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KR101909000B1 - 세포 배양용 키트 및 세포 배양용 키트의 사용 방법 - Google Patents

세포 배양용 키트 및 세포 배양용 키트의 사용 방법 Download PDF

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KR101909000B1
KR101909000B1 KR1020147021478A KR20147021478A KR101909000B1 KR 101909000 B1 KR101909000 B1 KR 101909000B1 KR 1020147021478 A KR1020147021478 A KR 1020147021478A KR 20147021478 A KR20147021478 A KR 20147021478A KR 101909000 B1 KR101909000 B1 KR 101909000B1
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kit
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사토시 다나카
타카히코 토타니
요이치 이시자키
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도요세이칸 그룹 홀딩스 가부시키가이샤
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Abstract

배양 용기를 이용한 세포 배양에서 세포 주입에서 배지 추가, 샘플링 회수까지를 키트 내에서 폐쇄계를 유지하면서 자동 배양 가능하게 한다. 세포를 배양하기 위한 폐쇄계 세포 배양용 키트로서, 세포를 배양하기 위한 배양 용기와 배지 등을 저장해 두기 위한 배지 저장 용기와 세포를 주입하기 위한 세포 주입 용기와, 배양 후의 세포 현탁액을 회수하는 세포 회수 용기와를 각각 최소한 1개 이상 가진 배지 저장 용기가, 배양 후의 배지를 회수하는 폐액 용기로서도 사용되며, 배양 용기, 배지 저장 용기, 세포 주입 용기 및 세포 회수 용기가 도관에 의해서 연결된 세포 배양용 키트로 한다. 또한 배양 중인 세포 현탁액의 일부를 샘플링하는 것이 가능한 샘플링 용기를 적어도 1개 이상 가진 샘플링 용기가 도관에 의해서 배양 용기에 연결된 세포 배양용 키트로 한다.

Description

세포 배양용 키트 및 세포 배양용 키트의 사용 방법{CELL CULTURE KIT, AND METHOD OF USING CELL CULTURE KIT}
본 발명은 배양 용기를 사용해서 세포 배양을 하는 자동 세포 배양 장치에 사용하기 위한 세포 배양용 키트 및 그 사용 방법에 관한 것이다.
최근 의약품 생산, 유전자 치료, 재생 의료, 면역 요법 등의 분야에서 세포나 조직, 미생물 등을 인공적인 환경 하에서 효율적으로 대량으로 배양하는 것이 요구되고 있다.
이러한 세포의 대량 배양에서는, 배양 용기를 사용해서 자동적으로 세포 배양을 하는 자동 세포 배양 장치를 적절하게 사용할 수 있다.
자동 세포 배양 장치를 사용할 때에는 콘타미네이션의 리스크를 저감하기 위해 폐쇄계에서 실시하는 것이 중요하다. 그러나 세포 주입부터 배지 추가, 샘플링 회수까지를 폐쇄계를 유지하면서 자동 배양 가능한 간편한 세포 배양용 키트는 이제까지 존재하지 않았다.
(특허 문헌 1) 국제 공개 2007/052716호 팜플렛
즉, 이제까지 자동 세포 배양 장치는 몇 가지 제안되고 있으며 그 장치에 사용하는 용기 키트도 제안되었으나 임상 응용에 있어서 필요한 세포 주입부터 배지 추가, 샘플링, 회수까지 폐쇄계를 유지한 채, 간편하게 달성할 수 있는 세포 배양용 키트는 존재하지 않았다.
구체적으로는, 배양 용기를 사용해서 자동적으로 세포 배양을 하는 자동 세포 배양 장치로서 예를 들면 특허 문헌 1에 기재된 세포 배양 장치를 들 수 있다. 이 장치에서는 배지 저류 수단, 기능 발현용 배양 용기 및 증식용 배양 용기가 폐쇄계로 구성되어 있다(청구항 7참조). 그러나 이 세포 배양 장치에서는 폐액 백에서 세포 회수 백으로 교환할 때에 대해서는 폐쇄계를 유지할 수 있는 구성은 보이지 않고, 개방 계에서 하고 있다고 생각된다. 또한 그 외에도 세포 주입부터 회수까지를 폐쇄계를 유지한 채 실현가능하게 하기 위한 세포 배양용 키트는 보이지 않았다.
또한, 자동 세포 배양 장치를 사용하는 데 있어서, 세포 배양용 키트에 있어서의 배지 저장 용기는 냉장되는 경우가 있다. 그러나 냉장된 배지를 배지 저장 용기에서 배양 용기에 직접 송액(액을 보냄)하면 배양 용기 내의 배지 온도가 떨어져서 세포의 증식이 나빠진다는 문제가 있었다.
또한, 냉장된 배지는 기체의 용해도가 높고 다량의 탄산 가스와 산소가 녹아 있다. 이것을 배양 용기에 옮겨 가온하면 기체의 용해도는 액온도가 높아질수록 낮아지므로 배양 용기 내에서 기포가 발생한다는 문제가 있었다. 배양 용기 내에서 발생한 기포는 용기 내를 교반할 때 미세하게 거품이 일고, 세포에 대해서 악영향을 미친다. 또한, 용기 내부를 관찰할 때 기포가 방해가 되고 관찰하기 어렵다는 문제가 있었다.
이러한 문제의 대책으로서 배지 저장 용기 자체를 가온해두는 것이 고려되지만, 배지는 가온 시간이 길어지면 세포 배양 효율이 저하된다. 이 때문에 되도록 배양하기 직전까지는 배지를 냉장 보관하는 것이 바람직하다.
본 발명은 상기 사정을 감안하여 이루어진 것이며, 배양 용기를 사용한 세포 배양에서 세포 주입에서 배지 추가, 샘플링, 회수까지를 키트 내에서 폐쇄계를 유지하면서 자동적으로 하는 것을 가능하게 하기 위한 세포 배양용 키트의 제공을 목적으로 한다.
또한, 배지의 온도를 조정하기 위한 온도 조정 용기를 갖춘 세포 배양용 키트 및 그 사용 방법의 제공을 목적으로 한다.
상기 목적을 달성하기 위해서 본 발명의 세포 배양용 키트는 세포를 배양하기 위한 폐쇄계 세포 배양용 키트로서, 세포를 배양하기 위한 배양 용기와, 배지 등을 저장해 두기 위한 배지 저장 용기와, 세포를 주입하기 위한 세포 주입 용기와, 배양 후의 세포 현탁액을 회수하는 세포 회수 용기를 각각 최소한 1개 이상 가지고 배지 저장 용기가 배양 후의 배지를 회수하는 폐액 용기로서 사용되며, 배양 용기, 배지 저장 용기, 세포 주입 용기 및 세포 회수 용기가 도관에 의해서 연결된 구성으로 되어 있다.
또한, 본 발명의 세포 배양용 키트를, 배양 중인 배지를 일부 샘플링하는 것이 가능한 샘플링 용기를 적어도 1개 이상 가지고 샘플링 용기가 도관에 의해서 배양 용기에 연결된 구성으로 하는 것도 바람직하다.
나아가 본 발명의 세포 배양용 키트를, 배지 등의 온도를 조정하기 위한 온도 조정 용기가 배양 용기와 배지 저장 용기를 연결하는 도관에서 갈라져 형성된 구성으로 하는 것이 바람직하며, 배지 저장 용기에서 냉장된 배지 등의 일부 또는 전부가 온도 조정 용기에 이송되어 소정의 온도로 승온된 후, 배양 용기에 이송되는 구성으로 하는 것도 바람직하다.
또한, 본 발명의 세포 배양용 키트의 사용 방법은 세포 배양용 키트에 세포를 배양하기 위한 배양 용기와, 배지 등을 저장해 두기 위한 배지 저장 용기와, 세포를 주입하기 위한 세포 주입 용기와, 배양 후의 세포 현탁액을 회수하는 세포 회수 용기와, 배지 등의 온도를 조정하기 위한 온도 조정 용기가 각각 최소한 1개 이상 갖추어지고, 배지 저장 용기가 배양 후의 배지를 회수하는 폐액 용기로서도 사용되며, 배양 용기, 배지 저장 용기, 세포 주입 용기, 세포 회수 용기 및 온도 조정 용기가 도관에 의해서 연결되고, 배지 저장 용기에서 배지 등이 냉장되어 이 냉장된 배지 등의 일부 또는 전부가 배지 저장 용기에서 온도 조정 용기로 이송되고, 온도 조정 용기에서 배지 등이 소정의 온도로 승온하고, 온도가 조정된 배지 등이 배양 용기에 이송되는 방법으로 되어 있다.
배양 용기를 사용한 세포 배양에서 세포 주입부터 배지 추가, 샘플링 회수까지 키트 내에서 폐쇄계를 유지하면서 할 수 있게 된다. 또한 배지 저장 용기에서 냉장된 배지를 온도 조정 용기에 옮기고 온도를 조정하고 나서 배양 용기에 이송할 수 있으므로 배양 용기 내의 배지 온도의 저하를 막고 세포의 증식 저해를 방지할 수 있다.
도 1은 본 발명의 제1실시 형태의 세포 배양용 키트(1포트시방)의 구성을 나타내는 도이다.
도 2는 본 발명의 제2실시 형태의 세포 배양용 키트(2포트시방)의 구성을 나타내는 도이다.
도 3은 본 발명의 제3실시 형태의 세포 배양용 키트(3포트시방)의 구성을 나타내는 도이다.
도 4는 본 발명의 제4실시 형태의 세포 배양용 키트(1포트시방)의 구성을 나타내는 도이다.
도 5는 본 발명의 제4실시 형태의 세포 배양용 키트(2포트시방)의 구성을 나타내는 도이다.
도 6은 본 발명의 제4실시 형태의 세포 배양용 키트(3포트시방)의 구성을 나타내는 도이다.
이하, 본 발명의 세포 배양용 키트의 바람직한 실시 형태에 대해서 도면을 참조하면서 설명한다.
<제1실시 형태>
먼저 도 1을 참조하여 본 발명의 제1실시 형태에 대해서 설명한다. 이 도는 본 실시 형태의 세포 배양용 키트의 구성을 나타내는 도이다.
본 실시 형태의 세포 배양용 키트는, 배양 용기 (10), 배지 저장 용기 (20), 세포 주입 용기 (30), 세포 회수 용기 (40)를 갖추고 있다. 또한, 샘플링 용기 (50)를 갖추는 것이 바람직하다.
배양 용기 (10)는 가요성 소재를 재료로 하여, 주머니 모양(백형)으로 형성한 용기이며, 배지(배양액)를 넣는 동시에, 배양 대상 세포를 파종하여 세포를 대량 배양하기 위한 용기이다.
배양 용기 (10)는 세포 배양에 필요한 가스 투과성을 가지고 있는 것이 필요하다. 구체적으로는 5000ml/m2·day, atm(37℃-80%RH)이상의 산소 투과율을 가지는 것이 바람직하다.
또한, 내용물을 확인할 수 있도록 배양 용기 (10)의 전부 또는 일부는 투명성을 가지는 것이 바람직하다. 도 1에서 배양 용기 (10) 위에는 주름이 생길 수 없으며 내부의 관찰을 쉽게 하게 할 수 있는 관찰 프레임 (11)이 도시되어 있다.
또한, 배양 용기 (10)는 높은 세포 증식 효율을 실현하기 위해서 저세포 독성, 저용출성 및 방사선 멸균 적성을 갖는 것이 바람직하다.
이런 조건을 충족하는 배양 용기 (10)의 재료로서는, 폴리 에틸렌계 수지가 바람직하다. 폴리 에틸렌계 수지란 폴리 에틸렌, 에틸렌과 α-올레핀의 공중합체, 에틸렌과 초산 비닐의 공중합체, 에틸렌과 아크릴산이나 메타 크릴산 공중 중합체와 금속 이온을 사용한 아이오 노머 등이 있다. 또한, 폴리올레핀, 스틸렌계 엘라스토머, 폴리에스테르계 열 가소성 엘라스토머, 실리콘계 열 가소성 엘라스토머, 실리콘 수지 등을 사용할 수도 있다.
또한, 배양 용기 (10)는 배지나, 세포의 주입, 회수 등을 하기 위한 포트를 갖춘다. 이 포트의 수는 특히 한정되지 않지만, 후술하는 바와 같이 1~3포트의 것이 적합하게 사용된다.
배지 저장 용기 (20)는 배양 용기 (10)에 이송하는 세포를 배양하기 위한 배지를 격납하는 용기이다. 배지 저장 용기 (20)는, 격납되어 있는 배지의 pH가 배양 기간 중에 크게 변화하지 않도록, 가스 차단성을 갖는 것이 바람직하다. 구체적으로는 1000ml/m2·day, atm(23℃-80%RH)이하의 이산화 탄소 투과율을 가지는 것이 바람직하다. 이는 배지 중에 포함된 고농도의 탄산 가스가 공기 중으로 빠져나가고 배지 중의 탄산 가스 농도가 저하하여 결과적으로 pH가 상승하는 것을 회피하기 위해서 배지 저장 용기 (20)내부에서 이산화 탄소가 외부로 빠져나가는 것을 최대한 줄이는 것이 바람직하기 때문이다.
또한, 배지 저장 용기 (20)에는 최소한 2개의 포트를 갖추는 것이 바람직하다. 이 중 1개의 포트에는 배양 용기 (10)와 연결하는 도관(튜브)이 연결되어 이 배지 저장 용기 (20)에서 신선한 배지가 배양 세포의 증식 등에 맞추어 조금씩 배양 용기 (10)로 보내진다. 배지가 봉입된 배지 저장 용기 (20)는 냉장고에서 보존되는 것이 바람직하다. 또한, 배지 저장 용기 (20)의 다른 1개의 포트는 본 실시 형태의 세포 배양용 키트의 외부로부터 배지를 배지 저장 용기 (20)에 공급하기 위한 배지 충전구 (21)이며, 무균 접합 장치 등을 통해서 이 배지 충전구 (21)로부터 배지가 충전된다.
또한, 본 실시 형태의 세포 배양용 키트에서 1개의 포트만을 갖춘 배지 저장 용기 (20)를 사용하여 이 포트에서 배지를 배지 저장 용기 (20)에 충전한 후에 이 포트에서 배지를 배양 용기 (10)로 이송할 수도 있다.
또한, 배지 저장 용기 (20)는 배양 완료 후, 폐액 용기로서 사용할 수 있다. 즉, 배양 용기 (10)에서 세포 회수 용기 (40)에 세포를 회수하기에 앞서서 배지의 상등액을 폐액 용기로서의 배지 저장 용기 (20)로 이송함으로써 그 후 농축된 세포 현탁액을 배양 용기 (10)에서 세포 회수 용기 (40)로 보낼 수 있다. 이는 전용의 폐액 용기를 사용하지 않는 제2실시 형태에 있어서도 마찬가지이다.
또한, 본 실시 형태의 세포 배양용 키트에서 배지 저장 용기 (20)를 2이상 갖출 수도 있다. 이에 따라 동일한 배지를 2배 분량을 저장할 수 있는 외에, 각각 다른 배지를 저장하므로써, 배양 용기 (10)에 다양한 변화로 배지를 공급하는 것도 가능하다.
세포 주입 용기 (30)는 배양 개시시에 필요한 세포와 배지가 들어간 용기이다. 이 용기의 내용물을 배양 용기 (10)로 옮겨서, 배양이 개시된다. 세포 주입 용기 (30)에 넣을 수 있는 세포와 배지는 총량 약 250ml정도로 하는 것이 바람직하지만, 이에 한정되는 것은 아니다.
또한, 세포 주입 용기 (30)는 세포와 배지를 담는 용기이므로 배양 용기 (10)와 마찬가지로 가스 투과성을 가지고 있는 것이 바람직하다. 또한, 저세포 독성, 저용출성 등을 가지는 것도 바람직하다. 그래서 세포 주입 용기 (30)의 재료로서는, 배양 용기 (10)와 같은 것을 사용하는 것이 바람직하다.
이 세포 주입 용기 (30)에는 최소한 1개의 포트가 갖추어 진다. 그리고 이 포트를 통해서 세포 주입 용기 (30)에서 배양 용기 (10)에 배양 개시 시의 세포와 배지가 보내진다.
세포 회수 용기 (40)는 배양 종료 후에 배양된 세포와 배지의 일부를 배양 용기 (10)에서 회수하기 위한 용기이다. 그래서 세포 회수 용기 (40)도 배양 용기 (10)와 같은 특성을 갖추고 있는 것이 바람직하고 그 재료로서 배양 용기 (10)와 같은 것을 사용하는 것이 바람직하다.
세포 회수 용기 (40)에는 최소한 1개의 포트가 갖추어 지고 이 포트를 통해서 배양 용기 (10)에서 세포 회수 용기 (40)에 세포와 배지의 일부가 보내진다.
샘플링 용기 (50)는 세포 배양 중이나 배양 종료 후에, 배양 용기 (10)에서의 세포 현탁액의 일부를 이송해서 샘플링을 하기 위한 용기이다. 이 샘플링 용기 (50)로 이송하는 샘플로서 예를 들면 10ml정도의 양으로 하는 것이 바람직하지만, 이에 한정되는 것은 아니다.
샘플링 용기 (50)에는 2개의 포트가 갖추어 지고 있으며 이 중 한쪽의 포트에는 배양 용기 (10)와 연결하는 도관(튜브)이 연결되어 배양 용기 (10)에서 세포 현탁액이 샘플링 용기 (50)로 보내진다. 또한, 다른 포트는 각종 분석을 하기 위해서 샘플링 용기 (50)내의 세포 현탁액의 일부를 꺼내기 위해서 사용된다. 또한, 이것들을 동시에 하는 1개의 포트를 갖춘 것이나, 3개 이상의 포트를 갖추고 여러 차례의 분취(나누어 취함)를 가능하게 하는 구성으로 할 수도 있다.
다음에, 본 실시 형태의 세포 배양용 키트에서의 각 용기를 접속하는 도관에 대해서 설명한다.
이들 도관의 재료는 사용 목적에 따라 적절한 것을 적절히 선택하는 것이 바람직하다. 예를 들면, 실리콘 수지, 연질 염화 비닐 수지, 폴리부타디엔 수지, 에틸렌-초산 비닐 공중 합체, 폴리우레탄계 열 가소성 엘라스토머, 폴리에스테르계 열 가소성 엘라스토머, 실리콘계 열 가소성 엘라스토머, 스틸렌계 엘라스토머, 예를 들면, SBS(스티렌·부타디엔·스틸렌), SIS(스티렌·이소 프렌·스틸렌), SEBS(스티렌·에틸렌·부틸렌·스틸렌), SEPS(스티렌·에틸렌·프로필렌·스틸렌), 폴리올레핀 수지, 불소계 수지 등을 사용할 수 있다.
또한, 본 실시 형태의 세포 배양용 키트에서 도관에는 크게 나누어 2종류의 다른 것이 사용된다.
즉, 배양 용기 (10)와 배지 저장 용기 (20)를 접속하기 위한 배지 공급용 튜브와 기타 용기의 조합의 사이를 접속하는 배지 이송용 튜브이다.
배양 용기 (10)와 배지 저장 용기 (20)를 접속하기 위한 배지 공급용 튜브로서는 특히 폴리올레핀 또는 실리콘 수지로 구성된 것을 사용하는 것이 바람직하다. 배지 공급용 튜브는 배양 기간을 통해서 배지를 조금씩 배양 용기 (10)로 이송하는 것이기 때문에 특히 우수한 저세포 독성, 저용출성 등을 가진 것이 바람직하다. 한편, 이 배지 공급용 튜브는 배양 공정에서 특히 용단(녹아서 끊어짐)할 필요는 없다. 그래서 이들을 고려하여 상기 재료로 된 것을 사용하는 것이 바람직하다.
도 1에서 배지 저장 용기 접속 튜브 (22)는 이러한 배지 공급용 튜브로 구성하는 것을 가정하고 있으며 예를 들면 내경 3.5mm, 외경 6.0mm의 실리콘 튜브 등을 적절하게 사용할 수 있다.
기타 용기의 조합 사이를 접속하는 배지 이송용 튜브는 장시간에 걸쳐 배지를 이송하는 것이 아니기 때문에 저세포 독성, 저용출성 등에 대해서 높은 기능을 갖추게 할 필요는 없다. 또한, 도관을 용단함으로써 세포 주입 용기나, 세포 회수 용기(폐액 용기)샘플링 용기를, 폐쇄계를 유지한 채 본 실시 형태의 세포 배양용 키트에서 분리하여 사용 가능한 것이 바람직하다.
이러한 용기에 접속되는 배지 이송용 튜브로서 적어도 한곳이 열 가소성 수지로 형성된 것을 사용하는 것이 바람직하다. 또한, 배지 이송용 튜브 전체를 열 가소성 수지로 형성할 수도 있다.
또한, 열 가소성 수지로서는 예를 들면, 연질 염화 비닐 수지를 사용할 수 있지만 이에 한정되지 않는다.
도 1에서 세포 주입 용기 접속 튜브 (31), 세포 회수 용기 접속 튜브 (41) 및 샘플링 용기 접속 튜브 (51)는 이런 배지 이송용 튜브로 구성하는 것을 상정하고 있으며 예를 들면 내경 3.3mm, 외경 5.0mm의 염화 비닐 튜브 등을 적절하게 사용할 수 있다.
또한, 본 실시 형태의 세포 배양용 키트의 외부로부터 배지를 배지 저장 용기 (20)에 공급하기 위한 배지 충전구 (21)를 형성하는 포토에는 열 가소성 수지로 이루어진 튜브를 접속하는 것이 바람직하고, 특히 연질 염화 비닐 수지로 이루어진 튜브를 접속하는 것이 바람직하다. 이는 배지 저장 용기 (20)에는 무균 접합 장치를 통해서 이 배지 충전구 (21)로부터 배지가 충전되지만, 현재 무균 접합 장치에의 접속에는 주로 연질 염화 비닐 수지가 사용되고 있기 때문이다. 또한, 튜브의 선단 처리에 관해서는 본 실시 형태의 2단 씰 이외에도 루어 커넥터, 니들 레스 커넥터, 세프탐 등의 부재를 적용할 수도 있다.
본 실시 형태의 세포 배양용 키트는 도 1에 도시하는 바와 같이 배양 용기 (10)에 포트가 1개만 갖추어져 있는 1포트시방이다.
즉, 본 실시 형태의 세포 배양용 키트에서는, 배양 용기 (10)에 제1포트 (12)가 갖추어지고 이 제1포트 (12)에 배지 저장 용기 접속 튜브 (22)를 통해서 배지 저장 용기 (20)가 접속된다. 그리고 이 배지 저장 용기 접속 튜브 (22)에 기타의 용기가 접속되는 구성으로 되어 있다.
즉, 세포 주입 용기 (30)는 세포 주입 용기 접속 튜브 (31)를 통해서 배지 저장 용기 접속 튜브 (22)에 접속된다. 또한, 세포 회수 용기 (40)는 세포 회수 용기 접속 튜브 (41)를 통해서 배지 저장 용기 접속 튜브 (22)에 접속된다. 또한, 샘플링 용기 (50)는 샘플링 용기 접속 튜브 (51)를 통해서 배지 저장 용기 접속 튜브 (22)에 접속된다. 그리고 튜브 펌프가 배지 저장 용기 접속 튜브 (22)에만 갖추어져 있다.
여기서 세포 주입 용기 (30)는 배지 저장 용기 접속 튜브 (22)에서의 배양 용기 (10) 가장자리에 접속하는 것이 바람직하다. 이렇게 하면, 배양을 개시할 때 배지 저장 용기 (20)에서 배양 용기 (10)에 배지를 주입할 때, 배지 저장 용기 접속 튜브 (22)내의 공기가 배양 용기 (10)에 들어가는 것을 최소한으로 억제할 수 있기 때문이다.
구체적으로는 우선 배지 저장 용기 (20)에서 세포 주입 용기 (30)에 배지가 보내지고, 배지 저장 용기 (20)와 세포 주입 용기 (30)사이를 접속하는 도관의 내부에는 배지가 채워진다. 이때 그 도관의 내부에 존재했던 공기는 세포 주입 용기 (30)내부로 이동한다. 다음에 세포 주입 용기 (30)에서 배양 용기 (10)에 세포와 배지를 보낼 때 세포 주입 용기 (30)내의 공기를 상부에 이동시켜서 세포와 배지만 세포 주입 용기 (30)에서 배양 용기 (10)에 보낼 수 있다.
그래서 배양 용기 (10)에 들어가는 공기는 세포 주입 용기 (30)가 연결된 배지 저장 용기 접속 튜브 (22)의 가장자리에서 배양 용기 (10)까지에만 존재하는 것만으로 된다. 따라서 세포 주입 용기 (30)를 배지 저장 용기 접속 튜브 (22)에서 배양 용기 (10)에 되도록 가까운 위치에 접속하므로써, 배양 용기 (10)에 보내지는 공기를, 세포의 관찰이나 촬영에 방해되지 않을 정도로 최소한으로 억제가 가능해진다.
또한, 최소한 배지 저장 용기 (20)와 세포 주입 용기 (30)에 대해서는 세포 배양용 키트에 있어서 분리 가능하게 구성하는 것이 바람직하다. 이는 사용 전에 배지 저장 용기 (20)에는 배지가 충전되고 세포 주입 용기 (30)에는 세포와 배지가 충전되어 사용 시에 이들을 세포 배양용 키트에 접속해서 사용하기 위해서이다. 이들 이외의 배양 용기 (10), 세포 회수 용기 (40), 샘플링 용기 (50)와 이들에 부속되는 튜브류는 사용 전(제조시)에 일체로 구성하는 것이 바람직하다. 또한, 후술 하는 폐액 용기 (60)도 사용 전에 일체로 구성할 수 있다.
또한, 각 튜브에 클립을 갖추거나 전자 밸브 등으로 각 튜브에서의 배지 등의 이송을 제어하거나 하는 것이 바람직하다.
또한, 배지 저장 용기 접속 튜브 (22)에서의 연결 부분에는 캡이 달린 또는 커버가 달린 루어 커넥터(니드레스 커넥터)등을 사용할 수 있다.
또한, 본 실시 형태의 세포 배양용 키트에서는 배지 저장 용기 접속 튜브 (22)에는 실리콘 튜브를, 그 외에는 염화 비닐 튜브를 사용하여 필요에 따라 연결관(예를 들면 내경 5.3mm, 외경 7.0mm)을 사용하고 있으나 본 발명은 이와 같은 구체적 구성에 한정되는 것은 아니다.
본 실시 형태의 세포 배양용 키트는, 예를 들면 다음과 같은 방법으로 사용할 수 있다.
먼저 도 1에 도시한 세포 배양용 키트에서 배지를 충전한 배지 저장 용기 (20)의 배지 저장 용기 접속 튜브 (22)에서의 커넥터를 연결함과 동시에 세포와 배지를 충전한 세포 주입 용기 (30)의 세포 주입 용기 접속 튜브 (31)를 커넥터에 의해서 접속한다.
다음에 배지 저장 용기 (20)로부터 배지 저장 용기 접속 튜브 (22)와 세포 주입 용기 접속 튜브 (31)를 통해서 세포 주입 용기 (30)까지 배지를 이송한다. 이 때, 배지가 이송된 부분의 튜브에 들어 있던 공기는 세포 주입 용기 (30)에 들어간다.
다음에 세포 주입 용기 (30)에서 배양 용기 (10)에 세포와 배지를 이송한다. 이 때, 세포 주입 용기 (30)의 포트를 아래쪽으로 하여 세로로 하고 세포 주입 용기 (30)에 들어 있는 공기를 상부에 모으는 등으로 공기를 배양 용기 (10)에 보내지 않고 세포와 배지만을 배양 용기 (10)로 이송할 수가 있다.
다음에 배지 저장 용기 (20)로부터 배지 저장 용기 접속 튜브 (22)를 통해서 배지를 배양 용기 (10)로 이송한다. 또한, 세포 주입 용기 (30)에서 세포와 배지를 배양 용기 (10)로 이송시키는 타이밍은 상기에 한정되는 것이 아니고, 예를 들면 배지 저장 용기 (20)에서 배양 용기 (10)에 일부 또는 전부의 배지를 이송한 타이밍으로 할 수도 있다.
그리고, 배양 용기 (10)에 소정량의 배지와 세포가 충전되면 적당히 진탕 및 교반이 이뤄지고 일정 기간 세포 배양이 진행된다. 세포 배양 중에는 샘플을 배양 용기 (10)로부터 샘플링 용기 (50)에 적절히 이송함으로써, 조사나 분석에 이용할 수 있다.
일정 기간의 세포 배양이 완료되면 세포의 회수를 한다. 이 때, 배지 저장 용기 (20)는 폐액 용기로 사용된다.
즉, 우선 배양 용기 (10)를 정지시키고 세포를 하부로 침강시킨 뒤, 세포 현탁액의 상등액을 배양 용기 (10)로부터 배지 저장 용기 (20)로 이송시킨다. 이로써 배양 용기 (10)에서의 세포 현탁액을 농축할 수 있으며 세포 회수 용기 (40)로 옮기는 액량을 저감할 수 있다. 이어서 이 농축된 세포 현탁액을 배양 용기 (10)에서 세포 회수 용기 (40)에 회수한다.
이와 같이, 본 실시 형태의 세포 배양용 키트를 사용함으로써 폐쇄계에서 세포 배양을 할 수 있다.
이상과 같이, 본 실시 형태의 세포 배양용 키트에 의하면, 배양 용기를 이용한 세포 배양에서 세포 주입부터 배지 추가, 샘플링 회수까지를 키트 내에서 폐쇄계를 유지하면서 자동적으로 할 수 있다. 또한, 본 실시 형태의 세포 배양용 키트는 1포트 시방이므로 송액용 튜브 펌프가 1개로도 되고 장치를 단순화할 수 있다.
<제2실시 형태>
다음에, 도 2를 참조하여 본 발명의 제2실시 형태에 대해서 설명한다. 이 도는 본 실시 형태의 세포 배양용 키트의 구성을 나타내는 도이다.
본 실시 형태의 세포 배양용 키트는 2포트 시방으로 되어 있는 점에서 제1실시 형태와 다르고 그 밖의 점에서는 제1실시 형태의 세포 배양용 키트와 같은 구성으로 되어 있다. 즉, 본 실시 형태의 세포 배양용 키트는, 배양 용기 (110), 배지 저장 용기 (20), 세포 주입 용기 (30), 세포 회수 용기 (40)를 갖추고 또한, 샘플링 용기 (50)를 갖추는 것이 바람직하다.
본 실시 형태의 세포 배양용 키트에서의 배양 용기 (110)는 도 2에 도시하는 바와 같이, 제1포트 (112)와 제2포트 (113)를 갖추고 있다.
제1포트 (112)에는, 제1실시 형태와 마찬가지로, 배지 저장 용기 (20)가 배지 저장 용기 접속 튜브 (22)를 통해서 접속되어 있다. 제2포트 (113)에는 세포 회수 용기 (40)가 세포 회수 용기 접속 튜브 (41)를 통해서 접속되어 있다. 배지 저장 용기 접속 튜브 (22) 및 세포 회수 용기 접속 튜브 (41)에는 각각 튜브 펌프가 사용되며, 각각 배지, 세포 현탁액의 이송이 이루어진다.
또한, 세포 주입 용기 (30)는 세포 주입 용기 접속 튜브 (31)를 통해서 배지 저장 용기 접속 튜브 (22)에 접속되고 샘플링 용기 (50)는 샘플링 용기 접속 튜브 (51)를 통해서 배지 저장 용기 접속 튜브 (22)에 연결되어 있다.
본 실시 형태의 세포 배양용 키트의 사용 방법은 세포 배양 완료까지는 제1실시 형태와 같은 방법으로 할 수 있다. 그리고 세포의 회수 시에는 배지 저장 용기 접속 튜브 (22)를 경유하지 않고 제2포트 (113)와 세포 회수 용기 접속 튜브 (41)를 경유하여 튜브 펌프에 의해서 세포 현탁액을 세포 회수 용기 (40)에 회수할 수 있다.
본 실시 형태의 세포 배양용 키트에 의하면, 상기와 같이 세포의 회수 시에 배지 저장 용기 접속 튜브 (22)를 경유하지 않고 전용 튜브 펌프에 의해서 세포 현탁액을 배양 용기 (110)에서 세포 회수 용기 (40)에 회수할 수 있다. 그래서 세포의 회수를 보다 효율적으로 할 수 있게 된다. 본 실시 형태는 2포트 시방의 한 예이며, 세포 회수 용기 (40)대신 제2포트 (113)와 샘플링 용기 접속 튜브 (51)를 통해서 샘플링 용기 (50)를 접속할 수도 있다.
<제3실시 형태>
다음에 도 3을 참조하여 본 발명의 제3실시 형태에 대해서 설명한다. 이 도는 본 실시 형태의 세포 배양용 키트의 구성을 나타내는 도이다.
본 실시 형태의 세포 배양용 키트는 3포트 시방으로 되어 있는 점에서 제1실시 형태와 다르며, 그 외의 점에서는 제1실시 형태의 세포 배양용 키트와 같은 구성으로 되어 있다. 즉, 본 실시 형태의 세포 배양용 키트는, 배양 용기 (210), 배지 저장 용기 (20), 세포 주입 용기 (30), 세포 회수 용기 (40), 폐액 용기 (60)를 갖추고 또한, 샘플링 용기 (50)를 갖추는 것이 바람직하다. 또한, 배지 저장 용기 (20)로서 배지 저장 용기 (20a)와 (20b)의 2개가 갖추어져 있다.
본 실시 형태의 세포 배양용 키트에서의 배양 용기 (210)는 도 3에 도시하는 바와 같이 제1포트 (212), 제2포트 (213)및 제3포트 (214)를 갖추고 있다.
본 실시 형태에서는 제1포트에는 샘플링 용기 (50)와 폐액 용기 (60)가 각각 샘플링 용기 접속 튜브 (51), 폐액 용기 접속 튜브 (61)를 통해서 접속되어 있다. 또한, 이들 튜브가 합류한 튜브 부분에는 튜브 펌프가 사용되며, 샘플링 용기 (50)에 대한 세포 현탁액의 이송 및 폐액 용기 (60)에 대한 상등액의 이송이 각각 행해진다.
또한, 제2포트 (213)에는 배지 저장 용기 접속 튜브 (22) (22a, 22b)를 통해서 배지 저장 용기 (20a, 20b)가 접속되어 있다. 이와 같이, 배지 저장 용기를 복수 사용함으로써 다른 조성의 배지를 조합하여, 배양 용기 (10)로 이송할 수 있어서 공급하는 배지의 조성이나 타이밍 등에 변화를 갖게 하는 것이 가능하다. 또한, 배지 저장 용기 접속 튜브 (22)에는 튜브 펌프가 사용되어, 배양 용기 (210)에의 배지의 이송이 이루어진다.
또한, 제3포트 (214)에는 세포 회수 용기 (40)가 세포 회수 용기 접속 튜브 (41)를 통해서 접속되어 튜브 펌프에 의해서 세포 현탁액이 배양 용기 (210)에서 세포 회수 용기 (40)로 이송된다.
본 실시 형태의 세포 배양용 키트의 사용 방법은 먼저 세포의 배양을 시작할 때까지는 제1실시 형태와 같은 방법으로 할 수 있다. 도 3에서는 기재 공간의 제약으로 세포 주입 용기 접속 튜브 (31)가 배지 저장 용기 접속 튜브 (22)의 중간에 접속되어 있으나 실제로는 배양 용기 (210)에 공기가 들어가는 것을 억제하기 위해 제2포트의 경우에 접속하는 것이 바람직하다.
또한, 세포 배양 중에는 샘플을 배양 용기 (210)로부터 샘플링 용기 (50)에 적절히 이송함으로써, 조사나 분석에 이용할 수 있다.
또한 세포 배양 완료 후에는 세포 현탁액의 상등액을 배양 용기 (210)에서 폐액 용기 (60)에 폐액 용기 접속 튜브 (61)를 통해서 이송시켜서, 배양 용기 (210)에서 세포 현탁액을 농축할 수 있다. 마지막으로 이 농축된 세포 현탁액을 배양 용기 (210)에서 세포 회수 용기 (40)에 회수한다.
본 실시 형태의 세포 배양용 키트에 따르면 복수의 동작을 동시에 할 수 있게 된다. 특히 배지 저장 용기 (20)나 배지 저장 용기 접속 튜브 (22)에 아직 배지가 잔존하고 있는 경우라도 샘플링 용기 (50)에 대한 샘플링을 할 수 있고, 배지의 공급과 샘플링의 타이밍을 유연하게 조정할 수 있게 된다.
<제4실시 형태>
다음에 도 4~도 6을 참조하여 본 발명의 제4실시 형태에 대해서 설명한다. 이들 도는 본 실시 형태의 세포 배양용 키트의 구성을 나타내는 도이다.
본 실시 형태의 세포 배양용 키트는 제1실시 형태~ 제3실시 형태 구성에 더해서, 배지의 온도를 조정하기 위한 온도 조정 용기 (70) 및 온도 조정 용기 접속 튜브 (71)를 갖춘다는 점에 특징이 있다. 기타의 구성에 대해서는 제1실시 형태~ 제3실시 형태의 것과 같은 것으로 할 수 있다.
이하, 제1실시 형태의 세포 배양용 키트에 온도 조정 용기 (70) 및 온도 조정 용기 접속 튜브 (71)를 추가한 본 실시 형태의 세포 배양용 키트를 나타내는 도 4를 이용해서 설명하지만 도 5,6에서 온도 조정 용기 (70) 및 온도 조정 용기 접속 튜브 (71)에 대해서도 도 4와 마찬가지이다.
온도 조정 용기 (70)는 배지 저장 용기 (20)에서 배양 용기 (10)에 배지를 이송할 때, 이송시키는 배지를 일단 저류하여, 배지의 온도를 조정하기 위한 용기이다. 이송할 배지의 양은 특히 한정되지 않으며, 배지 저장 용기 (20)내에서의 배지의 일부 또는 전부로 할 수 있다. 세포 배양용 키트에 복수의 배지 저장 용기 (20)가 갖춰져 있는 경우이며 그 일부의 배지 저장 용기 (20)에 배지가 아니라, 배양 용기 (10)에서 배양 중인 배지에 추가하기 위한 생리 활성 물질이나 사이토카인 그 외 여러가지 물질이 저장되어 있는 경우에는, 온도 조정 용기 (70)에 의해서 이들을 승온시키는 것도 가능하다. 온도 조정 용기 (70)의 용기는 배지 저장 용기 (20)와 같은 가스 차단성을 갖는 것이 바람직하다.
온도 조정 용기 (70)에는 최소한 1개의 포트가 갖추어 지고 포트에 온도 조정 용기 접속 튜브 (71)가 접속되고 온도 조정 용기 접속 튜브 (71)는 배지 저장 용기 (20)와 배양 용기 (10)를 접속하는 배지 저장 용기 접속 튜브 (22)에 접속되어 있다. 즉 온도 조정 용기 (70)는 배지 저장 용기 (20)와 배양 용기 (10)를 접속하는 튜브에서 분기되어 폐쇄계를 유지한 형태로 세포 배양용 키트에 갖추어 질 수 있다. 온도 조정 용기 접속 튜브 (71)와 배지 저장 용기 접속 튜브 (22)는 일체로 형성된 것이라도 된다.
또한, 온도 조정 용기 (70)는 연포재(Soft package material)로 이루어진 것이 바람직하며, 공기 구멍을 가진 구성으로 하는 것도 바람직하다. 온도 조정 용기 (70)에서 배지가 승온되면 배지 중에 용해되어 있던 가스가 빠진다. 이때, 온도 조정 용기 (70)의 포트를 아래쪽으로 해둠으로써 가스를 온도 조정 용기 (70)의 상부에 모을 수 있고 배지만을 배양 용기 (10)에 송액할 수 있다. 그래서 배양 용기 (10)내에 불필요한 기포를 혼입시키지 않고, 배지를 이송할 수 있다.
온도 조정 용기 (70)는 배양 용기 (10)가 배치되는 인큐베이터의 내부에 배치하는 것이 바람직하다. 이 경우, 온도 조정 용기 (70)내의 배지는 배양 용기 (10)내의 배지와 같은 온도로 조정할 수 있게 된다. 그 온도로서는 예를 들면 37℃로 할 수 있다.
또한, 온도 조정 용기 (70)를 인큐베이터의 외부에 배치해서 예를 들면 별개의 가온 장치에 의해서 온도 조정 용기 (70)를 가온하여 온도 조정 용기 (70)내의 배지 온도를 조정하는 것도 바람직하다. 이 경우는, 예를 들면 30~37℃ 등의 온도 범위로 조정할 수 있다.
또한 온도 조정 용기 (70)를 인큐베이터의 외부에 배치하여 특별한 가온 장치를 설치하지 않고 정치시켜둠으로써 온도 조정 용기 (70)내의 배지 온도를 상온(실온)으로 되돌릴 수도 있다.
또한, 본 실시 형태의 세포 배양용 키트에서 온도 조정 용기 (70)를 2개이상 갖출 수도 있다. 이에 따라 동시에 2배량 이상의 배지나 기타 물질의 온도를 조정할 수 있게 된다.
온도 조정 용기 접속 튜브 (71)는 배양기간을 통해서 배지를 조금씩 배양 용기 (10)로 이송하는 것이므로 특히 뛰어난 저세포 독성, 저용출성 등을 가진 것이 바람직하고, 또한, 배양 공정에서 특히 용단할 필요는 없다. 그래서 온도 조정 용기 접속 튜브 (71)는 배양 용기 (10)와 배지 저장 용기 (20)를 접속하는 배지 저장 용기 접속 튜브 (22)와 같은 것으로 하는 것이 바람직하다.
이상과 같이 본 실시 형태의 세포 배양용 키트에 의하면, 배양 용기에 이송하기 위해서 필요한 양의 배지를 온도 조정 용기에 넣어서 승온한 후에, 배양 용기에 송액할 수 있다.
그래서 배양 용기 내의 배지 온도가 저하하지 않고 세포의 증식 저해를 저지할 수 있다.
또한, 이와 같이 온도 조정 용기에 따라서 배지를 승온할 수 있기 때문에 배지 저장 용기 내의 배지는 이제까지와 같이 냉장 보관이 가능하며, 배지의 가열 시간이 길어지는 경우에 세포 배양 효율이 떨어진다는 문제의 발생을 방지할 수 있다.
또한, 승온에 의해서 배지에 용해되어 있던 가스가 빠짐으로 온도 조정 용기에서 배양 용기에 배지만을 이송할 수 있고 배양 용기 내에 기포가 혼입되는 것을 방지할 수 있게 된다.
본 발명은 이상의 실시 형태에 한정되는 것이 아니고 본 발명의 범위 내에서 다양한 변경 실시가 가능하다 것은 말할 필요도 없다.
예를 들면 실시 형태에서는 특정 사이즈의 튜브를 사용하는 예가 제시되며 특정한 커넥터가 사용되고 있으나, 본 발명의 기술적 범위의 범위 내에서 같은 기능을 얻을 수 있는 다른 부품을 사용하는 등 적절히 변경할 수 있다. 또한, 배양 중인 배지에 추가하기 위한 생리 활성 물질이나 사이토카인 그 외 다양한 물질이 충전된 용기를 실시 형태의 키트에 부가하여 장착해 두는 것도 가능하다.
본 발명은 대량의 세포를 배양할 필요가 있는 바이오 의약이나 재생 의료, 면역 요법 등의 분야에서 적절하게 이용할 수 있다.

Claims (14)

  1. 세포를 배양하기 위한 폐쇄계 세포 배양용 키트이며,
    세포를 배양하기 위한 배양 용기와,
    배지 등을 저장해 두기 위한 배지 저장 용기와,
    세포를 주입하기 위한 세포 주입 용기와,
    배양 후의 세포 현탁액을 회수하는 세포 회수 용기를 각각 최소한 1개 이상 가지고
    상기 배지 저장 용기가, 배양 후의 배지를 회수하는 폐액 용기로서도 사용되며,
    상기 배양 용기, 상기 배지 저장 용기, 상기 세포 주입 용기 및 상기 세포 회수 용기가 도관에 의해 연결되며,
    상기 세포 주입 용기가 상기 배지 저장 용기와 상기 배양 용기를 연결하는 도관의 경우에, 상기 배양 용기의 가장자리에서 갈라지며,
    상기 세포 주입 용기는 상기 배양 용기로 이송되는 상기 세포에 더하여, 상기 배지 저장 용기의 상기 배지 일부와 상기 도관의 내부에 존재했던 공기의 일부가 그 내부로 이송되고, 상기 세포와 상기 배지 저장 용기로부터 이송된 상기 배지가 상기 배양 용기로 보내지도록 구성되는 것을 특징으로 하는 세포 배양용 키트.
  2. 제1항에 있어서, 배양 중인 세포 현탁액의 일부를 샘플링하는 것이 가능한 샘플링 용기를 적어도 1개 이상 가지고
    상기 샘플링 용기가 도관에 의해서 상기 배양 용기에 연결된
    것을 특징으로 하는 세포 배양용 키트.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 배지 저장 용기와는 별개로, 배양 중 또는 배양 후의 배지를 회수하는 폐액 용기를 적어도 1개 이상 가지고
    상기 폐액 용기가, 도관에 의해서 상기 배양 용기에 연결된
    것을 특징으로 하는 세포 배양용 키트.
  4. 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 배지 저장 용기를 2개 가지고 각각에 동일한 또는 다른 배지가 충전되는 것을 특징으로 하는 세포 배양용 키트.
  5. 제1항 또는 제2항에 있어서, 배지 등의 온도를 조정하기 위한 온도 조정 용기가 상기 배양 용기와 상기 배지 저장 용기를 연결하는 도관에서 갈라져 형성된 것을 특징으로 하는 세포 배양용 키트.
  6. 제5항에 있어서, 상기 배지 저장 용기에서 냉장된 배지 등의 일부 또는 전부가, 상기 온도 조정 용기에 이송되어 소정의 온도로 승온된 후, 상기 배양 용기에 이송되는 것을 특징으로 하는 세포 배양용 키트.
  7. 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 각 용기가 가요성 소재로 주머니 모양으로 형성되어 있는 것을 특징으로 하는 세포 배양용 키트.
  8. 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 배지 저장 용기가 1000ml/m2·day, atm(23℃-80%RH)이하의 이산화탄소 투과율을 가지고, 상기 배양 용기가 5000ml/m2·day, atm(37℃-80%RH)이상의 산소 투과율을 가지는 것을 특징으로 하는 세포 배양용 키트.
  9. 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 배지 저장 용기에 적어도 2개의 도관이 있고, 상기 배양 용기와 연결되어 있지 않은 도관이 연질 염화 비닐 수지로 형성되는 것을 특징으로 하는 세포 배양용 키트.
  10. 제2항에 있어서, 상기 세포 주입 용기, 상기 세포 회수 용기, 상기 샘플링 용기 및 상기 폐액 용기에 대한 도관의 적어도 한곳이 열 가소성 수지로 형성되어 있는 것을 특징으로 하는 세포 배양용 키트.
  11. 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 배지 저장 용기 및 상기 세포 주입 용기의 적어도 하나가 상기 세포 배양용 키트에서 분리 가능함을 특징으로 하는 세포 배양용 키트.
  12. 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 배지 저장 용기와 상기 배양 용기 사이의 도관이 폴리올레핀 또는 실리콘 수지임을 특징으로 하는 세포 배양용 키트.
  13. 삭제
  14. 세포를 배양하기 위한 폐쇄계 세포 배양용 키트의 사용 방법이며,
    상기 세포 배양용 키트에 세포를 배양하기 위한 배양 용기와, 배지 등을 저장해 두기 위한 배지 저장 용기와, 세포를 주입하기 위한 세포 주입 용기와, 배양 후의 세포 현탁액을 회수하는 세포 회수 용기가 각각 최소한 1개 이상 갖추어 지고 상기 배지 저장 용기가, 배양 후의 배지를 회수하는 폐액 용기로서 사용되며, 상기 배양 용기, 상기 배지 저장 용기, 상기 세포 주입 용기 및 상기 세포 회수 용기가 도관에 의해서 연결되어
    상기 세포 주입 용기가 상기 배지 저장 용기와 상기 배양 용기를 연결하는 도관의 경우에, 상기 배양 용기의 가장자리에서 갈라지고,
    상기 배지 저장 용기에서 배지 등이 상기 세포 주입 용기에 이송되는 것과 함께 상기 배지 저장 용기와 상기 세포 주입 용기 사이의 도관 내부에 존재했던 공기가 상기 세포 주입 용기의 내부로 이동하고,
    상기 세포 주입 용기에서 세포 및 배지 등이 상기 배양 용기에 이송되고,
    이어서, 상기 배지 저장 용기에서 배지 등이, 상기 배양 용기에 이송되는
    것을 특징으로 하는 세포 배양용 키트의 사용 방법.
KR1020147021478A 2012-02-01 2013-01-28 세포 배양용 키트 및 세포 배양용 키트의 사용 방법 Active KR101909000B1 (ko)

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