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KR102025005B1 - 전암성 병변에서 조기 간암을 진단 및 예측할 수 있는 바이오 마커 및 이의용도 - Google Patents

전암성 병변에서 조기 간암을 진단 및 예측할 수 있는 바이오 마커 및 이의용도 Download PDF

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KR102025005B1
KR102025005B1 KR1020180009550A KR20180009550A KR102025005B1 KR 102025005 B1 KR102025005 B1 KR 102025005B1 KR 1020180009550 A KR1020180009550 A KR 1020180009550A KR 20180009550 A KR20180009550 A KR 20180009550A KR 102025005 B1 KR102025005 B1 KR 102025005B1
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Abstract

본 발명은 전암성 병변에서 조기 간암을 진단 및 예측할 수 있는 바이오마커로서 BANF1, PLOD3 및 SF3B4의 용도에 관한 것이다. 구체적으로 본 발명은 BANF1, PLOD3 및 SF3B4로 이루어진 군 중에서 선택되는 하나 이상 이상의 조기 간암 진단용 마커 및 상기 마커의 검출제제를 포함하는 조기 간암 진단용 조성물 및 진단 키트에 관한 것이다. 또한 본 발명은 환자의 시료로부터 BANF1, PLOD3 및 SF3B4로 이루어진 군 중에서 선택되는 하나 이상 이상의 조기 간암 진단마커를 검출하는 방법, 상기 마커를 이용한 조기 간암 진단을 위한 정보 제공방법에 관한 것이다.

Description

전암성 병변에서 조기 간암을 진단 및 예측할 수 있는 바이오 마커 및 이의용도{Biomarker for early diagnosis of hepatocellular carcinoma in precancerous lesion and use thereof}
전암성 병변에서 조기 간암을 진단 및 예측할 수 있는 바이오마커로서 BANF1, PLOD3 및 SF3B4의 용도에 관한 것이다.
암은 인류의 건강을 위협하는 대표적인 질병으로서 산업화된 국가에서 단일 질병으로는 가장 대표적인 사망 원인이다. 암의 발생원인은 아직도 규명되지 않고 있으나 내적 요인인 유전적 요소와 외적 요인인 암 발생 유발요소로 작용되는 발암화학물질, 계속적인 염증과 손상, 암 유발 바이러스 감염의 복합적 요소가 작용하는 것으로 간주된다.
그러나 암은 불치의 병으로 단정할 만큼 절망적인 것은 아니며 조기진단과 함께 적극적인 치료에 임하면 완치될 수 있다. 따라서 조기발견과 조기진단과 치료가 암치료의 효과를 높이는 데 결정적으로 중요하며, 진행된 암에서도 다각적이고 적극적인 방법들을 동원한다면 완치 내지 생명을 연장시키고 괴로운 증세를 호전시킬 수 있다.
암 중에서도 간암은 세계적으로 가장 치명적인 암의 하나로 알려져 있으며, 특히 아시아와 사하라 이남 아프리카에서 해마다 약 오십만 명 이상이 간암으로 사망하고 있는 것으로 보고되고 있다. 간암은 크게 간세포 자체로부터 발생한 원발성 간암 (간세포암; hepatocellular carcinoma)과 다른 조직의 암이 간으로 전이되어 온 전이성 간암으로 구분할 수 있는데, 간암의 약 90% 이상은 원발성 간암이다. 이러한 간암의 발병 원인 중 대다수는 B형 간염 바이러스 또는 C형 간염 바이러스에 의한 급성 또는 만성적인 감염이라는 것이 보고되고 있지만, 간암의 발병 및 진행에 관한 세포 내의 분자적 메커니즘은 아직도 명확히 규명되지 못한 상태이다. 종래의 연구에 따르면 각종 성장인자 유전자와 같은 전-종양형성유전자 (protooncogene)가 다양한 원인에 의하여 종양형성유전자(oncogene)로 돌연변이되어 과발현하거나 과활성을 갖는 경우, 또는 Rb 단백질이나 p53 단백질과 같은 종양형성 억제 유전자 (tumor suppressor gene) 가 다양한 원인에 의하여 돌연변이 되어 저발현하거나 기능을 잃는 경우 간암을 비롯한 다양한 암의 발병과 진행을 유발하는 것으로 보고되어 있다. 최근에는 간암을 비롯한 대부분의 암의 발병 및 진행은 특정 몇몇 유전자들에 의하여 이루어지는 것이 아니라 세포주기, 신호전달 등과 관련된 다양한 각종 유전자들의 복합적인 상호작용에 발병하는 것으로 인식되고 있으며, 따라서 개별적인 유전자나 단백질의 발현이나 기능에만 중점을 두는 것에서 벗어나 다양한 유전자나 단백질에 대한 총체적인 연구의 필요성이 대두되고 있다.
한편, 정상인에서 간암을 조기에 정확하게 발견해 낼 수 있는 바이오마커 검사는 아직까지 개발되지 못했으며, 고위험군에서 비침습적인 조기 간암 진단을 위하여 사용하고 있는 검사 방법이 혈청 알파태아단백 검사이다. AFP는 개발 당시 민감도와 특이도를 모두 양호한 수준으로 달성할 수 있는 기준값으로 20 ng/mL로 제시되었으나, 이 경우 민감도가 60%에 지나지 않으며 현재 국제 학회의 간암 진단 가이드라인에 따라 200 ng/mL를 기준으로 간암을 진단할 경우 특이도는 상승하지만 민감도가 22%에 불과하다. 기존의 연구 결과, AFP는 전체적으로 약 66%의 민감도와 82%의 특이도를 갖는 것으로 알려져 있어 모든 간암 환자를 진단하는 데에 제한이 있다.
그 외 진단 기준으로 확립되어 있지는 않으나 간암 진단에 도움이 되는 혈청 마커로는 Descarboxyprothrombin (DCP), Prothrombin Induced by Vitamin K Absence II (PIVKA-II), 글리코실화 AFP 대 총 AFP (L3 fraction) 분포, alpha fucosidase, glypican 3, HSP-70 등이 있다. 그러나 각각은 예후 인자로서 의미를 가지는 것이 대부분이고, 단독으로 사용하였을 때 정확도가 낮아 아직 선별 검사로 사용되지 못하고 있으며, 간암을 조기 진단하는 것은 이미 한계에 다다른 것으로 판단된다. 아울러 실제 수술이나 고주파 열치료술과 같은 근치적 치료가 가능한 단계에서 진단되는 환자들은 전체 간암 환자의 30% 정도에 국한된다.
따라서, 간암의 근본적인 치료가 가능한 단계에서 최대한 조기진단 할 수 있는 특이성과 민감도가 향상된 새로운 진단 마커의 개발이 시급하다.
대한민국 공개특허 제10-2016-0072027호
이에 본 발명자들은 전암성 병변 부위에서 BANF1, PLOD3 또는 SF3B4의 발현수준을 측정함으로써 간암을 조기에 정확하게 진단할 수 있음을 최초로 확인함으로써 본 발명을 완성하였다.
따라서 본 발명의 목적은 BANF1, PLOD3 및 SF3B4로 이루어진 군 중에서 선택되는 하나 이상 이상을 포함하는, 조기 간암 진단용 마커 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 BANF1, PLOD3 및 SF3B4로 이루어진 군 중에서 선택되는 하나 이상 이상의 조기 간암 진단용 마커 단백질 또는 이를 암호화하는 유전자의 mRNA 발현수준을 측정하는 제제를 포함하는, 조기 간암 진단용 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 본 발명의 조성물을 포함하는, 조기 간암 진단 키트를 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 간암 진단에 필요한 정보를 제공하기 위하여 환자의 시료로부터 BANF1, PLOD3 및 SF3B4로 이루어진 군 중에서 선택되는 하나 이상의 조기 간암 진단마커를 검출하는 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 환자로부터 분리된 생물학적 시료로부터 BANF1, PLOD3 및 SF3B4로 이루어진 군 중에서 선택되는 하나 이상의 유전자에 대한 mRNA 또는 단백질의 발현수준을 측정하는 단계; 및 상기 측정된 BANF1, PLOD3 또는 SF3B4의 발현수준을 대조군 시료의 해당 유전자의 발현수준과 비교하는 단계를 포함하는, 조기 간암 진단을 위한 정보 제공방법을 제공하는 것이다.
상기와 같은 목적을 달성하기 위해 본 발명은, BANF1(barrier to autointegration factor 1), PLOD3(procollagen-lysine, 2-oxoglutarate 5-dioxygenase 3) 및 SF3B4(splicing factor 3b subunit 4)로 이루어진 군 중에서 선택되는 하나 이상을 포함하는, 조기 간암 진단용 마커 조성물을 제공한다.
본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 BANF1는 서열번호 1의 염기서열 또는 서열번호 2의 아미노산 서열로 이루어진 것이고, 상기 PLOD3은 서열번호 3의 염기서열 또는 서열번호 4의 아미노산 서열로 이루어진 것이고, 상기 SF3B4는 서열번호 5의 염기서열 또는 서열번호 6의 아미노산 서열로 이루어진 것일 수 있다.
또한 본 발명은 BANF1, PLOD3 및 SF3B4로 이루어진 군 중에서 선택되는 하나 이상의 조기 간암 진단용 마커 단백질 또는 이를 암호화하는 유전자의 mRNA 발현수준을 측정하는 제제를 포함하는, 조기 간암 진단용 조성물을 제공한다.
본 발명의 일실시예에 있어서, BANF1 유전자는 서열번호 1의 염기서열로 이루어진 것이고 BANF1 단백질은 서열번호 2의 아미노산 서열로 이루어진 것이며, PLOD3 유전자는 서열번호 3의 염기서열로 이루어진 것이고 PLOD3 단백질은 서열번호 4의 아미노산 서열로 이루어진 것이며, SF3B4 유전자는 서열번호 5의 염기서열로 이루어진 것이고 SF3B4 단백질은 서열번호 6의 아미노산 서열로 이루어진 것일 수 있다.
본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 제제는 BANF1, PLOD3 또는 SF3B4에 특이적인 프라이머, 프로브, 앱타머, 항체 또는 기질일 수 있다.
본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 측정은 전암성 병변 시료에서 측정하는 것일 수 있다.
본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 측정은 역전사 중합효소연쇄반응, 경쟁적 중합효소 연쇄반응, 실시간 중합효소 연쇄반응, Nuclease 보호 분석(RNase, S1 nuclease assay), in situ 교잡법, DNA 마이크로어레이 이용법, 노던 블랏, 웨스턴 블랏, ELISA(Enzyme Linked Immuno Sorbent Assay), 방사선 면역분석법, 면역 확산법, 면역 전기영동, 조직 면역염색, 면역침전 분석법, 보체 고정 분석법, FACS, 질량분석법(Mass spectrometry) 및 단백질 마이크로어레이 이용법 중에서 선택되는 방법으로 수행하는 것일 수 있다.
또한 본 발명은 상기 본 발명의 조성물을 포함하는, 조기 간암 진단 키트를 제공한다.
또한 본 발명은 간암 진단에 필요한 정보를 제공하기 위하여 환자의 시료로부터 BANF1, PLOD3 및 SF3B4로 이루어진 군 중에서 선택되는 하나 이상의 조기 간암 진단마커를 검출하는 방법을 제공한다.
본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 검출은 전암성 병변 시료에서 BANF1, PLOD3 및 SF3B4로 이루어진 군 중에서 선택되는 하나 이상의 마커 단백질 또는 이를 암호화하는 유전자의 mRNA 발현수준을 측정하는 것일 수 있다.
또한 본 발명은 환자로부터 분리된 생물학적 시료로부터 BANF1, PLOD3 및 SF3B4로 이루어진 군 중에서 선택되는 하나 이상의 유전자에 대한 mRNA 또는 단백질의 발현수준을 측정하는 단계; 및 상기 측정된 BANF1, PLOD3 또는 SF3B4의 발현수준을 대조군 시료의 해당 유전자의 발현수준과 비교하는 단계를 포함하는, 조기 간암 진단을 위한 정보 제공방법을 제공한다.
본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 시료는 전암성 병변 조직일 수 있다.
본 발명의 일실시예에 있어서, BANF1, PLOD3 및 SF3B4로 이루어진 군 중에서 선택되는 하나 이상의 유전자 또는 단백질의 발현수준이 대조군 시료의 발현수준 보다 증가한 경우, 간암이 발병된 것으로 판단할 수 있다.
본 발명은 전암성 병변에서 조기 간암을 진단 및 예측할 수 있는 바이오마커로서 BANF1, PLOD3 및 SF3B4의 용도에 관한 것으로, 간암으로 발전하기 이전 단계인 전암성 병변에서 이들 마커의 발현 수준을 측정함으로써 간암을 조기에 진단할 수 있어 간암을 조기 발견하고, 예방하며 치료율을 향상시킬 수 있는 효과가 있으며, 또한 이들 마커의 발현 또는 활성 억제제들은 간암의 성장과 증식, 이동과 전이를 억제할 수 있어 간암의 새로운 치료제로서 사용 가능하다.
도 1은 간세포암에서 본 발명의 신규 간암 진단 마커를 동정하는 순서를 나타낸 모식도이다.
도 2는 초기 단계의 간세포암을 진단할 수 있는 마커 동정 결과에 관한 것으로, 2a는 다양한 단계별 간세포암 및 전암성 병변 부위(premalignant lesion)에서 의미있는 발현차이를 보이는 3,628개의 유전자의 히트맵(상단; Welch’s t-test p<0.05이고 정상 시료와 1.5배 발현 차이를 보이는 것을 선정) 및 각 질환의 평균값에 대한 히트맵 및 계통도를 나타낸 것이다(하단). 2b는 LGDN, HGDN, eHCC 및 G1에서 유의하게 발현이상을 나타내는(one way ANOVA p<0.005) 1,730개 유전자의 히트맵을 나타낸 것이고(상단), LGDN, HGDN, eHCC 및 G1의 평균값에 대한 계층분석 결과를 나타낸 것이다(하단). 2c는 특정 그룹 간 발현 차이를 나타내는 유전자를 벤다이어그램 결과로 나타낸 것이고(왼쪽), 모든 그룹에서 차등적 발현을 보이는 690개의 유전자에 대한 히트맵을 나타낸 것이며(중간), 초기 단계의 간세포암에서 점진적으로 상향 조절된 85개 유전자의 동정에 대한 전략적 모델을 나타낸 것이다(오른쪽). 2d는 13개 유전자에 대한 ROC 곡선 분석을 나타낸 것으로, 표준선과 비교하여 AUC의 통계적 유의미한 차이를 나타낸 것이다. 2e는 HCC TMA에서 10개의 후보 유전자 마커에 대한 면역화학적 분석 결과를 사진(상단) 및 발현율(하단)로 나타낸 것이다.
도 3은 신규한 암 결정(진단) 마커의 발현 프로파일을 나타낸 것으로, 3a는 TCGA_LIHC 데이터셋 유래의 HCC 환자의 비종양 조직 및 종양 조직에 대한 10개 마커 유전자의 발현 정도를 분석한 것을 나타낸 것이며, 3b는 코호트 1 유래의 단계별 HCC 환자 조직에서 10개 마커 유전자의 발현정도를 분석한 것을 나타낸 것이다.
도 4는 전암성 병변부위에서 초기 단계의 HCC 진단 마커로서 BANF1, PLOD3 및 SF3B4의 가능성에 대한 분석 결과를 나타낸 것으로, 4a는 초기 단계 HCC의 전체 섹션에서 10개 후보 마커들에 대한 면역조직화학염색 결과의 이미지를 나타낸 것이고, 4b는 기존 마커(CM) 및 본 발명의 신규마커(NM) 각각에 대한 양성 발현정도를 막대그래프로 나타낸 것이며(왼쪽), 면역조직화학염색 결과의 이미지를 나타낸 것이다(오른쪽). 4c는 기존 마커(CM) 및 본 발명의 신규마커(NM) 각각에 대한 양성 발현정도를 나타낸 것이며(왼쪽), 기존마커 음성발현의 HCC에서 본 발명의 신규 마커의 양성 발현율 또는 본 발명의 신규마커 음성발현의 HCC에서 기존마커의 양성 발현율을 막대 그래프로 나타낸 것이고(중간), 모든 종래 마커의 음성 발현 결과를 면역조직화학염색 결과 이미로 나타낸 것이다(오른쪽). 4d는 CM-양성 RN 조직에서의 NM 음성 발현율과 NM-양성 RN 조직에서의 CM 음성 발현율을 그래프로 나타낸 것이다. 4e는 각 마커별 ROC 곡선을 나타낸 것이고, 4f는 간세포암 환자에서 3개의 본 발명의 신규 마커에 대한 단백질 발현율에 대한 Kaplan-Meier 생존 곡선 분석 결과를 나타낸 것이다.
도 5는 신규한 10개 후보 유전자 마커에 대한 ROC 분석 결과를 나타낸 것으로, 코호트 2 HCC 환자군에서의 3개의 기존 마커 및 3개의 신규 마커에 대한 ROC 분석 결과를 나타낸 것이다.
도 6은 HCC에서 BANF1, PLOD3 및 SF3B4의 비정상적인 발현양상 및 in vitro에서 이들의 비활성화에 의한 간세포암의 성장 억제 효과를 확인한 것으로, 6a는 TCGA_LIHC HCC 50쌍에서 BANF1, PLOD3 및 SF3B4의 발현수준을 나타낸 것이고(각 왼쪽 도면), 무작위적으로 선별된 13쌍의 HCC 조직에서의 발현 수준을 나타낸 것이다(각 오른쪽 도면). 6b는 6쌍의 조기 간세포암(상단) 및 DL을 갖는 3쌍의 조기 간세포암(하단)에서 BANF1, PLOD3 및 SF3B4 발현수준을 웨스턴 블럿 결과로 나타낸 것이다. 6c는 간세포암이 유발된 마우스(상단) 및 쥐(하단)에서 BANF1, PLOD3 및 SF3B4의 발현정도를 확인한 결과이다. 6d는 H-ras로 형질전환된 마우스(상단) 및 DEN으로 유도된 간세포암 쥐 모델(하단)에서의 BANF1, PLOD3 및 SF3B4 발현수준을 웨스턴 블럿으로 확인한 결과이다. 6e는 대조군 si-RNA(si-Cont) 및 각 유전자에 대한 siRNA(si-BANF1, si-PLOD3 및 si-SF3B4)로 형질감염된 SNU-449 세포의 세포생존율(왼쪽) 및 세포 성장률(오른쪽)을 MTT 분석 및 BruD 분석으로 각각 측정한 결과를 나타낸 것이다. 6f는 형질감염된 SNU-449 세포의 집락형성 정도를 분석한 결과를 나타낸 것이다.
도 7은 BANF1, PLOD3 및 SF3B4을 타겟팅하여 간세포암 세포주의 종양발생 억제 및 전이 억제를 분석한 결과를 나타낸 것으로, 7a는 대조군 si-RNA(si-Cont) 및 각 유전자에 대한 siRNA(si-BANF1, si-PLOD3 및 si-SF3B4)로 형질감염된 SNU-449 세포주에 대한 이동 및 침윤정도를 세포 이동(왼쪽) 및 이동 세포수(오른쪽)로 측정한 결과를 나타낸 것이고, 7b는 7a와 동일한 실험군에 대한 상처 치유 분석 결과를 세포 이미지로 나타낸 것이고(왼쪽), 이동율로 나타낸 것이다(오른쪽). 7c는 대조군 si-RNA(si-Cont) 및 각 유전자에 대한 siRNA(si-BANF1, si-PLOD3 및 si-SF3B4)로 형질감염된 SNU-449 세포주에서의 EMT 조절 단백질을 웨스턴 블럿으로 확인한 것이며, 7d는 대조군 si-RNA 및 si-BANF1, si-PLOD3 또는 si-SF3B4로 형질 감염된 SNU-449 세포주가 이식된 마우스 모델의 마우스 사진 및 종양 크기를 측정한 결과를 나타낸 것이다. 7e는 H-ras로 형질전환된 마우스에 대한 MSNs의 투여시점을 모식도로 나타낸 것이고(상단), MSNs 단독 및 MSNs_ siRNA를 H-ras로 형질전환된 마우스에 투여 후, 시간별 형성된 종양수를 측정한 결과를 나타낸 것이다(하단). 7f는 H-ras로 형질전환된 마우스의 간 조직에서의 BANF1, PLOD3 및 SF3B4 발현수준을 웨스턴 블럿 결과로 나타낸 것이다.
도 8은 siRNA를 함유한 메조기공 실리카 나노입자(MSN)를 이용한 결과를 나타낸 것으로, 8a는 각 유전자에 대한 siRNA로 형질감염 후, Hepa-1c1c7 마우스 간암 세포에서 BANF1, PLOD3 및 SF3B4 발현수준을 웨스턴 블럿으로 확인한 것이고, 8b는 메조기공 실리카 나노입자(MSN)와 각 유전자의 siRNA로 형질감염된 Hepa-1c1c7 마우스 간암 세포에서의 BANF1, PLOD3 및 SF3B4 발현수준을 나타낸 것이며, 8c는 메조기공 실리카 나노입자(MSN)와 각 유전자의 siRNA로 형질감염된 Hep3B 세포에서의 BANF1, PLOD3 및 SF3B4 발현수준을 나타낸 것이다.
도 9는 SF3B4의 간암 마커로서의 가능성에 대한 임상학적 타당성을 분석한 결과로서, 9a는 TCGA_LIHC 데이터 셋에서의 BANF1, PLOD3 및 SF3B4 mRNA 발현수준을 나타낸 것이고, 9b는 HCC 환자 전체(왼쪽) 및 무병생존 환자(오른쪽)에서 신규 3개의 마커의 mRNA 발현을 갖는 Kaplan-Meier 생존 곡선을 나타낸 것이다. 9c는 HCC 환자 전체에서 BANF1, PLOD3 및 SF3B4 mRNA 발현에 대한 Kaplan-Meier 생존 곡선을 나타낸 것이다. 9d는 HCC 환자 전체(왼쪽) 및 무병생존 환자(오른쪽)에서 SF3B4의 카피수 증폭과 mRNA의 상향조절의 조합에 대한 Kaplan-Meier 생존 곡선을 나타낸 것이고, 9e는 TCGA_LIHC 데이터 셋에서 SF3B4의 유전자 카피수 변이빈도를 나타낸 것이며(왼쪽), 카피수 변이값과 mRNA 발현값의 상관관계를 나타낸 것이다(오른쪽). 9f는 20쌍의 HCC 환자조직에 대한 SF3B4 의 유전자 카피수(왼쪽) 및 mRNA 발현 수준(오른쪽)을 qRT-PCR로 분석한 결과를 나타낸 것이다.
도 10은 SF3B4의 파괴에 따른 간암 세포의 세포 주기 억제 및 EMT 진행 억제를 나타낸 것으로, 10a는 TCGA_LIHC 데이터 셋에서 366명의 HCC 환자에서의 SF3b 복합체 서브유닛의 유전적 변이를 나타낸 것이고, 10b는 지정된 HCC GEO 데이터베이스에서 종양과 비종양에 대한 SF3b 복합체 서브유닛의 상대적인 발현수준을 비교한 것을 나타낸 것이고, 10c는 2개의 정상 간세포주 및 8개의 HCC 세포주에서의 SF3B4 mRNA 발현을 qRT-PCR(상단) 및 웨스턴 블럿(하단)으로 분석한 결과를 나타낸 것이다. 10d는 342 개의 SF3B4 상관 유전자에 대한 자율적인 계층 클러스터링 분석에 대한 히트맵을 나타낸 것이고(왼쪽), GSE16757 데이터셋의 SF3B4 고클러스터 환자군 및 SF3B4 저클러스터 환자군의 Kaplan-Meier 생존 곡선을 나타낸 것이다. 10e는 SF3B4와 관련된 GSEA의 유전자 셋트를 나타낸 것이며, 총 11개 유전자 리스트들이 MSigDB에 의해 확인되었고(상단). 성장-관련 유전자 세트(KEGG_CELL_CYCLE)가 SF3B4과 관련된 특징으로 나타났고, 바코드는 유전자의 위치를 나타낸다(하단). 도 10f는 si-SF3B4 로 형질감염 후 2개의 HCC 세포주에 대한 FACS 분석 결과를 나타낸 것으로, 왼쪽은 히스토그램을 나타낸 것이고 오른쪽은 각 세포주기 단계의 퍼센트를 나타낸 것이다(p < 0.05, p < 0.01, p < 0.001; t test).
도 11은 HCC 세포주에서 SF3B4의 넉다운이 미치는 영향을 분석한 것으로, 11a는 SNU-449 및 SNU-368 세포주에 대해 si-RNA Cont(대조군) 및 si-RNA SF3B4로 각각 형질감염시킨 후, 세포생존율(왼쪽)과 세포증식율(오른쪽)을 분석한 결과를 나타낸 것이고, 11b는 세포집락 형성 정도를 분석한 결과를 나타낸 것이며, 11c는 트랜스웰 이동 및 침윤 분석을 통해 간암 세포의 이동 및 침윤 정도를 이미지화하고(왼쪽) 이동 세포수를(오른쪽) 분석한 것을 나타낸 것이다. 11d는 SF3B4을 넉다운 시킨 후, 0 및 24시간에서의 상처치유 효과를 분석한 결과를 나타낸 것이고, 11e는 EMT 조절 단백질들의 발현정도를 웨스턴 블럿으로 확인한 것을 나타낸 것이며, 11f는 SF3B4을 넉다운 시키고 48시간째에 FASC를 이용하여 PI 염색된 세포에 대한 히스토그램 결과를 나타낸 것이다.
도 12는 간암 발생과정에서 SF3B4의 조절자들을 분석한 것을 나타낸 것으로, 12a는 SF3B4에 대한 siRNA 및 SSA로 각각 처리된 HeLa 세포 및 간세포암 세포주에서 각 단백질의 발현정도를 웨스턴 블럿으로 분석한 것으로 나타낸 것이고(상단), 해당 유전자들의 mRNA 수준을 qRT-PCR로 분석한 결과를 나타낸 것이다. 12b는 12a의 각 실험군에 대한 세포주기 조절자들의 발현 정도를 웨스턴 블럿으로 확인한 것이며, 12c는 GSE80861 RNA-seq 데이터 세트를 이용한 유전자 발현 분석 및 선택적인 스플라이싱 이벤트 분석의 파이프 라인을 나타낸 것이고(왼쪽), 원형 차트는 다르게 차등적 발현을 보이는 유전자(DEG, 오른쪽 상단) 및 선택적 스플라이싱 이벤트(AS) 유형의 분포를 나타낸 것이다. 12d는 TCGA_LIHC 데이터셋에서 GRIP1, PLP1, KLF4 및 KRT80의 상대적인 발현 정도를 나타낸 것이고, 12e는 SF3B4 siRNA로 형질감염된 세포에서 KLF4의 발현정도를 qRT-PCR로 분석한 결과를 나타낸 것이며, 12f는 Sashimi 플롯은 KLF4의 선택적 스플라이싱 (alternative splicing)을 나타낸 것이고, 스킵된 엑손(SE)을 나타낸 것이다(p < 0.05, p < 0.01, p < 0.001; t test).
도 13은 간암 세포주에서 SF3B4의 종양억제자인 KLF4 조절능을 분석한 것으로, 13a는 SF3B4 siRNA(왼쪽) 또는 SSA가 처리된(오른쪽) SNU-449 및 SNU-368 세포주들의 세포생존율을 MTT 분석 결과로 나타낸 것이고, 13b는 GSE80861 데이터셋에서 8개의 유전자에 대한 상대적인 발현 변화 및 선택적 스플라이싱(대조군 대비 SF3B4이 넉다운된 세포주 비교)을 나타낸 것이다. 13c는 SF3B4 siRNA로 형질감염된 SNU-449 및 SNU-368 세포주에서 GRIP1, PLP1, KLF4의 발현정도를 분석한 것으로 나타낸 것이고, 13d 및 13e는 TCGA_LIHC 데이터셋(13d) 및 GSE77314 데이터셋(13e) 유래의 50쌍의 HCC 환자군에서 SF3B4와 8개 유전자들 사이의 발현 상관관계를 분석한 것을 나타낸 것이다.
도 14는 SF3B4의 기능을 규명한 것으로, 14a는 SF3B4 넉다운 또는 KLF4 과발현된 HCC 세포주에서 p27 Kip1 및 Slug 의 발현수준을 나타낸 것이고, 14b는 SF3B4 넉다운 또는 KLF4 과발현된 SNU-449 세포에서 p27 Kip1 또는 Slug 프로모터 서열을 함유한 리포터 플라스미드의 루시퍼라제 활성도를 측정한 것이며, 14c는 SF3B4 넉다운된 세포에서 KLF4 mRNA 및 2개의 KLF4 mRNA isoform에 대한 RT-PCR 산물 이미지를 나타낸 것이고(왼쪽), HCC 세포주에서 확인된 2개의 KLF4 mRNA isoform과 각 다이아그램 하단에는 스플라이싱 사이트를 표기한 것이며(중간), 붉은색 라인은 splicing junction을 나타낸 것이다(오른쪽). 14d는 SF3B4 넉다운된 SNU-449 세포가 이식된 누드 마우스 모델에서 종양의 성장 정도를 종양성장 곡선(왼쪽)과 형광이미지(오른쪽)로 나타낸 것이고, 14e는 14d의 마우스 동물모델로부터 수득한 암 조직에서 SF3B4 및 KLF4의 발현수준을 분석한 결과를 나타낸 것이며, 14f는 HCC에서 야생형 KLF4 발현 억제를 통한 SF3B4의 발암 작용 가설 모델을 나타낸 것이다.
본 발명은 간암을 조기에 검출 및 진단할 수 있는 새로운 바이오 마커로서 BANF1(barrier to autointegration factor 1), PLOD3(procollagen-lysine, 2-oxoglutarate 5-dioxygenase 3) 및 SF3B4(splicing factor 3b subunit 4)를 사용할 수 있음을 규명한 점이 특징이 있다.
간암은 세계적으로 가장 치명적인 암으로 알려져 있으며, 발병되면 예후가 좋지 않아 사망률이 높은 암이다. 따라서 간암을 조기에 발견할 수 있다면 간암을 조기에 예방하고 적절한 치료방법을 적용하여 치료효과를 높일 수 있을 것이다.
그러나 대부분의 간암 판정은 암의 진행이 많이 진행된 상태에서 판단되고 있어 조기에 간암의 발병 여부를 판단할 수 있는 마커의 개발이 필요한 실정이었다.
이에 본 발명자들은 간암을 조기에 진단할 수 있는 바이오마커를 발굴하기 위해 연구하던 중, BANF1, PLOD3 및 SF3B4의 간암 조기 진단 마커로서의 사용 가능성을 확인하였고, 이들을 억제할 경우, 간암을 예방 또는 치료할 수 있음을 확인함으로써 간암 치료를 위한 새로운 타겟으로서 BANF1, PLOD3 및 SF3B4을 발굴하였다.
상기 BANF1(barrier to autointegration factor 1)은 보존된 인간 염색질 단백질로서 핵 어셈블리(nuclear assembly) 및 염색질 탈응축(chromatin decondensation)에 주로 관여하는 것으로 알려져 있고, BANF1는 분자들 간의 통합으로부터 레트로바이러스를 보호할 수 있는 단백질로 처음 규명되었고, 숙주 세포게놈으로 분자간의 통합을 촉진시킨다는 기능이 알려져 있다. 그러나 아직까지 BANF1과 암과의 관련성에 대한 내용은 밝혀진 바 없다.
PLOD3(procollagen-lysine, 2-oxoglutarate 5-dioxygenase 3)은 프로콜라겐 분자간 가교결합 및 섬유의 초분자 콜라겐 구조의 안정화에 중요한 갈락토실- 및 글루코실-트랜스퍼라제의 활성 때문에 하이드록시라이신-결합의 탄수화물을 생성하는 유일한 이소 효소라고 알려져 있다. 또한, PLOD3은 MMP9를 모집하는데 관여하는 것으로 알려져 있을 뿐, 암의 진행 및 암과의 관련성에 대해 알려진 바가 없다. SF3B4(splicing factor 3b subunit 4)는 포유동물 SF3b 복합체의 핵심 단백질을 암호화하며, U2-type 스플라이소솜(spliceosome)의 일부분으로 U2 snRNP를 연결 부위에 묶는 역할에 대해 알려져 있을 뿐, SF3B4 역시 암과의 관련성에 대해서는 알려진 바가 없다.
한편, 본 발명자들은 간암을 조기에 예측하고 진단할 수 있는 신규한 바이오마커를 발굴하기 위해, 전체 전사체학(transcriptome) 발현 마이크로어레이를 이용하여 정상 간조직, 조기 간암조직 및 진행 간암 조직에서의 차별적 발현수준을 보이는 유전자들을 스크리닝한 결과, BANF1, PLODS3 및 SF3B4이 정상 조직에 비해 모두 강하게 과발현되고 있음을 확인하였고, HGDN으로부터 암이 전이된(transitioning) 6개의 조기 간세포암 전체 섹션 모두에서 이들 유전자가 과발현되고 있는 것으로 나타났다.
특히 본 발명에서 발굴한 상기 마커들은 전암성 병변에서 조기 간암 여부를 검출 및 진단할 수 있는 특징이 있다.
간암은 정상간, 만성간염, 간경화, 간암에 이르는 다단계 병변의 발전 양상을 가지며, 최근 방사선학적 검사 기술이 발달하면서 간 내의 작은 결절들이 발견되어지며 큰 결절들은 간암으로 진행할 가능성이 높다. 특히 간암과 구분이 어렵고 간암의 특성을 일부 갖고 있는 이형성 결절(DN; dysplastic nodule)은 간암의 다단계 발생 과정의 일부이며 간암의 전암성 병변의 대표적인 형태로 알려져 있다.
또한 간경변에서 관찰되는 결절성 병변은 재생성 결절, 이형성 결절, 간세포암, 국소성 지방병변이 있으며, 재생성 결절은 1~10mm의 크기이며, 간 전체에 퍼져있고 크기가 균일하다. 주변의 재성성 결절보다 크기가 큰 거대 재생성 결절은 세포의 비정향이 없고 결절 내에 정상적인 문맥을 가지고 있다. 이형성 결절은 크기가 대부분 1~1.5cm이며 피막을 가지지 않는다. 저등급 이형성 결절은 단일 클론의 증식으로 발생한 것으로 세포나 구조상의 이상이 없으나 단독 동맥을 동반할 수 있다. 고등급 이형성 결절은 세포의 이정형과 구족 이상을 보이고 소세포 변화의 핵의 다형성을 나타낸다.
본 발명의 마커들은 전암성 병변(precancerous lesion)에서 조기 간암을 검출할 수 있는데, 상기 전암성 병변은 간암으로 넘어가기 전 단계를 말하며 간암에 준하는 치료를 요구하지 않는 상태로서, 저등급 이형성 결절(LGDN; low-grade DN) 또는 고등급 이형성 결절(HGDN; high-grade DN)을 포함하는 이형성 결절(DN; dysplastic nodule)일 수 있으며, 본 발명의 일실시예에서는 전암성 병변인 HGDN 조직에서 상기 3개의 유전자들이 정상 조직에 비해 과발현되고 있는 것을 확인할 수 있었다.
나아가 본 발명의 마커들이 종래 마커들에 비해 정확도가 더 우수한지 확인하기 위해, 이형성 결절(DN), 간세포 선종 및 국소 결절 증식을 포함하는 다른 종양 병소와 조기 간암의 구별이 가능한 것으로 알려진 GPC3, GS 및 HSP70 마커들과 본 발명의 마커들에 대해, 간세포암 조직에서의 발현양상을 분석하였다.
그 결과, 간세포암 조직에서 종래 마커가 발현되는 양성 발현율은 50.9%인 것으로 나타난 반면, 본 발명의 마커가 발현되는 양성 발현율은 72.7%인 것으로 나타났다. 또한, 간세포암 조직에서 종래 마커의 음성 발현율은 49.1%인 것으로 나타난 반면, 본 발명의 신규 마커의 음성 발현율은 27.3%로 나타났다.
따라서 이러한 결과를 통해 본 발명에서 동정한 BANF1, PLODS3 및 SF3B4 마커가 종래 마커인 GPC3, GS 및 HSP70에 비해 간암을 더 우수한 효율과 정확도로 진단할 수 있음을 알 수 있었다.
뿐만 아니라, 본 발명의 일실시예에서는 간세포암 환자의 Kaplan-Meier 생존 곡선을 분석한 결과, 본 발명의 신규 마커들의 높은 발현을 보인 환자의 무병 생존율은 본 발명의 마커들의 발현 수준이 낮은 환자보다 유의하게 낮은 것으로 나타났으며, 특히 본 발명의 마커를 단독으로 사용한 경우에 비해 조합으로 사용한 경우 정확도가 더 높은 것으로 나타났다.
이를 통해 본 발명의 신규 마커들은 간세포암의 발병을 유도하는 발암 작용이 있음을 알 수 있었고, 이들 마커의 발현수준 측정을 통해 조기 간암을 진단할 수 있으며, 나아가 환자의 생존율 예후도 예측할 수 있음을 알 수 있었다.
그러므로 본 발명은 BANF1(barrier to autointegration factor 1), PLOD3(procollagen-lysine, 2-oxoglutarate 5-dioxygenase 3) 및 SF3B4(splicing factor 3b subunit 4)로 이루어진 군 중에서 선택되는 하나 이상을 포함하는, 조기 간암 진단용 마커 조성물을 제공할 수 있다.
또한 본 발명은 BANF1, PLOD3 및 SF3B4로 이루어진 군 중에서 선택되는 하나 이상의 조기 간암 진단용 마커 단백질 또는 이를 암호화하는 유전자의 mRNA 발현수준을 측정하는 제제를 포함하는, 조기 간암 진단용 조성물을 제공할 수 있다.
본 발명에서, 상기“진단”이라는 용어는 병리 상태를 확인하는 것을 의미하는 것으로서, 본 발명의 목적상 상기 진단은 간암 진단 마커의 발현 유무를 확인하여 간암의 발병 여부를 확인하는 것을 의미하며, 간암 진단 마커의 발현 유무 및 발현 정도를 확인하여 간암의 발병여부, 발전 및 경감 등을 판단하는 것도 포함한다. 특히 본 발명에서는 상기 마커를 이용하여 조기 간암을 진단할 수 있다.
또한 본 발명의 마커는 간암의 예후를 판단하기 위한 용도로서 사용할 수 있는데, 본 발명에서, 상기 "예후"는 암이 진단된 이후에 암의 완치 가능성, 치료 후 재발 가능성, 환자의 생존 가능성 등 암에 따른 환자의 각종 상태를 예측하는 것을 말한다. 암의 예후는 다양한 관점에서 추정될 수 있지만, 대표적으로 재발가능성, 생존가능성, 무병생존가능성의 관점에서 판단될 수 있다. 본 발명의 목적상 예후는 간암의 진단 이후 생존의 예후를 의미할 수 있다. 본 발명에서 제공하는 바이오 마커를 사용하면, 간암 환자의 생존 예후를 보다 용이하게 예측할 수 있어, 고 위험군의 환자를 분류하거나, 추가 필요한 치료 방법의 사용 여부를 결정하는 데 활용할 수 있고, 이로써 간암 발병 후의 생존율을 높이는 데 기여할 수 있다.
또한, 상기 "예측"이란 환자가 치료법에 대해 선호적으로 또는 비선호적으로 반응하여 환자의 치료 후 생존할 여부 및/또는 가능성과 관련된다. 본 발명의 추정 방법은 암 발병 환자에 대한 가장 적절한 치료 방식을 선택함으로써 치료 결정을 하기 위해 임상적으로 사용될 수 있다. 또한, 본 발명의 예측 방법은 환자가 예를 들어 소정 치료제 또는 조합물, 외과적 개입, 화학요법 등의 투여를 비롯한 소정 치료 처방과 같은 치료 처방에 선호적으로 반응하는지를 확인하거나, 치료 처방 후 환자의 장기 생존이 가능한지 여부를 예측하는 데 사용될 수 있다.
또한, 상기 “진단용 마커(diagnosis marker)”란 간암의 세포 또는 조직을 정상 세포 또는 조직과 구분하여 진단할 수 있는 물질을 의미하며, 정상 세포에 비하여 간암의 세포에서 증가 또는 감소를 보이는 폴리펩타이드 또는 핵산(예컨대, mRNA 등), 지질, 당지질, 당단백질, 당(단당류, 이당류, 올리고당류 등) 등과 같은 유기 생체 분자 등을 포함한다. 본 발명에서 제공하는 간암 진단용 마커, 바람직하게 간암 조기 진단용 마커는 정상 세포에 비해 간암의 세포(또는 조직) 또는 간암으로 발전하기 전단계의 세포(또는 조직)에서 발현양이 증가하는 BANF1, PLOD3 또는 SF3B4일 수 있다.
본 발명에서 BANF1 유전자는 서열번호 1의 염기서열로 이루어진 것이고 BANF1 단백질은 서열번호 2의 아미노산 서열로 이루어진 것이며, PLOD3 유전자는 서열번호 3의 염기서열로 이루어진 것이고 PLOD3 단백질은 서열번호 4의 아미노산 서열로 이루어진 것이며, SF3B4 유전자는 서열번호 5의 염기서열로 이루어진 것이고 SF3B4 단백질은 서열번호 6의 아미노산 서열로 이루어진 것일 수 있다.
본 발명에서 상기 마커 유전자의 수준은, 바람직하게 마커 유전자가 발현된 mRNA 수준, 즉, mRNA의 양을 의미하며, 상기 수준을 측정할 수 있는 물질로는 본 발명의 마커인 BANF1, PLOD3 또는 SF3B4 유전자에 특이적인 프라이머, 프로브, 앱타머, 항체 또는 기질을 포함할 수 있다.
본 발명에서 상기“프라이머”란 용어는 적합한 온도 및 적합한 완충액 내에서 적합한 조건(즉, 4종의 다른 뉴클레오시드 트리포스페이트 및 중합반응 효소) 하에서 주형-지시 DNA 합성의 개시점으로 작용할 수 있는 단일-가닥 올리고뉴클레오타이드를 의미한다. 프라이머의 적합한 길이는 다양한 요소, 예컨대, 온도와 프라이머의 용도에 따라 변화가 있을 수 있다. 또한, 프라이머의 서열은 주형의 일부 서열과 완전하게 상보적인 서열을 가질 필요는 없으며, 주형과 혼성화되어 프라이머 고유의 작용을 할 수 있는 범위 내에서의 충분한 상보성을 가지면 충분하다. 따라서 본 발명에서의 프라이머는 주형인 BANF1, PLOD3 또는 SF3B4 유전자의 뉴클레오타이드 서열에 완벽하게 상보적인 서열을 가질 필요는 없으며, 이 유전자 서열에 혼성화되어 프라이머 작용을 할 수 있는 범위 내에서 충분한 상보성을 가지면 충분하다.
상기 “증폭 반응”은 핵산 분자를 증폭하는 반응을 말하며, 이러한 유전자의 증폭 반응들에 대해서는 당업계에 잘 알려져 있고, 예컨대, 중합효소 연쇄반응(PCR), 역전사 중합효소 연쇄반응(RT-PCR), 리가아제 연쇄반응(LCR), 전자 중재 증폭(TMA), 핵산 염기서열 기판 증폭(NASBA) 등이 포함될 수 있다.
본 발명에서, 상기“프로브”라는 용어는 자연의 또는 변형된 모노머 또는 연쇄(linkages)의 선형 올리고머를 의미하며, 디옥시리보뉴클레오타이드 및 리보뉴클레오타이드를 포함하고 타켓 뉴클레오타이드 서열에 특이적으로 혼성화할 수 있으며, 자연적으로 존재하거나 또는 인위적으로 합성된 것을 말한다. 본 발명에 따른 프로브는 단일쇄일 수 있으며, 바람직하게는 올리고디옥시리보뉴클레오티드일 수 있다. 본 발명의 프로브는 자연 dNMP(즉, dAMP, dGMP, dCMP 및 dTMP), 뉴클레오타이드 유사체 또는 유도체를 포함할 수 있다. 또한, 본 발명의 프로브는 리보뉴클레오타이드도 포함할 수 있다. 예컨대, 본 발명의 프로브는 골격 변형된 뉴클레오타이드, 예컨대, 펩타이드 핵산 (PNA) (M. Egholm et al., Nature, 365:566-568(1993)), 포스포로티오에이트 DNA, 포스포로디티오에이트 DNA, 포스포로아미데이트 DNA, 아마이드-연결된 DNA, MMI-연결된 DNA, 2'-O-메틸 RNA, 알파-DNA 및 메틸포스포네이트 DNA, 당 변형된 뉴클레오타이드 예컨대, 2'-O-메틸 RNA, 2'-플루오로 RNA, 2'-아미노 RNA, 2'-O-알킬 DNA, 2'-O-알릴 DNA, 2'-O-알카이닐 DNA, 헥소스 DNA, 피라노실 RNA 및 안히드로헥시톨 DNA, 및 염기 변형을 갖는 뉴클레오타이드 예컨대, C-5 치환된 피리미딘(치환기는 플루오로-, 브로모-, 클로로-, 아이오도-, 메틸-, 에틸-, 비닐-, 포르밀-, 에티틸-, 프로피닐-, 알카이닐-, 티아조릴-, 이미다조릴-, 피리딜- 포함), C-7 치환기를 갖는 7-데아자퓨린 (치환기는 플루오로-, 브로모-, 클로로-, 아이오도-, 메틸-, 에틸-, 비닐-, 포르밀-, 알카이닐-, 알켄일-, 티아조릴-, 이미다조릴-, 피리딜-), 이노신 및 디아미노퓨린을 포함할 수 있다.
또한, 본 발명에서 상기 BANF1, PLOD3 또는 SF3B4 단백질의 수준은, 바람직하게 BANF1, PLOD3 또는 SF3B4 유전자가 발현된 mRNA로부터 번역과정을 거쳐 생성된 각 마커에 대한 폴리펩티드를 의미하며, 상기 단백질의 수준을 측정할 수 있는 물질로는 BANF1, PLOD3 또는 SF3B4 단백질에 대해 특이적으로 결합할 수 있는 다클론 항체, 단일클론 항체 및 재조합 항체 등의 “항체”를 포함할 수 있다.
또한, 본 발명에 있어서, 상기 기술한 바와 같이 간암을 진단할 수 있는 마커 단백질로서 BANF1, PLOD3 또는 SF3B4 단백질이 규명되었으므로, 상기 단백질을 이용하여 항체를 생성하는 방법은 당해 기술분야의 일반적 기술자가 공지된 기술을 이용하여 용이하게 제조할 수 있다. 예컨대, 다클론 항체의 경우에는 BANF1, PLOD3 또는 SF3B4 항원을 동물에 주사하고 동물로부터 채혈하여 항체를 포함하는 혈청을 수득하는 당업계에 널리 공지된 방법에 의해 생산할 수 있으며, 이러한 다클론 항체는 염소, 토끼, 양, 원숭이, 말, 돼지, 소, 개 등의 임의의 동물 종 숙주로부터 제조가능하다. 단일클론 항체의 경우에는 당업계에 널리 공지된 하이브리도마(hybridoma) 방법(Kohler et al., European Jounral of Immunology, 6, 511-519, 1976)을 이용하여 제조할 수 있거나 또는 파지 항체 라이브러리(Clackson et al, Nature, 352, 624-628, 1991, Marks et al, J. Mol. Biol., 222:58, 1-597, 1991) 기술을 이용하여 제조할 수 있다. 또한, 본 발명에 따른 항체는 2개의 전체 길이의 경쇄 및 2개의 전체 길이의 중쇄를 가지는 완전한 형태뿐만 아니라, 항체 분자의 기능적인 단편을 포함할 수 있다. 항체 분자의 기능적인 단편이란 적어도 항원 결합 기능을 보유하고 있는 단편을 뜻하며, Fab, F(ab'), F(ab') 2 및 Fv 등이 있다.
또한, 본 발명은 BANF1, PLOD3 또는 SF3B4 단백질 또는 이를 암호화하는 유전자의 발현 수준을 측정할 수 있는 제제를 함유하는 조성물을 포함하는 조기 간암 진단 또는 예후 진단용 키트를 제공할 수 있다.
본 발명의 키트에 포함되는 간암 진단 또는 예후 진단용 조성물은 BANF1, PLOD3 또는 SF3B4 단백질 또는 이를 암호화하는 유전자의 발현 수준을 측정할 수 있는 프라이머, 프로브, 앱타머, 항체 또는 기질을 포함할 수 있으며, 이들의 정의는 앞서 기술된 바와 같다.
본 발명의 키트가 만일 PCR 증폭 과정에 적용되는 경우, 본 발명의 키트는 선택적으로, PCR 증폭에 필요한 시약, 예컨대, 완충액, DNA 중합효소(예컨대, Thermus aquaticus (Taq), Thermus thermophilus (Tth), Thermus filiformis, Thermis flavus, Thermococcus literalis 또는 Pyrococcus furiosus(Pfu)로부터 수득한 열 안정성 DNA 중합효소), DNA 중합 효소 조인자 및 dNTPs를 포함할 수 있으며, 본 발명의 간암 진단용 키트가 면역 분석에 적용되는 경우, 본 발명의 키트는 선택적으로, 이차항체 및 표지의 기질을 포함할 수 있다. 나아가, 본 발명에 따른 키트는 상기한 시약 성분을 포함하는 다수의 별도 패키징 또는 컴파트먼트로 제작될 수 있다.
또한, 본 발명은 BANF1, PLOD3 또는 SF3B4 단백질 또는 이를 암호화하는 유전자의 발현 수준을 측정할 수 있는 조기 간암 진단용 조성물을 포함하는 조기 간암 진단용 마이크로어레이를 제공한다.
본 발명의 마이크로어레이에 있어서, BANF1, PLOD3 또는 SF3B4 단백질 또는 이를 암호화하는 유전자의 발현 수준을 측정할 수 있는 프라이머, 프로브 또는 항체는 혼성화 어레이 요소(hybridizable array element)로서 이용되며, 기질(substrate) 상에 고정화된다. 바람직한 기질은 적합한 견고성 또는 반-견고성 지지체로서, 예컨대, 막, 필터, 칩, 슬라이드, 웨이퍼, 파이버, 자기성 비드 또는 비자기성 비드, 겔, 튜빙, 플레이트, 고분자, 미소입자 및 모세관을 포함할 수 있다. 상기 혼성화 어레이 요소는 상기 기질 상에 배열되고 고정화되며, 이와 같은 고정화는 화학적 결합 방법 또는 UV와 같은 공유 결합적 방법에 의해 수행될 수 있다. 예를 들어, 상기 혼성화 어레이 요소는 에폭시 화합물 또는 알데히드기를 포함하도록 변형된 글래스 표면에 결합될 수 있고, 또한 폴리라이신 코팅 표면에서 UV에 의해 결합될 수 있다. 또한, 상기 혼성화 어레이 요소는 링커(예: 에틸렌 글리콜 올리고머 및 디아민)를 통해 기질에 결합될 수 있다.
한편, 본 발명의 마이크로어레이에 적용되는 시료가 핵산일 경우에는 표지(labeling)될 수 있고, 마이크로어레이상의 어레이 요소와 혼성화 될 수 있다. 혼성화 조건은 다양할 수 있으며, 혼성화 정도의 검출 및 분석은 표지 물질에 따라 다양하게 실시될 수 있다.
또한, 본 발명은 간암 진단에 필요한 정보를 제공하기 위하여 환자의 시료로부터 BANF1, PLOD3 및 SF3B4로 이루어진 군 중에서 선택되는 하나 이상의 조기 간암 진단마커를 검출하는 방법을 제공할 수 있다.
또한, 본 발명은 환자로부터 분리된 생물학적 시료로부터 BANF1, PLOD3 및 SF3B4로 이루어진 군 중에서 선택되는 하나 이상의 유전자에 대한 mRNA 또는 단백질의 발현수준을 측정하는 단계; 및 상기 측정된 BANF1, PLOD3 또는 SF3B4의 발현수준을 대조군 시료의 해당 유전자의 발현수준과 비교하는 단계를 포함하는, 조기 간암 진단을 위한 정보 제공방법을 제공할 수 있다.
상기에서 BANF1, PLOD3 또는 SF3B4 유전자의 발현수준 또는 단백질 수준을 측정하는 방법은 공지의 기술을 이용하여 생물학적 시료로부터 mRNA 또는 단백질을 검출 또는 분리하는 공지의 공정을 포함하여 수행될 수 있다.
본 발명에서 상기 "생물학적 시료"란 간암 발생 또는 진행 정도에 따른 상기 BANF1, PLOD3 또는 SF3B4 유전자의 발현 수준 또는 단백질의 수준이 정상 대조군과는 다른, 생체로부터 채취된 시료를 말하며, 상기 시료로는 예를 들면, 이에 제한되지는 않으나, 조직, 세포, 혈액, 혈청, 혈장, 타액 및 뇨 등이 포함될 수 있다. 바람직하게는 전암성 병변일 수 있으며, 상기 전암성 병변은 간암으로 진행되기 전 단계라면 모두 포함될 수 있고, 본 발명의 일실시예에서는 전암성 병변으로 고등급 이형성 노드(HGDN; high-grade DN) 시료를 사용하였다.
상기 마커 유전자의 발현 수준 측정은 바람직하게는 mRNA의 수준을 측정하는 것이며, mRNA의 수준을 측정하는 방법으로는 역전사 중합효소연쇄반응(RT-PCR), 실시간 역전사 중합효소연쇄반응, RNase 보호 분석법, 노던 블럿 및 DNA 칩 등이 있으나, 이에 제한되지는 않는다.
상기 마커 단백질 수준의 측정은 항체를 이용할 수 있는데, 이러한 경우, 생물학적 시료 내의 마커 단백질과 이에 특이적인 항체는 결합물, 즉, 항원-항체 복합체를 형성하며, 항원-항체 복합체의 형성량은 검출 라벨(detection label)의 시그널의 크기를 통해서 정량적으로 측정할 수 있다. 이러한 검출 라벨은 효소, 형광물, 리간드, 발광물, 미소입자(microparticle), 레독스 분자 및 방사선 동위원소로 이루어진 그룹 중에서 선택할 수 있으며, 이에 제한되는 것은 아니다. 단백질 수준을 측정하기 위한 분석 방법으로는, 이에 제한되지는 않으나, 웨스턴 블럿, ELISA, 방사선면역분석, 방사선 면역 확산법, 오우크테로니 면역 확산법, 로케트 면역전기영동, 조직면역 염색, 면역침전 분석법, 보체 고정분석법, FACS, 단백질 칩 등이 있다.
따라서 본 발명은 상기와 같은 검출 방법들을 통하여, 대조군의 마커 유전자에 대한 mRNA 발현양 또는 단백질의 발현양과 간암 환자 또는 간암 의심환자에서의 마커 유전자 mRNA 발현양 또는 단백질의 양을 확인할 수 있고, 상기 발현양의 정도를 대조군, 즉, 정상인의 샘플과 비교함으로써 간암의 발병여부, 진행단계 또는 예후 등을 예측 및 진단할 수 있다.
본 발명의 일실시예에 따르면, 간암 환자로부터 수득한 간암 조직과 정상 간 조직을 대상으로 조직 용해물을 수득한 다음, BANF1, PLOD3 또는 SF3B4에 대한 항체를 이용한 웨스턴 블럿 방법을 수행하여 각 시료로부터 해당 단백질 양을 측정한 다음, 상기 측정치를 정상의 대조군과 비교 분석하는 과정을 통해 수행하였다.
나아가 본 발명자들은 간암 치료제로서 BANF1, PLOD3 또는 SF3B4 억제제들을 사용할 수 있음을 규명하였다. 본 발명의 일실시예에 의하면, BANF1, PLOD3 또는 SF3B4 억제제로서 이들 유전자들의 발현을 억제하는 siRNA를 이용하여 넉다운 시킨 후, 간세포암의 성장 및 증식을 분석한 결과, 이들 유전자의 발현 또는 활성 억제시 암세포의 성장과 증식이 억제되는 것으로 나타났고, 세포주기 이상이 초래되고 세포사멸이 유도되어 궁극적으로 간암을 예방 및 치료할 수 있음을 알 수 있었다.
따라서 BANF1, PLOD3 또는 SF3B4의 활성 및 발현을 억제할 수 있는 물질은 간암 치료제로 사용할 수 있으며, 본 발명은 BANF1, PLOD3 또는 SF3B4의 억제제를 유효성분으로 포함하는, 간암의 전이 및 재발 억제용 약학적 조성물을 제공할 수 있다.
본 발명에 따른 약학적 조성물에는 BANF1, PLOD3 또는 SF3B4의 발현 또는 활성을 억제할 수 있는 물질이라면 모두 포함할 수 있고, 바람직하게는 화학물질, 뉴클레오티드, 안티센스, siRNA 올리고뉴클레오타이드 또는 천연물 추출물을 유효성분으로 포함할 수 있으며, 더욱 바람직하게는 본 발명의 BANF1, PLOD3 또는 SF3B4 유전자의 뉴클레오티드 서열에 상보적인 서열을 가지는 안티센스 또는 siRNA(small interference RNA) 올리고뉴클레오티드를 유효성분으로 포함할 수 있으며, 더욱더 바람직하게는 siRNA를 사용할 수 있다.
본 발명에서 상기 "안티센스 올리고뉴클레오타이드”란 용어는 특정 mRNA의 서열에 상보적인 핵산 서열을 함유하고 있는 DNA 또는 RNA 또는 이들의 유도체를 의미하고, mRNA 내의 상보적인 서열에 결합하여 BANF1, PLOD3 또는 SF3B4의 단백질로의 번역을 저해하는 작용을 한다. 본 발명의 안티센스 서열은 BANF1, PLOD3 또는 SF3B4 mRNA에 상보적이고 BANF1, PLOD3 또는 SF3B4 mRNA에 결합할 수 있는 DNA 또는 RNA 서열을 의미하며, BANF1, PLOD3 또는 SF3B4 mRNA의 번역, 세포질내로의 전위(translocation), 성숙(maturation) 또는 다른 모든 전체적인 생물학적 기능에 대한 필수적인 활성을 저해할 수 있다.
또한, 상기 안티센스 핵산은 효능을 증진시키기 위하여 하나 이상의 염기, 당 또는 골격(backbone)의 위치에서 변형될 수 있다(De Mesmaeker et al., Curr Opin Struct Biol., 5, 3, 343-55, 1995). 핵산 골격은 포스포로티오에이트, 포스포트리에스테르, 메틸 포스포네이트, 단쇄 알킬, 시클로알킬, 단쇄 헤테로아토믹, 헤테로시클릭 당간 결합 등으로 변형될 수 있다. 또한, 안티센스 핵산은 하나 이상의 치환된 당 모이어티(sugar moiety)를 포함할 수 있다. 안티센스 핵산은 변형된 염기를 포함할 수 있다. 변형된 염기에는 하이포크잔틴, 6-메틸아데닌, 5-메틸피리미딘(특히 5-메틸시토신), 5-하이드록시메틸시토신(HMC), 글리코실 HMC, 젠토비오실 HMC, 2-아미노아데닌, 2-티오우라실, 2-티오티민, 5-브로모우라실, 5-하이드록시메틸우라실, 8-아자구아닌, 7-데아자구아닌, N6 (6-아미노헥실)아데닌, 2,6-디아미노퓨린 등이 있다. 또한, 본 발명의 안티센스 핵산은 상기 안티센스 핵산의 활성 및 세포 흡착성을 향상시키는 하나 이상의 모이어티(moiety) 또는 컨쥬게이트(conjugate)와 화학적으로 결합될 수 있다. 콜레스테롤 모이어티, 콜레스테릴 모이어티, 콜릭산, 티오에테르, 티오콜레스테롤, 지방성 사슬, 인지질, 폴리아민, 폴리에틸렌 글리콜 사슬, 아다맨탄 아세트산, 팔미틸 모이어티, 옥타데실아민, 헥실아미노-카르보닐-옥시콜에스테롤 모이어티 등의 지용성 모이어티 등이 있고 이에 제한되지는 않는다. 지용성 모이어티를 포함하는 올리고뉴클레오티드와 제조 방법은 본 발명의 기술 분야에서 이미 잘 알려져 있다(미국특허 제5,138,045호, 제5,218,105호 및 제5,459,255호). 상기 변형된 핵산은 뉴클레아제에 대한 안정성을 증가시키고 안티센스 핵산과 표적 mRNA와의 결합 친화력을 증가시킬 수 있다.
안티센스 올리고뉴클레오타이드는 통상의 방법으로 시험관에서 합성되어 생체 내로 투여하거나 생체 내에서 안티센스 올리고뉴클레오타이드가 합성되도록 할 수 있다. 시험관에서 안티센스 올리고뉴클레오타이드를 합성하는 일예는 RNA 중합효소 I를 이용하는 것이다. 생체 내에서 안티센스 RNA가 합성되도록 하는 한 가지 예는 인식부위(MCS)의 기원이 반대 방향에 있는 벡터를 사용하여 안티센스 RNA가 전사되도록 하는 것이다. 이런 안티센스 RNA는 서열 내에 번역 중지 코돈이 존재하도록 하여 펩타이드 서열로 번역되지 않도록 하는 것이 바람직하다.
본 발명에서 "siRNA”용어는 RNA 방해 또는 유전자 사일런싱을 매개할 수 있는 핵산 분자를 의미한다(국제공개 특허번호 00/44895, 01/36646, 99/32619, 01/29058, 99/07409 및 00/44914 참조). siRNA는 표적 유전자의 발현을 억제할 수 있기 때문에 효율적인 유전자 넉다운(knock-down) 방법으로서 또는 유전자치료 방법으로 제공된다.
본 발명의 siRNA 분자는, 센스 가닥(TCIRG1 mRNA 서열에 상응하는 서열)과 안티센스 가닥(TCIRG1 mRNA 서열에 상보적인 서열)이 서로 반대쪽에 위치하여 이중쇄를 이루는 구조를 가질 수 있으며, 또한, 본 발명의 siRNA 분자는 자기-상보성(self-complementary) 센스 및 안티센스 가닥을 가지는 단일쇄 구조를 가질 수 있다. 나아가 siRNA는 RNA끼리 짝을 이루는 이중사슬 RNA 부분이 완전히 쌍을 이루는 것에 한정되지 않고 미스매치(대응하는 염기가 상보적이지 않음), 벌지(일방의 사슬에 대응하는 염기가 없음) 등에 의하여 쌍을 이루지 않는 부분이 포함될 수 있다. 또한, siRNA 말단 구조는 TCIRG1 유전자의 발현을 RNAi 효과에 의하여 억제할 수 있는 것이면 평활(blunt) 말단 혹은 점착(cohesive) 말단 모두 가능하고, 점착 말단 구조는 3'-말단 돌출 구조와 5'-말단 돌출 구조 모두 가능하다.
또한, 본 발명의 siRNA 분자는 자기-상보성(self-complementary) 센스 및 안티센스 가닥 사이에 짧은 뉴클레오티드 서열이 삽입된 형태를 가질 수 있으며, 이 경우 뉴클레오타이드 서열의 발현에 의해 형성된 siRNA 분자는 분자내 혼성화에 의하여 헤어핀 구조를 형성하게 되며, 전체적으로는 스템-앤드-루프 구조를 형성하게 된다. 이 스템-앤드-루프 구조는 인 비트로 또는 인 비보에서 프로세싱되어 RNAi를 매개할 수 있는 활성의 siRNA 분자를 생성한다.
siRNA를 제조하는 방법은 시험관에서 siRNA를 직접 합성한 뒤, 형질전환 과정을 거쳐 세포 안으로 도입시키는 방법과 siRNA가 세포 안에서 발현되도록 제조된 siRNA 발현 벡터 또는 PCR-유래의 siRNA 발현 카세트 등을 세포안으로 형질전환 또는 감염(infection)시키는 방법이 있다.
또한, 유전자 특이적인 siRNA를 포함하는 본 발명의 조성물은 siRNA의 세포내 유입을 촉진시키는 제제를 포함할 수 있다. siRNA의 세포내 유입을 촉진시키는 제제에는 일반적으로 핵산 유입을 촉진하는 제제를 사용할 수 있으며, 이러한 예로는, 리포좀을 이용하거나 콜레스테롤, 콜레이트 및 데옥시콜산을 비롯한 다수의 스테롤류 중 1종의 친유성 담체와 함께 배합할 수 있다. 또한 폴리-L-라이신(poly-L-lysine), 스퍼민(spermine), 폴리실아잔(polysilazane), 폴리에틸레민(PEI: polyethylenimine), 폴리디하이드로이미다졸레늄(polydihydroimidazolenium), 폴리알리라민(polyallylamine), 키토산(chitosan) 등의 양이온성 고분자(cationic polymer)를 이용할 수도 있고, 숙실화된 PLL(succinylated PLL), 숙실화된 PEI(succinylated PEI), 폴리글루타믹산(polyglutamic acid), 폴리아스파틱산(polyaspartic acid), 폴리아크릴산(polyacrylic acid), 폴리메타아크릴산(polymethacylic acid), 덱스트란 설페이트(dextran sulfate), 헤파린(heparin), 히아루릭산(hyaluronic acid) 등의 음이온성 고분자(anionic polymer)를 이용할 수 있다.
또한, 상기 BANF1, PLOD3 또는 SF3B4 단백질의 발현 및 활성을 감소시키는 물질로서 BANF1, PLOD3 또는 SF3B4 단백질에 특이적인 항체를 사용할 경우, 상기 항체는 기존의 치료제와 직접 또는 링커 등을 통하여 간접적으로 커플링(예를 들어, 공유결합)시킬 수 있다. 항체와 결합될 수 있는 치료제로는 이에 제한되지는 않으나, 131I, 90Y, 105Rh, 47Sc, 67Cu, 212Bi, 211At, 67Ga, 125I, 186Re, 188Re, 177Lu, 153Sm, 123I, 111In 등과 같은 방사성핵종(radionuclide); 메토트렉세이트(methotrexate), 아드리아마이신(adriamycin), 및 인터페론과 같은 림포카인(lympokine) 등의 생물학적 반응 변형체 또는 약물; 리신, 아브린, 디프테리아 등과 같은 독소; 이형기능성 항체(heterofunctional antibodies), 즉 다른 항체와 결합되어서 그 복합체가 암 세포와 효능 세포(예를 들면, T 세포와 같은 K 세포(killer cell) 모두에 결합하는 항체; 및 자연적인, 즉, 비-연관 또는 비-복합된 항체와 결합될 수 있다.
또한, 본 발명에서 상기 본 발명의 약학적 조성물은 약학적으로 허용되는 담체를 추가로 포함할 수 있다. 상기에서 "약학적으로 허용되는"이란 생리학적으로 허용되고 인간에게 투여될 때, 통상적으로 위장 장애, 현기증 등과 같은 알레르기 반응 또는 이와 유사한 반응을 일으키지 않는 조성물을 말한다. 약학적으로 허용되는 담체로는 예를 들면, 락토스, 전분, 셀룰로스 유도체, 마그네슘 스테아레이트, 스테아르산 등과 같은 경구 투여용 담체 및 물, 적합한 오일, 식염수, 수성 글루코스 및 글리콜 등과 같은 비경구 투여용 담체 등이 있으며 안정화제 및 보존제를 추가로 포함할 수 있다. 적합한 안정화제로는 아황산수소나트륨, 아황산나트륨 또는 아스코르 브산과 같은 항산화제가있다. 적합한 보존제로는 벤즈알코늄 클로라이드, 메틸- 또는 프로필-파라벤 및 클로로부탄올이 있다. 그 밖의 약학적으로 허용되는 담체로는 다음의 문헌에 기재되어 있는 것을 참고로 할 수 있다(Remington's Pharmaceutical Sciences, 19th ed., Mack Publishing Company, Easton, PA, 1995).
본 발명에 따른 약학적 조성물은 상술한 바와 같은 약학적으로 허용되는 담체와 함께 당업계에 공지된 방법에 따라 적합한 형태로 제형화 될 수 있다. 즉, 본 발명의 약학적 조성물은 공지의 방법에 따라 다양한 비경구 또는 경구 투여용 형태로 제조될 수 있으며, 비경구 투여용 제형의 대표적인 것으로는 주사용 제형으로 등장성 수용액 또는 현탁액이 바람직하다. 주사용 제형은 적합한 분산제 또는 습윤제 및 현탁화제를 사용하여 당업계에 공지된 기술에 따라 제조할 수 있다. 예를 들면, 각 성분을 식염수 또는 완충액에 용해시켜 주사용으로 제형화될 수 있다. 또한, 경구 투여용 제형으로는, 이에 한정되지는 않으나, 분말, 과립, 정제, 환약 및 캡슐 등이 있다.
상기와 같은 방법으로 제형화된 약학적 조성물은 유효량으로 경구, 경피, 피하, 정맥 또는 근육을 포함한 여러 경로를 통해 투여될 수 있는데, 상기 “투여”란 어떠한 적절한 방법으로 환자에게 소정의 물질을 도입하는 것을 의미하며 물질의 투여 경로는 목적 조직에 도달할 수 있는 한 어떠한 일반적인 경로를 통하여 투여될 수 있다.
또한, 상기에서 “유효량” 이란 환자에게 투여하였을 때, 예방 또는 치료 효과를 나타내는 양을 말한다. 본 발명에 따른 약학적 조성물의 투여량은 환자의 질환 종류 및 중증도, 연령, 성별, 체중, 약물에 대한 민감도, 현재 치료법의 종류, 투여방법, 표적 세포 등 다양한 요인에 따라 달라질 수 있으며, 당 분야의 전문가들에 의해 용이하게 결정될 수 있다. 또한, 본 발명의 약학적 조성물은 종래의 치료제와 병용하여 투여될 수 있고 종래의 치료제와는 순차적 또는 동시에 투여될 수 있으며, 단일 또는 다중 투여될 수 있다. 바람직하게는 상기 요소를 모두 고려하여 부작용 없이 최소한의 양으로 최대 효과를 얻을 수 있는 양을 투여할 수 있으며, 더욱 바람직하게는 1~10000㎍/체중kg/day, 더욱더 바람직하게는 10~1000㎎/체중kg /day의 유효용량으로 하루에 수회 반복 투여될 수 있다.
나아가 본 발명은 (a) BANF1, PLOD3 또는 SF3B4 유전자 또는 이의 단백질을 포함하는 세포에 분석하고자 하는 시료를 접촉시키는 단계; (b) 상기 BANF1, PLOD3 또는 SF3B4 유전자의 발현양, 단백질의 양 또는 단백질의 활성을 측정하는 단계; 및 (c) 상기 (b) 단계의 측정 결과, BANF1, PLOD3 또는 SF3B4 유전자의 발현양, 단백질의 양 또는 단백질의 활성이 감소되는 경우에 상기 시료는 간암의 예방 또는 치료용 물질로 판정하는 단계를 포함하는, 간암의 예방 또는 치료용 물질을 스크리닝 하는 방법을 제공할 수 있다.
본 발명의 방법에 따르면, 먼저 BANF1, PLOD3 또는 SF3B4 유전자 또는 이의 단백질을 포함 또는 발현하는 세포에 분석하고자 하는 시료를 접촉시킬 수 있다. 여기서 상기“시료”는 BANF1, PLOD3 또는 SF3B4 유전자의 발현양, 단백질의 양 또는 단백질의 활성에 영향을 미치는지 여부를 검사하기 위하여 스크리닝에서 이용되는 미지의 물질을 의미한다. 상기 시료는 화학물질, 뉴클레오티드, 안티센스-RNA, siRNA(small interference RNA) 및 천연물 추출물을 포함할 수 있으나, 이에 제한되지는 않는다. 이후, 시료가 처리된 세포에서 BANF1, PLOD3 또는 SF3B4 유전자의 발현양, 단백질의 양 또는 단백질의 활성을 측정할 수 있으며, 측정 결과, BANF1, PLOD3 또는 SF3B4 유전자의 발현양, 단백질의 양 또는 단백질의 활성이 감소되는 것이 측정되면 상기 시료는 간암을 치료 또는 예방할 수 있는 물질로 판정될 수 있다.
상기에서 활성 측정 방법은 당업계에 공지된 다양한 방법을 통해 수행될 수 있는데, 예를 들면, 이에 제한되지는 않으나, 역전사 중합효소 연쇄반응(reverse transcriptase-polymerase chain reaction), 실시간 중합효소 연쇄반응(real time-polymerase chain reaction), 웨스턴 블럿, 노던 블럿, ELISA(enzyme linked immunosorbent assay), 방사선면역분석(RIA: radioimmunoassay), 방사 면역 확산법(radioimmunodiffusion) 및 면역침전분석법(immunoprecipitation assay)등을 이용하여 수행할 수 있다.
이하, 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명하기로 한다. 그러나 이들 실시예는 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로서, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.
<준비예>
시료준비
하기 실험을 위해 3개의 독립적인 간질환 환자 코호트를 사용하였다. 코호트 1(107 tissues from 81 patients, snap-frozen tissue)은 유전자 발현 마이크로어레이에 사용되었고, 코호트 2(546 tissues from 546 patients, tissue microarray)는 조직 마이크로어레이에 사용되었으며, 코호트 3((160 tissues from 70 patients, full section)은 면역조직화학법에 사용하였다. 이들 3개 군의 코호트에 대한 임상 병리학적 특징은 하기 표 1에 나타내었다.
Figure 112018008997321-pat00001
생존율(Progression free survival)은 수술 날짜와 특정 형태의 재발이 진단된 날짜 사이의 간격으로 정의하였다. 또한 모든 피험자로부터는 선언에 기초하여 서면 동의를 얻었고, 본 연구는 가톨릭대학교 의과대학((IRB 승인 번호 : MC12EISI0106, MC12SNMI0184)의 IRB(Institutional Review of Board) 승인을 받아 진행하였다.
<실험방법>
① 조직 마이크로어레이 및 면역조직화학염색
조직 마이크로어레이(TMA; tissue microarray) 구축을 위해, 포르말린으로 고정시킨 후 파라핀으로 임베드한 코호트 2(n=546) 환자군의 간암 조직을 병리학자가 점수를 체크할 수 있도록 매핑하였다. 간 조직은 각각의 블록을 펀칭하였고 0.6mm 직경의 스틸레토(stylet)를 이용하여 5mm 두께의 섹션이 되도록 잘라 파라핀 블록에 넣었다. 섹션을 접착성 전사테이프 방법을 이용하여 슬라이드에 접착시켰고 자외선 조사로 교차결합 시켰다. 각 단백질 수준을 조사하기 위해 TMA 및 전체 절편 시료에 대해 하기 표 2의 항체들을 이용하여 면역조직염색을 수행하였다.
[표 2]
웨스턴블럿 및 조직마이크로 어레이에 사용된 항체 목록
Figure 112018008997321-pat00002
② TCGA 및 NCBI GEO 데이터 분석
HCC에서 HCC 마커의 발현수준을 재구성하기 위해, 데이터는 TCGA 간 간세포 암종 프로젝트와 NCBI GEO 데이터베이스 (수탁 번호 : GSE16757, GSE22058, GSE25097, GSE36376, GSE44106, GSE45436, GSE54236, GSE80861, GSE89377 및 GSE93392)로부터 수득하였다. TCGA RNA-seq 데이터는 먼저 모든 RPKM 값을 교체 한 후 log2로의 변형이 적용되도록 분석하였다.
③ 마이크로어레이 분석
대규모 유전자 발현 프로파일링을 위해 코호트 1 환자군의 냉동된 간 조직을 유전자 발현 마이크로 어레이 분석에 사용하였다. 코호트 1 환자군의 시료로부터 3개의 독립적인 세트를 선택하고 TRIzol 시약을 이용하여 총 RNA를 추출한 다음, Illumina Total-Prep RNA 증폭 Kit 컬럼(Ambion Inc., Austin, TX)을 이용하여 RNA를 분리하였다. RNA의 품질 조절은 ExperionTM 시스템 (Bio-Rad, Hercules, CA)을 이용하여 수행하였고, 마이크로어레이 분석은 HumanHT-12 V4 Expression BeadChips (Illumina, Inc., San Diego, CA)을 이용하여 분석하였다. 바이오틴화된 cRNA는 MessageAmp kit (Ambion, Inc.)를 이용하여 정제하였으며, 칩(chips)의 혼성과 스캐닝은 Illumina의 표준방법에 따라 수행하였다. 일차 마이크로어레이 데이터는 GEO 데이터베이스에서(GSE89377)에서 이용할 수 있다.
④ 웨스턴블럿 분석
환자의 냉동 조직 및 세포들은 단백질 추출버퍼((50 mM HEPES, 5 mM EDTA, 50 mM NaCl, 1% Triton X-100, 50 mM NaF, 10 mM Na2P2O7, 1 mM Na3VO4, 100 x Halt protease inhibitor cocktail)로 용해시켰다. 동량의 단백질을 함유한 용해물들은 SDS-PAGE 상에서 전기 영동하였고, PVDF 막으로 전기이동시킨 후, 블록킹 버퍼(5% skimmed milk in Tris-buffered saline, 0.1% Tween-20)로 블록킹 반응을 수행한 다음, 상기 표 2의 항체들을 이용하여 반응시켜 웨스턴블럿을 수행하였다.
⑤ 세포 이동 및 침윤 분석(Motilityand invasion assay)
In vitro 상에서 세포 이동 및 침윤 분석을 수행하였는데, 세포 이동은 수정된 Boyden chamber 분석(BD Bioscience)으로 수행하였고, 침윤 분석은 Matrigel (BD Biosciences)을 이용하여 수행하였다. 침윤 분석을 위해 Matrigel을 0.3mg/ml의 농도가 되도록 코팅 버퍼로 희석하였다. 이후 100ul로 분주한 희석된 Matrigel 용액을 트랜스웰 세포 배양 삽입물의 일부분으로 덮었고, 37℃에서 1시간 동안 배양한 후, 삽입물(인서트)을 시드할 준비를 하였다. si-SF3B4로 세포를 형질감염시킨 후, 세포들을 트랜스웰 인서트에 도포하였고 화학유인물질로서 5%의 FBS가 함유된 혈청이 없는 배지를 사용하여 배양하였다. 각 분석을 위한 세포 배양 후(세포이동: 시간 배양, 침윤 분석: 12시간)이동되었거나 침윤된 세포들을 Diff-Quik staining kit (Sysmex, Japan)을 이용하여 염색하였으며, Axiovert 200 인버티드 현미경(Zeiss, Jena, Germany)으로 200배 배율로 관찰하였다.
⑥ 메조포러스 실리카 나노입자의 형질감염
BANF1, PLOD3 및 SF3B4에 대한 특이적 si-RNA는 80 ul InViVojectionTM RNAi-나노 시약(mesoporous silica nanoparticle, Cat. No. DHMSN-vivoRNA; Lemonex Inc., Seoul, Korea)에 3nmol의 농도로 첨가하였고, 200ul의 PBS 용액을 준비하였다. MSNs 및 si-RNA 의 혼합물을 H-ras 형질전환된 HCC 마우스 모델에 9~23주 동안 매주 꼬리에 정맥주사하였다. 이후 초음파 장비를 이용하여 17주, 19주 및 21일 주째에 각각 초음파 영상 촬영을 하여 영상이미지를 수집하였다.
세포들은 밤새도록 배양한 후, Diff-Quik 염색 키트(Sysmex, Chuo-ku, Cobe, Japan)를 이용하여 염색하였다. 세포 이미지는 ×200배 배율로 Axiovert 200 inverted microscope (Zeiss, Oberkochen, Germany)를 이용하여 관찰하였고, 3개의 무작위 이미지 필드에서 세포수를 카운팅하였다.
⑦ 간암 이식 마우스 모델제조
이종이식 종양 형성 분석을 위해, 1 × 107 세포의 형질감염용 세포를 0.2
ml PBS (pH 7.4) 및 30 % (v / v) 마트리겔 매트릭스 (BD Biosciences)와 혼합하였다. 상기 세포 현탁액을 6 주령 수컷 Balb / c 누드 마우스에 피하 주사 하였다. 마우스를 일주일에 2번씩 주사 부위에서의 종양 형성 여부를 관찰하였다. 종양부피는 0.5 × 길이 (L) × 너비2 (W2)로 계산하였다. 각 실험군은 10 마리의 마우스로 구성하였고, 종양 성장은 캘리퍼스를 사용하여 세 직교 방향으로 종양 크기를 측정하였다. 결과는 평균 종양 부피 및 95%의 신뢰구간으로 표시하였다. H-ras12V가 활성화된 동형접합 형질전환 마우스는 유대열 박사(인간 유전체 연구실, 한국 연구실, 한국 생명 공학 연구소, 대전)로부터 입수하여 사용하였다. 형질전환 마우스는 H-ras12V가 활성화된 마우스이다. 수컷 마우스는 15주령부터 HCC가 자발적으로 발달되기 시작하였다. 이에 본 발명자들은 5마리의 35주령된 마우스로부터 비종양 조직과 HCC 조직을 절제하여 수득하였고, 3쌍의 HCC 조직을 선택하여 병리학적 조사를 수행하였다. 이때 HCC의 유도는 DEN(Diethylnitrosamine)를 이용하여 수행하였다.
⑧ 통계 분석
생존 곡선은 Kaplan-Meier 제품 한계 법을 사용하여 플롯되도록 하였고, 생존 곡선의 차이는 log-rank test를 사용하여 결정하였다. 모든 실험은 적어도 3 회 수행하였고, 모든 샘플은 3 중으로 분석하였다. 결과는 평균 ± 표준 편차 (SD) 또는 평균의 표준 에러(SEM)로 나타내었다. Graphpad ™ 5.0 (GraphPad software Inc., San Diego, CA, USA)을 사용하여 unpaired 양측 스튜던트 t- 테스트에 의해 그룹 간의 통계적 차이를 평가하였다. p < 0.05인 것에 대해 통계적으로 유의미한 것으로 판단하였으며, 카이 제곱 검정 (2-양면)은 매개 변수 간의 연관을 결정하는데 사용하였다.
⑨ RNA 및 DNA 분리, RT-PCR 및 qRT-PCR 분석
총 RNA는 동결된 조직 및 세포주로부터 TRIzol 시약을 이용하여 분리하였다.총 RNA의 1ug은 Tetro cDNA Synthesis Kit (Bioline, London, UK)을 이용한 역전사 반응으로 cDNA를 합성하였다. RT-PCR 반응은 nTaq DNA polymerase (Enzynomics, Daejeon, Korea)를 이용하여 수행하였고, Gel Doc XR image system (Bio-Rad, Hercules, CA)로 ethidium bromide 반응에 의한 DNA 여부를 확인하였다. qRT-PCR은 SensiFAST SYBR No-ROX Kit (Bioline)를 이용하여 수행하였고 iQ™-5 (Bio-Rad)를 이용하여 실시간 모니터링 하였다. 3중 분석에 의한 평균 Ct는 추가 계산에 사용하였다. 정상화 된 유전자 발현은 상대적인 정량화 방법을 사용하여 결정하였다. 결과는 3 회의 실험 평균값으로 나타내었다. 조직 및 세포의 게놈 DNA는 DNAzol 시약 (Invitrogen)을 사용하여 설명서에 따라 추출 및 분리하였다. 카피수 변이분석을 위해, SF3B4 게놈 DNA 영역은 Genbank accession No. NC_000001.11의 게놈서열에 따라 엑손 -1에서 인트론 1까지를 커버하는 프라이머 세트를 이용하여 20쌍(비종양 및 종양)의 HCC 조직으로부터 증폭하였다. qRT-PCR은 상기 기술한 방법과 같이 반응시켰고, 글리세롤 알데히드 -3- 포스페이트 탈수소 효소는 내인성 로딩 대조군으로 사용하였다. RT-PCR 및 qRT-PCR에 사용된 프라이머의 서열은 하기 표에 나타내었다.
[표 3]
프라이머 서열
Figure 112018008997321-pat00003
⑩ 세포배양
인간 HCC 세포주(Hep3B, PLC/PRF/5, SK-Hep-1, SNU-354, SNU-368, SNU-387, SNU-423, SNU-449) 및 Hepa-1c1c7 마우스 간안 세포주는 한국세포주 은행 (Seoul, South Korea)으로부터 입수하여 사용하였다. 불멸화된 간 세포주인 MIHA 및 L-02는 Dr. Jayanta Roy-Chowdhury (Albert Einstein College of Medicine, New York, NY)가 제공하여 사용하였다. 각 세포주들은 10% FBS, 100units/mL penicillin-streptomycin (Invitrogen, Carlsbad, CA)이 함유된 EMEM (American Type Culture Collection, Manassas, VA), RPMI-1640 또는 DMEM 배지에서 배양하였고, 모든 배양은 5% 이산화탄소 및 37℃의 온도가 유지되는 조건에서 배양하였다.
⑪ 형질감염(transfection)
형질감염을 위한 siRNA들은 Genolution (Seoul, Korea)에서 합성하여 사용하였거나 바이오니아(대전, 한국)에 의뢰하여 합성한 것을 사용하였다. si-RNA의 염기서열은 하기 표 4에 나타낸 바와 같다. 1.4Kb human KLF4 ORF (NM_004235)가 pcDNA3.1+/C-(K)-DYK 플라스미드에 서브클로닝된 KLF4 발현 플라스미드는 GenscriptTM (Piscataway, NJ)로부터 구입하여 사용하였다. 형질감염은 Lipofectamine RNAiMAX 또는 Lipofectamine 2000 시약(Invitrogen)을 이용하여 수행하였다. SF3b 복합체 억제제인 Spliceostatin A(SSA)는 AdooQ Bioscience (Cat No. A12700; Irvine, CA, USA)로부터 구입하여 사용하였다.
[표 4]
siRNA 서열
Figure 112018008997321-pat00004
⑫ 세포성장 및 세포증식 분석
세포성장 분석을 위해 먼저 12웰 플레이트에 세포가 30%정도 차도록 분주하였다. 형질감염 및 억제제를 처리한 후, 0.5 mg/mL MTT (3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide)를 처리하고 1시간 동안 반응시켰다. 포르마잔 크리스탈은 DMSO로 용해시키고 VICTOR3™ multilabel plate reader (PerkinElmer, Boston, MA)를 이용하여 570nm에서 흡광도를 측정하였다.
세포증식 분석을 위해, 24웰 플레이트에 세포가 30%정도 차도록 분주하였다. 형질감염 후, 세포에 BrdU(5-bromo-2'-deoxyuridine)를 처리하고 2시간 동안 반응시킨 후, 상온에서 30분 동안 고정시켰다. 세포들을 anti-BrdU에 대한 항체로 1시간 동안 상온에서 반응시켰다. 미반응된 항체들은 세척 버퍼로 세척하여 제거하였다. Horseradish peroxidase-결합된 2차 항체를 각 웰에 첨가하고, 이후 기질 용액을 첨가하여 반응시킨 후, 반응정지 용액을 첨가하여 반응을 종결시켰다. 최종 반응산물을 VICTOR3™ multilabel plate reader (PerkinElmer)를 이용하여 490nm의 흡광도에서 측정하였다.
⑬ 집락형성 분석(Clonogenic assay)
6웰 플레이트에 세포들을 분주하고((1000 cells/well) si-대조군 및 si-SF3B4로 세포들을 형질감염 시켰다. 2주 후 형성된 세포 콜로니를 포름알데히드(1% v/v)로 30분 동안 상온에서 고정시키고 크리스탈 바이올렛(0.5% v/v)으로 염색하였다. 형성된 콜로니의 수는 클론 카운터 프로그램을 이용하여 분석하였다.
⑭ 상처 치유 분석
형질감연된 세포들을 6웰 플레이트에 분주하고 세포들이 100%가 되도록 플레이트를 가득채우면, micropipette tip을 이용하여 스크래치를 내었다. 이후 스트래치가 있는 영역의 이미지를 시간별로 IX70 fluorescence inverted microscope (Olympus, Tokyo, Japan)를 이용하여 관찰하였다.
⑮ 세포사멸 분석
세포사멸 정도를 분석하기 위해 Annexin V-FITC Apoptosis Detection Kit I (BD Biosciences, San Jose, CA)을 이용하였다. 형질감염 후, 간암 세포들을 차가운 PBS 버퍼로 세척하였고 1× 바인딩버퍼로 현탁하였다. 1×105 세포들을 5ml 배양 튜브로 옮기고 5ul의 annexin V-FITC 및 10 ul propidium iodide 용액을 첨가하여 혼합하였다. 20분 동안 상온에서 암 조건하에 반응시키고 400ul의 1× 바인딩버퍼를 각 튜브에 첨가한 후, FACS Calibur flow cytometer (BD Biosciences)를 이용하여 세포사멸이 발생된 분획을 분석하였다.
세포주기 분석
간암 세포주를 si-SF3B4로 형질감염 시키고, 48시간 동안 배양한 다음 트립신 처리로 형질감염된 세포를 수집하였다. 이후 차가운 PBS 버퍼로 세척하고 70% 에탄올로 고정시킨 후, 1mg/ml RNase가 함유된 200ul의 PBS로 현탁한 후, 암 조건에서 37℃의 온도로 30분 동안 반응시켰다. 핵은 50 ug/ml propidium iodide (BD Biosciences)로 염색하였고, 염색된 세포 분획들은 Cell-Quest FACS analysis software (BD Biosciences)를 이용하여 분석하였다.
<실시예 1>
전암성 병변에서 잠재적 간암 진단 마커의 동정
전암성 병변(premalignant lesion)에서 간세포암(HCC)과 관련된 유전자의 발현 특성을 확인하기 위해 임상 병리학 데이터와 유전자 발현을 다음과 같은 비 편향분석 방법으로 분석하였다. 여기서 전암성 병변은 간암으로 넘어가기 전 단계를 말하는 것으로 간암에 준하는 치료를 요구하지 않는 상태이다.
먼저, 전체 전사체학(transcriptome) 발현 마이크로어레이를 이용하여 정상 간조직(13개 조직); 8개의 저등급 섬유증(LGCH; low-grade fibrosis) 및 12개의 고등급 섬유증(HGCH;high-grade fibrosi)를 포함하는 만성 간염 조직; 간 경화 조직 12개; 11개의 저등급 이형성 노드(LGDN; low-grade DN) 및 11개의 고등급 이형성 노드(HGDN; high-grade DN)을 포함하는 이형성 노드(DN; dysplastic nodule); 조기 간세포암 조직(eHCC) 5개; Edmonson Grade 1(G1) 9개, G2 12개 및 G3 14개를 포함하는 간세포암 조직;을 분석하였다. 상기와 같은 본 발명에 따른 잠재적 암 진단 마커의 동정 순서에 대한 모식도는 도 1에 나타내었다.
계층적 클러스터링 분석 결과, 만성 간 질환(LGCH, HGCH, 간경변증 및 LGDN), 초기 간암 (HGDN, eHCC 및 G1) 및 간암 HCC (G2 및 G3)과 같이 3개의 구별된 서브클러스터로 구분되는 계통도를 나타내었다(도 2a 참조). 또한 LGDN, HGDN, eHCC 및 G1에 대한 재분석 결과, LGDN은 간세포암의 초기 단계인 것으로 확인 되었다(도 2b 참조). 따라서 HGDN은 초기 단계의 간세포암의 시작을 나타내는 특징이라는 것을 알 수 있었으며, 전암성 병변(precancerous lesion)은 드라이버 유전자(driver gene) 활성의 시작 부위가 될 수 있으며 이후 간세포암으로 발전될 수 있다. 이러한 결과를 통해 본 발명자들은 전암 병변, 즉 HGDN 내에서 잠재적 간세포암을 예측하는 유전자 세트를 확인하기 위한 유전자의 선택 전략을 디자인했다.
LGDN에서 G1 HCC까지의 각 분자 특성은 LGDN vs HGDN, LGDN vs eHCC /G1 HCC, HGDN vs eHCC / G1 HCC에 대해 분석하였다. 690개의 유전자들 중에서 8개의 유전자가 LGDN에서 간세포암(HCC)으로 진행될수록 점진적으로 발현이 증가되는 것으로 나타났다(도 2c 참조).
다음으로, HCC로의 진행을 전암성 병변인 HGDN에서 확인할 수 있는 분자를 선택하기 위해 ROC(receiver operating characteristic) 곡선의 비교 분석을 수행하였다(도 2d 참조).
분석 결과, 85개의 유전자 중에서 13개가 0.8 이상인 AUC(area under the curve) 값을 나타내어 특이성 및 민감성이 있는 마커들로의 사용 가능함을 예측할 수 있었고(하기 표 5 참조), Cancer Genome Atlas 간세포 암종 (TCGA_LIHC) 데이터 수집 및 National Biotechnology Information Center (NCBI)의 Gene Expression Omnibus (GEO) 데이터베이스에서 제공되는 HCC 환자의 대규모 코호트에서 13 가지 유전자의 발현을 분석하였다.
[표 5]
ROC 분석 결과에 따른 13개의 후보 유전자
Figure 112018008997321-pat00005
그 결과, 3 개의 유전자(ALKBH2, HSD3B7, PARP10)는 비종양과 비교하여 HCC에서 지속적인 과발현(>1.5배)을 보이지 않았기 때문에 제외시켰다(6개의 테스트 코호트에서 <50%, 하기 표 6 참조)).
[표 6]
간암 환자의 대규모 코호트에서 초기 HCC 드라이버 유전자 후보들의 발현수준
Figure 112018008997321-pat00006
이후, TCGA_LIHC 데이터 코호트와 107개의 HCC 세트 모두에서 과발현되는 것으로 나타나는 10 개의 후보 마커 유전자를 확인하였다(도 3a 및 3b 참조).
그런 뒤, 주위의 비종양 조직과 비교하여 HCC에서 이들 10개 유전자의 과발현을 확인하기 위해, 546개의 HCC(140개 G1, 297개 G2 및 109개 G3)를 함유하는 조직 마이크로 어레이 (TMA)를 사용하여 면역조직화학분석(IHC)을 수행하였다.
그 결과, 10개 마커 후보 유전자 중에서 정상 간 조직 (NL)에 비해 CYC1, FAM83H, MAD3 및 MELK는 간세포 암에서 유의하게 과발현되지 않는 것으로 나타났고(도 2e 참조), HCC 환자의 임상 병리학 데이터 및 발현의 다변량 분석을 바탕으로 BANF1, PLOD3 및 SF3B4를 후보 마커로 선택했다(하기 표 7 참조).
[표 7]
코호트 2에서(n=546) 10개 유전자에 대한 임상병리학적 특징과 발현 분석결과
Figure 112018008997321-pat00007
<실시예 2>
전암성 병변에서 BANF1, PLODS3 및 SF3B4에 대한 간세포암 결정 마커로서의 검증
전암성 병변에서 간세포암에 대한 결정 마커로서 BANF1, PLODS3 및 SF3B4의 사용 가능성을 검증하기 위해, HGDN으로부터 전이된(transitioning) 6개의 조기 간세포암 전체 섹션을 이용하여 면역조직화학분석(IHC)을 수행하였다.
그 결과, 예상한 바와 같이 10개 후보 마커 중에서 BANF1, PLODS3 및 SF3B4이 조기 간세포암(eHCC) 및 HGDN에서 모두 강하게 과발현 또는 양성 발현되는 것으로 나타났다. 반면 비종양 부위에서는 1개만 양성발현되는 것으로 나타났다(도 4a 참조). 또한 나머지 6개의 마커는 재생 결절(regenerating nodules (RNs)) 내에서 비종양 조직 주변과 eHCC에서 유의한 차이를 보이지 않았다.
또한, 3개의 유전자인 GPC3, GS 및 HSP70은 DN, 간세포 선종 및 국소 결절 증식을 포함하는 다른 종양 병소와 eHCC의 구별이 가능한 것으로 알려져 있다. 이에 본 발명자들은 55 명의 조기 간암과 105 명의 RN을 포함한 70 개의 전체 섹션을 대상으로 3 개의 기존 마커 (CMs; GPC3, GS 및 HSP70)와 본 발명에서 새롭게 동정한 신규 마커 (NMs; BANF1, PLOD1, SF3B4)에 대해 비교 IHC 분석을 수행하였다.
그 결과, HCC에서 2개 이상의 종래 마커 유전자의 발현 양성율(≥2 (+) / 3 CM 이상)은 50.9 % (28/55)로 나타났고, 반면 HCC에서 본 발명에서 규명한 2개 이상의 신규 마커 유전자의 발현 양성율(2개 이상 (+) / 3 NM)은 72.7 % (40/55)로 나타났다(도 4b 및 표 8 참조). 또한 HCC에서 종래 마커의 음성 발현율(≤1 (+) / 3 CM)은 49.1 % (27/55) 였고, 본 발명의 신규 마커의 음성 발현율(≤1 (+) / 3 NMs)은 27.3 % (15/ 55)인 것으로 나타났다.
[표 8]
기존마커와 본 발명의 신규마커에 대한 조기 간세포암에서의 발현양상 분석 결과
Figure 112018008997321-pat00008
또한, 특히 종래마커의 음성발현을 보인 HCC에서 신규 마커의 양성 발현율은 59.3%(16/27)인 것으로 나타났고, 신규마커의 음성 발현을 보인 HCC에서 종래 마커의 양성 발현율은 26.6%(4/15)인 것으로 나타났다(도 4c 참조). 그러나 RNs에서 종래마커와 신규 마커들 간의 음성적인 비율에는 유의한 차이가 없는 것으로 나타났다(도 4d 참조).
나아가 ROC 곡선 비교 분석 결과, 본원의 신규 마커들이(BANF1, PLOD1, SF3B4) 기존 마커(GPC3, GS 및 HSP70)에 비해 더 우수한 마커라는 것을 확인할 수 있었다(표 9 및 도 5 참조).
[표 9]
ROC 곡선평가에 의한 조기 HCC 진단용 6개 마커의 진단 성능 분석결과
Figure 112018008997321-pat00009
뿐만 아니라, 특히 2세트의 조합 (HSP70, GPC3, BANF1 및 SF3B4)을 사용한 경우, 전암성 병변에서 가장 민감하고 특이적으로 간세포암의 조기 진단이 가능함을 알 수 있었다(하기 표 10 및 도 4e 참조).
[표 10]
기존마커, 본 발명의 신규마커 및 조합마커에 대한 조기 간암과 재생 결절 간의 ROC 분석 결과
Figure 112018008997321-pat00010
또한 HCC 환자의 Kaplan-Meier 생존 곡선 (코호트 2) 분석을 통해, 본 발명의 신규 마커 유전자들의 높은 발현을 보인 간세포암 환자의 무병 생존율이 본 발명의 신규 마커 유전자들의 발현 수준이 낮은 환자보다 유의하게 낮은 것으로 나타났고(도 4f), 이를 통해 본 발명의 신규 마커 유전자들이 HCC의 초기 단계를 유도할 수 있음을 알 수 있었다.
<실시예 3>
간세포암에서의 BANF1, PLODS3 및 SF3B4의 과발현과 이들의 활성 억제를 통한 항암 효과 분석
<3-1> 간세포암에서의 BANF1, PLODS3 및 SF3B4 과발현 확인
HCC에서의 BANF1, PLOD3 및 SF3B4의 비정상적인 조절은 TCGA_LIHC 데이터 세트 코호트에서 HCC 환자 50쌍과 일치된 쌍으로 확인되었고, 추가로 HCC 조직에서 무작위로 선택된 13 세트를 추가로 qRT-PCR 분석하였다(도 6a 참조).
그 결과, PLOD3과 SF3B4는 인접한 비종양 간 조직 (NL)과 비교하여 13개의 HCC 중에서 9-12개에서 (69-92 %)에서 과발현 되었다 (> 2 배 이상으로 과발현됨). 또한 NL을 가진 eHCC 6 쌍과 인접한 DN 및 NL을 갖는 3 쌍의 eHCC에 대한 웨스턴 블랏 분석 결과, eHCC에서 BANF1, PLOD3 및 SF3B4 단백질이 월등히 높은 발현 수준을 나타내었다(도 6b 참조).
다음으로, GEO 데이터베이스에서 이용 가능한 화학적으로 유도된 마우스 및 쥐 HCC 모델에서 Banf1, Plod3 및 Sf3b4 발현을 재구성하였다.
그 결과, 도 6c에 나타낸 바와 같이, Banf1, Plod3 및 Sf3b4의 발현은 마우스 및 쥐 모델 모두 상피 종양 (AD), eHCC 및 진행성 HCC (aHCC)에서 상응하는 NL의 상향 조절을 나타내었다.
이러한 결과 검증을 위해, H-ras 형질 전환 마우스와 DEN(diethylnitrosamine)으로 유도 쥐 HCC 모델을 제조한 후, 웨스턴 블럿을 통해 이들 동물 군에서의 BANF1, PLOD3 및 SF3B4 발현을 조사하였다.
그 결과, 도 6d에 나타낸 바와 같이, 이들 모두 3가지 마커들의 발현이 증가된 것으로 나타났다.
<3-2> BANF1, PLODS3 및 SF3B4 억제에 따른 암세포의 증식 및 집락형성 억제 다음으로, 간암 발생 과정에서 BANF1, PLOD3, SF3B4의 생물학적 기능을 알아보기 위해 RNAi와 3- (4,5-dimethylthiazol-2-yl) -2,5-diphenyltetrazolium bromide (MTT) 분석을 이용하여 각 유전자를 넉다운 시키고, 세포 성장 속도를 측정하였다. 또한, BrdU(bromodeoxyuridine) 도입 및 집락형성 분석(clonogenic assay)은 SNU-449 HCC 세포의 증식 속도를 측정하기 위해 수행하였다.
그 결과, 각각 BANF1, PLOD3 및 SF3B4을 넉다운 시킨 경우, SNU-449 HCC 세포의 성장과 증식이 억제되는 것으로 나타났고(도 6e 및 6f), BANF1, PLOD3 및 SF3B4은 간세포암의 임상병리학적 특성에서 혈관침윤 및 분화와 같은 암 전이성과 관련되어 있는 것으로 나타났다(표 1 참조).
<3-3> BANF1, PLODS3 및 SF3B4 억제에 따른 암 전이 억제효과 분석 인 비트로에서 세포이동성 및 침윤 분석을 수행하여 이들 본 발명에 따른 신규 마커들이 HCC의 암 전이에 영향을 미치는지 분석하였다.
그 결과, 각각 BANF1, PLOD3 및 SF3B4을 넉다운시킨 군에 대한 변형된 Boyden chamber 분석 결과, SNU-449 세포의 혈청 자극에 의한 세포 이동 및 침윤 현상이 유의적으로 억제되는 것으로 나타났고(도 7a), 유사하게 상처 치유 분석에서도 BANF1, PLOD3 및 SF3B4을 각각 넉다운시킨 군의 경우, 혈청 자극에 의한 SNU-449 세포의 상처치유 효과가 감소되는 것으로 나타났다(도 7b 참조).
나아가 본 발명에 따른 신규 마커들이 EMT에도 영향을 미치는지 확인하기 위해, EMT 조절인자들에 대한 발현 변화를 웨스턴 블럿을 통해 분석하였다. EMT의 전형적인 마커인 N-cadherin, Fibronectin, Snail 및 Slug들이 본 발명의 유전자를 각각 넉다운 시킨 결과, 현저하게 이들 발현이 감소된 것으로 나타났다. 반면, 상피세포 마커인 Ecadherin은 동일 세포에서 증가한 것으로 나타났다(도 7c 참조). 이러한 결과를 통해 본 발명자들은 본 발명에 따른 BANF1, PLOD3 및 SF3B4이 간세포암에서 EMT 조절인자들의 발현을 선택적으로 조절하며 암 전이능을 갖는다는 것을 알 수 있었다.
<3-4> In vivo에서 BANF1, PLODS3 및 SF3B4 억제에 따른 항암 활성 분석 BANF1, PLODS3 및 SF3B4 억제에 따른 항암 활성 여부를 확인하기 위해, BANF1, PLODS3 및 SF3B4 유전자들이 각각 넉다운 시킨 종양 세포를 가슴샘이 없는 누드 마우스에 피하 주입시키고, 이후 종양의 성장과 종양의 부피를 측정하였는데, 그 결과, BANF1, PLODS3 및 SF3B4를 각각 넉다운 시킨 세포를 주입한 군이 대조군인 si-Cont를 처리한 세포를 주입한 군에 비해 종양의 성장과 종양의 부피가 월등히 감소한 것으로 나타났다.
또한, 대조군 세포주를 쥐에 주입 후, 50일이 경과한 시점에서 분석한 결과, 10마리 중, 6마리가 종양이 형성된 것으로 나타난 반면, BANF1, PLODS3 또는 SF3B4이 넉다운된 세포주를 쥐에 주입한 군에서는 10마리 중 0~2마리만이 종양이 미약하게 발생한 것으로 나타났다(도 7d).
또한, BANF1, PLOD3 및 SF3B4에 대한 특이적인 si-RNA 전달을 통해 항암 효과를 유도하기 위한 방법으로, 매우 큰 기공을 갖는 메조 포러스 실리카 나노 입자 (MSNs)를 사용하였다. 먼저 12~15주령의 간세포암이 자발적으로 발달된 H-ras 형질전환 마우스를 준비하였다. BANF1, PLOD3 및 SF3B4을 타겟으로 하는 si-RNAs 들을 함유한 메조 포러스 실리카 나노 입자 (MSN_si-RNA)를 상기 준비한 마우스에 주입하고 확인하였으며, 이때 대조군으로는 si-RNA가 없는 MSN만이 주입된 마우스군을 사용하였고, 마우스 간에서의 간세포암은 출생 후 16 주부터 희생되는 시점인 23 주까지 초음파 검사를 통해 분석하였다.
그 결과, MSN만이 주입된 대조군은 17주째에 4마리 중 3마리에서 간세포암이 발견되었으며, 반면 MSN_si-RNA를 주입한 군은 19주째에 4마리 중 2마리에서 작은 간세포암이 발견되었다(도 7e 참조). 웨스턴 블럿 결과, MSN_si-RNA를 주입한 군에서는 BANF1, PLOD3 및 SF3B4이 대조군에 비해 각각 넉다운 되어 있음을 확인함으로써, MSN_si-RNA에 의해 타겟 유전자들이 정확하게 발현 억제됨을 알 수 있었다(도 7f 참조).
따라서 이러한 결과를 통해 본 발명자들은 BANF1, PLOD3 및 SF3B4의 발현 또는 활성을 억제할 수 있는 물질들은 간암, 특히 간세포암의 치료제로 사용 가능함을 알 수 있었다.
<실시예 4>
SF3B4의 억제에 따른 간세포암 종양 발생 억제분석
HCC에서의 임상적 관련성을 조사하기 위해 TCGA_LIHC에서 360명의 HCC 환자의 BANF1, PLOD3 및 SF3B4의 변화 빈도를 평가했다. BANF1, PLOD3 및 SF3B4의 과발현은 360명 환자 중에서 140명에게 나타났다(도 9a 참조). Kaplan-Meier 생존 곡선은 BANF1, PLOD3 및 SF3B43의 상향 조절을 가진 HCC 환자의 전반적인 생존율 (OS)과 무병 생존율 (DFS)이 모두 정상 발현을 보이는 간세포암 환자 군에 비해 낮게 나타났다(OS; Logrank P = 0.002, DFS; Logrank P = 0.001, 도 9b 참조).
또한, 흥미롭게도 이들 유전자 중에서 오로지 SF3B43만 과발현되는 군은 HCC 환자의 전반적인 생존율 (OS)과 무병 생존율 (DFS)이 매우 낮은 것으로 나타났다(도 9c 참조). SF3B43의 증폭은 OS 및 DFS의 간세포암 환자에 매우 나쁜 결과를 초래하는 것으로 나타났고, 이는 SF3B43의 증폭이 간암 발생에서 SF3B43의 기작을 활성화시킨다는 것을 예상할 수 있었다(도 9d~9f).
SF3B4는 6개의 SF3b(splicing factor 3b) 복합체 중에 하나로, U2 snRNP super-complex에서 중요한 단백질이다. TCGA_LIHC and GEO databases에서 SF3b(splicing factor 3b) 복합체의 6개 서브유닛에 대한 발현 수준 및 변화 빈도를 분석한 결과, SF3B4만이 간세포암에서 특이적으로 과발현되어 있고 유전자 카피수가 증폭되어 있는 것으로 나타났다(도 10a 및 10b).
또한 10개의 다른 종류의 간 세포주, MIHA 불멸화 정상 간세포주 및 8개의 인간 간세포암 세포주를 대상으로 qRT-PCR로 SF3B4의 발현수준을 분석하였는데, 그 결과, MIHA 세포주에 비해 간세포암의 세포주에서 SF3B4의 mRNA와 단백질이 모두 과발현되어 있는 것으로 나타났다(도 10c 참조). 나아가 SF3B4의 발현 억제 결과, SNU-449 and SNU-368 HCC 세포의 세포 성장 및 증식은 모두 억제되는 것으로 나타났다(도 11a , 11b).
변형된 Boyden chamber 분석 및 상처 치유 분석의 결과에서도 SF3B4 넉다운 시, 동일 세포주의 암전이성 특징이 모두 억제되는 것으로 나타났다(도 11c 및 11d).
EMT에 관여하는 단백질들의 발현에 미치는 영향을 웨스턴블럿을 통해 확인한 결과, 간세포암 세포주에서 SF3B4 넉다운 시 N-cadherin, Fibronectin, Snail 및 Slug이 모두 억제되는 것으로 나타났고, E-cadherin만이 과발현되는 것으로 나타났다(도 11e).
앞서 실험 결과에 의하면, 간세포암에서는 SF3B4의 유전자 및 단백질이 과발현되고 있는 것으로 나타남에 따라, 100명의 HCC 환자의 코호트(GSE16757)에서 SF3B4의 발현과 예후에 대한 관련성을 분석하였다.
SF3B4 발현과 높은 상관 관계를 보이는 발현 패턴을 가진 유전자 (n = 342)를 군집 분석을 위해 선택하였다 (P <0.001, r> 0.5 또는 r <-0.5). 환자들은 SF3B4 high cluster (SF3B4_high) 그룹 또는 SF3B4 low cluster (SF3B4_low) 그룹으로 나누었다. HCC 환자의 Kaplan-Meier 생존 곡선은 SF3B4 발현이 높은 환자의 5 년 OS 비율이 SF3B4 발현이 낮은 환자보다 유의하게 낮았다 (P = 0.014, 도 10d).
다음으로, SF3B4 관련 유전자 표지의 생물학적 관련성을 조사하기 위해 Molecular Signatures Database (MsigDB)에서 SF3B4 관련 유전자 표지와 관련된 신호 전달 경로를 확인하기 위해 GSEA(gene set enrichment analysis)을 수행하였다.
KEGG_CELL_CYCLE은 매우 의미있는 유전자 세트로 확인되었다(도 10e). 또한 유세포분석 결과에 의하면, SF3B4이 넉다운된 간세포암 세포주에서는 G1기의 세포수가 현저하게 증가하였고, 동시에 S 기와 G2 / M 기의 세포수는 감소한 것으로 나타났다. 반면 SF3B4의 넉다운은 세포 사멸 과정에는 영향을 미치지 않았다(도 10f 및 도 11f).
<실시예 5>
SF3B4의 KLF4에 대한 비정상적인 스플라이싱 작용 및 간세포암 유도
간세포암 발생과정에서 SF3B4의 생물학적 역할 규명을 위해 SF3B4 넉다운에 의한 spliceosome 활성을 조사하였다. SF3B4 넉다운 SF3b 복합체에 의해 조절되는 대표적인 분자인 VEGF의 발현을 억제하는 반면, VEGF mRNA의 비스플라이싱 형태(VEGF pre-mRNA)는 HeLa 세포에서 SF3B4 넉다운에 의해 증가되었다(도 12a).
SF3b 복합체의 억제제인 Spliceostatin A (SSA)를 처리한 경우, VEGF 단백질 발현 억제가 SF3b 복합체의 스플라이싱 활성 억제에 관여함이 밝혀졌고, 두 개의 다른 HCC 세포주에서 동일한 결과로 나타났다. SF3B4 넉다운 SSA의 처리는 HCC 세포주의 종양 세포 성장을 억제하는 것으로 나타났다(도 13a).
세포주기 조절 단백질에 대한 웨스턴 블럿은 SF3B4를 타겟팅 한 암세포 성장 억제의 기작을 확인하기 위해 수행하였다. SF3B4 넉다운은 CDK4, CDK2, cyclin D1 및 cyclin E의 발현을 억제하고 동시에 HCC 세포주에서 p27Kip1을 유도하였으며, SSA 처리는 동일한 세포에서 이러한 결과를 반복적으로 나타났다(도 12b). 이러한 결과는 SF3B4 과발현이 p27Kip1을 포함한 음성 세포주기 조절 인자의 억제를 유도하고 동시에 HCC 세포의 세포주기 전이(transition)에서 특이적 조절인자인 CDK4, CDK2, cyclinD1, cyclin E의 발현을 유도함을 시사한다. 간세포암에서 SF3B4 넉다운은 pRb의 인산화 억제(hypophosphorylation)를 유도한다.
다음으로, HCC 세포에서 비정상적인 발현 SF3B4의 직접 표적을 조사하기 위해, SF3B4 넉다운 HepG2 세포의 차세대 시퀀싱 (NGS) -RNA 서열 데이타를 분석하였다. 이 데이터 세트는 GEO 데이터베이스 (GSE80861)에서 구할 수 있으며 ENCODE 프로젝트 (the Encyclopedia of DNA Element)의 일부로 수행하였다. 이 분석은 SF3B4 넉다운 세포에서 특이적인 발현양상을 보이는 유전자 (DEG; differentially expressed genes)들 3,182 개의 유전자를 확인하였다(대조군에 비해 1.5 배 이상 차이). SF3B4 넉다운 관련된 AS 현상을 확인하기 위해, paired-end reads를 ENCODE 데이터베이스에 매핑하고 MATS (Multivariate Analysis of Transcript Splicing Analysis) 분석 도구를 사용하여 엑손 포함을 정량화하였다.
분석 결과, 스킵된 엑손 (SE), 유지된 인트론 (RI), 대안 3 '스플라이싱 사이트(A3SS), 대안 5' 스플라이싱 사이트 (A5SS) 및 상호 배타적인 엑손 (MXE)과 같이 6개의 서로 다른 스플라이싱 현상이 일어나는 것으로 분석되었다(도 12c). 또한, 2가지 이상의 AS 사건과 함께 이 두 가지 분석을 조합하면 SF3B4가 넉다운된 HepG2 세포에서 8개의 유전자가 현저하게 전사가 억제된 것으로 나타났다(도 13b).
이를 보다 명확하게 확인하기 위해, 8개의 유전자를 TCGA_LIHC 데이터셋에 적용하였고, 이 중에서 4개의 유전자인 GRIP, PLP1, KLF4 및 KRT80을 SF3B4의 타겟 후보 유전자로 선택하였다(도 12d). 특이하게 KLF4만이 SF3B4가 넉다운된 2개의 간세포암 세포주에서 활성화 되어 있는 것으로 나타났다(도 12e 및 도 13c 참조).
8개의 유전자들 중에서 KLF4과 SF3B4은 간세포암에서 서로 유의미한 음성적인 상관관계를 보였다(도 13d 및 13e). 이러한 결과는 SF3B4 넉다운이 야생형 KLF4의 전사 발현의 회복을 유도하고, HCC 세포에 대한 항종양 효과를 나타냄을 의미하며, 실제로, NGS-RNA 분석은 HCC 조직에서 야생형 KLF4의 전사체가 억제되어 있는 것으로 나타났으며, 간세포암 환자에서는 KLF4 SE 전사체가 증가되어 있는 것으로 나타났다(도 12f).
나아가 본 발명자들은 SF3B4 과발현이 SF3b 복합체를 유발하여 KLF4 전사 체를 스플라이싱하여 비기능성 AS 전사체가 되도록 하는지 확인하기 위해, SF3B4 넉다운되고 KLF4가 이소성 발현(ectopic expression)되는 플라스미드를 간세포암 세포주에 적용하여 분석하였다.
이후 SF3B4가 넉다운되고 KLF4가 과발현되는 세포에서 SF3B4의 조절인자 인 p27Kip1과 Slug을 관찰하였다.
그 결과, 예상대로 KLF4의 이소성 발현은 동일한 세포에서 SF3B4 넉다운의 효과를 나타내었다(도 14a).
다음으로, SF3B4 활성화가 HCC 세포에서 KLF4 전사 활성을 통해 p27Kip1 및 Slug 발현을 직접적으로 조절하는지를 조사하기 위해, p27Kip1 또는 slug-promoter를 갖는 루시퍼라제 리포터 플라스미드를 제조하고 SNU-449 세포로 형질 감염시켰고, 동시에 SF3B4 특이적인 siRNA 또는 KLF4 플라스미드를 형질감염시켰다.
그 결과, p27Kip1 프로모터 형질 감염체의 루시퍼라제 활성은 SF3B4 넉다운 세포주 및 KLF4 과발현 세포주 모두에서 유의하게 증가하였으며, Slug- 프로모터 형질 감염체의 루시퍼라제 활성은 동일한 세포에서 유의하게 억제되었다(도 14b).
이후 SF3B4 넉다운이 KLF4의 발현 유도와 동시에 KLF4, Liver-KLF4-iso1 및 Liver-KLF4-iso2의 다양한 스플라이싱 이성질체를 억제하는지 확인하였다.
직접적인 시퀀싱 분석으로 야생형 KLF4 전사체에서 스킵된 엑손 전사체가 생성되었음을 확인하였다(도 14c).
마지막으로, SF3B4의 불활성화가 생체 내에서 종양억제자인 KLF4의 회복을 통해 종양 억제 효과를 유발하는지 확인하기 위해, SF3B4 넉다운 및 KLF4 과발현 세포를 흉선 누드 마우스에 피하 주사 하였다.
그 결과, SF3B4 넉다운과 KLF4를 발현하는 SNU-449 세포 모두에서 전체적으로 종양 성장 속도와 희생시의 평균 체적이 유의하게 감소했다(도 14d). 또한, 면역블럿 분석에서는 SF3B4 넉다운 및 KLF4가 발현하는 이종 이식 조직 모두에서 KLF4의 유도를 확인할 수 있었다(도 14e).
따라서 이상과 같은 실험 결과를 통해 본 발명자들은 초기 간암을 정확하게 예측할 수 있는 바이오마커로서 BANF1, PLOD3 및 SF3B4를 사용할 수 있음을 알 수 있었고, 특히 이들 마커를 단일로 사용하는 것에 비해 2개 이상으로 조합하여 사용할 경우, 진단 정확도가 더 높은 것을 알 수 있었으며, 특히 이들 마커는 전암성 병변 시료에서 확인할 수 있다는 특징이 있다.
뿐만 아니라 SF3B4의 경우, 간암 발병시 KLF4의 발현 및 활성을 억제하여 간암을 진행 및 유발시키는 것을 알 수 있었고, SF3B4 발현을 억제할 경우, KLF4의 발현 증가를 통해 항암 활성을 유도할 수 있음을 알 수 있었다.
이제까지 본 발명에 대하여 그 바람직한 실시예들을 중심으로 살펴보았다. 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자는 본 발명이 본 발명의 본질적인 특성에서 벗어나지 않는 범위에서 변형된 형태로 구현될 수 있음을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 개시된 실시예들은 한정적인 관점이 아니라 설명적인 관점에서 고려되어야 한다. 본 발명의 범위는 전술한 설명이 아니라 특허청구범위에 나타나 있으며, 그와 동등한 범위 내에 있는 모든 차이점은 본 발명에 포함된 것으로 해석되어야 할 것이다.
<110> THE CATHOLIC UNIVERSITY OF KOREA INDUSTRY-ACADEMIC COOPERATION FOUNDATION <120> Biomarker for early diagnosis of hepatocellular carcinoma in precancerous lesion and use thereof <130> PN1706-209 <160> 42 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 1179 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> BANF1 cDNA sequence <400> 1 ccagtgttcc cagttcccac cagtccaact gcgaggagtg cgacgtgagt ctgagtctga 60 tccctccgaa aaccgtactt ccggcgctgt ctcggaggcc tcccgtcccc tcccttgtcc 120 gtcttctaac tcttccccac gccaggtccg tcaagcctaa gtccttgagt tccgggtccg 180 ggcagcagag aaaggaagtc ctctccctgg aggcctatct ccctcagaac tgcgcgagaa 240 gcgagacctt agaaggcagg gcttcccgcg aaggaccgga aaggagcgcc tactaaggac 300 gccgtcgagg tccggggcgc ctcaactcta tagctctaac tggctagaag tgcccaacgt 360 ggaatgtttc ttttttaaag gcggctcttg aagcgacccg gaagcggaag tggaagaaag 420 ttctagtggc ttgaggtatc cgcaggagcg gccgggtggc gggaggaacc gttacgggaa 480 ctgaagttgc ggattaagcc tgatcaagat gacaacctcc caaaagcacc gagacttcgt 540 ggcagagccc atgggggaga agccagtggg gagcctggct 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600 accgaggggt acctgcgttt cctgcgctct gcggagttct tcaactacac tgtgcggacc 660 ctgggcctgg gagaggagtg gcgagggggt gatgtggctc gaacagttgg tggaggacag 720 aaggtccggt ggttaaagaa ggaaatggag aaatacgctg accgggagga tatgatcatc 780 atgtttgtgg atagctacga cgtgattctg gccggcagcc ccacagagct gctgaagaag 840 ttcgtccaga gtggcagccg cctgctcttc tctgcagaga gcttctgctg gcccgagtgg 900 gggctggcgg agcagtaccc tgaggtgggc acggggaagc gcttcctcaa ttctggtgga 960 ttcatcggtt ttgccaccac catccaccaa atcgtgcgcc agtggaagta caaggatgat 1020 gacgacgacc agctgttcta cacacggctc tacctggacc caggactgag ggagaaactc 1080 agccttaatc tggatcataa gtctcggatc tttcagaacc tcaacggggc tttagatgaa 1140 gtggttttaa agtttgatcg gaaccgtgtg cgtatccgga acgtggccta cgacacgctc 1200 cccattgtgg tccatggaaa cggtcccact aagctgcagc tcaactacct gggaaactac 1260 gtccccaatg gctggactcc tgagggaggc tgtggcttct gcaaccagga ccggaggaca 1320 ctcccggggg ggcagcctcc cccccgggtg tttctggccg tgtttgtgga acagcctact 1380 ccgtttctgc cccgcttcct gcagcggctg ctactcctgg actatccccc cgacagggtc 1440 acccttttcc tgcacaacaa cgaggtcttc catgaacccc acatcgctga ctcctggccg 1500 cagctccagg accacttctc agctgtgaag ctcgtggggc cggaggaggc tctgagccca 1560 ggcgaggcca gggacatggc catggacctg tgtcggcagg accccgagtg tgagttctac 1620 ttcagcctgg acgccgacgc tgtcctcacc aacctgcaga ccctgcgtat cctcattgag 1680 gagaacagga aggtgatcgc ccccatgctg tcccgccacg gcaagctgtg gtccaacttc 1740 tggggcgccc tgagccccga tgagtactac gcccgctccg aggactacgt ggagctggtg 1800 cagcggaagc gagtgggtgt gtggaatgta ccatacatct cccaggccta tgtgatccgg 1860 ggtgataccc tgcggatgga gctgccccag agggatgtgt tctcgggcag tgacacagac 1920 ccggacatgg ccttctgtaa gagctttcga gacaagggca tcttcctcca tctgagcaat 1980 cagcatgaat ttggccggct cctggccact tccagatacg acacggagca cctgcacccc 2040 gacctctggc agatcttcga caaccccgtc gactggaagg agcagtacat ccacgagaac 2100 tacagccggg ccctggaagg ggaaggaatc gtggagcagc catgcccgga cgtgtactgg 2160 ttcccactgc tgtcagaaca aatgtgtgat gagctggtgg cagagatgga gcactacggc 2220 cagtggtcag gcggccggca tgaggattca aggctggctg gaggctacga gaatgtgccc 2280 accgtggaca tccacatgaa gcaggtgggg tacgaggacc agtggctgca gctgctgcgg 2340 acgtatgtgg gccccatgac cgagagcctg tttcccggtt accacaccaa ggcgcgggcg 2400 gtgatgaact ttgtggttcg ctaccggcca gacgagcagc cgtctctgcg gccacaccac 2460 gactcatcca ccttcaccct caacgttgcc ctcaaccaca agggcctgga ctatgaggga 2520 ggtggctgcc gcttcctgcg ctacgactgt gtgatctcct ccccgaggaa gggctgggca 2580 ctcctgcacc ccggccgcct cacccactac cacgaggggc tgccaacgac ctggggcaca 2640 cgctacatca tggtgtcctt tgtcgacccc tgacactcaa ccactctgcc aaacctgccc 2700 tgccattgtg cctttttagg gggcctggcc cccgtcctgg gagttggggg atgggtctct 2760 ctgtctcccc acttcctgag ttcatgttcc gcgtgcctga actgaatatg tcaccttgct 2820 cccaagacac ggccctctca ggaagctccc ggagtccccg cctctctcct ccgcccacag 2880 gggttcgtgg gcacagggct tctggggact ccccgcgtga taaattatta atgttccgca 2940 gtctcactct gaataaagga cagtttgtaa gtcttgaaaa aaaaaaaaaa aaaaa 2995 <210> 4 <211> 738 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> PLOD3 Amino acid sequence <400> 4 Met Thr Ser Ser Gly Pro Gly Pro Arg Phe Leu Leu Leu Leu Pro Leu 1 5 10 15 Leu Leu Pro Pro Ala Ala Ser Ala Ser Asp Arg Pro Arg Gly Arg Asp 20 25 30 Pro Val Asn Pro Glu Lys Leu Leu Val Ile Thr Val Ala Thr Ala Glu 35 40 45 Thr Glu Gly Tyr Leu Arg Phe Leu Arg Ser Ala Glu Phe Phe Asn Tyr 50 55 60 Thr Val Arg Thr Leu Gly Leu Gly Glu Glu Trp Arg Gly Gly Asp Val 65 70 75 80 Ala Arg Thr Val Gly Gly Gly Gln Lys Val Arg Trp Leu Lys Lys Glu 85 90 95 Met Glu Lys Tyr Ala Asp Arg Glu Asp Met Ile Ile Met Phe Val Asp 100 105 110 Ser Tyr Asp Val Ile Leu Ala Gly Ser Pro Thr Glu Leu Leu Lys Lys 115 120 125 Phe Val Gln Ser Gly Ser Arg Leu Leu Phe Ser Ala Glu Ser Phe Cys 130 135 140 Trp Pro Glu Trp Gly Leu Ala Glu Gln Tyr Pro Glu Val Gly Thr Gly 145 150 155 160 Lys Arg Phe Leu Asn Ser Gly Gly Phe Ile Gly Phe Ala Thr Thr Ile 165 170 175 His Gln Ile Val Arg Gln Trp Lys Tyr Lys Asp Asp Asp Asp Asp Gln 180 185 190 Leu Phe Tyr Thr Arg Leu Tyr Leu Asp Pro Gly Leu Arg Glu Lys Leu 195 200 205 Ser Leu Asn Leu Asp His Lys Ser Arg Ile Phe Gln Asn Leu Asn Gly 210 215 220 Ala Leu Asp Glu Val Val Leu Lys Phe Asp Arg Asn Arg Val Arg Ile 225 230 235 240 Arg Asn Val Ala Tyr Asp Thr Leu Pro Ile Val Val His Gly Asn Gly 245 250 255 Pro Thr Lys Leu Gln Leu Asn Tyr Leu Gly Asn Tyr Val Pro Asn Gly 260 265 270 Trp Thr Pro Glu Gly Gly Cys Gly Phe Cys Asn Gln Asp Arg Arg Thr 275 280 285 Leu Pro Gly Gly Gln Pro Pro Pro Arg Val Phe Leu Ala Val Phe Val 290 295 300 Glu Gln Pro Thr Pro Phe Leu Pro Arg Phe Leu Gln Arg Leu Leu Leu 305 310 315 320 Leu Asp Tyr Pro Pro Asp Arg Val Thr Leu Phe Leu His Asn Asn Glu 325 330 335 Val Phe His Glu Pro His Ile Ala Asp Ser Trp Pro Gln Leu Gln Asp 340 345 350 His Phe Ser Ala Val Lys Leu Val Gly Pro Glu Glu Ala Leu Ser Pro 355 360 365 Gly Glu Ala Arg Asp Met Ala Met Asp Leu Cys Arg Gln Asp Pro Glu 370 375 380 Cys Glu Phe Tyr Phe Ser Leu Asp Ala Asp Ala Val Leu Thr Asn Leu 385 390 395 400 Gln Thr Leu Arg Ile Leu Ile Glu Glu Asn Arg Lys Val Ile Ala Pro 405 410 415 Met Leu Ser Arg His Gly Lys Leu Trp Ser Asn Phe Trp Gly Ala Leu 420 425 430 Ser Pro Asp Glu Tyr Tyr Ala Arg Ser Glu Asp Tyr Val Glu Leu Val 435 440 445 Gln Arg Lys Arg Val Gly Val Trp Asn Val Pro Tyr Ile Ser Gln Ala 450 455 460 Tyr Val Ile Arg Gly Asp Thr Leu Arg Met Glu Leu Pro Gln Arg Asp 465 470 475 480 Val Phe Ser Gly Ser Asp Thr Asp Pro Asp Met Ala Phe Cys Lys Ser 485 490 495 Phe Arg Asp Lys Gly Ile Phe Leu His Leu Ser Asn Gln His Glu Phe 500 505 510 Gly Arg Leu Leu Ala Thr Ser Arg Tyr Asp Thr Glu His Leu His Pro 515 520 525 Asp Leu Trp Gln Ile Phe Asp Asn Pro Val Asp Trp Lys Glu Gln Tyr 530 535 540 Ile His Glu Asn Tyr Ser Arg Ala Leu Glu Gly Glu Gly Ile Val Glu 545 550 555 560 Gln Pro Cys Pro Asp Val Tyr Trp Phe Pro Leu Leu Ser Glu Gln Met 565 570 575 Cys Asp Glu Leu Val Ala Glu Met Glu His Tyr Gly Gln Trp Ser Gly 580 585 590 Gly Arg His Glu Asp Ser Arg Leu Ala Gly Gly Tyr Glu Asn Val Pro 595 600 605 Thr Val Asp Ile His Met Lys Gln Val Gly Tyr Glu Asp Gln Trp Leu 610 615 620 Gln Leu Leu Arg Thr Tyr Val Gly Pro Met Thr Glu Ser Leu Phe Pro 625 630 635 640 Gly Tyr His Thr Lys Ala Arg Ala Val Met Asn Phe Val Val Arg Tyr 645 650 655 Arg Pro Asp Glu Gln Pro Ser Leu Arg Pro His His Asp Ser Ser Thr 660 665 670 Phe Thr Leu Asn Val Ala Leu Asn His Lys Gly Leu Asp Tyr Glu Gly 675 680 685 Gly Gly Cys Arg Phe Leu Arg Tyr Asp Cys Val Ile Ser Ser Pro Arg 690 695 700 Lys Gly Trp Ala Leu Leu His Pro Gly Arg Leu Thr His Tyr His Glu 705 710 715 720 Gly Leu Pro Thr Thr Trp Gly Thr Arg Tyr Ile Met Val Ser Phe Val 725 730 735 Asp Pro <210> 5 <211> 2001 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> SF3B4 cDNA sequence <400> 5 aaatcagggt tgtgaggcca aatctgcaag aaggctgcag gcgagaggga aggctccctc 60 tgcgcctgaa agcccccaag tcctcgggtt ggggggaact cttcagcaca tccttctctg 120 gacaacagaa gaagaatcac tgtccacaaa atatattaaa actgaaattt ttgttctttt 180 agctttcgaa tttacacttt tgagagcagt gtgattcttt caagtctagc agtgcattaa 240 gagggcctga gcgtttccgt tccgccctcc tcgctaagac aactagcagc ggcacctcag 300 gacgcgagcc gaggactcta ccgcccgacc caggttaagt ttcggaggct cctaagatgg 360 ctgcagccgc ttccaggcac ctcctcttcc gcggccccgc ccaccgctac gtccgtcttc 420 gccccggaag tggaagtcgt gctgaggtca gaaggcggaa ccgctgctgg gagacggcgg 480 gatctctttc gccatggctg ccgggccgat ctccgagcgg aatcaggatg ccactgtgta 540 cgtggggggc ctggatgaga aggttagtga accgctgctg tgggaactgt ttctccaggc 600 tggaccagta gtcaacaccc acatgccaaa ggatagagtc actggccagc accaaggcta 660 tggctttgtg gaattcttga gtgaggaaga tgctgactat gccattaaga tcatgaacat 720 gatcaaactc tatgggaagc caatacgggt gaacaaagca tcagctcaca acaaaaacct 780 ggatgtaggg gccaacattt tcattgggaa cctggaccct gagattgatg agaagttgct 840 ttatgatact ttcagcgcct ttggggtcat cttacaaacc cccaaaatta tgcgggaccc 900 tgacacaggc aactccaaag gttatgcctt tattaatttt gcttcatttg atgcttcgga 960 tgcagcaatt gaagccatga atgggcagta cctctgtaac cgtcctatca ccgtatctta 1020 tgccttcaag aaggactcca agggtgagcg ccatggctca gcagccgaac gacttctggc 1080 agctcagaac ccgctctccc aggctgatcg ccctcatcag ctgtttgcag atgcacctcc 1140 tccaccctct gctcccaatc ctgtggtatc atcattgggg tctgggcttc ctccaccagg 1200 catgcctcct cctggctcct tcccaccccc agtgccacct cctggagccc tcccacctgg 1260 gataccccca gccatgcccc caccacctat gcctcctggg gctgcaggac atggcccccc 1320 atcggcagga accccagggg caggacatcc tggtcatgga cactcacatc ctcacccatt 1380 cccaccgggt gggatgcccc atccagggat gtctcagatg cagcttgcac accatggccc 1440 tcatggctta ggacatcccc acgctggacc cccaggctct gggggccagc caccgccccg 1500 accaccacct ggaatgcctc atcctggacc tcctccaatg ggcatgcccc cccgagggcc 1560 tccattcgga tctcccatgg gtcacccagg tcctatgcct ccgcatggta tgcgtggacc 1620 tcctccactg atgccccccc atggatacac tggccctcca cgacccccac cctatggcta 1680 ccagcggggg cctctccctc cacccagacc cactccccgg ccaccagttc cccctcgagg 1740 cccacttcga ggccctctcc ctcagtaaat tcacattttc cttcctcctg ttacattttc 1800 ccaatatctt ttctattcct tggaccaatc agagatgctg tagctccttg gggcaaaggt 1860 actaatccct ttcagcaccc ccactccatt ccccttttta atgtaacttt ttccacagga 1920 ggtatttctt ttttatgttg gtcctgagta ttttgcaaat gcacagagaa aataaaacta 1980 aactccttgt ttaaaaaaaa a 2001 <210> 6 <211> 424 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> SF3B4 Amino acid sequence <400> 6 Met Ala Ala Gly Pro Ile Ser Glu Arg Asn Gln Asp Ala Thr Val Tyr 1 5 10 15 Val Gly Gly Leu Asp Glu Lys Val Ser Glu Pro Leu Leu Trp Glu Leu 20 25 30 Phe Leu Gln Ala Gly Pro Val Val Asn Thr His Met Pro Lys Asp Arg 35 40 45 Val Thr Gly Gln His Gln Gly Tyr Gly Phe Val Glu Phe Leu Ser Glu 50 55 60 Glu Asp Ala Asp Tyr Ala Ile Lys Ile Met Asn Met Ile Lys Leu Tyr 65 70 75 80 Gly Lys Pro Ile Arg Val Asn Lys Ala Ser Ala His Asn Lys Asn Leu 85 90 95 Asp Val Gly Ala Asn Ile Phe Ile Gly Asn Leu Asp Pro Glu Ile Asp 100 105 110 Glu Lys Leu Leu Tyr Asp Thr Phe Ser Ala Phe Gly Val Ile Leu Gln 115 120 125 Thr Pro Lys Ile Met Arg Asp Pro Asp Thr Gly Asn Ser Lys Gly Tyr 130 135 140 Ala Phe Ile Asn Phe Ala Ser Phe Asp Ala Ser Asp Ala Ala Ile Glu 145 150 155 160 Ala Met Asn Gly Gln Tyr Leu Cys Asn Arg Pro Ile Thr Val Ser Tyr 165 170 175 Ala Phe Lys Lys Asp Ser Lys Gly Glu Arg His Gly Ser Ala Ala Glu 180 185 190 Arg Leu Leu Ala Ala Gln Asn Pro Leu Ser Gln Ala Asp Arg Pro His 195 200 205 Gln Leu Phe Ala Asp Ala Pro Pro Pro Pro Ser Ala Pro Asn Pro Val 210 215 220 Val Ser Ser Leu Gly Ser Gly Leu Pro Pro Pro Gly Met Pro Pro Pro 225 230 235 240 Gly Ser Phe Pro Pro Pro Val Pro Pro Pro Gly Ala Leu Pro Pro Gly 245 250 255 Ile Pro Pro Ala Met Pro Pro Pro Pro Met Pro Pro Gly Ala Ala Gly 260 265 270 His Gly Pro Pro Ser Ala Gly Thr Pro Gly Ala Gly His Pro Gly His 275 280 285 Gly His Ser His Pro His Pro Phe Pro Pro Gly Gly Met Pro His Pro 290 295 300 Gly Met Ser Gln Met Gln Leu Ala His His Gly Pro His Gly Leu Gly 305 310 315 320 His Pro His Ala Gly Pro Pro Gly Ser Gly Gly Gln Pro Pro Pro Arg 325 330 335 Pro Pro Pro Gly Met Pro His Pro Gly Pro Pro Pro Met Gly Met Pro 340 345 350 Pro Arg Gly Pro Pro Phe Gly Ser Pro Met Gly His Pro Gly Pro Met 355 360 365 Pro Pro His Gly Met Arg Gly Pro Pro Pro Leu Met Pro Pro His Gly 370 375 380 Tyr Thr Gly Pro Pro Arg Pro Pro Pro Tyr Gly Tyr Gln Arg Gly Pro 385 390 395 400 Leu Pro Pro Pro Arg Pro Thr Pro Arg Pro Pro Val Pro Pro Arg Gly 405 410 415 Pro Leu Arg Gly Pro Leu Pro Gln 420 <210> 7 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> BANF1 Forward Primer <400> 7 gaaccgttac gggaactgaa 20 <210> 8 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> BANF1 Reverse Primer <400> 8 cccggaagag gtcttcatct 20 <210> 9 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PLOD3 Forward Primer <400> 9 cagctccagg accacttctc 20 <210> 10 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PLOD3 Reverse Primer <400> 10 gagcgggcgt agtactcatc 20 <210> 11 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> SF3B4 Forward Primer <400> 11 ctcagatgca gcttgcacac 20 <210> 12 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> SF3B4 Reverse Primer <400> 12 ggagggccag tgtatccat 19 <210> 13 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> VEGFA_exon1-2 Forward Primer <400> 13 tccaacttct gggctgttct 20 <210> 14 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> VEGFA_exon1-2 Reverse Primer <400> 14 atgattctgc cctcctcctt 20 <210> 15 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> VEGFA_intron1 Forward Primer <400> 15 tgtcaggtcc gcatgtcttg 20 <210> 16 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> VEGFA_intron1 Reverse Primer <400> 16 acccgcatca gatcattcct 20 <210> 17 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> KLF4 Forward Primer <400> 17 ttaccaagag ctcatgccac c 21 <210> 18 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> KLF4 Reverse Primer <400> 18 ggtgtgcctt gagatgggaa 20 <210> 19 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> KLF4-Full Forward Primer <400> 19 ttctgggccc ccacatta 18 <210> 20 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> KLF4-Full Reverse Primer <400> 20 tccactgtct gggatttaaa aatg 24 <210> 21 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> GRIP1 Forward Primer <400> 21 tgagagtccc tacactaaat ccg 23 <210> 22 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> GRIP1 Reverse Primer <400> 22 attcctcccg ataccgtcag a 21 <210> 23 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PLP1 Forward Primer <400> 23 acctatgccc tgaccgttg 19 <210> 24 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PLP1 Reverse Primer <400> 24 tgctggggaa ggcaatagac t 21 <210> 25 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> KRT80 Forward Primer <400> 25 tgatgggtga gtcggaatta 20 <210> 26 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> KRT80 Reverse Primer <400> 26 cttcccagga attccagata ca 22 <210> 27 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> GAPDH Forward Primer <400> 27 accaggtggt ctcctctgac 20 <210> 28 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> GAPDH Reverse Primer <400> 28 tgctgtagcc aaattcgttg 20 <210> 29 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Control Sense siRNA <400> 29 ccuacgccac caauuucgu 19 <210> 30 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Control Antisense siRNA <400> 30 acgaaauugg uggcguagg 19 <210> 31 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> BANF1 Sense siRNA <400> 31 aagaagcugg aggaaagggg u 21 <210> 32 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> BANF1 Antisense siRNA <400> 32 accccuuucc uccagcuucu u 21 <210> 33 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PLOD3 Sense siRNA <400> 33 gcaucuggag cuuucugua 19 <210> 34 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PLOD3 Antisense siRNA <400> 34 uacagaaagc uccagaugc 19 <210> 35 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> SF3B4 Sense siRNA <400> 35 gcaguaccuc uguaaccgu 19 <210> 36 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> SF3B4 Antisense siRNA <400> 36 acgguuacag agguacugc 19 <210> 37 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Banf1 Sense siRNA <400> 37 ccucagcguu ucaaucuuu 19 <210> 38 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Banf1 Antisense siRNA <400> 38 aaagauugaa acgcugagg 19 <210> 39 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Plod3 Sense siRNA <400> 39 cgacugcaga aucuccucu 19 <210> 40 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Plod3 Antisense siRNA <400> 40 agaggagauu cugcagucg 19 <210> 41 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Sf3b4 Sense siRNA <400> 41 cugcuuuacg auacuuuca 19 <210> 42 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Sf3b4 Antisense siRNA <400> 42 ugaaaguauc guaaagcag 19

Claims (13)

  1. 삭제
  2. 삭제
  3. BANF1, PLOD3 및 SF3B4로 이루어진 군 중에서 선택되는 하나 이상의 단백질 또는 이를 암호화하는 유전자의 mRNA 발현수준을 측정하는 제제를 포함하는, 조기 간암 진단용 조성물로서,
    상기 측정은 전암성 병변에서 측정하는 것을 특징으로 하는, 조기 간암 진단용 조성물.
  4. 제3항에 있어서,
    BANF1 유전자는 서열번호 1의 염기서열로 이루어진 것이고 BANF1 단백질은 서열번호 2의 아미노산 서열로 이루어진 것이며, PLOD3 유전자는 서열번호 3의 염기서열로 이루어진 것이고 PLOD3 단백질은 서열번호 4의 아미노산 서열로 이루어진 것이며, SF3B4 유전자는 서열번호 5의 염기서열로 이루어진 것이고 SF3B4 단백질은 서열번호 6의 아미노산 서열로 이루어진 것을 특징으로 하는, 조기 간암 진단용 조성물.
  5. 제3항에 있어서,
    상기 제제는 BANF1, PLOD3 또는 SF3B4에 특이적인 프라이머, 프로브, 앱타머, 항체 또는 기질인 것을 특징으로 하는, 조기 간암 진단용 조성물.
  6. 삭제
  7. 제3항에 있어서,
    상기 측정은 역전사 중합효소연쇄반응, 경쟁적 중합효소 연쇄반응, 실시간 중합효소 연쇄반응, Nuclease 보호 분석(RNase, S1 nuclease assay), in situ 교잡법, DNA 마이크로어레이 이용법, 노던 블랏, 웨스턴 블랏, ELISA(Enzyme Linked Immuno Sorbent Assay), 방사선 면역분석법, 면역 확산법, 면역 전기영동, 조직 면역염색, 면역침전 분석법, 보체 고정 분석법, FACS, 질량분석법(Mass spectrometry) 및 단백질 마이크로어레이 이용법 중에서 선택되는 방법으로 수행하는 것을 특징으로 하는, 조기 간암 진단용 조성물.
  8. 제3항에 따른 조성물을 포함하는, 조기 간암 진단용 키트.
  9. 삭제
  10. 삭제
  11. 환자로부터 분리된 전암성 병변 조직으로부터 BANF1, PLOD3 및 SF3B4로 이루어진 군 중에서 선택되는 하나 이상의 유전자에 대한 mRNA 또는 단백질의 발현수준을 측정하는 단계; 및
    상기 측정된 BANF1, PLOD3 또는 SF3B4의 발현수준을 대조군 시료의 발현수준과 비교하는 단계를 포함하는, 조기 간암 진단을 위한 정보제공 방법.
  12. 삭제
  13. 제11항에 있어서,
    BANF1, PLOD3 및 SF3B4로 이루어진 군 중에서 선택되는 하나 이상의 유전자에 대한 mRNA 또는 단백질의 발현수준이 대조군 시료의 발현수준 보다 증가한 경우, 간암이 발병된 것으로 판단하는 것을 특징으로 하는, 조기 간암 진단을 위한 정보제공 방법.
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