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KR101900199B1 - 기능성이 향상된 신규 간엽성 전구세포, 이를 포함하는 항염증용 세포치료제 조성물 및 간엽성 전구세포의 제조방법 - Google Patents

기능성이 향상된 신규 간엽성 전구세포, 이를 포함하는 항염증용 세포치료제 조성물 및 간엽성 전구세포의 제조방법 Download PDF

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KR101900199B1
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Abstract

본 발명의 일 실시예는 중간엽 줄기세포(MSC, Mesenchymal Stem Cell)에 비해 표피성장인자 수용체(EGF-R, Epidermal Growth Factor Receptor)를 과발현하고, 중간엽 줄기세포에 비해 CD95(Cluster Differentiation 95)를 저발현하는, 기능성이 향상된 신규 간엽성 전구세포를 제공한다.

Description

기능성이 향상된 신규 간엽성 전구세포, 이를 포함하는 항염증용 세포치료제 조성물 및 간엽성 전구세포의 제조방법{NOVEL FUNCTIONALLY ENHANCED MESENCHYMAL PROGENITOR CELL, CELL THERAPEUTIC COMPOSITION FOR ANTI-INFLAMMATORY INCLUDING THE SAME AND METHOD FOR PREPARING MESENCHYMAL PROGENITOR CELL}
본 발명은 표피성장인자 수용체(EGF-R, Epidermal Growth Factor Receptor)를 과발현하고, CD95(Cluster Differentiation 95)를 저발현하는, 기능성이 향상된 신규 간엽성 전구세포(FEMP, Functionally Enhanced Mesenchymal Progenitor), 이를 포함하는 항염증용 세포치료제 조성물 및 간엽성 전구세포의 제조방법에 관한 것이다.
중간엽이란 배아 발생 중에 일어나는 상피-중간엽 이행(EMT, Epithelial to Mesenchyme Transition)에 의해 형성된 중간층에 해당하는 중배엽의 조직을 통칭하며, 인간 배아줄기세포는 이러한 초기 발생을 시험관 내에서 설명할 수 있는 유일하며, 유익한 세포의 원천으로써 사용할 수 있다.
현재 성체뿐만 아니라 인간 배아줄기세포 유래 중간엽 줄기세포 혹은 중간엽 전구세포에 대한 연구가 활발히 진행되고 있는 바, 성체에서 중간엽 줄기세포와 같이 골수에 골을 형성할 수 있는 전구세포가 존재한다는 것이 최초로 알려진 후 골수 외에도 치밀골, 말초혈액, 지방조직, 그리고 제대혈과 양막 등 태아의 조직에서 모두 분리가 가능한 것으로 보고되었다.
이러한 성체 유래 중간엽 줄기세포는 세포치료에 유용하게 쓰일 수 있는 다양한 특성을 가지고 있기 때문에 실제 임상치료에 있어 골, 연골, 힘줄 등 근골격계와 심혈관계에서 심근재생, 폐섬유화의 치료, 척추손상의 치료에까지 연장되어 다양한 분야에서 세포치료에 관한 시도가 이루어지고 있다.
그러나, 일반적인 성체 중간엽 줄기세포는 배아줄기세포와 달리 시험관 내에서 장기간 계대 배양하는 경우, 불규칙한 증식능력을 나타내어 한 세포의 분열능력이 40회를 넘지 못하는 것으로 알려져 있다. 또한, 확립된 세포 계통이 없어 성체로부터 반복적인 세포 준비가 요구되어 연구에 한계점이 있다.
이러한 한계를 극복하기 위해 인간 배아줄기세포로부터 중간엽 줄기세포를 분리, 배양하는 연구가 지속적으로 진행되고 있다. 기존에 알려진 배아줄기세포로부터 중간엽 줄기세포를 얻는 방법으로, 원하는 표지인자(Marker)를 나타내는 세포를 유세포 분석기(Fluorescent activated cell sorter, FACS)를 통해 분리하는 것과 분화 유도를 위해 사이토카인(Cytokine)을 처리하는 방법 등이 일반적으로 사용되고 있다.
그러나, 유세포 분석기를 이용하는 방법은 레이저를 사용하기 때문에 세포의 생존률을 저하시킬 뿐만 아니라, 분리한 후 얻어지는 세포의 수가 적어 배양 기간이 증가하는 문제가 있고, 사이토카인 처리의 경우 지속적 처리에 의한 고비용 및 분화 후에도 배아줄기세포의 전분화능을 효과적으로 제거하기 어려운 문제가 있다.
한편, 이와 같은 줄기세포 내지 전구세포를 이용하여 세포치료제로 활용하기 위한 연구가 활발히 진행되고 있다. 이들 중, 항염증 목적의 세포치료제와 관련하여 현재까지 명확한 기전이 규명된 바 없고, 뚜렷한 치료 효과가 나타나지 않는 실정이다.
본 발명은 전술한 종래기술의 문제점을 해결하기 위한 것으로, 본 발명의 목적은 증식능 및 분화능이 개선되고 이동능, 혈관신생 효능 및 체내 생존능력이 향상된 신규 간엽성 전구세포, 이를 포함하는 세포치료제 조성물 및 이러한 간엽성 전구세포의 제조방법을 제공하는 것이다.
그러나, 본 발명이 해결하고자 하는 과제는 이상에서 언급한 과제로 제한되지 않으며, 언급되지 않은 또 다른 과제들은 아래의 기재로부터 해당 기술분야의 통상의 지식을 가진 자에게 명확하게 이해될 수 있을 것이다.
본 발명의 일 실시예에 따르면, 중간엽 줄기세포(MSC, Mesenchymal Stem Cell)에 비해 표피성장인자 수용체(EGF-R, Epidermal Growth Factor Receptor)를 과발현하고, 중간엽 줄기세포에 비해 CD95(Cluster Differentiation 95)를 저발현하는, 간엽성 전구세포(FEMP, Functionally Enhanced Mesenchymal Progenitors)가 제공된다.
일 측에 따르면, 상기 간엽성 전구세포(FEMP)는 배아줄기세포(ESC, Embryonic Stem Cell), 유도 전분화능 줄기세포(iPSC, induced Pluripotent Stem Cell) 또는 체세포 핵치환 줄기세포(SCNT, Somatic Cell Nuclear Transfer cell) 유래일 수 있다.
일 측에 따르면, 상기 배아줄기세포는 포유동물 유래일 수 있다.
일 측에 따르면, 상기 간엽성 전구세포(FEMP)는 중간엽 줄기세포에 비해 LTBP(Latent-Transforming growth factor Beta-binding Protein), VEGF(Vascular Endothelial Growth Factor), KDR(Kinase insert Domain Receptor), FZD(Frizzled), FGF(Fibroblast Growth Factor), ANG(Angiopoietin), PDGFR(Platelet-Derived Growth Factor Receptor) 및 EMAP(Endothelial Monocyte-Activating Polypeptide)로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 혈관신생인자(angiogenesis factor)를 과발현할 수 있다.
일 측에 따르면, 상기 간엽성 전구세포(FEMP)는 중간엽 줄기세포에 비해 MMP(Matrix Metalloproteinase) 및 HGF(Hepatocyte growth factor) 중 하나 이상의 이동인자(migration factor)를 과발현할 수 있다.
일 측에 따르면, 상기 간엽성 전구세포(FEMP)는 지방세포(adipocyte), 골세포(osteocyte), 연골세포(chondrocyte) 또는 근세포(myocyte)로의 분화능을 가질 수 있다.
일 측에 따르면, 상기 간엽성 전구세포(FEMP)는 배가 시간(doubling time)이 20시간 내지 35시간일 수 있다.
일 측에 따르면, 상기 간엽성 전구세포(FEMP)는 PBMC(Peripheral Blood Mononuclear Cell)의 증식을 억제할 수 있다.
일 측에 따르면, 상기 간엽성 전구세포(FEMP)는 IL-10(Interleukin 10)의 분비를 유도할 수 있다.
본 발명의 다른 일 실시예에 따르면, 상기 간엽성 전구세포(FEMP)를 유효성분으로 포함하는, 항염증용 세포치료제 조성물이 제공된다.
본 발명의 또 다른 일 실시예에 따르면, (a) 배아줄기세포(ESC), 유도 전분화능 줄기세포(iPSC) 또는 체세포 핵치환 줄기세포(SCNT) 유래의 배상체(Embryoid body)를 다공성 막이 구비된 세포배양 삽입체 상에서 배양하는 단계; (b) 상기 세포배양 삽입체 하부로 이동한 전구세포를 분리하는 단계; 및 (c) 상기 전구세포의 표피성장인자 수용체(EGF-R) 및 CD95 발현 수준을 중간엽 줄기세포(MSC)의 발현 수준과 비교하는 단계;를 포함하는, 간엽성 전구세포의 제조방법이 제공된다.
일 측에 따르면, 상기 다공성 막의 기공 크기가 1㎛ 내지 20㎛일 수 있다.
일 측에 따르면, 상기 세포배양 삽입체는 FBS(Fetal bovine serum), SR(Serum replacement) 및 HPL(Human platelet lysate)로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 첨가물을 포함할 수 있다.
본 발명의 간엽성 전구세포는 특정 마커 발현 양상의 변화에 따라 우수한 증식능, 분화능, 이동능 및 혈관신생 효능을 나타낼 수 있다.
또한, 이러한 간엽성 전구세포를 포함하는 세포치료제 조성물은 우수한 항염증 효능을 구현할 수 있어 아토피 피부염, 방광염 등에 의한 염증 발생 부위에 효과적인 치료제로 적용될 수 있다.
나아가, 다공성 막이 구비된 세포배양 삽입체를 이용해 상기 간엽성 전구세포를 제조함으로써, 세포생존률을 향상시킬 수 있고 저비용으로 배아줄기세포의 전분화능을 효과적으로 제거할 수 있다.
본 발명의 효과는 상기한 효과로 한정되는 것은 아니며, 본 발명의 상세한 설명 또는 청구범위에 기재된 발명의 구성으로부터 추론 가능한 모든 효과를 포함하는 것으로 이해되어야 한다.
도 1은 본 발명의 일 실시예에 따른 간엽성 전구세포(FEMPs)를 촬영한 이미지이다.
도 2는 본 발명의 일 실시예에 따른 간엽성 전구세포(FEMP)의 제조방법 각 단계를 촬영한 이미지이다.
도 3은 본 발명의 일 실시예에 따른 간엽성 전구세포(FEMP)의 Oct4 및 Nanog 발현 수준을 측정한 그래프이다.
도 4는 본 발명의 실시예에 따른 간엽성 전구세포(FEMP)의 배양 조건에 따른 세포 형태을 촬영한 이미지이다.
도 5는 본 발명의 일 실시예에 따른 간엽성 전구세포(FEMP)의 핵형 분석 결과를 나타낸 것이다.
도 6은 본 발명의 일 실시예에 따른 간엽성 전구세포(FEMP) 및 골수 유래 중간엽 줄기세포(BM-MSC)의 EGF-R 및 CD95 발현률을 측정한 그래프이다.
도 7은 본 발명의 일 실시예에 따른 간엽성 전구세포(FEMP)가 분화한 지방세포(Adipocyte) 및 골세포(Osteocyte)를 촬영한 이미지이다.
도 8은 본 발명의 일 실시예에 따른 간엽성 전구세포(FEMP)의 이동 특성을 측정한 이미지 및 그래프이다.
도 9는 본 발명의 일 실시예에 따른 간엽성 전구세포(FEMP)의 혈관신생인자(angiogenesis factor) 및 이동인자(migration factor)의 발현 수준을 골수 유래 중간엽 줄기세포와 비교하여 나타낸 그래프이다(cutoff: 1.1).
도 10은 본 발명의 일 실시예에 따른 간엽성 전구세포(FEMP)의 PBMC 증식 억제능을 나타낸 그래프이다.
도 11은 본 발명의 일 실시예에 따른 간엽성 전구세포(FEMP)의 IL-10 분비 유도능을 나타낸 그래프이다.
도 12는 본 발명의 일 실시예에 따른 간엽성 전구세포(FEMP)의 방광염 치료 효능을 관찰한 이미지이다.
이하에서, 첨부된 도면을 참조하여 실시예들을 상세하게 설명한다.
아래 설명하는 실시예들에는 다양한 변경이 가해질 수 있다. 아래 설명하는 실시예들은 실시 형태에 대해 한정하려는 것이 아니며, 이들에 대한 모든 변경, 균등물 내지 대체물을 포함하는 것으로 이해되어야 한다.
실시예에서 사용한 용어는 단지 특정한 실시예를 설명하기 위해 사용된 것으로, 실시예를 한정하려는 의도가 아니다. 단수의 표현은 문맥상 명백하게 다르게 뜻하지 않는 한, 복수의 표현을 포함한다. 본 명세서에서, "포함하다" 또는 "가지다" 등의 용어는 명세서 상에 기재된 특징, 숫자, 단계, 동작, 구성 요소, 부품 또는 이들을 조합한 것이 존재함을 지정하려는 것이지, 하나 또는 그 이상의 다른 특징들이나 숫자, 단계, 동작, 구성 요소, 부품 또는 이들을 조합한 것들의 존재 또는 부가 가능성을 미리 배제하지 않는 것으로 이해되어야 한다.
다르게 정의되지 않는 한, 기술적이거나 과학적인 용어를 포함해서 여기서 사용되는 모든 용어들은 실시예가 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자에 의해 일반적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 가지고 있다. 일반적으로 사용되는 사전에 정의되어 있는 것과 같은 용어들은 관련 기술의 문맥 상 가지는 의미와 일치하는 의미를 가지는 것으로 해석되어야 하며, 본 출원에서 명백하게 정의하지 않는 한, 이상적이거나 과도하게 형식적인 의미로 해석되지 않는다.
또한, 실시예를 설명함에 있어서 관련된 공지 기술에 대한 구체적인 설명이 실시예의 요지를 불필요하게 흐릴 수 있다고 판단되는 경우 그 상세한 설명을 생략한다.
기능성이 강화된 신규 간엽성 전구세포 ( FEMP , Functionally Enhanced Mesenchymal Progenitors)
도 1은 본 발명의 일 실시예에 따른 간엽성 전구세포(FEMPs)를 촬영한 이미지이다.
도 1과 같이 본 발명의 일 실시예에 따르면, 중간엽 줄기세포(MSC, Mesenchymal Stem Cell)에 비해 표피성장인자 수용체(EGF-R, Epidermal Growth Factor Receptor)를 과발현하고, 중간엽 줄기세포에 비해 CD95(Cluster Differentiation 95)를 저발현하는, 간엽성 전구세포(FEMP)가 제공된다.
상기 "중간엽 줄기세포(MSC)"는 뼈, 연골, 지방, 근육세포를 포함하는 다양한 중배엽성 세포로 분화할 수 있는 다분화능 줄기세포(multipotent stem cell)을 의미한다. 상기 중간엽 줄기세포는 제대, 제대혈, 골수, 지방, 근육, 신경, 피부, 양막, 융모막, 탈락막 또는 태반에서 유래된 것일 수 있고, 바람직하게는 골수 유래 중간엽 줄기세포(BM-MSC, Bone Marrow- Mesenchymal Stem Cell)일 수 있다.
또한, 상기 중간엽 줄기세포는 인간, 태아 또는 인간을 제외한 포유동물로부터 유래될 수 있다. 인간을 제외한 포유동물로는 개과 동물, 고양이과 동물, 원숭이과 동물, 소, 양, 돼지, 말, 랫트, 마우스, 기니피그 등을 예로 들 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
상기 간엽성 전구세포(FEMP)는 통상적인 중간엽 줄기세포(MSC)에 비해 표피성장인자 수용체(EGF-R)를 과발현하고, CD95를 저발현함에 따라, 상기 중간엽 줄기세포의 특성뿐만 아니라 우수한 증식능, 분화능 및 이동능을 보유하고, 우수한 체내 생존 능력 또한 나타낼 수 있다. 즉, 상기 간엽성 전구세포(FEMP)는 기존 성체 유래 중간엽 줄기세포보다 기능성이 월등히 뛰어난 세포를 의미할 수 있다.
상기 표피성장인자 수용체(EGF-R, Epidermal Growth Factor Receptor)는 세포외 단백질 리간드의 상피 성장인자 패밀리에 대한 세포-표면 수용체로서, 줄기세포의 근거리분비(paracrine)를 촉진시켜 VEGF(Vascular Endothelial Growth Factor), HGF(Fibroblast Growth Factor)와 같은 혈관신생인자의 발현을 촉진시킬 수 있고, HBEGF(Heparin-Binding EGF-like Growth Factor), AREG(Amphiregulin)와 같은 다양한 성장인자나 사이토카인의 발현을 증가시켜 줄기세포의 증식능, 분화능을 향상시킬 수 있다.
또한, 상기 EGF-R은 MAP kinase(Mitogen-Activated Protein kinase), PKC(Protein Kinase C) 등과 함께 줄기세포에 작용하여 이동능을 향상시킬 수 있다. 따라서, 상기 EGF-R을 과발현하는 간엽성 전구세포(FEMP)는 통상적인 중간엽 줄기세포에 비해 우수한 증식능, 분화능 및 이동능을 나타낼 수 있다.
나아가, 방광염, 아토피 피부염과 같은 염증성 질환에 있어서, 상기 EGF-R은 표피성장인자(EGF, Epidermal Growth Factor)와의 상호작용을 통해 항염 활성 및 피부 재생을 촉진할 수 있다.
상기 CD95(Cluster Differentiation 95)는 FasR(Fas Receptor), APO-1(Apoptosis antigen 1), 또는 TNFRSF6(Tumor Necrosis Factor Receptor Superfamily Member 6) 등의 명칭으로도 알려져 있으며, 세포 표면에 위치하여 세포자살(apoptosis)을 유도하는 사멸수용체(death receptor)이다.
구체적으로, 상기 CD95에 FasL(Fas Ligand) 또는 CD95L(CD95 Ligand)로 알려진 리간드가 결합하면 DISC(Death-Inducing Signaling Complex)를 형성하여 세포자살이 일어날 수 있다.
즉, 줄기세포 또는 전구세포가 상기 CD95를 과발현하는 경우, 상기 CD95에 의해 세포자살의 신호전달이 활성화될 수 있는 반면에, 상기 CD95를 상대적으로 저발현하는 줄기세포나 전구세포는 세포자살 신호전달이 억제되어 우수한 증식능을 나타낼 수 있다. 따라서, 상기 간엽성 전구세포(FEMP)는 중간엽 줄기세포(MSC), 특히 골수 유래 중간엽 줄기세포(BM-MSC)에 비해 우수한 증식능을 보유할 수 있다. 이러한 특성은 줄기세포 이식(stem cell graft)에 있어서, 우수한 세포 생존능을 보유함을 의미할 수 있다.
상기 간엽성 전구세포(FEMP)는 배아줄기세포(ESC, Embryonic Stem Cell), 유도 전분화능 줄기세포(iPSC, induced Pluripotent Stem Cell) 또는 체세포 핵치환 줄기세포(SCNT, Somatic Cell Nuclear Transfer cell) 유래일 수 있다.
본 명세서에서 사용된 용어 "배아줄기세포(ESC, Embryonic Stem Cell)"는 포유동물의 수정란이 모체의 자궁에 착상하기 직전인 포배기 배아에서 내세포괴(ICM, Inner Cell Mass)를 추출하여 체외에서 배양한 것으로, 동물의 모든 세포로 분화할 수 있는 전분화능 줄기세포(pluripotency stem cell)를 의미한다. 이는 넓은 의미로는 배아줄기세포에서 유래한 배아체(embryoid body), 유도 전분화능 줄기세포(iPSC, induced Pluripotent Stem Cell) 및 체세포 핵치환 줄기세포(SCNT, Somatic Cell Nuclear Transfer cell)를 포함하는 개념으로 이해될 수 있다.
상기 배아줄기세포는 인간, 영장류, 소, 돼지, 양, 말, 개, 쥐, 랫트 및 가축을 포함하는 포유동물 유래의 모든 배아줄기세포를 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니며, 바람직하게는 인간 배아줄기세포일 수 있다.
상기 인간 배아줄기세포는, 예를 들어 H9(James A. Thomson et. al. Embryonic Stem Cell Lines Derived from Human Blastocysts. Science 1998 Dec 4; 282(5395):1827) 등이 사용될 수 있으나, 이들 예에 한정되는 것은 아니며, 인간 배아줄기세포는 당업자에 의하여 용이하게 구축될 수 있다.
한편, 상기 간엽성 전구세포(FEMP)는 중간엽 줄기세포(MSC)에 비해 LTBP(Latent-Transforming growth factor Beta-binding Protein), VEGF(Vascular Endothelial Growth Factor), KDR(Kinase insert Domain Receptor), FZD(Frizzled), FGF(Fibroblast Growth Factor), ANG(Angiopoietin), PDGFR(Platelet-Derived Growth Factor Receptor) 및 EMAP(Endothelial Monocyte-Activating Polypeptide)로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 혈관신생인자(angiogenesis factor)를 과발현할 수 있다.
또한, 상기 간엽성 전구세포(FEMP)는 중간엽 줄기세포(MSC)에 비해 MMP(Matrix Metalloproteinase) 및 HGF(Hepatocyte growth factor) 중 하나 이상의 이동인자(migration factor)를 과발현할 수 있다.
상처가 발생한 조직 주변에 상기 간엽성 전구세포(FEMP)가 존재하는 경우, 이의 치료를 위해 항염 활성, 세포의 이동능 및 혈관재생 효능이 중요한 요인으로 작용할 수 있다. 즉, 상처 등에 의해 염증이 발생한 조직, 기관으로 상기 줄기세포가 이동하여 염증을 완화시키고 손상된 혈관을 재생시키는 기능을 순차적으로 수행할 수 있다. 이 때, 각각의 항염 활성, 이동능 및 혈관재생 효능의 수준에 따라 상처 치료 효능이 결정될 수 있다. 상기 이동능은 표적 기관 내지 조직으로 이동하는 호밍(homing) 능력을 포함하는 개념으로 이해될 수 있다.
상기 간엽성 전구세포(FEMP)는 중간엽 줄기세포(MSC)에 비해 혈관신생인자 및 이동인자를 과발현함으로써, 표적 기관 내지 조직으로 신속하게 이동하여 혈관 조직을 복구할 수 있으므로, 염증성 질환의 예방 또는 치료용 세포치료제 등으로 유용하게 활용될 수 있다.
특히, 상기 혈관신생인자 중 FGF(Fibroblast Growth Factor)는 전술한 표피성장인자 수용체(EGF-R)와 함께 항염 활성 효능을 나타낼 뿐만 아니라, 피부의 재생을 촉진하여 아토피 피부염과 같은 염증성 질환의 치료 효과를 향상시킬 수 있다.
한편, 전술한 것과 같이 상기 간엽성 전구세포(FEMP)는 우수한 분화능, 예를 들어 지방세포(adipocyte), 골세포(osteocyte), 연골세포(chondrocyte) 또는 근세포(myocyte)로의 분화능을 가질 수 있다.
따라서, 상기 간엽성 전구세포는 당뇨성 망막병증, 간질성 방광염, 과민성 방광염과 같은 질환, 증상의 치료에 적절한 세포치료제로 사용될 수 있고, 특히 염증성 질환의 치료에 우수한 효과를 나타낼 수 있다.
또한, 상기 간엽성 전구세포(FEMP)는 표피성장인자 수용체(EGF-R)를 과발현함으로써 통상의 중간엽 줄기세포에 비해 향상된 증식능을 구현할 수 있다. 구체적으로, 상기 줄기세포 배양 시점으로부터 세포수가 2배가 되는 배가시간(doubling time)이 20시간 내지 35시간, 바람직하게는 24시간 내지 32시간일 수 있다. 이러한 세포 증식능은 세포치료제로서 상기 FEMP의 효능을 더욱 향상시킬 수 있음을 의미한다.
상기 간엽성 전구세포(FEMP)는 PBMC(Peripheral Blood Mononuclear Cell)의 증식을 억제하거나 IL-10(Interleukin 10)의 분비를 유도함으로써 항염 활성을 나타낼 수 있다. 이에 따라, 상기 세포치료제 조성물은 아토피 피부염, 류마티스 관절염, 간질성 방광염 등에 효과적인 치료제로 적용될 수 있다. 상기 PBMC는 T-세포, B-세포, NK(Natural Killer) 세포, 단핵구(Monocyte), 대식세포(Macrophage) 등을 포함할 수 있다.
구체적으로, 상기 간엽성 전구세포(FEMP)는 대식세포에서 MHC(Major Histocompatibility Complex) 발현을 억제하고, CD28, CD80, CD86 등의 상호작용을 억제함으로써 T-세포의 활성을 억제할 수 있다.
또한, 상기 간엽성 전구세포(FEMP)에 의해 분비가 유도된 IL-10은 대식세포에서 iNOS(inducible Nitric Oxide Synthase), COX-2(inducible Cyclooxyganas)와 같은 염증 관련 효소의 발현을 억제함으로써 항염 활성을 나타낼 수 있다. 구체적으로, 상기 간엽성 전구세포(FEMP)는 PBMC에서 IL-10의 분비를 증가시킬 수 있다.
위와 같은 우수한 항염 활성에 따라, 상기 간엽성 전구세포는 항염증용 세포치료제 조성물로 사용될 수 있다.
또한, 상기 세포치료제 조성물은 상기 간엽성 전구세포(FEMP)를 수용하기 위한 지지체, 바람직하게는 생분해성 지지체를 더 포함할 수 있다. 이 때, 상기 생분해성 지지체는 피브린 글루, 히알루론산, 젤라틴, 콜라겐, 알긴산, 셀룰로오스, 펙틴, 키틴, 폴리글라이콜산, 또는 폴리유산과 같은 하이드로겔일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
상기 세포치료제 조성물은 약학적으로 허용가능한 담체를 더 포함할 수 있다. 상기 약학적으로 허용가능한 담체는 식염수, 멸균수, 링거액, 완충 식염수, 덱스트로즈 용액, 말토 덱스트린 용액, 글리세롤, 에탄올, HSA(Human serum albumin) 및 이들 성분 중 1종 이상을 혼합하여 사용할 수 있으며, 필요에 따라 항산화제, 완충액 및 정균제 등 다른 통상의 첨가제를 첨가할 수 있다.
상기 세포치료제 조성물은 희석제, 분산제, 계면활성제, 결합제 및 윤활제를 부가적으로 첨가하여 수용액, 현탁액, 유탁액 등과 같은 주사용 제형으로 제제화 할 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
기능성이 강화된 신규 간엽성 전구세포(FEMP)의 제조방법
본 발명의 다른 일 실시예에 따르면, (a) 배아줄기세포(ESC), 유도 전분화능 줄기세포(iPSC) 또는 체세포 핵치환 줄기세포(SCNT) 유래의 배상체(Embryoid body)를 다공성 막이 구비된 세포배양 삽입체 상에서 배양하는 단계; (b) 상기 세포배양 삽입체 하부로 이동한 전구세포를 분리하는 단계; 및 (c) 상기 전구세포의 표피성장인자 수용체(EGF-R) 및 CD95 발현 수준을 중간엽 줄기세포(MSC)의 발현 수준과 비교하는 단계;를 포함하는, 간엽성 전구세포의 제조방법이 제공된다.
상기 (a) 단계의 배아줄기세포, 유도 전분화능 줄기세포 및 체세포 핵치환 줄기세포에 관해서는 전술한 것과 같다.
본 명세서에서 사용된 용어 "배상체(EB, Embryoid Body)"는 배아줄기세포 간 부착되어 형성된 세포 응집체를 의미하는 것으로, 미분화 상태를 유지시키는 요소들을 제거한 배아줄기세포를 소수성 배양용기에 접종시키면 상기 배아줄기세포가 배양용기 바닥에 밀착하지 않고 세포들 간 응집하여 1㎜ 이하 크기의 배상체를 형성한다. 상기 배상체는 포유동물의 체성분을 구성하는 삼배엽성(내배엽, 중배엽, 외배엽) 분화능을 가질 수 있다.
본 명세서에서 사용된 용어 "세포배양 삽입체"는 다공성 막을 가지는 기구로서, 배아줄기세포, 유도 전분화능 줄기세포 또는 체세포 핵치환 줄기세포 유래의 배상체를 배양하는 경우, 배아 발생 과정에서 일어나는 상피-중간엽 이행(EMT, Epithelial-Mesenchymal Transition)이 자연스럽게 일어나도록 하는 기구를 의미한다. 이 때, 상기 다공성 막의 기공 크기가 1㎛ 내지 20㎛, 바람직하게는 6㎛ 내지 12㎛, 더 바람직하게는 8㎛일 수 있다.
상기 세포배양 삽입체의 배지 구성으로는 EGM2-MV, DMEM, MEM-α, STEMPRO-MSC, MesenCult-MSC 배지를 사용할 수 있으며, 바람직하게는 EGM2-MV, DMEM 또는 MEM-α를 사용할 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
또한, 상기 세포배양 삽입체는 FBS(Fetal bovine serum), SR(Serum replacement) 및 HPL(Human platelet lysate)로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 첨가물을 포함할 수 있다.
구체적으로, 상기 첨가물은 1~10%의 FBS, 1~10%의 SR 또는 1~10%의 HPL일 수 있으며, 바람직하게는 5% FBS 또는 2.5~5% HPL일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
상기 (b) 단계에서는 상기 (a) 단계 이후 다공성 막을 통해 세포배양 삽입체 하부로 이동한 전구세포, 구체적으로 간엽성 전구세포(FEMP)를 분리할 수 있다. 이 때, 상기 세포배양 삽입체 하부에는 상기 FEMP가 상피세포 형상으로 응집되어 있을 수 있다.
상기 다기능성 간엽성 전구세포(FEMP)의 분리는 효소적 분리를 통해 단일 세포로 분리하는 방법, 또는 기계적 분리를 통해 상피세포 형상 시트로 분리하는 방법을 이용할 수 있으며, 줄기세포의 원형 유지를 위해 기계적 방법을 이용하는 것이 바람직할 수 있다.
본 명세서에서 사용된 용어 "효소적 분리"는 효소 처리를 통하여 세포 응집체를 분리하는 방법을 의미하며, 구체적으로 콜라게네이즈 Ⅰ, Ⅱ, Ⅲ, Ⅳ를 포함하는 콜라게네이즈(Collagense), 아큐타제(Accutase), 디스파제(Dispase), trypLE 또는 트립신-EDTA를 처리함으로써 분리할 수 있고, 바람직하게는 저자극성 효소인 trypLE일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
또한, 기계적 분리 방법으로는 스크랩퍼를 이용하여 상피세포 형상의 시트의 원형을 유지한 상태에서 분리, 배양하는 방법을 이용할 수 있다.
상기 (c) 단계는 상기 (b) 단계에서 분리한 전구세포의 특정 마커 발현 수준을 중간엽 줄기세포(MSC), 구체적으로 골수 유래 중간엽 줄기세포(BM-MSC)의 발현 수준과 비교하는 단계로, 상기 마커는 표피성장인자 수용체(EGF-R) 및 CD95일 수 있다.
이에 따라, 상기 (c) 단계에서 분리한 전구세포가 상기 중간엽 줄기세포에 비해 표피성장인자 수용체(EGF-R)를 과발현하고, CD95를 저발현하는 경우, 다기능성 간엽성 전구세포(FEMP)에 해당하는 것으로 판단할 수 있다. 구체적인 마커 특성에 관해서는 전술한 것과 같다.
위와 같은 방법에 따라 제조된 간엽성 전구세포는 특히 항염 활성 효과가 우수하므로, EGF-R, CD95와 같은 마커 발현 수준에 따라 선별하여 지지체, 담체, 희석제, 기타 첨가제 등과 혼합하여 제형화할 수 있다. 상기 지지체, 담체 등에 관해서는 전술한 것과 같다.
이하, 본 발명의 실시예에 관하여 상세히 설명하기로 한다.
실시예 1: 인간 배아줄기세포(hESC) 유래 간엽성 전구세포(FEMP)의 분리
도 2는 본 발명의 일 실시예에 따른 간엽성 전구세포의 제조방법의 각 단계를 촬영한 이미지이다.
도 2를 참고하면, 인간 배아줄기세포(A)를 정상산소 상태(37℃, 5% CO2 세포배양기)에서 배상체(B) 형성을 통해 초기 분화시킨 후, 8㎛의 기공크기를 가진 세포배양 삽입체 상에 도말하였다(C). 도말 시 20% SR(Serum Replacement), 1% NEAA(Non-essential amino acid), 0.1% β-mercaptoethanol 및 1% anti-biotic을 포함하는 DMEM/F12(Dulbecco's Modified Eagle Medium/Nutrient Mixture F-12) 배지를 사용하였다.
세포배양 삽입체 상에서 배상체를 1일 내지 10일 동안 배양하였고, 이에 따라 전구세포가 삽입체 하부로 이동하여 상피세포 형상의 시트를 형성하였음을 확인하였다(D). RT-PCR 분석을 통해 각 세포의 이행 패턴을 확인하였고 그 결과를 도 3에 나타내었다. 마커 유전자, 프라이머 염기서열 등의 구체적인 조건은 하기 표 1에 나타내었다.
유전자 프라이머 염기서열 온도
(℃)		 횟수
(cycle)		 NCBI Reference
Sequence
Oct4 Sense AACTCGAGCAATTTGCCAAGCTCC 55 30 NM_001110336.1
Anti-sense TTCGGGCACTGCAGGAACAAATTC
Nanog Sense CAAAGGCAAACAACCCACTT 55 30 NM_024865.2
Anti-sense TCTGCTGGAGGCTGAGGTAT
도 3을 참고하면, 세포배양 삽입체 상부에 잔존하는 인간 배아줄기세포(hESC)는 전분화능(pluripotency) 표지자인 Oct4 및 Nanog을 일정 수준 발현한 반면에, 세포배양 삽입체 하부로 이동한 간엽성 전구세포(FEMP)는 인간 배아 섬유아세포(hEF)와 유사하게 Oct4 및 Nanog을 거의 발현하지 않는 것을 확인하였다.
이러한 결과를 통해, 상피-중간엽 이행을 통해 세포배양 삽입체 하부로 이동한 간엽성 전구세포(FEMP)를 용이하게 분리할 수 있고, 상기 간엽성 전구세포(FEMP)는 인간 배아줄기세포(hESC)와는 상이한 특성을 나타낼 것으로 예측할 수 있다.
실시예 2: 인간 배아줄기세포( hESC ) 유래 간엽성 전구세포(FEMP)의 배양 및 증식
도 2는 본 발명의 일 실시예에 따른 줄기세포의 제조방법의 각 단계를 촬영한 이미지이다.
도 2를 참고하면, 상기 실시예 1에서 상기 세포배양 하부에 형성된 간엽성 전구세포(FEMP) 시트를 스크랩퍼를 이용해 박리(E)한 후 새로운 배양 접시에 옮겨 계대 배양하였다. 이 때, 배양 배지는 5% 소태아혈청(FBS, Fetal Bovine Serum)을 포함하는 EGM-2MV 배지를 사용하였다.
구체적으로, 상기 상피세포 형상의 시트로부터 줄기세포가 뻗어나오면, 상피세포 형상의 시트를 걷어내고, 이를 재차 계대 배양하여 지속적으로 줄기세포를 수득하였다. 잔존 줄기세포는 trypLE를 사용하여 세포를 제거하고 계대 배양하였다.
1계대(F), 5계대(G) 및 7계대(H)의 전구세포를 관찰한 결과, 수 차례의 계대 배양을 반복하여도 전구세포의 형태나 특징에 이상이 발견되지 않았다. 이러한 결과는, 인간 배아줄기세포 유래의 상기 간엽성 전구세포(FEMP)가 계대의 제한성이 없고, 다공성 막을 활용하는 방법이 기존에 보고된 인간 배아줄기세포 유래 중간엽 줄기세포를 분리, 배양하는 방법에 비해 효율적이라는 것을 나타낸다.
또한, 위와 동일한 조건으로 간엽성 전구세포(FEMP)를 계대 배양하되, 5%의 FBS를 대체하여 2.5% 및 5%의 HPL(Human platelet lysate)를 사용한 결과, FBS를 사용한 경우와 마찬가지로 줄기세포가 뻗어나오는 것을 확인할 수 있었다(도 4).
실시예 3: 간엽성 전구세포(FEMP)의 염색체 분석
상기 실시예 1 및 2에 따라 제조된 간엽성 전구세포(FEMP)가 계대의 횟수와 기간에 관계 없이 정상적인 염색체 특성을 나타내는지 확인하기 위해 9계대 및 19계대 줄기세포에 대한 핵형 분석을 실시하였다.
구체적으로, 배양액 10㎖가 담긴 배양 용기에 100㎍/㎕ 농도의 콜히친(colchicine) 용액 20㎕을 혼합하여 37℃에 2시간 동안 방치하였다. 그 후, 상기 용액을 500rpm에서 원심분리한 뒤, 상층액을 제거하고 5㎖의 저장액(0.075M KCl)에 세포를 부유시켜 37℃의 항온 수조에 25분 동안 방치하였다. 각 튜브에 고정액(methanol : glacial acetic acid = 3 : 1, v/v)을 5방울씩 첨가하여 1,200rpm에서 8분 동안 원심분리한 뒤, 상층액을 제거하고 5㎖ 고정액에 세포를 부유시켜 상온에 10분 동안 방치하는 과정을 2회 반복하였다. 세포를 0.5㎖의 고정액에 부유시키고 70% 에탄올에 침지해 둔 슬라이드 글라스 상에 세포 부유액을 적가하였다. 알코올 램프를 이용해 슬라이드 상의 에탄올을 건조시키고 공기 중에서 수분을 제거한 뒤 커버슬립을 덮고 현미경으로 관찰하였다(도 5).
도 5를 참고하면, 간엽성 전구세포(FEMP)는 계대의 횟수와 기간에 상관 없이 정상적인 염색체 특성을 나타내는 것을 확인하였다.
실시예 4: 간엽성 전구세포(FEMP)의 마커 발현 분석
상기 실시예 2에 따라 제조된 11계대 및 21계대 간엽성 전구세포(FEMP)의 세포 특성을 확인하기 위해, 유세포 분석기(FACS, Fluorescence Activated Cell Sorting)를 이용하여 마커의 발현을 분석하였다. 구체적으로, 트립신-EDTA를 사용하여 줄기세포를 박리한 뒤, 5x105cells/㎖ 농도로 PBS(Phosphate Buffered Saline)에 부유시켰다. 각 세포에 CD73, CD95, CD44, CD11b, CD14, CD19, CD34, CD45, HLA-DR(Human Leukocyte Antigen - antigen D Related) 및 EGF-R(Epidermal Growth Factor Receptor) 항체를 첨가하여 45분 동안 실온에서 반응시킨 뒤 각각의 세포에 대해 유세포 분석을 실시하였고 그 결과를 하기 표 2에 나타내었으며, 이들 중 EGF-R 및 CD95의 결과는 도 6에 함께 나타내었다. 이 때, 대조군으로는 7계대의 골수 유래 중간엽 줄기세포(BM-MSC) 및 16계대의 섬유아세포(Fibroblast)를 사용하였다.
마커 BM-MSC p7 FEMP p11 FEMP p21 Fibroblast p16
CD73 99.75 99.27 98.92 99.4
CD95 93.64 12.38 18.07 93.90
CD44 99.59 99.79 99.65 97.43
CD11b 0.36 0.03 0.32 0.34
CD14 0.4 0.11 0.22 0.73
CD19 0.19 0.04 0.13 0.16
CD34 1.79 1.49 1.42 0.37
CD45 0.15 0.14 0.15 0.33
HLA-DR 0.36 0.1 0.06 0.26
EGF-R 15.26 85.93 58.43 98.84
(단위: %)
상기 표 2 및 도 6을 참고하면, 간엽성 전구세포(FEMP)는 BM-MSC와 비교하여 EGF-R을 약 40% 내지 70% 과발현하고, CD95는 약 80% 저발현함을 알 수 있다. 이러한 결과를 통해, 간엽성 전구세포(FEMP)가 BM-MSC에 비해 우수한 증식능 및 분화능을 나타낼 것으로 예상할 수 있다.
또한, CD73과 같은 마커가 강하게 발현되었고, CD34, CD45 등의 조혈 줄기세포 마커는 발현되지 않아 상기 간엽성 전구세포(FEMP)가 통상적인 중간엽 줄기세포의 특성 및 다분화능을 포함하는 것으로 분석되고, 실제로 지방세포, 골세포, 근세포 등으로 분화됨을 확인하였다 (도 7).
실시예5 : Fas Ligand에 의한 간엽성 전구세포(FEMP)와 BM- MSC 의 세포사멸 현상 분석
Fas Ligand-induced apoptosis 현상을 확인하기 위하여, 간엽성 전구세포에 recombinant Fas Ligand를 처리하였다. 이 때, 대조군으로 골수 유래 중간엽 줄기세포(BM-MSC)를 사용하였고, 양성대조군으로 A549 를 사용하였다. 구체적으로 각 96 well culture plates에 BM-MSC, 간엽성 전구세포(FEMP), A549 세포를 각각 1x104 cells/well 농도로 100㎕씩 시딩(seeding)하고, 37에서 24 시간 동안 배양한 후, apoptosis를 유도하기 위하여 recombinant human Fas Ligand를 0, 50, 100, 500 ng/㎖ 의 농도로 24시간 동안 반응시켰다. Apoptotic cell의 집단을 확인하기 위하여 세포생존율을 CCK-8 반응법으로 분석하였다. 분석 결과는 도 8에 나타내었다.
도 8을 참고하면, BM-MSC에 Fas Ligand를 처리하였을 때 농도 의존적으로 apoptotic cell이 증가하였다. 특히, 500ng/㎖ Fas Ligand를 처리 후 1일째 apoptotic cell이 40.64±12.02% 증가됨을 확인하였다. 그러나 간엽성 전구세포(FEMP)의 경우 21.19±7.21% 증가됨을 확인하였다.
이러한 결과는 상기 간엽성 전구세포(FEMP)가 CD95 저발현 세포이기 때문에 Fas Ligand에 의한 세포사멸이 적게 관찰되고, BM-MSC는 CD95 고발현 세포이기 때문에 세포사멸이 촉진됨을 확인하였다. 이 결과는 CD95 expression level에 따라 Fas Ligand 의존적으로 MSC의 growth와 apoptosis에 영향을 끼친다.
실시예 6: 간엽성 전구세포(FEMP)의 증식 특성 분석
상기 실시예 1 및 2 에 따라 제조된 간엽성 전구세포(FEMP)의 증식 특성을 확인하기 위해, 정상 산소 분압 하에서 배양된 16 계대 간엽성 전구세포(FEMP)에 대한 세포 증식능을 생세포밀도(viable cell density)(cells/㎝2)를 이용하여 분석하였다. 이 때, 대조군으로는 정상 산소 분압 하에서 배양된 16 계대 골수 유래 중간엽 줄기세포(BM-MSC)를 이용하였다.
각각의 줄기세포를 6 well plate 의 배양접시에 2.0x104cells/plate 농도로 계대 별(16, 17, 18, 19 계대) 3 well씩 도말하였다. 각 줄기세포를 정상 산소 분압에서 배양한 뒤, 배양기간 별로 0.25%의 트립신을 이용하여 배양접시에서 분리하였다. 혈구계수기(Hemocytometer)를 이용하여 세포수를 3 회 반복 계수함으로써 평균 세포수를 확인하였고, 그 결과를 하기 표 3에 나타내었다.
Group Passage 16 Passage 17 Passage 18 Passage 19
BM-MSC doubling time (dT) 39.7559 51.7705 52.2821 59.7651
PDL (회) 2.3691 1.8203 1.8051 1.5818
FEMP doubling time (dT) 24.2851 25.6893 36.5355 31.8651
PDL (회) 3.9357 3.6722 2.6305 2.9216
상기 표 3을 참고하면, 상기 실시예 1 및 2에 따라 제조된 간엽성 전구세포(FEMP)는 골수 유래 중간엽 줄기세포(BM-MSC)에 비해 배가 시간(doubling time)이 대폭 감축되었음을 알 수 있다.
구체적으로, BM-MSC가 39시간 초과의 배가 시간을 나타냄에 반해, 간엽성 전구세포(FEMP)는 32시간 미만의 배가 시간을 나타내어 월등히 향상된 증식능을 나타내는 것으로 분석된다.
실시예 7: 간엽성 전구세포(FEMP)의 이동 특성 분석
상기 실시예 1 및 2에 따라 제조된 간엽성 전구세포(FEMP)의 이동(migration) 특성을 확인하기 위해 μ-디쉬 35㎜, 고 배양-삽입(high culture-insert)을 이용하여 이동 세포수를 분석하였다. 이 때, 대조군으로는 골수 유래 중간엽 줄기세포(BM-MSC)를 사용하였다.
구체적으로, 각 μ-디쉬 35㎜에 상기 간엽성 전구세포(FEMP) 및 BM-MSC를 각각 3x104cells/well 농도로 70㎕씩 시딩(seeding)하고, 37℃에서 24시간 동안 배양한 후, 배양 삽입(culture-insert)을 제거하였으며, 10% DMEM 2㎖를 첨가한 후, 현미경으로 촬영하고 이동 세포수를 계산하였다. 분석 결과는 도 9에 나타내었다.
도 9을 참고하면, BM-MSC에 비해 간엽성 전구세포(FEMP)의 이동 세포수가 월등히 많은 것을 확인할 수 있고, 이러한 결과는 상기 간엽성 전구세포(FEMP)가 우수한 이동능력을 통해 우수한 항염 활성을 나타낼 수 있음을 시사한다.
실시예 8: 간엽성 전구세포(FEMP)의 혈관신생인자 및 이동인자 분석
상기 실시예 1 및 2의 간엽성 전구세포(FEMP)의 혈관신생인자(angiogenesis factor) 및 이동인자(migration factor)의 발현 특성을 확인하기 위해, 상기 실시예 4와 동일한 방법으로 11계대의 간엽성 전구세포(FEMP) 및 7계대의 골수 유래 중간엽 줄기세포(BM-MSC)의 발현률을 분석하였다.
분석 결과는 FEMP/BM-MSC의 상대적인 값(fold change)으로 나타내었으며, cutoff 값을 1.1로 설정하여 도 10에 나타내었다.
도 10을 참고하면, 이동인자인 MMP-1 및 HGF는 BM-MSC에 비해 간엽성 전구세포(FEMP)에서 1.3배 이상 발현되어 상기 간엽성 전구세포(FEMP)가 우수한 이동능을 나타내는 것으로 분석되며, 이는 상기 실시예 7과 일치하는 결과임을 알 수 있다.
또한, BM-MSC와 비교하여 LTBP-1, ANG-1, FGF-16 등 다양한 혈관신생인자가 간엽성 전구세포(FEMP)에서 높은 수준으로 발현되며, 특히 LTBP-1, VEGF-B, KDR, Frizzled-1, FGF-16의 경우 1.3배 이상으로 발현되어 상기 간엽성 전구세포(FEMP)가 BM-MSC에 비해 우수한 혈관신생능력을 보유하는 것으로 분석된다.
이러한 결과를 통해, 후술할 항염증 뿐만 아니라 혈관신생, 즉 손상 혈관 재생 용도의 세포치료제로 상기 간엽성 전구세포(FEMP)가 우수한 효능을 구현할 수 있음을 알 수 있다.
실시예 9: 간엽성 전구세포(FEMP)의 PBMC 증식 억제 효과 분석
상기 실시예 1 및 2에 따라 제조된 간엽성 전구세포(FEMP)의 PBMC(Peripheral Blood Mononuclear Cell) 증식 억제 효과를 확인하기 위해, 세포수(n=1000, 2000, 5000, 10000)를 달리하여 상기 간엽성 전구세포(FEMP) 및 골수 유래 중간엽 줄기세포(BM-MSC)를 2x105cells/well 농도의 PBMC(Peripheral Blood Mononuclear Cell)가 포함된 96 well plate에서 5일 동안 공배양하였다. 각 실험군에 대해 CFSE(CarboxyFluorescein Succinimidyl Ester)로 표지하여 PBMC 증식 억제율(%)을 측정하였으며, 그 결과를 하기 표 4 및 도 11에 나타내었다.
세포수 BM-MSC FEMP
1000 0.70±0.56 2.09±0.20
2000 0.31±0.32 4.10±0.61
5000 6.01±1.16 12.83±0.60
10000 3.54±1.81 36.24±0.41
상기 표 4 및 도 11을 참고하면, 동일 세포수에서 BM-MSC에 비해 상기 간엽성 전구세포(FEMP)가 향상된 PBMC 억제율을 나타내었으며, 특히 세포수가 10000개인 실험군에서 약 10배 향상된 억제율을 확인하였다.
상기 결과는 실시예 1 및 2에 따라 제조된 간엽성 전구세포(FEMP)가 혈관, 조직 손상 등에 의해 형성되는 PBMC의 증식을 억제함으로써, 우수한 항염 활성을 나타내는 세포치료제로 적용될 수 있음을 시사한다.
실험예 10: 간엽성 전구세포(FEMP)의 IL-10 분비 유도 효과 분석
상기 실시예 1 및 2에 따라 제조된 간엽성 전구세포(FEMP)의 항염 활성, 구체적으로 IL-10(Interleukin 10) 분비 유도 효과를 확인하기 위해, 1x106cells/well 농도의 PBMC(Peripheral Blood Mononuclear Cell)를 96 well plate에 도말하고 100ng/㎖ LPS로 염증 반응을 유도하였다.
구체적으로, 상기 LPS 처리 유무 및 세포(FEMP 또는 BM-MSC) 처리 유무를 달리하여 각 실험군에서 IL-10의 농도를 측정하였고, 그 결과를 하기 표 5 및 도 12에 나타내었다.
실험군 IL-10 농도 (pg/㎖)
PBMC -5.20±5.29
PBMC + LPS 39.96±3.38
PBMC + BM-MSC 2.70±1.07
PBMC + BM-MSC + LPS 67.96±2.16
PBMC + FEMP -4.69±0.71
PBMC + FEMP + LPS 56.58±1.74
상기 표 5 및 도 12를 참고하면, LPS를 첨가하기 전과 비교하여 LPS로 염증 반응을 유발한 PBMC에서 일정 수준의 IL-10이 분비된 것을 확인할 수 있다. 또한, LPS로 염증 반응을 유발한 PBMC를 BM-MSC 또는 FEMP와 공배양한 경우에 IL-10가 더욱 증가하였다.
이러한 결과는 골수 유래 중간엽 줄기세포(BM-MSC) 뿐만 아니라, 상기 실시예 1 및 2에 따라 제조된 간엽성 전구세포(FEMP) 또한 염증 발생 환경에서 PBMC에 의한 IL-10의 분비를 유도함으로써 항염 활성을 나타낼 수 있음을 시사한다. 따라서, 상기 FEMP를 포함하는 조성물은 항염증용 치료제로 적용될 수 있다.
실험예 11: 간엽성 전구세포(FEMP)의 방광염 치료 효과 분석
상기 실시예 1 및 2에 따라 제조된 간엽성 전구세포(FEMP)의 방광염에 대한 치료 효과를 확인하기 위해 동물모델을 제작하였다. 6주령 암컷 SD rat의 방광 내에 24gage 카테터를 삽입하여0.2mM HCl을 10분간 노출시키고 1M bicarbonate를 10분간 처리하여 중화시킨 후, PBS로 2회 세척하여 방광염을 유발하였다.
1주일 후 복강을 개복하여 방광을 노출시킨 뒤, 방광 외층과 내막 사이에 상기 간엽성 전구세포를 농도별로 처리하고 대조군에는 PBS를 처리한 후 봉합하였다. 세포 이식 4주 및 8주 경과 시점에 조직을 적출하여 조직 슬라이드를 제작하였고, H&E stain을 실시하여 현미경 상에서의 관찰 결과를 도 13에 나타내었다.
도 13을 참고하면, PBS를 처리한 대조군에서는 시간 경과에 따라 방광 내막에 염증 세포의 침윤(infiltration) 및 육아조직(granulation) 형성이 확인되었으며, 상피세포의 과증식(hyperproliferation)이 관찰되었다.
간엽성 전구세포(FEMP)를 저농도(1x105 cell/100㎕, 1x106 cell/100㎕) 처리한 그룹에서는 대조군과 유사한 결과를 나타내거나 뚜렷한 방광염 치료 효과가 확인되지 않았으나, 3x106 이상의 농도를 처리한 그룹에서는 방광상피와 고유막(lamina propria) 조직이 정상 조직과 유사한 정도까지 회복되는 것을 확인할 수 있다.
이러한 결과로부터, 상기 간엽성 전구세포(FEMP)는 방광염 치료용, 특히 간질성 방광염 치료용으로 적용될 수 있음을 알 수 있다.
이상과 같이 실시예들이 비록 한정된 실시예와 도면에 의해 설명되었으나, 해당 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자라면 상기의 기재로부터 다양한 수정 및 변형이 가능하다. 예를 들어, 설명된 기술들이 설명된 방법과 다른 순서로 수행되거나, 및/또는 설명된 구성요소들이 설명된 방법과 다른 형태로 결합 또는 조합되거나, 다른 구성요소 또는 균등물에 의하여 대치되거나 치환되더라도 적절한 결과가 달성될 수 있다.
그러므로, 다른 구현들, 다른 실시예들 및 청구범위와 균등한 것들도 후술하는 청구범위의 범위에 속한다.

Claims (13)

  1. 중간엽 줄기세포(MSC, Mesenchymal Stem Cell)에 비해 표피성장인자 수용체(EGF-R, Epidermal Growth Factor Receptor)를 과발현하고,
    중간엽 줄기세포에 비해 CD95(Cluster Differentiation 95)를 저발현하는, 간엽성 전구세포를 유효성분으로 포함하는, 항염증용 세포치료제 조성물.
  2. 제1항에 있어서,
    배아줄기세포(ESC, Embryonic Stem Cell), 유도 전분화능 줄기세포(iPSC, induced Pluripotent Stem Cell) 또는 체세포 핵치환 줄기세포(SCNT, Somatic Cell Nuclear Transfer cell) 유래인, 간엽성 전구세포를 유효성분으로 포함하는, 항염증용 세포치료제 조성물.
  3. 제2항에 있어서,
    상기 배아줄기세포는 포유동물 유래인, 간엽성 전구세포를 유효성분으로 포함하는, 항염증용 세포치료제 조성물.
  4. 제1항에 있어서,
    중간엽 줄기세포에 비해 LTBP(Latent-Transforming growth factor Beta-binding Protein), VEGF(Vascular Endothelial Growth Factor), KDR(Kinase insert Domain Receptor), FZD(Frizzled), FGF(Fibroblast Growth Factor), ANG(Angiopoietin), PDGFR(Platelet-Derived Growth Factor Receptor) 및 EMAP(Endothelial Monocyte-Activating Polypeptide)로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 혈관신생인자(angiogenesis factor)를 과발현하는, 간엽성 전구세포를 유효성분으로 포함하는, 항염증용 세포치료제 조성물.
  5. 제1항에 있어서,
    중간엽 줄기세포에 비해 MMP(Matrix Metalloproteinase) 및 HGF(Hepatocyte growth factor) 중 하나 이상의 이동인자(migration factor)를 과발현하는, 간엽성 전구세포를 유효성분으로 포함하는, 항염증용 세포치료제 조성물.
  6. 제1항에 있어서,
    지방세포(adipocyte), 골세포(osteocyte), 연골세포(chondrocyte) 또는 근세포(myocyte)로의 분화능을 갖는, 간엽성 전구세포를 유효성분으로 포함하는, 항염증용 세포치료제 조성물.
  7. 제1항에 있어서,
    배가 시간(doubling time)이 20시간 내지 35시간인, 간엽성 전구세포를 유효성분으로 포함하는, 항염증용 세포치료제 조성물.
  8. 제1항에 있어서,
    PBMC(Peripheral Blood Mononuclear Cell)의 증식을 억제하는, 간엽성 전구세포를 유효성분으로 포함하는, 항염증용 세포치료제 조성물.
  9. 제1항에 있어서,
    IL-10(Interleukin 10)의 분비를 유도하는, 간엽성 전구세포를 유효성분으로 포함하는, 항염증용 세포치료제 조성물.
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