서는 옥수수 시럽 고형물, 꿀, 수크로오스, 프록토오스, 락토오스, 말토오스 등의 당 감미제를 들 수 있다. 풍미제는 맛이나 향을 좋게 하기 위하여 사용될 수 있는데, 천연의 것과 합성된 것 모두 사용될 수 있다. 구체적으로는 천연의 것을 사용하는 경우이다. 천연의 것을 사용할 경우에 풍미 이외에 영양 강화의 목적도 병행할 수 있다. 천연 풍미제로서는 사과, 레몬, 감귤, 포도, 딸기, 복숭아 등에서 얻어진 것이거나 녹차잎, 둥굴레, 대잎, 계피, 국화 잎, 자스민 등에서 얻어진 것일 수 있다. 또한, 인삼(홍삼), 죽순, 알로에 베라, 은행 등에서 얻어진 것을 사용할 수 있다. 천연 풍미제는 액상의 농축액이나 고형상의 추출물일 수 있다. 경우에 따라서 합성 풍미제가 사용될 수 있는데, 합성 풍미제는 에스테르, 알콜, 알데하이드, 테르펜 등이 이용될 수 있다. 생리 활성 물질로서는 카테킨, 에피카테킨, 갈로카테킨, 에피갈로카테킨 등의 카테킨류나, 레티놀, 아스코르브산, 토코페롤, 칼시페롤, 티아민, 리보플라빈 등의 비타민류 등이 사용될 수 있다. 미네랄로서는 칼슘, 마그네슘, 크롬, 코발트, 구리, 불소화물, 게르마늄, 요오드, 철, 리튬, 마그네슘, 망간, 몰리브덴, 인, 칼륨, 셀레늄, 규소, 나트륨, 황, 바나듐, 아연 등이 사용될 수 있다.

또한, 본 발명의 식품 조성물은 상기 감미제 등 이외에도 필요에 따라 보존제, 유화제, 산미료, 점증제 등을 포함할 수 있다.

이러한 보존제, 유화제 등은 그것이 첨가되는 용도를 달성할 수 있는 한 극미량으로 첨가되어 사용되는 것이 바람직하다. 극미량이란 수치적으로 표현할 때 식품 조성물 전체 중량을 기준으로 할 때 0.0005 중량％ 내지 약 0.5 중량％ 범위를 의미한다. 사용될 수 있는 보존제로서는 소듐 소르브산칼슘, 소르브산나트륨, 소르브산칼륨, 벤조산칼슘, 벤조산나트륨, 벤조산칼륨, EDTA(에틸렌디아민테트라아세트산) 등을 들 수 있다. 사용될 수 있는 유화제로서는 아카시아검, 카르복시메틸셀룰로스, 잔탄검, 펙틴 등을 들 수 있다. 사용될 수 있는 산미료로서는 연산, 말산, 푸마르산, 아디프산, 인산, 글루콘산, 타르타르산, 아스코르브산, 아세트산, 인산 등을 들 수 있다. 이러한 산미료는 맛을 증진시키는 목적 이외에 미생물의 증식을 억제할 목적으로 식품 조성물이 적정 산도로 되도록 첨가될 수 있다. 사용될 수 있는 점증제로서는 현탁화 구현제, 침강제, 겔형성제, 팽화제 등을 들 수 있다.

본 발명은 다른 하나의 양태로, 상기 암 줄기세포 성장 억제용 조성물을 포함하는, 암의 치료 또는 예방용 약학적 조성물을 제공한다.

본 발명의 일실시예에서는 MCF-7 세포주와 MDA-MB-231세포주에서 시클레소나이드를 처리한 경우, 유방암 세포주들의 성장이 억제되는 것을 확인하였다(도 1A 및 1B). 또한, 시클레소나이드 처리에 의해, MDA-MB-231 세포에서 세포자멸 소체(apoptotic bodies) 형성을 확인하였다(도 1E).

본 발명의 다른 일실시예에서는 A549 세포에서 시클레소나이드를 처리한 경우, 폐암 세포주들의 성장이 억제되는 것을 확인하였다(도 7A). 또한, 시클레소나이드 처리에 의해, A549 세포에서 세포자멸 소체(apoptotic bodies) 형성을 확인하였다(도 7B).

이에 따라, 본 발명의 조성물은 유방암 또는 폐암의 치료 또는 예방용 약학적 조성물로 이용할 수 있다.

또한, 본 발명의 일실시예에서는 시클레소나이드 억제제가 유방암 세포에서 CD44^high/CD24^low를 발현하는 모집단을 감소시켰으며(도 4A), ALDH 양성 유방암 세포의 비율을 감소시킨 것을 확인하였다(도 4B). 또한, ALDH 양성 폐암 세포의 비율을 감소시킨 것을 확인하였다(도 10). 이에 따라, 상기 조성물은 CD44^high/CD24^low를 발현하는 유방암 세포의 성장을 억제할 수 있으며, 알데히드 탈수소효소(ALDH) 양성의 유방암 세포의 성장을 억제할 수 있으며, 또한 알데히드 탈수소효소(ALDH) 양성의 폐암 세포의 성장을 억제할 수 있다.

본 발명은 다른 하나의 양태로, 상기 암 줄기세포 성장 억제용 조성물을 포함하는, 암전이 억제용 약학적 조성물을 제공한다.

상기 암은 발생한 부위에 존재하는 원발암과 상기 발생 부위로부터 신체의 다른 부위로 퍼져나간 전이암으로 구분된다. 상기 "암전이"는 악성 종양이 발병한 장기에서 떨어진 다른 조직으로 전파한 상태를 의미한다. 암세포가 혈액순환이나 림프순환을 통해 퍼져나가서 형성되는 것으로, 대개는 혈액순환을 타고 다른 장기로 옮겨간 후 새로운 종양으로 자라난 것이다. 이와 달리 암세포가 이웃한 조직으로 직접 이동하여 형성되기도 한다. 본 발명에서 암전이는 암세포가 이웃조직으로 직접 이동하고 침투하는 침윤(invasion)에 의한 암세포의 확산 및 암세포가 혈류를 타고 이동하여 물리적으로 원발암과는 인접하지 않은 장기에서 새로운 종양을 형성하는 전이(metastasis)를 모두 포함한다. 한편, 상기 암전이에 있어서, 세포의 이동은 필수적이다. 따라서, 이러한 암세포의 이동을 저해하는 것이 암전이를 예방하는 일차적인 방법임은 자명하다.

본 발명에서 상기 암은 이에 제한되지 않으나, 유방암 또는 폐암일 수 있다. 본 발명에서 용어 "암", "암 줄기세포", "암 줄기세포 성장 억제", "약학적 조성물"에 대한 설명은 전술한 바와 같다.

본 발명의 일실시예에서는 시클레소나이드가 MDA-MB-231 세포의 이동과 콜로니 형성을 농도 의존적으로 억제하는 것을 확인하였다(도 1F 및 1G).

또한, 본 발명의 다른 일실시예에서는 상기 시클레소나이드가 A549 세포의 이동과 콜로니 형성을 억제하는 것을 확인하였다(도 7E 및 7F)

이에 따라, 상기 본 발명의 조성물은 암세포의 이동을 억제함으로써 암 전이를 억제할 수 있는 바, 암의 전이 억제용 약학적 조성물로 활용이 가능하다.

본 발명은 다른 하나의 양태로, 상기 암 줄기세포 성장 억제용 조성물을 포함하는, 암의 개선 또는 예방용 식품 조성물을 제공한다.

본 발명에서 용어 "암", "암 줄기세포", "암 줄기세포 성장 억제", "식품 조성물"에 대한 설명은 전술한 바와 같다. 본 발명의 일실시예에서는 MCF-7 세포주와 MDA-MB-231 세포주에서 시클레소나이드를 처리한 경우, 유방암 세포주들의 성장이 억제되는 것을 확인하였으며, 다른 일실시예에서는 A549 세포주에서 시클레소나이드를 처리한 경우, 폐암 세포주들의 성장이 억제되는 것을 확인하였는 바, 암의 개선 또는 예방용 식품 조성물로 이용이 가능하다. 본 발명에서 상기 암은 유방암 또는 폐암일 수 있으나, 이에 제한되지는 않는다.

본 발명은 다른 하나의 양태로, 상기 암 줄기세포 성장 억제용 조성물을 포함하는, 암전이 개선 또는 예방용 식품 조성물을 제공한다.

본 발명에서 용어 "암전이", "암 줄기세포", "암 줄기세포 성장 억제", "식품 조성물"에 대한 설명은 전술한 바와 같다. 본 발명의 일실시예에서는 시클레소나이드가 MDA-MB-231 세포의 이동과 콜로니 형성을 농도 의존적으로 억제하였으며, 다른 일실시예에서는 시클레소나이드가 A549 세포의 이동과 콜로니 형성을 억제하는 것을 확인하였는 바, 암전이 개선 또는 예방용 식품 조성물로 이용이 가능하다. 본 발명에서 상기 암은 유방암 또는 폐암일 수 있으나, 이에 제한되지는 않는다.

본 발명은 다른 하나의 양태로, 하기 화학식 1로 표시되는 시클레소나이드 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 시험관(in vitro) 또는 인간을 제외한 개체에 투여하는 단계를 포함하는, 암 줄기세포의 성장을 억제하는 방법을 제공한다.

[화학식 1]

본 발명에서, 용어 "시클레소나이드", "암", "암 줄기세포", "암 줄기세포 성장 억제"에 대한 설명은 전술한 바와 같다.

본 발명에서 용어 "개체"란 암전이가 발생하였거나 암이 발생한 인간을 포함한 모든 동물을 의미한다. 소, 돼지, 양, 닭, 개, 인간 등을 포함하는 포유동물, 조류 등을 포함하며, 본 발명의 상기 조성물의 투여에 의해 암 줄기세포의 성장이 억제되고 이에 의해 암이 치료되는 개체는 제한없이 포함한다.

본 발명의 시클레소나이드는 유방암과 폐암 세포의 성장을 억제하며, 유방암과 폐암 줄기세포의 형성을 억제하였다. 또한, 유방암과 폐암 줄기세포에서 특징적으로 발현하는 것으로 알려진 Nanog, C-myc, Oct4, Sox2, Snail 및 CD44와 같은 자가 재생 유전자의 발현을 억제하였으며, 유방암 줄기세포의 맘모스페어 형성과 폐암 줄기세포의 투머스페어 형성에 관여하는 것으로 알려진 IL-6와 IL-8의 생산을 억제하였으며, STAT3 신호전달 경로를 억제하는 것을 확인하였다. 이에 따라, 상기 화합물은 유방암과 폐암 등의 암 줄기세포의 성장과 이들 암의 성장을 억제하는 바, 유방암과 폐암 등의 암의 치료에 활용이 가능하다.

도 1은 시클레소나이드가 유방암 세포주에서 다양한 암 특징을 억제하는 것을 나타낸다. 구체적으로, (A 및 B) 시클레소나이드의 화학적 구조 및 시클레소나이드의 MCF-7 및 MDA-MB-231 세포에 대한 생존률을 나타낸다. MCF-7 및 MDA-MB-231 세포에 48시간 동안 시클레소나이드의 농도를 증가시켜 처리하였다. 시클레소나이드의 항 증식 효과는 MTS 분석에 의해 측정하였다.
(C, D, E) 유방암 세포의 세포 사멸에 미치는 시클레소나이드의 영향을 나타낸다. MDA-MB-231 세포에 시클레소나이드를 24시간 동안 처리하고, 사멸 세포를 아넥신 V-PI 염색 키트를 사용하여 FACS에 의해 분석하였다. MDA-MB-231 세포에서 caspase3/7 활성은 Caspase-Gloss 3/7 kit에 의해 분석하였다. 형광 염색법에 의해 사멸된 세포(apoptotic cells)을 분석하였으며, 유방암에서 핵은 Hoechst 33258로 염색하였다(확대, x100).
(F) 인간의 유방암 세포의 이동 포텐셜에 대한 시클레소나이드의 효과를 나타낸다. MDA-MB-231 세포의 상처 치유는 시클레소나이드 처리 여부에 따라, 0시간, 18시간에 촬영하였다.
(G) 인간의 유방암 세포의 콜로니 형성에 대한 시클레소나이드의 효과를 나타낸다. 상기 해리된 1000개의 MDA-MB-231 세포를 6-웰 플레이트에 접종하고, 7 일간 시클레소나이드 및 DMSO의 표시된 농도로 처리하였다. 콜로니의 대표 이미지가 기록되었다. 표시된 데이터는 3 개의 독립적인 실험의 평균 ± SD를 나타낸다. *p<0.05 vs. DMSO-처리된 대조군.
도 2는 이종이식 모델에서 종양성장에 대한 시클레소나이드의 효과를 나타낸다. 300만개의 세포는 면역 결핍 NOD-SCID 암컷 누드 마우스의 유방 지방 패드에 주입하였다.
(A) MCF-7 세포를 생산하는 면역 결핍 누드 마우스에서 시클레소나이드가 종양 성장에 미치는 효과를 나타낸 것이다. 사용된 약물 투여량은 10mg/kg이다.
(B) 종양의 무게에 대한 시클레소나이드의 효과를 나타낸다. 종양 무게는 치료 후에 측정하였다.
(C) 종양 부피는 캘리퍼를 사용하여 주 2회 측정하였으며, (폭×길이²)/2로 산출하였다. 종양 성장 곡선은 실험 기간 동안 모니터링 하였다.
*는 대조군과 비교하여, p <0.05. 대표적인 이미지는 치료 7주 끝에 캡쳐하였으며, 그 결과는 vehicle 처리된 대조군, 시클레소나이드 처리된 마우스로 나타냈다.
도 3은 맘모스페어 형성에 대한 시클레소나이드의 효과를 나타낸다. MCF-7 및 MDA-MB-231 세포는 7일 동안 맘모스페어 형성 조건에서 배양했다.
(A) MCF-7 세포 유래된 맘모스페어 형성에 대한 시클레소나이드의 효과를 나타낸다. 1차 맘모스페어는 시클레소나이드(5 및 10 μM) 또는 DMSO와 함께 배양하였다.
(B) MDA-MB-231 세포에서 유래된 맘모스페어 형성에 시클레소나이드의 효과를 나타낸다. 상기 맘모스페어는 시클레소나이드(10 μM) 또는 DMSO와 함께 배양하였다. MCF-7 및 MDA-MBB-231 세포는 배양 7일 동안 시클레소나이드와 DMSO로 처리하였다. 이미지는 10배 배율 현미경으로 얻었으며, 대표 맘모스페어였다(스케일 바 = 100μm).
(C) MCF-7과 MDA-MB231 세포에서 유래된 맘모스페어 형성에 대한 프레드니손과 덱사메타손(20 내지 80 μM)의 효과를 조사했다.
도 4는 유방암 세포주에서 암줄기세포 마커의 발현에 대한 시클레소나이드의 효과를 나타낸다.
(A) MDA-MB-231 세포에서 CD44+/CD24- 세포의 수에 대한 시클레소나이드의 효과를 나타낸다. MDA-MB-231 세포에서 시클레소나이드의 처리 유무에 따라, CD44+/CD24- 세포의 비율을 측정하였다. FACS 분석을 위해, 100,000개의 세포를 획득 하였다. 게이팅은 대조군 항체를 기반으로 했다.
(B) ALDH 양성 세포 집단에 대한 시클레소나이드의 효과를 나타낸다. MDA-MB-231 세포는 2 일간 시클레소나이드 (10 μM) 또는 DMSO로 처리한 후, ALDEFLUOR 분석 및 FACS 분석을 실시하였다. 오른쪽 패널은 음성 대조군으로 ALDH 저해제인, DEAB로 처리된 ALDH 양성 세포를 나타내고, 왼쪽 패널은 DEAB 처리되지 않은 ALDH 양성 세포를 나타낸다. ALDH 양성 집단은 박스에 표시하였다.
도 5는 맘모스페어에서 STAT3 신호 경로에 대한 시클레소나이드의 효과를 나타낸다.
(A) 맘모스페어에서 STAT3 신호 전달 경로에 대한 시클레소나이드의 효과를 나타낸다. STAT3 및 NF-kB의 핵 단백질 발현 및 활성화를 pSTAT3, STAT3, P65 및 라민 B에 대한 항체로 맘모스페어에서 측정하였다. 시클레소나이드는 맘모스페어에서 핵 pSTAT3 단백질의 수준을 감소시켰다.
(B) 시클레소나이드로 처리된 MDA-MB-231 세포 유래된 맘모스페어 핵 용해물(lysates)의 EMSA (전기영동 이동성 시프트) 분석을 나타낸다. 핵 용해물은 ?Mbiotin-labeled Stat3 probe로 배양하였으며, 6 % PAGE에 의해 분리하였다.
레인 1: 프로브 단독; 레인 2: 프로브 + 핵 추출물; 레인 3: 프로브 + 시클레소나이드 처리된 핵 추출물; 레인 4: 자기 경쟁; 레인 5: 돌연변이 STAT3 프로브와 함께 배양된 핵 추출물. 상기 시클레소나이드는 맘모스페어 핵 용해물에서 DNA/STAT3 상호 작용을 감소시켰다.
(C) 시클레소나이드 또는 DMSO 처리된 종양의 인간 염증성 사이토카인 분석을 나타낸다. 상기 염증성 사이토카인은 BD cytometric bead array (CBA) human inflammatory cytokines kit를 이용하여 측정하였다. CBA 분석은 IL-6, IL-8, IL-10, IL-12, IL-1β, 및 TNF 항체를 사용하여 수행하였다.
도 6은 유방암에서 암줄기세포 로드에 대한 시클레소나이드의 효과를 나타낸다.
(A) CSC 마커인 Nanog, Sox2, C-myc, Oct4 및 CD44 유전자의 전사 발현 수준은 시클레소나이드 및 DMSO-처리된 맘모스페어에서 CSC 마커 특이적인 프라이머를 사용하여 실시간 PCR(realtime RT-PCR)을 사용하여 분석하였다. β-액틴은 내부 대조군으로 사용하였다.
(B) 맘모스페어 성장에 대한 시클레소나이드의 효과를 나타낸다. 시클레소나이드는 맘모스페어의 성장을 억제한다. 2일간 시클레소나이드 및 DMSO 처리된 맘모스페어는 단일 세포로 분리하였으며, 동등한 세포 수로 6 cm 디쉬에 플레이팅하였다. 플레이팅 24시간 후, 세포를 계수하였다. 2일 및 3일째, 세포는 세번 계수되었고, 평균 값으로 플롯팅하였다. 상기 데이터는 3 개의 독립적인 실험의 평균 ± SD를 나타낸다. *p<0.05 vs. DMSO-처리된 대조군.
도 7은 시클레소나이드가 폐암 세포주에서 다양한 암 특징을 억제하는 것을 나타낸다. (A) 시클레소나이드의 A549 폐암 세포에 대한 생존률을 나타낸다. A549 세포에 48시간 동안 시클레소나이드의 농도를 증가시켜 처리하였다. 시클레소나이드의 항 증식 효과는 MTS 분석에 의해 측정하였다.
(B) 형광 염색법에 의해 사멸된 세포(apoptotic cells)을 분석하였으며, 폐암에서 핵은 Hoechst 33258로 염색하였다(확대, x100).
(C) 폐암 세포의 세포 사멸에 미치는 시클레소나이드의 영향을 나타낸다. A549 세포에 시클레소나이드를 24시간 동안 처리하고, 사멸 세포을 아넥신 V-PI 염색 키트를 사용하여 FACS에 의해 분석하였다.
(D) A549 세포에서 caspase3/7 활성은 Caspase-Gloss 3/7 kit에 의해 분석하였다.
(E) 인간의 폐암 세포의 이동 포텐셜에 대한 시클레소나이드의 효과를 나타낸다. A549 세포의 상처 치유는 시클레소나이드 처리 여부에 따라, 0시간, 18 시간에 촬영하였다.
(F) 인간의 폐암 세포의 콜로니 형성에 대한 시클레소나이드의 효과를 나타낸다. 상기 해리된 1000개의 A549 세포를 6-웰 플레이트에 접종하고, 7 일간 표시된 농도의 시클레소나이드와 DMSO로 처리하였다. 콜로니의 대표 이미지가 기록되었다. 표시된 데이터는 3 개의 독립적인 실험의 평균 ± SD를 나타낸다. *p<0.05 vs. DMSO-처리된 대조군.
도 8은 폐암 세포가 이식된 이종이식 모델에서 종양성장에 대한 시클레소나이드의 효과를 나타낸다. 500만개의 세포는 면역 결핍 NOD-SCID 수컷 누드 마우스의 피하조직에 주입하였다.
(A) A549 세포를 생산하는 면역 결핍 누드 마우스에서 시클레소나이드가 종양 성장에 미치는 효과를 나타낸 것이다. 사용된 약물 투여량은 10mg/kg이다.
(B) 종양의 무게에 대한 시클레소나이드의 효과를 나타낸다. 종양 무게는 치료 후에 측정하였다.
(C) 종양 부피는 캘리퍼를 사용하여 주 2회 측정하였으며, (폭×길이²)/2로 산출하였다. 종양 성장 곡선은 실험 기간 동안 모니터링 하였다.
*는 대조군과 비교하여, p <0.05. 대표적인 이미지는 치료 14주 끝에 캡쳐하였으며, 그 결과는 vehicle 처리된 대조군, 시클레소나이드 처리된 마우스로 나타냈다.
도 9는 투머스페어 형성에 대한 시클레소나이드의 효과를 나타낸다. A549 세포는 7일 동안 투머스페어 형성 조건에서 배양했다.
(A) A549 세포 유래된 투머스페어 형성에 대한 시클레소나이드의 효과를 나타낸다. 1차 투머스페어는 시클레소나이드 (5 및 10 μM) 또는 DMSO와 함께 7일간 배양하였다.
(B) A549 세포 유래된 투머스페어 형성에 대한 시클레소나이드의 활성화형인 이소부티릴 시클레소나이드의 효과를 나타낸다.
(C) A549 세포 유래된 투머스페어 형성에 대한 Glucocorticoids인 프레드니손 및 덱사메타손의 효과를 나타낸다. 1차 투머스페어는 프레드니손 및 덱사메타손 (40 및 80 μM) 또는 DMSO와 함께 7일간 배양하였다.
이미지는 10배 배율 현미경으로 얻었으며, 대표적인 투머스페어였다(스케일 바 = 100μm).
도 10은 ALDH 양성 세포 집단에 대한 시클레소나이드의 효과를 나타낸다. A549 세포는 2 일간 시클레소나이드 또는 DMSO로 처리한 후, ALDEFLUOR 분석 및 FACS 분석을 실시하였다. 하단 패널은 ALDH 저해제인, DEAB로 처리된 ALDH 양성 세포를 나타내고, 상단 패널은 DEAB 처리되지 않은 ALDH 양성 세포를 나타낸다. ALDH 양성 집단은 박스에 표시하였다.
도 11은 폐암에서 암 줄기세포 로드(load)에 대한 시클레소나이드의 효과를 나타낸다.
(A) CSC 마커인 nanog, sox2, c-myc, 및 snail 유전자의 전사 발현 수준은 시클레소나이드 및 DMSO-처리된 투머스페어에서 CSC 마커 특이적인 프라이머를 사용하여 실시간 PCR(RT-PCR)을 사용하여 분석하였다. β-액틴은 내부 대조군으로 사용하였다.
(B) 투머스페어 성장에 시클레소나이드의 효과를 나타낸다. 시클레소나이드는 투머스페어의 성장을 억제한다. 2일간 시클레소나이드 및 DMSO 처리된 투머스페어는 단일 세포로 분리하였으며, 동등한 세포 수로 6 cm 디쉬에 플레이팅하였다. 플레이팅 24시간 후, 세포를 계수하였다. 1일, 2일 및 3일째, 세포는 세번 계수되었고, 평균 값으로 플롯팅하였다. 상기 데이터는 3 개의 독립적인 실험의 평균 ± SD를 나타낸다. *p<0.05 vs. DMSO-처리된 대조군.
도 12는 투머스페어에서 세포 외 IL-8의 단백질 수준에 대한 시클레소나이드의 효과를 나타낸다.
시클레소나이드 또는 DMSO 처리된 종양의 인간 염증성 사이토카인 분석을 나타낸다. 상기 염증성 사이토카인은 BD cytometric bead array (CBA) human inflammatory cytokines kit를 이용하여 측정하였다. CBA 분석은 IL-6, IL-8, IL-10, IL-12, IL-1β, 및 TNF 항체를 사용하여 수행하였다.

이하, 본 발명을 실시예에 의해 보다 상세히 설명한다. 단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기의 실시예에 한정되는 것은 아니다.

<A: 실험 재료 및 방법>

실시예 1: 실험재료

매우 낮은 부착 클러스터 플레이트를 포함하는 6-웰 배양 플레이트는 코닝(Tewksbury, MA, USA)로부터 획득했다. 시클레소나이드는 Sigma-Aldrich Co.(St. Louis, MO, USA)로부터 구입하였다. 세포 생존율은 CellTiter 96® aqueous one solution cell proliferation assay kit (Promega, Madison, WI, USA)을 사용하여 측정하였다. ALDEFLUOR™ Kit는 STEMCELL Technologies Inc (Vancouver, BC, Canada)에서 구입하였다.

실시예 2-1: 인간의 유방암 세포 배양과 맘모스페어 ( mammospheres ) 형성

인간의 유방암 세포, MCF-7은 American Type Culture Collection (ATCC; Manassas, VA, USA)로부터 얻었다. MCF-7 세포 및 MDA-MB-231는 10 % 소 태아 혈청(FBS; Hyclone), 100 U/㎖ 페니실린, 및 100 μg/ml 스트렙토마이신(Hyclone)을 포함하는 Dulbecco’s Modified Essential Medium (DMEM; Hyclone, Logan, UT, USA)에서 배양하였다. 상기 MCF-7 세포는 5 % CO₂를 함유하는 가습된 배양기에서 37℃로 유지하였다. 세포는 10cm 배양 접시에 1×10⁶ 세포의 밀도로 플레이팅 하였다. 1차 맘모스페어를 확립하기 위하여, 싱글 세포 현탁된 MCF-7 세포는 2ml의 complete MammoCult^TM medium (StemCell Technologies, Vancouver, BC, Canada)을 포함하는 ultra-low attachment 6-well plates에 웰당 3.5-4×10⁴의 세포수로 접종하였다. 상기 complete MammoCult^TM medium은 4 μg/ml의 헤파린, 0.48 μg/㎖의 하이드로코르티손, 100 U/ml 페니실린 및 100 μg/㎖의 스트렙토마이신으로 보충하였다. 상기 세포를 7일 동안 37 ℃, 5 % CO₂ 배양기에서 배양하였다.

실시예 2-2: 인간의 폐암 세포 배양과 투머스페어 ( tumorsphere ) 형성

인간의 폐암 세포, A549는 실시예 2-1의 유방암 세포와 동일한 배양 조건에서 배양하였다. 1차 투머스페어를 확립하기 위하여, 싱글 세포 현탁된 A549 세포는 2ml의 Cancer Stem Premeium medium(ProMab Biotechnologies Inc, Richmond, CA, USA)을 포함하는 ultra-low attachment 6-well plates에 웰당 5×10⁴의 세포수로 접종하였다. 상기 세포를 10일 동안 37 ℃, 5 % CO₂ 배양기에서 배양하였다.

실시예 3-1: 유방암 맘모스페어의 자동 계산

배양 10 일째, 세포 배양 플레이트를 스캐너(Epson Perfection V700 PHOTO, Epson Korea, Co, Seoul, Korea)에 배치하여, 맘모스페어의 8 비트 그레이 스케일 이미지를 얻었다. 낮은 해상도 (300 dpi)에서 이미지는 NICE 소프트웨어 프로그램을 사용하여 얻었으며, ftp://ftp.nist.gov/pub/physics/mlclarke/NICE에서 다운로드 했다. 카운팅을 위해, 행과 열의 바람직한 수(예를 들면, 6-웰 플레이트의 경우 2 x3)를 선택하여, 관심 영역(ROIs)을 생성하였으며, NICE program의 타원형 세팅을 선택한 후에, 개개의 ROIs는 제공된 ROI 형상을 이동 및 크기를 조정하여, 디파인(define)하였다. 상기 이미지의 배경 신호는 임계 알고리즘을 이용하여 부정하였으며, 선택된 이미지는 자동적으로 계수하였다. 상기 맘모스페어 형성 분석은 웰당 맘모스페어의 수/웰당 플레이팅된 총 세포의 수x100에 상응하여 맘모스페어의 형성 효율(MFE, %)을 결정하였다.

실시예 3-2: 폐암 투머스페어(tumorsphere)의 자동 계산

상기 실시예 3-1과 동일한 방법으로 폐암 투머스페어를 계수하였으며, 상기 투머스페어 형성 분석은 웰당 투머스페어의 수/웰당 플레이팅된 총 세포의 수 x100에 상응하여 투머스페어의 형성 효율(TFE, %)을 결정하였다.

실시예 4: 카스파제 -3/7( Caspase -3/7) 분석

유방암 세포와 폐암 세포는 24 시간 동안 시클레소나이드의 상이한 농도로 처리하였다. 카스파제-3/7 활성은 Caspase-Glo 3/7 kit (Promega, Wisconsin, USA)에 대한 제조업체의 지시에 따랐다. Caspase-Glo3/7 시약 100 ㎕를 암세포 배양 96-웰에 첨가하였다. 플레이트는 플레이트 실러로 덮고 실온에서 1 시간 동안 배양하였으며, plate-reading luminometer, GloMax® Explorer (Promega, Wisconsin, USA)를 이용하여 측정하였다.

실시예 5: CD44 및 CD24 발현 유세포 분석(Flow cytometric analysis)

MCF-7 세포에서 CD44 및 CD24의 발현은 FACS 분석에 의해 측정하였다. 1X 트립신/EDTA를 사용하여 세포를 분리 및 수확한 후, 백만개의 세포를 현탁시키고, FITC-결합된 항-인간 CD44와 PE-결합된 항-인간 CD24 항체 (BD Pharmingen, San Diego, CA, USA)로 표지하고 4℃에서 30분 동안 배양하였다. 이어서, 상기 세포를 1X PBS로 3회 세척하고, 유동세포 계측법(flow cytometry, Accuri C6, BD, San Diego, CA, USA)으로 분석하였다.

실시예 6: 아넥신 ( Annexin ) V/PI 염색 분석

암 세포는 6-웰 플레이트에서 배양하였으며, 유방암의 경우, 시클레소나이드 20 μM에서, 폐암의 경우, 시클레소나이드 10 및 20 μM 또는 DMSO와 함께 24시간 동안 배양하였다. 제조업체의 지시에 따라, 사멸된 세포는 PI 및 FITC-Annexin V로 이중염색하였다. 상기 샘플은 유동 세포 계측법(Flow cytometry) (Accuri C6, BD, San Diego, CA, USA)으로 분석하였다.

실시예 7: 형광 염색법에 의한 세포 사멸 분석

MDA-MB-231 세포를 시클레소나이드 20 μM, 또는 A549 세포를 시클레소나이드 30 μM에서 24 시간 동안 처리하고, 세포는 훽스트 (Hoechst) 33258 용액 (10 mg/ml)에서 37℃에서 30 분 동안 배양 하였다. 이후 세포를 형광 현미경으로 관찰하였다.

실시예 8: 클론원성 분석

MDA-MB-231 또는 A549 세포를 6-웰 플레이트에서 낮은 밀도로 접종하고, DMEM 배지에서 상이한 시클레소나이드 농도로 MDA-MB-231에 처리하거나, 10 μM 시클레소나이드로 A549 세포에 처리하였다. 24시간 후 배지는 새로운 배지로 교체하였고, 7 일간 성장하도록 배양하였다. 성장한 콜로니를 계수하였다.

실시예 9: 스크래치 이동 분석

MDA-MB-231 또는 A549 세포를 6-웰 플레이트에 접종하고 90 % 컨플루언시로 성장시켰다. 멸균된 백색 마이크로 피펫 팁을 사용하여, 셀층에 스크래치를 만들었다. DMEM 배지로 세척한 후, 유방암 또는 폐암은 시클레소나이드 또는 DMSO로 처리하였다. 18시간째에, 상처영역(wounded areas)을 40배 광학 현미경으로 촬영했다.

실시예 10-1: 유방암 세포 증식 분석

CellTiter 96® aqueous one solution 세포 증식 키트를 이용하여 MCF-7 및 MDA-MB-231 세포의 증식 속도를 측정했다. MCF-7 세포 및 MDA-MB-231 세포를 48 시간 동안 시클레소나이드 0, 5, 10, 20, 40 및 80 μM의 존재 하에 96-웰 플레이트에서 배양하였다. 제조사의 프로토콜에 따라, 96-웰 플레이트 판독기(Dynex Revelation, Dynex Ltd., Billingshurst, UK)를 사용하여, 490 nm에서 흡광도를 결정하였다. 각각의 데이터는 3세트를 측정하여 결정하였다.

실시예 10-2: 폐암 세포 증식 분석

폐암 세포로, A549 세포를 사용하고, 시클레소나이드를 0, 10, 20, 40, 80 및 100μM의 농도로 처리한 것을 제외하고, 실시예 10-1과 동일한 방법으로 수행하였다.

실시예 11: 웨스턴 블랏팅

시클레소나이드 처리된 MCF-7 및 MDA-MB-231 맘모스페어로부터 분리된 단백질은 10 % SDS-PAGE상에서 분리하고 폴리비닐리덴 디플루오라이드 멤브레인(Millipore, Bedford, MA, USA)으로 옮겼다. 상기 멤브레인을 30분 동안 실온에서 5 % 탈지 분유를 함유하는 PBS-트윈 20 (0.1%, v/v)에서 블로킹하였다. 상기 블랏은 밤새 4℃에서 1차 항체를 포함하는 블로킹 용액으로 배양하였다. 사용된 1차 항체는 다음과 같다: Stat3, p65, Lamin B, 및 phospho-Stat3(Cell Signaling, Beverly, MA, USA). β-액틴(Santa Cruz Biotechnology)는 로딩 대조군으로 사용하였다. PBS-트윈 20(0.1%, v/v)으로 세척 한 후, 상기 블랏은 horseradish peroxidase-결합된 2차 항체로 배양하고, 화학발광 검출키트(Santa Cruz Biotechnology)로 감광하였다.

실시예 12: ALDEFLUOR 분석

ALDEFLUOR 분석 시스템은 알데히드 탈수소효소(ALDH)의 활성에 기초된 CSCs의 식별, 평가 및 분리에 대한 신규한 접근법을 제공한다. 활성 시약 BODIPY-아미노아세트알데히드를 유방암 세포 또는 폐암 세포에 첨가하였으며, 알데히드 탈수소효소(ALDH)에 의해 형광의 BODIPY-아미노아세테이트로 전환되었다. ALDH 저해제인, 디에틸아미노벤즈알데히드(diethylaminobenzaldehyde, DEAB)은 음성 대조군으로 사용하였다. MCF-7 세포 또는 A549 세포에 24시간 동안 10 또는 20 μM의 시클레소나이드로 처리하고, ALDH 양성 세포의 비율은 ALDEFLUOR 분석법으로 분석하였다. ALDH 양성 및 음성 세포는 C6 Accuri 유동 세포 계측법 (BD Bioscience)를 사용하여 분류하였다.

실시예 13-1: 유방암 세포를 생산하는 면역 결핍 NOD- SCID ( BALB / cSIc (nu/nu)) female 누드 마우스의 화학 요법

총 12마리의 유방암 세포를 생산하는 NOD-SCID(BALB/cSIc (nu/nu)) 암컷 누드 마우스는 두 개의 그룹으로 구분하였다. 음성 대조군인 6 마리의 마우스는 화학 요법을 받지 않았다. 대조군 마우스의 종양의 부피는 매 3일마다 측정하였고, 식 (폭×길이²)/2를 사용하여 계산하였다. 다른 여섯 마리의 누드 마우스는 10mg/kg/day의 최적 투여량으로 주입공정을 사용하여 시험약물을 선행화학요법으로 받았다.

실시예 13-2: 폐암 세포를 생산하는 면역 결핍 NOD- SCID ( BALB / cSIc (nu/nu)) male 누드 마우스의 화학 요법

총 12 마리의 폐암을 생산하는 NOD-SCID(BALB/cSIc (nu/nu) male 누드 마우스는 2 그룹으로 나누었다. 음성 대조군인 6 마리의 마우스는 화학 요법을 받지 않았다. 대조군 마우스의 종양의 부피는 매 3일마다 측정하였고, 식 (폭×길이²)/2를 사용하여 계산하였다. 다른 여섯 마리의 누드 마우스는 10mg/kg/day의 최적 투여량으로 주입공정을 사용하여 시험약물을 선행화학요법으로 받았다.

실시예 14: 실시간 PCR ( realtime RT- PCR )

제조업체의 지시에 따라, 이중가닥 DNA 특이 염료로 SYBR 그린을 사용하여 One Step SYBR PrimeScript RT-PCR kit(Takara, Tokyo, Japan)로 전사체의 수준을 측정하였다. 원스텝 RT-PCR 반응은 1μg의 total RNA, 10μl의 2X One Step SYBR RT-PCR Buffer IV, 1μl의 PrimeScript 1 step Enzyme Mix II, CD44, NANOG, OCT4, C-myc, Sox2, Snail 및 β-actin에 대한 10 μM의 PCR 정방향 프라이머, 및 PCR 역방향 프라이머를 포함하여, 반응당 20 ㎕의 최종 부피에서 수행하였다.

상기 정방향, 역방향 프라이머는 다음과 같다.

CD44 forward primer: AGAAGGTGTGGGCAGAAGAA(서열번호 1),

CD44 reverse primer: AAATGCACCATTTCCTGAGA(서열번호 2),

NANOG forward primer: ATGCCTCACACGGAGACTGT(서열번호 3),

NANOG reverse primer: AAGTGGGTTGTTTGCCTTTG(서열번호 4),

OCT4 forward primer: AGCAAAACCCGGAGGAGT(서열번호 5),

OCT4 reverse primer: CCACATCGGCCTGTGTATATC(서열번호 6),

SOX2 forward primer: TTGCTGCCTCTTTAAGACTAGGA (서열번호 7),

SOX2 reverse primer: CTGGGGCTCAAACTTCTCTC (서열번호 8),

C-myc forward primer: AATGAAAAGGCCCCCAAGGTAGTTATCC(서열번호 9),

C-myc reverse primer: GTCGTTTCCGCAACAAGTCCTCTTC(서열번호 10),

β-actin forward primer: TGTTACCAACTGGGACGACA(서열번호 11),

β-actin reverse primer: GGGGTGTTGAAGGTCTCAAA(서열번호 12).

Snail forward primer: ACCACTATGCCGCGCTCTT (서열번호 15),

Snail reverse primer: GGTCGTAGGGCTGCTGGAA (서열번호 16).

표적 유전자의 mRNA의 상대적 발현량은 비교 CT 법을 이용하여 계산하였다. 적어도 3 개의 독립적인 PCR 절차는 통계분석을 따라서 수행하였다. PCR 산물은 내부 대조군(internal control)으로 β-actin 유전자로 표준화했다.

실시예 15: 인간 염증성 사이토카인 분석

염증성 사이토 카인은 제조사의 지시에 따라, BD cytometric bead array (CBA) human inflammatory cytokines kit를 이용하여 측정하였다(BD, San Diego, CA, USA).

혼합된 capture beads를 볼텍싱하고, beads 50 μl를 분석 튜브에 첨가했다. 인간 염증성 사이토카인 표준 50 μl와 배양된 투머스페어 용액을 분석 튜브에 더하고 나서, 사이토카인 PE 용액을 혼합하였다. 3시간 후, 상기 혼합된 용액을 세척하고, 유동세포계측법(flow cytometry)으로 분석하였다 (Accuri C6, BD, San Diego, CA, USA).

실시예 16: Electrophoretic mobility shift assays ( EMSA )

EMSA는 제조업체의 지시에 따라, Lightshift의 chemiluminscet EMSA 키트 (Thermoscientific, IL, USA)를 사용하여 검출하였다. Stat3 probe의 비오틴-상부 및 하부 프로부(5′-CTTCATTTCCCGGAAATCCCTA-Biotin3′, 서열번호 13 및 5′-TAGGGATTTCCGGGAAATGAAG-Biotin3′, 서열번호 14)는 어닐링되었고 상기 이중가닥 올리고뉴클레오티드는 비오틴으로 말단 표지하였다. MCF-7, MDA-MB-231 및 A549 세포로부터 핵 추출물은 참고문헌에 제시된 바와 같이 제조하였다 (Choi HS, Hwang CK, Kim CS, Song KY, Law PY, Wei LN and Loh HH. Transcriptional regulation of mouse mu opioid receptor gene: Sp3 isoforms (M1, M2) function as repressors in neuronal cells to regulate the mu opioid receptor gene. Mol Pharmacol. 2005; 67(5):1674-1683).

비오틴-표지된 DNA 프로브는 20분 동안 실온에서 1μg/μL poly [dI-dC])를 포함하는 최종 부피 20 ㎕의 EMSA 버퍼에서, 시클레소나이드 처리된 핵 단백질과 함께 배양하였다. 상기 반응 혼합물을 4℃에서 0.5× TBE (45 mM Tris borate 및 1 mM EDTA)에서 4 % 폴리아크릴아미드 비변성 겔에 전기영동하였으며, 화학발광 핵산 검출 키트 (Thermoscientific, IL, USA)를 사용하여 시각화 하였다.

실시예 17: 통계 분석

모든 데이터는 평균 ± 표준 편차 (SD)로 표시 하였다. 데이터는 student’s t-test를 이용하여 분석하였다. 0.05 보다 낮은 p값은 통계적으로 유의한 것으로 간주되었다(GraphPad Prism 5 Software, San Diego, CA, USA).

<B: 실험예 > 유방암 줄기세포 및 유방암에 대한 효과 분석

실험예 1: 시클레소나이드 ( ciclesonide ) 인간 유방암 세포의 세포 사멸을 유도하고, 증식을 억제하는 효과

도 1A에 도시된 시클레소나이드의 인간 유방암 세포주인, MCF-7 및 MDA-MB-231에서 항증식 효과를 조사하기 위하여 시클레소나이드를 농도별로 처리한 후, MTS 분석을 수행하였다. 그 결과, 시클레소나이드 처리 48시간 후에, MCF-7 및 MDA-MB-231 세포주에서 시클레소나이드 10μM 이상 농도에서 농도 의존적으로 유방암 세포주들의 성장이 억제되는 것을 확인하였다(도 1A 및 1B).

다음으로, MDA-MB-231 세포에서 사멸된 유방암 세포의 수(아넥신 V+)는 각각 시클레소나이드 20μM 처리에 의해 증가하는 것을 확인하였다(도 1C).

다음으로, MDA-MB-231 세포에서 캐스파제3/7의 형광분석을 수행하였으며, 그 결과, 시클레소나이드 40 μM 및 80 μM 에서 캐스파제3/7의 활성이 유도되는 것을 확인하였다(도 1D). 또한, 시클레소나이드 처리에 의해, MDA-MB-231 세포에서 세포자멸 소체(apoptotic bodies) 형성을 확인하였다(도 1E). 또한, 시클레소나이드는 MDA-MB-231세포의 이동과 콜로니 형성을 억제하였다(도 1F 및 1G). 이러한 결과는 시클레소나이드가 효과적으로 다양한 암 특징 (증식, 이동, 세포 사멸 및 콜로니 형성)을 억제하는 것을 의미한다.

실험예 2: 시클레소나이드가 이종 이식 모델에서 종양 성장을 억제하는 효과

시클레소나이드는 시험관에서 유방암 세포의 증식을 억제하는 것을 도 1에서 확인하였다. 다음으로, 시클레소나이드가 이종 이식 종양 모델(xenograft tumor model)에서 종양 유발을 억제하는지를 조사했다. 시클레소나이드 투여군에서 종양 부피는 시클레소나이드를 처리하지 않은 대조군보다 작았다(도 2A 및 2C). 또한 시클레소나이드 처리 군에서 종양 무게도 시클레소나이드를 처리하지 않은 대조군보다 작았다(도 2B). 그러나, 시클레소나이드 처리 군에서의 마우스의 체중은 대조군과 유사했다(도 2A). 이러한 결과는 시클레소나이드가 이종 이식 모델에서 종양 발생을 효과적으로 억제하는 것을 의미한다.

실험예 3: 시클레소나이드가 유방암 줄기세포를 억제하는 효과

시클레소나이드가 맘모스페어의 형성을 억제할 수 있는지 여부를 평가하기 위해, MCF-7 및 MDA-MB-231 세포로부터 유래된 1차 맘모스페어(mammosphere)에 상이한 농도의 시클레소나이드를 처리하였다. 도 3에 나타난 바와 같이, 시클레소나이드는 유방암 세포주로부터 유래된 1차 맘모스페어의 형성을 억제하였다. 맘모스페어의 수는 90%까지 감소하였으며, 맘모스페어의 크기도 감소하였다(도 3A 및 3B).

다음으로, 현재 약으로 많이 사용하고 있는 Glucocorticoids인 프레드니손(prednisone)과 덱사메타손(dexamethasone)을 이용한 비교실험 결과, 10μM 농도에서 시클레소나이드가 유방암 줄기세포의 성장을 현저히 억제한 것과 달리, 같은 Glucocorticoids에 속하는 프레드니손(prednisone)과 덱사메타손(dexamethasone)는 80μM의 고농도에서도 유방암 줄기세포의 성장을 억제하지 못하는 것을 확인하였다(도 3C).

따라서, 시클레소나이드는 기존 스테로이드와 달리, 효과적으로 유방암 줄기 세포를 억제하는 것을 알 수 있었다.

실험예 4: 시클레소나이드가 CD44high / CD24low를 발현하는 집단과 ALDH 양성 유방암 세포의 비율을 감소시키는 효과

MCF-7 세포에 24 시간 동안 시클레소나이드를 처리하였으며, 유방암 세포에서 CD44^high/CD24^low를 발현하는 집단 (subpopulation)에서 상기 시클레소나이드 저해제의 효과를 조사하였다. 그 결과, 상기 시클레소나이드 저해제는 유방암 세포에서 CD44^high/CD24^low를 발현하는 집단을 감소시켰다(도 4A). MCF-7 세포에 시클레소나이드를 24 시간 동안 처리하고 ALDH 양성 유방암 세포의 비율에 시클레소나이드 저해제의 효과를 조사하기 위해 ALDEFLUOR 분석을 실시하였다. 그 결과, 시클레소나이드가 ALDH 양성 유방암 세포의 비율을 감소시킨 것을 확인하였다(도 4B).

실험예 5: 시클레소나이드가 맘모스페어에서 STAT3 신호 경로를 저해하는 효과

시클레소나이드의 세포 기능을 조사하기 위해, 시클레소나이드 처리 하에, MCF-7 세포에서 유래된 맘모스페어에서 STAT3의 인산화 상태를 조사하였다. 그 결과, 시클레소나이드는 대조군에 비하여, 핵 STAT3 단백질의 인산화를 감소시켰다(도 5A).

또한, STAT3와 높은 친화성으로 결합하는 비오틴-표지된 SIE 결합 프로브를 이용하여, 시클레소나이드 처리된 핵 추출물과 Stat3 DNA의 결합을 분석했다. 도 5B에 도시된 바와 같이, 시클레소나이드는 비오틴-표지된 SIE 프로브와 Stat3가 결합하는 것을 억제하였다(도 5B, 레인 3). pStat3/비오틴-표지된 SIE 프로브의 특이도는 표지되지 않은 초과 자기 경쟁자(unlabeled excess self-competitor)(도. 5B, 레인 4)와 돌연변이된 SIE 경쟁자(mutated-Stat competitor)(도. 5B, 레인 5)를 사용하여 확인하였다. 이러한 데이터를 통해 Stat3 신호 전달 경로는 맘모스페어의 성장과 자가 재생을 조절하는 데에 중요하다는 것을 알 수 있었다.

실험예 6: MDA -MB-231 세포로부터 유래된 맘모스페어의 증식과 IL-6, IL-8 생산에 대한 시클레소나이드의 효과.

분비된 IL-6와 IL-8는 맘모스페어 형성에 중요한 역할을 하는 것으로 알려져 있었다(Sansone P, Storci G, Tavolari S, Guarnieri T, Giovannini C, Taffurelli M, Ceccarelli C, Santini D, Paterini P, Marcu KB, Chieco P and Bonafe M. IL-6 triggers malignant features in mammospheres from human ductal breast carcinoma and normal mammary gland. J Clin Invest. 2007; 117(12):3988-4002). 이에, 분비되는 IL-6와 IL-8의 생산량을 확인하기 위해, flow cytometer를 이용하여, 염증성 사이토카인 프로파일링 분석을 수행하였다.

그 결과, 염증성 사이토카인 프로파일링 데이타에 제시된 바와 같이, 시클레소나이드 처리에 의해 분비된 IL-6와 IL-8의 생산 수준이 감소하였다. 내부 대조군은 시클레소나이드 처리하지 않은 MDA-MB-231 맘모스페어 배양액을 이용하였다(도 5C).

실험예 7: 시클레소나이드가 암줄기세포(CSCs)의 자가재생 유전자 발현과 맘모스페어의 증식을 억제하는 효과

시클레소나이드가 자가 재생 유전자의 발현을 억제하는지를 확인하기 위하여, 자가 재생 유전자 발현을 실시간 PCR (realtime RT-PCR)에 의해 조사하였다. 그 결과, 시클레소나이드는 유방암 세포에서 Nanog, Sox2, Oct4, C-myc 및 CD44와 같은 자가 재생 유전자의 발현을 감소시켰다(도 6A).

다음으로, 시클레소나이드가 맘모스페어의 증식을 억제하는지를 확인하기 위하여, 맘모스페어에 시클레소나이드를 처리하였으며, 맘모스페어의 세포 수를 계수 하였다. 그 결과, 시클레소나이드는 맘모스페어의 세포 사멸을 유도하였으며, 시클레소나이드 처리된 맘모스페어에서 관찰된 세포수는 적었다. 이러한 결과를 통해, 시클레소나이드가 맘모스페어 증식을 크게 감소시키는 것을 알 수 있었다(도 6B).

<C: 실험예 > 폐암 줄기세포 및 폐암에 대한 효과 분석

실험예 8: 시클레소나이드가 인간 폐암 세포의 세포 사멸을 유도하고, 증식을 억제하는 효과

인간 폐암 세포주인, A549 세포에서 시클레소나이드의 항증식 효과를 조사하기 위하여 도 7A에 도시된 시클레소나이드를 농도별로 처리한 후, MTS 분석을 수행하였다. 그 결과, 시클레소나이드 처리 48시간 후에, A549 세포주에서 시클레소나이드 40μM 이상에서 농도 의존적으로 폐암 세포주들의 성장이 억제되는 것을 확인하였다(도 7A).

또한, 시클레소나이드 처리에 의해, A549 세포에서 세포자멸 소체(apoptotic bodies) 형성을 확인하였다(도 7B).

다음으로, A549 세포에서 사멸된 폐암 세포의 수(아넥신 V+)는 시클레소나이드 10 및 20 μM 처리에 의해 증가하는 것을 확인하였다(도 7C). 또한, A549 세포에서 캐스파제3/7의 형광분석을 수행하였으며, 그 결과, 시클레소나이드 80μM에서 캐스파제3/7의 활성이 유도되는 것을 확인하였다(도 7D). 또한, 시클레소나이드는 A549 세포의 이동과 콜로니 형성을 억제하였다(도 7E 및 7F). 이러한 결과는 시클레소나이드가 효과적으로 다양한 암 특징 (증식, 이동, 세포 사멸 및 콜로니 형성)을 억제하는 것을 의미한다.

실험예 9: 시클레소나이드가 이종 이식 모델에서 종양 성장을 억제하는 효과

시클레소나이드는 시험관에서 폐암 세포의 증식을 억제하는 것을 도 7에서 확인하였다. 다음으로, 폐암세포를 이용하여 종양을 형성시켜 이종 이식 종양 모델(xenograft tumor model)을 제조하였으며, 시클레소나이드를 처리하여 종양의 크기를 주별로 측정하여 효과를 검정하였다. 그 결과, 시클레소나이드 투여군에서 종양 부피는 시클레소나이드를 처리하지 않은 대조군보다 작았다(도 8A 및 8C). 또한, 시클레소나이드 처리 군에서 종양 무게도 시클레소나이드를 처리하지 않은 대조군보다 작았다(도 8B). 그러나, 시클레소나이드 처리 군에서의 마우스의 체중은 대조군과 유사했다. 이러한 결과는 시클레소나이드가 이종 이식 모델에서 종양 발생을 효과적으로 억제하는 것을 의미한다. 즉, 시클레소나이드는 종양크기 및 무게를 감소하는데 탁월한 효과를 나타내며, 폐암치료에 시클레소나이드가 효과를 나타내는 것을 의미한다.

실험예 10: 시클레소나이드가 폐암 줄기세포를 억제하는 효과

시클레소나이드가 투머스페어(tumorsphere)의 형성을 억제할 수 있는지 여부를 평가하기 위해, A549 세포로부터 유래된 1차 투머스페어(tumorsphere)에 상이한 농도의 시클레소나이드를 처리하였다. 도 9A에 나타난 바와 같이, 시클레소나이드는 폐암 세포주인 A549 세포로부터 유래된 1차 투머스페어의 형성을 억제하였다. 투머스페어의 수는 ~90%까지 감소하였으며, 투머스페어의 크기도 현저히 감소하였다(도 9A).

또한, 시클레소나이드의 활성화형인 이소부티릴 시클레소나이드(isobutyryl ciclesonide)를 처리한 결과 5μM 와 10μM에서 폐암 줄기세포 억제활성을 나타내는 것을 확인하였다.

그러나, Glucocorticoids에 속하는 프레드니솔 및 덱사메타손은 80μM에서도 폐암 줄기세포 억제 활성을 나타내지 않았다(도 9C).

따라서 시클레소나이드와 활성화형인 이소부티릴 시클레소나이드(isobutyryl ciclesonide)는 기존 스테로이드보다 효과적으로 폐암 유래 암줄기 세포를 억제하는 것을 알 수 있었으며, 모든 Glucocorticoids가 폐암줄기세포의 성장을 억제하지 않는 것을 확인하였다.

실험예 11: 시클레소나이드가 ALDH 양성 폐암 세포의 비율을 감소시키는 효과

다음으로, 폐암세포에 ALDH 저해제인 DEAB와 시클레소나이드를 처리하여 폐암 줄기세포 마커인 ALDH를 분석하였다.

A549 세포에 24 시간 동안 시클레소나이드를 처리하였으며, ALDH 양성 폐암 세포의 비율에 시클레소나이드 저해제의 효과를 조사하기 위해 ALDEFLUOR 분석을 실시하였다. 그 결과, 시클레소나이드가 ALDH 양성 폐암 세포의 비율을 감소시킨 것을 확인하였다(도 10).

실험예 12: 시클레소나이드의 암줄기세포 ( CSCs ) 마커의 발현과 투머스페어의 증식 억제 효과

시클레소나이드가 암줄기세포 마커인 자가 재생 유전자의 발현을 억제하는지를 확인하기 위하여, 자가 재생 유전자 발현을 실시간 PCR (RT-PCR)에 의해 조사하였다. 그 결과, 시클레소나이드 처리에 의해, 시클레소나이드를 처리하지 않은 군에 비해, nanog, sox2, c-myc, 및 snail의 유전자 발현이 감소하는 것을 확인하였다(도 11A).

다음으로, 시클레소나이드가 투머스페어의 증식을 억제하는지를 확인하기 위하여, 투머스페어에 시클레소나이드를 처리하였으며, 투머스페어의 세포 수를 계수 하였다. 시클레소나이드 처리 후 투머스페어(tumosphere)의 생존 암세포수를 1, 2, 3일간 분석한 결과, 시클레소나이드 처리 군에서는 투머스페어의 성장이 억제되었지만, 비처리 군에서는 투머스페어의 성장이 진행되는 것을 확인하였다(도 11B). 따라서 시클레소나이드는 투머스페어 증식을 크게 감소시키는 것을 알 수 있었다(도 11B).

실험예 13: 시클레소나이드의 투머스페어에서 IL-8 분비 저해효과

분비된 IL-8는 투머스페어 형성에 중요한 역할을 하는 것으로 알려져 있었다(Ginestier C, Liu S, Diebel ME, Korkaya H, Luo M, Brown M, Wicinski J, Cabaud O, Charafe-Jauffret E, Birnbaum D, Guan JL, Dontu G and Wicha MS. CXCR1 blockade selectively targets human breast cancer stem cells in vitro and in xenografts. J Clin Invest. 2010; 120(2):485-497).

이에, 분비되는 IL-8의 생산량을 확인하기 위해, flow cytometer를 사용하여, 염증성 사이토카인 프로파일링 분석을 시행하였다. 염증성 사이토카인은 BD cytometric bead array (CBA) human inflammatory cytokines kit를 이용하여 측정하였다. CBA 분석은 IL-6, IL-8, IL-10, IL-12, IL-1β, 및 TNF 항체를 사용하여 수행하였다. 그 결과, 도 12의 염증성 사이토카인 프로파일링 데이터에 제시된 바와 같이, 시클레소나이드 처리에 의해, 염증성 사이토카인인 IL-8의 생산 수준은 감소하였다. 도 12의 아래 그림은 IL-8 생산량을 그래프로 나타낸 것이다. 따라서, 시클레소나이드가 암 줄기세포 유지에 필수적인 IL- 8 분비를 억제함으로써 폐암 줄기세포를 억제하는 것을 알 수 있었다.

상기 실험예들을 통해, 본 발명의 시클레소나이드는 유방암과 폐암의 증식을 억제할 뿐만 아니라, 유방암과 폐암의 줄기세포의 성장을 억제하는 것을 확인하여, 유방암과 폐암 그리고 이들의 줄기세포의 성장 억제 용도로 사용이 가능하다는 것을 알 수 있었다.

이상의 설명으로부터, 본 발명이 속하는 기술분야의 당업자는 본 발명이 그 기술적 사상이나 필수적 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 실시될 수 있다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 이와 관련하여, 이상에서 기술한 실시 예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적인 것이 아닌 것으로서 이해해야만 한다. 본 발명의 범위는 상기 상세한 설명보다는 후술하는 특허 청구범위의 의미 및 범위 그리고 그 등가 개념으로부터 도출되는 모든 변경 또는 변형된 형태가 본 발명의 범위에 포함되는 것으로 해석되어야 한다.

<110> Jeju National University Industry-Academic Cooperation Foundation <120> Composition for inhibiting a growth of breast cancer stem cells comprising ciclesonide <130> DP20190277 <150> KR 10-2016-0133358 <151> 2016-10-14 <160> 16 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CD44 forward primer <400> 1 agaaggtgtg ggcagaagaa 20 <210> 2 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CD44 reverse primer <400> 2 aaatgcacca tttcctgaga 20 <210> 3 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> NANOG forward primer <400> 3 atgcctcaca cggagactgt 20 <210> 4 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> NANOG reverse primer <400> 4 aagtgggttg tttgcctttg 20 <210> 5 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> OCT4 forward primer <400> 5 agcaaaaccc ggaggagt 18 <210> 6 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> OCT4 reverse primer <400> 6 ccacatcggc ctgtgtatat c 21 <210> 7 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> SOX2 forward primer <400> 7 ttgctgcctc tttaagacta gga 23 <210> 8 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> SOX2 reverse primer <400> 8 ctggggctca aacttctctc 20 <210> 9 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Cmyc forward primer <400> 9 aatgaaaagg cccccaaggt agttatcc 28 <210> 10 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Cmyc reverse primer <400> 10 gtcgtttccg caacaagtcc 20 <210> 11 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> beta actin forward primer <400> 11 tgttaccaac tgggacgaca 20 <210> 12 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> beta actin reverse primer <400> 12 ggggtgttga aggtctcaaa 20 <210> 13 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> biotin upper strand of Stat3 probe <400> 13 cttcatttcc cggaaatccc ta 22 <210> 14 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> biotin lower strand of Stat3 probe <400> 14 tagggatttc cgggaaatga ag 22 <210> 15 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Snail forward primer <400> 15 accactatgc cgcgctctt 19 <210> 16 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Snail reverse primer <400> 16 ggtcgtaggg ctgctggaa 19

Claims (8)

1. 하기 화학식 1로 표시되는 화합물 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 유효성분으로 포함하는, 유방암 줄기세포 성장 억제용 약학적 조성물.
   [화학식 1]
   

   
2. 제1항에 있어서, 상기 화합물은 시클레소나이드인 것인, 조성물.
3. 제1항에 있어서, 상기 화합물은 (i) 유방암 유래의 맘모스페어(mammosphere)의 형성을 억제하거나, 또는 (ii) 유방암 유래의 맘모스페어의 증식을 억제하는 것인, 조성물.
4. 제1항에 있어서, 상기 유방암 줄기세포는 Nanog, C-myc, Oct4, Sox2 및 CD44로 선택되는 하나 이상의 자가 재생(self-renewal) 유전자를 발현하는 것인, 조성물.
5. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항의 조성물을 포함하는, 유방암의 치료 또는 예방용 약학적 조성물.
6. 제5항에 있어서, 상기 조성물은 CD44^high/CD24^low를 발현하는 유방암 세포의 성장을 억제하는 것인, 약학적 조성물.
7. 제5항에 있어서, 상기 조성물은 알데히드 탈수소효소(ALDH) 양성의 유방암 세포의 성장을 억제하는 것인, 약학적 조성물.
8. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항의 조성물을 포함하는, 유방암 전이 억제용 약학적 조성물.

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