KR101936537B1 - 식물정화에 사용된 해바라기 바이오매스를 이용한 바이오에탄올 제조방법 - Google Patents

Abstract

본원은 식물정화에 사용된 해바라기 바이오매스를 이용한, 바이오에탄올 제조방법에 관한 것이다.

Description

식물정화에 사용된 해바라기 바이오매스를 이용한 바이오에탄올 제조방법{METHOD FOR PRODUCING BIOETHANOL FROM SUNFLOWER USED FOR PHYTOREMEDIATION}

본원은 식물정화에 사용된 해바라기 바이오매스를 이용한, 바이오에탄올 제조방법에 관한 것이다.

해바라기는 전 세계에서 네 번째로 많이 사용되는 지방 종자이며 2,500만 헥타르 이상의 토지에서 경작된다. 추산되는 바에 따르면 1 헥타르당 수확되는 해바라기는 머리 부분 (10%)과 줄기를 포함하여 3-7톤의 건조 바이오매스를 생성한다. 식물유의 수요 증가에 따라 해바라기의 경작량은 매년 10 내지 20% 증가해 왔으며, 이에 따라 해바라기 줄기의 축적량도 크게 증가했다. 종자를 수확한 후에, 해바라기 줄기는 바이오에탄올, 메탄, 자일리톨, 자일로올리고사카라이드, 항산화제, 셀룰로오스 펄프 및 종이의 연료로 고려되었다. 해바라기 종자 껍질 역시 에탄올 생산의 원료로 사용되어 왔다.

해바라기는 금속-오염된 토양의 식물정화에도 또한 사용된다. 몇몇 연구들에 의하면 해바라기는 니켈(Ni), 구리(Cu), 비소(As), 납(Pb) 및 카드뮴(Cd)과 같은 다양한 중금속에 대한 강한 내성 때문에 중금속의 식물정화에 우수한 후보임이 알려졌다. 중금속은 인간의 건강에 악영향을 미치는 독성 물질이다. 가장 흔한 중금속은 카드뮴, 크롬, 구리, 수은, 납 및 아연이며, 이들은 20보다 큰 원자번호를 가지며 금속의 성질을 가지고 있다. 이들 금속들은 잘 분해되지 않기 때문에 이들의 정화에는 일반적으로 이들의 제거가 요구된다. 금속의 영향을 받은 토양을 정화하는 해바라기의 능력은 기존에도 알려진 바 있었다. 해바라기는 금속 오염된 땅에서 자라면서 중금속을 격리시킬 수 있기 때문에 식물정화에 유용한 것으로 알려졌다. 그러나, 수확 후 들판에 남은 해바라기 줄기, 해바라기 머리 부분 및 잎은 소각되기 때문에 환경 오염을 유발한다. 매년 생성되는 대량의 해바라기로부터 목질 섬유소 잔여물이 나오며, 이는 당(sugar)의 주된 저비용 원료로 사용될 수 있으며, 이들 당은 가수분해 및 유리당의 발효에 의해 유용한 물질, 예를 들어 에탄올로 전환될 수 있다.

목질 섬유소 식물 바이오매스는 가장 풍부한 재생가능한 탄소 공급원인 동시에 유지가능한 바이오리파이너리 산업의 기반을 제공한다. 목질 섬유소 바이오매스를 발효가능한 당으로 전환하는 데 있어서 가장 큰 문제는, 바이오컨버젼을 위한 효율적인 효소 시스템이다. Trichoderma reesei 는 섬유소 분해 효소의 제조에 가장 널리 사용되는 진균이다. 그러나 연구에 따르면 단일 성분 셀룰라아제 또는 순수 배양으로부터의 셀룰라아제는 고차 폴리머를 효율적으로 모노머로 전환할 수 없었다.

따라서, 식물로부터 바이오에탄올을 효율적으로 생산하기 위해서는, 적절한 효소 또는 효소의 조합을 사용해야 함은 물론이며, 이로부터 높은 에탄올 생산 수율을 얻기 위한 최적의 조건을 설정하는 것이 매우 중요하다.

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본원의 목적은 중금속으로 오염된 토양에 식재되어 식물정화에 사용된 해바라기를 이용하여 효율적으로 바이오에탄올을 생산하는 방법을 제공하는 것이다.

본원에서는, 목질 섬유소 바이오매스의 당화에 효과적인, 포리오타 아디포사(Pholiota adiposa) 및 아르밀라리아 제미나(Armillaria gemina) 에서 수득된 리그노셀룰라아제를 고축적 해바라기 바이오매스의 당화에 사용하였다. 또한, 바이오 에탄올 제조를 위한 전처리, 해독 및 당화 공정의 최적화를 위해 본원에서는 토양 내의 금속 오염물 (As, Cd, Co, Cr, Cu, Fe, Mn, Ni, Pb, 및 Zn)의 농도가 계산되고, 바이오매스의 상이한 부분들에 축적된 이들 금속의 양이 측정되고, 바이오매스로부터 얻어진 투명한 가수분해물의 적합성이 커플링된 발효 반응을 이용해 테스트되었다.

그러나, 본원이 해결하고자 하는 과제는 이상에서 언급한 과제로 제한되지 않으며, 언급되지 않은 또 다른 과제들은 아래의 기재로부터 당업자에게 명확하게 이해될 수 있을 것이다.

본원의 제 1 측면은, 중금속에 의해 오염된 토양에 해바라기(Helianthus annuus)를 식재하여 해바라기에 중금속을 축적시키는 단계; 중금속이 축적된 해바라기를 채취한 후 알칼리 가수분해하는 전처리 단계; 전처리된 해바라기 바이오매스를 타이로마이세스 키오네우스(Tyromyces chioneus) 유래의 라카아제 (TcLac)를 이용하여 해독하는 단계; 해독된 해바라기 바이오매스를 포리오타 아디포사(Pholiota adiposa) 및 아르밀라리아 제미나(Armillaria gemina) 유래의 리그노셀룰라아제의 조합을 이용하여 당화하는 단계; 및 효모를 이용하여 당화된 바이오매스로부터 에탄올을 생성하는 단계를 포함하는 바이오에탄올 제조방법을 제공할 수 있다.

본원의 일 구현예에 따르면, 상기 타이로마이세스 키오네우스는 수탁번호 KFCC 11573P로 기탁된 것일 수 있다.

본원의 일 구현예에 따르면, 상기 포리오타 아디포사는 수탁번호 KCCM 11187P 로 기탁된 것일 수 있다.

본원의 일 구현예에 따르면, 상기 아르밀라리아 제미나는 수탁번호 KCCM 11186P 로 기탁된 것일 수 있다.

본원의 일 구현예에 따르면, 상기 중금속은 비소(As), 카드뮴(Cd), 코발트(Co), 크롬(Cr), 구리(Cu), 철(Fe), 망간(Mn), 니켈(Ni), 납(Pb), 및 아연(Zn)의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것일 수 있다.

본원의 일 구현예에 따르면, 상기 전처리는 2% NaOH를 이용하여 210℃에서 1 시간 동안 수행되는 것일 수 있다.

본원의 일 구현예에 따르면, 상기 라카아제는 5 내지 10 IU로 사용되는 것일 수 있다.

본원의 일 구현예에 따르면, 상기 포리오타 아디포사 및 아르밀라리아 제미 나 유래의 리그노셀룰라아제의 조합은 5 내지 10 FPU/g로 사용되는 것일 수 있다.

본원에 따르면, 중금속을 함유하는 오염된 토양에 해바라기를 식재하여 오염된 토양을 정화하는 동시에, 중금속이 축적된 해바라기로부터 효율적으로 바이오에탄올을 생산하는 방법을 제공할 수 있다. 특히, 본원에서는 전처리된 바이오매스 내의 잔여 페놀 화합물이 당화 및 에탄올 발효를 저해하는 것을 방지하기 위해 타이로마이세스 키오네우스(Tyromyces chioneus) 유래의 라카아제 (TcLac)를 이용해 전처리된 해바라기 바이오매스를 해독하고, 포리오타 아디포사(Pholiota adiposa) 및 아르밀라리아 제미나(Armillaria gemina) 유래의 리그노셀룰라아제의 조합을 이용하여 바이오매스를 당화함으로써 우수한 당화 효율에 도달할 수 있었다. 특히, 포리오타 아디포사(Pholiota adiposa) 및 아르밀라리아 제미나(Armillaria gemina)가 혼합된 진균 배양은 단일 배양에 비하여 향상된 생산성, 적용성 및 기질 활용성 등의 효과들을 나타낼 수 있었다.

도 1은 (a) 비소, (b) 카드뮴, (c) 납, (d) 구리, (e) 니켈 및 (f) 아연 이온의 상이한 농도에 따른 T. 키오네우스 라카아제의 잔여 활성을 보여주는 그래프이다. ●는 1 시간, ○는 2 시간, ▼는 3 시간 및 △는 4 시간 동안 효소가 특정 조건 하에서 37℃에서 인큐베이션된 결과이다.
도 2는 전처리된 해바라기 바이오매스의 TcLac을 이용한 해독 반응 온도의 최적화 그래프이다. 실험은 5 U의 TcLac을 이용해 180 분 동안 pH 5.0 (0.1 N 염산), 35℃에서 진탕 (150 rpm)하면서 수행되었다.
도 3은 전처리된 해바라기 바이오매스의 해독을 위한 TcLac 용량 최적화 그래프이다. 해독 공정은 180 분 동안 pH 5.0 (0.1 N 염산), 35℃에서 진탕 (150 rpm)하면서 수행되었다.
도 4는 전처리된 해바라기 바이오매스를 TcLac을 이용해 해독하는 공정에 있어서 인큐베이션 시간의 최적화 그래프이다. 해독 공정은 10 U의 TcLac을 이용해 pH 5.0 (0.1 N 염산), 35℃에서 진탕 (150 rpm)하면서 수행되었다.

이하, 첨부한 도면을 참조하여 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자가 용이하게 실시할 수 있도록 본원의 구현예 및 실시예를 상세히 설명한다.

그러나 본원은 여러 가지 상이한 형태로 구현될 수 있으며 여기에서 설명하는 구현예 및 실시예에 한정되지 않는다. 그리고 도면에서 본 발명을 명확하게 설명하기 위해서 설명과 관계없는 부분은 생략하였으며, 명세서 전체를 통하여 유사한 부분에 대해서는 유사한 도면 부호를 붙였다.

본원 명세서 전체에서, 어떤 부분이 어떤 구성요소를 "포함"한다고 할 때, 이는 특별히 반대되는 기재가 없는 한 다른 구성요소를 제외하는 것이 아니라 다른 구성 요소를 더 포함할 수 있는 것을 의미한다.

본 명세서에서 사용되는 정도의 용어 "약", "실질적으로" 등은 언급된 의미에 고유한 제조 및 물질 허용오차가 제시될 때 그 수치에서 또는 그 수치에 근접한 의미로 사용되고, 본원의 이해를 돕기 위해 정확하거나 절대적인 수치가 언급된 개시 내용을 비양심적인 침해자가 부당하게 이용하는 것을 방지하기 위해 사용된다. 또한, 본원 명세서 전체에서, "~ 하는 단계" 또는 "~의 단계"는 "~를 위한 단계"를 의미하지 않는다.

본원 명세서 전체에서, 마쿠시 형식의 표현에 포함된 "이들의 조합"의 용어는 마쿠시 형식의 표현에 기재된 구성 요소들로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상의 혼합 또는 조합을 의미하는 것으로서, 상기 구성 요소들로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상을 포함하는 것을 의미한다.

본원 명세서 전체에서, "A 및/또는 B"의 기재는, "A 또는 B, 또는, A 및 B"를 의미한다.

이하 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세하게 설명하고자 하나, 하기의 실시예는 단지 설명의 목적을 위한 것이며 본원의 범위를 한정하고자 하는 것은 아니다.

해바라기( Helianthus annuus )의 재배, 전위 처리(front end processing) 및 특성분석

해바라기는 11 kg (건조 중량)의 시험 토양 및 3 반복의 각각의 농도의 중금속으로 채워진 PVC 포트(30 × 26 cm)에서 재배되었다. 재배는 22℃의 온실 내에서, pH 6.5 내지 7.5에서 거의 12 시간의 광주기에서 수행되었다. 토양 내 중금속의 농도는 비소에서 최대 100 mg/kg, 카드뮴에서 최대 100 mg/kg, 구리에서 최대 450 mg/kg, 니켈에서 최대 100 mg/kg, 납에서 최대 2,000 mg/kg, 그리고 아연에서 최대 300 mg/kg였다. 식물 분석을 위해서, 포트 내의 해바라기(SF)는 조심스럽게 토양으로부터 제거되었고; 뿌리 (R_sf), 줄기 (S_sf), 잎 (L_sf), 및 꽃 (F_sf)이 이어서 분리되었고, 이어서 토양 입자를 제거하기 위해 증류수로 세척되었다. 뿌리, 줄기, 잎 및 꽃은 오븐 (SH-MPM, Vision, Korea) 내에서 105℃에서 24 시간 동안 건조되었으며, 식물 조직의 건조 중량이 측정되었다. 건조된 식물 조직은 중금속 농도 측정을 위해 밀(mil)을 이용해 균질화되었다. 균질화된 식물 조직들은, 중금속 분석을 위한 EPA 3052 방법에 따라 HNO₃, H₂O₂, 및 증류된 H₂O (9:1:1, v/v/v)의 용액에서 마이크로파 시료분해장치(MSP 1000, CEM, USA)를 이용해 분해(digest)되었다. 분해된 샘플들은 0.45 ㎛ 실린지 필터를 통해 필터링되었으며, 탈이온수를 첨가하여 부피 측정 플라스크 내에 25 ml씩 담았다. 식물 조직 내의 중금속 농도는 유도결합 플라즈마 분광분석기(inductively coupled plasma-optical emission spectrometer)(ICP-OES, iCAP 7000, thermos, USA)를 이용해 측정되었다.

진균의 유지 및 효소 생산

진균 스트레인(strain)의 배양 및 유지는 종래에 기술된 대로 수행되었다. 본원에서 사용된 P. adiposa SKU714 및 A. gemina KJS114의 KCCM 수탁번호는 각각 11187P 및 11186P였다. 효소 생산을 위해, P. adiposa SKU714 및 A. gemina KJS114은 배양 배지 내에 1:2의 비율로 접종되었다. 라카아제(laccase)를 생산하는 새로운 진균이 또한 단리되었고, 이의 ITS1-5.8S-ITS2 rDNA 부분이 계통 발생적 분석을 위한 특정 프라이머 세트를 이용해 증폭되었다.

진균들의 조합은 종래 기술된 방법에 따라 다양한 촉매 활성을 측정함으로써 그 특성이 분석되었다: 필터 페이퍼 활성 (FPU); p-니트로페닐-β-D-글루코피라노시드 (pNPG)에 대한 β-글루코시다아제 작용 (BGL), 엔도-β-1,4 글루카나아제 (EG) 활성, 자이라나아제 (xylanase)활성, 및 1 mM 2,2-아지노비스-[3-에틸벤조티아졸린-6-설포네이트] (ABTS)의 산화 속도와 연관된 라카아제의 활성. 환원되는 당의 유리는 디니트로살리실릭산(DNSA) 시약 방법을 이용해 측정되었다. 원료(crude) 조합 효소의 잔여(residual) FPU는 효소를 최대 48 시간 동안 상이한 농도의 금속 이온 (버퍼 내에 용해; pH 5.0)과 함께 35℃의 정적 조건 하에서 인큐베이션 한 후에 확인되었다.

전처리: 2% 수산화나트륨을 이용한 열화학 방법

상이한 부분들의 바이오매스의 알칼리-매개 전처리가 종래 기술된 방법에 의해 수행되었다. 전처리 후, 용출액(effluent)의 pH가 7.0이 될 때까지 증류수를 이용하여 잘 세척하였으며, 이어서 버퍼 용액 (pH 5.0)에 밤새 침지시켰다. 침지된 바이오매스는 원심분리 (8000 g; 10 분)에 의해 버퍼 용액으로부터 회수되었으며 이어서 항량(constant weight)으로 건조 (60°C; 12 시간)되었다.

해독: 진균 라카아제 및 고축적된 바이오매스

Tyromyces chioneus로부터 얻은 원료(crude) 라카아제(TcLac)가 알칼리-전처리된 SF 바이오매스를 해독하기 위해 사용되었다. 원료 TcLac에서는 라카아제 활성만이 존재하였으며, 망간 퍼옥시다아제 또는 리그닌 퍼옥시다아제와 같은 다른 리그닌 분해성 효소는 탐지되지 않았다. pH, 인큐베이션 시간, 및 해독 처리를 위한 라카아제 용량을 최적화하기 위해 예비 분석이 수행되었다. 분석은 회전식 진동기 (150 rpm) 내의 30℃의 25 mL 50 mM 버퍼 내의 전처리된 볏짚 2 g (건조 중량)을 함유하는 100 mL의 에를렌마이어(Erlenmeyer) 플라스크 내에서 수행되었다. 폴린-시오칼투(Folin-Ciocalteu) 방법을 이용하여 주기적으로 상청액의 총 페놀이 분석되었으며, 그 결과는 액상의 리터당 카테콜당량(CE)의 그램수로 표현되었다.

Microtox ®: 잔여 금속 오염물의 확인

효소적 당화가 수행되기 전에 전처리 및 해독된 고축적 SF 바이오매스 내의 금속 오염물의 보유량을 확인하기 위해, 전처리 단계의 용출액이 지표로서 사용되었다. TcLac-촉매된 해독 단계에서도 전처리된 기질로부터 오염물질이 걸러질 수 있기 때문에, 이어진 해독 단계에서도 용출액이 분석되었다. 용출액을 사용하여 분석함으로써, 금속 오염물을 걸러 냄으로 인해 용출액의 생태 독성이 현저하게 증가하는지 여부를 확인할 수 있다. 생태 독성이 높을수록, 더욱 많은 주요 금속들이 걸러진다는 것이며, 결과적으로 SF 바이오매스 내에 금속 오염물이 적게 보유된다는 것이다. 비-오염된 SF 바이오매스와 비-해독된 바이오매스로부터 유리된 용출액이 대조군으로서 사용되었다. 전처리 용출물은 Microtox® Model 500 analyzer (Modern Water, New Castle, DE, USA)을 이용해 81.9% 독성 테스트 프로토콜을 이용해 분석되었다. 각각의 샘플들의 상이한 희석물들이 준비되었으며, 각각의 샘플들의 삼투도가 제조자에 의해 제공된 삼투도-조정 용액을 이용해 조정되었다.Microtox® 분석에 의해 측정되는 종말점(endpoint)은 노출 5 및 15 분 후 발광 해양 박테리아 Vibrio fischeri에 의해 방출되는 빛의 강도 감소의 탐지에 의존한다. 따라서, EC_{50- 5min} and EC_{50- 15min} 는 박테리아의 발광의 50% 감소에 해당한다. 이들 EC 값들은 각각의 수집된 서브-샘플의 급성 독성을 측정하기 위한 수집된 각각의 용출물 서브-샘플들의 표준 81.9% 독성 테스트를 이용해 계산되었다. 시험 결과는 엑셀 워크시트에 입력되었으며 상이한 처리 샘플들 내의 색상 차이를 정규화하기 위해 수정되었다. 모델 유기체가 50% 사멸하는 데에 필요한 용출물의 EC를 각각의 샘플에 대해 측정하기 위해, 15 분 인큐베이션 후의 급성 독성 유닛(TOU)이 또한 계산되었다. 각각의 동결 건조된 박테리아 샘플의 민감도는 ZnSO₄·7H₂O를 기준 물질로 이용하여 실험실 내에서 주기적으로 확인되었다.

당화 : 파라미터 최적화

당화 수율(SY)에 영향을 미치는 상이한 물리적 파라미터들이, 오염되지 않은 대조군 바이오매스를 이용하여 종래의 일 변수 최적화(one-variable-optimization) 방법을 이용해 최적화되었다. 각각의 물리적 파라미터들, 즉 온도(T), 효소 용량(ED), 기질 농도(SC), 인큐베이션 시간(IT), 및 분당 회전수(rpm)이 SF 바이오매스의 각각의 부분, 즉 Rsf, Ssf, Lsf, 및Fsf 에 대하여 개별적으로 최적화되었다. 각각의 파라미터의 효과를 평가하기 위해, 환원당(RS)의 수율 및 SY이 고정되고 최적화되지 않은 조건(30°C, pH 4.5, 효소 10 FPU를 이용해 48 시간 동안 인큐베이션)을 이용해 계산되었다. IT를 최적화하기 위해, 샘플들은 반응 혼합물로부터 최대 48 시간의 규칙적인 간격 (6 시간) 후에 채취되어 RS (mg/g-기질) 및 이어서 SY (%)를 추산하였다. 유사하게, 최적화를 위해 광범위한 온도 (25-45°C) 및 회전 속도 (50-250 rpm)에 걸쳐서 당화 실험이 수행되었다. ED는 효소 밀리그램 당 2.5 내지 15 FPU 범위의 다양한 효소 농도를 이용하여 최적화되었다. SC의 경우, 상이한 농도 (0.5-2% w/v)의 전처리된 기질이 시험되었다. 상업화된 BGL (Novozyme-188)의증가율(augmentation)이 또한 상업화된 셀룰라아제(Celluclast 1.5 L) 단독과 조합된 고정된 효소 용량 (기질 그램 당 10 U/mg)을 이용해 조사되었다. RS의 추산은 540 nm에서 DNSA 분석을 이용해 수행되었으며, SY는 종래에 기술된 방법을 이용해 계산되었다.

고축적 해바라기의 가수분해물로부터 바이오에탄올 제조

효소적 당화 후에, 샘플들은 원심분리 (8000 g; 4°C; 20 분)되고, 바이오매스의 펠렛으로부터 분리된 투명한 용액 (가수분해물)을 수득하였다. SF 바이오매스의 상이한 부분들로부터 수득한 투명한 가수분해물들이 수집되었고, 함께 풀(pool) 되었으며, 바이오에탄올 생산을 위해 N₂-퍼징을 이용해 농축되었다. H . annuus의 투명한 가수분해물(CHHA)을 농축하여 5% (w/v) RS 농축물을 수득하였다. Saccharomyces cerevisiae (ATCC 32167)의 액체 종배양 (48 시간 배양됨)이 농축된 RS를 바이오에탄올로 전환하기 위한 접종원 (10% v/v)으로 사용되었다. 화학적으로 정의된 배지 (효모 추출물 5.0 g/L; (NH₄)₂SO₄ 10.0 g/L; KH₂PO₄ 4.5 g/L, 및 MgSO₄.7H₂O 1.0 g/L)가 농축된 RS 용액과 혼합되었으며 30℃에서 48 시간 동안 정적 조건 하에서 접종되었다. 에탄올 발효를 위한 가수분해물 배지의 성능을 비교하기 위해, 가수분해물이 탄소 소스인 덱스트로스로 대체된 합성 배지가 사용되었다. 샘플들은 매 6 시간 마다 수집되고, 원심분리 (8000 g; 4°C; 20 분)되었으며, 가스 크로마토그래피(GC)의 불꽃 이온화 검출기(flame ionization detector)를 이용해 덱스트로스 소모 및 에탄올 생산이 분석되었다. 헬륨 기체가 이동상으로 사용되었으며, 반면 공기 및 수소가 FID를 위해 사용되었다. 에탄올의 부피 생산성(g/L/h), 생산되는 에탄올의 수율 (g/L), 및 당 전환 효율 (%)이 종래 기술된 방법에 따라 계산되었다.

고축적 금속 오염물

고축적종이라고도 불리는 녹색 식물의 소집단은 하기의 금속 중 하나 이상을 그들의 싹 내로 흡수하고 격리하는 능력을 가진다: > 10,000 mg/kg 의 Zn 및Mn; > 1,000 mg/kg 의 Ni, Co, Cu, 및 Pb; 및> 100 mg/kg 의 Cd. 해바라기는 높은 흡수능을 가지며 독성 중금속의 생체 축적종으로 사용되어왔다. 낮은 농도 (10-150 mg/kg 건조 토양)의 Ni, As 및 Cd의 경우, Cd^{2 +} (161 mg/kg 건조 wt.)는 해바라기 잎 및 꽃 내에 가장 높은 농도로 축적된 반면, 뿌리 내에는 건조 중량 78.4 mg/kg만이 축적되었다 (표 1 참조). 유사하게, Ni 와 As에서, 꽃과 잎의 조합이 뿌리에 비해 높은 식물정화 효능을 나타내었다. Zn^{2 +}의 경우, 토양 내에 공급된 금속 이온의 최초 농도가 증가함에 따라, 식물에 의한 흡수 역시 증가하였다 (표 1 참조). 토양에 공급된 농도(즉, 300 mg-Zn/kg 건조 토양)에 비하여 거의 2.5배 이상의 Zn^{2 +}이 꽃과 잎의 조합 내에서 관찰되었다. 뿌리 단독에 의해 흡수된 농도는 공급된 Zn^{2 +}의 거의 1.5배였다 (표 1 참조). 성장 중인 해바라기에 Cu^{2 +}가 중간 농도(300 and 450 mg/kg 건조 토양)로 공급된 경우, 모든 식물 부분 중 가장 적은 축적능이 관찰되었다. 잎 및 꽃에는 75.3 mg의 Cu^{2 +}만이 존재하였으며, 줄기에는 10.3 mg만이 관찰되었다 (표 1 참조). 가장 높은 농도 (2000 mg/kg 건조 토양)에서 Pb의 축적과 관련하여, 잎 및 꽃의 조합에 의해 축적된 149 mg과 비교하여, 줄기에서 가장 높은 252 mg의 Pb^{2 +}의 축적능을 나타내었다. 중간 농도의 Pb (1000 mg/kg 건조 토양)에서도, 뿌리는 가장 높은 축적능 (136 mg)을 나타내었다. 그러나, 더 낮은 농도 (250 mg/kg dry soil)의 Pb^{2 +}가 유지된 경우, 뿌리 (29.1 mg), 및 잎 및 꽃의 조합 (26.3 mg) 모두에서 유사한 농도의 금속이 축적되었다 (표 1 참조). 대조군 토양에서 재배된 해바라기 조직 내의 중금속 농도가 분석되었으며 대조군으로 고려되었다.

효소 생산 및 금속 이온의 저해 효과

진균 스트레인들의 공배양은 그들의 동시 성장, 및 미량 원소와 미네랄 용액과 함께 유사한 탄소및 질소 소스의 활용 능력에 의존한다. 영양 요소들의 일 변수 표준화(One-variable standardization)에서, 밀겨를 탄소 소스로 이용하였을 때 가장 높은 2.57 U/mL의 FPU를 나타내었다. 전체 공정의 비용 효율성은, 탄소 소스 (셀룰로오스 또는 Avicel) 또는 질소 소스로서 상업화된 화합물을 사용함으로써 저해되었다. 유사하게, 일 변수 표준화를 통해 물리적 파라미터를 최적화하기 위해 7-L 발효조 (3-L- 작업 부피)가 사용되었다. 모든 최적화된 물리적 및 영양학적 조건 하에서, 배양된 P. adiposa 와 A. gemina의 상승작용으로 인해 각각의 단독 배양시에 비해 2.1 내지 3 배 높은 FPU 활성을 나타내었다. Celluclast는 단지 0.49 U/mg의 필터 페이퍼 활성을 나타내었을 뿐이며 191 mg/mL의 단백질 함량을 가졌다.

조합 효소가 금속-오염된 바이오매스의 가수분해를 위해 사용되기 때문에, 상이한 금속 이온의 존재에 대한 조합 효소의 민감성이 또한 연구되었다. 진균 조합 효소가 필터 페이퍼 활성 시험을 위해 로딩되어 있을 때, 당화를 위한 잔여 FPU 활성이 계산되었다. 설계된 당화 시험에 따라, 12 시간 내지 48 시간의 규칙적인 간격 이후에 잔여 활성이 계산되었다. 모든 시험된 금속 이온들 중에, Pb^{2 +}에 의해 최대의 저해 효과가 나타났으며 단지 1 mM의 이온 농도에서도 36 시간 후에 잔여 활성 40%을 나타내기에 충분했다. 비소 및 카드뮴 이온 또한 현저한 저해를 나타냈으며 각각 36 시간 및 48 시간 후에 40%의 잔여 활성이 관찰되었다. 조합 효소는 구리 및 니켈 이온에 대해서 유사한 저항성을 보였으며, 두 금속 오염물에 대해서 36 시간 후에 85% 이상의 잔여 활성이 관찰되었다. 조합 효소는 아연 이온에 대해서 가장 높은 저항성을 나타내었으며 100 mM, 35℃에서 36 시간 후에도 91% 초과의 잔여 활성을 보유하였다. 원료 조합 혼합물 내의 수많은 촉매 서브유닛의 존재는 이들 사이의 상승적 상호작용을 유발하고, 이에 따라 금속 이온에 대한 저항성을 제공하였을 것으로 보인다.

새로이 분리된 Tyromyces chioneus 진균으로부터 추출된 TcLac에서 우수한 K _m 특성 (2,6-디메톡시 페놀에서 75.5 μM) 이 관찰되었다. TcLac-생산 스트레인의 KCCM 수탁번호는 KFCC 11573P이다. 원료 TcLac은 또한 상이한 농도의 금속 이온에서 최대 4 시간의 인큐베이션에서 안정한 것으로 나타났다. 해독 공정은 4 시간 동안만 수행되기 때문에, 4 시간 이후에서의 금속 이온에 대한 저항성은 확인되지 않았다. 리그노셀룰라아제 저해와 유사한 경향이 다양한 금속 이온 오염물의 존재 하의 TcLac 활성의 저해에서도 나타났다. 최고 농도 (100 mM)의 Pb^{2 +}및 Zn^{2 +}이온의 존재 하에 37℃에서 진탕 (150 rpm)한 경우 4 시간 후에 TcLac 활성의 최대 저해 (10 IU)가 관찰되었다 (도 1 참조). 유사하게, Cd^{2 +}및 As^{2 +} 이온 50 및 100 mM이 동일한 수준의 효소 저해를 나타내었으며, 각각 34.5 및 29.6%의 잔여 TcLac 활성을 나타내었다 (도 1 참조). 다른 금속 오염물들 중, TcLac은 100 mM의 Cu^{2 +}에 대해 가장 높은 저항성을 보였으며, 4 시간의 인큐베이션 후에 66.3%의 잔여 라카아제 활성을 보유하였다 (도 1 참조). 게다가, TcLac은 각각의 금속 오염물 (1 mM)의 존재 하에 4 시간 동안 인큐베이션 한 후에도 90% 이상의 잔여 활성을 보유하였으며, 이는 TcLac이 금속 오염물이 고축적된 SF 바이오매스의 해독에 매우 적합하다는 것을 의미한다. 원료 조합 혼합물 내의 수많은 촉매 서브유닛의 존재는 이들 사이의 상승적 상호작용을 유발하고, 이에 따라 금속 이온에 대한 저항성을 제공하였을 것으로 보인다.

고축적 바이오매스의 열화학적 전처리

접합 물질로서의 리그닌의 존재로 인해, 이를 제거하고 셀룰로오스 물질을 효소적 가수분해에 노출시키기 위한 전처리가 필요하다. 본원에서, 열화학적 전처리가80 내지 100°C의 범위에서 2% NaOH를 이용하여 수행되었다. 주 구성 요소, 즉 셀룰로오스, 헤미셀룰로오스, 리그닌 및 회분의 정량적인 분석이 전처리의 전후에서 수행되었다. 전처리 전에는, SF 바이오매스는34.4% 셀룰로오스, 29% 리그닌, 및 20.1% 헤미셀룰로오스를 함유하였다. 전처리 후에는, 원하지 않는 헤미셀룰로오스 및 리그닌 물질이 바이오매스로부터 제거됨으로 인해 셀룰로오스 물질의 양이 증가하였다.

전처리된 바이오매스의 효소적 해독

바이오매스의 전처리 단계에서 잔여 페놀 화합물 (PCs)이 당화 효소 및 알코올 발효를 저해하는 것으로 알려져 있다. 따라서, 전처리된 SF 바이오매스는 해바라기의 투명한 가수분해물(CHHA)을 수득하기 위해 25 내지 45°C의 넓은 범위의 온도에서 TcLac을 이용해 해독되었다. 가장 높은 해독 효율이 35℃에서 관찰되었다 (도 2 참조). 최적화된 온도의 편차는 해독 효율의 현저한 저하를 유발하였다 (도 2 참조). 이는 최적 온도에서 TcLac의 최적 촉매 속도와 연관되어 있는 것으로 보인다. 유사한 경향이 잔여 PCs의 해독을 위한 TcLac 용량의 최적화에서 관찰되었다. 최적화된 TcLac 용량 (10 IU)은, 대조군 바이오매스에서의 0.83 g/L의 PCs에 비해 0.33 g/L의 총 잔여 PCs을 도출하였다 (도 3 참조). 인큐베이션 시간의 최적화에 의해 총 잔여 PCs가 0.25 g/L 까지 감소하였으며, 이는 비-해독된 바이오매스에 비해 69.8% 적은 것이다 (도 4 참조). 이러한 해독 단계를 더욱 단축시키기 위해, 240 분을 넘는 IT는 고려되지 않았다. Chandel 등은 진균 Cyathusstercoreus 의 라카아제 100 U을 이용한 나무 사탕수수 바가스 가수분해물의 해독을 연구하였다. 그 결과 5 시간의 반응 후 페놀 화합물이 77.5% 제거되었다. 그러나, 본원에서 사용된 반응 배지는 TcLac을 10 U만을 포함하며, 이는 종래의 연구에서 보고된 용량의 1/10에 불과하다. 많은 연구에서 라카아제가 리그노셀룰로오스 가수분해물을 해독할 수 있다는 것을 보였으며, 이로 인해 에탄올 생산성이 2-3배 증가한다고 알려졌다.

합성 매개제와 커플링된 라카아제-촉매된 해독은 이후의 세척 단계를 필요로 한다. 따라서, 전체 공정을 더욱 단순하게 하기 위해서, 매개제의 역할은 시험되지 않았다.

Microtox ®를 이용한 금속 고축적 확인

전처리 및 해독 단계로부터 수집된 용출액이 81.9% 독성 테스트 프로토콜을 위해 처리되었다. 대조군과 비교하여, 고축적된 바이오매스의 전처리 이후 수집된 용출액에서 급성 독성에는 뚜렷한 차이가 없었다 (표 2 참조). Microtox® 분석 인큐베이션의 5 분 및 15 분 후에, 급성 독성이 각각 9.8% 및 11.9% 만큼 미미하게 증가하였음이 관찰되었다 (표 2 참조). 이러한 사실은 대부분의 금속 오염물은 전처리 후에도 바이오매스 내에 남아있다는 것을 의미한다. 급성 독성의 증가는, 강한 열화학적 전처리 에너지에 의해 침출되는, 느슨하게 결합되어 있던 금속 이온에 의한 것일 수 있다. 더욱이, 전처리된 고축적 바이오매스의 용출액은 혼합 금속 오염물 용액에 비해 급성 독성이 66.1 및 72.3% 낮았는데 (표 2 참조), 이는 바이오매스 내에 금속 오염물이 남아있다는 사실을 뒷받침한다. 유사하게, 전처리된 고축적 SF 바이오매스의 해독 후에 수집된 용출물은 혼합 금속 오염물 용액에 비해 55.8 및 68.2% 낮은 급성 독성을 가졌다 (표 2 참조). 이는, 해독 후에도 85% 이상의 금속 오염물들이 바이오매스 내에 남아있다는 사실을 시사한다.

고축적바이오매스의 당화

최근의 식물정화의 주 목적은 금속 오염물의 생물흡착을 연구하고 고축적바이오매스로부터 상업적으로 가치있는 물질을 생산하는 것이다. 고축적된 해바라기 바이오매스의 적합성은 효소적 가수분해 및 당의 생산에 의해 확인된다. 바이오매스 kg 당 10 및 50 mg (니켈 및 비소)의 흡수된 금속 이온의 존재는 최종 당화 수율 (SY%)에 영향을 미치지 않았다. 가장 높은 SY% (87.4%)는 토양 내에 10 mg/kg의 Na²⁺가 공급된 줄기에서 관찰되었다. 유사하게, As^{2 +}의 식물정화에, 가장 높은 SY% (86.2%)는 꽃과 잎의 조합에서 관찰되었다. 그러나, Cd가 토양 내에 50 mg/kg로 공급된 경우, 바이오매스의 모든 부분에서 현저한 생물축적이 관찰되었다. 유사하게 생물축적된 Ni 및 As의 농도에서 수득된 수율과 비교하여 최종 SY%에서 미세한 감소만이 있었다는 사실은 카드뮴에 대한 해바라기의 높은 식물정화능을 확인시켜준다 (표 3 참조). 토양 내 100 mg/kg의 Ni, As 및 Cd 중에서, 가장 높거나 가장 낮은 SY는 Ni^{2 +}(84.2%) 및 Cd^{2 +}(63.3%)에서 각각 수행된 식물정화에서 관찰되었다. Zn^{2 +}의 식물정화의 경우, 가장 높은 SY (82.1%)는 128 mg의 금속이 축적된 해바라기의 줄기에서 관찰되었다. 토양 보다 2.5 배 높은 Zn^{2 +}오염물의 존재 하에서도, 거의 28%의 SY가 관찰되었다. 이는 제조된 진균 조합의 금속에 대한 내성을 또한 확인시켜주는 것이다 (표 1 참조). 그러나, 높은 농도 (토양 내에서 > 250 mg/kg)의 납은 진균 조합의 촉매적 거동에 부정적인 영향을 미쳤다. 가장 높은 SY (90%)는 Pb^{2 +}이 바이오매스에 의해 중간 농도 (26.3 mg)로 흡수된 해바라기의 줄기에서 관찰되었다. 바이오매스의 상이한 부분에서 흡수된 Pb^{2 +}의 농도가 증가함에 따라, 최종 SY는 감소하였다 (표 1 참조). 이는 진균 조합의 촉매적 거동에 대한 Pb^{2 +}의 부정적인 영향을 보여준다.

본원에서, P. adiposa 및 A. gemina 리그노셀룰라아제의 조합은 10 FPU/g의 효소 및 5.5%의 기질을 사용하였을 때 금속-흡수 해바라기 바이오매스에서 최대 87.4%의 당화 수율을 보였다. 종래의 보고에서는, 상업적으로 판매되는 효소인 Celluclast (8 to 25 FPU/g-기질) 및 Novozyme BGL의 2:1 및 1:1의 조합이 사용되어 57.8 내지 72%의 가수분해 수율이 수득되었다 (표 4 참조). 그러나, 이러한 효소 수준은 본원에서 사용된 것에 비하여 훨씬 많은 양이다. 본원에서 상업적으로 판매되는 효소인 (10 FPU) 및 Novozyme BGL (6 U)이 대조군으로 사용되었다.

바이오에탄올 생산

고축적 해바라기로부터 수득된 가수분해물의 적합성을 결정하기 위해 바이오에탄올 생산이 수행되었다. 비슷한 투명한 가수분해물이 줄기, 및 잎과 꽃의 혼합물에서 제조되었으며; 발효 반응은 가수분해물들 중 단 하나에 대하여 수행되었다. 줄기로부터 얻은 투명한 가수분해물이 선택되었는데, 이는 해독 후에 줄기 내의 잔여 리그닌이 꽃과 잎의 혼합물에 비해 적었기 (~7%) 때문이다. 더욱이, 줄기(Ni^{2 +}; 토양 내 10 mg/kg; 바이오매스 내 0.5 mg/kg)로부터 수득된 최종 SY%가 꽃과 잎의 혼합물에서 얻은 것보다 높았다. 가수분해물로부터 수득한 최종 에탄올 수율은 11.4 (g/L)이었으며, 이는 61.7%의 당 전환 효율에 해당한다 (표 3 참조). 잔여 당 함량은 낮았으며 (14 g/L), 이는 공정의 효율성을 나타낸다. 높은 당 전환 효율은 바이오에탄올 생산을 위한 가수분해물의 적합성을 시사하며, 식물정화에 있어서 고축적종인 해바라기의 잠재력을 의미한다.

본원에서 제공된 방법에 의해, 최적화된 조건은 534 mg/g-기질에 상응하는 최대 87.3%의 수율을 나타내었다.

전술한 본원의 설명은 예시를 위한 것이며, 본원이 속하는 기술분야의 통상의 지식을 가진 자는 본원의 기술적 사상이나 필수적인 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 쉽게 변형이 가능하다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 이상에서 기술한 실시예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적이 아닌 것으로 이해해야만 한다. 예를 들어, 단일형으로 설명되어 있는 각 구성 요소는 분산되어 실시될 수도 있으며, 마찬가지로 분산된 것으로 설명되어 있는 구성 요소들도 결합된 형태로 실시될 수 있다.

본원의 범위는 상기 상세한 설명보다는 후술하는 특허청구범위에 의하여 나타내어지며, 특허청구범위의 의미 및 범위, 그리고 그 균등 개념으로부터 도출되는 모든 변경 또는 변형된 형태가 본원의 범위에 포함되는 것으로 해석되어야 한다.

Claims (6)

1. (a) 10 mg/kg의 니켈(Ni²⁺)에 의해 오염된 토양에 해바라기(Helianthus annuus)를 식재하여 해바라기에 니켈을 축적시키는 단계;
   (b) 니켈이 축적된 해바라기의 줄기를 채취한 후, 2% NaOH를 이용하여 210℃에서 1 시간 동안 처리하여 알칼리 가수분해하는 전처리 단계;
   (c) 전처리된 해바라기 바이오매스를 수탁번호 KFCC 11573P인 타이로마이세스 키오네우스(Tyromyces chioneus) 유래의 라카아제 (TcLac) 10 IU를 이용하여 pH 5.0 (0.1 N 염산), 35℃에서 180분 동안 해독하여, 총 잔여 페놀 화합물을 0.25 g/L까지 감소시키는 단계;
   (d) 해독된 해바라기 바이오매스 5.5%를 수탁번호 KCCM 11187P인 포리오타 아디포사(Pholiota adiposa) 및 수탁번호 KCCM 11186P인 아르밀라리아 제미나(Armillaria gemina) 유래의 리그노셀룰라아제의 조합 10 FPU/g을 이용하여 당화하는 단계; 및
   (e) 효모를 이용하여 당화된 바이오매스로부터 에탄올을 생성하는 단계;를 포함하는 바이오에탄올의 제조방법.
   
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