KR101906037B1

KR101906037B1 - 표고버섯 품종 천장 3호 감별용 caps 마커 및 이의 용도

Info

Publication number: KR101906037B1
Application number: KR1020170024231A
Authority: KR
Inventors: 류호진; 문수윤; 이화용
Original assignee: 충북대학교 산학협력단
Priority date: 2017-02-23
Filing date: 2017-02-23
Publication date: 2018-10-08
Anticipated expiration: 2037-02-23
Also published as: KR20180097350A

Abstract

본 발명은 표고버섯 품종 천장 3호를 신속하고 간편하게 감별할 수 있는 감별용 키트 및 감별 방법을 제공한다. 본 발명의 표고버섯 품종 천장 3호 감별용 키트 및 감별 방법은 품종 감별에 비용 및 시간이 적게 소요되고 결과 해석이 용이한 장점을 갖는다.

Description

표고버섯 품종 천장 3호 감별용 CAPS 마커 및 이의 용도{CAPS Marker for Differentiation of Shiitake Mushroom Cultivar Chunjang-3 and use thereof}

본 발명은 표고버섯 품종 천장 3호 감별용 CAPS 마커 및 이의 용도에 관한 것이다.

전 세계적으로 버섯산업은 1990년대 후반 급속하게 증가하였고, 양송이, 느타리버섯, 표고버섯, 목이버섯, 팽이버섯 류가 전 세계 버섯 생산의 약 95%를 차지하고 있으며, 이중 표고버섯은 한국, 중국, 일본 등 아시아국가에서 일반적으로 재배되는 버섯으로 약 17%를 차지하고 있다. 2016년 국내에서 표고버섯의 생산액과 생산량은 국내 임산버섯 생산의 약 97%를 차지하고 있고, 우리나라 국민의 버섯 선호도는 표고버섯(20.6%), 새송이버섯(13.4%), 느타리버섯(12.9%), 양송이버섯(11.1%), 팽이버섯(8.9%) 순이다. 이처럼 표고는 국내 버섯시장, 그리고 단기소득임산물에서 매우 중요한 위치를 차지하고 있다.

우리나라는 2002년에 국제식물신품종보호동맹(UPOV)에 50번째로 정실가입하였으며, 2008년부터는 표고버섯이 “종자산업법”에 의거한 품종보호 대상 작물로 지정되었다. 현재 우리나라에서 표고버섯의 품종을 개발할 때 산림청에서 제작한 표고버섯 특성조사요령에 의하여 품종간 구별을 하고 있다. 하지만 형태표지 이외에 분자마커를 이용한다면 더욱 효율적일 것이다. 현재 한중 FTA의 영향으로 중국산 표고의 수입이 증가하고 있고, 표고의 생산량보다 소비량이 많은 일본에서 중국산 표고보다 한국산을 선호하고 있어, 동북아 3국의 표고 시장이 급속히 변화하고 있다. 이에 따라 직접적인 버섯의 수출입 이외에 품종의 수출도 이루어 질 것으로 판단된다.

2010년 10월 제 10차 생물다양성협약 당사국 총회를 통해 나고야 의정서가 채택됨에 따라 각국은 현재 보유하고 있는 유전자원에 대한 보호를 강화할 것으로 생각된다. 따라서 국내에서 보급되고 있는 국산 표고버섯 품종을 분자마커로 구분하는 것은 우리나라 표고버섯 유전자원을 보호하는 한편 수입품종에 대한 구별성 등에 매우 중요한 일이다.

분자마커는 유전 현상의 본질인 DNA의 염기서열 차이를 대상으로 하기 때문에 발육 단계와 관계없이 안정되고, 모든 조직에서 탐지할 수 있다는 장점을 가지고 있다. 현재까지 개발된 분자 마커의 종류로는 AFLPs(Amplified Fragment Length Polymorphisms), RFLPs(Restriction Fragment Length Polymorphisms), RAPD(Random Amplified Polymorphic DNA), SSRs(Simple Sequence Repeats, microsatellite), STS(Sequence Tagged Sites), CAPS(Cleaved Amplification Polymorphic Sequence) 등이 있다. 이중 CAPS는 증폭된 PCR 산물에 제한효소를 처리하여 절단 위치에 따른 DNA 단편의 크기 차이를 확인하는 방법으로, DNA에 존재하는 염기쌍 하나의 치환인 SNP(Single Nucleotide Polymorphism)의 변이를 예측할 수 있는 분자 마커이다. CAPS 마커를 이용한 분석법은 단계가 간단하고 고가의 장비를 필요로 하지 않기 때문에 비용적인 측면에서 효율적이고, 공우성(co-dominant)이고, 쉽게 결과를 해석할 수 있는 장점을 가진다.

본 명세서 전체에 걸쳐 다수의 논문 및 특허문헌이 참조되고 그 인용이 표시되어 있다. 인용된 논문 및 특허문헌의 개시 내용은 그 전체로서 본 명세서에 참조로 삽입되어 본 발명이 속하는 기술 분야의 수준 및 본 발명의 내용이 보다 명확하게 설명된다.

본 발명자들은 표고버섯 품종 천장 3호를 신속하고 정확하게 판별할 수 있는 방법을 개발하고자 노력하였다. 그 결과, 표고버섯 품종 천장 3호의 특이적인 SNP(Single Nucleotide Polymorphism)를 규명하고, 이를 감별할 수 있는 CAPS(Cleaved Amplification Polymorphic Sequence) 마커를 이용한 중합효소연쇄반응 및 제한효소 처리를 통해 표고버섯 품종 천장 3호를 판별할 수 있음을 확인함으로써 본 발명을 완성하였다.

따라서, 본 발명의 목적은 표고버섯 품종 천장 3호 감별용 키트를 제공하는 데 있다.

본 발명의 다른 목적은 표고버섯 품종 천장 3호의 감별 방법을 제공하는 데 있다.

본 발명의 다른 목적 및 이점은 하기의 발명의 상세한 설명, 청구범위 및 도면에 의해 보다 명확하게 된다.

본 발명의 일 양태에 따르면, 본 발명은 서열목록 제1서열의 103번째 뉴클레오타이드 위치에 아데닌(adenine, A)을 가지는 단일염기다형성(Single Nucleotide Polymorphism) 부위를 포함하는 10-100개의 연속 뉴클레오타이드 서열에 특이적으로 결합하는 프라이머 또는 프로브를 포함하는 표고버섯 품종 천장 3호 감별용 키트를 제공한다.

본 발명자들은 표고버섯 품종 천장 3호를 신속하고 정확하게 판별할 수 있는 방법을 개발하고자 노력하였다. 그 결과, 표고버섯 품종 천장 3호의 특이적인 SNP(Single Nucleotide Polymorphism)를 규명하고, 이를 감별할 수 있는 CAPS(Cleaved Amplification Polymorphic Sequence) 마커를 이용한 중합효소연쇄반응 및 제한효소 처리를 통해 표고버섯 품종 천장 3호를 판별할 수 있음을 확인하였다.

본 발명의 표고버섯 품종 천장 3호 감별용 키트는 서열목록 제1서열의 103번째 뉴클레오타이드 위치에 아데닌을 가지는 단일염기다형성 부위를 포함하는 10-100개의 연속 뉴클레오타이드 서열에 특이적으로 결합하는 프라이머 또는 프로브를 포함한다.

본 명세서에서 용어, “뉴클레오타이드"는 단일가닥 또는 이중가닥 형태로 존재하는 디옥시리보뉴클레오타이드 또는 리보뉴클레오타이드이며, 다르게 특별하게 언급되어 있지 않은 한 자연의 뉴클레오타이드의 유사체를 포함한다(Scheit, Nucleotide Analogs, John Wiley, New York(1980); Uhlman 및 Peyman, Chemical Reviews, 90:543-584(1990)).

본 명세서에서, 용어“단일염기다형성(SNP)”은 게놈에서 단일염기(A, T, C 또는 G)가 종의 멤버들 간 또는 한 개체(individual)의 쌍 염색체 간에 다른 경우에 발생하는 DNA 서열의 다양성을 의미한다. 단일염기는 폴리뉴클레오타이드 서열에 변화(대체), 제거(결실) 또는 첨가(삽입)될 수 있다. SNP는 번역 프레임의 변화를 유발할 수 있다. 단일염기다형성은 유전자의 코딩 서열, 유전자의 비-코딩 부위 또는 유전자 사이의 내부 지역(intergenic regions)에 포함될 수 있다. 유전자의 코딩 서열 내의 SNP는 유전암호의 중복성(degeneracy)으로 인해 반드시 타겟 단백질의 아미노산 서열 상에 변화를 일으키지는 않는다. 동일한 폴리펩타이드 서열을 형성하는 SNP는 동의적(synonymous)이라 하고(침묵 돌연변이라고도 불리움), 다른 폴리펩타이드 서열을 형성하는 SNP의 경우 비-동의적(non-synonymous)이라고 한다. 비-동의적 SNP는 미스센스 또는 넌센스일 수 있으며, 미스센스 변화는 다른 아미노산을 발생시키는 반면에 넌센스 변화는 비성숙 종결코돈을 형성한다. 단백질-코딩 부위가 아닌 곳에 존재하는 SNP는 유전자 사일런싱, 전사인자 결합 또는 비-코딩 RNA 서열을 유발시킬 수 있다.

본 명세서에서, 용어 “프라이머”는 올리고뉴클레오타이드를 의미하는 것으로, 핵산쇄(주형)에 상보적인 프라이머 연장 산물의 합성이 유도되는 조건, 즉, 뉴클레오타이드와 DNA 중합효소와 같은 중합제의 존재, 그리고 적합한 온도와 pH의 조건에서 합성의 개시점으로 작용할 수 있다. 구체적으로는, 프라이머는 디옥시리보뉴클레오타이드이며 단일쇄이다. 본 발명에서 이용되는 프라이머는 자연(naturally occurring) dNMP(즉, dAMP, dGMP, dCMP 및 dTMP), 변형 뉴클레오타이드 또는 비-자연 뉴클레오타이드를 포함할 수 있다. 또한, 프라이머는 리보뉴클레오타이드도 포함할 수 있다.

본 발명에 있어서, 프라이머로서 이용된 올리고뉴클레오티드는 또한 뉴클레오티드 유사체(analogue), 예를 들면, 포스포로티오에이트(phosphorothioate), 알킬포스포로티오에이트 또는 펩티드 핵산(peptide nucleic acid)를 포함할 수 있거나 또는 삽입 물질(intercalating agent)를 포함할 수 있다.

본 명세서에서, 용어 “프로브”는 특정 뉴클레오타이드 서열에 혼성화될 수 있는 디옥시리보뉴클레오타이드 및 리보뉴클레오타이드를 포함하는 자연 또는 변형되는 모노머 또는 결합을 갖는 선형의 올리고머를 의미한다. 구체적으로는, 프로브는 혼성화에서의 최대 효율을 위하여 단일가닥이다. 프로브는 구체적으로는 디옥시리보뉴클레오타이드이다.

본 발명에 이용되는 프라이머 또는 프로브로서, 상기 SNP를 포함하는 서열에 완전하게(perfectly) 상보적인 서열이 이용될 수 있으나, 특이적 혼성화를 방해하지 않는 범위 내에서 실질적으로(substantially) 상보적인 서열이 이용될 수도 있다. 구체적으로는, 본 발명에 이용되는 프로브는 본 발명의 SNP를 포함하는 10-30개의 연속 뉴클레오타이드 잔기를 포함하는 서열에 혼성화 될 수 있는 서열을 포함한다. 보다 구체적으로는, 상기 프로브의 3’-말단 또는 5’-말단은 상기 SNP 염기에 상보적인 염기를 갖는다. 일반적으로, 혼성화에 의해 형성되는 듀플렉스(duplex)의 안정성은 말단의 서열의 일치에 의해 결정되는 경향이 있기 때문에, 3’-말단 또는 5’-말단에 SNP 염기에 상보적인 염기를 갖는 프로브에서 말단 부분이 혼성화되지 않으면, 이러한 듀플렉스는 엄격한 조건에서 해체될 수 있다.

혼성화에 적합한 조건은 Joseph Sambrook, et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y.(2001) 및 Haymes, B. D., et al., Nucleic Acid Hybridization, A Practical Approach, IRL Press, Washington, D.C. (1985)에 개시된 사항을 참조하여 결정할 수 있다. 혼성화에 이용되는 엄격한 조건(stringent condition)은 온도, 이온세기(완충액 농도) 및 유기용매와 같은 화합물의 존재 등을 조절하여 결정될 수 있다. 이러한 엄격한 조건은 혼성화되는 서열에 의존하여 다르게 결정될 수 있다.

본 명세서에서, 용어 “상보적”은 소정의 어닐링 또는 혼성화 조건하에서 프라이머 또는 프로브가 타겟 핵산 서열에 선택적으로 혼성화할 정도로 충분히 상보적인 것을 의미하며, 실질적으로 상보적(substantially complementary) 및 완전히 상보적(perfectly complementary)인 것을 모두 포괄하는 의미를 가지며, 구체적으로는 완전히 상보적인 것을 의미한다. 본 명세서에서, 프라이머 서열과 관련하여 사용되는 용어, “실질적으로 상보적인 서열”은 완전히 일치되는 서열뿐만 아니라, 특정 서열에 어닐링하여 프라이머 역할을 할 수 있는 범위 내에서, 비교 대상의 서열과 부분적으로 불일치되는 서열도 포함되는 의미이다.

본 발명의 상기 표고버섯 품종 천장 1호 감별용 키트는 특정 서열을 규명하는 데 이용되는 당업계에 공지된 다양한 방식을 응용하여 실시될 수 있다. 예를 들어, 본 발명에 응용될 수 있는 기술은, 형광 인 시투 혼성화(FISH), 직접적 DNA 서열결정, PFGE 분석, 서던 블롯 분석, 단일-가닥 컨퍼메이션 분석(SSCA, Orita et al., PNAS, USA 86:2776(1989)), RNase 보호 분석(Finkelstein et al., Genomics, 7:167(1990)), 닷트 블롯 분석, 변성 구배 젤 전기영동(DGGE, Wartell et al., Nucl.Acids Res., 18:2699(1990)), 뉴클레오타이드 미스매치를 인식하는 단백질(예: E. coli의 mutS 단백질)을 이용하는 방법(Modrich, Ann. Rev. Genet., 25:229-253(1991)), 및 대립형-특이 PCR을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다.

본 발명의 다른 양태에 따르면, 본 발명은 (a) 서열목록 제2서열 및 제3서열의 뉴클레오타이드 서열로 이루어지는 프라이머 세트; 및 (b) 열목록 제1서열의 103번째 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 4-20개의 연속 뉴클레오타이드 서열을 인식하는 제한효소를 포함하는 표고버섯 품종 천장 3호 감별용 키트를 제공한다.

본 발명의 일 구현예에 따르면, 상기 제한효소는 XhoI, PaeR7I, TliI, BssHI, Sfr2741, SlaI 또는 StrI이다.

본 발명의 일 구현예에 따르면, 상기 제한효소 XhoI, PaeR7I, TliI, BssHI, Sfr2741, SlaI 또는 StrI는 ‘CTCGAG’의 절단 부위를 갖는다. 서열목록 제1서열의 103번째 뉴클레오타이드 위치가 구아닌(guanine, G)인 경우에 XhoI, PaeR7I, TliI, BssHI, Sfr2741, SlaI 또는 StrI에 의해 절단되고, 아데닌(adenine, A)인 경우에는 절단되지 않는다. 즉, 표고버섯 품종 천장 3호는 서열목록 제1서열의 103번째 뉴클레오타이드 위치가 아데닌이므로 상기 제한효소에 의해 절단되지 않아, 다른 품종의 표고버섯과 구별할 수 있다.

상기 표고버섯 품종 천장 3호 감별용 키트는 유전자 증폭 방식에 의해 실시된다.

본 명세서에서 유전자 증폭 키트를 설명하면서 기재된 용어, "증폭"은 핵산 분자를 증폭하는 반응을 의미한다. 다양한 증폭 반응들이 당업계에 보고되어 있으며, 이는 중합효소 연쇄반응(PCR)(미국 특허 제4,683,195, 4,683,202, 및 4,800,159호), 역전사-중합효소 연쇄반응(RT-PCR)(Sambrook 등, Molecular Cloning. A Laboratory Manual, 3rd ed. Cold Spring Harbor Press(2001)), Miller, H. I.(WO 89/06700) 및 Davey, C. 등(EP 329,822)의 방법, 리가아제 연쇄 반응(ligase chain reaction; LCR)(17, 18), Gap-LCR(WO 90/01069), 복구 연쇄 반응(repair chain reaction; EP439,182), 전사-매개 증폭(transcription-mediated amplification; TMA, WO 88/10315), 자가 유지 염기서열 복제(self sustained sequence replication, WO 90/06995), 타깃 폴리뉴클레오티드 염기서열의 선택적 증폭(selective amplification of target polynucleotide sequences, 미국 특허 제6,410,276호), 컨센서스 서열 프라이밍 중합효소 연쇄 반응(consensus sequence primed polymerase chain reaction(CP-PCR), 미국 특허 제4,437,975호), 임의적 프라이밍 중합효소 연쇄 반응(arbitrarily primed polymerase chain reaction(AP-PCR), 미국 특허 제5,413,909호 및 제5,861,245호), 핵산 염기서열 기반 증폭(nucleic acid sequence based amplification(NASBA), 미국 특허 제5,130,238호, 제5,409,818호, 제5,554,517호, 및 제6,063,603호), 가닥 치환 증폭(strand displacement amplification)(21, 22) 및 고리-중재 항온성 증폭(loop-mediated isothermal amplification; LAMP)(23)를 포함하나, 이에 한정되지는 않는다. 사용 가능한 다른 증폭 방법들은 미국특허 제5,242,794, 5,494,810, 4,988,617호 및 미국 특허 제09/854,317호에 기술되어 있다.

PCR은 가장 잘 알려진 핵산 증폭 방법으로, 그의 많은 변형과 응용들이 개발되어 있다. 예를 들어, PCR의 특이성 또는 민감성을 증진시키기 위해 전통적인 PCR 절차를 변형시켜 터치다운(touchdown) PCR, 핫 스타트(hot start) PCR, 네스티드(nested) PCR 및 부스터(booster) PCR이 개발되었다. 또한, 실시간(real-time) PCR, 분별 디스플레이 PCR(differential display PCR: DD-PCR), cDNA 말단의 신속 증폭(rapid amplification of cDNA ends: RACE), 멀티플렉스 PCR, 인버스 중합효소 연쇄반응(inverse polymerase chain reaction: IPCR), 벡토레트(vectorette) PCR 및 TAIL-PCR(thermal asymmetric interlaced PCR)이 특정한 응용을 위해 개발되었다.

PCR에 대한 자세한 내용은 McPherson, M.J., 및 Moller, S.G. PCR. BIOS Scientific Publishers, SpringerVerlag New York Berlin Heidelberg, N.Y. (2000)에 기재되어 있으며, 그의 교시사항은 본 명세서에 참조로 삽입된다.

본 발명의 키트가 PCR 증폭 과정에 적용되는 경우에는, 본 발명의 키트는 선택적으로 PCR 증폭에 필요한 시약, 예컨대 완충액, DNA 중합효소, DNA 중합 효소 조인자 및 dNTPs를 포함할 수 있다. 본 발명의 키트는 상기한 시약 성분을 포함하는 다수의 별도 패키징 또는 컴파트먼트로 제작될 수 있다.

본 발명에 이용되는 프라이머는 주형의 한 부위에 혼성화 또는 어닐링되어, 이중쇄 구조를 형성한다. 이러한 이중쇄 구조를 형성하는 데 적합한 핵산 혼성화의 조건은 Joseph Sambrook, 등, Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y.(2001) 및 Haymes, B. D., 등, Nucleic Acid Hybridization, A Practical Approach, IRL Press, Washington, D.C. (1985)에 개시되어 있다.

다양한 DNA 중합효소가 본 발명의 증폭에 이용될 수 있으며, E. coli DNA 중합효소 I의 "클레나우" 단편, 열안정성 DNA 중합효소 및 박테리오파아지 T7 DNA 중합효소를 포함한다. 구체적으로는, 중합효소는 다양한 박테리아종으로부터 얻을 수 있는 열안정성 DNA 중합효소이고, 이는 Thermus aquaticus(Taq), Thermus thermophilus(Tth), Thermus filiformis, Thermis flavus, Thermococcus literalis, 및 Pyrococcus furiosus(Pfu)를 포함한다.

중합 반응을 실시할 때, 반응 용기에 반응에 필요한 성분들을 과량으로 제공하는 것이 바람직하다. 증폭 반응에 필요한 성분들의 과량은, 증폭반응이 성분의 농도에 실질적으로 제한되지 않는 정도의 양을 의미한다. Mg² ⁺와 같은 조인자, dATP, dCTP, dGTP 및 dTTP를 원하는 증폭 정도가 달성될 수 있을 정도로 반응 혼합물에 제공하는 것이 요구된다. 증폭 반응에 이용되는 모든 효소들은 동일한 반응 조건에서 활성 상태일 수 있다. 사실, 완충액은 모든 효소들이 최적의 반응 조건에 근접하도록 한다. 따라서, 본 발명의 증폭 과정은 반응물의 첨가와 같은 조건의 변화 없이 단일 반응물에서 실시될 수 있다. 본 발명에 있어서 어닐링은 타깃 뉴클레오타이드 서열과 프라이머 사이에 특이적 결합을 가능하게 하는 엄격조건 하에서 실시된다. 어닐링을 위한 엄격조건은 서열-의존적이며 주위 환경적 변수에 따라 다양하다.

이렇게 증폭된 본 발명의 마커의 뉴클레오티드 서열를 제한효소 처리하여 산물의 크기를 비교함으로써 표고버섯 품종을 구별한다. 예를 들어, 상술한 증폭 반응 결과물을 젤 전기영동을 하고, 그 결과 형성되는 밴드를 관찰 및 분석함으로써 본 발명의 마커의 크기를 조사한다.

본 명세서에서 사용되는 제한효소 자리에 위치하는 SNP를 CAPS 마커라고 한다.

본 발명에 있어서, “CAPS 마커”는 SNP처럼 한 개의 염기서열이 변하거나 InDel에 의해 발생하는 제한효소에 의해 잘리는 부위의 변화를 해석할 수 있는 마커이다. CAPS 마커는 유전자좌에 특이적인 프라이머로 PCR 증폭을 한 후 제한효소로 잘라준 뒤 나타나는 다형성을 분석하는 방법이다.

본 발명의 또 다른 구현예에 따르면, 다음의 단계를 포함하는 표고버섯 품종 천장 3호의 감별 방법을 제공한다:

(a) 표고버섯으로부터 핵산분자를 분리하는 단계;

(b) 상기 핵산분자의 단일염기다형성(Single Nucleotide Polymorphism, SNP)의 염기 타입을 검출하는 단계로서, 상기 SNP는 서열목록 제1서열의 103번째 뉴클레오타이드 위치에 존재하는 SNP인 단계; 및

(c) 상기 검출한 SNP 위치의 염기 타입으로부터 표고버섯 품종 천장 3호를 감별하는 단계로, 상기 SNP 위치의 염기가 아데닌(adenine, A)인 경우에 표고버섯 품종 천장 3호로 판정한다.

본 명세서에서 용어, “핵산 분자”는 DNA(gDNA 및 cDNA) 그리고 RNA 분자를 포괄적으로 포함하는 의미를 갖으며, 핵산 분자에서 기본 구성 단위인 뉴클레오타이드는 자연의 뉴클레오타이드 뿐만 아니라, 당 또는 염기 부위가 변형된 유사체 (analogue)도 포함한다(Scheit, Nucleotide Analogs, John Wiley, New York(1980); Uhlman 및 Peyman, Chemical Reviews, 90:543-584(1990)).

본 발명의 일 구현예에 따르면, 상기 핵산분자는 지노믹 DNA(gDNA)이다.

본 발명의 방법에 있어서, 상기 지노믹 DNA는 표고버섯의 배지, 표고버섯 종균 또는 표고버섯 균사체일 수 있다. 구체적으로는, 표고버섯 균사체로부터 얻는다. 핵산분자의 공급원(source)로서의 식물체는 어떠한 발달 단계에 있는 것이든 모두 공급원으로서 이용될 수 있다.

본 발명의 방법에서 출발물질이 gDNA인 경우, gDNA의 분리는 당업계에 공지된 통상의 방법에 따라 실시될 수 있다(참조: Rogers & Bendich (1994)).

본 발명의 다른 양태에 따르면, 본 발명은 다음의 단계를 포함하는 표고버섯 품종 천장 3호의 감별 방법을 제공한다:

(a) 표고버섯으로부터 핵산 분자를 분리하는 단계;

(b) 상기 핵산 분자를 주형으로 사용하고, 서열목록 제2서열 및 제3서열의 뉴클레오타이드 서열로 이루어지는 프라이머 세트를 사용하여 중합효소연쇄반응(Polymerase Chain Reaction)을 실시하는 단계;

(c) 상기 중합효소연쇄반응의 증폭산물을 서열목록 제1서열의 103번째 뉴클레오타이드를 포함하는 4-20개의 연속 뉴클레오타이드 서열을 인식하는 제한효소 처리하는 단계; 및

(d) 단계 (c)의 결과물을 분석하는 단계로, 상기 결과물이 제한효소에 의해 절단되지 않으면 표고버섯 품종 천장 3호로 판정한다.

본 발명의 방법은 상기 키트와 동일한 방식, 프라이머 및/또는 제한효소를 이용하기 때문에, 이 둘 사이에 공통된 내용은 본 명세서의 과도한 복잡성을 피하기 위하여, 그 기재를 생략한다.

본 발명의 특징 및 이점을 요약하면 다음과 같다:

(a) 본 발명은 표고버섯 품종 천장 3호를 신속하고 간편하게 감별할 수 있는 감별용 키트 및 감별 방법을 제공한다.

(b) 본 발명은 품종 감별에 비용 및 시간이 적게 소요되고 결과 해석이 용이한 표고버섯 품종 천장 3호 감별용 키트 및 감별 방법을 제공한다.

도 1은 표고버섯 품종 천장 3호 감별용 프라이머 세트를 이용하여 PCR을 실시하고 PCR 산물을 시퀀싱하여 SNP를 확인한 결과를 나타낸다.
도 2는 표고버섯 품종 천장 3호 감별용 프라이머 세트를 이용하여 PCR을 실시하고 제한효소 XhoI를 이용하여 CAPS 마커를 확인한 결과를 나타낸다.

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에 있어서 자명할 것이다.

본 명세서 전체에 걸쳐, 특정 물질의 농도를 나타내기 위하여 사용되는 “%“는 별도의 언급이 없는 경우, 고체/고체는 (중량/중량) %, 고체/액체는 (중량/부피) %, 그리고 액체/액체는 (부피/부피) %이다

실시예

프라이머의 제작

표 1은 프라이머 서열을 이용한 PCR 방법으로 표고버섯 품종 천장 3호에서 증폭되는 마커 염기서열(RL-LE-134) 및 프라이머 서열을 나타낸 것이다. 표고버섯의 게놈 서열에서 천장 3호에 특이적인 변이가 생긴 염기서열을 찾았고, 이를 이용하여 프라이머를 제작하였다.

-	서열	서열목록
RL-LE-134	5’-ACCTTTGCGGTGTGTCTTCTcttctgtctgtaggaaaaggttctcatgcactcttcatcagcatacttgcgacgaaacgcttggcgttttcagcctcgcctcAaggaaatgaacgaattacttcgagagatcttttccgacgggagaataacactgatagcaaAAGGCGAATGGAAAGGACCT-3’(183bp)	제1서열
RL-LE-134F	5’-ACCTTTGCGGTGTGTCTTCT 3’(20 bp)	제2서열
RL-LE-134R	5’-AGGTCCTTTCCATTCGCCTT-3’(20 bp)	제3서열

PCR 방법 및 결과

표 1의 프라이머 서열을 이용하여 PCR을 수행하고 시퀀싱을 하여 변이를 확인하였다(도 1) 표고버섯 표준유전체 균주인 B17과 표고버섯 품종 천장 3호에서 지노믹(Genomic) DNA를 추출하여 20 ng의 DNA를 이용하여 PCR을 수행하였다. DNA 추출과 PCR 수행 방법은 다음과 같다.

PDB(Potato Dextrose Broth) 배지에서 배양한 표고버섯 균사체를 미라클로스(miracloth)에 여과시킨 후 PBS 버퍼(NaCl 135 mM, KCl 2.7 mM, Na₂HPO₄ 4.3 mM 및 KH₂PO₄ 1.4 mM)로 세척하고 키친타올로 물기를 제거하였다. 건조된 균사를 액체질소에 얼려 막자사발로 곱게 갈은 후 GeneAll® GenEx™ Plant kit를 이용하여 지노믹 DNA를 추출하였다. 튜브에 옮겨 담은 균사에 PL 완충액 500 ㎕를 넣고 65℃에서 10분 동안 가열해준 후 파이펫을 이용하여 잘 혼합하였다. 13000 rpm으로 1분 동안 원심분리를 실시한 후 상층액을 분리하여 새 튜브로 옮겨준 후 PP 완충액을 상층액의 1/3만큼 넣고 볼텍서를 이용해 잘 혼합하였다. 얼음에서 5분간 방치 후 13000 rpm으로 5분 동안 원심분리를 실시하였다. 상층액을 분리하여 새 튜브로 옮기고 동량의 PCI(phenol : Chloroform : isoamylalcohol = 25 : 24: 1)를 넣어준 후 뒤집어 섞어주었다. 13000 rpm에서 10분 동안 원심분리를 실시한 후 상층액을 분리하여 새 튜브에 옮기고, 동량의 이소프로판올(isopropanol)을 넣어준 후 뒤집어 섞어주었다. 얼음에 10분 동안 방치 후 13000 rpm에서 1분 동안 원심분리를 실시하였다. 상층액을 제거한 후 70% 에탄올 1 ㎖를 넣어 DNA 펠렛을 살짝 띄우고 13000 rpm에서 1분 동안 원심분리 하였다. 상층액을 제거한 후 13000 rpm에서 1분 동안 한 번 더 원심분리를 실시하였다. 남은 에탄올을 전부 제거하고 DNA 펠렛을 상온에서 5분 동안 건조시킨 후, RE 완충액 100 ㎕를 넣어 DNA 펠렛을 용해시켰다. 추출한 지노믹 DNA 20 ng을 주형으로 본 발명에서 제작한 프라이머를 이용하여 PCR을 수행하였다.

PCR은 95℃에서 3분, 다시 95℃에서 30초, 58℃에서 30초, 72℃에서 20초로 35 사이클을 증폭한 후, 추가로 72℃에서 5분간 반응시킴으로써 수행되었다.

PCR 수행 후 시퀀싱 결과를 얼라인(alignment)하여 비교함으로써 천장 3호에 특이적인 변이가 존재하는 것을 확인할 수 있었다.

도 2는 표 1의 프라이머 서열을 이용하여 PCR을 수행하고 제한효소 XhoI을 처리한 결과를 나타낸다. 표고버섯 표준유전체 균주 B17, 그리고 표고버섯 품종 백화향, 산마루 1호, 산마루 2호, 산백향, 천장 3호, 참아람, 산조 701호, 산조 707호 및 산조 708호에서 지노믹 DNA를 추출하여 20 ng의 DNA를 이용하여 PCR을 수행하였다. 제한효소 XhoI에 의하여 천장 3호가 다른 품종들과 구분되는 것을 확인할 수 있었다. 천장 3호의 구분은 검정색의 밴드패턴으로 확인할 수 있다.

도 2에서 확인할 수 있듯이, 표고버섯 품종 천장 3호의 산물는 제한효소에 의해 절단되지 않아, 183 bp의 밴드 사이즈를 나타내었고, XhoI에 의해 절단된 다른 표고버섯 품종은 83 bp, 100 bp의 밴드 사이즈를 나타내었다.

이상으로 본 발명의 특정한 부분을 상세히 기술하였는바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 이러한 구체적인 기술은 단지 구체적인 구현예일 뿐이며, 이에 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백하다. 따라서 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항과 그의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.

<110> Chungbuk National University Industry-Academic Cooperation Foundation <120> CAPS Marker for Differentiation of Shiitake Mushroom Cultivar Chunjang-3 and use thereof <130> PN170040 <160> 3 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 183 <212> DNA <213> Unknown <220> <223> Shiitake Mushroom Cultivar Chunjang-3 <400> 1 acctttgcgg tgtgtcttct cttctgtctg taggaaaagg ttctcatgca ctcttcatca 60 gcatacttgc gacgaaacgc ttggcgtttt cagcctcgcc tcaaggaaat gaacgaatta 120 cttcgagaga tcttttccga cgggagaata acactgatag caaaaggcga atggaaagga 180 cct 183 <210> 2 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> forward primer <400> 2 acctttgcgg tgtgtcttct 20 <210> 3 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> reverse primer <400> 3 aggtcctttc cattcgcctt 20

Claims

서열목록 제1서열의 103번째 뉴클레오타이드 위치에 아데닌(adenine, A)을 가지는 단일염기다형성(Single Nucleotide Polymorphism) 부위를 포함하는 10-100개의 연속 뉴클레오타이드 서열에 특이적으로 결합하는 프라이머 또는 프로브를 포함하는 표고버섯 품종 천장 3호 감별용 키트.
(a) 서열목록 제2서열 및 제3서열의 뉴클레오타이드 서열로 이루어지는 프라이머 세트; 및 (b) 서열목록 제1서열의 103번째 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 4-20개의 연속 뉴클레오타이드 서열을 인식하는 제한효소를 포함하는 표고버섯 품종 천장 3호 감별용 키트.
제 2 항에 있어서, 상기 제한효소는 XhoI, PaeR7I, TliI, BssHI, Sfr2741, SlaI 또는 StrI인 것을 특징으로 하는 키트.
다음의 단계를 포함하는 표고버섯 품종 천장 3호의 감별 방법:
(a) 표고버섯으로부터 핵산분자를 분리하는 단계;
(b) 상기 핵산분자의 단일염기다형성(Single Nucleotide Polymorphism, SNP)의 염기 타입을 검출하는 단계로서, 상기 SNP는 서열목록 제1서열의 103번째 뉴클레오타이드 위치에 존재하는 SNP인 단계; 및
(c) 상기 검출한 SNP 위치의 염기 타입으로부터 표고버섯 품종 천장 3호를 감별하는 단계로, 상기 SNP 위치의 염기가 아데닌(adenine, A)인 경우에 표고버섯 품종 천장 3호로 판정한다.
다음의 단계를 포함하는 표고버섯 품종 천장 3호의 감별 방법:
(a) 표고버섯으로부터 핵산 분자를 분리하는 단계;
(b) 상기 핵산 분자를 주형으로 사용하고, 서열목록 제2서열 및 제3서열의 뉴클레오타이드 서열로 이루어지는 프라이머 세트를 사용하여 중합효소연쇄반응(Polymerase Chain Reaction)을 실시하는 단계;
(c) 상기 중합효소연쇄반응의 증폭산물을 서열목록 제1서열의 103번째 뉴클레오타이드를 포함하는 4-20개의 연속 뉴클레오타이드 서열을 인식하는 제한효소 처리하는 단계; 및
(d) 단계 (c)의 결과물을 분석하는 단계로, 상기 결과물이 제한효소에 의해 절단되지 않으면 표고버섯 품종 천장 3호로 판정한다.
제 5 항에 있어서, 상기 단계(c)의 제한효소는 XhoI, PaeR7I, TliI, BssHI, Sfr2741, SlaI 또는 StrI인 것을 특징으로 하는 방법.