KR101984559B1

KR101984559B1 - 대상물의 분류를 위한 장치 및 분류 방법

Info

Publication number: KR101984559B1
Application number: KR1020177006398A
Authority: KR
Inventors: 마르티나 디 베네르
Original assignee: 스템 셀 에스.알.엘.
Priority date: 2014-08-20
Filing date: 2015-08-14
Publication date: 2019-05-31
Anticipated expiration: 2035-08-14
Also published as: SMT202300007T1; HUE060950T2; EP3183568B1; ES2936343T3; FI3183568T3; JP2017527281A; LT3183568T; SI3183568T1; JP6487035B2; US20170241959A1; RS63882B1; WO2016027204A1; PL3183568T3; HRP20230049T1; DK3183568T3; CN107076708A; US10788463B2; CN107076708B; EP4155725A1; PT3183568T

Abstract

본 발명은 유체 내의 분산상(dispersed phase)의 동적 분류(dynamic fractionation)를 위한 장치 및 방법에 관한 것이다. 상기 장치는 제1 내지 제3 주입 포트로부터 분류 채널을 포함한다. 제1 및 제2 구속 유체는 제1 및 제2 주입 포트 각각을 통해 주입가능하다. 상기 분산상을 반송하기 위한 용출 유체는 제1 및 제2 주입 포트들 사이에 배치된 제3 주입 포트를 통해 채널 내로 주입가능하다. 상기 채널의 단부는 제1 내지 제3 주입 포트에 대응하도록 각각 배치된 제1 내지 제3 말단부를 포함하며, 제1 및 제2 구속 유체가 제1 및 제2 사전정의된 유속을 각각 갖고, 상기 용출 유체가 제3 사전정의된 유속을 가질 수 있도록 기하학적 형상을 가지며, 상기 제3 사전정의된 유속은 상기 제1 및 제2 유속보다 크다.

Description

대상물의 분류를 위한 장치 및 분류 방법{DEVICE FOR THE FRACTIONATION OF OBJECTS AND FRACTIONATION METHOD}

본 발명은 분산 유체 내에서 대상물, 특히 생물학적 시료의 분류를 위한 장치에 관한 것이고, 또한 본 발명은 분산 유체 내에서 유기 대상물 또는 무기 대상물, 특히 미생물체, 생물학적 시료 및 그 유사체의 분류 방법에 관한 것이다.

종래기술에는 분산된 대상물 및 입자에 대한 분류를 위한 장치가 공지되어 있다. 특히, 이들 장치는 세포성 샘플과 같은 생물학적 시료를 분류하는데 이용될 수 있다. 이 경우, 입자는 서로 상이한 단세포 또는 세포군일 수 있다.

분류 장치가 임의 종류의 생물학적 시료와 함께 이용될 수 있음에도, 줄기세포를 선택하여 격리시키는 장치를 이용하는데 관심이 많다. 따라서, 생물학적 시료 및 줄기세포에 관한 공유 저작물에 대한 상이한 분류 방법 및 장치는 하기와 같다.

분리를 위한 생물적 초기 세포 샘플은 (지지체(supports) 또는 스캐폴드(scaffolds)에 대한) 접착 또는 생리적 유체 내로의 부유에서 성장하는 상이한 세포종에 의해 구성된 이질성 세포군의 동등물이다. 초기의 샘플로부터, 우선 플라스틱 지지체 상의 접착에서 콜쳐(colture)에서 성장되는 부착세포와, 분산 유체 내에 분산된 콜쳐에서 성장된 다른 부유종이 얻어질 수 있다. 특히, 중간엽 줄기세포가 부착세포로서 식별되는 한편, 다른 부유종은 혈구, 림프구, 적혈구, 종양세포 등인 세포이다.

줄기세포는 손상된 성숙세포의 교체에 의해 조직의 기능적 및 구조적 완전성을 유지하는데 할애되는 "원시(primitive)" 세포이다. 줄기세포는 상이한 종류의 조직(상이한 "효능" 정도)으로 구별하는 그 상이한 능력과, 약학의 미래가 되는 재생의학에서의 큰 관점에 대해 식별될 수 있다.

실제 근원으로부터 나오는 복잡하고 이질성의 샘플을 단순화할 가능성과, 재생의학으로부터 진단에 걸치는 적용을 위해 상이한 목적으로 상이한 세포종의 계군(subpopulation)을 성취하도록 (지방조직 및 신생아조직과 같은) 폐기된 조직을 재사용할 기회가 아주 도전적이다. 근래에는, 진단 분야에서 생물지표로서 종양세포에 그리고 세포약물로서 사용될 잠재력에 대해 줄기세포 및 혈구, 특히 말초혈액에 특정한 주의가 제공된다.

줄기세포는 모든 조직에 분포되어, 골수(bone marrow), 치수(dental pulp), 지방조직(adipose tissue), 신생아조직(peripheral blood), 탯줄(umbilical cord) 및 태막(fetal membrane)을 포함하는 근원에 주로 위치되며, 그로부터 줄기세포가 선택될 수 있지만, 그 조직의 국부화는 잘 정의되지 않고, 줄기세포로부터 더욱 구별되고 유래되는 상이한 모든 세포로부터 격리되는 특정 구역에서 식별될 수 없다. 현재, 인간 줄기세포의 선택/농축은 막항원(membrane antigen)의 존재를 인식하는 면역학표식 기술(immunolabeling techniques)로 또는 유전자 선택 기술에 의해 수행된다. 그러나, 면역학표식은 줄기세포를 손상시키거나 또는 바람직하지 못한 구별 공정으로 유도할 수 있을 뿐만 아니라, 면역학표식은 "경질(hard)" 세포 분류 기술로 고려되는데, 그 이유는 연구를 위해서가 아니라 의료 및 임상 목적을 위해 분석된 세포를 이용하는 최소한의 조작에 대한 규정을 충족하지 않기 때문이다.

더욱이, 유전자 선택은, 특히 분류된 세포의 생체내 재사용을 위해 공지된 관련 문제점을 갖는 세포 유전자 조작(cell genetic modifications)을 필요로 한다. 또한, 이는 값비싸고 긴 절차적 시간을 제공한다.

임의 종류의 세포 및 조직으로 구별할 수 있는 재생성 줄기세포(totipotent stem cells)의 우선적인 근원은 배아(embryo)이다. 어쨌든, 인간 배아로부터 재생성 줄기세포에 대한 실험 및 사용은 (2005년 6월의 국민투표 결과로 인해 이탈리아와 같은) 일부 국가에서 금지되지만, 다른 많은 국가에서, 유효한 법에 의해 엄격하게 규제되거나 또는 (다른 유럽 국가 또는 미국에서와 같이) 생명 윤리학적 고려에 의해 단념되고 있다.

재생성 줄기세포 후의 다능성 줄기세포(multipotent stem cell)는 거의 모든 인간 조직에 존재하는 광범위한 조직에서 특수화될 수 있는 간엽성 줄기세포(mesenchymal stem cells)와 같은 대부분의 스태미날(staminal)이다.

배아와는 상이한 근원에서의 다능성 줄기세포의 낮은 유용성은 또 다른 적용을 위한 적절한 세포수를 얻기 위해 그 선택/농축을 위해 유효한 기술의 사용을 필요로 한다.

다능성 줄기세포는 직접 면역태그(direct immunotag)에 의해 또는 유동세포계수법(flow cytometry)에서의 흐름-조력식 세포 소팅(Flow-Assisted Cell Sorting: FACS) 또는 면역-코팅된 자기 비드에 의한 자기-조력식 세포 소팅(Magnetic-Assisted Cell Sorting: MACS)과 같은 특정한 표지의 사용을 수반하는 세포 선택 기술에 의해 선택/농축될 수 없는데, 그 이유는 이들 방법의 선택은 세포 구별 특성을 대표하는 면역학적 표지(면역 표지)의 인식에 근거하여, 줄기세포 파워의 정도가 증가함에 따라 식별하기 어렵기 때문이다. 이러한 이유로, 간충직세포(mesenchymal cell)를 확실히 식별할 수 있는 표지의 전체 패널이 아직 존재하지 않는다.

일반적으로, 간충직 줄기세포는 직접 면역학표지를 통한 표현형 특성(phenotypic proprieties)에 근거한 정확한 차이를 저해하는 표면항원의 광범위하고 다각적인 패널을 나타내는 다능성 세포이다(W. Wagner 등. Experimental Hematology 33 (2005) 1402-1416).

또한, FACS 및 MACS 기술은 분류된 간충직 줄기세포, 생균수의 비교적 낮은 회소, 재생 및 성장에 대한 낮은 능력 및 상이한 구별력 다음, 바람직하지 못한 암조직의 형성을 초래할 수 있는 소정의 구별 경로로부터의 일탈에 받는 생리학을 유도할 수 있다.

간충직 줄기세포가 아닌 세포를 위한 면역 표지를 채용하는 "네거티브(negative)" 선택 기술은 전체 세포군으로부터 간충직 줄기세포를 배제하는데 이용된다. 이러한 기술은 격감된 개체군 내에 목표 세포의 존재를 절대적으로 보장하지 않는데, 그 이유는 구체적으로 마킹되지 않으므로 특정한 표지에 접착되지 않기 때문이다. 또한, 그 에스페시피시티(aspecificity)로 인한 방혈(depletion)은 동일한 패밀리에 속하는 간충직 세포 계군의 차이를 허용하지 않고, 상이한 근원으로부터의 군들 사이 또는 동일한 근원으로부터의 계군들 사이의 가능한 차이를 구별할 수 없다.

또한, 간충직 줄기세포는 수행비용 및 시간의 견지에서 노동이 들고 값비싸며, 고도의 전문인력 및 유전자 세포 조작을 필요로 하는 유전자 선택 프로세스(유전자 도입 기술(Gene Transfer Technology: GTT))를 통해 분류된다.

그러나, 기존의 기술은 세포 선택의 2가지 대립물의 표현, 즉 낮은 세포 회수를 의미하는 극도로 특정하거나 또는 세포 특성화의 부재를 의미하는 불특정한 것이다.

생물학적 시료의 분류 및 선택에 대해, 선택/농축에 대한 문제점은 세포 조작, 방혈 기술에 의해 격리되는 세포군을 위한 조성에 대한 확신 결여, 몇몇 군에 의해 조성되는 복잡하거나 원 샘플(raw samples)을 분리하는 불가능성으로 인해 여전히 풀리지 않고 있다. 착생 조건(adherent conditions)에서 성장하는 생물학적 시료의 분리/농축은 다능성 줄기세포의 샘플, 특히 인간 줄기세포에서 훨씬 더 문제가 되며, 이는 세포 변경 또는 그 고통을 수반하지 않고, 너무 비싸지 않고 또한 통상적인 특수화된 실험실 인원에 의해 동작되는 비교적 단순한 방법을 통한 예컨대 간충직 세포이다. 과학 연구 목적과는 상이한 임의의 적용을 위해 대상물 또는 입자를 사용하는데 최소한의 조작이 필수적임을 상기하는 것이 중요하다.

줄기세포 및 암세포와 같은 희귀군과 관련하여, 상이한 조직으로부터 세포를 분리하기 위해 변형된 기술이 평가되고 있으며, 특히 필드-플로우 분류법(Field-Flow Fractionation의 약어: FFF)이 평가되고 있는데, 이는 복잡한 군 내에 피분석물에 대한 형태학 및 특유한 생물물리학적 특성을 포함하는 물리적 차이에만 근거하여 상이한 세포군 및 관련 계군을 구별할 수 있다(Reschiglian 등, TRENDS in Biotechnology Vol.23 No.9 September 2005). 이들 기술로 인해, 최소한의 조작에 대한 표준으로 남아있는 목표 세포를 얻고, 샘플을 단순화하는 것이 가능해진다.

이들 기술 및 방법론은 시작 샘플에 대해 처리되는 세포 샘플을 변화없이 유지하여 보조 특성을 추가하거나 또는 본래 특성을 제거하지 않는 절차로 이루어진다. 우리는 기술, 즉 FFF(필드-플로우 분류), Gr-FFF(중력적 필드-플로우 분류), Sd-FFF(침강 필드-플로우 분류), FDF(유전이동 FFF), 원심분리기 및 그 유사법을 언급하고 있다.

동적 유동 조건에서의 필적할만한 분리 기술 및 특히 FFF에 속하는 기술은 생물리학적 염분 버터 내의 부유물에 추가하는 생세포를 마련한 세포분(cell fractions)의 분류를 위한 방법을 제공한다. 그 다음, 샘플은 분류 장치 내에 도입된다. 도입 및 분리는 연속적인 흐름과, 샘플이 분류를 위한 모세 채널(capillary channel) 내에 도입될 수 있는 시린지를 포함하는 주입 시스템 양자에 의해 일어날 수 있다.

그 다음, 샘플은 장치에 의해 분리 또는 분류되거나 또는 초기 샘플로부터 격리된 입자 그룹 또는 단일 입자의 거동에 관한 연구를 위해 관찰된다. 분리는 정적 또는 동적 조건에서 동작될 수 있다. 동적 경우에, 연속적인 흐름이 펌핑되고, 장치 자체와의 접촉 존재 또는 부재 하에서 장치로부터의 용출 메커니즘이 수행되고; 정적 경우에, 세포가 살아있는 유체의 조성 및 조건의 견지에서의 조작에 의해 부여되는 조건 변화에 대한 응답을 관찰하는 특정 위치에 세포가 보유된다. 동적 분리 방법은 장치의 물리적 조성 상에서 분석/분리되는 대상물의 부동화를 방지하여, 그와의 접촉을 회피할 수 있다. 그 다음, 분류 장치를 통한 교차 동안에 분리되는 상이한 군에서의 상이한 세포 타입을 수용하는 부분이 수집된다. 변형적으로, 일단 연구가 완료되거나 하면 또는 세포 노화 및 활성도의 이유로 세포 샘플은 폐기된다.

필드-플로우 분류 기술에 속하는 몇 가지의 방법은 세균군으로부터 상피세포까지 생물학적 샘플의 분리를 위해 이용되지만, 종래기술에 공지된 방법 및 장치의 실시와 함께 성취되는 결과는 몇 가지의 단점을 보인다. 지구 중력장으로 인한 동적 흐름 분리 조건에서 동작하는 기술이 특히 증거가 되는데, 그 이유는 분리 목적을 위해 유용한 다른 것들 중에 가장 단순하고 값싼 기술이기 때문이다.

이들 기술은 도 14에 도시된 세부사항에 대한 분류 장치를 이용한다. 분류 요소(1100)는 분류 장치 내의 흐름방향으로 (화살표로 나타낸) 종방향 흐름으로 주입 포트(102)를 통해 도입될 수 있는 채널(1122)을 포함한다. 상기 장치는 역장(field of force), 예컨대 중력을 일반적으로 받아, 흐름방향에 대해 수직하게 작용한다.

채널(1122)에서, 장치의 내부에서 대상물의 운반 유체(이동상)의 횡방향 유속 프로파일은 층류 흐름으로 인해 포물선 모양이다. 종방향 유속의 프로파일을 위해 동일하다. 따라서, 분류 장치 내로 주입되는 세포는 용출 유체의 동일한 흐름 프로파일을 따른다. 이는 0으로 안내하고 측벽의 표면 상에서 0인 측벽 부근에서의 흐름 속도의 감소에 따라 분류 장치의 측벽 부근에 있는 세포의 부동화를 불가피하게 수반한다. 이는 0과 같은 속도를 갖고, 분류 채널의 벽에 부착하는 세포의 부동화로 인한 세포 샘플 손실을 의미한다. 샘플 손실은 부착 줄기세포의 분류에 대해 명백하며, 이는 장치의 벽과 같은 고형 지지부에 부착하도록 사전 배치된다.

본 발명의 목적은 효능에 대한 유지보수, 사용하기 용이성, 기존의 기구적 기술에 대한 비용 저렴에 관한 문제점을 극복하는 동시에, 부동화, 세포 회수, 생존성 및 샘플 조작의 견지에서의 결여를 최소화할 수 있는 동적 조건에서 분류 및 격리를 위한 장치를 제공하는 것이다. 즉, 본 발명의 목적은 분류 채널벽 상에 분리할 대상물의 부동화를 극복하거나 또는 적어도 감소시키게 하여 용출된 시료 회수의 개선을 보장하는 장치를 제공하는 것이다. 이러한 장치는 군 또는 계군의 높은 회수 세포 분리 및/또는 격리를 위한 장치에 속하며, "스케일 업(scale up)" 임상적/의료-수술적 장치로의 허용을 수반하는 최소한의 조작 기술의 카테고리를 따른다.

본 발명의 또 다른 목적은 유체-동적 조건에서 분산 유체 내의 대상물의 분류를 위한 방법을 제공하여, 상이한 용기 내의 용출된 대상물 일부의 수집을 허용하므로, 목표 대상물을 수용하는 일부를 격리시키고 장치 내로 주입된 세포 시료를 손실할 위험을 회피한다.

본 발명의 과제는 독립항에 의해 해결된다. 본 발명의 유리한 실시예는 종속항의 목적이다.

특히, 본 발명은 분산 유체(dispersing fluid) 내의 분산상(dispersed phase)의 동적 분류(dynamic fractionation)를 위한 장치에 관한 것이다. 상기 분산상은 대상물 및 입자 또는 입자군, 바람직하게 세포, 분자, 입자 등과 같이 크기설정된 미소체를 포함할 수 있다. 상기 장치는 분류 채널과, 제1 내지 제3의 일련의 주입 포트로 이루어진다. 제1 주입 포트를 통해, 제1 구속 유체가 채널 내에 주입될 수 있는 한편, 제2 주입 포트를 통해, 제2 구속 유체가 상기 채널 내에 주입될 수 있다. 상기 분산상의 반송을 위한 용출 유체는 제3 주입 포트를 통해 상기 채널 내에 주입될 수 있다. 상기 제3 주입 포트는 제1 및 제2 주입 포트들 사이에 배치된다. 상기 분류 채널의 제1 부분은 제1 내지 제3 주입 포트 각각에 대응하는 제1 내지 제3 말단부를 구비한다. 상기 제1 내지 제3 말단부(241, 251)는, 제1 및 제2 구속 유체가 제1 및 제2 사전정의된 유속을 각각 갖고, 용출 유체가 제3 사전정의된 유속을 가질 수 있도록 치수 설정되며, 상기 제3 사전정의된 유속은 상기 제1 및 제2 유속보다 커서 상기 제1 및 제2 구속 유체들 사이에 상기 용출 유체를 구속한다. 상기 제1 내지 제3 포트를 통해 상기 분류 채널 내에 도입되는 유체는 상기 분류 채널 내에 이동상을 정의한다.

유리하게, 제1 내지 제3 부분은 상기 채널의 종축에 평행하게 흐르는 층류를 발전시키는 해당 포트를 통해 유체의 도입을 허용하는 기하학적 형상을 가질 수 있다. 예컨대, 상기 단부는 아치형 또는 뾰족형 또는 V-자형 프로파일을 가질 수 있다. 변형적으로, 제1 내지 제3 단부는 다각형 형상일 수 있다. 제1 내지 제3 주입 포트는 말단부 각각의 근방에 위치될 수 있으며, 용출 유체의 주입 포트에 대응하는 단부는 유리하게 서로 동일할 수 있는 제1 및 제2 구속 유체의 주입 포트에 대응하는 말단부보다 넓다.

본 발명의 또 다른 목적은 분산 유체 내의 대상물을 분류를 위한 방법으로서, 이는 제1 주입 포트를 통한 제1 구속 유체와, 제2 주입 포트를 통한 제2 구속 유체의 분류 채널에서의 주입을 구비한다. 상기 제1 및 제2 구속 유체는 제1 및 제2 사전정의된 유속에 각각 공급된다. 또한, 상기 방법은 제1 및 제2 주입 포트들 사이에 배치된 제3 주입 포트를 통해 이동상의 공급을 위해 용출 유체의 주입을 구비한다. 상기 용출 유체는 제1 및 제2 사전정의된 유속보다 큰 제3 사전정의된 유속을 가져서 상기 제1 및 제2 구속 유체들 사이에 상기 용출 유체를 구속한다.

유리하게, 상기 제1 및 제2 구속 유체의 제1 및 제2 사전정의된 유속은 용출 유체의 제3 사전정의된 유속의 5% 내지 25% 범위, 바람직하게 제3 사전정의된 유속의 10%일 수 있다.

본 발명에 따른 분류 방법 및 장치에 대한 또 다른 이점 및 특징은 첨부한 도면을 참조하여 비제한적인 예로서 기술된 일부 구조에 대한 하기의 상세한 설명으로부터 명백할 것이다.

도 1은 본 발명의 제1 실시예 또는 중요 도면에 따른 분류 장치에 대한 세부 평면도,
도 2는 본 발명에 따른 분류 장치에 대한 세부도,
도 3은 도 2의 장치로서 분해된 구성을 도시한 도면,
도 4는 도 1-3의 장치의 구성요소에 대한 평면도,
도 5는 본 발명의 제2 실시예에 따른 장치의 세부 사시도,
도 6은 도 5의 장치에 대한 분해 사시도,
도 7(A) 및 (B)는 본 발명에 따른 방법과, 당해기술의 방법을 실시하는 장치에서의 총 흐름의 종방향 프로파일과, 종방향으로 유체의 속도장의 프로파일 사이의 비교를 각각 나타낸 그래프,
도 8(A) 및 (B)는 본 발명에 따른 장치에서 주입된 총 세포 샘플 흐름의 표면 트랜드와, 당해기술에 따른 장치에서의 총 샘플 흐름과 비교하여 나타낸 유한요소법(FEM) 시뮬레이션에 의해 얻어진 다이아그램,
도 9(A) 및 (B)는 당해기술에 따른 장치(9(A))에서의 흐름의 트랜드와 비교를 위해 본 발명에 따른 분류 장치(9(B)) 내의 총 흐름의 트랜드를 FEM 시뮬레이션에 의해 나타낸 벡터를 도시한 도면,
도 10(A) 및 (B)는 당해기술에 따른 장치(10(A))에서의 속도의 트랜드와 비교를 위해 본 발명에 따른 분류 장치(10(B)) 내의 반송 유체(이동상)의 속도장의 피상적인 총 속도장의 트랜드를 나타낸 다이아그램,
도 11(A) 및 (B)는 당해기술에서의 장치(11(A))에서의 속도의 트랜드와 비교를 위해 본 발명에 따른 분류 장치(11(B)) 내의 반송 유체(이동상)의 총 속도 벡터장의 트랜드를 나타낸 도면,
도 12(A) 및 (B)는 당해기술에 공지된 장치와, 본 발명에 따른 장치에 의한 용출된 샘플의 검출 그래프,
도 13(A) 및 (B)는 당해기술에서의 장치와, 본 발명에 따른 장치에서 측벽 각각의 근방에서 검출된 용출된 부분의 수집 포트를 배치한 단부에 근접한 세포 분포를 나타낸 사진,
도 14는 종래기술에 공지된 분류 장치의 개략적인 세부도.

하기 단락은 본 발명의 각종 대표적인 실시예를 기술한다. 예컨대, 이해를 용이하게 하기 위해, 본 발명에 따른 분류 장치는 생물학적 시료, 특히 세포의 분류를 언급하도록 기술될 것이다. 또한, 하기의 상이한 실시예를 언급하도록 기술된 해결책은 상이한 종류의 샘플, 예컨대 수 ㎛ 내지 수백 ㎛로 이루어진 적절한 사이즈의 유기 및 무기 입자, 예컨대 중합 입자, 구형 또는 층판형 광물 입자, 탄소 입자, 실리카 입자, 약물 전달용 입자, 혈청 및 부유 세포, 세균군, 리포솜 소포에 대한 분석 및 분리를 위해 이용될 수 있다.

용어 "분류 채널"은 설명 및 청구범위에 사용되어 본 발명에 따른 장치의 분류 요소 내에 얻어진 리세스를 나타내며, 그 내에서 분류 요소의 제1 단부에 대응하게 배치된 주입 지점으로부터 제1 단부에 반대편의 분류 요소의 제2 단부에 대응하게 위치된 추출 지점까지 유체가 흐를 수 있다. 분류 채널은 모세 채널일 수 있다.

용어 "모세관(capillary)"은 적어도 하나의 치수로 치수설정하여 분류 채널 내에 층류의 방향을 허용하는 채널을 지시하는데 이용된다. 모세 분류 채널은 모세관 현상의 정의를 충족하지 않는 길이 및 폭을 제공할 수 있는 한편, 층류를 얻기 위해 이러한 정의를 충족하는 두께를 제공할 수 있다.

용어 "분류 채널"은 저어도 하나의 치수가 이전 단락에서 정의를 만족하는 모세 채널을 의미한다.

용어 "측방향 밴드"는 채널의 측벽에 인접한 분류 채널의 일부를 지시하며, 이는 채널의 길이에 걸쳐 측벽을 따라 연장되고 채널의 측벽에 수직하는 치수를 가지며, 0이 아닌 폭의 조건으로 지시된다.

용어 "대상물"은 입자 혹은 작은 사이즈의 유기 또는 무기 입자의 클러스터, 바람직하게 중합 입자, 구형 또는 층판형 광물 입자, 석탄 입자, 실리카 입자, 약물 전달용 입자, 혈청 및 부유 세포, 세균군, 리포솜 소포와 같은 미소체에 대해 분리 공정을 받는 분산상을 지칭한다.

용어 "분산상(dispersed phase)"은 분산하는 상(dispersing phase)의 물리적 상태와는 상이한 물리적 상태에서의 요소를 지칭한다. 분산하는 상은 분산상이 균일하게 분포하지만 혼화성이지 않은 요소이다. 예컨대, 입자 또는 세포의 경우, 분산상 또는 세포 분산은 액체로 균일하게 분산(분산하는 상)하는 고형 입자 분산(고형상)일 수 있다. 이 경우 고형/액체 분산으로 불리는데, 그 이유는 2개의 상이 상이한 물리적 상태에 있고 혼화성(고형 및 액체형)이 아니기 때문이다.

본 발명은 당해기술에 공지된 분류 장치가 필드-플로우 분류의 원리를 이용하며, 분류 채널벽에 부착되어 분석 또는 분리될 무시하지 못할 샘플의 부분을 갖는 단점이 있다는 관찰에 근거한다. 종래의 분류 장치에 의한 미시적 시료 분리 방법은 샘플의 약 40% 손실될 수 있다. 이는 분류 채널 내에 샘플이 주입되는 용출 유체가 층류를 가지고 흐름 속도 프로파일이 포물선 형상이며, 최대 속도가 채널의 중앙에 있고 채널의 측벽 근방에서 0인 점으로 인한 것이다. 용출 유체 내로의 모든 대상물은 채널의 벽 근방에서 0의 속도를 가지며, 채널의 측벽에 부착하는 경향이 있다. 당해기술에 공지된 일부 장치의 또 다른 문제점은 이송상 흐름이 정지될 때, 즉 이동상 흐름 없이 채널 내로 샘플이 주입되어, 샘플 주입 바로 후에 시작된다는 점이다. 또한, 이 경우, 채널 내에 주입된 샘플 부분은 채널 하부벽에 부착하고, 샘플 수집 포트인 출구를 향해 이송되지 않는다. 더욱이, 채널의 측벽 근방의 대상물이 0의 속도로 용출 유체부 내로 부유하는 점은 이러한 대상물을 측벽에 접촉하게 하여, 그 손실을 야기하고, 그 결과 분류 장치의 효율을 감소시킨다. 이러한 문제점은 분리할 대상물이 실리카 입자, 중합 입자, 또는 세균군, 세포, 특히 상피세포 또는 부착 줄기세포와 같은 생물학적 시료를 포함한다면 명백하며, 이들은 벽에 더욱 쉽게 부착한다.

본 발명에 따른 장치는 분류 채널의 종축에 수직방향으로의 용출 유체의 흐름 프로파일이 장치의 최종 성능을 위해 무시하지 못할 역할을 한다는 점에 근거한다. 이 경우, 상기 채널의 종축은 주입 포트로부터 채널의 수집 포트까지 일방향을 따라 모두 연장되는 축과 같이 식별된다. 특히, 본 발명은 분리 채널 내로의 최적 용출 흐름이 유치하게 이상적인 경우에 단차 또는 구형파 프로파일을 본질적으로 갖는다는 관찰에 근거한다. 실제로, 채널의 종축에 수직하게 배향된 중앙에서 0이 아닌 정면과, 측벽 근방의 분류 채널의 측방향 밴드에서 0을 제공하는 용출 흐름 프로파일은 채널의 측벽에 샘플 부착의 감소를 야기하여, 장치의 효율에 대한 중요한 증대를 보장한다. 바람직하게, 측방향 밴드의 폭은 채널의 총 폭의 10% 내지 25% 범위에 있다.

본 발명에 따른 상술한 바와 같은 용출 유체를 허용하는 분류 장치의 세부 사항이 도 1에 도시된다. 채널(221) 내로의 유체 속도 트랜드는 도 11(B)에 도시된다.

특히, 도 1은 분류 채널(221)을 얻는 분류 요소(200)에 대한 평면도를 도시한다. 도 1에 도시한 실행 형태에 대한 설명을 언급하는 분류 요소(200)는 제1 및 제2 유체 주입 포트(321)를 포함한다. 제1 및 제2 주입 포트는 용어 제1 및 제2 측방향 포트에 의해서도 기술될 것이다. 제1 주입 포트(321)를 통해, 채널 내에서 제1 구속 유체를 주입하는 한편, 제2 주입 포트(321)를 통해, 채널 내에서 제2 구속 유체를 주입하는 것이 가능하다. 이동상의 부양(alimentation)을 위한 용출 유체는 제3 주입 포트(311), 즉 중앙 포트에 의해 채널(221) 내에 주입될 수 있다. 제3 주입 포트(311)는 제1 및 제2 주입 포트(321)들 사이에 배치된다. 채널(221)의 제1 단부는 제1 내지 제3 주입 포트(321, 311)에 대응하게 각각 배치된 제1 내지 제3 말단부(241, 251)를 포함한다. 제1 내지 제3 말단부가 구성되어, 분류 채널(221) 내에서 2가지의 상이한 흐름을 야기하는 기하학적 형상을 갖는다. 특히, 제1 및 제2 구속 유체는 2개의 측방향 흐름을 각각 이루어, 제1 및 제2 사전정의된 유속을 가질 수 있다. 제3 주입 포트를 통해 주입된 용출 유체는 중앙 흐름을 형성하여, 제3 사전정의된 유속을 가질 수 있다.

제3 사전정의된 유속은 제1 및 제2 사전정의된 유속보다 높아 제1 및 제2 구속 유체들 사이에 용출 유체를 구속한다. 더욱이, 용출 유체의 유속보다 늦은 유속을 갖는 구속 흐름을 형성하는 선호는 샘플 필드-플로우 분류를 수행하도록 동의하는 폭을 갖는 중앙 흐름을 허용하여, 분류 채널의 측벽과 샘플의 일부의 접촉을 회피한다. 채널의 기하학적 형상에 대한 선택, 특히 말단부(241, 251)의 선택은 필드-플로우 분류 방법을 효율적인 방식으로 적용하게 한다. 분류 채널의 모든 종축을 따라 수 ㎛ 밴드, 특히 100 ㎛ 미만으로 강제된 용출 유체 흐름을 생성하도록 말단부(241, 251)의 위치 및 기하학적 형상에 대해 선택하면, 샘플의 시료 분리를 허용하지 않을 것이다.

제1 및 제2 주입 포트를 통해 주입된 흐름은 주입 단계 동안에 그리고 분리 공정 동안에 샘플의 유체 가이드로서 또는 구속 요소로서 작용한다. 이러한 구성은 분리 효율 감소를 야기하는 용출 흐름의 세포 손실 및 밴드 확장을 방지한다. 유리하게, 제1 및 제2 구속 흐름은 서로에 그리고 용출 유체 흐름 또는 중앙 흐름에 평행할 수 있다. 유체 가이드를 얻기 위해, 제1 내지 제3 말단부(241, 251)는 그 해당하는 종축이 서로에 평행하고 그리고 분류 채널(221)의 종축에 평행하도록 구성 및 배치될 수 있다. 이러한 구성은 서로에 평행한 층류를 쉽고 정확하게 생성하게 함으로써, 용출 유체는 제1 및 제2 구속 유체의 흐름에 평행한 채널의 중앙에서 흐른다.

본 발명의 유리한 형태에서, 제3 주입 포트(311)에 대응하는 제3 말단부(241)(중앙 말단부로도 부름)의 베이스는, 제1 및 제2 주입 포트(321)에 대응하게 각각 배치된 제1 및 제2 말단부(251)(제1 및 제2 측방향 말단부로도 부름)의 베이스보다 크다. 본 발명에 따른 분류 채널(221)의 구성에서, 말단부의 베이스는 분류 채널(221)에 연결된 각각의 말단부(241, 251)의 일부이다. 베이스에 대향된 말단부(241, 251)의 일부는 종래에서와 같이 용어 지점 말단부로 불릴 것이다.

상술한 구성의 또 다른 전개에서, 제1 및 제2 말단부의 베이스 폭은 제3 말단부의 베이스 폭의 50%까지의 값을 가질 수 있다. 제1 및 제2 말단부(251)의 베이스 폭은, 중앙 흐름이 분류 채널(221)의 측벽으로부터 0이 아닌 사전결정된 거리, 예컨대 제3 말단부의 베이스 폭의 25% 내지 50% 범위에 있음을 보장하도록 선택될 수 있다.

본 발명의 예시적인 구현에서, 측방향 흐름은 0.1 ml/분의 유속을 가질 수 있고, 1 ml/분의 유속을 가질 수 있는 중앙 흐름에 평행할 수 있다. 더욱 상세하게, 제3 말단부(241)의 기하학적 형상 및 치수는 채널(221)의 총 폭의 거의 반과 동일한 분류 채널(221)의 모든 폭을 따라 세포 샘플의 분포를 얻도록 폭의 용출 유체 흐름(중앙 채널)을 얻기 위해 선택될 수 있다. 제1 및 제2 말단부(251)는 채널(221)의 총 폭의 10% 내지 25% 범위의 폭을 갖는 측방향 채널의 중앙 채널 측부에서 생성하도록 기하학적 형상을 가질 수 있다. 측방향 채널은 제1 및 제2 구속 유체의 흐름에 의해 발생된다. 이로써, 중앙 채널은 사전정의된 거리에 배치되며, 이는 분류 채널(221)의 측벽으로부터 채널(221)의 총 폭의 10% 내지 25% 범위의 값에 대응한다.

유리하게, 제1 내지 제3 말단부(241, 251)는 아치형일 수 있다. 본 발명에 따르면, 용어 "아치형"은 일반적이다. 그 결과, 말단부는 아치형 형상에 따른 임의의 프로파일일 수 있다. 이들 프로파일은, 예컨대 뾰족 형상, V자 형상 또는 U자 형상, 혹은 반원형 또는 다각형이다.

제안된 유속으로 조합된 상술된 구성이 세포 분리 및 세포 회수에 대해 양호한 결과를 나타내더라도, 중앙 및 측방향 채널의 치수, 구속 유체 및 용출 유체 유속은 상기한 바와는 상이한 값을 가질 수 있다. 이들 값은 분류 장치의 이용 및 장치 내에 주입되는 샘플의 특성에 따라 다르다. 생물학적 시료의 분리를 위한 적용에서, 중앙 유속은 0.5 내지 3 mm/분의 범위에서 선택될 수 있고, 타당하게 분리 장치의 치수로 증가할 수 있고, 이는 4 내지 6 cm 범위의 폭, 20 내지 40 cm 범위의 길이, 0.1 내지 0.7 mm 범위의 두께일 수 있다. 더욱이, 말단부(241, 251)는 상술한 바와 상이한 프로파일을 가질 수 있다. 예컨대, 말단부(241, 251)는 본 발명의 상이한 아이디어를 의미하지 않고서 다각형 프로파일을 가질 수 있다.

도 1에 도시한 구성에 따르면, 샘플은 분류 채널(221) 내로 용출 유체를 주입하기 전에 제3 주입 포트를 통해 분류 채널 내로 주입될 수 있다. 이 경우 샘플은 분류 채널(221)의 바닥면 상에 쌓여서, 분류 채널(221)을 따라 모두 용출 유체에 의해 용출된다.

도 1에 기술된 분류 장치(200)는 상술한 샘플 주입에 관한 방법에 제한되지 않는다. 유리하게, 분류 장치(200)는 분류 채널(221)에 의해 분류되어야 하는 유체 내에 대상물의 부유물인 샘플의 주입을 위해 격막(septum)(도 1에 미도시)에 의해 구현되는 샘플 주입 포트를 포함할 수 있다. 샘플 주입 포트는, 예컨대 분류 채널(221)의 평면에 수직인 용출 유체의 흐름 내에 대상물의 주입을 허용하기 위해 배치된다. 더욱 상세하게, 샘플 주입 포트는 분류 채널의 평면에서 흐름에 의해 샘플을 주입하기 위해 배치된다. 본 발명에 따른 실시 형태에서, 격막은 유리하게 용출 유체의 흐름에 의해 정의된 중앙 채널의 중심부에서 제3 주입 포트(311)와 정렬 배치될 수 있다.

격막을 통한 주입에 의해, 샘플은 채널(221) 내로 주입되는 대상물이 채널(221)의 바닥면에 부착하지 않는 방식으로 운동 중인 용출 유체 내에 주입된다. 용출 유체에 평행하게 흐르는 구속 유체로 인해, 그 전체 길이에 대해 분류 채널(221) 내로 팽창하는 주입된 대상물이 측방향 유체에 의해 중앙 채널 내로 구속됨으로써, 채널(221) 내로 주입되는 대상물이 분류 채널(221)의 측방향 벽에 부착하지 않는다.

본 발명에 따른 분류 장치는 제1 내지 제3 주입 포트(311, 321)와 유체식 연결하는 적어도 하나의 스트림 제어 수단(441)을 더 포함한다. 스트림 제어 수단(441)은 제1 주입 포트(311)에 의해 주입된 용출 유체의 흐름이 제3 사전정의된 유속을 갖게 한다. 스트림 제어 수단은 제1 및 제2 주입 포트(321) 각각을 통해 분류 채널(211) 내로 주입되는 제1 및 제2 구속 유체의 흐름을 제어하도록 제1 및 제2 주입 포트(321)와 유체 연결한다. 스트림 제어 수단(441)은 제1 및 제2 구속 유체의 흐름이 제1 및 제2 사전정의된 유속을 갖게 하며, 상기 제1 및 제2 사전정의된 유속은 제3 사전정의된 유속보다 낮다. 본 발명에서 알려진 경우에, 제1 및 제2 사전정의된 유속은 동일한 값을 갖는다. 변형적으로, 제1 및 제2 사전정의된 유속은 상이한 값을 가질 수 있다.

본 발명에 따른 특정한 제조 형태에서, 스트림 제어 수단(441)은 별개의 유체 채널을 통해 용출 포트(311, 321)를 용출하는 하나의 펌핑 시스템(미도시), 예컨대 정량 펌프(peristaltic pump), 시린지 펌프(syringe pump), 멤브레인 펌프(membrane pump), HPLC 펌프 및 그 유사 펌프를 포함한다. 이 경우, 제1 내지 제3 사전정의된 유속 모두는 펌프와 그 해당하는 용출 포트 사이의 유체식 장치 내에 배치된 해당하는 밸브에 의해 제어될 수 있다. 상기 열거된 펌프는 단지 일례로서, 이에 제한되지 않는다. 특히, 본 발명에 따른 분류 채널 내로 유체의 흐름을 제어하는 모든 펌프는 상기 열거된 펌프의 동일한 효율성으로 사용될 수 있다.

본 발명에 따른 상이한 제조에서, 스트림 제어 수단(441)은 제1 및 제2 주입 포트(321)와 유체식 연결하는 제1 및 제2 펌프(미도시)와, 제2 주입 포트(311)와 유체식 연결하는 제3 펌프(미도시)를 포함한다. 이 경우, 제1 내지 제3 펌프는 제1 및 제2 사전정의된 유속을 각각 갖는 제1 및 제2 구속 유체와, 제3 사전정의된 유속을 갖는 용출 유체를 생성하기 위해 독립적으로 제어될 수 있다.

당업자는 스트림 제어 수단의 다른 구성을 고려할 수 있다. 예컨대, 제1 및 제2 구속 유체가 동일한 유속을 갖는 경우에, 제1 및 제2 주입 속도가 동일한 값을 갖는다면, 스트림 제어 수단은 제1 및 제2 구속 유체를 공급하는 제1 펌프와, 용출 유체를 공급하는 제2 펌프를 구비할 수 있다. 이와 같이 상기한 구성에 따르면, 분류 장치의 설계 및 제조 형태는 더 용이하고 값싸진다.

도 2는 도 1에 나타낸 제조 개념인 본 발명의 제조 형태에 따른 분류 장치의 세부사항을 도시한다.

분류 장치(200)의 유리한 실시 형태는 적어도 3개의 플라스틱 재료층을 포함하며, 이는 분류 장치의 축적벽이 되어 용출된 부분의 수집 포트를 제공하는 적어도 하나의 하부층(101)과, 모세 채널의 측벽 윤곽을 고정하는 하나의 중간층과, 이동상 및 세포 샘플의 주입 포트와, 용출된 부분의 수집 포트를 배치하는 하나의 상부층(301)을 구비한다.

플라스틱 재료층은 제거가능하거나 영구적인 방식으로 서로 매칭되며, 상기 층들은 장치의 반복 사용에 대한 가능성과, 폐기가능한 것으로 사용할 가능성 모두를 고려하여 제조된다. 분류 장치(200)는 채널(221)을 포함한다. 채널은 하부층 또는 축적벽(101)을 차례로 포함한다. 축적벽은 플라스틱 재료, 예컨대 폴리염화비닐, 폴리카보네이트, 폴리에스터, 폴리스티렌 또는 폴리메틸메타크릴레이트로 제조될 수 있다. 변형적으로, 축적벽(101)은 무기재료, 예컨대 유리로 제조될 수 있다. 유리는 플라스틱 재료보다 더 극성이 있으므로, 이러한 재료는 장치가 플라스틱 입자, 예컨대 폴리스티렌을 분리하는데 이용되는 경우에 유리하게 사용될 수 있다. 이러한 하부층은 이러한 타입의 분류 장치의 축적벽이다. 하부층(101)은 5 내지 15 mm 범위의 두께, 바람직하게 10 mm 두께를 가질 수 있다. 당업자는 분류 장치의 용도 및 설계 요건에 따라 지시된 것과 상이한 두께를 가는 하부층을 선택할 수 있음이 명백하다.

분류 장치(200)는 상부층 또는 공급벽(301)을 포함하며, 제3 주입 포트 또는 분류 채널의 이동상의 중앙 주입 포트(311)와, 이동상의 제1 및 제2 주입 포트 또는 측방향 주입 포트(321)가 배치된다. 도 2는 샘플 주입 포트(331)를 포함하는 도 1에 따라 기술된 분류 장치의 제조 형태를 도시한다.

분류 장치(200)는 용출된 부분을 수집을 위해 하나의 수집 포트(341)를 더 포함한다. 상부층(301)은 하부층(101)의 실질적으로 동일한 특성을 가지며, 5 내지 15 mm 범위, 바람직하게 10 mm의 두께를 갖는 플레이트로 구성된다. 공급벽(301)은 플라스틱 재료, 예컨대 폴리염화비닐 또는 폴리카보네이트로 제조될 수 있다. 변형적으로, 축적벽은 폴리염화비닐, 폴리카보네이트, 폴리에스터, 폴리스티렌, 폴리메틸메타크릴레이트 및 그 유사재료로 제조될 수 있다. 상부벽(301) 상에 배치된 포트가 5 mm 차순의 섹션을 가지지만, 이러한 섹션은 변경되고 주입 채널, 주입 채널 및 수집 채널(미도시)을 갖는 접합 섹션에 따라 다른데, 그 이유는 본 발명의 요지가 아니기 때문이다. 축적벽(101)과 마찬가지로, 상술된 두께 및 직경값은 제한되지 않고, 당업자가 분류 장치의 용도 및 설계 요건에 따라 지시된 것과 상이한 직경을 갖는 상이한 벽두께 및 주입 포트를 선택할 수 있음이 명백하다.

축적벽(101)과 공급벽 사이에는, 분류 채널(221)의 주변 프로파일을 고정하는 하나의 중간층(201)이 있다. 모세 채널의 프로파일은 적절한 제오에 의해 중간층 내에 얻어질 수 있다. 중간층(201)과 모세 채널(221)은 도 3의 분해도에서 볼 수 있다. 중간층(201)은 플라스틱 재료, 예컨대 폴리에틸렌 테레프탈레이트로 제조되며, 이는 0.2 mm 내지 0.5 mm 범위, 바람직하게 0.25 mm의 두께를 가진다. 분류 채널(211)의 주변 프로파일은 종방향 벽, 수집 포트(341)에 대응하게 배치된 오자이브(ogive)(231), 및 주입 포트 또는 중앙 및 측방향 주입 포트(311, 321)에 각각 대응하는 3개의 말단부(241, 251)를 포함한다. 본 문헌에 기술된 제조 형태에서, 말단부는 아치형이다. 제1 미 제2 말단부(251)는 측방향 말단부로 지시되는 한편, 제3 말단부(241)는 중앙 말단부로 지시될 것이다. 모세 채널의 중앙 주입 포트(311)와 측방향 주입 포트(321)는 말단부(241, 251)로 안내한다.

도 4는 도 1-3의 장치의 구성요소에 대한 평면도이다. 특히, 도 4는 중간층(201)의 일부에 대한 평면도를 도시한다. 도 4에 기술된 특정 실시에서, 제3 말단부(241)에 대응하는 중앙 말단부는, 그 베이스에서, 측방향 말단부(241)의 실질적으로 이중 폭(D)인 2D 폭이다. 도면에서, 이동상의 주입 포트(311, 321)와, 주입 포트(331)는 점선으로 나타낸다. 주입 포트(331)는 중앙 주입 포트(311)의 동일한 종축과, 상기한 말단부의 베이스라인 바로 아래에 배치된다. 특히, 주입 포트(331)는 중앙 흐름과 측방향 흐름이 라인업되어 안정되는 채널의 지점에 유리하게 배치될 수 있다. 또한, 말단부(241, 251)는 외측 팁부로부터 모든 말단부의 베이스라인의 중간까지 연장되는 그 종축이 분류 채널(221)의 종축, 더욱 상세하게 분류 장치(200)에 평행하도록 배향된다. 이러한 기하학적 형상은 평행한 층류를 허용한다. 더욱이, 제1 및 제2 말단부(251) 내에 제1 및 제2 구속 유체를 주입함으로써 발생되는 흐름은 제3 주입 포트(311)를 통해 제3 말단부(241) 내로 그리고 분류 채널(221) 내로 주입되는 용출 유체의 주입 속도보다 낮은 주입 속도를 갖는다. 이로써, 용출 유체는 중앙 채널 내로 흘려서 제1 및 제2 구속 유체들 사이에 구속되며, 이는 정확한 샘플 분리를 허용하는 폭을 갖는다.

도 5는 독립적으로 평행하게 작동할 수 있는 복수의 분류 채널(212, 222)을 제공하는 본 발명에 따른 분류 장치의 제2 제조 형태를 도시한다. 도 5는 2개의 분류 채널을 포함하는 분률 장치(400)를 도시한다. 본 발명이 이러한 구성에 제한되지 않고, 분류 장치가 3개 이상의 분류 채널을 포함할 수 있음이 임의의 경우에 암시된다. 단순함을 위해, 다수 채널 구성은 2개의 분류 채널(212, 222)을 갖는 분류 장치를 참조하여 기술된다. 다수 분류 장치(400)는 하부층(102), 2개의 모세 채널의 주변 프로파일이 제조되는 중간층(202)(도 5에 도시되며, 상세히 후술됨), 및 상부층 또는 주입벽(302)을 포함한다. 상부층(302)은 중간층(312) 상에 배치되며, 이는 3개의 다른 하층, 즉 중간층과 접촉하는 제1 하층(312), 제1 하층(312) 상에 배치되어 제1 하층과 접촉하는 제2 하층(322), 및 제2 하층(322) 상에 배치되어 제2 하층과 접촉하는 제3 하층(332)으로 나뉘며; 제3 하층(332)은 구속 유체(342)를 공급하는 구속 포트와, 용출 유체를 공급하는 용출 포트를 구비한다. 더욱이, 제3 하층은 분류 채널 내로 분리될 샘플을 주입하는 샘플 주입 포트(362)와, 샘플 출력 수집으로의 포트(112)를 포함한다. 이러한 구성은 제한되는 것으로 고려되지 않아야 하고, 입력 및 출력 포트가 상술한 바와 상이한 장치의 층으로 배치될 수 있음을 암시한다. 예컨대, 샘플 출력 수집을 위한 포트(112)는 하부층(102) 상에 교대로 배치될 수 있다.

도 6은 다수 모세 채널을 형성하는 상이한 층과 하층을 분해사시도로 도시한다. 하부층(102)은 전술한 모세 채널(200)의 하부층과 마찬가지로 플라스틱 재료로 제조된다.

중간층(202)은 모세 채널(200)을 위해 전술된 중간층의 동일한 특징을 바람직하게 갖는 플라스틱 재료층이며, 2개의 채널(212, 222)의 주변 프로파일은 수집 덕트(232)에 의해 제1 단부에 연결되도록 제조된다. 분류 채널(212, 222)은, 예컨대 전술한 모세 패널(400)의 동일한 주변 프로파일을 가질 수 있다.

상부층(302)은 전술한 하층을 포함하며, 제1 하층(312)은 용출 유체 주입을 위한 각각의 분류 채널용 하나의 중앙 주입 포트(372)와, 각각의 모세 패널을 위한 2개의 측방향 주입 포트(382)와, 용출할 샘플의 주입 및 샘플 출력 포트를 위한 포트(392)를 구비한다. 이러한 하층은 바람직하게 폴리염화비닐, 폴리카보네이트 또는 폴리메타크릴산메틸로 제조되며, 예컨대 1 mm 내지 5 mm 범위의 두께, 바람직하게 3 mm의 두께를 갖는다.

제2 하층(322)은, 예컨대 PET 또는 PETG로 혹은 유사한 특징을 갖는 재료로 제조되며, 예컨대 0.2 mm 내지 0.7 mm 범위의 두께, 바람직하게 0.5 mm의 두께를 갖는다. 이러한 하층에는, 제1 하층(312)의 측방향 주입 포트(382)의 주입 덕트(402), 중앙 주입 포트(372)의 주입 덕트(412), 샘플 주입 포트(392)의 주입 덕트(422), 및 포트(112)의 주입 덕트(232)가 제조된다.

제3 하층(332)은 폴리염화비닐, 폴리카보네이트 또는 폴리메타크릴산메틸로 제조되며, 예컨대 1 mm 내지 5 mm 범위의 두께, 바람직하게 3 mm의 두께를 갖는다. 이러한 하층에는, 전술한 바와 같이 상부 주입 구멍(342, 352, 362, 112)이 제조된다.

본 발명에 따른 분류 장치의 작동과, 이를 실시하는 세포 시료 분류를 위한 방법은 하기의 설명에서 명백해진다. 전술한 바와 같이, 당해기술에 공지된 분류 방법의 단점 중 하나는 중앙으로부터 측벽으로 포물선 감소를 갖는 반송 유체의 종방향 속도에 관한 것이다. 이와 부분적으로 관련된 또 다른 문제점은, 초기에 세포가 채널의 중앙부 내로 강제되는 경향이 있고, 그 후 용출 채널 전방을 따라 팽창한다는 점이다. 세포 시료 반송 유체의 속도가 측벽 근방에서 0인 경향이 있기 때문에, 세포는 감속되어 분류 효율 및 세포 회수를 열악하게 할 수 있다. 그 대신에, 본 발명은 샘플이 모세 채널의 모든 벽을 접촉하지 않게 하여, 이러한 장치가 최소한의 조작 규정에 완전히 응답하게 한다.

분류 장치의 성능을 개선하기 위해, 본 발명에 따른 방법은 채널의 종축에 대응하는 분산상을 반송하는 중앙 흐름을 각각의 분류 채널 내에 갖기 위해 분류 채널(212, 222)을 공급하는데 이용되는 거의 2개의 상이하고 독립적인 유속과, 분류 채널의 측벽에 대응하는 2개의 측방향 흐름 또는 구속 흐름에 의해 분류 채널 내에 이동상을 삽입하는 것을 제안한다. 중앙 흐름에 대한 더 낮은 유속을 갖는 제1 및 제2 측방향 흐름은 세포 또는 생물학적 시료와 같은 샘플의 일부에 대한 측벽 상에 부착을 방지하는 동시에, 분류 채널의 모든 길이를 위한 중앙 채널에 용출된 샘플을 구속한다. 본 발명에 따른 분류 장치의 구성에서, 용출 유체를 위한 채널 중앙부의 이동상 유속은 0.5 ml/분 내지 0.5 ml/분의 범위, 바람직하게 0.8-1.0 ml/분의 차순이며; 채널의 측방향부에서의 제1 및 제2 구속 흐름의 유속은 중앙부 유속의 5% 내지 15% 범위, 바람직하게 그 유속의 10%이다.

본 발명에 따른 분류 채널의 모든 측벽을 따르는 제1 및 제2 구속 흐름의 존재는 분류 채널의 포물선 종방향 속도에 관한 기능 조건을 변경하여, 분류 채널 내에 "이동성(mobile)" 측벽을 발전시킨다.

더욱이, 분류할 샘플은 이동상 주입의 바로 하류에 배치된 주입 포트를 통해 이동상 흐름 내에 주입되며; 이러한 방편은 주입된 세포 시료의 양호한 구속을 허용한다.

분류 장치는 본 발명에 따른 방법의 작동 단계에 따라 시험되었으며; 예비 시험이 장치 내에 글루코오스를 주입하여 수행되었다. 도 7(A) 및 (B)의 차트에서 관찰될 수 있는 바와 같이, FEM 시뮬레이션의 결과는 2개의 장치에 대한 상이한 기능을 명백하게 도시한다. 그 차트에서, 채널의 폭보다는 채널의 전방 상의 위치에 관한 종방향 속도(도 7(A)) 및 총 흐름(7(B))의 변화 곡선이 각각 있다. 시뮬레이션을 위해, 1 ml/분의 이동상 유속과, 40.0 mm의 총 분류 채널 폭이 장치 양자를 위해 선택되었다. 이들 값이 표시되며, 상이한 치수와 상이한 유속을 갖는 채널이 본 발명과 호환가능함이 명백하다. 더욱 상세하게, 본 발명은 상술한 측방향 흐름의 유속과 중앙 흐름 사이의 비와 관련되고 층류를 생성하는 분류 채널(221, 212, 222)을 이용하여 구현가능하다.

종방향 속도장 프로파일(도 7(A) 참조)의 차이가 본 발명(점선) 및 당해기술(연속선)에 다른 채널의 상이한 트랜드로서 명확하게 관련된다면, 총 종방향 흐름 프로파일(도 7(B))의 변화는 특히 중요하다. 실제로, 흐름은 측벽으로부터 사전정의된 거리에서 실질적으로 0으로 감소된 것으로 보이므로, 본 발명에 따른 장치에 의해 용출할 샘플을 구속하는데 더 양호한 성능을 보인다.

이러한 결과는 이전과 같이 동일한 조건으로 연산된 주입 세포 샘플의 속도장 및 표면 흐름의 트랜드를 제공하는 유한 요소 시뮬레이션(FEM)에 의해 입증되며; 이러한 시뮬레이션은 본 발명에 따른 장치 내에 총 샘플 흐름 및 반송 유체의 속도장이 도 8-11에 도시한 차트에 적용된 디더링(dithering)에 기록된 바와 같이, 속도장(도 10(A) 및 (B)) 및 총 흐름(도 8(A) 및 (B)) 각각의 증대로서 더 밀집한 것으로 명확하게 두드러지며, 용출된 샘플의 더 높은 포커싱을 확인하는 것을 나타낸다. 특히, 도 8(A)는 종래의 분류 채널 내의 총 흐름에 대한 트랜드를 도시한다. 이러한 도면은 종래의 분류 채널 내의 흐름이 분류 채널의 측벽으로 연장되어 채널 측벽을 향해 분리할 샘플의 일부를 이송하는 방법을 도시한다. 도 8(B)는 본 발명에 따른 분류 채널 내의 총 흐름을 도시한다. 본 발명에 따른 분류 채널 내의 총 흐름 트랜드로부터, 분류 채널 내로 용출 흐름 또는 중앙 흐름에 대한 포커싱이 명확하게 증명된다. 용출 흐름은 분류 채널의 측벽으로부터 사전정의된 거리로 분류 채널의 중앙에 구속된다. 그 결과, 중앙 흐름에 의해 주입된 샘플의 시료는 채널 벽으로부터 소정 거리에 유지되고, 이로써 이러한 시료의 측벽으로의 부착이 회피된다. 도 9(A) 및 (B)는 도 8(A) 및 (B)를 지칭하는 것으로 벡터 형태로 흐름 트랜드를 도시한다.

도 10(A)은 종래의 분류 채널에서의 흐름 속도에 대한 트랜드를 도시한다. 종래 채널에 따른 횡방향 속도의 모든 트랜드는 포물선 형상이고, 그 속도는 분류 채널의 측벽 근방에서 0이다. 도 10(B)는 본 발명에 따른 분류 채널 내의 속도의 트랜드를 도시한다. 본 경우의 속도 프로파일은 본질적으로 일정하고, 채널의 중앙에서 평탄하고 측방향 채널 내에서 덜 알려진다. 시료를 분리하게 하는 횡방향 속도장은 포물선 형상으로 유지하며, 그 속도는 축적 및 주입벽 상에서 0이다. 도 11(A) 및 (B)는 도 10(A) 및 (B)에서 언급된 바와 같이 벡터 형태로 속도 트랜드를 도시한다.

상이한 세포 시료에 대한 몇 가지의 분류 시험을 수행했으며; 도 12(A)는 당해기술에 공지된 분류 장치(연속선) 및 본 발명에 따른 분류 장치 및 방법(점선)에 의해 각각 분류되는 2가지의 줄기세포 샘플에 대한 용출 차트를 도시한다.

치수(dental pulp)(DP-MSC)로부터의 간충직 줄기세포를 양자의 장치에 주입하였고; 이동장으로서 등장성(isotonic) PBS + BSA 0.1%를 사용하였다. 주입된 샘플은 100 ㎕ 내에 300,000 세포를 수용하였다. 차트는 시간함수에서 흡관도를 나타낸다.

실험 결과는 본 발명에 따른 장치를 이용하여 더 높은 세포 회수 및 더 양호한 분리 특성을 강조하며, 그 조건은:

- 분리 채널의 동일한 용적(표준 형상을 갖는 4 cm / 유체 레일을 갖는 4 cm);

- 분리를 위한 동일한 유체 유속(유체 가이드의 유속을 제외한 분리 흐름으로서 0.8 ml/분);

- 주입된 동일한 샘플

이다.

도 12(B)는 유사한 실험을 나타내며, 전체 혈액 샘플의 50 ㎕가 당해기술에 따른 분리 장치 및 방법(점선)과, 본 발명에 따른 분리 장치 및 방법(연속선) 각각에 의해 용출되고; 이동상은 염류 용액 및 BSA 0.1%이었다.

분리를 위한 "스톱 흐름(stop flow)" 단계를 필요로 하는 종(species)을 위한 회수, 효율 및 민감도에서 임의의 상당한 차이가 없다. 분리 공정은 채택된 실험 조건에 의해 영향을 받지 않고; 그 반대로, 적혈구 세포(HRBC)의 보유 용적에 대응하는 보유 피크의 이론적 가우스(theoretical Gaussian)에 대한 더 양호한 응집력이 관찰된다.

더욱이, 당해기술에 공지된 장치 내의 용출된 부분의 수집 포트 근방에서 사진이 취해지지만, 세포 시료는 측방향 흐름(도 13(A))과, 본 발명에 따른 장치(도 12B)) 없이 이동상의 주입 포트 하류의 포트를 통해 주입된다. 당해기술에 따른 장치의 경우에 양자의 기하학적 형상을 위한 입구에서 더 많이 포커싱되지만, 이동상 흐름 내로 바로 그 주입 포트를 통해 주입된 세포는 섹션을 따라 팽창하고 분포하여, 채널의 벽과 접촉하는 경향이 있다. 이는 샘플을 구속하는 것이 없어서 측벽 근방에서 팽창하기 때문에 일어난다. 이러한 결과는 본 발명에 따른 장치에서 일어나지 않는데, 그 이유는 세포가 측방향 흐름으로 인해 구속되기 때문이다.

본 발명에 따른 장치는 도 1-6에 도시된 바와 같이 제조될 수 있다. 이동상의 주입 포트(311, 321)는 모세 채널의 원위 단부 근방에 유리하게 배치된다. 포트는 채널 주변 프로파일(211)의 단부를 나누는 말단부(241, 251)의 정점으로 흐른다. 이러한 말단부는 상술된 소위 "이동벽"을 발전시키기 위해 채널 내에 독립적인 이동상 주입 흐름의 형성을 촉진한다.

유리하게, 용출용 샘플 주입 포트는 말단부의 베이스라인 근방에 본 발명에 따른 모세 패널의 종축 상에 배치된다.

더욱이, 도 5 및 6에 도시한 다수의 분류 채널 장치는 세포의 1 내지 2백만 범위에서 다수의 대상물, 예컨대 세포로 샘플 처리에 특히 적합하다.

다수의 채널 분류 장치를 위한 해결책은 다수의 채널(2) 내에 배치된 2개 이상의 모세 채널을 공급하기 위해 그 자체의 흐름 분포 덕트 시스템을 갖는 장치, 이동상의 하나만의 주입 덕트 및 용출된 부분의 하나만의 수집 포트를 갖는 것에 대한 제조에 의해 제공된다.

상부층(302)을 이루는 하층(312, 322, 332)은 중간층(202) 내에 얻어진 주변 프로파일에 의해 설명되는 모세 채널(212, 222) 양자 내에 주입된 샘플과, 이동상의 주입 흐름을 나누게 한다. 이로써, 얻어진 다수의 모세 채널은 당해기술에 따른 다수의 채널 장치보다 더 콤팩트하고, 더 효율적이고 신뢰성 있는 제조 형태로 나타난다.

다수의 채널 분류 장치는 매우 높은 분류 성능을 허용하며, 이는 도 1-3에 도시한 전술된 단일의 모세 채널의 동일한 기능 원리에 근거하며, 도 1-3에 기술된 특징이 도 5 및 6에 기술된 구성에 그리고 그 반대로 호환 및 적용가능함이 암시된다. 예컨대, 도 1에 기술된 제어 수단(400)은 도 2-6에 기술된 장치에 의해 이용가능하다. 동일한 방식으로, 도 5 및 6에 기술된 주입벽(302)은 주입벽(301)에 교대로 분류 장치(200)를 위해 이용될 수 있다.

양자의 장치는 본 발명에 따른 장치를 폐기가능한 것으로 사용할 가능성을 갖기 위해 사용된 재료 및 제조에 의해 구조적으로 설계된다.

더욱이, 본 발명은 분산상의 동적 분류를 위한 방법을 언급한다. 도 1-13의 분류 장치를 기술하는 분리 공정에 따른 특징은 본 발명에 따른 방법에 적용가능하며, 이는 제1 주입 포트를 통해 모세 채널 내로 주입되는 제1 구속 유체와, 제2 주입 포트를 통한 제2 구속 유체를 구비한다. 제1 및 제2 구속 유체는 제1 및 제2 사전정의된 유속으로 각각 공급된다. 더욱이, 상기 방법은 제1 및 제2 주입 포트들 사이에 배치된 제3 주입 포트를 통해 이동상을 공급하기 위해 주입된 용출 유체를 포함한다. 용출 유체는 제1 및 제2 구속 유체들 사이에 용출 유체를 구속하기 위해 제1 및 제2 사전정의된 유속보다 큰 제3 사전정의된 유속을 갖는다.

본 발명의 제조 형태에 따르면, 방법은 하기의 단계를 포함한다.

a) 이동상 내로 분산되는 세포 시료 샘플의 마련;

b) 거의 하나의 모세 채널을 포함하는 적절한 분류 장치의 놓인 평면에 수직하게 염류 및 생체적합성 용액의 연속적인 흐름에 의한 샘플의 주입;

c) 장치 내로의 샘플 용출; 및

d) 시작 샘플로부터 개시된 군 또는 계군에서 격리된 상이한 세포종에 의해 구성된 부분 수집.

샘플 주입 단계 후에 그리고 샘플 용출 단계 전에, 선택적으로 용출 유체 흐름이 중지될 수 있다. 변형적으로, 주입 및 용출 단계는 이동상 중지 흐름 없이 실시되므로, 장치의 축적벽과의 접촉 상호작용을 방지할 수 있다.

이동상은 분류 장치의 측방향부 근방에서 상기 분류 장치의 중앙부 내로 사전정의된 유속에 의해 그리고 중앙부의 유속보다 낮은 유속에 의해 공급된다.

본 발명에 따른 방법으로서, 제1 및 제2 구속 유체의 제1 및 제2 주입 유속은 용출 유체의 제3 사전정의된 이동상 유속의 5% 내지 25% 범위로 선택될 수 있다. 유리한 형태에서, 제1 및 제2 사전정의된 유속은 제3 사전정의된 유속의 10%이다.

더욱이, 본 발명에 따른 방법은 분류 조건 및 주입될 샘플의 타입에 따라 제1 및 제2 구속 유체 및/또는 용출 유체의 유속을 설정함으로써 구현된다. 용어 분류 조건은 주입될 대상물의 분류 및 기기장치의 기능에 적합한 모든 조성의 변수를 지칭한다. 예컨대, 이동상 조성(상이한 pH, 염도, 이온강도, 계면활성제를 갖는 수용성 또는 유기 용액), 용출의 유속 및 속도, 측방향 및 주입 흐름, 소정 시간 동안의 하나 이상의 흐름의 중지, 샘플 주입된 양 및 농도, 분석 시간, 시스템 마련 및 컨디셔닝의 단계.

본 발명에 따른 상술한 방법 및 장치에서, 분산상은 생물학적 시료, 특히 특정 세포 및/또는 줄기세포에 의해 조성될 수 있다.

도 1-4 및 7-13을 언급하여 기술된 장치 및 분류 장치의 도 5 및 6에 따라 기술된 장치 및 분류 장치와 명백하게 호환되고, 도 5 및 6에 따라 기술된 장치 및 분류 요소 내에서 실시가능하다. 더욱 상세하게, 임의의 도면을 언급하여 기술된 구현 형태에 따라 기술된 특징은 나머지 도면을 언급하여 기술된 구현 형태에서 실시될 수 있다.

Claims

분산 유체(dispersing fluid) 내의 분산상(dispersed phase)의 동적 분류(dynamic fractionation)를 위한 장치에 있어서,
분류 채널(221, 212, 222);
상기 분류 채널 내에 제1 구속 유체를 주입가능한 제1 주입 포트(321)와, 상기 분류 채널(221, 212, 222) 내에 제2 구속 유체를 주입가능한 제2 주입 포트(321); 및
상기 분류 채널(221, 212, 222) 내에 상기 분산상을 반송(transporting)하기 위한 용출 유체(elution fluid)를 주입가능하며, 상기 제1 및 제2 주입 포트(321)들 사이에 배치되는 제3 주입 포트(311)
를 포함하며,
상기 분류 채널(221, 212, 222)의 제1 단부는 상기 제1 내지 제3 주입 포트(311, 321)들에 대응하는 제1 내지 제3 말단부(241, 251)를 구비하고,
상기 제1 내지 제3 말단부(241, 251)는, 상기 제1 및 제2 구속 유체가 제1 및 제2 사전정의된 유속을 각각 갖고, 상기 용출 유체가 제3 사전정의된 유속을 가질 수 있도록 치수 설정되며, 상기 제3 사전정의된 유속은 상기 제1 및 제2 유속보다 커서 상기 제1 및 제2 구속 유체들 사이에 상기 용출 유체를 구속하고,
상기 제1 및 제2 주입 포트(321) 각각에 대응하는 상기 제1 및 제2 말단부(251)의 베이스의 폭은 상기 제3 주입 포트(311)에 대응하는 상기 제3 말단부(241)의 베이스의 폭의 25% 내지 50% 범위에 있는
것을 특징으로 하는,
동적 분류용 장치.
제1항에 있어서,
상기 제1 내지 제3 말단부(241, 251)는, 그 해당하는 종축이 서로 평행하고 상기 분류 채널(221, 212, 222)의 종축에 평행하도록 구성되어, 상기 용출 유체가 상기 제1 및 제2 구속 유체에 평행하게 흐를 수 있는,
동적 분류용 장치.
제1항 또는 제2항에 있어서,
상기 제1 내지 제3 말단부(241, 251)는 아치형인,
동적 분류용 장치.
제1항 또는 제2항에 있어서,
상기 분류 채널(221, 212, 222) 내에서 분산 유체 내의 상기 분산상을 주입하기 위한 샘플 주입 포트(331)를 더 구비하며, 상기 샘플 주입 포트(331)는 상기 분류 채널(221, 212, 222) 내에서 상기 용출 유체 내에 상기 분산상을 주입하게 하도록 위치설정되는,
동적 분류용 장치.
제1항 또는 제2항에 있어서,
상기 제1 내지 제3 주입 포트(211, 321)와 유체식으로 연결하며 상기 용출 유체의 흐름을 상기 제3 사전정의된 유속으로 제어하는 적어도 하나의 제1 스트림 제어 수단(441)을 더 포함하며,
상기 적어도 하나의 제1 스트림 제어 수단(441)은 상기 제1 구속 유체의 흐름을 상기 제1 사전정의된 유속으로 제어하고, 상기 제2 구속 유체의 흐름을 상기 제2 사전정의된 유속으로 제어하는,
동적 분류용 장치.
분산 유체(dispersing fluid) 내의 분산상(dispersed phase)의 동적 분류(dynamic fractionation)를 위한 방법에 있어서,
제1 주입 포트(321)를 통해 제1 구속 유체와, 제2 주입 포트(321)를 통해 제2 구속 유체를 분류 채널(221, 212, 222) 내에 주입하는 단계로서, 상기 제1 및 제2 구속 유체는 제1 및 제2 사전정의된 유속으로 각각 공급되는, 상기 제1 및 제2 구속 유체의 주입 단계; 및
제3 주입 포트(311)를 통해 이동상(mobile phase)을 공급하기 위한 용출 유체를 상기 제1 및 제2 주입 포트(321)들 사이에 배치된 상기 분류 채널(221, 212, 222) 내에 주입하는 단계로서, 상기 용출 유체는 제3 사전정의된 유속으로 공급되는, 상기 용출 유체의 주입 단계
를 포함하며,
상기 제3 사전정의된 유속은 상기 제1 및 제2 유속보다 커서 상기 제1 및 제2 구속 유체들 사이에 상기 용출 유체를 구속하고,
상기 제1 및 제2 구속 유체의 상기 제1 및 제2 사전정의된 유속은 상기 용출 유체의 상기 제3 유속의 5% 내지 25% 범위에 있는
것을 특징으로 하는,
동적 분류 방법.
제6항에 있어서,
상기 제1 및 제2 구속 유체와 상기 용출 유체는 상기 분류 채널(221, 212, 222)의 제1 단부의 제1 내지 제3 말단부(241, 251)에 대응하는 상기 분류 채널(221, 212, 222) 내에 주입되는,
동적 분류 방법.
제6항 또는 제7항에 있어서,
상기 제1 및 제2 구속 유체의 상기 제1 및 제2 사전정의된 유속은 상기 제3 사전정의된 유속의 10%인,
동적 분류 방법.
제6항 또는 제7항에 있어서,
분산 유체 내에 분산상의 샘플을 마련하는 단계;
샘플 주입 포트(331)를 통해, 상기 분류 채널(221, 212, 222)을 통해 흐르는 상기 용출 유체 내에 마련된 샘플을 도입하는 단계;
상기 분류 채널(221, 212, 222)로부터 상기 마련된 샘플을 용출하는 단계; 및
상기 마련된 샘플의 도입 단계 후에 그리고 상기 마련된 셈플의 용출 단계 전에, 상기 용출 유체의 흐름을 중단하는 단계
를 더 포함하는,
동적 분류 방법.
제6항 또는 제7항에 있어서,
분류 조건 및 주입된 샘플의 타입 중 하나 또는 그 양자에 근거하여, 상기 용출 유체 또는 상기 제1 및 제2 구속 유체의 유속을 설정하는 단계를 더 포함하는,
동적 분류 방법.
제6항 또는 제7항에 있어서,
상기 분산상은 생물학적 시료를 구비하는,
동적 분류 방법.